CN110105454A - 一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法，通过VCAM‑1突变体和VEGF165突变体基因的克隆，融合蛋白基因质粒的构建，融合蛋白的表达和纯化等步骤制备融合蛋白，融合蛋白具有显著的血管新生抑制作用，对胃癌具有较高的抗肿瘤药效。本发明中的融合蛋白包含VCAM‑1突变体和VEGF165突变体两种靶向蛋白片段，通过柔性肽片段连接，生物活性高，制备方法简单，实用性强，可用于制备多种抗肿瘤药物，应用前景广阔。

Description

一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及重组蛋白药物技术领域，特别涉及一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法。
背景技术
血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)是免疫球蛋白超家族成员，它在细胞免疫反应中起到将白细胞募集到炎症损伤位点的重要作用。早期在恶性黑色素瘤的研究中发现肿瘤细胞对VCAM-1的识别及连接作用，继而提出VCAM-1可能参与肿瘤转移的重要生物学特性。多种肿瘤细胞表面发现VCAM-1的异常表达，VCAM-1在肿瘤形成和转移过程中的作用逐渐被重视，揭示VCAM-1在肿瘤发生、发展中的作用，可以对肿瘤的起因以及进展过程等增加新的认识，为肿瘤的临床治疗新方法、新药物的研究等提供理论依据。
VCAM-1(CD106)属于免疫球蛋白超家族成员，由若干个胞外免疫球蛋白样结构域、1个跨膜区域和由19个氨基酸构成的胞质结构区组成。1990年，在关于B细胞和淋巴生发中心的研究中首次发现VCAM-1的配体-整合素α4β1(VLA-4)，随后又发现了整合素α4β7、αMβ2、α9β1和αDβ2等，但VLA-4是研究最广泛的VCAM-1配体。VCAM-1可拼接组成7个(7domains，7d)或者6个(6domains，6d)免疫球蛋白样的结构域，6d缺少第四结构域。第一结构域和第四结构域是VLA-4的结合位点。6dVCAM-1在溶解状态下与VLA-4有着更强的结合能力，而7d VCAM-1在介导细胞黏附和播散中更为有效。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的血管新生因子，是促进血管生长作用最强的关键因子之一，是诱导血管生成的主要调节因素。而血管的生成是肿瘤快速生长和恶变转移所必须的条件。目前共发现有五种哺乳动物VEGF配体和三种VEGF酪氨酸激酶受体，一些共受体还可间接的调节VEGF的生物学效应。VEGF在正常组织和肿瘤组织中的表达有显著差异，在肿瘤的发生发展中具有重要作用，为肿瘤的治疗提供了新的作用靶点。
构建融合蛋白的基本方法是将具有特定功能的天然或人工编码的多肽序列模块化，并使用基因编码的DNA序列模板合成，随后将第1个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第2个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。通过控制每一个功能肽模块在整体蛋白材料中的确切位置和密度，人们便能够根据实际需要改变融合蛋白的组成。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。
目前局部癌症虽然可以成功地运用外科手术和放射疗法治疗，但化学疗法仍是常规治疗晚期或转移性肿瘤的首选。由于化疗药物存在选择性低、不良反应大、多药耐药等缺陷，很大程度上限制了其使用。单抗类肿瘤靶向疗法虽然解决了靶向性的问题，但其蛋白分子量大，免疫原性高，易产生过敏及免疫交叉反应，且由于研发成本高，研发难度大，产能有限等原因导致其售价高昂，普通癌症患者很难普及使用，同时单抗类药物存在剂型比较单一，给药方式多为静脉注射或滴注，无法口服等问题，使得药物应用十分不便。
采用基因重组技术将两种抗肿瘤靶点融合后，融合蛋白可同时阻断整合素信号通路和VEGF165通路，阻断肿瘤的血管新生，强烈抑制肿瘤细胞的增殖和营养供应，在相同剂量下可显著提高抗肿瘤相应，是未来抗肿瘤靶向药物的发展方向之一。同时，抗肿瘤融合蛋白来源为人源，具有高亲和力、强特异性、低不良反应的特点。此外大多数还具选择性靶向肿瘤细胞的性质，因而在临床应用上具有非常重要的开发价值，作为抗肿瘤化合物具有较好的前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对目前单抗类药物和化疗类药物在治疗肿瘤中存在的诸多缺点，本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白及在制备抗肿瘤药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种抗肿瘤融合蛋白，融合蛋白的氨基酸序列为：PKNTVISVNPSTKLQEGGSVTMTCSSEGLPAPEIFWSKKLDNGNLQHLSGNATLTLIAMRMEDSGIYVCEGVNLIGKNRKEVELIVQEKPFTVEISPGPRIAAQIGDSVMLTCSVMGCESPSFSWRTQIDSPLSGKVRSEGTNSTLTLSPVSFENEHSYLCTVTCGHKKLEKGIQVEFDPTGGSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIK。
优选地，所述融合蛋白的核苷酸序列为：
CCGAAAAACACCGTTATCTCTGTTAACCCGTCTACCAAACTGCAGGAAGGTGGTTCTGTTACCATGACCTGCTCTTCTGAAGGTCTGCCGGCGCCGGAAATCTTCTGGTCTAAAAAACTGGACAACGGTAACCTGCAGCACCTGTCTGGTAACGCGACCCTGACCCTGATCGCGATGCGTATGGAAGACTCTGGTATCTACGTTTGCGAAGGTGTTAACCTGATCGGTAAAAACCGTAAAGAAGTTGAACTGATCGTTCAGGAAAAACCGTTCACCGTTGAAATCTCTCCGGGTCCGCGTATCGCGGCGCAGATCGGTGACTCTGTTATGCTGACCTGCTCTGTTATGGGTTGCGAATCTCCGTCTTTCTCTTGGCGTACCCAGATCGACTCTCCGCTGTCTGGTAAAGTTCGTTCTGAAGGTACCAACTCTACCCTGACCCTGTCTCCGGTTTCTTTCGAAAACGAACACTCTTACCTGTGCACCGTTACCTGCGGTCACAAAAAACTGGAAAAAGGTATCCAGGTTGAATTCGACCCGACCGGTGGTTCTTACTGCCACCCGATCGAAACCCTGGTTGACATCTTCCAGGAATACCCGGACGAAATCGAATACATCTTCAAACCGTCTTGCGTTCCGCTGATGCGTTGCGGTGGTTGCTGCAACGACGAAGGTCTGGAATGCGTTCCGACCGAAGAATCTAACATCACCATGCAGATCATGCGTATCAAA。
一种包含上述核苷酸序列的质粒载体，所述质粒载体为pET-28a，所述核苷酸序列位于pET-28a载体T7启动子下游，所述核苷酸序列两端的限制性内切酶为HindIII和BamHI。
优选地，所述融合蛋白的理论分子量为38kDa，实际分子量为42kDa，其N端为VCAM-1突变体序列，C端为VEGF165突变体序列，N端和C端之间利用DPTGG柔性肽连接。
一种制备上述融合蛋白的方法，包含如下步骤：
(1)培养HepG2细胞，提取RNA后逆转录生成cDNA；
(2)以cDNA为模板，设计VCAM-1突变体引物，PCR方法生成VCAM-1突变体DNA片段；
(3)将VCAM-1突变体DNA片段插入质粒载体中，转化宿主菌，挑取阳性克隆扩增培养后提取VCAM-1重组质粒；
(4)以cDNA为模板，设计VEGF165突变体引物，PCR方法生成VEGF165突变体DNA片段；
(5)将VEGF165突变体DNA片段插入VCAM-1重组质粒中，转入BL-21工程菌中挑取阳性克隆测序；
(6)测序比对正确后在适合的表达条件下，培养步骤(5)中的BL-21重组菌并表达融合蛋白；
(7)收集菌体后，通过溶菌，超声破碎，硫酸铵分级沉淀进行蛋白质分离纯化，初步分离重组后的融合蛋白；
(8)通过DEAE-52离子交换层析法纯化融合蛋白，收集蛋白溶液，-70℃冻干后收集蛋白冻干粉即得。
优选地，所述步骤(3)中宿主菌为Ecoli BL-21或DH-5α。
优选地，所述VCAM-1突变体引物序列为：上游引物CAAGCTTCCGAAAAACACCGTTAT，下游引物GGAATTCAACCTGGATACCTTTT。
优选地，所述VEGF165突变体引物序列为：上游引物CGAATTCGACCCGACCGGTGGTTCTTACTGCCACCCGATCG，下游引物AGGATCCTTTGATACGCATGATCTGCATGG。
优选地，所述表达条件为恒温37℃，200rpm摇菌，接种BL-21重组菌后1～4h无菌条件下加入1～5wt‰浓度为20～40mM的乳糖水溶液诱导，诱导后4～11h终止培养。
本发明获得的有益效果：
(1)本发明的融合蛋白包含VCAM-1突变体片段和VEGF165突变体片段，VCAM-1突变体片段可靶向结合于肿瘤细胞表面的整合素上，抑制其他粘附分子配体与整合素的结合，而VCAM-1突变体片段与整合素的结合也无法活化整合素，阻断整合素信号通路，抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤组织的血管新生，而C端的VEGF165突变体片段可同时与VEGFR2结合，在肿瘤组织内阻断VEGF信号通路，抑制新生血管形成，达到预防或治疗肿瘤的目的；
(2)本发明的融合蛋白对肿瘤的靶向性、亲和性较高，还可以增加肿瘤对其他治疗方法的敏感度；与阻断抗体相比，免疫原性低，不良反应率低，制备和纯化过程更为简单，生产效率高；
(3)本发明的融合蛋白分子量较小，有利于全身给药时药物在目标位置的扩散和靶向。
(4)本发明的氨基酸序列中采用柔性肽段连接两个功能片段，可防治蛋白表达过程中的折叠错误导致的活性表位遮盖，增加融合蛋白在体内与靶标蛋白的结合效率，增强药物稳定性，延长半衰期。
(5)本发明的融合蛋白具有抗肿瘤作用，可对胃癌有较高的抑制作用，抑瘤率可达71.2％，同时具有显著的抑制血管新生的作用，血管生成抑制率可达70％以上。
附图说明
图1为PCR获得VCAM-1突变体基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
M为DNA Marker，Lane1：PCR产物。
图2为PCR获得VEGF165突变体基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
M为DNA Marker，Lane1：PCR产物。
图3为12％SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白结果，即重组菌的诱导曲线。
M为Protein Marker，Lane1：诱导前的全菌蛋白样品，Lane2-9：诱导后4～11小时每个小时的全菌蛋白样品。
图4为12％SDS-PAGE电泳检测超声裂解菌体结果。
M为Protein Marker，Lane1：诱导前全菌蛋白，Lane2：诱导后6h全菌蛋白，Lane3：超声裂解后上清，Lane4：超声裂解后沉淀。
图5为12％SDS-PAGE电泳检测硫酸铵分级沉淀目的蛋白结果。
M为Protein Marker，Lane1：菌体裂解上清，Lane2：10％-15％饱和度时蛋白沉淀，Lane3：15％-20％饱和度时蛋白沉淀，Lane4：20％-25％饱和度时蛋白沉淀，Lane5：25％-30％饱和度时蛋白沉淀，Lane6：30％-35％饱和度时蛋白沉淀Lane7：35％-40％饱和度时蛋白沉淀。
图6为12％SDS-PAGE电泳检测DEAE52阴离子交换层析对目的蛋白纯化结果。
M为Protein Marker，Lane1：上样前蛋白溶液样品，Lane2-9：蛋白洗脱峰每8mL取样样品。
图7为12％SDS-PAGE电泳检测融合蛋白冻干粉复溶结果。
M为Protein Marker，Lane1：诱导前全菌蛋白，Lane2：诱导后6h全菌蛋白，Lane3：冻干粉复溶样品。
具体实施方式
本发明中VCAM-1突变体片段和VEGF165突变体片段，其中VCAM-1突变体片段为VCAM-1蛋白223～399位氨基酸残基，为VCAM-1蛋白中第三和第四结构域，为VCAM-1与整合素结合的主要结构域，但不包含第一结构域，无法激活整合素信号通路，因此可竞争性的结合整合素，抑制其余整合素配体的结合，抑制和阻断整合素信号通路，抑制肿瘤细胞粘附增殖及炎症刺激反应。
VEGF165突变体片段为VEGF165蛋白第50～110位氨基酸残基，包含VEGF165与VEGFR2的全部表面结合位点，可有效结合于肿瘤组织周边的血管内皮细胞表面的VEGFR2上，显著抑制肿瘤组织周围的血管新生，进一步抑制肿瘤组织增殖。
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
本说明书中所提到的材料：
(1)宿主菌和质粒
宿主菌Escherichia coli BL21和DH-5α是基因工程常用工程菌种，基因工程研究相关的实验室一般都有保存。pET-28a载体为本实验室构建并保存。
(2)酶和试剂
分子克隆工具酶为Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒、PCR胶回收试剂盒为上海生工生物科技有限公司产品；RNA抽提试剂盒及cDNA逆转录试剂盒为赛默飞世尔公司产品。
(3)培养基
LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NY：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
实施例1：本发明中抗肿瘤融合蛋白制备方法如下：
(1)37℃,5％CO2培养人肝癌细胞HepG2，收集细胞后采用4℃预冷生理盐水洗涤三次，将细胞采用RNA抽提试剂盒提取总RNA。
(2)采用逆转录cDNA试剂盒以总RNA为模板，逆转录生成cDNA，PCR反应条件为30℃，10min；42℃，40min；95℃，5min；70℃，15min。反应结束后取出反应物冰上放置。
(3)本实验利用PCR技术，利用合成的2条VCAM-1突变体引物V1、V2、和2条VEGF165突变体引物C1、C2，分别从cDNA模板上获得目的基因的片段，再将两个目的片段逐个插入到pET-28a表达载体中，采用共用的酶切位点将两段目的基因连接成整段的融合蛋白基因序列，从而获得含有融合蛋白序列的质粒载体。四条引物序列如下：
V1：5′-CAAGCTTCCGAAAAACACCGTTAT-3′含保护碱基C及Hind III酶切位点；
V2：5′-GGAATTCAACCTGGATACCTTTT-3′含保护碱基G及EcoR I酶切位点
C1：5′-CGAATTCGACCCGACCGGTGGTTCTTACTGCCACCCGATCG-3′含保护碱基C及EcoR I酶切位点
C2：5′-AGGATCCTTTGATACGCATGATCTGCATGG-3′含保护碱基A及BamH I酶切位点
引物由捷瑞测序公司合成。PCR反应在eppendorf PCR扩增仪上进行。C1和C2按1∶1比例混合，于94℃，30s；55℃，45s；72℃，1min；共35个循环。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见图1)，条带位置与预期的522bp一致。
PCR产物经切胶回收获得的目的基因片段和pET-28a载体质粒分别经EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用T4DNA连接酶4℃连接，转化至E.coli BL21感受态细胞后涂布到含50mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落，酶切方法初筛阳性克隆，将阳性克隆送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确。
再将V1和V2按1∶1比例混合，于94℃，30s，56℃，45s；72℃，1min；共35个循环。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见图2)，条带位置与预期的535bp一致。
PCR产物经切胶回收获得的目的基因片段和第一步构建的载体质粒分别经EcoR I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用T4DNA连接酶4℃连接，其他步骤同第一步克隆，将阳性克隆送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确(序列见SEQ ID NO：2)，至此融合蛋白基因构建完成。
(4)基因在大肠杆菌中的表达及培养重组表达菌以1％接种量在液体LB培养基中37℃振荡过夜，再1％转接摇瓶大批培养，培养3h后加入终浓度为7mM乳糖诱导表达，诱导6h后收集菌体，留样进行SDS-PAGE分析(参见附图3)。融合蛋白在诱导后6h达到稳定的最大表达量，通过Bandscan软件分析融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的35％，并在胞内以可溶性形式表达。
(5)挑选高表达量菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养；过夜培养液转接入LB培养基，37℃扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。8000r/min离心15min，上清及沉淀均留样。pH8.0，50mM的Tris·HCl漂洗2次菌体沉淀；向收集的菌体中加入配制好的菌体裂解液(10mL/g菌体)，放置于37℃摇床恒温剧烈振荡2小时后进行超声裂解操作，以充分裂解菌体；裂解至溶液不粘滞时取出裂解液，12000r/min离心15min，收集上清及沉淀均留样标记。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白主要存在于菌体裂解上清中，故可判断融合蛋白为胞内可溶性表达。
取裂解上清于冰浴中边搅拌边加入研细的硫酸铵粉末至相应饱和度，4℃静置1小时后12000r/min离心20min，每一级饱和度各取上清和沉淀制备样品，进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示目的蛋白主要在硫酸铵溶液15％至25％饱和度时集中沉淀，虽然在更高饱和度时也有目的蛋白析出，但含量较少，可忽略。取上述沉淀复溶于离子交换缓冲液(25mMTris·HCl，pH8.0)中，于4℃透析过夜，再于4℃，12000r/min，离心20min，弃沉淀，上清用DEAE-52阴离子交换柱进行进一步分离纯化。
(6)采用DEAE-纤维素DE52作为弱酸型阴离子交换剂，将DEAE-52用HCl和NaOH分别处理后用蒸馏水将其洗至中性，再将DEAE-52装入层析柱中，层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接核酸蛋白检测仪，利用离子交换缓冲液(pH8.0，25mM Tris·HCl)进行层析柱的平衡，平衡完毕后以1mL/min的速度进行蛋白溶液的上样操作，上样后重复平衡操作，再用NaCl(0-500mM)进行梯度洗脱，收集洗脱峰，并每8ml留样，进行SDS-PAGE电泳分析。
(7)收集蛋白纯度较高的洗脱液，4℃对其用蒸馏水透析过夜，将透析后的洗脱液平铺于玻璃平皿中，平放入-20℃冰箱中预先冷冻至固体，再迅速转移至冻干机中零下40℃冻干12小时，刮取蛋白干粉冷冻保存，用于抗肿瘤实验。。
实施例2：抗肿瘤融合蛋白的制备，方法如下：
其余与实施例1相同，不同点在于先将VCAM-1突变体质粒转化进入DH-5α工程菌中扩增，再将重组融合蛋白质粒转化进入BL-21工程菌中进行蛋白表达。
BL-21重组菌的诱导表达条件为恒温37℃，200RPM摇菌，接种BL-21重组菌后4h无菌条件下加入5wt‰浓度为10mM的乳糖水溶液诱导，诱导后11h终止培养。
实施例3：抗肿瘤融合蛋白的制备，方法如下：
其余与实施例1相同，不同点在于先将VCAM-1突变体质粒转化进入DH-5α工程菌中扩增，再将重组融合蛋白质粒转化进入BL-21工程菌中进行蛋白表达。
BL-21重组菌的诱导表达条件为恒温37℃，200RPM摇菌，接种BL-21重组菌后1h无菌条件下加入1wt‰浓度为5mM的乳糖水溶液诱导，诱导后4h终止培养。
将实施例1-3中制备的融合蛋白进行体内抗肿瘤实验，测定其肿瘤抑制率，方法如下：
实验材料：18～22g雄性裸小鼠50只；肿瘤细胞株为胃癌MGC-803，将实施例1-3中制备的融合蛋白溶于无菌生理盐水中，使终浓度为5mg/mL，0.22微米滤膜过滤后无菌分装，4℃保存备用。Avastin和多西他赛注射液，均购自江苏先声再康医药有限公司。
实验方法：
(1)将MGC-803细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养至密度80％以上，培养基为含10％FBS的DMEM高糖培养基，用0.25％的胰蛋白酶消化液消化收集细胞，1000rpm离心弃上清，生理盐水洗涤三遍后重悬计数至5×107/mL，4℃保存备用。
(2)将肿瘤细胞细胞悬液接种至裸小鼠前肢腋下，0.1mL/只，空白对照组不处理，接种后每三天观察出瘤情况，在肿瘤体积达到0.1mm3时分组给药。
(3)设置空白对照组、模型组、实施例2给药组和阳性对照组，每组8只小鼠，阳性药采用Avastin和多西他赛注射液，Avastin的给药剂量为15mg/kg，每三天给药一次，多西他赛注射液的给药剂量为5mg/kg每7天给药一次，阳性药的给药方式均为静脉注射。空白对照组不做任何处理，模型组在造模后给予生理盐水灌胃，给药体积0.1mL/10g，给药组给予抗肿瘤药物溶液灌胃，给药体积0.1mL/10g，每日给药一次。
(4)给药21天后测量肿瘤体积，计算抑瘤率，计算公式如下：
抑瘤率(％)＝(模型组肿瘤体积-给药组肿瘤体积)/模型组肿瘤体积
实验结果如下：
表1各组药物抗肿瘤药效
组别 有效成分 抑瘤率(％)
实施例1 SEQ ID NO:1 71.2
实施例2 SEQ ID NO:1 56.9
实施例3 SEQ ID NO:1 58.4
Avastin 单抗 61.2
多西他赛注射液 紫杉醇 51.9
根据上述实验结果，本发明的肿瘤抑制率明显高于对照药物Avastin和多西他赛注射液，用药剂剂量小于对照药物。
采用采用实施例1中制备的融合蛋白进行鸡胚绒毛尿囊膜血管新生抑制试验，方法如下：
新鲜罗曼鸡鸡胚照胚，用铅笔标示出气室和鸡胚位置，置于37℃，相对湿度60～80％的孵育箱中孵育至7～8日龄，每日观察两次，观察鸡胚的发育存活情况，筛选出发育良好，活力正常的鸡胚用于实验。
将融合蛋白溶液稀释5个梯度(5、1、0.2、0.04、0.008mg/mL)，每组8枚鸡胚，对照药物采用Avastin，开窗：鸡胚发育第八天，灯下照蛋观察确定鸡胚位置，做好标记，暴露接种部位。植入：取药液200μL，浸入预先制备消毒好的0.2立方厘米的明胶海绵，无菌置于鸡胚CAM，接种后封口，放回37℃培养箱中继续孵育，每12h观察一次，孵化5天，观察明胶海绵区血管形成情况。满足成像面积在规定的误差范围内的照片用PHOTOSHOP软件将各图片读入工作区，并将其转化为灰度值图像，最后转为B/W图像，计算血管面积值和面积的比值，结果如下：
表2各组鸡胚血管百分比
组别 剂量(mg/kg) 血管新生抑制率(％)
阴性对照组 NS 6.34±0.87
Avastin 15 69.34±2.64
T1 5 71.44±5.69
T2 1 64.16±0.66
T3 0.2 55.35±3.34
T4 0.04 41.32±3.54
T5 0.008 28.87±1.49
上述结果表明，本发明优选实施例1中制备的融合蛋白可有效抑制血管新生，并呈现剂量依赖性，表明本发明中的融合蛋白通过特定肽段的融合连接达到双重血管抑制作用，具有显著的血管新生抑制作用，效果好于阳性对照药物Avastin。
综上所述，本发明的融合蛋白包含VCAM-1突变体片段和VEGF165突变体片段，VCAM-1突变体片段可靶向结合于肿瘤细胞表面的整合素上，抑制其他粘附分子配体与整合素的结合，而VCAM-1突变体片段与整合素的结合也无法活化整合素，阻断整合素信号通路，抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤组织的血管新生，而C端的VEGF165突变体片段可同时与VEGFR2结合，在肿瘤组织内阻断VEGF信号通路，抑制新生血管形成，达到预防或治疗肿瘤的目的；本发明的融合蛋白对肿瘤的靶向性、亲和性较高，还可以增加肿瘤对其他治疗方法的敏感度；与阻断抗体相比，免疫原性低，不良反应率低，制备和纯化过程更为简单，生产效率高；本发明的融合蛋白分子量较小，有利于全身给药时药物在目标位置的扩散和靶向。本发明的氨基酸序列中采用柔性肽段连接两个功能片段，可防治蛋白表达过程中的折叠错误导致的活性表位遮盖，增加融合蛋白在体内与靶标蛋白的结合效率，增强药物稳定性，延长半衰期。本发明的融合蛋白具有抗肿瘤作用，可对胃癌有较高的抑制作用，抑瘤率可达71.2％，同时具有显著的抑制血管新生的作用，血管生成抑制率可达70％以上。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
SEQUENCE LISTING
<110> 张慧君
<120> 一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法
<130> 14656
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Lys Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu
1 5 10 15
Gly Gly Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Ile Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu
35 40 45
Ser Gly Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser
50 55 60
Gly Ile Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys
65 70 75 80
Glu Val Glu Leu Ile Val Gln Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser
85 90 95
Pro Gly Pro Arg Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr
100 105 110
Cys Ser Val Met Gly Cys Glu Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln
115 120 125
Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gly Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser
130 135 140
Thr Leu Thr Leu Ser Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu
145 150 155 160
Cys Thr Val Thr Cys Gly His Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val
165 170 175
Glu Phe Asp Pro Thr Gly Gly Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
180 185 190
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
195 200 205
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
210 215 220
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
225 230 235 240
Met Arg Ile Lys
<210> 2
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgaaaaaca ccgttatctc tgttaacccg tctaccaaac tgcaggaagg tggttctgtt 60
accatgacct gctcttctga aggtctgccg gcgccggaaa tcttctggtc taaaaaactg 120
gacaacggta acctgcagca cctgtctggt aacgcgaccc tgaccctgat cgcgatgcgt 180
atggaagact ctggtatcta cgtttgcgaa ggtgttaacc tgatcggtaa aaaccgtaaa 240
gaagttgaac tgatcgttca ggaaaaaccg ttcaccgttg aaatctctcc gggtccgcgt 300
atcgcggcgc agatcggtga ctctgttatg ctgacctgct ctgttatggg ttgcgaatct 360
ccgtctttct cttggcgtac ccagatcgac tctccgctgt ctggtaaagt tcgttctgaa 420
ggtaccaact ctaccctgac cctgtctccg gtttctttcg aaaacgaaca ctcttacctg 480
tgcaccgtta cctgcggtca caaaaaactg gaaaaaggta tccaggttga attcgacccg 540
accggtggtt cttactgcca cccgatcgaa accctggttg acatcttcca ggaatacccg 600
gacgaaatcg aatacatctt caaaccgtct tgcgttccgc tgatgcgttg cggtggttgc 660
tgcaacgacg aaggtctgga atgcgttccg accgaagaat ctaacatcac catgcagatc 720
atgcgtatca aa 732
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caagcttccg aaaaacaccg ttat 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaattcaac ctggatacct ttt 23
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgaattcgac ccgaccggtg gttcttactg ccacccgatc g 41
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggatccttt gatacgcatg atctgcatgg 30

Claims (9)

1.一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于：融合蛋白的氨基酸序列为：PKNTVISVNPSTKLQEGGSVTMTCSSEGLPAPEIFWSKKLDNGNLQHLSGNATLTLIAMRMEDSGIYVCEGVNLIGKNRKEVELIVQEKPFTVEISPGPRIAAQIGDSVMLTCSVMGCESPSFSWRTQIDSPLSGKVRSEGTNSTLTLSPVSFENEHSYLCTVTCGHKKLEKGIQVEFDPTGGSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIK。
2.根据权利要求1中所述的一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的核苷酸序列为：
CCGAAAAACACCGTTATCTCTGTTAACCCGTCTACCAAACTGCAGGAAGGTGGTTCTGTTACCATGACCTGCTCTTCTGAAGGTCTGCCGGCGCCGGAAATCTTCTGGTCTAAAAAACTGGACAACGGTAACCTGCAGCACCTGTCTGGTAACGCGACCCTGACCCTGATCGCGATGCGTATGGAAGACTCTGGTATCTACGTTTGCGAAGGTGTTAACCTGATCGGTAAAAACCGTAAAGAAGTTGAACTGATCGTTCAGGAAAAACCGTTCACCGTTGAAATCTCTCCGGGTCCGCGTATCGCGGCGCAGATCGGTGACTCTGTTATGCTGACCTGCTCTGTTATGGGTTGCGAATCTCCGTCTTTCTCTTGGCGTACCCAGATCGACTCTCCGCTGTCTGGTAAAGTTCGTTCTGAAGGTACCAACTCTACCCTGACCCTGTCTCCGGTTTCTTTCGAAAACGAACACTCTTACCTGTGCACCGTTACCTGCGGTCACAAAAAACTGGAAAAAGGTATCCAGGTTGAATTCGACCCGACCGGTGGTTCTTACTGCCACCCGATCGAAACCCTGGTTGACATCTTCCAGGAATACCCGGACGAAATCGAATACATCTTCAAACCGTCTTGCGTTCCGCTGATGCGTTGCGGTGGTTGCTGCAACGACGAAGGTCTGGAATGCGTTCCGACCGAAGAATCTAACATCACCATGCAGATCATGCGTATCAAA。
3.一种包含权利要求2中所述核苷酸序列的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体为pET-28a，所述核苷酸序列位于pET-28a载体T7启动子下游，所述核苷酸序列两端的限制性内切酶为HindIII和BamHI。
4.根据权利要求1中所述的一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的理论分子量为38kDa，实际分子量为42kDa，其N端为VCAM-1突变体序列，C端为VEGF165突变体序列，N端和C端之间利用DPTGG柔性肽连接。
5.一种制备权利要求1中所述融合蛋白的方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)培养HepG2细胞，提取RNA后逆转录生成cDNA；
(2)以cDNA为模板，设计VCAM-1突变体引物，PCR方法生成VCAM-1突变体DNA片段；
(3)将VCAM-1突变体DNA片段插入质粒载体中，转化宿主菌，挑取阳性克隆扩增培养后提取VCAM-1重组质粒；
(4)以cDNA为模板，设计VEGF165突变体引物，PCR方法生成VEGF165突变体DNA片段；
(5)将VEGF165突变体DNA片段插入VCAM-1重组质粒中，转入BL-21工程菌中挑取阳性克隆测序；
(6)测序比对正确后在适合的表达条件下，培养步骤(5)中的BL-21重组菌并表达融合蛋白；
(7)收集菌体后，通过溶菌，超声破碎，硫酸铵分级沉淀进行蛋白质分离纯化，初步分离重组后的融合蛋白；
(8)通过DEAE-52离子交换层析法纯化融合蛋白，收集蛋白溶液，-70℃冻干后收集蛋白冻干粉即得。
6.根据权利要求5中所述的融合蛋白制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中宿主菌为Ecoli BL-21或DH-5α。
7.根据权利要求5中所述的融合蛋白制备方法，其特征在于：所述VCAM-1突变体引物序列为：上游引物CAAGCTTCCGAAAAACACCGTTAT，下游引物GGAATTCAACCTGGATACCTTTT。
8.根据权利要求5中所述的融合蛋白制备方法，其特征在于：所述VEGF165突变体引物序列为：上游引物CGAATTCGACCCGACCGGTGGTTCTTACTGCCACCCGATCG，下游引物AGGATCCTTTGATACGCATGATCTGCATGG。
9.根据权利要求5中所述的所述的融合蛋白制备方法，其特征在于：所述表达条件为恒温37℃，200rpm摇菌，接种BL-21重组菌后1～4h无菌条件下加入1～5wt‰浓度为20～40mM的乳糖水溶液诱导，诱导后4～11h终止培养。
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