CN101058808B

CN101058808B - 一种与乳腺癌有关的p60基因,其编码的蛋白及应用

Info

Publication number: CN101058808B
Application number: CN2006100762782A
Authority: CN
Inventors: 尚永丰; 孙露洋; 吴歌
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2006-04-21
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2026-04-21
Also published as: CN101058808A

Abstract

本发明涉及p60基因，该基因编码的Q9H972-2蛋白，以及所述基因和蛋白在医学中的应用。所述蛋白参与乳腺癌的发生发展，为乳腺癌的理论研究及临床治疗提供线索和思路。

Description

一种与乳腺癌有关的p60基因，其编码的蛋白及应用

技术领域

本发明涉及一种与乳腺癌有关的p60基因，该基因编码的Q9H9 72-2蛋白，以及所述基因和蛋白在医学中的应用。所述蛋白参与乳腺癌的发生发展，为乳腺癌的理论研究及临床治疗提供线索和思路。

背景技术

某些蛋白可抑制或促进肿瘤细胞的生长和增殖，发现新的抑制或促进肿瘤生长和增殖的基因和编码的蛋白可为肿瘤的治疗提供新的方法和手段。

发明内容

本发明发现了一种参与乳腺癌发生发展过程的蛋白Q9H972-2，克隆了编码该蛋白的基因p60，构建了含有该基因的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞，并且发现该蛋白可影响乳腺癌等肿瘤细胞的生长和增殖，基于以上发现，完成了本发明。

p60又名HGNC：20162，FLJ12154。定位于染色体14q11.2，cDNA全长2352bp，表达蛋白约60kD，ORF长为1617bp，编码539个氨基酸。

同源序列比对

种属序列号特征

Pongo pygmaeus CR85760.1 cDNA DKFZp468C2110

Canis familiaris NM_537369.2 类似于蛋白C14或f93前体

Bos taurus NM_583415.2 类似于蛋白C14或f93前体

Pan troglodytes XM_522798.1 类似于蛋白C14或f93前体

Rattus XM_573773.1 类似于RIKEN cDNA 4931414P19

norvegicus

本发明将pcDNA3.1(-)-p60表达质粒转染到MCF-7细胞中，使p60基因在该细胞中表达，提取细胞总蛋白，Western Blot鉴定了p60基因表达产物的存在。

MTT法检测p60基因表达产物对乳腺癌细胞增殖的影响，结果表明，p60基因表达产物对乳腺癌细胞的增殖起抑制作用。

因此，根据本发明，提供了：

1、可影响肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。

2、编码上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者其互补序列或与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。

3、含有上述基因或者编码上述蛋白的基因的表达载体。

4、由上述表达载体转化的宿主细胞。

5、生产本发明的重组蛋白的方法，该方法包括培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白。

6、针对如以上项1所述的蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克隆抗体。

7、以上项1所述的蛋白或以上项2所述的基因在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

8、含有以上项1所述的蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。

9、一种用于对进行PCR扩增的引物对，引物如下所示：

引物1：5’-TAT AGA ATT CGC CAC CAT GTC CTT CAG TGC CAC CAT-3’

引物2：5’-TAT AGC CAC CGA ATT CAT GTC CTT CAG TGC CAC CAT-3’

附图说明

图1为PCR后1％琼脂糖电泳结果。

图2为p60编码的蛋白在真核细胞MCF-7中的表达图(Westernblot)。一抗为小鼠抗人Flag单克隆抗体，二抗为本实验室保存的兔抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗。1为阴性对照，2为细胞裂解液。用带Flag标签的pcDNA3.1(-)-p60质粒转染MCF-7细胞。蛋白水平用抗Flag抗体检测。1、2道分别表示阴性对照和MCF-7的细胞溶解产物。

图3为基因的染色体定位，定位于染色体14q11.2。

具体实施方式

本发明的一个方面是可抑制乳腺癌细胞增殖的蛋白Q9H972-2，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白等，优选是重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的蛋白可以是糖基化或可以是非糖基化。

本发明的另一个方面是编码上述蛋白的基因p60，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。多核苷酸序列片段包括其互补链可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或双链的。DNA可以是编码链或非编码链。或上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体制造的遗传工程宿主细胞和用重组技术生产的本发明的多肽产品及方法。本发明的多核苷酸序列可以包括在用于表达多肽的众多表达载体的任意一种中。适宜的载体例如包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒，腺相关病毒、逆转录病毒或其它载体。本发明中适用的表达载体可以是原核或真核表达载体，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。含有本发明的基因序列的载体可以用来转化或转导适当宿主细胞以使宿主表达此多肽。

宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或者是原核细胞，例如大肠杆菌等细菌细胞。

利用常规的基因重组技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列用来表达或生产重组的具有抑制乳腺癌细胞增殖的基因编码的蛋白多肽。包含：(1)用本发明的具有抑制乳腺癌细胞增殖的基因p60(或变异体)，或者含有该基因p60的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3)从培养物包括培养基或培养的细胞中分离、纯化蛋白质。从而可以大量生产本发明的多肽。

本发明的蛋白具有抑制乳腺癌细胞增殖的作用，其可用于乳腺癌的治疗。因此，本发明的一个目的是本发明的上述蛋白在制备治疗肿瘤，尤其乳腺癌中的用途。

本发明的蛋白可以单独或与合适的药用载体组合使用。这种组合物可以包含治疗有效量的蛋白或拮抗剂以及药学可接受的载体或赋型剂，这样的载体包括但不限于：盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘醇，乙醇，或混合物，这些制剂应适合给药方式。

本发明的药物组合物可以以适当的方式给药，如通过局部、静脉内、腹腔内、肌内、皮下等途径给药。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式，待治疗者的身体条件和诊断医生的判断。

通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。其次可以利用本发明的蛋白或其部分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。另外通过将抗体接种给宿主动物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体，还可以通过常规杂交瘤方法产生单克隆抗体。

对p60基因进行生物信息学分析，发现其表达谱较广泛。

p60表达信息：

(1)高表达的组织：BM-CD34+、胎脑、马尾神经节、BM-CD105+内皮细胞、骨髓、颈上神经节、扁桃体、丘脑、子宫、骨骼肌、心肌、胰岛、Burkitt氏淋巴瘤、721B淋巴瘤、PB-CD4+T细胞。

(2)低表达的组织：三叉神经节、下丘脑、扁桃体、小脑、额叶前部皮层、顶叶、全脑、胰腺、唾液腺、前列腺、肾上腺、胎甲状腺、慢性粒细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、PB-CD14+单核细胞。

因此，本发明可促进我们对乳腺癌发生机制的了解，并以此作为诊断治疗的理论依据。更为重要的是该基因所编码的蛋白可用于作为肿瘤尤其是乳腺癌治疗的候选药物。

实施例

实施例1：

用PCR方法从人乳腺癌cDNA文库克隆编码Q9H972-2蛋白的p60基因。以乳腺癌cDNA文库为模板，在P60基因N端接上Flag标签，用下列引物进行PCR扩增：

引物1：5’-TAT AGA ATT CGC CAC CAT GTC CTT CAG TGC CAC CAT-3’

引物2：5’-TAT AGC CAC CGA ATT CAT GTC CTT CAG TGC CAC CAT-3’

扩增反应的条件：在50μL的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-C1(PH8.5)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP，10pmol引物，0.25U的pfu DNA聚合酶(Takara公司产品)。按下列条件反应30个周期：94℃ 30sec；56℃ 30sec；72℃ 2min 30sec。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用EcoRI及BamHI双酶切后，克隆到相同酶切的pcDNA3.1(-)真核表达载体中。DNA序列分析结果表明PCR产物与预期的DNA序列基本相符。

实施例2：p60在真核细胞中的表达

Western Blot是在蛋白质电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的，其基本原理为抗原抗体反应。细胞蛋白提取物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到固相支持物上(本实验采用硝酸纤维素膜)。与特异的一抗反应(本实验用小鼠抗人Flag单克隆抗体，Sigma)，再与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(本实验室保存兔抗鼠二抗)孵育显色，可以得到特异蛋白分子的免疫印迹图。该方法具有从混杂抗原中检测出特定的抗原的特点，因此本实验用于检测带有Flag标签的p60基因转染MCF-7细胞后的表达情况。

1)瞬时转染实验：

于转染前一天将MCF-7细胞接种于10cm培养板中，接种密度为2×10⁶个细胞/孔，每孔加入培养液10ml。24小时后，细胞长至覆盖培养孔底面积约85-90％时，可准备转染。在EP管中配制下述溶液：溶液A：24μg pcDNA3.1(-)-p60表达质粒，溶于1.5mL无血清无双抗DMEM培养液。溶液B：将48μL脂质体溶液(lipofectamine 2000 reagent)加入到1.5mL无血清无双抗DMEM培养液中，室温静置5分钟。然后将溶液A、B混合，室温静置20分钟，用无血清和不含双抗的DMEM培养液洗涤细胞。

将上述A、B溶液的混合液中加入12mL无血清无双抗的DMEM培养液，混匀后加至细胞表面。37℃，5％CO2条件孵育4-6小时后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培养液取代前述培养液，继续培养细胞至48小时。

2)细胞总蛋白的提取：

培养的细胞经0.25％胰酶消化使之分散，4℃低速离心去上清，将沉淀置于冰上30min，再用预冷的PBS洗2次，每10⁶细胞加入裂解液100μL，使细胞充分裂解30min，再于4℃，20000×g离心15min，收集上清。

3)Bradford法测定细胞裂解液蛋白的浓度：

首先配制考马斯亮蓝染色液；将标准牛血清白蛋白(BSA)配制成1mg/ml的蛋白标准液，分别将10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg蛋白标准液和5μL待测蛋白质样品加入3mL考马斯亮蓝染液中，室温孵育10min，在595nm波长处测定吸收值。BSA标准样品测定标准曲线，在一定范围内OD₅₉₅与蛋白浓度成正比。样品蛋白质的浓度经标准曲线拟合方程来计算。

4)电泳及免疫反应：

流程如下：A、制胶(5％浓缩胶，10％分离胶)；B、50μg蛋白样品加入上样缓冲液，煮沸，上样；C、电泳，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压；D、转膜，100V，1.5h；E、封闭，1h；F、一抗反应，4℃，过夜；G、TBST洗膜，三次，每次10min；H、二抗反应，1.5h；I、TBST洗膜，三次，每次10min；J、显色、曝光。

实施例3：MTT法检测不同浓度的Q9H972-2蛋白对乳腺癌细胞增殖的影响

MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定等。本实验利用MTT法观察Q9H972-2蛋白对MCF-7生长的影响。具体操作方法如下：

将培养到对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×10⁴个。次日按照浓度梯度加入Q9H972-2蛋白(25、50、100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％CO2进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内加入50μlL1mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL，轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。MTT实验表明Q9H972-2蛋白对MCF-7细胞生长增殖起抑制作用，并且与剂量有关。

p60基因[1].ST25

SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>一种与乳腺癌有关的p60基因，其编码的蛋白及应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1617

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1614)

<223>

<400>1

atg tcc ttc agt gcc acc att ctc ttc tcc cct ccc agt ggc agc gag 48

Met Ser Phe Ser Ala Thr Ile Leu Phe Ser Pro Pro Ser Gly Ser Glu

1 5 10 15

gcc aga tgc tgc tgc tgc gcc tgt aag agt gag act aat gga ggc aac 96

Ala Arg Cys Cys Cys Cys Ala Cys Lys Ser Glu Thr Asn Gly Gly Asn

20 25 30

aca ggc tcc cag ggt ggg aat cct cct ccc agc acc ccc atc aca gtg 144

Thr Gly Ser Gln Gly Gly Asn Pro Pro Pro Ser Thr Pro Ile Thr Val

35 40 45

act gga cat ggc ttg gct gtt cag agc tca gag cag ctc ctg cat gtt 192

Thr Gly His Gly Leu Ala Val Gln Ser Ser Glu Gln Leu Leu His Val

50 55 60

atc tac cag cgg gtc gat aag gca gtg ggt ttg gct gaa gct gct ctg 240

Ile Tyr Gln Arg Val Asp Lys Ala Val Gly Leu Ala Glu Ala Ala Leu

65 70 75 80

ggt ctt gcc agg gcc aac aat gag ttg tta aaa cgt ctc cag gag gaa 288

Gly Leu Ala Arg Ala Asn Asn Glu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Glu Glu

85 90 95

gtg ggt gac ctg agg caa ggg aaa gtg tcc atc cct gat gaa gat ggg 336

Val Gly Asp Leu Arg Gln Gly Lys Val Ser Ile Pro Asp Glu Asp Gly

100 105 110

gaa agc cgg gca cat agt tcc cca cct gag gag cct ggg cct ctc aag 384

Glu Ser Arg Ala His Ser Ser Pro Pro Glu Glu Pro Gly Pro Leu Lys

115 120 125

gaa agt ccc ggg gaa gcc ttt aag gct ctg tct gcc gtg gaa gag gag 432

Glu Ser Pro Gly Glu Ala Phe Lys Ala Leu Ser Ala Val Glu Glu Glu

130 135 140

tgt gac agc gtg ggc agc ggc gtg cag gtg gtg att gag gag ctg cgg 480

Cys Asp Ser Val Gly Ser Gly Val Gln Val Val Ile Glu Glu Leu Arg

145 150 155 160

cag ctg gga gca gcc tca gtg ggg cct ggg cct ttg ggc ttc cca gca 528

Gln Leu Gly Ala Ala Ser Val Gly Pro Gly Pro Leu Gly Phe Pro Ala

165 170 175

act cag agg gac atg cgg ctc cca ggg tgc acg ctg gct gcc agc gag 576

Thr Gln Arg Asp Met Arg Leu Pro Gly Cys Thr Leu Ala Ala Ser Glu

180 185 190

gcg gcc ccc ctg ctc aat cct ctg gtg gat gat tac gtg gcc tct gag 624

Ala Ala Pro Leu Leu Asn Pro Leu Val Asp Asp Tyr Val Ala Ser Glu

195 200 205

ggt gca gta cag cga gtt ctg gtc cct gct tat gcc aag caa ctc tca 672

Gly Ala Val Gln Arg Val Leu Val Pro Ala Tyr Ala Lys Gln Leu Ser

210 215 220

cca gcc aca caa ctg gca atc cag cgg gca acc cca gag aca gga cca 720

Pro Ala Thr Gln Leu Ala Ile Gln Arg Ala Thr Pro Glu Thr Gly Pro

225 230 235 240

gaa aat gga acc aag ctg cca cca ccc cgc cct gag gac atg ctc aat 768

Glu Asn Gly Thr Lys Leu Pro Pro Pro Arg Pro Glu Asp Met Leu Asn

245 250 255

gcc gct gct gcg ctg gac agt gcc ttg gaa gag tca ggc cct ggg agc 816

Ala Ala Ala Ala Leu Asp Ser Ala Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Ser

260 265 270

act ggg gag ctg aga cac tct cta ggg ctg acc gtt tcc cca tgc agg 864

Thr Gly Glu Leu Arg His Ser Leu Gly Leu Thr Val Ser Pro Cys Arg

275 280 285

acc aga gga agt ggg cag aag aac tcc agg cgc aag cgg gat ctt gta 912

Thr Arg Gly Ser Gly Gln Lys Asn Ser Arg Arg Lys Arg Asp Leu Val

290 295 300

ctc tct aaa ctg gtc cac aat gtg cat aac cac atc acc aat gac aag 960

Leu Ser Lys Leu Val His Asn Val His Asn His Ile Thr Asn Asp Lys

305 310 315 320

aga ttc aat ggg tct gaa agc atc aag tcc tct tgg aat att tca gta 1008

Arg Phe Asn Gly Ser Glu Ser Ile Lys Ser Ser Trp Asn Ile Ser Val

325 330 335

gtg aag ttt ctt ctg gaa aag ctc aag caa gag ctg gtg acc agt ccc 1056

Val Lys Phe Leu Leu Glu Lys Leu Lys Gln Glu Leu Val Thr Ser Pro

340 345 350

cac aat tac act gat aag gag cta aaa gga gcc tgt gtg gcc tac ttc 1104

His Asn Tyr Thr Asp Lys Glu Leu Lys Gly Ala Cys Val Ala Tyr Phe

355 360 365

ctt act aag agg cgt gag tac cgc aac tcc ctg aac ccc ttt aaa ggc 1152

Leu Thr Lys Arg Arg Glu Tyr Arg Asn Ser Leu Asn Pro Phe Lys Gly

370 375 380

ctg aag gaa aaa gag gag aag aaa ctt cga agt cgc cga tat cgg ctt 1200

Leu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Lys Leu Arg Ser Arg Arg Tyr Arg Leu

385 390 395 400

ttt gcc aac cga tcc agt atc atg agg cat ttt gga cct gag gac caa 1248

Phe Ala Asn Arg Ser Ser Ile Met Arg His Phe Gly Pro Glu Asp Gln

405 410 415

cgt ctg tgg aat gat gtg aca gag gaa ctg atg tca gat gaa gag gac 1296

Arg Leu Trp Asn Asp Val Thr Glu Glu Leu Met Ser Asp Glu Glu Asp

420 425 430

agt ctt aac gag cca ggt gtg tgg gtg gcc cgc cct ccc cgt ttc cgg 1344

Ser Leu Asn Glu Pro Gly Val Trp Val Ala Arg Pro Pro Arg Phe Arg

435 440 445

gcc cag cgc ctc aca gag ctc tgc tac cac ctg gat gct aac tct aag 1392

Ala Gln Arg Leu Thr Glu Leu Cys Tyr His Leu Asp Ala Asn Ser Lys

450 455 460

cat ggc acc aaa gcc aac cgt gtg tat ggg cct ccc tca gac aga ctg 1440

His Gly Thr Lys Ala Asn Arg Val Tyr Gly Pro Pro Ser Asp Arg Leu

465 470 475 480

cct tct gct gaa gcc cag ctc ctt cca cca gaa ctt tac aat cct aat 1488

Pro Ser Ala Glu Ala Gln Leu Leu Pro Pro Glu Leu Tyr Asn Pro Asn

485 490 495

ttc caa gaa gag gaa gat gag gga ggg gat gag aat gca cct ggc tcc 1536

Phe Gln Glu Glu Glu Asp Glu Gly Gly Asp Glu Asn Ala Pro Gly Ser

500 505 510

cca tct ttt gac caa ccc cac aaa acc tgc tgt cct gac ttg aac tca 1584

Pro Ser Phe Asp Gln Pro His Lys Thr Cys Cys Pro Asp Leu Asn Ser

515 520 525

ttc att gaa atc aag gtg gaa aag gat gaa taa 1617

Phe Ile Glu Ile Lys Val Glu Lys Asp Glu

530 535

<210>2

<211>538

<212>PRT