CN102139117A

CN102139117A - Tob1基因在制备抑制乳腺癌转移的药物中的应用

Info

Publication number: CN102139117A
Application number: CN2011100031190A
Authority: CN
Inventors: 樊赛军; 焦旸
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2011-01-07
Filing date: 2011-01-07
Publication date: 2011-08-03

Abstract

本发明属于基因药物领域，具体涉及TOB1基因在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。本发明公开了一种抑制乳腺癌转移药物，所述抑制乳腺癌转移药物的活性成分包括携带TOB1基因的真核表达质粒。本发明所述TOB1基因通过抑制多种乳腺癌转移相关蛋白的表达，抑制乳腺癌细胞的远处转移。因此，本发明可以针对在乳腺癌发病早期即能发生远处转移、从而导致不良预后的情况，直接给予阻断乳腺癌转移的TOB1基因治疗药物，使患有高侵袭性乳腺癌的患者得到及时治疗，有效提高患者的生存率。

Description

TOB1基因在制备抑制乳腺癌转移的药物中的应用

技术领域

本发明属于基因药物领域，具体涉及TOB1基因（抗增殖蛋白家族成员Tob1，transducer of ErbB2，1）在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。

背景技术

侵袭、转移是恶性肿瘤的重要表现之一，也是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。乳腺癌是目前最常见的女性恶性肿瘤性疾病，约1/3乳腺癌病人在确诊时已有转移灶的发生，而远处转移也是治疗最终失败并致患者死亡的主要原因之一。相关研究表明，乳腺癌转移是涉及多基因、多步骤的复杂过程，与互相关联的诸多因素有关：如细胞外基质和基底膜的降解与破坏、细胞骨架重构引起细胞运动与迁移，以及肿瘤血管和淋巴管生成等，这些均受到乳腺癌转移相关基因的调控。

抗增殖蛋白家族成员TOB1是新近报道的乳腺癌抑制基因，研究发现TOB1蛋白能通过多种机制显著抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长，其基因功能的缺失还与乳腺癌的进展有关。

另外，发明人所在课题组研究了抗增殖蛋白Tob1对人类宫颈癌细胞系HeLa放射敏感性的影响：为探讨抗增殖蛋白家族成员Tob1(transducer of ErbB2，1)对宫颈癌细胞系HeLa放射敏感性的影响，构建可表达Tob1基因全长的重组质粒pcDNA3.0-Tob1(pc3-Tob1)，采用脂质体介导转染入HeLa细胞，经G418筛选出阳性耐抗克隆。通过集落形成实验研究Tob1对HeLa细胞放射敏感性的影响，借助流式细胞术和WesternBlot法检测相关分子机制。结果显示，较之HeLa母细胞和转染"空"质粒pcDNA3.0的HeLa/pc3细胞，转染pc3/Tob1后HeLa细胞放射敏感性明显增加；Tob1蛋白高表达增加了HeLa细胞中由辐射诱导的细胞凋亡，提高了由辐射引起的Bax蛋白的表达，降低了Bcl2蛋白表达。上述结果提示Tob1提高了HeLa细胞对电离辐射的敏感性，其机制可能与其上调Bax蛋白的表达、下调Bcl2蛋白的表达，从而增加由辐射诱导的细胞凋亡有关（参见：焦旸，徐加英，车俊，樊赛军. 辐射研究与辐射工艺学报. 2010年04期）。

然而TOB1基因在制备抑制乳腺癌转移药物的应用国内外至今未见报道。

发明内容

本发明目的是提供一种TOB1基因的新应用，即TOB1基因在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：TOB1基因在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用，具体的，脂质体介导的真核表达质粒pc3-TOB1在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。

本发明同时要求保护一种抑制乳腺癌转移药物，所述抑制乳腺癌转移药物的活性成分包括携带TOB1基因的真核表达质粒，优选的技术方案中，所述携带TOB1基因的真核表达质粒为真核表达质粒pc3-TOB1。

上述技术方案中，真核表达质粒pc3-TOB1的制备方法为现有技术，可以参见文献：焦旸，徐加英，车俊，樊赛军. 辐射研究与辐射工艺学报. 2010年04期。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明所述TOB1基因通过抑制多种乳腺癌转移相关蛋白的表达，抑制乳腺癌细胞的远处转移。因此，本发明可以针对在乳腺癌发病早期即能发生远处转移、从而导致不良预后的情况，直接给予阻断乳腺癌转移的TOB1基因治疗药物，使患有高侵袭性乳腺癌的患者得到及时治疗，有效提高患者的生存率。

附图说明

附图1为实施例中成功筛选的TOB1过表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的RT-PCR结果图；

附图2为实施例中TOB1过表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231体外侵袭实验结果图；

附图3为实施例中TOB1过表达抑制MDA-MB-231细胞体外迁移能力测试实验结果图；

附图4为实施例中TOB1过表达引起MDA-MB-231中肿瘤转移相关基因表达水平的改变的结果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

1 材料和方法

1.1 材料：高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购于美国细胞收藏中心(ATCC)，重组真核表达质粒pcDNA3.0-Tob1 (pc3-Tob1) 自行构建和保藏。RPMI1640细胞培养基、0.25%胰酶、胎牛血清、谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素-链霉素双抗、脂质体Lipofectamin、G418和Trizol等均购自美国Invitrogen公司；Supper Array Oligo基因芯片与Truelabeling-AMP标记试剂盒购于美国SABiosciences公司；Matrigel由美国BD公司购得；实验所需其余有机、无机试剂均购自上海生工。

1.2 细胞培养与质粒稳定转染

细胞采用含5%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基，置于37℃、5%CO₂恒温恒湿条件下常规培养，每2d换液1次，3d-4d传代1次。Tob1重组真核表达质粒pc3-TOB1和“空”质粒pc3-neo经脂质体介导转染入MDA-MB-231细胞，继续在含500μg/ml G418的完全培养液中培养至有耐抗克隆的生成。另设置一组空白组，为未加任何处理的MDA-MB-231细胞。

1.2.2 采用RT-PCR法验证转染了真核表达质粒pc3-TOB1的MDA-MB-231细胞株能否成功获得过表达TOB1：总RNA采用Trizol法进行提取，经紫外分光光度法测定浓度与纯度后，经MMV-cDNA合成试剂盒合成第一链DNA，采用Green Master Mix PCR反应试剂进行特异性基因扩增。实验所需引物由上海生工合成：SEQ ID NO：1，TOB1（正向引物）：5'-GTG GAT CCA TGC AGC TTG AAA TCC AAG TA-3'，SEQ ID NO：2，（反向引物）：5'- TTT TTT TAG TTA GCC ATA ACA GGC TGG AA-3' ；SEQ ID NO：3，GAPDH（正向引物）：5'-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3'，SEQ ID NO：4，（反向引物）：5'-CAA CCT GGT CCT CAG TGT AG-3'。PCR反应条件参照文献：焦旸，徐加英，车俊，樊赛军. 辐射研究与辐射工艺学报. 2010年04期。

结果如图1所示：与作为对照组的母细胞和“空”质粒转染的MDA-MB-231相比，pc3-TOB1稳定转染后乳腺癌细胞MDA-MB-231中TOB1 mRNA表达水平增加4至5倍左右；而各组细胞中作为内参基因的GAPDH表达水平无明显差别。因此，可知采用脂质体转染和G418筛选成功获得可表达高水平TOB1蛋白的乳腺癌细胞MDA-MB-231。

1.2.3 采用Transwell人工基底膜体外侵袭实验检测TOB1高水平表达对高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231体外侵袭能力的影响：使用前小室底膜常规经Matrigel 胶稀释液包被、水化。细胞经无血清RPMI1640重悬，调整密度为1×10⁶/ml，上室中加入100μl 细胞悬液，下室中加入500μl完全培养基，继续培养24h。取出小室，经PBS洗涤后进行二甲苯固定和台盼蓝染色。于显微镜下观察穿膜细胞数，并计算穿过率，每膜取16个视野，每组设3个复膜，求平均值。

结果如图2所示，未转染和转染“空”质粒的对照组MDA-MB-231细胞穿透基底膜的比率约为60%左右；而稳定高表达TOB1的乳腺癌细胞穿透人工基底膜的细胞数占接种细胞数的比率降低至约10%，与对照组相比，穿透率显著降低(P<0.05)。

1.2.4 采用划痕实验检测TOB1对MDA-MB-231体外迁移能力的影响，

对数期细胞以1×10⁶/ml密度接种于6孔细胞培养板，待生长至完全融合后，用200μl加样枪头划痕。用PBS完全洗去漂浮细胞，每孔重新加入2ml RPMI1640完全生长培养基，继续培养48h。采用MaCintosh HD system 在显微镜下观察并拍照记录各组细胞划痕的愈合情况，以此检测其体外迁移能力。

结果如图3所示：过表达TOB1的细胞，其体外迁移能力较之对照组细胞有明显下降趋势；划痕后48h，对照组（未转染质粒或转染“空”质粒pcDNA3.0的细胞）划痕基本全部愈合，而过表达TOB1的细胞仍存在明显划痕，基本未愈。

1.2.5 采用通路特异性的基因芯片法进行检测，分析TOB1抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231体外侵袭、转移所涉及的机制：SABioscienses Supper Array实验具体操作详见试剂盒操作说明。简述如下：总RNA采用Trizol法进行提取，经紫外分光光度法测定浓度与纯度后，经 TrueLabeling-AMP 2.0 试剂盒合成并标记cRNA。各组标记好的cRNA与肿瘤转移特异性Oligo芯片杂交、洗膜和显影后，通过X线胶片曝光，经BandScan软件进行图像分析。

结果发现，高表达TOB1的MDA-MB-231细胞中，多种肿瘤转移相关基因发生了明显的表达改变：肿瘤转移抑制基因BRMS1的表达明显增加，而促进肿瘤转移的相关基因HSP90、FXYD5、RHOC、S100A4等的表达则明显降低(P<0.05)（图4）。

1.2.6 统计学分析：本实施例中所有数据分析采用SPSS10.0统计软件的t检验和One-way ANOVA检验，P值<0.05为差异有统计学意义。

核苷酸和/或氨基酸序列表

<110> 苏州大学

<120> TOB1基因在制备抑制乳腺癌转移的药物中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtggatccat gcagcttgaa atccaagta 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tttttttagt tagccataac aggctggaa 29

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

caactacatg gtctacatgt tcc 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

caacctggtc ctcagtgtag 20

Claims

1.TOB1基因在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。

2.脂质体介导的真核表达质粒pc3-TOB1在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。

3.一种抑制乳腺癌转移药物，所述抑制乳腺癌转移药物的活性成分包括携带TOB1基因的真核表达质粒。

4.根据权利要求3所述乳腺癌转移药物，其特征在于，所述携带TOB1基因的真核表达质粒为真核表达质粒pc3-TOB1。