CN115927333A - piR-36249基因类似物及其在预防和治疗癌症中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种piR‑36249基因类似物,该类似物是根据piR‑36249基因序列合成的,该类似物可以通过碱基互补配对的方式直接结合OAS2 mRNA,显著促进抑癌基因OAS2的蛋白表达水平,从而有效抑制睾丸癌细胞的增殖、侵袭以及促进癌细胞发生凋亡,最终实现抑制肿瘤生长的目的,预示着piR‑36249基因类似物可以作为睾丸癌的生物标志物和预后指标,具备潜在的生物医药开发价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种piR-36249基因类似物及其在预防和治疗癌症中的用途。
背景技术
PIWI-interacting RNA(piRNA)是一种长度为23-36个核苷酸的非编码RNA,首次在哺乳动物生殖细胞中发现。piRNA可以与PIWI蛋白形成复合物,参与转座子沉默、基因组重排、精子发生和生殖干细胞维护等重要生物学过程。PIWI-piRNA通路被认为是生殖系统的免疫系统,PIWI-piRNA通过识别和抑制有害的遗传元件如转座子元件来保护生殖细胞基因组。一旦转座子元件不受限制地扩散,就会引起基因组损伤和基因突变,这与男性不育、睾丸癌等生理和病理过程密切相关。
从遗传和发育角度,哺乳动物的雄性生殖细胞中可以分为两种不同类别的piRNA:前粗线期piRNA(pre-pachytene piRNA)和粗线期piRNA(pachytene piRNA)。在成年雄性小鼠睾丸中,粗线期piRNA含量最多,占piRNA总量的95%以上,敲除粗线期piRNA通路的相关蛋白可导致精子发生停滞。例如,有研究组发现小鼠粗线期piRNA可以介导睾丸组织mRNA的切割,表明了piRNA在小鼠睾丸组织中可以发挥siRNA类似的功能,而且该功能为雄性生殖细胞发育成熟所必需。近期研究表明,正常生殖细胞向睾丸癌细胞转化过程中PIWI/piRNA通路基本丢失,其丢失可能是生殖细胞发生癌变的原因。
睾丸癌被认为是由男性生殖细胞发育异常引发的癌症,其中睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ-cell tumor,TGCT)占睾丸癌的95%。组织学上,TGCT可分为精原细胞瘤和非精原细胞瘤,精原细胞肿瘤类似原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)肿瘤,而非精原细胞肿瘤包括未分化的胚胎瘤、分化的胚胎畸胎瘤以及胚胎外的卵黄囊绒毛膜癌,其中胚胎瘤的发病率约占非精原细胞瘤的87%,严重危害到男性健康和生殖能力。TGCT在普通人群中是罕见的肿瘤,但在15-44岁的男性中是最常见的恶性肿瘤之一。目前TGCT的诊断主要依靠体检检查、超声检查、磁共振成像、血清肿瘤标志物的测定和病理检查。根据欧洲泌尿外科学会(European Association of Urology,EAU)发布的睾丸癌指南,大约15-30%的TGCT患者在一线化疗后会复发,并将需要额外的治疗。研究发现,原发性TGCT可转移至腹膜后淋巴结、大脑、颈部、心脏、肺动脉、下腔静脉和主动脉、肺、肝、胃和软骨。这反映了睾丸肿瘤的侵袭性生物学特征,同时也提出了睾丸癌治疗所面临的困难与挑战。目前TGCT的标准治疗是根治性睾丸切除术、以顺铂(Diamminedichloroplatinum,DDP)为中心的联合化疗方案、放疗以及腹膜后淋巴结清扫等。但TGCT治疗对其他器官产生的副作用将成为TGCT患者生存的长期风险因素。文献报道,TGCT患者出现肾脏疾病、继发性白血病、颈内动脉闭塞和中风等与化疗有关,严重增加了家庭经济负担和社会压力。更为重要的是,睾丸组织的正常发育和特异性的基因表达与调控是最终形成正常精子的必要条件,而精子发生异常是男性不育的主要原因。因此,寻找到一个合适的特异性靶点,开发出新的TGCT治疗策略是大家一直努力的方向。
近年来,大量的证据表明,piRNA的异常表达与多种癌症的发生、进展和侵袭显著相关,包括胃癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌和肺癌等多种癌症。例如,piRNA-30473通过上调m6AmRNA甲基化酶WTAP的表达,提高己糖激酶2(HK2)m6A水平,增加HK2的表达,促进弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的发展。在人乳腺癌中,SEPW1P是一个蛋白编码基因SEPW1的反转录假基因,piR-36712引导PIWI蛋白与SEPW1P RNA结合,降解SEPW1P RNA,释放更多的miRNA结合到SEPW1 mRNA上,促进其降解。SEPW1蛋白的减少削弱了其对P53和P21的抑制,从而抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移。因此,piRNA可能成为潜在的癌症诊断指标、预后标记物或癌症治疗靶点。虽然piRNA在多种癌症中的重要性日益被认识,但其在睾丸癌中的作用和潜在机制仍未完全了解。研究发现,小非编码RNA作为睾丸生殖细胞肿瘤中的肿瘤抑制基因或癌基因,有望成为睾丸癌的检测新生物标记物、预后的不良指标,以及未来开发新疗法的潜在目标。因此,识别与睾丸癌相关的piRNA并阐明其机制将是一项令人兴奋和有意义的工作。
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述的现有技术而完成的,其目的在于,提供一种能够预防和治疗睾丸癌的piR-36249基因类似物。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述问题,进行了深入研究,其结果首次发现piR-36249基因类似物的异常表达与睾丸癌有一定的关系,由此提供了一种piR-36249基因类似物。
具体地,本发明涉及以下几个方面:
1.piR-36249基因类似物,其序列为SEQ ID NO:1所示的序列。
2.药物组合物,其包含项1所述的piR-36249基因类似物和药用载体。
3.项1所述的piR-36249基因类似物在制备用于抑制睾丸癌细胞增殖和侵袭的药物中的用途。
发明效果
根据本发明,piR-36249基因类似物转染于睾丸癌细胞中时,通过靶向OAS2 mRNA的3'UTR,上调OAS2 mRNA的表达,从而能够显著抑制睾丸癌细胞的增殖、侵袭及迁移,能够促进睾丸癌细胞凋亡。
附图说明
图1A:将piR-36249基因类似物与对照组共转入睾丸癌细胞(NT2)中,通过RT-qPCR检测piR-36249基因类似物的相对表达水平,确认piR-36249基因类似物的过表达效果(n=3)。
图1B:通过CCK8比色法检测转染piR-36249基因类似物的NT2细胞增殖情况(n=3)。
图1C-D:通过荧光标记的5-乙炔基-2-脱氧尿苷(Edu)可替代胸苷掺入到细胞新合成的DNA中,检测NT2细胞增殖情况。细胞核用Hoechst-33342(蓝色,如箭头1所示)染色,Edu染色(红色,如箭头2所示),合并图像(紫色,如箭头3所示),比例尺为50μm。
图1E-F:采用细胞划痕实验分析转染piR-36249基因类似物的NT2细胞迁移能力的影响,比例尺为200μm。并采用ImageJ软件对NT2细胞相对迁移面积进行定量统计(n=3)。数据结果以平均值±标准差表示,统计显著性以*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001表示。
图2A:将piR-36249基因类似物与对照组分别转入NT2细胞,通过流式细胞仪检测piR-36249基因类似物对NT2细胞凋亡的影响。
图2B:利用Flowjo_V10_CL软件对细胞凋亡比率进行定量统计(n=3)。
图2C-D:通过Western blots实验检测piR-36249基因类似物对NT2细胞凋亡相关蛋白(Caspase 3,COX IV和Bcl-2)的表达水平的影响(n=3)。数据结果以平均值±标准差表示,统计不显著性以ns表示,显著性以*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001表示。
图3A:通过RT-qPCR方法检测转染piR-36249基因类似物后NT2细胞中OAS2基因的表达情况,以GAPDH mRNA为内参(n=3)。
图3B-C:通过Western blots实验检测piR-36249基因类似物对OAS2蛋白表达水平的影响。
图3D:piR-36249基因类似物在OAS2 mRNA上的预测结合位点示意图。
图3E:在NT2细胞中共转染piR-36249基因类似物、阴性对照、载体对照、野生型OAS2-3'UTR和突变型OAS2-3'UTR,通过酶标仪检测每组荧光素酶活性(n=3)。数据以平均值±标准差表示,统计不显著性以ns表示,显著性以***P<0.001表示。
图3F-G:在NT2细胞中转染siRNA进行OAS2敲降,通过Western blot实验检测OAS2蛋白表达量变化,并使用ImageJ软件对OAS2蛋白表达水平进行定量统计,蛋白内参为GAPDH(n=3)。
图3H-I:使用细胞增殖检测试剂Edu,检测在敲降OAS2蛋白后的NT2细胞增殖情况。细胞核用Hoechst-33342(蓝色,如箭头1所示)染色,Edu染色(红色,如箭头2所示),合并图像(紫色,如箭头3所示),比例尺为50μm。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
下述实施例中piR-36249基因类似物的碱基序列如表1所示,表中piR-36249基因类似物序列和阴性对照组RNA序列(对照组序列是根据线虫基因序列设计,和所有的哺乳动物都没有同源性,适用于人源不同基因的研究,同时排除对人源细胞研究的干扰。)是由上海吉玛制药技术有限公司合成的。
表1:piR-36249基因类似物的碱基序列
实施例1:piR-36249基因类似物在癌细胞中的表达效果检测
本发明根据piR-36249基因碱基序列(GGGGGTATAGCTCAGTGGTAGAGCATTTGA,SEQ IDNO:3)来设计piR-36249基因类似物。为了确定该类似物是否能够在癌细胞中成功表达并发挥其功能,选取了与piRNA研究领域相关的人类生殖细胞系NT2(全称NTERA-2,是一种人睾丸畸胎瘤细胞,由北京协和细胞资源中心提供),使用(Polyplustransfection,#409-10)转染试剂将piR-36249基因类似物和阴性对照组分别转入NT2细胞,piR-36249基因类似物终浓度为20nm/L,并通过RT-qPCR实验(该实验依据上海吉玛公司提供的Hairpin-itTM miRNAs定量RT-PCR试剂盒进行操作)检测piR-36249基因类似物的表达水平。
如图1A结果所示,piR-36249基因类似物可以成功在NT2细胞中表达。更为重要一点,该类似物碱基序列长度也比较短,非常容易转入细胞,且表达效率高,比较适用于临床。
实施例2:piR-36249基因类似物对睾丸癌细胞增殖、侵袭以及凋亡的影响
由于细胞增殖对于癌细胞发生发展至关重要,首先探究了piR-36249基因类似物是否参与调控睾丸癌细胞的增殖过程。将适量的NT2细胞接种于细胞孔板中,24小时内将piR-36249基因类似物和对照组分别转入NT2细胞,转染48小时后收集细胞样品,使用细胞增殖检测试剂(CCK8,#BB-4202-2和BeyoClickTM EdU-647,#C0081S)对细胞生长进行评估。
如图1B-D所示,CCK8比色法以及Edu实验结果表明,与对照组相比,表达piR-36249基因类似物显著抑制NT2细胞增殖。
之后,将NT2细胞接种到细胞培养板中;24小时内,将piR-36249基因类似物和阴性对照组转入NT2细胞中;转染48小时后,将20cm刻度的直尺放在细胞孔的正中央,用200μL移液器枪头沿着直尺边缘垂直划痕细胞1次,划完线后用磷酸缓冲盐溶液(1×PBS)润洗2次;随后在划痕0小时和24小时后采用显微镜(OLYMPUS,IX73)明场观察,并拍摄细胞划痕面积,用于评估piR-36249基因类似物对睾丸癌细胞侵袭能力的影响。
图1E-F分析结果显示,piR-36249基因类似物可显著抑制NT2细胞的侵袭能力。
这些数据表明,piR-36249抑制睾丸癌细胞的增殖和侵袭。
为了研究piR-36249基因类似物是否通过影响细胞凋亡来抑制睾丸癌细胞的增殖能力,将piR-36249基因类似物和对照组分别转入NT2细胞,使用Annexin V-FITC和碘化丙啶(该实验依据诺唯赞公司提供的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒,#A211-02进行操作)对细胞进行染色标记,并通过流式细胞仪(BECKMAN,CytoFLEX)检测睾丸癌细胞凋亡情况。
图2A-B分析结果显示,转染piR-36249基因类似物表达后,可以诱导NT2细胞发生早期和晚期凋亡,而对照组对NT2细胞凋亡无明显抑制作用。
此外,对参与细胞凋亡信号通路的相关蛋白的表达水平也进行了检测,如促凋亡相关蛋白Caspase 3(SANTA CRUZ,#sc-7272)、细胞色素c氧化酶亚基IV(COX IV,Proteintech,#11242-1-AP)和抗凋亡蛋白Bcl-2(SANTA CRUZ,#sc-509)。
图2C-D结果显示,NT2细胞转染piR-362499类似物后,Caspase 3和COX IV蛋白水平显著性升高,与阴性对照组相比,Bcl-2蛋白水平也明显降低。
这些结果进一步表明,piR-36249基因类似物可能通过诱导睾丸癌细胞发生凋亡来影响细胞增殖。
实施例3:piR-36249基因类似物对睾丸癌细胞中基因表达水平的影响以及靶基因的筛选和验证
研究发现,piRNA可以通过不完全碱基配对与mRNA结合来抑制或激活基因的表达。因此,对转染piR-36249基因类似物或阴性对照组的NT2细胞进行收集,抽提RNA样品进行转录组测序分析(RNA-Seq由贝瑞基因科技公司提供测序平台,只检测mRNA),并从中筛选出来候选基因OAS2(全称2'-5'-oligoadenylate synthetase 2,Homo sapiens(human),GenBank ID:4939),通过RT-qPCR检测候选基因OAS2在转染piR-36249基因类似物或阴性对照组的NT2细胞中的mRNA表达水平变化。
图3A结果显示,OAS2基因表达水平异常升高。
此外,通过Western blot实验,检测了转染piR-36249基因类似物和对照组的NT2细胞中OAS2蛋白水平的变化。
图3B-C结果显示,表达piR-36249基因类似物后显著上调了OAS2蛋白的表达水平。
为了进一步研究piR-36249基因类似物是否可以通过不完全碱基配对的方式与OAS2 mRNA结合,通过piRNA靶基因预测软件miRanda(http://www.bioinformatics.com.cn)比对候选基因OAS2。
结果显示,piR-36249基因类似物可能与OAS2 mRNA的3'UTR存在相互作用。因此,将OAS2基因的3'UTR序列克隆到目标载体质粒pmirGlo(Promega,#E133A)中,利用双荧光素酶报告基因实验验证piR-36249基因类似物与OAS2 mRNA的3'UTR是否存在相互作用。随后将piR-36249基因类似物、阴性对照组、载体对照组、野生型OAS2-3'UTR和突变型OAS2-3'UTR(突变位点是将piR-36249基因类似物在OAS2 mRNA 3'UTR上结合的碱基序列按照A-T和G-C进行替换,将其结合位点突变后,piR-36249基因类似物将不再结合到OAS2-3'UTR)如图3D所示,共转入NT2细胞后进行荧光素酶活性检测(该实验根据Promega公司提供的Luciferase Assay System kit,#E2920进行操作)。
其中,piR-36249基因类似物在OAS2-3'UTR上结合的序列信息如表2所示。
表2:piR-36249基因类似物在OAS2-3'UTR上结合的序列信息
备注:黑色加粗表示piR-36249基因类似物在OAS2-3'UTR上的具体结合位点
图3E结果显示,荧光素酶活性在共转piR-36249基因类似物和野生型OAS2-3'UTR报告基因质粒的NT2细胞中显著降低,而突变型OAS2-3'UTR组的荧光素酶活性并未发生显著性变化。
这些结果表明,piR-36249基因类似物通过靶向OAS2-3'UTR,上调OAS2 mRNA的表达,促进OAS2蛋白水平。
根据文献报道OAS2是一种肿瘤抑制因子,可调节一些肿瘤的发生和发展,如结直肠癌和乳腺癌等。因此,为了进一步验证OAS2的表达对睾丸癌细胞增殖的影响,设计了靶向OAS2基因的siRNA(序列信息:5'-GCCCACCAAACUAAAGGAU-3',SEQ ID NO:6,由上海吉玛制药技术有限公司合成),将其转染到NT2细胞中进行的敲降实验。并通过Western blot实验,对其敲降效果进行检测。
图3F-G结果显示,转染siRNA后的NT2细胞中,OAS2蛋白表达水平明显降低。
此外,通过细胞增殖检测试剂(BeyoClickTM EdU-647,#C0081S)对敲降OAS2基因的NT2细胞的增殖情况进行评估。
图3H-I结果显示,敲降OAS2显著促进NT2细胞增殖。
综上所述,piR-36249基因类似物可以通过促进OAS2 mRNA的表达,增加OAS2蛋白水平,进而抑制睾丸癌细胞NT2的生长。也进一步说明了piR-36249基因类似物可以起到抑制肿瘤的效果,其具有潜在的药物研发潜力。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.piR-36249基因类似物,其序列为SEQ ID NO:1所示的序列。
2.药物组合物,其包含权利要求1所述的piR-36249基因类似物和药用载体。
3.权利要求1所述的piR-36249基因类似物在制备用于抑制睾丸癌细胞增殖和侵袭的药物中的用途。
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CN116555162B (zh) * | 2023-05-06 | 2023-11-21 | 郑州大学第一附属医院 | 基于piRNA与m6A甲基化在高糖损伤肾小管上皮细胞的调控应用 |
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