CN102183655B - 用于乳腺癌内分泌治疗预后判断的新的分子标志物cuedc2蛋白质 - Google Patents

用于乳腺癌内分泌治疗预后判断的新的分子标志物cuedc2蛋白质 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CUEDC2蛋白质在制备用于乳腺癌患者内分泌药物治疗预后判断的诊断剂的用途，该诊断剂包含所述CUEDC2蛋白质的抗体，该抗体为所述CUEDC2蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗体。本发明还提供了一种用于乳腺癌患者内分泌药物治疗预后判断的试剂盒或组合物，该试剂盒或组合物中含有抗CUEDC2蛋白质的抗体。本发明还进一步公开了CUEDC2基因或蛋白质在制备肿瘤治疗药物中的用途，即可将特异抑制CUEDC2基因\蛋白质表达或活性的小分子物质、特异性抗体等作为治疗药，恢复耐药肿瘤对药物治疗的敏感性。所述CUEDC2蛋白质的新用途为确定乳腺癌病人手术后辅助治疗的用药方案提供了新依据，从而提高所使用抗癌药物的治疗效果并减轻病人的痛苦和经济负担。

Description

用于乳腺癌内分泌治疗预后判断的新的分子标志物CUEDC2蛋白质
技术领域
本发明涉及CUEDC2蛋白质的新用途，特别是涉及CUEDC2蛋白质在制备用于乳腺癌患者内分泌治疗预后判断的诊断剂的用途；CUEDC2基因或蛋白质在制备肿瘤治疗药物中的用途。本发明还涉及用于乳腺癌患者内分泌治疗预后判断的试剂盒和组合物。
背景技术
肿瘤的发生严重威胁着人类健康，对肿瘤相关基因的研究一直是人类生物学一个重要的课题。乳腺癌是一种常见的肿瘤，是女性发病率最高的几种恶性肿瘤之一，多发于欧美等国家。在我国尤其是经济发达地区其发病率也呈逐年上升趋势，已经严重威胁了妇女的健康。
雌激素受体α(Estrogen receptorα，ERα)是一种激素依赖核转录因子，它在大约70％的乳腺肿瘤中都有表达。雌激素结合雌激素受体导致受体二聚化并被招募到ERα靶基因启动子区域的雌激素反应元件上。由于ERα在乳腺癌的发生发展上发挥了主要作用，目前乳腺癌的内分泌治疗主要是靶向ERα信号通路，包括：降低雌激素水平；拮抗ERα功能；或下调ERα表达水平。在这些靶向ERα的内分泌治疗中，选择性雌激素受体调节子他莫昔芬(tamoxifen)能通过竞争结合ERα并抑制乳腺癌生长，其已成为近30年来最主要的乳腺癌的内分泌治疗药物。然而，原发性或继发性他莫昔芬耐药性却是治疗这一疾病的重要挑战。ERα本身是对乳腺癌采用内分泌治疗是否敏感的最重要决定因素，ERα表达水平降低或丢失往往引起内分泌治疗耐药。已有研究表明，ERα表达水平的下降是由于某些乳腺癌肿瘤中的转录后或翻译后调节所致。例如，Src和AIB1可以激素依赖方式下调ERα水平。然而乳腺癌中ERα水平的下调机制尚未完全明确。
CUEDC2(Gene ID：79004)是一个功能尚不明确的蛋白质。生物信息学分析表明CUEDC2含有CUE结构域。已有报道发现CUE结构域是一类相对保守的、大约40个左右氨基酸的泛素结合结构域，它广泛存在于许多真核蛋白质中。CUE结构域能够结合单泛素和多泛素。我们实验室前期研究发现，CUEDC2降解孕激素受体，并参与乳腺癌细胞生长调控(Zhang，P.J.，Zhao，J.，et al.2007.CUE domain containing 2 regulatesdegradation of progesterone receptor by ubiquitin-proteasome.EMBO J 26(7)：1831-1842.)我们近期研究表明，CUEDC2与IKK复合体结合，招募GADD34和PP1，抑制NF-κB信号通路过度激活，参与炎症反应调控(Li，H.Y.，Liu，H.，et al.2008.Deactivation of thekinase IKK by CUEDC2 through recruitment of the phosphatase PP1.Nat Immunol 9(5)：533-541.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种CUEDC2蛋白质在制备用于乳腺癌患者内分泌治疗预后判断的诊断剂的用途和CUEDC2基因或蛋白质在制备肿瘤治疗药物中的用途。
本发明的进一步的目的是提供一种用于乳腺癌患者内分泌治疗预后判断的试剂盒和组合物。
本发明的CUEDC2蛋白质是指CUE domain containing 2蛋白质，GenBank：BAE19942.1，公开日期2005年8月19目。
本发明的目的是通过以下5个方面的研究结果来实现的：
1、CUEDC2通过泛素-蛋白酶体通路可下调ERα水平。
在乳腺癌MCF-7细胞中CUEDC2的过表达导致内源ERα蛋白质水平以激素非依赖的方式下调(图1)。在MCF-7和ZR-75-1细胞种转染CUEDC2 siRNA导致ERα表达水平上调(图2)。进一步，MCF-7细胞中过表达CUEDC2能增加ERα的泛素化水平而用特异siRNA干涉CUEDC2的表达能减少ERα的泛素化水平(图3)。利用雌激素受体特异报告基因进行的测活实验(图4)以及反转录PCR实验(图5)表明，CUEDC2能降低ERα转录活性及其靶基因的转录。
2、CUEDC2在乳腺癌组织中表达增加
为了研究CUEDC2在乳腺癌组织中的表达情况，首先制备了CUEDC2单克隆抗体，其制备过程如下：首先把CUEDC2全长编码序列构建到pGEX-KG原核表达载体上。将这一GST-CUEDC2融合表达载体转化大肠杆菌DH5α，加IPTG诱导表达并纯化，得到GST-CUEDC2融合蛋白质。将GST-hCUEDC2融合蛋白质100μg与弗氏完全佐剂进行充分乳化，对4-6周龄BAL B/c雌性小鼠进行首次皮下注射。首次免疫3周后，将GST-hCUEDC2融合蛋白质100μg与弗氏不完全佐剂充分乳化，对BAL B/c小鼠进行第二次皮下注射。第三次免疫后的第15天，经尾静脉采血，用ELISA法测定血清抗体的效价。加强免疫3天后，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选，有限稀释法克隆化。具体来说，就是稀释细胞悬液，接种96孔板，理论上使每个孔中只接种1个细胞，产生单克隆，从而得到分泌完全同质单克隆抗体的杂交瘤细胞。将得到的杂交瘤细胞经腹腔接种BAL B/c小鼠，12天左右开始采集腹水，即可得到腹水mAb，由京天成生物技术(北京)有限公司制备纯化的mAb。
利用上述制备的CUEDC2抗体，发明人对449例乳腺癌病例进行了免疫组织化学分析。结果表明，CUEDC2在乳腺癌肿瘤组织中的表达量比正常癌旁组织中明显上调(图6，P＜0.001)。对16例病例进行的实时定量PCR实验结果表明，CUEDC2 mRNA表达在乳腺癌肿瘤组织中也大大增加(图7)。
3、乳腺癌中CUEDC2与ERα表达水平呈负相关
我们还对449例乳腺癌病人中重要分子标志物如ER，PR，Ki-67，HER-1和HER-2进行了免疫组织化学分析，并对染色结果进行评分。将上述分子标志物与CUEDC2的评分情况进行相关分析，结果表明CUEDC2与ERα和PR表达水平呈负相关，与Ki-67和HER-2表达水平呈正相关，而与HER-1表达水平无统计学关联，见下表1。
表1.CUEDC2与其它常见乳腺癌标志物的相关分析
Figure BDA0000044910070000031
进一步对CUEDC2与ERα和PR在乳腺癌病人中的表达水平进行分析，结果表明CUEDC2表达高的乳腺癌病人中ERα和PR的表达水平及阳性率均较低(图8)。在不同组织分级的乳腺癌病人中，级别越高的病人CUEDC2表达越高。与此同时，ERα的表达水平随着肿瘤级别的增加而降低(图9)。以上结果说明，在乳腺癌中CUEDC2和ERα表达水平是负相关的。
4、CUEDC2高表达的乳腺癌病人对他莫昔芬(tamoxifen)治疗更不敏感
发明人对228例具有随访资料的乳腺癌病人进行了生存分析。这些病人中115例接受了他莫昔芬治疗。在这部分病人中，CUEDC2表达较高的病人无病生存和总生存率比CUEDC2表达较低的病人低(图10)。而在另外113例未接受他莫昔芬治疗的病人中，CUEDC2表达量高低与否，病人的无病生存和总生存率无统计学差异(图11)。以上结果表明CUEDC2可能是临床上乳腺癌病人对他莫昔芬乃至其它内分泌治疗如雌激素受体拮抗剂(如他莫昔芬和ICI182780等)、芳香化酶抑制剂(如阿那曲唑和来曲唑等)、LH-RH激动剂(如诺雷得和戈舍瑞林等)耐药的关键性决定因素。
5、乳腺癌细胞中CUEDC2过表达降低细胞对他莫昔芬的敏感性。
稳定转染CUEDC2的MCF-7细胞用不同剂量的他莫昔芬处理，检测细胞生长情况。结果表明，CUEDC2过表达确实引起MCF-7细胞对他莫昔芬不敏感。进一步，如果将过表达CUEDC2的MCF-7细胞进行CUEDC2 siRNA干涉，能够恢复细胞对他莫昔芬的敏感性(图12)。此外，克隆形成实验表明CUEDC2过表达明显使细胞对他莫昔芬引起的细胞死亡不敏感(图13)。为了验证上述结论我们还进行了动物实验。将稳定表达CUEDC2的MCF-7细胞注射到卵巢摘除的裸鼠乳房脂肪垫上，并在颈部皮下埋下他莫昔芬缓释药片，观察肿瘤生长情况。结果显示，与对照组相比，他莫昔芬能显著抑制MCF-7细胞在裸鼠体内的生长，而过表达CUEDC2的MCF-7细胞的裸鼠中他莫昔芬不能有效抑制肿瘤生长(图14)。
本发明人的研究表明CUEDC2蛋白质作为一个新的分子标志物可以被用于乳腺癌患者内分泌治疗的预后判断，特别是用于他莫昔芬耐药性的判断。
本发明的技术方案如下：
CUEDC2蛋白质在制备用于乳腺癌患者内分泌药物治疗预后判断的诊断剂的用途，所述的诊断剂包含所述CUEDC2蛋白质的抗体。
优选的，所述抗体为所述CUEDC2蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的，所述的内分泌药物包括雌激素受体拮抗剂、芳香化酶抑制剂、LH-RH激动剂。所述的雌激素受体拮抗剂包括他莫昔芬和ICI182780；所述的芳香化酶抑制剂包括阿那曲唑和来曲唑；所述的LH-RH激动剂包括诺雷得和戈舍瑞林。
一种用于乳腺癌患者内分泌药物治疗预后判断的试剂盒，所述试剂盒中含有CUEDC2蛋白质的抗体。
优选的，所述抗体为所述CUEDC2蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的，所述内分泌药物所述的内分泌药物包括雌激素受体拮抗剂、芳香化酶抑制剂、LH-RH激动剂。所述的雌激素受体拮抗剂包括他莫昔芬和ICI182780；所述的芳香化酶抑制剂包括阿那曲唑和来曲唑；所述的LH-RH激动剂包括诺雷得和戈舍瑞林。
优选的，所述试剂盒中还包含10×PBS、构椽酸盐缓冲液、苏木素溶液、TBS溶液、3％过氧化氢、分化液、封闭血清、抗体稀释液、DAB(二氨基联苯胺)显色剂。上述溶液的制备方法如下：
10×PBS(10倍的贮存液，稀释10倍后使用)：2g氯化钾(KCl)，80g氯化钠(NaCl)，17.8g Na2HPO4·2H2O和2.4g KH2PO4，800ml蒸馏水。
Citrate buffer(枸橼酸盐缓冲液，pH6.0)：9ml 0.1M枸橼酸溶液和41ml 0.1M枸橼酸钠溶液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值为6.0。
苏木素溶液：1g苏木素，10ml无水乙醇，20g明矾(铝钾硫酸盐)，0.5g氧化汞，190ml蒸馏水，10ml冰醋酸(HOAc)。
TBS溶液：12.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，17.5g氯化钠(NaCl)，7mL浓盐酸，加蒸馏水至2000mL，pH7.6。
3％过氧化氢：在4500ml的蒸馏水中加入50ml的30％H2O2即可，用于封闭内源性过氧化物酶。
分化液(1％HCl/70％乙醇)：1mL浓盐酸，70mL乙醇，29mL蒸馏水。
封闭血清(Blocking Solution)：5-10％的非免疫羊血清，90％-95％PBS溶液。一般血清种属的选择为二抗来源的动物的血清。
抗体稀释液：15mM/L叠氮钠(NaN3)，1％牛血清白蛋白(BSA)，0.01M/LPBS pH 7.4。
DAB(二氨基联苯胺)显色剂：50mg DAB粉剂DAB(常用四盐酸盐)，0.05mol/LTBS(0.05M，pH7.6)100ml，30％H2O2 30～40微升。配制方法：过滤掉沉淀物即可。先以少量TBS溶解DAB，然后加入余量TBS，充分混匀，使DAB的终浓度为0.05％，过滤后显色前加入30％H2O2 30～40。
一种用于乳腺癌患者内分泌药物治疗预后判断的组合物，所述组合物中含有CUEDC2蛋白质的抗体。
优选的，所述抗体为所述CUEDC2蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的，所述内分泌药物所述的内分泌药物包括雌激素受体拮抗剂、芳香化酶抑制剂、LH-RH激动剂，所述的雌激素受体拮抗剂包括他莫昔芬和ICI182780，所述的芳香化酶抑制剂包括阿那曲唑和来曲唑，所述的LH-RH激动剂包括诺雷得和戈舍瑞林。
CUEDC2基因或蛋白质在制备肿瘤治疗药物中的用途，所述的药物包含特异抑制CUEDC2基因\蛋白质表达或活性的小分子物质、特异性抗体等。所述的肿瘤为CUEDC2蛋白质高表达。
优选的，所述的药物包含能结合CUEDC2 mRNA并干涉其表达的siRNA或shRNA或其它能特异结合CUEDC2基因\蛋白质并抑制其表达或活性的小分子物质、特异性抗体等。
评估用内分泌药物来治疗乳腺癌的预后效果的方法的步骤如下：
a)检测获取自乳腺癌患者的生物样品中CUEDC2蛋白质的表达情况；
b)分析由步骤a)所得的检测结果，对所述的生物样品进行评分，所述评分的标准采用广为接受的半定量法，即同时考虑染色强度和染色范围(染色的方式为免疫染色)，根据染色强度和染色范围，每个所述的生物样本最终的得分为染色强度和染色范围的加权乘积，所述的染色强度表示为无＝0，弱＝1，中＝2，强＝3，所述的染色范围表示为0％＝0，1-24％＝1，25-49％＝2，50-74％＝3，75-100％＝4，所述最终的得分的范围为0-12；
其中，所述CUEDC2蛋白质的表达水平分为低(0-4分)，中(5-8分)和高(9-12分)三个阶段，所述CUEDC2蛋白质的表达水平低是指得分范围在0-4分之间，所述CUEDC2蛋白质的表达水平中等是指得分范围在5-8分之间所述CUEDC2蛋白质的表达水平高是指得分范围在9-12分之间；当CUEDC2蛋白质的表达水平高时，提示用所述内分泌药物治疗乳腺癌的预后效果不佳；当CUEDC2蛋白质的表达水平低或中等时，提示用所述内分泌药物治疗乳腺癌的预后效果好。本领域技术人员应当了解，本发明的0-12的得分范围，以及低、中、高三个水平的评分标准仅用于举例。根据本发明的思路本领域的技术人员能够想到使用不同的得分范围及得分标准来判断CUEDC2蛋白质在肿瘤组织中的表达水平。
本发明使用CUEDC2蛋白质制备用于乳腺癌患者内分泌治疗预后判断的诊断剂，也就是说CUEDC2蛋白质作为乳腺癌患者内分泌治疗预后判断的分子标志物的优点在于：乳腺癌内分泌治疗主要靶向雌激素受体ERα，内分泌治疗效果很大程度取决于ERα表达水平高低。虽然约70％乳腺癌病人中表达ERα，但是这部分病人中仍有40％对内分泌治疗不敏感。此外PR，HER-2表达水平也与乳腺癌内分泌治疗效果密切相关，它们已广泛用于指导临床内分泌治疗用药，但是更准确的治疗效果预测有赖于发现更多的耐药相关分子。我们发现，高表达CUEDC2的乳腺癌病人中ERα表达水平也相对较低，并且对于内分泌药物治疗不敏感。因此，CUEDC2可作为一个新的预测乳腺癌病人对内分泌药物治疗敏感性的分子标志物，可单独或联合其它传统分子标志物进行预后判断，提高准确性，更好地指导临床用药。CUEDC2蛋白质为确定乳腺癌病人手术后辅助治疗的用药方案提供了新依据，从而提高所使用抗癌药物的治疗效果并减轻病人的痛苦和经济负担。此外CUEDC2还可作为治疗位点，特异抑制其基因\蛋白质表达或活性的小分子物质、特异性抗体等作为治疗药可恢复耐药肿瘤对药物治疗的敏感性。
附图说明
图1示出了CUEDC2对雌激素受体(ERα)的影响，其描述了在乳腺癌MCF-7细胞中CUEDC2的过表达导致内源ERα蛋白质水平以激素非依赖的方式下调。
图2示出了干涉CUEDC2对ERα的影响，其描述了在MCF-7和ZR-75-1细胞中转染CUEDC2 siRNA导致ERα表达水平上调。
图3示出了CUEDC2对ERα泛素化水平的影响，其描述了MCF-7细胞中过表达CUEDC2能增加ERα的泛素化水平；而用特异siRNA干涉CUEDC2的表达能减少ERα的泛素化水平。
图4示出了CUEDC2对ERα转录活性的影响，其描述了利用雌激素受体报告基因进行的测活实验结果。
图5是反转录PCR实验图，其描述过表达CUEDC2对ERα靶基因mRNA表达影响的实验结果。
图6是CUEDC2在乳腺癌组织中的表达图，其描述了CUEDC2在乳腺癌肿瘤组织中的表达量比正常癌旁组织中明显上调，其中6a表示CUEDC2在癌旁和肿瘤组织中的表达水平，6b是6a的箱线图展示结果，6c表示具有代表性的三例病例染色结果，图6d表示CUEDC2在卵巢肿瘤组织中的表达水平。
图7描述了CUEDC2mRNA表达在乳腺癌肿瘤组织中也大大增加。
图8是CUEDC2与ERα和PR表达关联的图，其描述了CUEDC2表达高的乳腺癌病人中ERα和PR的表达水平及阳性率均较低。其中图8a显示了不同级别CUEDC2表达水平的乳腺癌病人中ERα表达水平的差别；8b显示了不同级别CUEDC2表达水平的乳腺癌病人中ERα阳性率的差别；8c显示了不同级别CUEDC2表达水平的乳腺癌病人中PR表达水平的差别；8d显示了不同级别CUEDC2表达水平的乳腺癌病人中PR阳性率的差别。
图9是不同组织学分级的乳腺癌病人中CUEDC2与ERα的表达水平图，其描述了CUEDC2表达水平随肿瘤级别增加而增加，而ERα的表达水平随着肿瘤级别的增加而降低。
图10是接受他莫昔芬治疗病人的生存曲线图，其描述了在此部分病人中CUEDC2表达较高的病人无病生存和总生存率比CUEDC2表达较低的病人低。
图11是未接受他莫昔芬治疗病人的生存曲线图，其描述了在此部分病人中CUEDC2表达量高低与否，病人的无病生存和总生存率无统计学差异。
图12是MCF细胞增殖曲线图，其描述了将过表达CUEDC2的MCF-7细胞进行CUEDC2 siRNA干涉，能够恢复细胞对他莫昔芬的敏感性。
图13是结晶紫克隆形成图，其描述了CUEDC2过表达明显使细胞对他莫昔芬引起的细胞死亡不敏感。
图14是裸鼠成瘤实验图，其描述了在接种了稳定表达CUEDC2的MCF-7细胞的裸鼠中他莫昔芬不能有效抑制肿瘤生长。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的内容作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而并不构成对本发明保护范围的任何限定。
实施例1CUEDC2对ERα泛素化降解
一、材料：
大肠杆菌E.coli DH5α购自鼎国生物公司，产品目录号MCC011。雌激素购自Sigma公司。鼠的单克隆抗体HA(F-7)、抗Myc(9E10)、β-Actin均购自Santa Cruz Biotechnology公司。鼠源抗Flag(M2)购自Sigma公司。Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。MCF-7细胞购自ATCC(Manassas，VA)，保藏号HTB-22，ZR-75-1细胞购自ATCC(Manassas，VA)，保藏号：CRL-1500。其中MCF-7细胞系在含有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、抗生素的Dulbecco’s Modified Eagle’s Mediam(DMEM)培养基中培养，ZR-75-1细胞则培养在RPMI-1640培养基中，置于37℃恒温和CO2气体浓度为5％的湿度培养箱中。抗CUEDC2抗体由在大肠杆菌中融合表达GST-hCUEDC2蛋白质，纯化并免疫小鼠后制备。
CUEDC2蛋白质的单克隆抗体的制备过程如下：首先把CUEDC2全长编码序列构建到pGEX-KG原核表达载体上。将这一GST-CUEDC2融合表达载体转化大肠杆菌DH5α，加IPTG诱导表达并纯化，得到GST-CUEDC2融合蛋白质。将GST-hCUEDC2融合蛋白质100μg与弗氏完全佐剂进行充分乳化，对4-6周龄BAL B/c雌性小鼠进行首次皮下注射。首次免疫3周后，将GST-hCUEDC2融合蛋白质100μg与弗氏不完全佐剂充分乳化，对BAL B/c小鼠进行第二次皮下注射。第三次免疫后的第15天，经尾静脉采血，用ELISA法测定血清抗体的效价。加强免疫3天后，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选，有限稀释法克隆化。具体来说，就是稀释细胞悬液，接种96孔板，理论上使每个孔中只接种1个细胞，产生单克隆，从而得到分泌完全同质单克隆抗体的杂交瘤细胞。将得到的杂交瘤细胞经腹腔接种BAL B/c小鼠，12天左右开始采集腹水，即可得到腹水mAb，由京天成生物技术(北京)有限公司制备纯化的mAb。
CUEDC2蛋白质的多克隆抗体的制备过程如下：首先把CUEDC2全长编码序列构建到pGEX-KG原核表达载体上。将这一GST-CUEDC2融合表达载体转化大肠杆菌DH5α，加IPTG诱导表达并纯化，得到GST-CUEDC2融合蛋白质。将GST-hCUEDC2融合蛋白质100μg与弗氏完全佐剂进行充分乳化，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射。第0星期采血2ml(获得0.5-1ml免疫前血清)，完全弗氏佐剂(CFA)混合的200μg抗原免疫兔。第2星期，完全弗氏佐剂(CFA)混合的200μg抗原免疫兔。第4星期，不完全弗氏佐剂(IFA)混合的100μg抗原免疫兔。第5星期，取检测血清20-30ml，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。第7星期，第二次采血20-30ml，溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。第8星期，第三次采血20-30ml，溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。第9星期，末次放血20-30ml，纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。
二、方法：
1.CUEDC2稳定表达细胞系的建立。
应用逆转录病毒感染的方法，把CUEDC2表达载体稳定整合入靶细胞MCF-7细胞中。方法如下：
Day 1用磷酸钙方法将pMSCV-IRES-GFP-Flag-CUEDC2与helper质粒转染293t细胞。
Day 2转染6h更换新鲜培养液
Day 3在六孔板上种靶细胞MCF-7，每孔5×105个
Day 4将病毒上清用45μm孔径滤器过滤后，加到之前种好的靶细胞MCF-7中
Day 6将6孔板中的靶细胞反复传代培养至10cm培养皿
Day 10用流式细胞仪分选GFP阳性细胞
得到稳定细胞系后，Western blot检测过表达效果。
2.RNA干涉实验
CUEDC2及对照的siRNA购自invitrogen公司，干涉序列分别为：
siCUEDC2#1：5’-CCAAGATGAGGCAACTGGCGCTGAG-3’；
siCUEDC2#2：5’-CCTATGTGCCTGGCTTCGCCCACAT-3’；
siCUEDC2#3：5’-CCGACCTCAGTGGCTTGGATGAGGT-3’.
siControl：5’-GGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATA-3’。
用Lipofectamine 2000转染试剂将1.5μg的siRNA转染到MCF-7细胞中，转染48小时后，收细胞进行Western检测。
3.泛素化实验
将MCF-7稳定过表达CUEDC2或MCF-7稳定干涉CUEDC2细胞，收细胞前16小时加入30μM蛋白酶体抑制剂MG132(Sigma)，处理完毕后，用lysis buffer(50mMTris-HCl PH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA，0.1％NP-40，10％glycerol，1mM DTT，1X cocktail)进行裂解。用ERα抗体进行免疫沉淀，收集沉淀煮样并进行Western blot，用Ubiquitin抗体进行检测。
4.荧光素酶活性实验
(1)将0.2μg的ERE-TK-Luc报告基因r与0.02μg海肾报告基因pRL-TK和不同剂量的CUEDC2表达质粒共同转入MCF-7以及T47D细胞中。转染后六小时换液，加入10nm的激素进行处理。处理24小时后，裂解细胞，弃去培养基，用PBS洗细胞后去除残留培养基，在加入裂解液前尽量除尽PBS，在培养孔内加入提前配制好的1x裂解液250μl。把培养板置于摇床室温摇15分钟。把细胞裂解液转移至离心管内，高速离心30秒，转移上清到新的EP管内。检测荧光素酶活性。在50μl底物溶液(Luciferase AssayReagent II)内加入10μl的细胞裂解液，用移液器混匀2-3次后放入荧光光度计中进行检测，取出检测管，加入50μl
Figure BDA0000044910070000101
混匀后检测，记录两次结果的比值。
5.细胞总RNA的提取及RT-PCR
首先用二乙苯礁碳酸盐(DEPC)浸泡处理所有的器具，以除去RNase。玻璃器皿高温烘烤4小时以上。枪头和EP管均使用商品化的无RNase产品。稳定转染CUEDC2到MCF-7细胞中，加入雌激素进行处理12小时，收细胞然后用1X冰浴PBS洗涤细胞，反复洗涤三次，弃尽PBS，加入TRIZOL(Sigma)。吹吸混匀后置于4℃过夜。随后，12,000rpm离心10分钟，以去除脂肪、蛋白质和高分子量的DNA。取离心上清，室温放置5分钟后，每1ml TRIZOL中加入0.2ml氯仿，震荡混匀后室温放置2-3分钟。12,000rpm离心15分钟后，RNA将存在于上层水相中，此时将上层水相小心转移到一个新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。12,000rpm离心10分钟，弃尽上清，用1ml75％的乙醇洗涤沉淀物。6,000rpm离心5分钟后弃上清，在空气中干燥10分钟。将沉淀溶解于100μl无RNase的水中，加入5μl DnaseI，置于37℃消化30分钟。最后，加入一倍体积以上的氯仿充分振荡混匀后离心5分钟，小心吸取上层液体并转移到新的管中，用紫外分光光度计进行定量。进行1％琼脂糖凝胶电泳，可见清晰的5S、18S、28S核糖体RNA条带。取1μg RNA、1μl oligo dT随机引物(50μmol/L)，加水至12.5μl，70℃解链10分钟，自然冷却至室温。稍加离心后，再加入5μl 5X反转录缓冲液、2μl dNTP混合物(2mmol/L)、1μl Rnase抑制剂以及0.5μl的M-MLV反转录酶(Promega)。RT-PCR的反应条件为：42℃反应1小时，70℃灭活15分钟。最后取反转录出的cDNA作为模板分别用Cyclin D1，pS2，CATD，以及GAPDH的引物进行RT-PCR分析。
三、结果：
乳腺癌MCF-7细胞中CUEDC2的过表达导致内源ERα蛋白质水平以激素非依赖的方式下调(图1)。在MCF-7和ZR-75-1细胞中转染CUEDC2 siRNA导致ERα表达水平上调(图2)。进一步，MCF-7细胞中过表达CUEDC2能增加ERα的泛素化水平，而用特异siRNA干涉CUEDC2的表达能减少ERα的泛素化水平(图3)。利用雌激素受体特异报告基因进行的测活实验(图4)以及反转录PCR实验(图5)表明，CUEDC2能降低ERα转录活性及其靶基因的转录。
实施例2CUEDC2在乳腺癌肿瘤组织中高表达
一、材料：
449例福尔马林固定的乳腺癌样品来自解放军总医院。其中228例病人为2000年至2004年收治，具有临床随访资料。另221例乳腺癌样品为2006年至2008年收治病人样本。肿瘤组织学分级按WHO分级标准分为1级(72例)，2级(266例)和3级(111例)。临床分期也按WHO分级标准划分。所有肿瘤均为初次发作，具有详细临床病例信息包括ERα，PR，EGRF(HER-1)，ERBB2(HER-2/Neu)和Ki-67的免疫组织化学检测结果。所有病人均接受根治性乳房切除术，腋下淋巴结进行常规清扫，淋巴结转移情况根据组织学检测确定。肿瘤大小定义为手术时肿瘤最大径大小。抗CUEDC2抗体参照实施例1中所描述的方法进行制备。我们还使用组织芯片，用免疫组化的方法检测了CUEDC2在卵巢肿瘤及癌旁组织中的表达情况。
二、万法：
CUEDC2免疫组织化学分析所用组织切片与临床诊断的ERα，PR，EGRF(HER-1)，ERBB2(HER-2/Neu)和Ki-67来源于同一石蜡包埋组织块。组织切片经二甲苯脱蜡后经过乙醇再水化。3％H2O2室温孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。10mM枸橼酸钠缓冲液煮10分钟进行抗原修复。切片用PBS清洗后用10％正常羊血清(购自Gibco公司)封闭，然后用1μgCUEDC2抗体在湿盒中孵育过夜。清洗后用DAB试剂盒检测，拍照。所有染色由病理医生进行盲法评分。评分标准采用广为接受的半定量法，即同时考虑染色强度和染色范围。根据染色强度(无＝0，弱＝1，中＝2，强＝3)和染色范围(0％＝0，1-24％＝1，25-49％＝2，50-74％＝3，75-100％＝4)，每个样本最终的得分为染色强度和染色范围的加权乘积，得分范围为0-12。CUEDC2表达水平分为低(0-4分)，中(5-8分)和高(9-12分)。
三、结果
发明人对449例乳腺癌病例进行了免疫组织化学分析，结果表明(参见表2)，CUEDC2在乳腺癌肿瘤组织中的表达量比正常癌旁组织中明显上调(图6a，b和c，P＜0.001)。组织芯片结果显示，CUEDC2在卵巢肿瘤组织中的表达量明显高于正常组织(图6d)。从449例乳腺癌病例中随机选取16例提取RNA，反转录后进行的实时定量PCR分析CUEDC2mRNA在肿瘤和癌旁组织中的表达，结果表明，CUEDC2mRNA表达在乳腺癌肿瘤组织中也大大增加(图7，P＝0.004)。以上结果证明CUEDC2在肿瘤组织中表达增加。
表2乳腺癌病例免疫组织化学分析结果
Figure BDA0000044910070000131
Figure BDA0000044910070000141
Figure BDA0000044910070000161
Figure BDA0000044910070000181
Figure BDA0000044910070000191
Figure BDA0000044910070000201
Figure BDA0000044910070000211
根据上述的实验方法，本发明人还检验出了CUEDC2在卵巢肿瘤组织中同样是高表达的(图6d)。
实施例3乳腺癌中CUEDC2与ERα表达呈负相关
一、材料：如实例二
二、方法和结果：
免疫组化方法如实例二。CUEDC2，ERα，PR，EGRF(HER-1)，ERBB2(HER-2/Neu)和Ki-67评分标准如实例二所述。首先利用Spearman相关分析进行了肿瘤中CUEDC2与ERα，PR，EGRF(HER-1)，ERBB2(HER-2/Neu)和Ki-67表达水平相关性分析。结果表明CUEDC2与ERα和PR表达水平呈负相关，与Ki-67和HER-2表达水平呈正相关，而与HER-1表达水平无统计学关联(表1)。进一步对CUEDC2与ERα和PR在乳腺癌病人中的表达水平进行分析，结果表明CUEDC2表达高的乳腺癌病人中ERα和PR的表达水平及阳性率均较低(图8)。在不同组织分级的乳腺癌病人中，级别越高的病人CUEDC2表达越高。与此同时，ERα的表达水平随着肿瘤级别的增加而降低(图9)。以上结果说明，在乳腺癌中CUEDC2和ERα表达水平是负相关的。
实施例4CUEDC2高表达的乳腺癌病人对他莫昔芬治疗不敏感
一、方法：
对228具有随访资料的病人进行生存分析。无病生存(Disease-free survival，DFS)和总生存(overall survival，OS)分别定义为从诊断患病到第一次复发或者死于乳腺癌的时间。最后一次随访依然存活的病人生存时间截尾于随访日期，死于非乳腺癌疾病的病人生存时间截尾于死亡时间。生存曲线按Kaplan-Meier方法绘制，曲线用log rank检验进行统计分析。所有统计分析中，P值小于0.05视为有统计学意义。统计分析用SPSS 13.0软件完成。
二、结果
为了评价CUEDC2下调ERα的临床意义，我们对228例具有随访资料的病人进行了生存分析。在这228名病人中，115名接受了他莫昔芬治疗。对于这些病人，CUEDC2高表达病人的无病生存(DFS)和总生存(OS)比CUEDC2低表达的病人更差。与此相反，在剩下113例未接受他莫昔芬治疗的病人中，CUEDC2表达水平的高低对于病人的无病生存和总生存无显著影响。这些结果表明，CUEDC2高表达的乳腺癌病人对他莫昔芬治疗的敏感性不如CUEDC2低表达的病人，提示CUEDC2在乳腺癌内分泌治疗产生耐药中可能发挥潜在重要作用。
实施例5CUEDC2过表达导致乳腺癌细胞对他莫昔芬不敏感
一、材料
4周龄雌性裸鼠购自军事医学科学院实验动物中心。细胞活性检测试剂盒(CellTiterGlo Luminescent Cell Viability Assay)购自promega公司。雌激素和tamoxifen缓释药片购自Innovative Research of America。
二、方法及结果
稳定转染CUEDC2的MCF-7细胞用不同剂量他莫昔芬处理，用细胞计数方法观察细胞生长情况(如图12所示)。我们发现CUEDC2过表达确实引起MCF-7对他莫昔芬处理不敏感。为了排除CUEDC2过表达对细胞生长的非特异作用，我们干涉了这些细胞中CUEDC2的表达并进行同样的细胞生长实验。结果显示，CUEDC2干涉恢复了MCF-7/CUEDC2对他莫昔芬的敏感性。此外，进行了结晶紫克隆形成实验，发现CUEDC2过表达明显使MCF-7细胞对他莫昔芬引起的细胞死亡不敏感，而对照MCF-7空载体细胞敏感。为了进一步验证上述结果，进行了动物实验。将5×106MCF-7/vector或MCF-7/CUEDC2细胞注射到卵巢切除的裸鼠乳腺脂肪垫上，并在皮下接种雌激素缓释药片。待肿瘤长到约100-150mm3时，裸鼠随机分成两组分别于皮下埋下他莫昔芬或对照安慰剂药片。经过持续观察和肿瘤大小测量，我们发现他莫昔芬明显抑制了MCF-7/vector细胞在裸鼠体内的成瘤，而不能抑制MCF-7/CUEDC2的成瘤。因此，这些结果表明CUEDC2对于乳腺癌细胞产生他莫昔芬耐药发挥重要作用。

Claims (7)

1.CUEDC2蛋白质在制备用于乳腺癌患者内分泌药物治疗预后判断的诊断剂的用途，其特征在于，所述的诊断剂包含所述CUEDC2蛋白质的抗体。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体为所述CUEDC2蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的内分泌药物包括雌激素受体拮抗剂、芳香化酶抑制剂、LH-RH激动剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的雌激素受体拮抗剂包括他莫昔芬和ICI182780；所述的芳香化酶抑制剂包括阿那曲唑和来曲唑；所述的LH-RH激动剂包括诺雷得和戈舍瑞林。
5.CUEDC2基因或蛋白质在制备肿瘤治疗药物中的用途，其特征在于，所述的药物包含能结合CUEDC2mRNA并干涉其表达的siRNA或shRNA；或能特异结合CUEDC2基因\蛋白质并抑制其表达或活性的小分子物质或特异性抗体。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的siRNA的序列为：
siCUEDC2#1:5’-CCAAGATGAGGCAACTGGCGCTGAG-3’；
siCUEDC2#2:5’-CCTATGTGCCTGGCTTCGCCCACAT-3’；
siCUEDC2#3:5’-CCGACCTCAGTGGCTTGGATGAGGT-3’。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为CUEDC2蛋白质高表达。
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