CN109111527B - 靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的gip34-vp3融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向特异性诱导肿瘤细胞，特别是肝癌细胞凋亡的重组GIP34‑VP3融合蛋白及其制备方法、用途，其要点是：通过人工合成方法直接合成GIP34‑VP3基因片段，将GIP34‑VP3基因片段亚克隆到真核载体并转染哺乳细胞株，表达重GIP34‑VP3融合蛋白；此GIP34‑VP3融合蛋白具有有很强的靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡作用，可用于恶性肿瘤的治疗。

Description

靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的融合蛋白，特别是靶向特异性诱导肝癌细胞凋亡的融合蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
原发性肝细胞癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，以起病隐匿，生长迅速，术后复发，预后极差为特点。据统计全世界每年新发肝癌患者60万例，而我国的肝癌新发患者数占全球的一半以上，肝癌已经成为国人健康和生命的第一杀手。目前，手术切除是肝癌治疗的首选方法，但绝大多数肝癌患者就诊时已到中晚期，丧失了手术治疗的良机，而常规的放、化疗效果极差，患者生存期一般不超过6个月。所以，建立肝癌精准靶向治疗的方法具有巨大的社会意义。
在肝癌患者中约80％的患者血清中可以检测到甲胎蛋白(alpha- fetoprotein,AFP)升高，AFP的含量与肝癌的恶性程度、药物耐受、患者预后及生存率等密切相关。过去一直认为AFP通过与癌细胞表面的AFP受体结合，是促进肝癌细胞生长的重要细胞因子，但是AFP是一种结构复杂的蛋白质，有 3个不同的功能区，每个功能区有不同的生物学作用。最近研究表明来源于AFP 的小分子多肽如GIP34、GIP14、GIP12、GIP8具有明确的抑制癌细胞生长作用，特别是GIP34通过P53和Bcl-2抑制肿瘤细胞的生长，业已成为癌症精准靶向治疗的新靶点。研究表明GIP34具有穿透肽和阻断离子通道的双重作用。GIP34 通过破坏所有癌细胞所具有的网状负电脂质双层而穿入到细胞质膜中，进而诱发癌细胞凋亡。癌细胞表面带有的网状负电不仅是靶向凋亡的标记，也使其成为GIP34指定穿入的候选细胞，所以GIP34靶向结合带有网状负电的癌细胞，而不结合带有正电的正常细胞，为其靶向特异性诱导癌细胞凋亡提供了理论基础。
国内外研究证明鸡贫血病毒VP3蛋白对人的各种组织来源的肿瘤细胞和异常转化细胞具有特异性杀伤作用，被命名为肿瘤特异性凋亡因子(Apoptin)，有希望成为有效治疗癌症的新型生物制剂。但是由于种属间的差异，人体细胞膜表面没有VP3相关的蛋白受体，所以，VP3不能与人的所用细胞主动结合，包括肿瘤细胞。而VP3必须进入肿瘤细胞，才能引起肿瘤细胞凋亡。所以限制了VP3的应用。此外VP3不是鸡贫血病毒的结构蛋白质，在体外非常不稳定，限制规模化生产。
为解决上述理论问题，我们曾经将VP3与GST融合表达，获得了体外稳定批量获得VP3蛋白的技术(专利号：ZL201010107675.8)，解决了体外大量获得 VP3蛋白的技术难题；同时我们将叶酸通过化学方法联结到VP3蛋白上，使其能自主进入肿瘤细胞，解决了种属间差异造成的VP3不能自主进入人肿瘤细胞的理论问题(专利号：ZL201010107682.8)。VP3诱导细胞凋亡的原理是必须进入癌细胞才能发挥作用；VP3诱导肿瘤细胞凋亡的特点是不依赖于抑癌基因-53 作用途径，也不被抑制细胞凋亡基因(Bcl-2)过量表达所抑制，而是激活与细胞凋亡相关的酶(主要为caspase)引起细胞凋亡。
在解决这两个技术难题的基础上，我们又对VP3进行了进一步的改进，将 GIP34与VP3基因融合，制备出能靶向特异性诱导肝癌细胞凋亡的GIP34-VP3 的融合蛋白。此融合蛋白即发挥了GIP34能与肝癌细胞靶向结合并抑制其生长的作用，又发挥了VP3特异性诱导肝癌细胞凋亡的双重药理效果，为肝癌治疗提供一个全新的基因工程产品。
发明内容
本发明提供一种在真核细胞中高效表达、稳定好、纯度高、且能靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组蛋白及其制备方法，及该方法获得的制品在抗肿瘤治疗中的应用。本发明提供的GIP34-VP3融合蛋白能与肿瘤细胞发生特异性结合、穿入细胞膜进入胞浆并特异性诱导肿瘤细胞凋亡，以达靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，可满足临床治疗肿瘤的需要。
本发明的技术方案是：在构建GIP34-Linker-VP3融合蛋白(GIP34-VP3融合蛋白)表达载体载体、转染哺乳细胞、构建高效表达GIP34-VP3融合蛋白细胞株的基础上，进一步建立一种纯化GIP34-VP3融合蛋白的技术方法，使其在体外易溶解、稳定、纯度高；能够与肿瘤细胞靶向结合并诱导其凋亡，成为一种新型的GIP34-VP3融合蛋白。
本发明提供的新型GIP34-VP3融合蛋白基因具有序列表中SEQ1所示的核苷酸序列；
本发明提供的新型GIP34-VP3融合蛋白氨基酸具有序列表中SEQ5所示的氨基酸序列；
本发明提供的GIP34-VP3融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过人工合成的方法直接获得GIP34-VP3融合蛋白的基因片段，构建 GIP34-Linker-VP3基因。亚克隆到哺乳细胞表达载体载体，脂质体法转染哺乳细胞表达，筛选高效表达细胞株，表达GIP34-VP3融合蛋白蛋白；
(2)GIP34-VP3融合蛋白哺乳细胞株的发酵,高效表达及纯化；
(3)GIP34-VP3融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡作用。
(1)中所说的构建GIP34-VP3融合蛋白哺乳细胞表达载体载体及哺乳细胞转染的方法:直接人工合成GIP34-Linker-VP3片段，定向亚克隆到表达质粒 pATX2EcoRI和NotI酶切位点；CHO细胞的转染方法：弃去CHO细胞原来的培养基，加入约5mL新鲜培养基，再加入DNA/DOTAP混合物100μl，轻轻摇晃培养瓶，使之在培养基中分布均匀，置37℃细胞培养箱培养6～10h后换新鲜完全1640培养基，48h后加G418(800μg/mL)筛选，实验同时设未转染细胞和空载体细胞为阴性对照，以无血清1640培养基培养，各实验组每24h收集上清液，用0.45μm滤器过滤，上清液-20℃保存；收集细胞培养上清液，用于纯化，筛选高效表达哺乳细胞株。
(2)中所说的GIP34-VP3融合蛋白CHO细胞株的培养及纯化步骤是：取高效表达细胞株细胞培养上清，缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后4℃放置6 小时以上，4℃下10000g离心30min收集沉淀，沉淀用100ml平衡液溶解，并对平衡液5000ml平衡液透析24小时以上，中间换夜2次；样品再上用平衡液平衡好的阴离子层析柱或-20℃保存备用，分别用含0.1mol/L、0.2mol/L、 0.5mol/L和1mol/LNaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，SDS电泳鉴定，取含分子量18kD蛋白质部分；用平衡液平衡Separose12层析柱；将上述浓缩的17.6kD 蛋白质部分按床体积的2-5％比例上样，流速为1.5ml/min；分步收集；SDS电泳鉴定后，收集分子量为17.6kD纯度高的蛋白质部分即为GIP34-VP3融合蛋白。
溶液准备：
无血清1640培养基。
饱和硫酸铵：以1000ml为单位按下列比例配制。
硫酸铵 1000g以上
平衡液：20mmol PB缓冲液(pH7.2)，以1000ml为单位按下列比例配制。
磷酸二氢钠.2H2O 3.12g
磷酸氢二钠.12H2O 7.16g
EDTA 0.37g
(3)将上述GIP34-VP3融合蛋白制品用于诱导肿瘤细胞凋亡，以体外培养细胞为例：将肿瘤细胞接种到96孔细胞培养板内，培养过夜；加入不同浓度的GIP34-VP3融合蛋白，继续培养24小时，用AnnexinV法测定细胞凋亡，试验设正常细胞对照。结果6.12g/L重GIP34-VP3融合蛋白可使30.45％以上的肿瘤细胞发生凋亡。
(4)将上述GIP34-VP3融合蛋白制品用于抗肿瘤治疗,以动物实验为例:将裸鼠皮下接种肿瘤细胞，待肿瘤长至150mm3左右时，将小鼠随机分组，分别皮下注射高、低二种不同计量的GIP34-VP3融合蛋白及生理盐水(对照组)，隔日注射，连续20天，实验结果表明GIP34-VP3融合蛋白对肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用，与对照组比治疗组肿瘤体积增殖明显缓慢。
附图说明
下面结合附图进一步说明本发明。
图1为GIP34-VP3融合蛋白表达及纯化结果,图中1为BSA对照；2为分子量标准，从大到小依次为120，80，60，40，30，20,10kDa；3为纯化的 GIP34-VP3融合蛋白；
图2GIP34-VP3融合蛋白体外对肝癌细胞HpG2细胞的增殖抑制，图中标示分别为：纵坐标为细胞增殖抑制率；横坐标为GIP34-VP3融合蛋白的浓度梯度。
图3为GIP34-VP3融合蛋白对肝癌HeG2细胞凋亡诱导作用，图中标示分别为：1、2、3的GIP34-VP3融合蛋白浓度分别为：0g/L 3g/L和6g/L。
图4为GIP34-VP3融合蛋白对裸鼠体内肝癌的治疗作用的肿瘤的实体照片图。
具体实施方式
(1)GIP34-VP3融合蛋白哺乳细胞株的构建、培养及纯化
(1.1)实验材料：中国仓鼠卵巢细胞即CHO细胞，脂质体DOTAP，完全 1640培养基。
(1.2)试验方法将人工合成的基因片段“Fc-linker-VP3”亚克隆到哺乳细胞表达载体pATX2载体，脂质体法转染哺乳细胞CHO。CHO细胞的转染方法：弃去CHO细胞原来的培养基，加入约5m新鲜培养基L，再加入DNA/DOTAP混合物100μl，轻轻摇晃培养瓶，使之在培养基中分布均匀，置37℃细胞培养箱培养6～10h，换新鲜完全1640培养基，48h后加G418(800μg/mL)筛选，实验同时设未转染细胞和空载体细胞为阴性对照，以无血清1640培养基培养，各实验组每24h收集上清液，用0.45μm滤器过滤，上清液-20℃保存；上清液中GIP34-VP3融合蛋白的纯化如下；将上述培养上清缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后4℃放置6小时以上，4℃下10000g离心30min收集沉淀，沉淀用100ml平衡液溶解，并对平衡液5000ml平衡液透析24小时以上，中间换夜一次；样品再上用平衡液平衡好的阴离子层析柱或－20℃保存备用，分别用含 0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1mol/LNaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，SDS电泳鉴定，取含分子量17.6kD蛋白质部分；用平衡液平衡Separose12层析柱；将上述浓缩的17.6kD蛋白质部分按床体积的2-5％比例上样，流速为 1ml/min；分步收集；SDS电泳鉴定后，取分子量为17.6kD纯度高的蛋白质部分即为GIP34-VP3融合蛋白；－20℃保存待鉴定。
(1.3)实验结果采用SDS电泳法或高效液相法测定蛋白质纯度，纯度在 97％以上,分子量为17.6kD，采用紫外分光光度计测定蛋白质含量，约为 0.3mg/ml。(图1)。
(2)GIP34-VP3融合蛋白体外细胞培养及体外增殖-毒性实验
(2.1)实验材料肝癌HeG2细胞购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，37℃、5％CO2饱和湿度的条件下培养。
(2.2)实验方法制备肝癌HeG2细胞单细胞悬液，将悬液加入96孔板内，调节每孔细胞数为3×104个/ml。96孔板内培养细胞24h后加入GIP34-VP3融合蛋白，使其终浓度为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20g/L，终体积为200μl，每个浓度为3孔，并设置调零孔(只加培养基)、对照组(加入终浓度为0.1％的DMSO)。培养24h后加10ul的CCK-8试剂和100ul培养基，混匀后孵育 24h后用酶标仪检测450nm下的各孔吸光度OD值，以每个浓度的3个复孔OD 值的平均值为各浓度的平均OD值，计算不同药物浓度的细胞抑制率(IR)：细胞抑制率(％)＝(Ac-As)/(Ac-Ab)×100％。As：实验孔，含细胞+培养基 +CCK-8+毒性物质；Ac：对照孔，含细胞+培养基+CCK-8；Ab：空白孔，含培养基+CCK-8。使用Graphpad Prism软件计算半数抑制浓度(IC50值)。
(2.3)实验结果终浓度为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20g/L GIP34-VP3融合蛋白处理肝癌HeG2细胞24h，对细胞的抑制率分别：12.4％、 31.2％、48.7％、65.6％、82.1％、89.7％、91.2％、92.6％、93.5％、94.1％。与对照组相比，GIP34-VP3融合蛋白能明显抑制肝癌HeG2细胞的增殖(P<0.05),并存在一定的浓度依赖性，24h的IC50为6.182g/L。以上实验数据均来自三次不同实验。(图2)
(3)GIP34-VP3融合蛋白体外肿瘤细胞培养-细胞凋亡实验
(3.1)实验材料人肝癌HeG2细胞购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，37℃、5％CO2饱和湿度的条件下培养。
(3.2)实验方法肝癌HeG2细胞接种培养瓶中，实验组参考CCK-8试验结果，加入GIP34-VP3融合蛋白的浓度分别为3g/L和6g/L。24h后终止培养，胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/ml，取1ml细胞，1000 r/min 4℃离心5min，弃上清后加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，重复离心2次。将细胞重悬于400ul结合缓冲液(BindingBuffer)，加入异硫氰酸荧光素(F1TC)标记的AnnexinV 5ul，避光4℃反应15min，再加入10ul PI 后轻轻混匀后4℃孵育5min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡。
(3.3)实验结果结果显示实验组细胞的早期和晚期凋亡率和坏死率均明显大于对照组。0、3、6g/L GIP34-VP3融合蛋白实验组早期凋亡率分别为2.42％、 17.14％、31.45％，晚期凋亡和细胞坏死率为1.30％、2.73％、9.26％(图3)。
(4)GIP34-VP3融合蛋白体内抗肿瘤作用：实验委托日本大阪癌症化学治疗研究所完成。
(4.1)实验材料：裸鼠雄性(体重18～20g)，肝癌HeG2细胞为该研究所饲养和保存。
(4.2)实验方法将肝癌HeG2细胞1×106接种于裸鼠右侧腋部皮下,所有动物常规饲养，待肿瘤包快长到150mm3后，随机分为GIP34-VP3融合蛋白治疗30μg/ml组、GIP34-VP3融合蛋白治疗50μg/ml组和生理盐水组，7只/组。治疗组：裸鼠右侧腋部皮下注射GIP34-VP3融合蛋白治疗30μg/ml和50μg/ml (0.1mL)/只，生理盐水组分别注射等体积的生理盐水。每组裸鼠隔日注射1 次；每日观察小鼠一般生活状况，肿瘤大小，隔日测量体重，于接种后3wk脱颈椎处死，分离肿瘤组织测量瘤体积。
(4.3)实验结果实验裸鼠的一般状况，接种瘤细胞后,各组小鼠正常喂养，接种1wk内一般生理状况没有明显变化。1wk后，与治疗组相比较，生理盐水组小鼠进食减少、消瘦、体重下降、皮毛失去光泽,肿瘤包块明显增大；而治疗组小鼠一般状况良好。32天后活杀小鼠，取肿瘤组织测量瘤体积，治疗组30μ g/ml和50μg/ml组的抑瘤率分别为60.6％和62.6％；抑瘤率差异显著(p<0.01) (附表)(图4)。
本发明的有益效果是：GIP34-VP3融合蛋白可在真核细胞中高效表达、稳定好、纯度高且有高活性，治疗效果显著，特别是实施本发明对生产设备没有特殊的要求，适合规模化和产业化，对于人类攻克肿瘤、特别是肝癌的生物治疗，延长患者生命具有重要意义。
序列表
<110> 沈阳金石生物制药有限公司
<120> 靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 492
<212> DNA
<213> 鸡贫血病毒(Chicken anemia virus)
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ctcagtgagg acaaactatt ggcctgtggc gagggagcgg ctgacattat tatcggacac 60
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atcactctat cgctgtgtgg ctgcgcgaat gctcgcgctc ccacgctaag atctgcaact 180
gcggacaatt cagaaagcac tggtttcaag aatgtgcagg acttgaggac cgatcaaccc 240
aagcctccct cgaagaagcg atcctgcgac ccctccgagt acagggtaag cgagctaaaa 300
gaaagcttga ttaccactac tcccagccga ccccgaaccg caagaaggcg tataagactg 360
taagtcgac 369
<210> 5
<211> 159
<212> PRT
<213> 鸡贫血病毒(Chicken anemia virus)
<400> 5
Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15
Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro
20 25 30
Gly Val Gly Gly Gly Ser Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro
35 40 45
Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu
50 55 60
Thr Pro His Cys Arg Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile
65 70 75 80
Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg
85 90 95
Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Gln
100 105 110
Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys
115 120 125
Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr
130 135 140
Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu
145 150 155
<210> 6
<211> 34
<212> PRT
<213> 人甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)
<400> 6
Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15
Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro
20 25 30
Gly Val
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工合成(Synthetic synthesis)
<400> 7
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> 鸡贫血病毒(Chicken anemia virus)
<400> 8
Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu
20 25 30
Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly
35 40 45
Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn
50 55 60
Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Gln Asp Leu Arg Thr Asp Gln
65 70 75 80
Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg
85 90 95
Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro
100 105 110
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu
115 120

Claims (4)

1.一种靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白，其特征是：
(1)通过人工合成的方法直接获得GIP34-VP3融合蛋白基因片段，其完整核酸序列为SEQ ID No: 1，SEQ ID No: 1序列由下列三个基因片段构成：人GIP34 基因片段、序列为SEQ ID No: 2；链接片段基因、序列为SEQ ID No: 3；VP3基因片段、序列为SEQ ID No: 4；
(2) 此GIP34-VP3融合蛋白的完整氨基酸序列为序列SEQ ID No: 5，该序列由下列3个氨基酸片段构成：GIP34的氨基酸片段、序列为SEQ ID No: 6；链接片段氨基酸、序列为SEQID No: 7；VP3氨基酸片段、序列为SQE ID No: 8。
2.按照权利要求1所述的靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白，其特征是：所述GIP34-VP3融合蛋白基因片段亚克隆到哺乳细胞表达载体及在哺乳细胞中表达。
3.制备权利要求2所述的靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白的方法，其特征是：
（1）GIP34-VP3融合蛋白哺乳细胞株的构建、发酵及回收 将人工合成的基因片段“GIP34-linker-VP3”亚克隆到哺乳细胞表达载体，转染哺乳细胞株表达，筛选高效表达细胞株，表达GIP34-VP3融合蛋白；
（2）GIP34-VP3融合蛋白的纯化 取高效表达细胞株细胞培养上清，缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后4℃放置6小时以上，4℃下10000g离心30min 收集沉淀，沉淀用100ml平衡液溶解，并对平衡液5000ml平衡液透析24小时以上，中间换夜2次；样品再上用平衡液平衡好的阴离子层析柱或-20℃ 保存备用，分别用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1mol/LNaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，SDS电泳鉴定，取含分子量17.6kD蛋白质部分；用平衡液平衡Separose12层析柱；将上述浓缩的18kD蛋白质部分按床体积的2-5%比例上样，流速为1.5ml/min；分步收集；SDS电泳鉴定后，收集分子量为17.6kD纯度高的蛋白质部分即为GIP34-VP3融合蛋白；
(3) 纯化的GIP34-VP3融合蛋白鉴定 采用SDS电泳法或高效液相法测定蛋白质纯度，纯度在97%以上,分子量为17.6kD，采用紫外分光光度计测定蛋白质含量，为0.3mg/ml。
4.权利要求1或2所述的一种特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白在制备用于抗恶性肿瘤治疗的药物中的用途。
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