CN101921820A - 具有活性重组肿瘤特异性凋亡因子的制备方法及其制品的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有活性重组肿瘤特异性凋亡因子的制备方法及其制品的应用，其要点是：(1)通过人工合成的方法直接获得Apoptin的基因片段，构建含GST-Apoptin基因的原核表达载体pGEX-A；(2)GST-Apoptin融合蛋白的发酵，高效表达，溶解，复性及纯化；(3)GST-Apoptin融合蛋白的化学化修饰，得到具有活性的重组肿瘤特异性凋亡因子，诱导肿瘤细胞凋亡，用于抗肿瘤治疗。本发明的有益效果是：在大肠杆菌中高效表达、稳定好、纯度高且有高活性，适合规模化和产业化。

Description

具有活性重组肿瘤特异性凋亡因子的制备方法及其制品的应用

技术领域

本发明涉及一种生物制药的制备方法及应用，尤其是具有活性的重组肿瘤特异性凋亡因子的制备方法、及该方法获得的制品在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

癌症治疗是世界性难题，癌症的生物治疗是手术、放疗、化疗等方法的重要补充，寻找更有效的生物制剂已成为21世纪重点研究领域之一。目前国内外已上市的用于肿瘤治疗的生物制剂主要有白细胞介素-2(IL-2)、干扰素(IFN)和单核细胞集落刺激因子(GSM)几种，不仅可供临床选择的品种较少，而且均为免疫增强剂或调节剂，所以研发具有治疗作用的新型生物制剂具有重要的社会意义和经济意义。

来源于鸡贫血病毒的鸡贫血病毒蛋白-3(vp3)对人的各种肿瘤细胞和异常转化细胞具有特异性杀伤作用。由于vp3能够选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，而不诱导正常细胞的凋亡，被命名为肿瘤特异性凋亡因子(Apoptin)。研究结果表明，Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡不依赖于抑癌基因-53(p53)作用途径，也不被抑制细胞凋亡基因(Bcl-2)过量表达所抑制，因此有希望成为有效治疗癌症的新型生物制剂。

与现有的抗肿瘤药物相比Apoptin具有如下特点：

(1)Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡不依赖P53途径，对那些P53基因突变的肿瘤细胞仍能诱导其凋亡，此点优于那些依靠P53发挥作用的抗肿瘤药，因为后者对P53突变的肿瘤细胞无效；

(2)Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡不仅不受bcl-2过表达的抑制，反而bcl-2过表达能够增强apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的作用，此点优于那些被bcl-2过表达抑制的抗肿瘤药；

(3)现有的抗肿瘤药物尽管数量繁多，也不乏疗效较好者，如紫杉醇、砷制剂等，但多数药物毒副作用大，且反复用药后多产生耐药性，而使肿瘤复发，所以研制毒副作用小、疗效显著的抗肿瘤药物是十分必要的。与紫杉醇相比，Apoptin具有独特优势：①不受自然资源的限制，可根据市场需求无限量的生产；②抗肿瘤作用机理独特，效果明显，无或低毒副作用；③Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡是通过激活胱天蛋白酶、释放细胞色素C和激活氨基末端激酶完成的，作用机理清楚。

但是由于Apoptin为来源于鸡贫血病毒的蛋白质，所以在Apoptin规模化生产和应用中存在两个重要的技术瓶颈，一是由于种属间的差异，人体细胞膜表面没有其相关的 蛋白受体，所以，Apoptin不能与人的细胞结合，进入细胞，引起细胞凋亡。而Apoptin诱导细胞凋亡的原理是进入细胞，激活与细胞凋亡相关的酶(主要为caspase)引起细胞凋亡。其二是原核表达的Apoptin在体外难溶解、不稳定，很难获得大量高纯度的蛋白质。所以尽管对Apoptin已经研究了十余年，但上述两个技术难题严重限制了Apoptin的产业化和临床应用，至今仍未应用于临床。所以解决这两个技术难题是使Apoptin实现产业化的关键，亦是国内外的研究热点。

针对这两个难题，目前国内外学者主要在以下两个方面开展研究：①以病毒为载体，将Apoptin基因带入肿瘤细胞，发挥Apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡作用。此种方法的优点是方法比较简单、易于操作、效果肯定；其缺点是不易产业化、病毒基因作为外源基因有潜在的引起基因重组发生突变的危险、病毒作为外援抗原反复应用，会刺激机体产生抗体，减弱其作用。②采用显微注射的方法将重组Apoptin蛋白直接注射到肿瘤细胞内。此种方法因其技术要求和设备要求很高，只适合实验室研究，不可能规模化应用，所以不能产业化。

发明内容

为能实现产业化，本发明的目的在于提供一种在大肠杆菌中高效表达、稳定好、纯度高、且有高活性的重组肿瘤特异性凋亡因子的制备方法，及该方法获得的制品在抗肿瘤治疗中的应用，以激活GST-Apopti诱导肿瘤细胞凋亡的活性，使GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞发生结合，用于诱导肿瘤细胞凋亡，以达到能够满足临床治疗肿瘤的目的。

本发明的技术方案是：在构建谷胱肽转移酶-肿瘤特异性凋亡因子(GST-Apoptin)融合蛋白原核表达载体(pGEX-A)的基础上，建立一种纯化GST-Apoptin融合蛋白的技术方法，使其在体外易溶解、稳定、纯度高；建立了GST-Apoptin融合蛋化学修饰方法，即用化学方法将叶酸连接到GST-Apoptin融合蛋白上，使GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞发生结合，使其成为一种新型重组肿瘤特异性凋亡因子。

本发明提供的新型重组肿瘤特异性凋亡因子具有序列表中序列1所示的氨基酸序列；

本发明提供的新型重组肿瘤特异性凋亡因子基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列；

本发明提供的重组肿瘤特异性凋亡因子的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过人工合成的方法直接获得Apoptin的基因片段，构建含GST-Apoptin基因的原核表达载体pGEX-A；

(2)GST-Apoptin融合蛋白的发酵，高效表达，溶解，复性及纯化；

(3)GST-Apoptin融合蛋白的化学修饰，将上步骤后的GST-Apoptin与叶酸连接，使 GST-Apoptin获得活性，诱导肿瘤细胞凋亡作用。

(1)中所说的构建含GST-Apoptin基因的原核表达载体pGEX-A的方法见文献：《鸡贫血病毒vp3基因融合表达载体的构建及表达》(www.cqvip.com)；

(2)中所说的GST-Apoptin融合蛋白的发酵，高效表达，溶解，复性及纯化的步骤是：将前述(1)表达GST-Apoptin融合蛋白的工程菌接种到含氨苄青霉素(AP)的液体肉汤培养基(LB)中，37℃摇床内培养，将菌液按比例转种到含AP的LB培养基中扩增，37℃摇床内培养，菌液浓度达到光密为1.0时按比例接种到发酵罐内，待菌液浓度达到光密为2.0后，加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂；诱导培养4h，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0值，收集上述发酵液；离心收集菌体，高压匀浆破碎菌体，离心收集沉淀，即为包涵体；取包涵体，加入包涵体溶解液磁力搅拌溶解4h；离心收集上清液；按比例缓慢加入复性液，室温磁力搅拌溶解4h；4℃复性12h以上；超滤浓缩；将上述浓缩的复性液通过用平衡液平衡的琼脂糖凝胶(Separose-12)层析柱，收集目的峰；将目的峰再上用平衡液平衡好的去内毒素亲和层析柱(FF层析柱)，收集洗脱峰即为纯化的GST-Apoptin(-20℃保存备用)。

(3)中所说的GST-Apoptin融合蛋白化学修饰步骤是：采用戊二醛法按下列比例配制GST-Apoptin融合蛋白与叶酸连接体系，具体是体积相同的0.2mg/ml GST-Apoptin融合蛋白和1.0mg/ml叶酸，再加入微量的戊二醛(原液125倍)，将配制好的连接体系，置于室温(25℃以上)避光放置3h；将连接液对磷酸盐缓冲液透析，4℃，12h以上；过滤除菌，即为新型重组肿瘤特异性凋亡因子(-20℃保存备用)。

将上述制品用于诱导肿瘤细胞凋亡，以体外培养细胞为例：将肿瘤细胞接种到96孔细胞培养板内，培养过夜；加入新型重组肿瘤特异性凋亡因子，继续培养72小时，用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定细胞凋亡，试验设正常细胞对照，未激活GST-Apoptin融合蛋白对照。结果10μg/mL新型重组肿瘤特异性凋亡因子可使50％以上的肿瘤细胞发生凋亡。

将上述制品用于抗肿瘤治疗，以动物实验为例：将小鼠皮下接种肿瘤细胞，使肿瘤长至5mm³左右时，将小鼠随机分组，分别皮下注射高、中、低三种不同计量的新型重组肿瘤特异性凋亡因子及生理盐水(对照组)，连续注射20天，实验结果表明新型重组肿瘤特异性凋亡因子对多种肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用，肿瘤组织明显萎缩。

附图说明

下面结合附图进一步说明本发明。

图1为GST-Apoptin融合蛋白原核表达载体构建方案。

图2为表达载体的酶切图谱及结果，图中标示分别为。

M：分子量标准，从大到小依次为2000，1000，750，500，250，100bp；

1：为质粒酶切对照；2、3、4：为表达载体pGEX-A酶切图谱。

图3为发酵菌体表达的重组肿瘤特异性凋亡因子(7.5％胶)，图中标示分别为：

M：分子量标准，从大到小依次为97.0，66.2，43.0，31.0，14.3kDa，

1：菌体蛋白对照；2、3：发酵表达的GST-Apoptin融合蛋白。

图4为分步纯化的重组肿瘤特异性凋亡因子(16％胶)。图中标示分别为：

M：分子量标准，从大到小依次为97.0，66.2，43.0，31.0，14.3kDa，

1、2、3、4、5：为分布收集的纯化的GST-Apoptin融合蛋白。

图5为新型重组肿瘤特异性凋亡因子对A375细胞的凋亡诱导作用。

图6为新型重组肿瘤特异性凋亡因子对S180荷瘤小鼠的治疗作用。图中A：为盐水对照组瘤体；B：为治疗组瘤体。

具体实施方式

(1)通过人工合成的方法直接获得Apoptin的基因片段；构建含GST-Apoptin基因的原核表达载体pGEX-A；

(2)GST-Apoptin融合蛋白的发酵，高效表达，溶解，复性及纯化，具体是：

(2.1)工程菌的活化、发酵及包涵体的回收取-70℃保存的工程菌种接种到含AP的营养琼脂平板培养基上，37℃培养12h以上；挑取单个菌落接种到含AP的LB液体培养基中，37℃摇床内培养12h以上，将菌液按1∶10比例接种到发酵罐内，37℃条件下培养；待菌液浓度达到2.0OD后，加入IPTG诱导剂；诱导培养4h，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0值。离心收集菌体，菌体用磷酸盐缓冲液(PB，pH7.2)悬浮，冰浴条件下，高压匀浆破碎菌体，反复4次。离心破碎后的菌体，收集沉淀，即为包涵体(图3)；

(2.2)包涵体的溶解和复性称取适量包涵体，加入包涵体溶解液(2％)，室温条件下，磁力搅拌溶解4h；离心4℃，9000rpm，15min，收集上清液；按1∶8比例缓慢加入复性液，室温磁力搅拌溶解4h；4℃复性12h以上；超滤浓缩20倍以上，立即纯化或-20℃保存备用。

(2.3)肿瘤特异性凋亡因子纯化用平衡液平衡Separose12层析柱；将上述浓缩的复性液按床体积的3％比例上样，流速为2ml/min；分步收集第2个峰；十二烷基硫酸钠(SDS)电泳鉴定后，取分子量为39kD纯度高的蛋白质部分；将上述样品再上用平衡液平衡好的FF层析柱(或-20℃保存备用)，按床体积75％比例上样，样品在柱内留置1h后，用平衡液洗脱；收集洗脱峰，-20℃保存待鉴定。

(2.4)纯化的肿瘤特异性凋亡因子鉴定采用SDS电泳法或高效液相法测定蛋白质纯度，纯度在95％以上(图4)，采用紫外分光光度计测定蛋白质含量，大约在0.5mg/ml； 采用鲎试剂法测定蛋白质样品内的内毒素含量，1∶200合格。

上述各液体配方范围及准备如下：

营养琼脂培养基平皿是，按1.5％的浓度称取营养琼脂，加适量的注射用水，高压灭菌，待培养基冷却到45℃时，加入氨苄青霉素(AP)，终浓度为100μg/ml)，然后将琼脂倒入平皿，待琼脂凝固后，4℃保存备用，(可用1～2周)。

LB液体培养基是，以1000ml为单位按下列比例配制：溶解后高压灭菌。

蛋白胨      10g

酵母提取物  5g

NaCl        1g

发酵液是，以20L为单位按下列比例配制，发酵罐内高压灭菌。

蛋白胨              200g

酵母提取物          100g

NaCl                20g

CaCl                2g

NH₄Cl               30g

葡萄糖              100g(单独高压，8磅)

磷酸二氢钠.2H₂O     30g

磷酸氢二钠.12H₂O    120g

补料液是，以1000ml为单位按下列比例配制。

蛋白胨              100g

酵母提取物          100g

葡萄糖              200g(700ml水溶解单独高压，8磅)

1mol IPTG(1000倍)是，过滤除菌，-20℃保存。

IPTG                0.48g

水                  20ml

氨苄青霉素(AP，5000倍)，应用浓度为100μg/ml

AP                  500mg

水                  5ml

20mmol PB缓冲液(pH7.2)以1000ml为单位按下列比例配制。

磷酸二氢钠.2H₂O     3.12g

磷酸氢二钠.12H₂O    7.16g

EDTA                0.37g

20mmol PB缓冲液(pH8.0)以1000ml为单位按下列比例配制。

磷酸二氢钠.2H₂O           3.12g

磷酸氢二钠.12H₂O          7.16g

EDTA                      0.37g

包涵体溶解液，以100ml为单位按下列比例配制。

20mmol PB缓冲液(pH8.0)    100ml

肌酸钠(1.0％-3.0％)       1.0～3.0g，取1.5g

三乙醇胺(10-30mM)         0.13～0.66ml，取0.33ml

DTT(10-30mM)              0.15～0.45g，，取0.31g

复性液，以1000ml为单位按下列比例配制。

20mmol PB缓冲液(pH8.0)    1000ml

DTT(10-30mM)              1.5～4.5g

平衡液，以1000ml为单位按下列比例配制。

20mmol PB缓冲液(pH7.2)    1000ml

肌酸钠(0.1％-1.0％)       0.1～1.0g，取1.0g

三乙醇胺(1mM)             0.132ml

包涵体洗涤液以1000ml为单位按下列比例配制。

20mmol PB缓冲液(pH7.2)    1000ml

TritonX-100(0.1％)        0.1ml

尿素(2mol)                120g

(3)GST-Apoptin融合蛋白的化学化修饰，即GST-Apoptin融合蛋白的激活。

(3.1)实验材料：医用叶酸，上述纯化的重组肿瘤特异性凋亡因子，戊二醛，

(3.2)实验方法：采用戊二醛法将重组肿瘤特异性凋亡因子与叶酸连，用偶联缓冲液按下列比例配制重组肿瘤特异性凋亡因子与叶酸连接体系，

0.2mg/ml重组肿瘤特异性凋亡因子          1ml

1.0mg/ml叶酸                            1ml

戊二醛(原液125倍)                       16μl(0.2％)

将配制好的连接体系，置于室温(25℃以上)避光放置3h；将连接液对1000ml磷酸盐缓冲液冲液透析，4℃，12h以上；

(3.3)过滤除菌，4℃保存备用。进行下列活性鉴定。

(4)新型重组肿瘤特异性凋亡因子体外诱导肿瘤细胞凋亡作用

(4.1)实验材料：

(4.1.1)重组肿瘤特异性凋亡因子PB溶液【20mmol PB缓冲液(pH7.2)，0.1％肌酸钠，1mM三乙醇胺】；

(4.1.2)人黑色素瘤细胞A375细胞株(引自军事医学科学院)；

(4.2)试验方法：采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡的活性。

(4.2.1)常规传代培养A375细胞；

(4.2.2)取生长良好的细胞，配制成4×10³个/ml的细胞悬液；

(4.2.3)将细胞悬液加入96孔细胞培养板，0.1ml/孔，37℃，5％CO₂培养过夜；

(4.2.4)加入上述激活的apoptin，0.1ml/孔，以50μg/ml为起点，2倍稀释，每个滴度作4孔；

(4.2.5)37℃，5％CO₂培养72h；

(4.2.6)吸弃培养上清夜，用磷酸盐缓冲液洗细胞2次；

(4.2.7)加入用无酚红RPMI1640配制的MTT(1mg/ml)，50μl/孔，37℃，5％CO₂培养3h；

(4.2.8)吸弃培养上清夜，用磷酸盐缓冲液洗细胞2次；

(4.2.9)加入二甲基亚砜(DMSO)，50μl/孔，37℃，10min；

(4.2.10)用EL340560nm波长，检测各孔A值。试验设正常细胞对照，未激活apoptin对照。

(4.3)结果10μg/mL活化的apoptin可使50％以上的肿瘤细胞发生凋亡(图5)。而未激活apoptin组细胞与正常对照组细胞没有差异。

(5)新型重组肿瘤特异性凋亡因子体内抗肿瘤作用

(5.1)实验材料：

雄性BALB/c小鼠(体重18～20g)购于中国医科大学动物部。小鼠S-180肉瘤细胞引自沈阳军区总医院医学实验科，小鼠腹腔传代以保证其致瘤性。重组肿瘤特异性凋亡因子PB溶液【20mmol PB缓冲液(pH7.2)，0.1％肌酸钠，1mM三乙醇胺】；

(5.2)实验方法

将S-180腹水肉瘤细胞用生理盐水配制成2×10⁹/L的细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，0.2ml/只。所有动物常规饲养^[4]。小鼠肿瘤包快长到5mm后，随机分为重组肿瘤特异性凋亡因子治疗组、GST-Apoptin融合蛋白对照组和生理盐水组，每组8只。治疗组：小鼠右侧腋部皮下注射，50μg(0.1mL)/只；对照组和生理盐水组分别注射等量、等体积的GST-Apoptin融合蛋白和生理盐水。每组小鼠每天注射1次；小鼠常规饲养，每日观察小鼠一般生活状况，肿瘤大小，每6d测量体重，于接种后3wk脱颈椎处死，分离肿 瘤组织称重。

(5.3)结果

(5.3.1)实验小鼠的一般状况，小鼠接种S-180肉瘤细胞后，各组小鼠正常喂养，接种1wk内一般生理状况没有明显变化。1wk后，与治疗组相比较，GST-Apoptin融合蛋白对照组和生理盐水组小鼠进食减少、消瘦、体重下降、皮毛失去光泽，肿瘤包块明显增大；到第2wk时，生理盐水组小鼠开始出现死亡；而治疗组小鼠一般状况良好。

(5.3.2)3wk后活杀小鼠，取肿瘤组织称瘤重，治疗组的瘤重为(0.56±0.41)g，抑瘤率为60.06％；GST-Apoptin融合蛋白对照组的瘤重为(1.36±0.55)g，抑瘤率为4.22％。以生理盐水组的瘤重为基数，计算出的治疗组和GST-Apoptin融合蛋白对照组的抑瘤率差异显著(p＜0.01)(图6)。

本发明的有益效果是：在大肠杆菌中高效表达、稳定好、纯度高且有高活性，治疗效果显著，特别是实施本发明对生产设备没有特殊的要求，适合规模化和产业化，对于人类攻克肿瘤、延长人类寿命具有重要意义。

序列1 GST-Apoptin融合蛋白氨基酸序列：

Chicken anemia virus

Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg

1               5                   10                  15                  20

Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys

    25                  30                  35                  40                  45

Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe

        50                  55                  60                  65                  70

Lys Asn Val Gln Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser

                75                  80                  85                  90

Glu Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg Thr Ala Arg

    95                  100                 105                 110                 115

Arg Arg Ile Arg Leu

            120

序列2 GST-Apoptin融合蛋白核苷酸序列

5’-GAA TTC ATG AAC GCT CTC CAA GAA GAT ACT CCA CCC GGA CCA TCA ACG   48

    GTG TTC AGG CCA CCA ACA AGT TCA CGG CCG TTG GAA ACC CCT CAC TGC   96

    AGA GAG ATC CGG ATT GGT ATC GCT GGA ATT ACA ATC ACT CTA TCG CTG  144

    TGT GGC TGC GCG AAT GCT CGC GCT CCC ACG CTA AGA TCT GCA ACT GCG  192

    GAC AAT TCA GAA AGC ACT GGT TTC AAG AAT GTG CAG GAC TTG AGG ACC  240

    GAT CAA CCC AAG CCT CCC TCG AAG AAG CGA TCC TGC GAC CCC TCC GAG  288

    TAC AGG GTA AGC GAG CTA AAA GAA AGC TTG ATT ACC ACT ACT CCC AGC  336

    CGA CCC CGA ACC GCA AGA AGG CGT ATA AGA CTG TAA GTC GAC-3’      378

Claims (5)

1.一种制备具有活性的重组肿瘤特异性凋亡因子的方法，其特征是：

(1)通过人工合成的方法直接获得Apoptin的基因片段，构建含GST-Apoptin基因的原核表达载体pGEX-A；

(2)GST-Apoptin融合蛋白的发酵、高效表达、溶解、复性及纯化，具体是：将(1)表达GST-Apoptin融合蛋白的工程菌接种到含氨苄青霉素的液体肉汤培养基中，37℃摇床内培养，将菌液按比例转种到含AP的LB培养基中扩增，37℃摇床内培养，菌液浓度达到光密为1.0时按比例接种到发酵罐内，待菌液浓度达到光密为2.0后，加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导剂；诱导培养4h，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0值，收集上述发酵液；离心收集菌体，高压匀浆破碎菌体，离心收集沉淀，即为包涵体；取包涵体，加入包涵体溶解液磁力搅拌溶解4h；离心收集上清液；按比例缓慢加入复性液，室温磁力搅拌溶解4h；4℃复性12h以上；超滤浓缩；将上述浓缩的复性液通过用平衡液平衡的琼脂糖凝胶层析柱，收集目的峰；将目的峰再上用平衡液平衡好的去内毒素亲和层析柱，收集洗脱峰即为纯化的重组肿瘤特异性凋亡因子；

(3)GST-Apoptin融合蛋白的化学修饰，将上步骤后的GST-Apoptin与叶酸连接，使GST-Apoptin获得活性，诱导肿瘤细胞凋亡作用。

2.一种权利要求1所述的制备具有活性的重组肿瘤特异性凋亡因子的方法获得的制品，其特征是：它用于抗肿瘤治疗。

3.按照权利要求1所述的制备具有活性的重组肿瘤特异性凋亡因子的方法，其特征是：所说的(2)GST-Apoptin融合蛋白的发酵、高效表达、溶解、复性及纯化是：

(2.1)工程菌的活化、发酵及包涵体的回收，取-70℃保存的工程菌种接种到含AP的营养琼脂平板培养基上，37℃培养12h以上；挑取单个菌落接种到含AP的LB液体培养基中，37℃摇床内培养12h以上，将菌液按1∶10比例接种到发酵罐内，37℃条件下培养；待菌液浓度达到2.0OD后，加入IPTG诱导剂；诱导培养4h，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0值。离心收集菌体，菌体用PB缓冲液悬浮，冰浴条件下，高压匀浆破碎菌体，反复4次。离心破碎后的菌体，收集沉淀，即为包涵体；

(2.2)包涵体的溶解和复性称取适量包涵体，加入包涵体溶解液，室温条件下，磁力搅拌溶解4h；离心4℃，9000rpm，15min，收集上清液；按1∶8比例缓慢加入复性液，室温磁力搅拌溶解4h；4℃复性12h以上；超滤浓缩20倍以上，立即纯化或-20℃保存备用；

(2.3)肿瘤特异性凋亡因子纯化用平衡液平衡Separose12层析柱；将上述浓缩的复性液按床体积的3％比例上样，流速为2ml/min；分步收集第2个峰；SDS电泳鉴定后，取分子量为39kD纯度高的蛋白质部分；将上述样品再上用平衡液平衡好的FF层析柱或-20℃保存备用，按床体积75％比例上样，样品在柱内留置1h后，用平衡液洗脱；收集洗脱峰，-20℃保存待鉴定；

(2.4)纯化的肿瘤特异性凋亡因子鉴定采用SDS电泳法或高效液相法测定蛋白质纯度，纯度在95％以上，采用紫外分光光度计测定蛋白质含量，大约在0.5mg/ml；采用鲎试剂法测定蛋白质样品内的内毒素含量，1∶200合格；

上述各液体配方范围及准备如下：

营养琼脂培养基平皿是，按1.5％的浓度称取营养琼脂，加适量的注射用水，高压灭菌，待培养基冷却到45℃时，加入氨苄青霉素(AP)，终浓度为100μg/ml)，然后将琼脂倒入平皿，待琼脂凝固后，4℃保存备用，(可用1～2周)。

LB液体培养基是，以1000ml为单位按下列比例配制：溶解后高压灭菌。

蛋白胨     10g

酵母提取物 5g

NaCl       1g

发酵液是，以20L为单位按下列比例配制，发酵罐内高压灭菌。

蛋白胨                  200g

酵母提取物              100g

NaCl                    20g

CaCl                    2g

NH₄Cl                   30g

葡萄糖                  100g(单独高压，8磅)

磷酸二氢钠.2H₂O         30g

磷酸氢二钠.12H₂O        120g

补料液是，以1000ml为单位按下列比例配制。

蛋白胨                  100g

酵母提取物              100g

葡萄糖                  200g(700ml水溶解单独高压，8磅)

1mol IPTG(1000倍)是，过滤除菌，-20℃保存。

IPTG                    0.48g

水                      20ml

氨苄青霉素(AP，5000倍)，应用浓度为100μg/ml

AP                      500mg

水                      5ml

20mmol PB缓冲液(pH7.2)以1000ml为单位按下列比例配制。

磷酸二氢钠.2H₂O         3.12g

磷酸氢二钠.12H₂O        7.16g

EDTA                    0.37g

20mmol PB缓冲液(pH8.0)以1000ml为单位按下列比例配制。

磷酸二氢钠.2H₂O         3.12g

磷酸氢二钠.12H₂O        7.16g

EDTA                    0.37g

包涵体溶解液，以100ml为单位按下列比例配制。

20mmol PB缓冲液(pH8.0)  100ml

肌酸钠(1.0％-3.0％)     1.0～3.0g

三乙醇胺(10-30mM)       0.13～0.66ml

DTT(10-30mM)            0.15～0.45g

复性液，以1000ml为单位按下列比例配制。

20mmol PB缓冲液(pH8.0)  1000ml

DTT(10-30mM)            1.5～4.5g

平衡液，以1000ml为单位按下列比例配制。

20mmol PB缓冲液(pH7.2)  1000ml

肌酸钠(0.1％-1.0％)     0.1～1.0g

三乙醇胺(1mM)           0.132ml

包涵体洗涤液以1000ml为单位按下列比例配制。

20mmol PB缓冲液(pH7.2)  1000ml

TritonX-100(0.1％)      0.1ml

尿素(2mol)              120g。

4.按照权利要求1所述的制备具有活性的重组肿瘤特异性凋亡因子的方法，其特征是：所说的(3)GST-Apoptin融合蛋白的化学化修饰步骤是，采用戊二醛法按下列比例配制GST-Apoptin融合蛋白与叶酸连接体系，具体是体积相同的0.2mg/ml GST-Apoptin融合蛋白和1.0mg/ml叶酸，再加入微量的戊二醛，将配制好的连接体系，置于室温25℃以上避光放置3h；将连接液对磷酸盐缓冲液透析，4℃，12h以上；过滤除菌。

5.按照权利要求4所述的制备具有活性的重组肿瘤特异性凋亡因子的方法，其特征是：所说的GST-Apoptin融合蛋白与叶酸连接体系是，用磷酸盐缓冲液按下列比例配制重组肿瘤特异性凋亡因子与叶酸连接体系，

0.2mg/ml重组肿瘤特异性凋亡因子  1ml

1.0mg/ml叶酸                    1ml

戊二醛(原液125倍)               16μl

将配制好的连接体系，置于室温25℃以上避光放置3h；将连接液对1000ml磷酸盐缓冲液透析，4℃，12h以上。

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