CN100451034C - 猪γ干扰素及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪γ干扰素及其编码基因与应用。该猪γ干扰素，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α干扰素相关功能的蛋白质。本发明猪γ干扰素可作为活性成分制备猪病毒感染性疾病的抗感染药物。本发明的设计合成的在大肠杆菌能高效表达猪γ干扰素编码基因，在大肠杆菌中高效表达，表达量达菌体总蛋白的60%以上，周期短，成本低。

Description

猪γ干扰素及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种猪γ干扰素及其编码基因与应用。

背景技术

干扰素是细胞对病毒感染或各种合成及生物诱生作用反应，而产生并分泌的一类天然生成的蛋白分子，分子量为15,000-21,000道尔顿。已经确定的干扰素有两大类：I型和II型。I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-τ四个亚型，II型干扰素主要有IFN-γ。

猪干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ亚型的均已有基因序列报道，并在原核或真核表达系统中实现重组表达，表达产物具有抗病毒活性，为基因工程干扰素的规模化生产和应用提供了依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪γ干扰素及其编码基因与其表达方法。

本发明所提供的猪γ干扰素，名称为PoIFN-γ，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有γ型干扰素功能的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列1由146个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的PoIFN-γ分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的PoIFN-γ便于纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK

Strep-tag ll	8	WSHPQFEK
			c-myc	11	EQKLISEEDL

上述(b)中的PoIFN-γ可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的PoIFN-γ的编码基因可通过将序列表中SEQID №：2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述猪γ干扰素的编码基因(PoIFN-γ)也属于本发明的保护范围。

鉴于密码子的兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏向性，本发明设计合成了含大肠杆菌喜好密码子的猪γ干扰素的编码基因，从而提高基因的表达水平。

所述猪γ干扰素的编码基因，是优化的猪γ干扰素基因，具体可为如下1)、2)或3)的基因：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在严格条件下与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

序列表中序列2是由441个脱氧核苷酸组成，自5′端第1-439位核苷酸序列为编码序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列。

含有上述基因的重组表达载体、工程菌和转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的表达猪γ干扰素的方法，是将上述PoIFN-γ通过表达载体导入大肠肝菌，筛选得到表达猪γ干扰素的工程细胞，培养工程细胞，表达得到猪γ干扰素。

所述表达载体可为pBV220、pET载体系列、pQE载体系列或pPIC9K，优选为pBV220。

所述大肠肝菌可为E.coli DH5α、E.coli TB1或E.coli BL21DE3等。

所述PoIFN-γ插入pBV220的BamHI和EcoRI的酶切位点间。

所述表达为诱导表达，即需42℃进行诱导表达，诱导时间优选为6小时。

本发明所提供的猪γ干扰素具备γ型干扰素的特征。该蛋白质对猪流行性腹泻、传染性胃肠炎、轮状病毒感染、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)、圆环病毒II型感染、伪狂犬病、猪流感、水疱病、细小病毒病具有抗感染作用。本发明的猪γ干扰素的编码基因在大肠杆菌能高效表达猪γ干扰素，表达量达菌体总蛋白的60％以上，周期短，成本低。

本发明猪γ干扰素可作为活性成分制备猪病毒感染性疾病的抗感染药物。以本发明的猪γ干扰素作为活性成分制备的药物也属于本发明的保护范围。

需要的时候，在所述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述药物的用量一般为10万U/头份，连续给药或隔天给药，疗程为3-7天。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测猪γ干扰素基因在大肠杆菌中的表达产物结果

图2为经纯化的重组猪γ干扰素的SDS-PAGE检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

所有引物合成及测序工作均由北京三博远志生物公司完成。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、猪γ干扰素基因的合成及其表达

一、猪γ干扰素基因的合成

参照猪γ干扰素基因序列(GENBANK号：CAA37252)，重新优化序列，替换稀有密码子，调节AT含量，使其可在大肠杆菌和毕赤酵母中均可高效表达，交由北京三博远志生物公司采用重叠PCR的方法合成优化后目的序列，合成的序列具有序列表中序列2的核苷酸序列，将其命名为PoIFN-γ，其编码序列表中序列1的氨基酸残基序列。

二、猪γ干扰素基因的表达及其表达产物的纯化

1)含猪γ干扰素基因的大肠杆菌重组表达载体(PoIFN-γ/pBV220)的构建

将PoIFN-γ基因通过PCR引入限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切位点(其中PCR的模板为步骤一合成的PoIFN-γ基因，引物为：pBVPoIFNγfor：5’GAATTCATGAGCTATTGCCAGGCGCCGTTT 3’(EcoRI)；pBVPoIFNγrev：5’GGATCCTTATTTAGATGCGCGCTGGC 3’(BamHI))，亚克隆入pMD18-T载体(Takara)，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行基因测序，将测序表明含有PoIFN-γ基因的重组载体命名为pMD18-PoIFN-γ。

将上述构建的pMD18-PoIFN-γ用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切后插入载体pBV220的BamHI和EcoRI酶切位点之间，转化大肠杆菌DH5α。经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组菌，将经鉴定表明含有PoIFN-γ的正确的重组载体命名为PoIFN-γ/pBV220，将PoIFN-γ/pBV220转化大肠杆菌获得的含有PoIFN-γ/pBV220的阳性克隆命名为DH5α-PoIFN-γ/pBV220。扩增培养工程菌DH5α-PoIFN-γ/pBV220，30℃，200转/分(旋转半径为13mm)振摇培养菌液OD₆₀₀至1，然后部分收集菌体，另一部分继续在42℃下诱导6小时。培养结束后，5000g、离心10分钟收集菌体，将诱导后收集的菌体以及未经诱导的菌体直接进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为诱导前全菌表达产物，泳道2为诱导后全菌表达产物)，在17kD左右处出现一条蛋白条带，与猪γ干扰素蛋白大小相符，蛋白质N端测序显示N端5个氨基酸分别为Ser-Tyr-Cys-Gln-Ala，表明重组猪γ干扰素基因(PoIFN-γ)在大肠杆菌中正确表达。经薄层凝胶扫描仪确定表达产物在全菌蛋白中所占比例大于60％。

2)重组猪γ干扰素的发酵生产

a、工程菌DH5α-PoIFN-γ/pBV220种子制备

将表达工程菌DH5α-PoIFN-γ/pBV220按1％的比例接种菌液于20ml含100微克/毫升Amp的LB液体培养基中，30℃200rmp振荡培养8-10h。升温至42℃诱导培养4h，重新鉴定表明为高表达重组猪γ干扰素的工程菌DH5α-PoIFN-γ/pBV220，划平板挑取单菌5-10个菌制备种子库(挑5-10个单菌于LB中摇瓶培养OD600至0.5左右，按750ul加50％甘油250ul比例，保种数十支，-20℃保存备用。

b、工程菌DH5α-PoIFN-γ/pBV220发酵种子液制备

-20℃保存工程菌DH5α-PoIFN-γ/pBV220种子按0.05％体积的量接种于200m2*YT培养液(含有蛋白胨16克/升、酵母粉10克/升、氯化钠5克/升的培养基)中30℃220rpm培养10-12h，(1％接种培养5h)作为发酵罐用种子液。

c、工程菌DH5α-PoIFN-γ/pBV220发酵生产

菌体培养阶段：发酵培养基(蛋白胨5克/升、酵母粉5克/升、KH₂PO₄ 2克/升、K₂HPO₄ 4克/升、Na₂HPO₄·12H₂O 7克/升、(NH₄)₂SO₄ 1.2克/升、NH₄Cl 0.2克/升、MnSO₄·5H₂O 0.001克/升、CoCl₂·6H₂O 0.004克/升、Na₂MoO₄·2H₂O 0.002克/升、ZnCl₂ 0.002克/升、CuSO₄·5H₂O 0.001克/升、H₃BO₄ 0.005克/升、FeSO₄·7H₂O 0.02克/升、CaCl·2H₂O 0.02克/升、MgSo₄·7H₂O 0.3克/升、消泡剂0.2克/升)高温灭菌后，每升培养基加入1ML 100mg/ml的氨苄，按5-10％体积的量接入种子液，35℃通气搅拌培养4小时，4小时后降温于30℃继续培养，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的糖(甘油)逐渐消耗，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧回升(上升30％左右)，开始补加发酵培养基，培养过程中用3M NaOH和10％磷酸维持pH值7.2。

碳源饲喂阶段：确认上一步碳源耗完后，开始此步骤。流加补料培养基(甘油150ml/L、蛋白胨30g/L、酵母粉30g/L、MgSO₄·7H₂O 5.5mg/L)，流加速度由溶氧控制(设定DO＝30％，当DO大于30％流加泵打开流加培养基，DO逐步下降，当DO下降到30％以下流加泵关闭)，大约每小时流加26-35ml培养基，培养过程中用3M NaOH(25％氨水)和10％磷酸维持pH值7.2。溶氧维持在30％以上。30℃培养2-3小时，准备诱导。

诱导表达阶段：继续连续流加补料培养基。升温42℃诱导表达目的蛋白，培养过程中用3M NaOH和10％磷酸维持pH值7.2。溶氧维持在30％以上，诱导6小时停罐。

3)重组猪γ干扰素的纯化

取5L得到的DH5α-PoIFN-γ/pBV220发酵液，5000g、离心10分钟收集菌体，经PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L，PH 8.0)洗涤后PBS缓冲液重悬，超声(Φ10探头，超声7秒间隔5秒)30分钟，使菌体破壁，10000g，4℃，离心10分钟收集沉淀，PBS缓冲液(NaCl137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，PH 8.0)洗涤沉淀(包涵体)，然后用变性缓冲液(6mol/L盐酸胍，2mmol/L EDTA，50mmol/LTris·Cl，10mmol/L DTT，pH 8.5)溶解包涵体，10000g，4℃，离心10分钟收集上清，即变性蛋白溶液，然后将变性蛋白溶液缓慢加入复性缓冲液(0.5mol/L L-Arg；2mmol/L EDTA，20％甘油；0.9mmol/L GSSG，0.1mol/L Tris·Cl，pH 8.0)中，4℃静置48小时，10000g，4度，离心20分钟收集上清，即为含有重组猪γ干扰素蛋白的溶液。

将获得的上清溶液用醋酸调节pH值为4.8，过阳离子交换层析柱(HiTrap SP FF，Amersham Biosciences)，将样品以0.3ml/分钟的速度加入层析柱中，用PH 4.8 PBS缓冲液和1M的NaCl以1ml/分钟的速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm进行检测。收集目标洗脱峰，将收集的洗脱峰液再过Sephacry1分子筛层析柱(Amersham Biosciences)，用PH 7.2PBS缓冲液以0.4ml/分钟的速度分离目的蛋白，收集目标洗脱峰，用0.22um滤径的膜过滤除菌后纯化的DH5α-PoIFN-γ/pBV220表达的重组猪γ干扰素溶液。对纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明，纯化的样品电泳在17kD附近处出现一条蛋白条带，与预期结果相符，蛋白质N端测序显示N端5个氨基酸分别为Ser-Tyr-Cys-Gln-Ala，表明获得了的猪γ干扰素，部分检测结果如图2所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为纯化产物)。

实施例2、重组猪γ干扰素的生物学活性测定

生物学活性测定参照2005年《中华人民共和国药典》三部附录X C细胞活性抑制法，用PK15细胞(ATCC Number：CCL-33)-水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus，VSV)(ATCC Number：VR-1238AF)系统，采用CPE(细胞致病变效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。

具体方法为：取PK15细胞在96孔板中培养至全部贴壁生长后，去除培养液，分两组，一组将猪γ干扰素标准品(购自prospec公司，货号CYT-402)稀释成1000U/ml，每孔加入0.1ml 4倍(4⁰、4¹、4²、4³、4⁴……4¹¹)倍比稀释，一组每孔加入0.1ml 4倍(4⁰、4¹、4²、4³、4⁴……4¹¹)倍比稀释的实施例1获得的DH5α-PoIFN-γ/pBV220表达并经纯化的重组猪γ干扰素溶液，用100TCID₅₀剂量的水疱性口炎病毒(VSV)进行攻毒，对照孔加无病毒的培养液，同时设立阴性对照(只加经倍比稀释的重组猪γ干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加病毒)、空白对照(不加干扰素，不加病毒)，在倒置显微镜下观察标准品1U/ml的孔出现50％病变的时候判断结果。染色后在波长570nm处测定吸光度，采用四参数回归计算法进行处理，并按下式计算干扰素生物学活性。

供试品生物学活性＝Pr×[(Ds×Es)÷(Dr×Er)]

式中Pr为干扰素标准品生物学活性；

Ds为供试品预稀释倍数；

Dr为干扰素标准品预稀释倍数；

Es为供试品相当于干扰素标准品半效量的稀释倍数；

Er为干扰素标准品半效稀释倍数。

结果表明得到的DH5α-PoIFN-γ/pBV220发酵的重组猪γ干扰素活性为3.2×10⁶U/ml纯化液，其浓度为420μg/ml，比活为7.6×10⁶U/mg。

实施例3、重组猪γ干扰素的安全性实验

取体况健康的21日龄大约克仔猪和5月龄大约克育肥猪(批号分别为20060602，20060125，购自山东省农业科学院良种猪场)，各20头(雌雄各半)，各随机分为2组，每组10头，共4组(仔猪I组、仔猪II组、育肥猪I组、育肥猪II组)。按照如下方法进行一次单剂量接种的安全实验、单剂量重复接种的安全试验及一次超剂量接种的安全试验：

一次单剂量接种的安全实验：仔猪I组和育肥猪I组按照颈部肌肉接种途径接种1个剂量(10⁵U/头)注射实施例1获得的纯化重组猪γ干扰素，连续观察2周。

单剂量重复接种的安全试验：将经单剂量接种的仔猪I组和育肥猪I组，于接种后2周以相同方法再接种一次，继续观察2周。

一次超剂量接种的安全试验：仔猪II组和育肥猪II组，按照颈部肌肉接种途径接种50个剂量(25×10⁵U/头)注射实施例1获得的纯化重组猪γ干扰素，连续观察2周。

实验期间，每天观察试验动物临床症状变化，包括精神，活动，呼吸，采食，饮水，注射部位，粪及尿情况，每天测量体温，记录动物异样反应，检查注射部位有无炎症反应。如引起死亡，对死亡猪进行剖检，观察病理变化，分析原因。

经过2周或4周连续观察，对注射重组猪γ干扰素前后动物症状进行比较，发现1次单剂量注射组、单剂量重复注射组和高剂量(50个剂量)一次注射组均饮食正常，精神状态无不良变化，呼吸及排泄未见异常现象，注射部位无肿胀和发炎，期间没有发现动物有任何不良反应。整个试验期间，未见有死亡猪。注射后每天测量动物体温发现，大部分仔猪接种后体温正常，维持在39.0-39.5℃之间的范围，偶尔会在接种的第二天出现体温升高现象，但持续不超过2天时间。结果表明，实施例1制备的重组猪γ干扰素对猪的安全性很高，以超剂量(50倍正常剂量)注射猪，无显著毒副作用，是一种安全的新型抗病毒制剂。

实施例4、重组猪γ干扰素的临床试用效果

1、猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)的治疗

取经临床鉴定为患有猪繁殖与呼吸综合征的21日龄大约克仔猪、70日龄杜洛克保育猪、5月龄大约克育成猪各10头(购自山东省农业科学院良种猪场)，分为给药组和对照组，每组每种猪5只，共15只。将给药组每天按5×10⁴U/头份剂量肌肉注射实施例1获得的重组猪γ干扰素，对照组只注射安慰剂(生理盐水)，连续注射三天。每天观察试验动物，对临床症状进行评分，具体评分规则如表1所示，结果如表2所示，结果表明给药组和对照组临床症状评分统计学上存在明显差异(表2)，重组猪γ干扰素可以有效地治疗猪繁殖与呼吸综合征，发病猪病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热、呕吐、腹泻症状消失；而注射安慰剂的对照组症状无改善。

临床症状观察项目——有无食欲、是否呕吐、腹泻状况、精神状态、脱水情况、粪便性状、肛温、体重等。

临床症状评分标准——按照下表给患病猪只进行打分，分数越高，体况越差，满分20分时，代表患病猪死亡。

评分时间和频率——对试验动物从第一天开始每天评分一次。

表1.临床症状评分规则

症状	分数
		死亡	20
肛温≥39.5℃37.1-39.4℃≤37℃	123
		精神状况疲惫(有意识，有活力的)萎靡(有意识，但无活力的)昏迷(无意识的)	134
脱水5％(轻微——皮肤开始出现褶皱)8％(中等——皮肤已存在褶皱)12％(严重——休克)	134
		粪便性状液态(腹泻)血便	24
腹痛轻微严重	12
		呕吐	3

表2.临床症状评分统计结果

2、猪流行性腹泻的治疗

取经临床鉴定为患有猪流行性腹泻的21日龄大约克仔猪、70日龄杜洛克保育猪、5月龄大约克育成猪各10头(购自山东省农业科学院良种猪场)，分为给药组和对照组，每组每种猪5只，共15只。将给药组每天按5×10⁴U/头份剂量肌肉注射实施例1获得的重组猪γ干扰素，对照组只注射安慰剂(生理盐水)，连续注射三天。每天观察试验动物，对临床症状进行评分，具体评分规则如表1所示，结果如表3所示，结果表明给药组和对照组临床症状评分统计学上存在明显差异(，实施例1制备的重组猪γ干扰素可以有效地治疗猪流行性腹泻病毒感染，实施例1制备的重组猪γ干扰素治疗过的发病猪(给药组)病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热、呕吐、腹泻症状消失；而注射安慰剂的对照组症状无改善。

表3.临床症状评分统计结果

序列表

<160>2

<210>1

<211>146

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Ser Tyr Cys Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Asp

1               5                   10                  15

Tyr Phe Asn Ala Ser Thr Ser Asp Val Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe

            20                  25                  30

Leu Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile

        35                  40                  45

Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys

    50                  55                  60

Asp Asn Gln Ala Ile Gln Arg Ser Met Asp Val Ile Lys Gln Asp Met

65                  70                  75                  80

Phe Gln Arg Phe Leu Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu

                85                  90                  95

Lys Leu Ile Lys Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala

            100                 105                 110

Ile Ser Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn

        115                 120                 125

Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala

    130                 135                 140

Ser Lys

145

<210>2

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agctattgcc aggcgccgtt ttttaaagaa atcacgatcc tgaaagacta ttttaacgct     60

tcgacctcgg atgttccgaa cggtggcccg ctgtttctgg aaattctgaa aaactggaaa    120

gaagaatctg acaaaaaaat cattcagagc cagattgtct ccttttactt caaattcttt    180

gaaatcttca aagataacca ggccattcag cgtagcatgg atgtgatcaa acaggacatg    240

tttcagcgtt tcctgaatgg tagctctggc aaactgaatg acttcgaaaa actgattaaa    300

attccggtgg ataatctgca gatccagcgc aaagccatct ctgaactgat caaagtgatg    360

aatgatctgt ctccgcgttc taacctgcgt aaacgcaaac gctctcagac catgttccag    420

ggccagcgcg catctaaata a                                              441

Claims (12)

1、猪γ干扰素，其氨基酸残基序列如序列表中序列1所示。

2、权利要求1所述的猪γ干扰素的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述猪γ干扰素的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5、含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6、含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7、一种表达猪γ干扰素的方法，是将权利要求2或3所述的猪γ干扰素基因通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达猪γ干扰素的工程细胞，培养工程细胞，表达得到猪γ干扰素。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：当所述宿主细胞为大肠杆菌，用于构建所述表达载体的出发载体为pBV220。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α；所述猪γ干扰素基因插入到pBV220的BamHI和EcoRI的酶切位点间。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述工程菌在42℃条件下进行诱导表达，诱导时间为6小时。

11、以权利要求1所述的猪γ干扰素为活性成分制备的猪病毒感染性疾病的抗感染药物。

12、以权利要求2或3所述的猪γ干扰素的编码基因为活性成分制备的猪病毒感染性疾病的抗感染药物。

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