CN111500609A - 一种抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途，所述制备方法采用热休克蛋白90及甘露糖蛋白65两种的原核表达的重组蛋白1:1混合物作为抗原制备特异性卵黄抗体，最终制得的卵黄抗体具有杀菌消毒功能，能够预防和治疗白色念球菌引起的真菌感染，该发明规避了用菌体直接作为抗原抗体产生的成分复杂、特异性和中和性不强的缺点，且制备的卵黄抗体无毒副作用，成本低廉，利于大规模生产。

Description

一种抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，特别涉及一种白色念株菌卵黄抗体的制备方法，由该方法制备的卵黄抗体及其在杀菌消毒方面的用途，尤其是在预防和治疗白色念球菌引起的真菌感染上的用途。

背景技术

白色念珠菌(C.albicans)是一种重要的人体致病真菌，革兰氏染色呈阳性，外形呈卵圆形念珠状，通常寄生于人口腔、胃肠道、女性生殖道黏膜及体表潮湿部位，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，但当机体免疫功能或机体防御力下降时，白色念珠菌会在黏膜下大量繁殖，随后侵入深层组织，可引起反复性的浅表黏膜感染或者严重的系统感染。通常表现为阴道炎、鹅口疮等。

由于对念珠菌现有的基础研究有限，目前临床上用于预防和治疗念珠菌病的药物也非常有限，常用的抗真菌类药物如伊曲康唑、克霉唑、咪康唑、两性霉素B等均易产生耐药性，且易产生过敏及毒副作用，对于轻微的感染及日常预防来说更易于采用无毒的生物制剂来完成。

卵黄抗体是一种采自于鸡蛋中高产的生物抗体制剂，是免疫禽蛋中提取的针对特定抗原的抗体。在卵黄中仅含有IgG，禽类抗体简称为IgY。产蛋鸡注射抗原免疫后，鸡法氏囊内的B细胞随即分化成为浆细胞，分泌针对特异性抗原的特异性抗体，这些抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，其在卵细胞中大量蓄积，且其浓度远高于血液中的浓度，据报道单个卵黄中抗体含量可达200mg，这些优势为卵黄抗体的大规模生产和提纯创造了条件。且卵黄抗体在多种温湿度、酸碱性等环境中有较好的稳定性。为其大规模应用又创造了生产和保存条件。卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，经过5次冻融，其抗原结合活性几乎都不受影响。这也为卵黄抗体的工业化生产灌装，衍生抗体制剂创造了条件。

发明内容

基于当前卵黄抗体在杀菌消毒市场上，尤其是在预防及治疗白色念珠菌感染市场上的空白及市场需求，本发明目的在于提供了抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途，具体是运用热休克蛋白90(Hsp90)、甘露糖蛋白65(MP65)两种抗原制备的卵黄抗体，并公开了将其用于预防及治疗白色念球菌病感染的医学用途。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明提供了一种重组DNA，重组DNA片段中包含白色念球菌热休克蛋白90核苷酸和甘露糖蛋白65核苷酸，所述热休克蛋白90的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述甘露糖蛋白65的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种由重组DNA作为抗原制备的卵黄抗体。

本发明提供的免疫性抗原包含热休克蛋白90抗原的氨基酸序列和甘露糖蛋白65的氨基酸序列，优选的热休克蛋白90抗原的氨基酸如SEQ ID NO：1所示，优选的甘露糖蛋白65的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，卵黄抗体的制备方法，如下：

(1)抗原制备：选取白色念球菌热休克蛋白90核苷酸及甘露糖蛋白65核苷酸序列全长作为抗原序列，表达，复性蛋白，作为免疫用抗原；

(2)免疫蛋黄的获取：用(1)中所述免疫抗原注射产蛋鸡，收集鸡胚，提取卵黄；

(3)卵黄抗体的提取纯化：收集(2)所述的卵黄，离心、透析、并进行溶液处理、最终得到卵黄抗体纯品。

进一步的，上述卵黄抗体的制备方法中，所述免疫用抗原中热休克蛋白90及甘露糖蛋白65两种抗原的混合比例为1∶1。

进一步的，所述的免疫卵黄的获取方法如下：每次每只注射2mg抗原，首次免疫两周后进行免疫加强，后每个15天进行一次免疫加强，免疫三次后再加强免疫一次，加强免疫10天后收集的鸡胚提取的卵黄。

进一步的，所述的卵黄抗体的提取纯化方法如下：

(1)卵黄加磷酸盐缓冲液匀浆，静置，离心，透析后截留分子量为150KD的抗体粗品，通过磷酸盐缓冲液透析，并在37℃重溶解15min后所得溶液为卵黄抗体粗溶液；

(2)向(1)中所得卵黄抗体粗溶液中等体积加入饱和硫酸铵溶液，得到沉淀；

(3)将(2)的沉淀以PBS缓冲液溶解，硫酸铵溶液处理后，静置得到沉淀物及为卵黄抗体粗纯品；

(4)测定卵黄抗体的纯度，重复(2)(3)步骤直至卵黄抗体纯度达到80％，将制备的卵黄抗体放置于4℃备用，长期保存加入冻干保护剂，冻干保存。

本发明提供了一种卵黄抗体在制备消毒杀菌制剂中的应用。

进一步的，卵黄抗体在制备消毒杀菌制剂中的应用，具体为预防和治疗白色念球菌引起的真菌感染。

卵黄抗体在制备消毒杀菌剂包括软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、擦剂、喷雾剂、气雾剂、油制剂或透皮贴剂。同时可以将卵黄抗体用于制备用于消毒预防感染用的纸巾、擦剂、洗护剂、牙膏和漱口水。

本发明具有以下优点及有益效果：

本发明应用白色念株菌热休克蛋白90、甘露糖蛋白65全长作为抗原，其特异性高针对性强，优于全菌体作为抗原，不产生其余非针对性，中和性不强的抗体，且其诱导产生的卵黄抗体可有效的结合到白色念珠菌的不同部位，降低感染风险。

本发明用于预防及治疗白色念球菌感染时具有成分安全，不产生耐药性的优点。

本发明提供的制备的卵黄抗体的方法，成本低廉，工艺简单，易于大规模生产。

具体实施方式

实施例1

抗原制备：

根据GENBANK中获取白色念株菌热休克蛋白90、甘露糖蛋白65基因全长，查找开放阅读框，获得其核苷酸序列，其中热休克蛋白90抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述甘露糖蛋白65的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

甘露糖蛋白65核苷酸序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并测序。

设计引物并合成引物，热休克蛋白90、甘露糖蛋白65引物序列如下：

Hsp90上游：5’-TCAGGATCCATGGCTGACGCAAAAG-3’(SEQ ID NO：5)；

Hsp90下游：5’-GACCTCGAGTTAATCAACTTCCAT-3’(SEQ ID NO：6)；

MP65上游：5’-TCAGAATTCATGTTATTCAAGTCTT-3’(SEQ ID NO：7)；

MP65下游：5’-CGCCTCGAGTTAGTTAGAGTAAA-3’(SEQ ID NO：8)。

引物同样交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物合成后超纯水稀释(按照引物合成管上的标注体积稀释)。保存在-20℃备用。

按照下表的反应体系PCR扩增基因片段，并凝胶回收(按照天根生化科技(北京)有限公司试剂盒操作说明书操作)。

PCR反应体系为：模板(合成产物)1μL；上游引物1μL；下游引物1μL；2×Master Mix10μL；水8μL。

PCR反应条件为：95℃10min；94℃90s，53℃90s，72℃90s，共30个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将PCR产物和pMD-18T连接8h，连接产物加入感受态E.coli Top10中冰浴30min，42℃热休克90s，随后立即冰浴2-3min。涂板(含氨苄西林100μg/ml的LB平板)37℃培养过夜。

挑取阳性菌落并接入LB培养基摇菌，提取质粒(按照天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒操作说明书操作)，经PCR及双酶切鉴定，重组质粒送生北京工生物工程有限公司测序。双酶切(预留的双酶切位点)重组克隆质粒阳性质粒和表达载体pET-32a(+)，回收目的基因基因片段和切开的pET-32a(+)载体，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌BL21中，挑取阳性菌落，并提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定；鉴定正确的重组质粒送北京生工生物工程有限公司测序。

挑取含有阳性质粒的单菌落，加入含50μg/ml卡那霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液A600达0.5时，加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导表达，37℃振荡诱导培养4h后离心，收集菌体。取5ml菌液，4℃，5000g/min离心3min，超声破碎后，加入SDS上样Buffer，煮沸10min，进行SDS-PAGE鉴定。

在5ml的LB培养基内加入5μl阳性菌种，及5μl卡那霉素，37℃摇菌，当OD值达到2时，转接入1L LB培养基中，继续摇菌2h，加入终浓度为1μg/mg的IPTG诱导表达4h。8000g离心3min收集菌体，菌体收集完之后用PBS洗两遍，去除培养基，超声破碎(130W，30min)。超声产物，12000g，离心15min，去除上清，含8M尿素的Banding Buffer 4℃溶解1h。尿素梯度复性，复性后的蛋白加入经处理后的Ni蛋白亲和柱，加入蛋白溶解液，流量为1ml/min。Elution Buffer洗脱，流量1ml/min。将所获得的蛋白样品，加入处理好的透析袋中，封口放入PBS中，搅拌，4℃透析，透析4次，每次3h。将透析袋放入PEG20000后，30min，等浓缩完，可加入一定量的PBS溶解。所得蛋白即为白色念株菌热休克蛋白90、甘露糖蛋白65免疫抗原。

实施例2

免疫及抗体制备：

选取20周龄产蛋母鸡10只；将制备的白色念株菌热休克蛋白90、甘露糖蛋白65免疫抗原1∶1混合。PBS稀释到4mg/ml，1∶1加入弗氏完全佐剂超声乳化(130W，5min)。

采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射1mL，及每只鸡免疫2mg抗原(1mg热休克蛋白90；1mg甘露糖蛋白65)。首次免疫两周后进行第一次加强免疫，佐剂替换为弗氏不完全佐剂，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫4次，从第一次加强免疫10天开始收集免疫鸡蛋，连续收集三个月的免疫鸡蛋，按照天数进行编号，并存放于4℃。

收集高免鸡胚，并用清水将表面进行清洗除去粪便等污物，碘伏涂抹表面消毒，用镊子敲破壳，鸡胚倒入平皿内，只取卵黄并加入磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)匀浆(鸡胚∶PBS为1∶2体积比)。4℃静置6h，溶解蛋白及抗体，然后以8000r/min的转速离心15min，取上清。将上清分批加入到150KD的透析袋中，封闭两端，将透析袋放入PH＝7.2的PBS中，4℃透析8h，透析完样品移入截留分子量为150KD的超离管中，10000r/min的转速离心10min，最后取1/10透析液体积的磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)，加入超离管中，37℃溶解15min，所得溶液为制备的卵黄抗体。

重溶后的液体滴入与滤液等体积的饱和硫酸铵溶液，然后4℃静置过夜，4℃，10000r/min离心10min，得到沉淀，沉淀再用PBS缓冲液(pH＝7.2)溶解，再加入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置2h；4℃，10000r/min离心20min，得到沉淀物及为卵黄抗体粗纯品。SDS-PAGE测定卵黄抗体的纯度，重复饱和硫酸铵沉淀步骤，直至纯度达到80％，将制备的卵黄抗体放置于4℃备用，长期保存加入冻干保护剂，冻干保存。

实施例3

应用实例：

实验依据《中国药典》2015版通则1201抗生素微生物检定法及美国临床

实验室标准委员会(NCCLS)推荐的标准方法(K-B法)对待测样品抑菌效力进行检测评价。

表1卵黄抗体体外抑制白色念珠菌结果

	抑菌环直径(m)	抑菌圈面积(mm)
			氟氟胞嘧啶(1μg)	0	0
氟康唑(25μg)	13.58	144.89
			酮康唑(15μg)	22.53	398.50
伊曲康唑(10μg)	19.04	284.83
			卵黄抗体(5mg)	12.77	128.01

表2白色念球菌MIC测试

通过抑菌圈测试及最低抑菌浓度测试，可知卵黄抗体具有一定的抑菌效果。其适用于体表及腔室清洗消毒应用。

实施例4

选取SPF级KM小鼠对卵黄抗体抗白色念珠菌感染进行研究，选用阴道炎模型，在感染前6d开始，每只小鼠每两天背部皮下注射1mg/ml的苯甲酸雌二醇油剂0.1ml，最后一次注射后，于小鼠阴道接种白色念珠菌1.0×10⁷CFU/只，24h后重复感染1次。感染后48h和72h分别取阴道分泌物进行涂片镜检，观察菌丝及芽生孢子生成情况，同时接种于沙氏琼脂平板上，观察菌株的生长情况；并观察阴道分泌物等变化。取造模成功的小鼠，每只用0.5ml无菌生理盐水进行阴道冲洗，将冲洗液进行菌落计数，根据小鼠阴道的菌落计数将其随机分为3组，分别为卵黄抗体组(1g/kg体重；PBS稀释)、阳性药物克霉唑组(50mg/kg体重)、模型组，每组10只；另以10只不感染白色念珠菌的小鼠作为空白对照。采用阴道内给药对模型小鼠进行治疗，每天1次，连续20天，模型组用生理盐水。治疗结束后对小鼠阴道进行菌落计数，统计分析小鼠阴道内菌落数的变化情况，观察药物对感染小鼠阴道内白色念珠菌的杀灭或抑制作用。

表3治疗前后白色念株菌数量统计

由上表可见，阳性药组菌落数明显减少，白色念球菌基本治愈，卵黄抗体组治疗前后菌落计数也明显减少(P＜0.01)，说明卵黄抗体也对白色念珠菌的阴道感染有显著的治疗作用，其虽没有完全治愈感染，但其明显减少了感染白色念球菌的数量，与对照组比较效果显著(P＜0.01)，与治疗前比较，菌落数也具有较大程度上的降低(P＜0.01)，综上所述，卵黄抗体制剂适用于白色念珠菌轻度感染或感染后作为洗剂辅助治疗应用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 徐晓芳

<120> 一种抗白色念球菌重组抗原及卵黄抗体的制备方法和用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 707

<212> PRT

<213> 白色念珠菌(C.albicans)

<400> 1

Met Ala Asp Ala Lys Val Glu Thr His Glu Phe Thr Ala Glu Ile Ser

1 5 10 15

Gln Leu Met Ser Leu Ile Ile Asn Thr Val Tyr Ser Asn Lys Glu Ile

20 25 30

Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile

35 40 45

Arg Tyr Gln Ala Leu Ser Asp Pro Ser Gln Leu Glu Ser Glu Pro Glu

50 55 60

Leu Phe Ile Arg Ile Ile Pro Gln Lys Asp Gln Lys Val Leu Glu Ile

65 70 75 80

Arg Asp Ser Gly Ile Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu Val Asn Asn Leu

85 90 95

Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Lys Ser Phe Met Glu Ala Leu Ser

100 105 110

Ala Gly Ala Asp Val Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr

115 120 125

Ser Leu Phe Leu Val Ala Asp His Val Gln Val Ile Ser Lys His Asn

130 135 140

Asp Asp Glu Gln Tyr Val Trp Glu Ser Asn Ala Gly Gly Lys Phe Thr

145 150 155 160

Val Thr Leu Asp Glu Thr Asn Glu Arg Leu Gly Arg Gly Thr Met Leu

165 170 175

Arg Leu Phe Leu Lys Glu Asp Gln Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Arg

180 185 190

Ile Lys Glu Val Val Lys Lys His Ser Glu Phe Val Ala Tyr Pro Ile

195 200 205

Gln Leu Val Val Thr Lys Glu Val Glu Lys Glu Val Pro Glu Thr Glu

210 215 220

Glu Glu Asp Lys Ala Ala Glu Glu Asp Asp Lys Lys Pro Lys Leu Glu

225 230 235 240

Glu Val Lys Asp Glu Glu Asp Glu Lys Lys Glu Lys Lys Thr Lys Thr

245 250 255

Val Lys Glu Glu Val Thr Glu Thr Glu Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro

260 265 270

Leu Trp Thr Arg Asn Pro Ser Asp Ile Thr Gln Asp Glu Tyr Asn Ala

275 280 285

Phe Tyr Lys Ser Ile Ser Asn Asp Trp Glu Asp Pro Leu Ala Val Lys

290 295 300

His Phe Ser Val Glu Gly Gln Leu Glu Phe Arg Ala Ile Leu Phe Val

305 310 315 320

Pro Lys Arg Ala Pro Phe Asp Ala Phe Glu Ser Lys Lys Lys Lys Asn

325 330 335

Asn Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Thr Asp Asp Ala Glu

340 345 350

Glu Leu Ile Pro Glu Trp Leu Ser Phe Ile Lys Gly Val Val Asp Ser

355 360 365

Glu Asp Leu Pro Leu Asn Leu Ser Arg Glu Met Leu Gln Gln Asn Lys

370 375 380

Ile Leu Lys Val Ile Arg Lys Asn Ile Val Lys Lys Met Ile Glu Thr

385 390 395 400

Phe Asn Glu Ile Ser Glu Asp Gln Glu Gln Phe Asn Gln Phe Tyr Thr

405 410 415

Ala Phe Ser Lys Asn Ile Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Ala Gln Asn

420 425 430

Arg Gln Ser Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe Tyr Ser Thr Lys Ser Ser

435 440 445

Glu Glu Met Thr Ser Leu Ser Asp Tyr Val Thr Arg Met Pro Glu His

450 455 460

Gln Lys Asn Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Ile Lys Ala Val Glu

465 470 475 480

Lys Ser Pro Phe Leu Asp Ala Leu Lys Ala Lys Asn Phe Glu Val Leu

485 490 495

Phe Met Val Asp Pro Ile Asp Glu Tyr Ala Met Thr Gln Leu Lys Glu

500 505 510

Phe Glu Asp Lys Lys Leu Val Asp Ile Thr Lys Asp Phe Glu Leu Glu

515 520 525

Glu Ser Asp Glu Glu Lys Ala Ala Arg Glu Lys Glu Ile Lys Glu Tyr

530 535 540

Glu Pro Leu Thr Lys Ala Leu Lys Asp Ile Leu Gly Asp Gln Val Glu

545 550 555 560

Lys Val Val Val Ser Tyr Lys Leu Val Asp Ala Pro Ala Ala Ile Arg

565 570 575

Thr Gly Gln Phe Gly Trp Ser Ala Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala

580 585 590

Gln Ala Leu Arg Asp Thr Thr Met Ser Ser Tyr Met Ser Ser Lys Lys

595 600 605

Thr Phe Glu Ile Ser Pro Ser Ser Pro Ile Ile Lys Glu Leu Lys Lys

610 615 620

Lys Val Glu Thr Asp Gly Ala Glu Asp Lys Thr Val Lys Asp Leu Thr

625 630 635 640

Thr Leu Leu Phe Asp Thr Ala Leu Leu Thr Ser Gly Phe Thr Leu Asp

645 650 655

Glu Pro Ser Asn Phe Ala His Arg Ile Asn Arg Leu Ile Ala Leu Gly

660 665 670

Leu Asn Ile Asp Asp Asp Ser Glu Glu Thr Ala Val Glu Pro Glu Ala

675 680 685

Thr Thr Thr Ala Ser Thr Asp Glu Pro Ala Gly Glu Ser Ala Met Glu

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Glu Val Asp

705

<210> 2

<211> 379

<212> PRT

<213> 白色念珠菌(C.albicans)

<400> 2

Met Leu Phe Lys Ser Phe Val Thr Phe Thr Val Leu Ala Asn Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Ala His Gln His His Gln His Lys Glu Glu Lys Arg

20 25 30

Ala Val His Val Val Thr Thr Thr Asn Val Val Val Val Thr Ile Gly

35 40 45

Asn Gly Asp Gln Thr Thr Thr Phe Ala Ala Pro Ser Val Ala Ala Asp

50 55 60

Ser Ser Val Ser Val Ser Val Asn Thr Glu Pro Pro Gln Asn His Pro

65 70 75 80

Thr Thr Thr Gln Asp Val Ala Ser Ala Ser Thr Tyr Pro Ser Ser Thr

85 90 95

Asp Gly Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Gln

100 105 110

Ala Gly Ser Glu Pro Ser Gly Gly Val Gly Ser Gly Gly Ala Lys Gly

115 120 125

Ile Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Asp Asn Gly Gly Cys Lys Ser Ser Ser

130 135 140

Gln Ile Ala Ser Glu Ile Ala Gln Leu Ser Gly Phe Asn Val Ile Arg

145 150 155 160

Leu Tyr Gly Val Asp Cys Asp Gln Val Ala Ala Val Leu Ile Ala Lys

165 170 175

Thr Ser Ser Gln Lys Ile Phe Ala Gly Ile Phe Asp Val Ser Ser Ile

180 185 190

Thr Ser Gly Ile Glu Ser Leu Ala Glu Ala Val Lys Ser Ile Cys Gly

195 200 205

Ser Trp Asp Asp Ile Tyr Thr Val Ser Ile Gly Asn Glu Leu Val Asn

210 215 220

Ala Gly Ser Ala Thr Pro Ser Gln Ile Lys Ala Tyr Val Glu Glu Gly

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Arg Lys Ala Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Gly Pro Val Val Ser Val

245 250 255

Asp Thr Phe Ile Ala Val Ile Asn Asn Pro Asp Leu Cys Asp Tyr Ser

260 265 270

Asp Tyr Met Ala Val Asn Ala His Ala Phe Phe Asp Gly His Val Ala

275 280 285

Ala Glu Asn Ser Gly Ala Trp Val Leu Gln Gln Ile Gln Arg Val Trp

290 295 300

Thr Ala Cys Gly Gly Lys Lys Asn Val Leu Ile Thr Glu Thr Gly Trp

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Pro Ser Arg Gly Asp Ser Asn Gly Val Ala Val Pro Ser Lys Ser Asn

325 330 335

Gln Gln Ala Ala Ile Ser Ser Ile Lys Ser Ser Cys Gly Ala Ser Ala

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Ile Leu Phe Thr Ala Phe Asn Asp Leu Trp Lys Ala Asp Gly Pro Tyr

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<210> 3

<211> 2124

<212> DNA

<213> 白色念珠菌(C.albicans)

<400> 3

atggctgacg caaaagttga aactcacgaa ttcactgctg agatctctca gttgatgtct 60

ttgatcatta acacagtcta ttcaaacaag gaaattttct taagagaatt gatctccaat 120

gcttctgatg ctttggacaa aatcagatac caagccttgt ctgatccatc ccaattggaa 180

tccgaaccag aattgttcat tagaatcatc cctcaaaagg accaaaaagt tttggaaatt 240

agagattctg gtattggtat gaccaaagct gacttggtca acaatttggg tactattgct 300

aaatctggta ccaaatcctt tatggaagct ttaagtgctg gtgctgacgt ttctatgatt 360

ggtcaatttg gtgttggttt ctactccttg ttcttggttg ctgatcacgt ccaagttatc 420

tccaaacaca atgacgacga acaatacgtt tgggaatcta acgctggtgg taagttcact 480

gttactttgg atgaaactaa cgaaagattg ggtcgtggta ccatgttgag attgttcttg 540

aaggaagatc aattggaata cttggaagaa aaaagaatca aagaagttgt caagaaacac 600

tctgaattcg ttgcttatcc aatccaatta gttgtcacca aagaagttga aaaagaagtt 660

ccagaaaccg aagaagaaga caaagctgct gaagaagacg acaagaaacc aaaattggaa 720

gaagtcaagg atgaagaaga cgaaaagaaa gaaaagaaga ccaagactgt caaagaagag 780

gttactgaaa ctgaagagtt gaacaagacc aaaccattat ggaccagaaa cccatctgat 840

atcactcaag atgaatacaa tgcattctac aagtctattt ccaacgactg ggaagaccca 900

ttggctgtca aacacttttc tgttgaaggt caattagaat tcagagctat cttgtttgtt 960

ccaaagagag ctccatttga tgcctttgaa tccaagaaga agaagaacaa catcaaatta 1020

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ttcatcaagg gggttgtcga ttccgaagac ttgccattga acttgtccag agaaatgttg 1140

caacaaaaca agattttgaa agttatcaga aagaacattg tcaaaaagat gattgaaact 1200

ttcaatgaaa tctctgaaga ccaagagcaa ttcaaccaat tctacactgc tttctccaag 1260

aacatcaaat tgggtattca tgaagatgct caaaacagac aatctttggc taaattgttg 1320

agattctact ctaccaaatc ttctgaagaa atgacttcct tgtctgacta cgttactaga 1380

atgccagaac accaaaagaa tatctactac atcactggtg aatccatcaa agccgttgaa 1440

aaatcaccat tcttggatgc cttgaaagct aagaactttg aagtcttgtt catggtggat 1500

ccaatcgatg aatatgccat gactcaattg aaggaatttg aagacaagaa attggttgat 1560

attaccaaag actttgaatt ggaagaaagt gacgaagaaa aagctgctag agaaaaggaa 1620

atcaaagaat acgaaccatt gaccaaagct ttgaaagata ttcttggtga tcaagttgaa 1680

aaagttgttg tttcctacaa acttgttgat gctccagctg ccattagaac tggtcaattt 1740

ggttggtctg ccaatatgga aagaatcatg aaggctcaag ctttgagaga caccaccatg 1800

tcttcttaca tgtcctctaa gaagaccttt gaaatttctc catcttcccc aattatcaag 1860

gaattgaaga agaaagttga aaccgatgga gctgaagaca agaccgttaa ggacttgacc 1920

actttgttgt ttgatactgc attgttgact tctggtttca ccttggacga accatccaac 1980

tttgcccaca gaattaacag attgattgcc ttgggattga atattgacga tgattcagaa 2040

gaaactgctg ttgaacctga agctactact actgcctcaa ctgacgaacc agctggagaa 2100

tctgctatgg aagaagttga ttaa 2124

<210> 4

<211> 1140

<212> DNA

<213> 白色念珠菌(C.albicans)

<400> 4

atgttattca agtctttcgt tacttttact gtcttagcca atgctttggc tgctccatta 60

gctcatcaac atcatcaaca taaagaagaa aaaagagctg ttcatgttgt taccaccacc 120

aatgttgttg ttgtcaccat tggtaatggt gatcaaacta ccacttttgc tgctccatct 180

gtagctgctg attctagtgt tagtgtttct gtcaacactg aaccacctca aaatcaccca 240

actactactc aagatgttgc ttctgcttct acttatccat cttccactga tggttctgcc 300

gcttcttctt ctgctgccgc ttcttcttct tctcaagctg gttctgaacc ttctggtggt 360

gttggatctg gtggtgctaa aggtattact tattctccat acagtgacaa tggtggatgt 420

aaatcatcat ctcaaattgc cagtgaaatt gctcaattat ctggatttaa tgtcattcgt 480

ttatacgggg ttgattgtga tcaagttgca gctgtattaa tagctaaaac ttcatctcaa 540

aaaattttcg ctggtatttt cgatgtttct agtattacat ctggtattga aagtttagct 600

gaagccgtta aaagtatttg cggtagttgg gatgatattt acactgtctc tattggtaat 660

gaattggtta atgctggttc tgccactcca agtcaaatta aagcttatgt tgaagaaggt 720

agaaaagctt taaaagctgc tggttacact ggtccagttg tttctgttga tacttttatt 780

gctgttatta acaatccaga tttatgtgat tactctgatt acatggctgt taacgctcat 840

gctttctttg atggtcacgt tgctgctgaa aactctggtg cttgggtctt gcaacaaatc 900

caaagagttt ggactgcttg tggtggtaaa aagaatgttt taattactga aactggttgg 960

ccatctagag gtgattctaa tggtgtcgcc gttccatcta agagtaacca acaagctgct 1020

atcagttcta ttaaatcttc ttgtggtgcc tctgctatat tattcactgc tttcaatgac 1080

ctttggaagg ccgacggtcc atacaatgct gaaaaatact ggggtattta ctctaactaa 1140

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaggatcca tggctgacgc aaaag 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacctcgagt taatcaactt ccat 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcagaattca tgttattcaa gtctt 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcctcgagt tagttagagt aaa 23

Claims (10)

1.一种重组DNA，其特征在于，重组DNA片段中包含白色念球菌热休克蛋白90核苷酸和甘露糖蛋白65核苷酸，所述热休克蛋白90的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述甘露糖蛋白65的核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示。

2.权利要求1所述的重组DNA作为抗原制备的卵黄抗体。

3.根据权利要求2所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

（1）抗原制备：选取白色念球菌热休克蛋白90核苷酸及甘露糖蛋白65核苷酸序列全长作为抗原序列，表达，复性蛋白，作为免疫用抗原；

（2）免疫蛋黄的获取：用（1）中所述免疫抗原注射产蛋鸡，收集鸡胚，提取卵黄；

（3）卵黄抗体的提取纯化：收集（2）所述的卵黄，离心、透析、并进行溶液处理、最终得到卵黄抗体纯品。

4.根据权利要求3所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫性抗原包含热休克蛋白90抗原的氨基酸序列和甘露糖蛋白65的氨基酸序列，所述热休克蛋白90抗原的氨基酸如SEQ ID NO:1所示，所述甘露糖蛋白65的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求3所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫用抗原中热休克蛋白90及甘露糖蛋白65两种抗原的混合比例为1:1。

6.根据权利要求3所述的所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述卵黄为每次每只注射2mg抗原，首次免疫两周后进行免疫加强，后每个15天进行一次免疫加强，免疫三次后再加强免疫一次，加强免疫10天后收集的鸡胚提取的卵黄。

7.根据权利要求3所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述卵黄抗体的提取纯化方法如下：

（1）卵黄加磷酸盐缓冲液匀浆，静置，离心，透析后截留分子量为150KD的抗体粗品，通过磷酸盐缓冲液透析，并在37℃重溶解15min后所得溶液为卵黄抗体粗溶液；

（2）向（1）中所得卵黄抗体粗溶液中等体积加入饱和硫酸铵溶液，得到沉淀；

（3）将（2）的沉淀以PBS缓冲液溶解，硫酸铵溶液处理后，静置得到沉淀物及为卵黄抗体粗纯品；

（4）测定卵黄抗体的纯度，重复（2）（3）步骤直至卵黄抗体纯度达到80%，将制备的卵黄抗体放置于4℃备用，长期保存加入冻干保护剂，冻干保存。

8.权利要求2所述的卵黄抗体在制备消毒杀菌制剂中的应用。

9.根据权利要求7所述的卵黄抗体在制备消毒杀菌制剂中的应用，其特征在于，所述应用为预防和治疗白色念球菌引起的真菌感染。

10.根据权利要求7所述的卵黄抗体在制备消毒杀菌制剂中的应用，其特征在于，所述制剂为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、擦剂、喷雾剂、气雾剂、油制剂或透皮贴剂。