CN112358545A - 鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉的制备方法及应用，制备方法通过获得毛滴虫与白色念珠菌的菌液；将毛滴虫灭活获得灭活毛滴虫抗原、将白色念珠菌灭活获得灭活白色念珠菌抗原；将上述2种灭活抗原与葡聚糖佐剂制备二联灭活疫苗，免疫产蛋母鸡；收集免疫后鸡蛋，分离卵黄，以泊洛沙姆除去蛋黄中脂肪成分，然后滤液经过中空纤维超滤膜浓缩，获得浓缩抗体，加入麦芽糊精低温冷冻干燥获得鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉。其效价远高于任何一种单独卵黄抗体的结合效价，具有显著防治毛滴虫与白色念珠菌感染的效果，饲喂该粉剂可以有效防治信鸽、赛鸽、肉鸽和珍珠鸡毛滴虫、白色念珠菌感染引起的口腔、嗉囊溃疡。

Description

鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉及其制备方法。

背景技术

鸽毛滴虫病，又称鸽口腔溃疡，亦称为"鸽癀"，是常见的鸽病之一，病原是禽毛滴虫，根据其寄生部位不同分为咽喉型和内脏型。咽喉型表现为口腔和咽喉黏膜形成粗糙钮扣状的黄色沉着物；湿润者，称为湿性溃疡；呈干酪样或痂块状则称为干性溃疡。脐部感染时，皮下形成肿块，呈干酪样或溃疡性病变；内脏型即引起内脏器官出现黄色粗糙界线明显的干酪样病灶，结果导致实质器官组织坏死。病鸽因口腔溃疡而妨害采食，在幼鸽和生长期鸽中可引起很高的死亡率。国内外资料报告，鸽毛滴虫病任何品种、年龄的鸽均可感染。肉鸽年龄愈小感染率越高，其中乳鸽感染率高达91.2％，青年鸽感染率77.5％，成年鸽感染率最低为43.9％，平均感染率为70.9％，成鸽多数呈带虫者，未见有明显症状；幼鸽病状明显，其中乳鸽的死亡率可达30％～80％。

白色念珠菌是一种重要的机会致病菌，常常与其他菌造成混合感染。鸽白色念珠菌感染称为鹅口疮，多无明显的特征症状，常见生长缓慢，羽毛松乱，嗉囊逐渐增大并下垂，触诊嗉囊柔软，压迫有疼痛感。白色念珠菌病最常见的剖检病变是嗉囊黏膜增厚，黏膜上带有白色圆形隆起的溃疡灶，溃疡表面有剥离的倾向。黏膜上常有伪膜斑和易于除去的坏死物，口和食道可能出现溃疡斑。造成动物机体食欲下降，给养殖业带来巨大损失。鸽子从3-10日龄陆续发病，发病率达50％、死亡率达20％-30％。

目前，临床上针对鸽毛滴虫的预防治疗抗生素主要采取甲硝唑(甲硝咪唑、灭滴灵)，饲喂方法为：每公斤饮水加入500mg，混饮3天、停药3天，是企业推荐的用量。或者0.2g/片成鸽口服一日四分之一片，幼鸽八分之一片。用药后必须添加缓解肾衰竭药物3天，防治中毒。针对白色念珠菌的治疗常常选择用0.3％-0.5％的硫酸铜溶液盛放在饮水杯上供鸽自由饮用，连续3-5d。饲料中拌入制霉菌素25万IU/kg，饲喂3天，停药3天，再次饲喂3天，保证每只每次20-25万单位。同时适时补给维生素A、复合维生素B，对大群防治有一定效果。也有研究表明，芍药苷、大蒜素、当归、黄连、金银花、透骨草等中药或提取物对白色念珠菌有一定的治疗作用。

除了甲硝唑、制霉菌素人用药物外，目前国内外都没有针对鸽毛滴虫与白色念珠菌专用、有效治疗的药物，也没有针对相关内容的研究。临床养殖中对这两种疾病的预防治疗主要采取甲硝唑、替硝唑、制霉菌素等抗生素或其他药物来预防治疗，造成了抗生物的滥用，同时造成了耐药性的产生。为维护动物源性食品安全和公共卫生安全，现有饲料中要求全面禁止添加抗生素，减少滥用抗生素造成的危害，维护动物源食品安全和公共卫生安全。因此，在严峻的用药形势下，一种健康绿色的抗体药物对信鸽、赛格、肉鸽和珍珠鸡的养殖来说是迫切需要的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉的制备方法，制备的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉用于防治鸽毛滴虫与白色念珠菌病，可以替代抗菌素-甲硝唑、制霉菌毒素的使用，保证信鸽、赛鸽、肉鸽和珍珠鸡健康绿色养殖。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉的制备方法，其包括如下步骤：

S1、培养获得鸽毛滴虫和白色念珠菌菌液；

S2、将毛滴虫灭活获得灭活鸽毛滴虫抗原，将白色念珠菌灭活获得灭活白色念珠菌抗原；

S3、将上述2种灭活抗原与1，3/1，6葡聚糖、赛彼科的763A佐剂制备二联灭活疫苗，免疫产蛋母鸡；

S4、收集免疫后鸡蛋，分离卵黄，以泊洛沙姆188除去蛋黄中脂肪成分，然后滤液经过中孔纤维膜浓缩，获得浓缩抗体，加入麦芽糊精干燥获得鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S1中，所述鸽毛滴虫采用蛋白胨、牛肝浸粉、磷酸氢二钾、5～10％孕马血清制备的基础培养基中加入青霉素、链霉素、两性霉素后大量扩增鸽毛滴虫。

如上所述的制备方法，优选地，所述基础培养基按照蛋白胨10g、牛肝浸粉10g、磷酸氢二钾1g和1000ml双蒸水的比例配置，高压灭菌后，添加体积比为5％～10％的孕马血清；按青霉素1000U/mL、链霉素1000U/mL、两性霉素B10μg/mL加入，扩增的条件为在37℃培养48～60小时。

1L培养基中接种2×10⁷个鸽毛滴虫，于37℃培养箱培养2-5d，可将鸽毛滴虫培养至2.5×10⁸CFU/mL。

白色念珠菌培养方法：白色念珠菌标准株接种于普通营养肉汤培养基，180rpm摇床培养17～24h，白色念珠菌则培养至2×10⁸CFU/mL。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述鸽毛滴虫灭活超声波破碎灭活，白色念珠菌采用加热灭活和超声波破碎相结合的方式。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述鸽毛滴虫灭活的方法为将鸽毛滴虫培养液于6000rpm离心5min，然后弃上清取沉淀用生理盐水洗涤2～4次，每次6000rpm离心5min，收集沉淀，进行超声波破碎，工作5s，暂停8s，功率400W，40个循环，然后静置于冰上10min，再以相同方式进行超声波破碎，超声累积工作80个循环，破碎完毕后6000rpm离心5min，收集上清，检验灭活，获得鸽毛滴虫灭活抗原；

所述白色念珠菌灭活的方法为收集菌体沉淀在70℃加热2h，之后超声波破碎，工作5s，暂停8s，间隔破碎，功率400W，50个循环，然后静置于冰上10min，再以相同方式进行超声波破碎，超声累积工作100个循环；3000rpm离心5min收集上清，检验灭活，获得鸽白色念珠菌灭活抗原。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，将鸽毛滴虫抗原：白色念珠菌抗原＝1:1比例，使用灭菌生理盐水稀释至一定的抗原含量，然后添加体积比为0.2％的β-1，3/1，6葡聚糖，然后与赛彼科763A疫苗佐剂按3:7的比例混合，然后使用磁力搅拌器进行乳化获得二联灭活疫苗，每羽份二联灭活疫苗0.5mL含有鸽毛滴虫1×10⁶个，白色念珠菌1×10⁸CFU。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，产蛋母鸡为180日龄的健康蛋鸡，进行颈部皮下免疫，每只鸡免疫注射0.5mL，每次免疫后间隔10天进行免疫，共免疫三次，第三次免疫后14天收集鸡蛋，用于步骤S4。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，按卵黄与泊洛沙姆188体积比为1:8比例加入1.0％泊洛沙姆，调整pH值在7.2，于4-8℃静置24h，除去脂肪，获得卵黄抗体溶液后，中空纤维超滤膜浓缩纯化，将卵黄抗体溶液经孔径为截流分子量为30kD的中空纤维超滤膜进行纯化浓缩。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述浓缩抗体与麦芽糊精按1：1～1：1.5的比例混合进行干燥。

优选地，干燥采用真空干燥机，烘干方式为连续加料，连续出料，进口温度为70℃，出口温度设定为30～40℃，干燥3～5小时。

由上述所述制备方法制备得到的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉。

如上所述制备方法获得的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉在防治信鸽、赛鸽、肉鸽和珍珠鸡口腔中鸽毛滴虫、白色念珠菌感染引起的口腔、嗉囊溃疡中的应用。

优选地，每只信鸽、赛鸽、肉鸽和珍珠鸡饲喂0.5-1.0g/kg的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉可以替代甲硝唑、替硝唑和制霉菌素。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉剂的制备方法，该方法制备的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉剂可以有效预防与治疗鸽毛滴虫与白色念珠菌的感染，替代人用药物-甲硝唑、替硝唑和制霉菌素使用，减少了抗生素的滥用。同时，将卵黄抗体制作成粉末状，可以长期保存，便于运输。将卵黄抗体粉末加入饲料中饲喂，适口性较好，便于饲喂与采食。

本发明方法制得的复合卵黄抗体效价远高于任何一种单独卵黄抗体的疗效，具有显著防治鸽毛滴虫与白色念珠菌感染的效果，将制备的卵黄抗体制备成粉剂，每只肉鸽饲喂0.5-1.0g/kg的粉剂可以有效防治信鸽、肉鸽毛滴虫、白色念珠菌感染引起的口腔、嗉囊溃疡。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1鸽毛滴虫培养基的筛选

目的：筛选不同的培养基，获得大量的鸽毛滴虫，便于制备大量的鸽毛滴虫抗原成分。

1试剂和材料：胰蛋白大豆肉汤、酵母提取物、胎牛血清、牛肝浸粉、蛋白胨、L-半胱氨酸、K₂HPO₄、NaCl、孕马血清可购自北京广达恒益生物科技有限公司。

青霉素、链霉素、两性霉素、酮康唑：购自中国食品药品检定研究院。

鸽毛滴虫：分离自发病的鸽子，中国农业大学动物医学院分离和鉴定提供。

2方法：

(1)10％牛血清基础培养基：将10g蛋白胨、10g牛肝浸粉、5g NaCl、1g K₂HPO₄和1000mL双蒸水，充分溶解后，高压灭菌，添加10％的胎牛血清，青霉素1000U/mL、链霉素1000U/mL、两性霉素B10μg/mL。接种1×10⁵个鸽毛滴虫，于37℃培养箱培养2-5d。

(2)HF培养基：20g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g麦芽糖，5g葡萄糖，5g抗坏血酸，1gKHCO₃，0.5g KCl，0.5g KH₂PO₄，0.1g HCl-L-半胱氨酸，0.1g FeSO₄，双蒸水，充分溶解后，高压灭菌后，添加青霉素25U/mL、链霉素25U/mL、庆大霉素80ug/mL、酮康唑20ug/mL。

(3)5％孕马血清培养基组成：将10g蛋白胨、10g牛肝浸粉、5g NaCl、1g K₂HPO₄和1000mL双蒸水，充分溶解后，高压灭菌后，添加体积比为5％的孕马血清，青霉素1000U/mL、链霉素1000U/mL、两性霉素B10μg/mL。

(4)10％孕马血清培养基组成：将10g蛋白胨、10g牛肝浸粉、5g NaCl、1g K₂HPO₄和1000mL双蒸水，充分溶解后，高压灭菌后，添加体积比为10％孕马血清，青霉素1000U/mL、链霉素1000U/mL、两性霉素B10μg/mL。

以上4种不同的培养基制备后，每1L培养基中接种2×10⁷个鸽毛滴虫，于37℃培养箱培养2-5d。染色后在显微镜下进行计数测定鸽毛滴虫含量。

3结果

10％牛血清基础培养基(作为对照组)、HF培养基、5％孕马血清培养基、10％孕马血清培养基这四种不同的培养基接种鸽毛滴虫后，培养48h鸽毛滴虫含量较低。培养60h后，其数量分别为1.1×10⁶、2.3×10⁵、2.5×10⁸和1.8×10⁸个。结果发现培养48小时和60小时后，5％孕马血清培养基和10％孕马血清培养基毛滴虫含量无差异，但是显著性高于对照组培养和HF培养基，具体结果见表1。随着时间延长，60小时后鸽毛滴虫培养数量达到高峰期，可以满足鸽毛滴虫抗原制备的要求。

根据鸽毛滴虫抗原数量，使用5％孕马血清培养基培养，培养60小时为优化的培养条件。

表1三种培养基制备鸽毛滴虫数量的比较

注：同一列中^a-b P<0.05

4结论

以上筛选含5％孕马血清的蛋白胨培养基培养60小时，鸽毛滴虫数量达到预期目的。

实施例2鸽毛滴虫、白色念珠菌二联灭活疫苗的制备

1试剂和材料：

鸽毛滴虫：按实施例的1优化后的方法制备获得2.5×10⁸个/mL的鸽毛滴虫。

赛彼科763A佐剂：购自赛彼科(上海)特殊化学品有限公司。

β-1，3/1，6葡聚糖：含量95％，购自湖北安琪酵母股份有限公司。

白色念珠菌：从发病肉鸽分离和鉴定，由中国农业大学动物医学院保存并提供。

2方法：

2.1白色念珠菌采用胰蛋白胨大豆肉汤培养基180rpm摇床培养17h，扩增培养获得2×10⁸CFU/mL的白色念珠菌液。

取鸽毛滴虫与白色念珠菌的培养液于6000rpm离心5min，然后弃上清取沉淀用生理盐水洗涤三次，每次6000rpm离心5min，尽可能洗去培养基液。

2.2鸽毛滴虫超声波灭活：收集鸽毛滴虫的沉淀，将沉淀重溶于适量体积的生理盐水中置于冰上进行超声波破碎，工作时间5s，暂停8秒，功率400W，循环40次，间隔破碎，冰裕(静置于冰上)10分钟后，再次按上述条件循环40次，破碎完毕后，6000rpm离心5min，收集上清，涂板检验已灭活后，即为灭活抗原，-20℃保存，备用。

2.3白色念珠菌的加热灭活：收集沉淀在70℃加热2h，之后加入适量体积生理盐水充分混匀后置于冰上进行超声波进行破碎，工作5s，暂停8s，间隔破碎，功率400W，循环50次，间隔破碎，冰裕10分钟后，再次按上述条件循环50次，3000rpm离心5min，收集上清，涂板检验已灭活后，即为灭活抗原，-20℃保存，备用。

2.4二联灭活苗的制备：以鸽毛滴虫、白色念珠菌2种抗原为液体相，添加体积比为0.2％的β-1，3/1，6葡聚糖，然后将水相与油相按3:7的体积比混合。水相组成：按体积比1份鸽毛滴虫抗原+1份白色念珠菌抗原+10份生理盐水，按照最终疫苗体积的0.2％添加β-1，3/1，6葡聚糖，制备水相。油相组成：赛彼科763A佐剂，混合后使用磁力搅拌器进行乳化8min。

3结果：

成功制备了毛滴虫与白色念珠菌二联灭活疫苗。每0.5mL含鸽毛滴虫抗原、1×10⁶个，白色念珠菌1×10⁸CFU。

实施例3鸽毛滴虫、白色念珠菌二联抗体的检测

1试剂和材料：

鸽毛滴虫抗原：按实施例1方法制备。

白色念珠菌抗原：见实施例2方法.

鸽毛滴虫与白色念珠菌二联灭活疫苗：见实施例2制备方法。

种母鸡：180日龄，海蓝白，河北涿州牧丰有限公司。

饲料：高峰期种鸡饲料，河北涿州牧丰有限公司。

2方法：

2.1免疫方法：试验的第1天，用鸽毛滴虫、白色念珠菌二联灭活疫苗进行免疫，然后每间隔14天，颈部皮下注射，剂量0.5毫升/鸡(每1mL含毛滴虫抗原为1×10⁹个，白色念珠菌为1×10⁹CFU)，在第3次免疫后，采样取血清，用ELISA法进行效价测定，如果效价不高，进行第4次免疫。

2.2抗体测定方法：免疫3次后，收集蛋样，先用酒精棉球消毒，打破鸡蛋，吸出定量蛋黄液，加入灭菌过的PBS在Eppnedoff管中2试验组蛋黄稀释液也对应于鸡进行编号，放入-20℃冰箱备用。

2.3鸽毛滴虫抗体、白色念珠菌抗体检测条件：将蛋黄用PBS溶液稀释(1:1的体积比)混匀后，将鸽毛滴虫、白色念珠菌分别按照1:10；1:20；1:40；1:80；1:100；1:120；1:140比例进行稀释，然后分别以0.25μg，0.5μg，1.0μg，1.5μg/孔，过夜包被96孔反应板。然后优化封闭条件、一抗、二抗的反应条件以及TMB的显色条件。在酶标仪450nm波长进行阅读。

3结果

3.1鸽毛滴虫、白色念珠菌酶联免疫吸附试验检测条件的优化

将蛋黄用PBS 1：1的体积比稀释混匀后，再将其进行稀释至1：80(鸽毛滴虫)和1：100(白色念珠菌)。检测用96孔板使用鸽毛滴虫1微克/孔，白色念珠菌0.5微克/孔，包被，4-8℃过夜包被。以5％奶粉+1％兔血清+PBST，200微升/孔，37℃1小时进行封闭。一抗37℃作用1小时，洗涤5次；加二抗(兔抗鸡二抗)1:5000 37℃0.5小时，洗涤5次；然后加TMB37℃显色10分钟后加入终止液，在450nm处读取吸光度(OD值)。阴性(免疫前)样本OD₄₅₀值分别为0.175、0.194；阳性样本OD₄₅₀值分别为1.211和1.118，这说明建立的酶联免疫吸附试验方法是有效的，可以用于检测鸡蛋蛋黄中鸽毛滴虫、白色念珠菌的抗体水平。

3.2鸽毛滴虫、白色念珠菌蛋黄抗体动态规律

按上述方法对不同免疫时间获得的蛋黄进行检测，获得结果如表2。

表2ELISA检测蛋黄中鸽毛滴虫、白色念珠菌抗体水平

样本分类	样本数	鸽毛滴虫抗体OD<sub>450</sub>值	白色念珠菌抗体OD<sub>450</sub>值
				免疫前	10	0.175±0.091<sup>a</sup>	0.194±0.08<sup>a</sup>
一免后14天	10	0.669±0.152<sup>b</sup>	0.542±0.218<sup>b</sup>
				二免后14天	10	1.046±0.271<sup>b</sup>	1.101±0.311<sup>c</sup>
三免后14天	10	1.39±0.320<sup>c</sup>	1.272±0.401<sup>c</sup>
				三免后28天	10	1.68±0.501<sup>c</sup>	1.39±0.312<sup>c</sup>
三免后56天	10	1.79±0.602<sup>c</sup>	1.30±0.402<sup>b</sup>

同一列中^a-b,b-c P<0.05，^a-cP<0.01

鸽毛滴虫、白色念珠菌阴性对照OD₄₅₀值分别为0.175和0.194。免疫后不同时间点检测毛滴虫、白色念珠菌抗体水平显示，一次免疫后显著性高于免疫前抗体水平。鸽毛滴虫抗体、白色念珠菌抗体2次免疫抗体OD值大于1.0，3次免疫后抗体水平逐渐增加。3次免疫后组蛋黄中检测到高水平抗鸽毛滴虫、白色念珠菌的抗体，且抗体持续时间达到56天。

实施例4鸽毛滴虫、白色念珠菌二联卵黄抗体纯化的技术工艺

1试剂和材料

泊洛沙姆188：购自南京威尔医药技术有限公司。

30kD的中空纤维超滤膜：上海根生生物科技有限公司。

2方法：

泊洛沙姆除去脂肪：取出高免卵黄后，按8倍体积加入1.0％泊洛沙姆(调整pH值在7.2)，于4-8℃静置72h，吸出上清液体表面的脂肪。

超滤浓缩：将卵黄除去脂肪的卵黄液体经截流分子量为30kD的中空纤维超滤膜进行浓缩，超滤时间控制在10min，同时除去泊洛沙姆，最少可到80倍以上。

鸽毛滴虫、白色念珠菌抗体水平的检测：泊洛沙姆除去脂肪后抗体(浓缩前)和中空纤维滤膜浓缩抗体(浓缩后)检测方法同实施例3。

3结果见表3。

表3抗体浓缩前和浓缩后鸽毛滴虫、白色念珠菌抗体水平

抗体分类	样本数	鸽毛滴虫抗体OD<sub>450</sub>值	白色念珠菌抗体OD<sub>450</sub>值
				浓缩前	10	1.52±0.482<sup>a</sup>	1.37±0.321<sup>a</sup>
浓缩后	10	2.95±1.102<sup>b</sup>	2.65±1.320<sup>b</sup>

注：同一列中a-b,b-c P<0.05,a-cP<0.01

表3显示利用泊洛沙姆除去蛋黄中脂肪抗体(浓缩前)，再经过中空纤维膜过滤浓缩抗体(浓缩后)检测结果，鸽毛滴虫、白色念珠菌抗体显著性高于浓缩前抗体测定值。

实施例5鸽毛滴虫、白色念珠菌抗体粉的制备工艺路线

1材料和设备：

浓缩卵黄抗体：方法同实施例4。

山梨醇、中药颗粒糊精、麦芽糊精和蔗糖：医药级，购买自中粮生物科技股份有限公司。

真空低温液体连续干燥机：上海成东科技有限公司，ZDG型。

2方法:

2.1干燥温度和出口温度设置

2.2抗体干燥配方的优化

配方1:浓缩抗体：中药制颗糊精：麦芽糊精＝1:1:0.5

配方2:浓缩抗体：中药制颗糊精：麦芽糊精＝1:1:1

配方3:浓缩抗体：麦芽糊精＝1:1

将浓缩抗体分别与中药制颗糊精、麦芽糊精按照以上配方制备混合物，控制合理的黏稠度后，通过管道吸入真空低温液体连续干燥机，进口温度为70℃，出口温度设定为40℃，按照上述设定的温度，进行烘干，制备成抗体粉。称取1克抗体粉，加入10毫升自来水，溶解后，测定其水溶性和按实施例3中联免疫吸附试验检测OD值。

3结果：见表4。

表4不同烘干配方对水溶性和抗体OD值的影响

处方	配方1	配方2	配方3
				干燥时间	4h	4h	4h
溶解性	70％溶解	90％溶解	100％溶解
				溶液澄清度	浑浊	部分浑浊	清亮
毛滴虫抗体	1.08±0.417<sup>a</sup>	1.56±0.216<sup>b</sup>	2.48±0.311<sup>c</sup>
				白色念珠菌抗体	0.97±0.072<sup>a</sup>	1.20±0.328<sup>a</sup>	1.82±0.314<sup>b</sup>

注：不同配方方和处理条件抗体水平的差异性按照同行进行比较。同一列中^a-b，b-cP<0.05，^a-cP<0.01。以干燥时间、溶解性和溶液的澄清度3个指标评价抗体干燥配方，优选配方3，即浓缩抗体与麦芽糊精按照1:1比例烘干4小时，可以制备抗体粉。表4显示不同配方和不同干燥时间毛滴虫抗体、白色念珠菌抗体水平出现显著差异，其中配方3处理后抗体水平显著优于配方1和配方2。

上述通过在卵黄抗体中添加不同的保护剂保证其抗体的稳定性，防治降解，并通过低温干燥工艺将卵黄抗体加工成粉末状，使卵黄抗体易于保存与运输。

实施例6鸽毛滴虫、白色念珠菌卵黄抗体的临床应用

1试剂和材料

白羽王肉鸽：30日龄，80只，购自北京野谷集团优迪鸽业有限公司。

肉鸽饲料：购自北京野谷集团优迪鸽业有限公司。

鸽毛滴虫、白色念珠菌二联卵黄抗体粉：同实施例5制备。

甲硝唑片：0.2g/片，华北制药河北华诺有限公司。

制霉菌素片：50万单位/片，山东鲁抗医药股份有限公司。

2方法：

2.1鸽毛滴虫感染模型：将30只肉鸽分为5组，每组6只肉鸽。其中4组感染毛滴虫，每次经口接种感染1×10⁶CFU，连续攻毒5天后，分别口服抗体高剂量组(1g/只)、中剂量组(0.5g/只)、低剂量组(0.2g/只)以及甲硝唑(0.1g/只)。以上抗体或者药物连续使用5天，第6天后采取安乐死处理鸽子，观察口腔和嗉囊的病变，同时采集口腔棉签拭子测定毛滴虫含量。

2.2白色念珠菌感染模型组：将50只肉鸽分为5组，每组10只肉鸽。其中4组感染白色念珠菌，每次感染1×10⁷CFU，经口接种感染，连续攻毒5天后，连分别口服抗体高剂量组(1g/只)、中剂量组(0.5g/只)、低剂量组(0.2g/只)以及制霉菌素(25万单位/只)。以上抗体或者药物连续使用5天，第6天后采取安乐死处理鸽子，观察口腔和嗉囊的病变，同时采集口腔棉签拭子测定白色念珠菌的含量。

3结果

3.1抗体不同剂量对鸽毛滴虫、白色念珠菌造成的口腔、嗉囊病变影响：从鸽毛滴虫模型和白色念珠菌病模型看，2种发病模型成功。鸽毛滴虫的靶器官在口腔，抗体高剂量组与甲硝唑疗效相等。从口腔的保护特点看，抗体高剂量组与甲硝唑保护率相同，抗体中剂量组可以达到83.4％保护率，抗体低剂量组达到66.7％保护率。结果见表5。

表5不同剂量的抗体对人工感染毛滴虫的疗效

分组	只数	口腔病变(％)	嗉囊病变(％)
				抗体高剂量组	6	0(0)<sup>a</sup>	0(0)<sup>a</sup>
抗体中剂量组	6	1(16.6)<sup>b</sup>	0(0)<sup>a</sup>
				抗体低剂量组	6	2(33.3)<sup>b</sup>	1(16.6)<sup>b</sup>
甲硝唑组	6	0(0)<sup>a</sup>	1(16.6)<sup>b</sup>
				人工感染组	6	5(83.3)<sup>c</sup>	6(100.0)<sup>c</sup>

注：同一列中^a-b,b-c P<0.05,^a-c P<0.01。

抗体对白色念珠菌模型疗效上：抗体中剂量组和高剂量组疗效与制霉菌素差异不显著，见表6。从保护嗉囊病变来看，抗体中剂量组和高剂量组达到了90％保护，这与制霉菌素的疗效相当。

表6不同剂量的抗体对人工感染白色念珠菌的疗效

3.2抗体不同剂量对鸽毛滴虫、白色念珠菌病原载量的造成的影响：

表7显示不同剂量的抗体口服后，对于降低鸽毛滴虫病原含量有所不同，其中高剂量组与甲硝唑的降低病原载量相等，抗体中剂量组、低剂量组与与人工感染对照组相比，病原的载量分别降低了1000倍、20000倍左右。制霉菌素组与人工感染组差异不显著，这提示无杀灭效果。

在检测白色念珠菌载量上来看，抗体高剂量组与制霉菌素组吴显著差异，抗体中剂量组与制霉菌素差异显著，低剂量抗体组与制霉菌素组差异极其显著。甲硝唑对于白色念珠菌杀灭效果与对照组相比，差异不显著。

表7不同剂量抗体对人工感染鸽毛滴虫、白色念珠菌病原载量的影响

注：同一列中^a-b,b-c P<0.05,^a-c,c-d,a-dP<0.01。

综合口腔病变指数、嗉囊病变指数以及口腔棉签拭子2种病原的含量，制备的抗体以中剂量组口服(0.5g/只)，连续5天可以有效防治鸽毛滴虫、白色念珠菌的人工感染，可以同时替代甲硝唑、制霉菌素。

上述说明将制备好的卵黄抗体粉用于治疗鸽毛滴虫与白色念珠菌感染，具有较好的治疗作用。

上述步骤为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述步骤的限制，其他的任何未违背本发明的发明原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化等均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、获得鸽毛滴虫和白色念珠菌菌液；

S2、将鸽毛滴虫灭活获得鸽毛滴虫抗原，将白色念珠菌灭活获得灭活白色念珠菌抗原；

S3、将上述2种灭活抗原与β-1，3/1，6葡聚糖、赛彼科的763A佐剂制备二联灭活疫苗，免疫产蛋母鸡；

S4、收集免疫后鸡蛋，分离卵黄，以泊洛沙姆188除去蛋黄中脂肪成分，然后滤液经过中空纤维膜浓缩，获得浓缩抗体，加入麦芽糊精干燥获得鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述鸽毛滴虫采用蛋白胨、牛肝浸粉、磷酸氢二钾、5％～10％孕马血清制备的基础培养基中加入青霉素、链霉素、两性霉素后大量扩增鸽毛滴虫；

所述基础培养基按照蛋白胨10g、牛肝浸粉10g、磷酸氢二钾1g和1000ml双蒸水的比例配置，高压灭菌后，添加体积比为5％～10％的孕马血清；按青霉素1000U/mL、链霉素1000U/mL、两性霉素B10μg/mL加入，扩增的条件为在37℃培养48～60小时。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述鸽毛滴虫灭活超声波破碎灭活，白色念珠菌加热灭活和超声破碎相结合的方式。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述鸽毛滴虫灭活的方法为将鸽毛滴虫培养液于6000rpm离心5min，然后弃上清取沉淀用生理盐水洗涤2～4次，每次6000rpm离心5min，收集沉淀，进行超声波破碎，工作5s，暂停8s，功率400W，40个循环，然后静置于冰上10min，再以相同方式进行超声波破碎，超声累积工作80个循环，破碎完毕后6000rpm离心5min，收集上清，检验灭活，获得鸽毛滴虫灭活抗原；

所述白色念珠菌灭活的方法为收集菌体沉淀在70℃加热2h，之后进行超声波破碎，工作5s，暂停8s，间隔破碎，功率400W，50个循环，然后静置于冰上10min，再以相同方式进行超声波破碎，超声累积工作100个循环；3000rpm离心5min收集上清，检验灭活，获得鸽白色念珠菌灭活抗原。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，将抗原添加体积比为0.2％的β-1，3/1，6葡聚糖，然后与赛彼科763A疫苗佐剂按3:7的比例混合，然后使用磁力搅拌器进行乳化获得二联灭活疫苗，每羽份二联灭活疫苗0.5mL含有鸽毛滴虫1×10⁶CFU，白色念珠菌1×10⁸CFU。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，产蛋母鸡为180日龄的健康蛋鸡，进行颈部皮下免疫，每只鸡免疫注射0.5mL，每次免疫后间隔10天进行免疫，共免疫三次，第三次免疫后14天收集鸡蛋，用于步骤S4。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，按卵黄与泊洛沙姆188体积比为1:8比例加入1.0％泊洛沙姆，调整pH值在7.2，于4-8℃静置24h，除去脂肪，获得卵黄抗体溶液后，中空纤维超滤膜浓缩纯化，将卵黄抗体溶液经孔径为截流分子量为30kD的中空纤维超滤膜进行纯化浓缩。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述浓缩抗体与麦芽糊精按1：1～1：1.5的比例混合进行干燥，干燥采用低温真空干燥机，烘干方式为连续加料，连续出料，进口温度为70℃，出口温度设定为30～40℃，干燥3～5小时。

9.由权利要求1-8中任一项所述制备方法制备得到的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉。

10.权利要求1-8中任一项所述制备方法获得的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉或权利要求9所述的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体粉在防治信鸽、赛鸽、肉鸽和珍珠鸡口腔中毛滴虫、白色念珠菌感染引起的口腔、嗉囊溃疡中的应用。