CN108823138B - 一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用 - Google Patents

一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108823138B
CN108823138B CN201810734991.4A CN201810734991A CN108823138B CN 108823138 B CN108823138 B CN 108823138B CN 201810734991 A CN201810734991 A CN 201810734991A CN 108823138 B CN108823138 B CN 108823138B
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ser
sequence
glu
escherichia coli
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810734991.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108823138A (zh
Inventor
李晶
刘文军
范文辉
刘丽蓉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Priority to CN201810734991.4A priority Critical patent/CN108823138B/zh
Publication of CN108823138A publication Critical patent/CN108823138A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108823138B publication Critical patent/CN108823138B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用。本发明提供的工程菌，全称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28a‑PolFNλ1‑IL2，保藏编号为CGMCC No.15920。本发明还保护所述大肠埃希氏菌在制备特异蛋白质中的应用；所述特异蛋白质如序列表的序列1或序列表的序列3所示。所述特异蛋白质具有预防猪病毒性传染病的功能。所述工程菌用于生产特异蛋白质，产量非常高，效果极其显著。本发明还保护所述大肠埃希氏菌在制备猪病毒性传染病疫苗中的应用。本发明对于猪病毒性传染病的防控具有重大应用推广价值。

Description

一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用
技术领域
本发明涉及一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用。
背景技术
养猪业中，猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪流感等多种病毒性传染病多发。虽然猪病疫苗种类繁多且免疫频繁，仍不能有效预防疾病的暴发与流行，上述病毒性传染病每年给养猪业造成了较大的经济损失。提高疫苗免疫效力，研发高效、安全的猪病防治用药成为养猪业中的迫切的需要。
干扰素(Interferon，IFN)最初于1957年由英国科学家Isaacs研究禽流感病毒的干扰现象时被发现，是一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，由病毒及其它种类的干扰素诱导剂来刺激内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及体细胞所产生，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及诱导分化等活性。干扰素作用的发挥并不是直接作用于病毒，而是刺激细胞产生多种广谱抗病毒蛋白，可通过直接或间接途径发挥抗病毒作用。
一方面，如果获得活性更高的干扰素产品。另一方面，如何从工业上实现干扰素产品的高产量、低成本的批量制备。上述两个方面对于猪病毒性传染病的防控，进而对于猪养殖业的发展具有重大价值。
发明内容
本发明的目的是提供一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用。
本发明提供的工程菌，全称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-PolFNλ1-IL2，已于2018年06月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15920。
本发明还保护所述大肠埃希氏菌在制备特异蛋白质中的应用；所述特异蛋白质如序列表的序列1或序列表的序列3所示。
所述特异蛋白质具有预防猪病毒性传染病的功能。所述工程菌用于生产特异蛋白质，产量非常高，效果极其显著。
本发明还保护所述大肠埃希氏菌在制备猪病毒性传染病疫苗中的应用。
本发明还保护所述大肠埃希氏菌在制备产品中应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)：(a)作为猪免疫增强剂；(b)制备猪免疫增强剂。
以上任一所述猪病毒性传染病为猪流感病毒引起的猪流感。所述猪流感病毒为H1N1猪流感病毒。所述H1N1猪流感病毒为A/California/04/2009A(H1N1)毒株。
以上任一所述猪为长白猪。
本发明对于猪病毒性传染病的防控具有重大应用推广价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。VSV病毒(水泡性口炎病毒)：中国兽医药品监察所。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、重组菌的构建以及目的蛋白的制备
一、重组质粒的构建
将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pET28a(+)载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒pET28a-PoIFNλ1-IL2。根据测序结果，对重组质粒pET28a-PoIFNλ1-IL2进行结构描述如下：在pET28a(+)载体的NdeI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白。序列表的序列1中，第1-172位氨基酸残基组成优化后的猪PoIFNλ1蛋白，第183-316位氨基酸残基组成优化后的猪IL2蛋白。
将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pET28a(+)载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在pET28a(+)载体的NdeI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的DNA分子。序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质。将序列表的序列3所示的蛋白质命名为优化前PoIFNλ1-IL2融合蛋白。序列表的序列3中，第1-172位氨基酸残基组成优化前的猪PoIFNλ1蛋白，第183-316位氨基酸残基组成优化前的猪IL2蛋白。
将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入pET28a(+)载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在pET28a(+)载体的NdeI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的DNA分子。序列表的序列5所示的DNA分子编码优化前的猪PoIFNλ1蛋白。
二、重组菌的构建和制备目的蛋白的能力比较
1、重组菌的获得
将重组质粒pET28a-PoIFNλ1-IL2导入大肠杆菌BL-21(DE3)，得到68株重组菌。
2、各株重组菌制备目的蛋白的能力比较
分别将步骤1制备的68株重组菌进行如下步骤：
(1)将重组菌单菌落接种至3ml含0.1mg/ml卡那霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养12小时，得到种子液。
(2)将20ml步骤(1)得到的种子液接种至1980ml含0.1mg/ml卡那霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至体系OD600nm值为0.6，加入IPTG并使其浓度为1mmol/L，然后37℃、200rpm振荡培养4h。
(3)完成步骤(2)后，将整个培养体系离心收集菌体，用pH8.0的PBS缓冲液悬浮，然后进行超声破碎(300W，超声6s停12s，99次)，然后5000g离心10分钟，收集沉淀(包涵体)。
(4)取步骤(3)得到的沉淀，依次用Washing buffer和Resuspension buffer洗涤。
Washing buffer(pH8.0)：含0.5％Triton-100、50mM Tris、300mM NaCl、10mMEDTA、10mM DTT，余量为水。
Resuspension buffer(pH8.0)：含50mM Tris、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT，余量为水。
(5)完成步骤(4)后，用Dissolution buffer完全溶解包涵体，然后4℃、10000g离心20分钟，收集上清液。
Dissolution buffer(pH8.0)：含6M Gua-HCl、10％甘油、50mM Tris、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT，余量为水。
(6)取步骤(5)得到的上清液，缓慢滴加到Refolding buffer中，4℃、200rpm搅拌24h。
Refolding buffer(pH8.0)：含100mM Tris、400mM L-Arg HCl、2mM EDTA、5mMGSH、0.5mM GSSG，余量为水。
(7)收集完成步骤(6)的整个体系，在4℃条件下进行浓缩，浓缩至20ml左右时加分子筛缓冲液至100ml，然后继续在4℃条件下进行浓缩，浓缩至20ml左右时加分子筛缓冲液至100ml，然后继续在4℃条件下进行浓缩，浓缩至4ml，即为浓缩液。
分子筛缓冲液(pH8.0)：含20mM Tris、150mM NaCl，余量为水。
(8)取1ml步骤(7)得到的浓缩液，4℃、12000rpm离心10min，用Superdex 7510/300GL分子筛层析柱纯化。
柱体积为24ml；填充物为葡聚糖凝胶G15 100-200。
洗脱液(pH8.0)：含20mM Tris、150mM NaCl，余量为水。
洗脱液流速：0.3ml/min。
收集保留体积为12.8ml-15.1ml的过柱后溶液，即为目的蛋白溶液。
将68株重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，均显示单一条带，即得到的电泳纯的目的蛋白。目的蛋白即优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白。
检测将各个重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度，67株重组菌得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度均为3.7-4.0mg/ml之间，1株重组菌得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度为24.1mg/ml(将该株重组菌命名为大肠埃希氏菌BL21/pET28a-PolFNλ1-IL2)。
3、重组菌的保藏
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-PolFNλ1-IL2，已于2018年06月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15920。
三、重组菌的构建和制备目的蛋白的能力比较
1、重组菌的获得
将重组质粒甲导入大肠杆菌BL-21(DE3)，得到20株重组菌。
2、各株重组菌制备目的蛋白的能力比较
分别将步骤1制备的20株重组菌进行检测，方法同步骤二的2。
将20株重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，均显示单一条带，即得到的电泳纯的目的蛋白。目的蛋白即优化前PoIFNλ1-IL2融合蛋白。
检测将各个重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度，20株重组菌得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度均为2.5-2.7mg/ml之间。
将20株重组菌中制备目的蛋白能力最强的一株重组菌命名为重组菌甲。
四、重组菌的构建及其制备目的蛋白的能力比较
1、重组菌的获得
将重组质粒乙导入大肠杆菌BL-21(DE3)，得到20株重组菌。
2、各株重组菌制备目的蛋白的能力比较
分别将步骤1制备的20株重组菌进行检测，方法同步骤二的2。
将20株重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，均显示单一条带，即得到的电泳纯的目的蛋白。目的蛋白即优化前猪PoIFNλ1蛋白。
检测将各个重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度，20株重组菌得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度均为1.1-1.3mg/ml之间。
将20株重组菌中制备目的蛋白能力最强的一株重组菌命名为重组菌乙。
步骤二、步骤三和步骤四的结果表明：采用相同的表达载体和宿主菌，优化前PoIFNλ1-IL2融合蛋白的产量显著高于优化前猪PoIFNλ1蛋白的产量，优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白的产量显著高于优化前PoIFNλ1-IL2融合蛋白的产量。
实施例2、目的蛋白的功能(动物试验验证)
试验动物为长白猪(40日龄，每只体重为10kg)。
本实施例中所用到的优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白为实施例1的步骤二中采用大肠埃希氏菌BL21/pET28a-PolFNλ1-IL2制备得到的。本实施例中所用到的优化前PoIFNλ1-IL2融合蛋白为实施例1的步骤三中采用重组菌甲制备得到的。本实施例中所用到的优化前猪PoIFNλ1蛋白为实施例1的步骤四中采用重组菌乙制备得到的。
组合物Ⅰ由优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白、白油和稀释液组成，充分混匀乳化。组合物Ⅱ由优化前PoIFNλ1-IL2融合蛋白、白油和稀释液组成，充分混匀乳化。组合物Ⅲ由优化前猪PoIFNλ1蛋白、白油和稀释液组成，充分混匀乳化。白油的功能为佐剂，SEPPIC S.A，MONTANIDE ISA 11R VG。稀释液为pH7.2的PBS缓冲液。
将试验动物分成7组，每组24只，分别处理如下(均为单次给药)：
第一组：通过滴鼻的方式，每头试验动物给予1mL组合物Ⅰ，优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白的给药剂量为0.1mg/kg试验动物，白油的给药剂量为0.1mg/kg试验动物；
第二组：通过肌肉注射的方式，每头试验动物给予1mL组合物Ⅰ，优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白的给药剂量为0.1mg/kg试验动物，白油的给药剂量为0.1mg/kg试验动物；
第三组：通过滴鼻的方式，每头试验动物给予1mL组合物Ⅱ，优化前PoIFNλ1-IL2融合蛋白的给药剂量为0.1mg/kg试验动物，白油的给药剂量为0.1mg/kg试验动物；
第四组：通过肌肉注射的方式，每头试验动物给予1mL组合物Ⅱ，优化前PoIFNλ1-IL2融合蛋白的给药剂量为0.1mg/kg试验动物，白油的给药剂量为0.1mg/kg试验动物；
第五组：通过滴鼻的方式，每头试验动物给予1mL组合物Ⅲ，优化前猪PoIFNλ1蛋白的给药剂量为0.1mg/kg试验动物，白油的给药剂量为0.1mg/kg试验动物；
第六组：通过肌肉注射的方式，每头试验动物给予1mL组合物Ⅲ，优化前猪PoIFNλ1蛋白的给药剂量为0.1mg/kg试验动物，白油的给药剂量为0.1mg/kg试验动物；
第七组：通过滴鼻的方式，每头试验动物给予1mL生理盐水。
给药当天作为试验第1天，试验第21天进行攻毒。攻毒采用鼻内接种的方式，每头试验动物接种1ml病毒液。病毒液为猪流感病毒A/California/04/2009A(H1N1)的病毒液，1ml病毒液中猪流感病毒A/California/04/2009A(H1N1)的含量为1000PFU。
试验第24-26天，统计各组的流感发病率。在该时间段出现如下三个症状中两个以上症状的猪判断为发病猪：①不采食；②呼吸困难；③体温为40.5℃以上。
第一组的流感发病率为8.33％。第二组的流感发病率为12.5％。第三组的流感发病率为20.83％。第四组的流感发病率为25％。第五组的流感发病率为41.67％。第六组的流感发病率为50％。第七组的流感发病率为100％。
实施例3、干扰素活性检测
细胞培养液：含10％FBS的DMEM培养液。
一、干扰素活性检测方法
1、细胞制备
取生长良好的PK-15细胞，消化后用细胞培养液悬浮，得到细胞浓度为5×105个/mL的细胞悬液；将细胞悬液加至96孔细胞培养板(100μl/孔)，在37℃、5％CO2条件下培养8-10h使其成为单层细胞。
2、采用细胞培养液为溶剂，先将待测物质溶解或稀释，使蛋白浓度为0.001mg/ml，作为母液，再将母液进行4倍梯度稀释，稀释6个梯度，得到各种稀释液。
3、取完成步骤1的细胞培养板，吸弃上清；3个阳性对照孔加入细胞培养液(100μl/孔)，3个阴性对照孔加入细胞培养液(100μl/孔)，其它孔加入步骤2得到的稀释液(100μl/孔)，每种稀释液设置3个复孔；然后在37℃、5％CO2条件下培养12-15h。
4、取VSV病毒，用无血清DMEM培养液稀释，得到病毒浓度为1000TCID50/ml的病毒稀释液。
5、取完成步骤3的细胞培养板，吸弃上清；3个阳性对照孔加入步骤4制备的病毒稀释液(100μl/孔)，3个阴性对照孔加入无血清DMEM培养液(100μl/孔)，其它孔加入步骤4制备的病毒稀释液(100μl/孔)；然后在37℃、5％CO2条件下培养24h。
6、取完成步骤5的细胞培养板，吸弃上清，加入结晶紫染色液(100μl/孔)，然后室温放置30min。
7、取完成步骤6的细胞培养板，吸弃上清，用双蒸水冲洗，然后加入脱色液(100μl/孔)，然后室温放置10min。
8、利用酶标仪测定OD570nm值并记录。
以能抑制50％细胞病变的干扰素含量定义为一个活性单位，运用Reed-Muench法计算干扰素效价，即能抑制50％细胞病变的稀释倍数，结果见表1。
表1运用Reed-Muench法计算干扰素效价
Figure BDA0001721789880000061
Figure BDA0001721789880000071
X：阴性对照孔的OD570平均值；
Y：阳性对照孔的OD570平均值。
根据上表计算各项值，最后根据G项按照如下公式计算干扰素效价(假设上述计算中G4项计算值大于0.5，而G5项计算值小于0.5)：
待测物质的干扰素效价(U/0.001mg)＝预先稀释倍数×4(4+(G4-0.5)/(G4-G5))。
二、优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白的干扰素活性
本步骤中所用到的优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白为实施例1的步骤二中采用大肠埃希氏菌BL21/pET28a-PolFNλ1-IL2制备得到的。
待测物质分别为如下：新制备的优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白(三个批次)、将优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白4℃-8℃保存6个月(三个批次)、将优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白4℃-8℃保存12个月(三个批次)、将优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白4℃-8℃保存18个月(三个批次)、将优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白4℃-8℃保存24个月(三个批次)、将优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白25℃保存1个月(三个批次)、将优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白25℃保存3个月(三个批次)、将优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白25℃保存6个月(三个批次)。
按照步骤一的方法检测干扰素活性。
新制备的优化后PoIFNλ1-IL2融合蛋白的干扰素效价为2×105U/mg。
待测物质的干扰素效价见表2。
表2
Figure BDA0001721789880000072
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用
<130> GNCYX181500
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 316
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Gly Pro Val Pro Thr Phe Lys Pro Thr Thr Thr Arg Lys Gly Cys His
1 5 10 15
Met Gly Gln Cys Gln Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Lys Gly Phe Lys
20 25 30
Lys Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Ser Leu Lys Asn Trp Ser
35 40 45
Cys Ser Ser Pro Leu Phe Pro Arg Thr Arg Asp Leu Arg Gln Leu Gln
50 55 60
Val Trp Glu Arg Leu Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Asp Leu Thr Leu
65 70 75 80
Lys Val Leu Arg Ala Ala Ala Asp Ser Ser Leu Gly Val Thr Leu Asp
85 90 95
Gln Pro Leu Arg Thr Leu His His Ile His Val Glu Leu Gln Ala Cys
100 105 110
Ile Arg Ala Gln Pro Thr Ala Gly Ser Arg Leu Gln Gly Arg Leu Asn
115 120 125
His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Thr Lys Lys Glu Ser Gln Gly
130 135 140
Phe Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe His Leu Leu Val Arg
145 150 155 160
Asp Leu Arg Ser Val Thr Ser Gly Asp Leu His Ile Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Asn Thr
180 185 190
Lys Lys Gln Leu Glu Pro Leu Leu Leu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Lys
195 200 205
Glu Val Lys Asn Tyr Glu Asn Ala Asp Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe
210 215 220
Lys Phe Tyr Met Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys
225 230 235 240
Leu Val Glu Glu Leu Lys Ala Leu Glu Gly Val Leu Asn Leu Gly Gln
245 250 255
Ser Lys Asn Ser Asp Ser Ala Asn Ile Lys Glu Ser Met Asn Asn Ile
260 265 270
Asn Val Thr Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Cys Glu Cys
275 280 285
Glu Tyr Asp Asp Glu Thr Val Thr Ala Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp
290 295 300
Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Tyr Ser Thr Leu Thr
305 310 315
<210> 2
<211> 951
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ggtccggttc cgaccttcaa accgaccacc acccgtaaag gttgccacat gggtcagtgc 60
cagtctctgt ctccgcagga actgaaaggt ttcaaaaaag ctaaagacgc tctggaagaa 120
tctctgtctc tgaaaaactg gtcttgctct tctccgctgt tcccgcgtac ccgtgacctg 180
cgtcagctgc aggtttggga acgtctggtt gctctggaag ctgaactgga cctgaccctg 240
aaagttctgc gtgctgctgc tgactcttct ctgggtgtta ccctggacca gccgctgcgt 300
accctgcacc acatccacgt tgaactgcag gcttgcatcc gtgctcagcc gaccgctggt 360
tctcgtctgc agggtcgtct gaaccactgg ctgcaccgtc tgcaggaagc taccaaaaaa 420
gaatctcagg gtttcctgga agcttctgtt accttcaacc tgttccacct gctggttcgt 480
gacctgcgtt ctgttacctc tggtgacctg cacatcggcg gtggtggtag cggcggtggt 540
ggtagtgctc cgacctcttc ttctaccaaa aacaccaaaa aacagctgga accgctgctg 600
ctggacctgc agagcctgct gaaagaagtt aaaaactacg aaaacgctga cctgtctcgt 660
atgctgacct tcaaattcta catgccgaaa caggctaccg aactgaaaca cctgcagtgc 720
ctggttgaag aactgaaagc tctggaaggt gttctgaacc tgggtcagtc taaaaactct 780
gactctgcta acatcaaaga atctatgaac aacatcaacg ttaccgttct ggaactgaaa 840
ggttctgaaa cctcttgcga atgcgaatac gacgacgaaa ccgttaccgc tgttgaattc 900
ctgaacaaat ggatcacctt ctgccagtct atctactcta ccctgaccta a 951
<210> 3
<211> 316
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Gly Pro Val Pro Thr Phe Lys Pro Thr Thr Thr Arg Lys Gly Cys His
1 5 10 15
Met Gly Gln Phe Gln Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Lys Gly Phe Lys
20 25 30
Lys Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Ser Leu Lys Asn Trp Ser
35 40 45
Cys Ser Ser Pro Leu Phe Pro Arg Thr Arg Asp Leu Arg Gln Leu Gln
50 55 60
Val Trp Glu Arg Leu Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Asp Leu Thr Leu
65 70 75 80
Lys Val Leu Arg Ala Ala Ala Asp Ser Ser Leu Gly Val Thr Leu Asp
85 90 95
Gln Pro Leu Arg Thr Leu His His Ile His Val Glu Leu Gln Ala Cys
100 105 110
Ile Arg Ala Gln Pro Thr Ala Gly Ser Arg Leu Gln Gly Arg Leu Asn
115 120 125
His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Thr Lys Lys Glu Ser Gln Gly
130 135 140
Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe His Leu Leu Val Arg
145 150 155 160
Asp Leu Arg Ser Val Thr Ser Gly Asp Leu His Ile Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Asn Thr
180 185 190
Lys Lys Gln Leu Glu Pro Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu Lys
195 200 205
Glu Val Lys Asn Tyr Glu Asn Ala Asp Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe
210 215 220
Lys Phe Tyr Met Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys
225 230 235 240
Leu Val Glu Glu Leu Lys Ala Leu Glu Gly Val Leu Asn Leu Gly Gln
245 250 255
Ser Lys Asn Ser Asp Ser Ala Asn Ile Lys Glu Ser Met Asn Asn Ile
260 265 270
Asn Val Thr Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Phe Glu Cys
275 280 285
Glu Tyr Asp Asp Glu Thr Val Thr Ala Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp
290 295 300
Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Tyr Ser Thr Leu Thr
305 310 315
<210> 4
<211> 951
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ggtccggttc cgaccttcaa accgaccacc acccgtaaag gttgccacat gggtcagttc 60
cagtctctgt ctccgcagga actgaaaggt ttcaaaaaag ctaaagacgc tctggaagaa 120
tctctgtctc tgaaaaactg gtcttgctct tctccgctgt tcccgcgtac ccgtgacctg 180
cgtcagctgc aggtttggga acgtctggtt gctctggaag ctgaactgga cctgaccctg 240
aaagttctgc gtgctgctgc tgactcttct ctgggtgtta ccctggacca gccgctgcgt 300
accctgcacc acatccacgt tgaactgcag gcttgcatcc gtgctcagcc gaccgctggt 360
tctcgtctgc agggtcgtct gaaccactgg ctgcaccgtc tgcaggaagc taccaaaaaa 420
gaatctcagg gttgcctgga agcttctgtt accttcaacc tgttccacct gctggttcgt 480
gacctgcgtt ctgttacctc tggtgacctg cacatcggcg gtggtggtag cggcggtggt 540
ggtagtgctc cgacctcttc ttctaccaaa aacaccaaaa aacagctgga accgctgctg 600
ctggacctgc agctgctgct gaaagaagtt aaaaactacg aaaacgctga cctgtctcgt 660
atgctgacct tcaaattcta catgccgaaa caggctaccg aactgaaaca cctgcagtgc 720
ctggttgaag aactgaaagc tctggaaggt gttctgaacc tgggtcagtc taaaaactct 780
gactctgcta acatcaaaga atctatgaac aacatcaacg ttaccgttct ggaactgaaa 840
ggttctgaaa cctctttcga atgcgaatac gacgacgaaa ccgttaccgc tgttgaattc 900
ctgaacaaat ggatcacctt ctgccagtct atctactcta ccctgaccta a 951
<210> 5
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ggtccggttc cgaccttcaa accgaccacc acccgtaaag gttgccacat gggtcagttc 60
cagtctctgt ctccgcagga actgaaaggt ttcaaaaaag ctaaagacgc tctggaagaa 120
tctctgtctc tgaaaaactg gtcttgctct tctccgctgt tcccgcgtac ccgtgacctg 180
cgtcagctgc aggtttggga acgtctggtt gctctggaag ctgaactgga cctgaccctg 240
aaagttctgc gtgctgctgc tgactcttct ctgggtgtta ccctggacca gccgctgcgt 300
accctgcacc acatccacgt tgaactgcag gcttgcatcc gtgctcagcc gaccgctggt 360
tctcgtctgc agggtcgtct gaaccactgg ctgcaccgtc tgcaggaagc taccaaaaaa 420
gaatctcagg gttgcctgga agcttctgtt accttcaacc tgttccacct gctggttcgt 480
gacctgcgtt ctgttacctc tggtgacctg cacatctaa 519

Claims (4)

1.大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-PolFNλ1-IL2，其保藏编号为CGMCCNo.15920。
2.权利要求1所述大肠埃希氏菌在制备特异蛋白质中的应用；所述特异蛋白质如序列表的序列1所示。
3.权利要求1所述大肠埃希氏菌在制备猪病毒性传染病疫苗中的应用。
4.权利要求1所述大肠埃希氏菌在制备产品中应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)：
(a)作为猪免疫增强剂；
(b)制备猪免疫增强剂。
CN201810734991.4A 2018-07-06 2018-07-06 一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用 Active CN108823138B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810734991.4A CN108823138B (zh) 2018-07-06 2018-07-06 一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810734991.4A CN108823138B (zh) 2018-07-06 2018-07-06 一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108823138A CN108823138A (zh) 2018-11-16
CN108823138B true CN108823138B (zh) 2020-05-01

Family

ID=64136157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810734991.4A Active CN108823138B (zh) 2018-07-06 2018-07-06 一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108823138B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101139390A (zh) * 2007-08-14 2008-03-12 中国科学院微生物研究所 猪γ干扰素及其编码基因与应用
CN103923209A (zh) * 2014-05-13 2014-07-16 北京凯因科技股份有限公司 一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物
CN103936861A (zh) * 2014-02-28 2014-07-23 南昌大学 重组草鱼干扰素-白介素1二联蛋白的制备方法及应用
CN106832004A (zh) * 2017-02-20 2017-06-13 中国科学院微生物研究所 一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用
CN107245108A (zh) * 2017-08-09 2017-10-13 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 牛白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种牛长效干扰素

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050287118A1 (en) * 2003-11-26 2005-12-29 Epitomics, Inc. Bacterial plasmid with immunological adjuvant function and uses thereof
CN103215244B (zh) * 2013-04-28 2014-11-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种碱性果胶酶PelN及其编码基因与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101139390A (zh) * 2007-08-14 2008-03-12 中国科学院微生物研究所 猪γ干扰素及其编码基因与应用
CN103936861A (zh) * 2014-02-28 2014-07-23 南昌大学 重组草鱼干扰素-白介素1二联蛋白的制备方法及应用
CN103923209A (zh) * 2014-05-13 2014-07-16 北京凯因科技股份有限公司 一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物
CN106832004A (zh) * 2017-02-20 2017-06-13 中国科学院微生物研究所 一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用
CN107245108A (zh) * 2017-08-09 2017-10-13 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 牛白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种牛长效干扰素

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Vaccination with recombinant L7/L12-truncated Omp31 protein induces protection against Brucella infection in BALB/c mice;Golshani, M等;《MOLECULAR IMMUNOLOGY》;20150630;第65卷(第2期);第287-292页，参见全文 *
重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白对鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响研究;闫若潜等;《第九届全国免疫学学术大会论文集》;20140118;第705-706页，参见全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108823138A (zh) 2018-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101948845B (zh) 编码鸡α干扰素的优化基因及其在制备鸡α干扰素中的应用
CN101818154B (zh) 编码猪α干扰素的基因片段及其应用
CN102041263B (zh) 鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因
WO2002080958A1 (fr) Interferon supercompose de recombinaison utilise comme inhibiteur de l&#39;antigene de surface et de l&#39;antigene e de l&#39;hepatite b
CN102643835A (zh) 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用
CN101514229B (zh) 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物
CN111455006B (zh) 大肠杆菌表达的重组鸡干扰素α产品及其制备方法与用途
CN106939042A (zh) 一种猪α干扰素及其应用
CN108823138B (zh) 一株工程菌及其在制备融合干扰素中的应用
CN113045670B (zh) 一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用
WO2020108427A1 (zh) 一种新型干扰素α及其制备方法、组合物和用途
CN108822219B (zh) 一种融合干扰素及其在制备粘膜免疫增强剂中的应用
CN106868035B (zh) 一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法
CN101001644B (zh) 空间构象改变的干扰素及其应用
CN108653194B (zh) 一种以融合干扰素为活性成分的嚼糖剂型药物
CN102351952A (zh) 一种低糖化突变体干扰素-λ1、其表达、纯化方法及其应用
KR20060130009A (ko) 변경된 공간 구조를 갖는 인터페론의 용도
CN114539426A (zh) 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法
CN112370524A (zh) 一种抗病毒组合物及其制备方法和应用
CN106832004A (zh) 一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用
KR101431172B1 (ko) 변경된 공간 구조를 갖는 인터페론의 용도
CN111218452A (zh) 一种重组人tsg-6基因、重组人tsg-6蛋白标准品及其制备方法和应用
CN111303302A (zh) 一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用
CN112266421B (zh) 一种重组融合蛋白及其制备的预防pcv2病毒感染的疫苗
CN112961232B (zh) 一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant