CN101001644B - 空间构象改变的干扰素及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于在受试体中预防或者治疗严重急性呼吸道综合症的方法，包括给予患者有效量的重组高效复合干扰素或者其功能等效物。本发明提供了抑制严重急性呼吸道综合症病原体的方法，包含将所述制剂与有效量的高效复合干扰素或者其等效物与病原体接触。

Description

空间构象改变的干扰素及其应用

本申请要求了提交于2003年8月28日的美国专利申请No.60/498,449、提交于2003年8月28日的美国专利申请No.60/498,785和提交于2003年8月28日的美国专利申请No.60/498,923的优先权。本申请同时要求了提交于2004年3月5日的印度专利申请No.279/MUM/2004和提交于2004年3月5日的印度专利申请No.280/MUM/2004的优先权。以上申请的内容全部被加入到本申请中作为参考。

在本申请中引用了各种参考文献。将这些出版物全部加入本申请作为参考，其与本发明相结合有助于全面地描述与本发明有关的技术状况。

技术领域

本发明涉及一种改变了空间构象的重组高效复合干扰素(recombinant super-compound interferon)(rSIFN-co)。本发明中所述rSIFN-co的特征之一是它不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA(脱氧核糖核酸)复制，而且能抑制HBeAg及HBsAg的分泌。

背景技术

IFN-con是将天然人α-干扰素亚型中最常见的保守性氨基酸用遗传工程的方法建构而成的一种全新干扰素分子.美国专利4,695,623和4,897,471中对此种干扰素已经有所描述。IFN-con已被证明具有广谱的干扰素活性和较强的抗病毒和抗肿瘤及天然杀伤细胞活性。美国Amgen的专利5,372,808公开了用

(interferon alfacon-1)治疗疾病的方法，中国专利97193506.8公开了应用(interferonalfacon-1)再次治疗丙型肝炎的方法，中国深圳九生生物工程有限公司的专利98114663.5公开了重组人共有干扰素α治疗乙型肝炎和丙型肝炎的方法。

美国食品与药品管理局(FDA)已于1997年底批准了美国Amgen公司用大肠杆菌生产的(interferon alfacon-1)用于临床丙肝病人的治疗。

当检测出表面抗原(HBsAg)阳性和e抗原(HBeAg)阳性者即可判定为乙型肝炎患者，目前临床上采用各种类型的α-干扰素对慢性乙型肝炎进行治疗。干扰素与细胞的表面细胞膜受体结合而抑制DNA和RNA(核糖核酸)的复制，包括诱导某些酶阻止病毒感染细胞中病毒的复制。所有的干扰素仅能抑制病毒DNA复制，而不能抑制e抗原与s抗原。

本申请在此详细描述了重组高效复合干扰素、制备方法及其应用。

首先发现于中国广州省的一种非典型性肺炎，即严重急性呼吸道综合症(SARS)已经传播到几个国家。2003年2-3月间已在香港、越南及加拿大发现类似病例。世界卫生组织(WHO)已对该病发出全球警报。2003年3月中旬，远东地区照顾患严重呼吸道疾病患者的医务工作者及家庭成员中出现SARS病例。其中许多都可通过不同的途径追溯到一名从广东到香港参观的医务工作者，该人因肺炎在香港住院并死亡。截至2003年4月WHO已接到来自25个国家的上千名SARS病例及几百个因SARS引起的死亡报告。这些病例中的大多数是在家中或医疗场所与SARS病人接触之后发生。本发明提供了一种预防和/或治疗SARS的方法。

目前在亚洲，另一个引起恐慌的流行病是禽流感病毒(H5N1)。禽流感是由甲型流感病毒所引起的鸟类传染性疾病。共有15种鸟类流感病毒亚性，H5N1受到特殊的关注是因为它快速变异，不仅感染动物，还感染人类。截止2004年2月4日，经确认死于禽流感的共有13人。世界卫生组织全球流感网络的实验室已经着手于控制病毒和防止更多的死亡发生。但是，要完全了解H5N1的危害以及它的传播途径，需要更多更精确的实验。此外，抗病毒药物只针对健康的人来治疗或者防止甲型流感病毒株才有效。参见http://www.who.int/csr/don/2004_01_15/en，2004年1月15日。

圣·尤大医院和其他顶级流感实验室的研究者正在竞相制造原型人类疫苗来对抗H5N1。他们期望原型疫苗能够在三周内完成。然而，科学家们担心H5N1在制造出疫苗前会发展成为人类超级流感。参见《华尔街日报》，“Scientists Rush to Greate Vaccine for Bird Flu-Just in Case，2004年1月28日”。

本申请在此描述了重组高效复合干扰素、制备方法及其应用。特别是在此公布的重组高效复合干扰素能够抑制，预防和/或治疗肝炎病毒，SARS病毒，或病毒引起的上呼吸道疾病和禽流感病毒。

发明简述

本发明提供了一种通过向目标个体施予有效量的重组高效复合干扰素及其等效物抑制、预防或治疗病毒性疾病或肿瘤的方法。

本发明提供的上述方法中，重组高效复合干扰素通过以下方式给药：口服、静脉注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻腔或粘膜给药、通过呼吸器吸入。

本发明提供了一种预防或治疗病毒性疾病的方法，其特征是所说的病毒性疾病包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其它类型的肝炎、由以下病毒引起的病毒感染：EB病毒、细胞巨化病毒、单纯性疱疹病毒、其它疱疹病毒、乳头瘤病毒、痘病毒、细小核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒、或III型人T细胞白血病病毒。

本发明提供了一种抗肝炎活性的方法。其特征是它可抑制HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg的产生。

本发明提供了一种预防或治疗上呼吸道感染疾病的方法。

本发明提供了一种预防或治疗肿瘤或癌症的方法，其特征是所说的肿瘤包括：皮肤癌、基底细胞癌及恶性黑色素瘤、肾细胞癌、肝癌、甲状腺癌、鼻咽癌、实体肿瘤、前列腺癌、胃/腹癌、食道癌、直肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、浅表膀胱癌、血管瘤、表皮样癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、血癌、急性血癌、慢性血癌、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、淋巴腺瘤、多发性骨髓瘤、红血球过多病、卡波济氏肉瘤。

本发明提供了一种通过向目标个体施予有效量的重组高效复合干扰素或其功能等效物预防或治疗严重急性呼吸道综合症(SARS)或病毒引起的上呼吸道疾病的方法。

重组高效复合干扰素(rSIFN-co)通过以下方式给药：口服、静脉注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻腔或粘膜给药、通过呼吸器吸入。

本发明提供了一种抑制严重急性呼吸道综合症病原体或病毒引起的上呼吸道疾病的方法。其特征是使病原体与有效量的重组高效复合干扰素或其功能等效物接触。

本发明还提供了一种抑制严重急性呼吸道综合症病毒、严重急性呼吸道综合症病毒感染细胞的或病毒引起的上呼吸道疾病的方法。其特征是使有效量的重组高效复合干扰素与所述病毒或细胞接触。所述的接触可是直接的也可是间接的。

本发明提供了一种含有有效量的、能抑制、预防及治疗严重急性呼吸道综合症病毒、严重急性呼吸道综合症病毒感染的细胞或病毒引起的上呼吸道疾病的重组高效复合干扰素和适当载体的组合物。

本发明提供了一种含有有效量的、能在受试体(subject)中抑制、预防及治疗严重急性呼吸道综合症、严重急性呼吸道综合症病毒感染的细胞或病毒引起的上呼吸道疾病的重组高效复合干扰素和适当药用载体的药用组合物。

附图说明

图1.根据大肠杆菌密码子的使用而设计的rSIFN-co cDNA序列和推断的rSIFN-co的氨基酸序列。

图2.另一种高效复合干扰素序列。

图3.pLac T7克隆载体质粒图。

图4.pHY-4表达载体质粒图。

图5.表达质粒pHY-5构建程序图。

图6-A.

圆二色谱图

(四川大学分析测试中心检测)

波长范围：250nm-190nm

灵敏度：2m°/cm

光程：0.20cm

仪器：圆二色谱仪J-500C

样品：含30μg/ml的IFN-conl，5.9mg/ml的NaCl和3.8mg/ml的Na₂P0₄，pH 7.0

(interferon alfacon-1)，是由美国安进公司生产，也称为共有干扰素，作为治疗成年人慢性丙型肝炎(HCV)的药品上市销售。它是目前FDA唯一批准的一种根据推理性药物设计进行生物优化得到的干扰素。并且，是有明确资料说明可用于干扰素治疗无应答或复发的患者。Intermune于2002年1月重新推出

同时开展了针对美国肝病学家的教育活动，介绍干复津的正确安全使用方法。这代表着占HCV患者50％的采用现有治疗方法治疗无效的患者有了新的希望。参见http://www.intermune.com/wt/itmn/infergen，2003年8月27日。

图6-B.参考文献中

圆二色谱图“Journal of Interferon andCytokine Research.16：489-499(1996)”

共有序列干扰素亚群的圆二色图谱。用阴离子交换色谱柱分离共有序列干扰素。将样品在10mM磷酸钠、PH7.4中透析。用Jasco J-170旋光分光计、在15℃的恒温箱中进行测量。(——)酰化产物形态；(--)cis末端形态；(···)met末端形态。A.远紫外光谱。B.近紫外光谱。

图6-C.rSIFN-co圆二色谱图

波长范围：320nm-250nm

灵敏度：2m°/cm

光程：2cm

仪器：圆二色谱仪J-500C

样品：含0.5mg/m1的rSIFN-co，5.9mg/ml的NaCl，3.8mg/ml的Na₂PO₄，pH 7.0

图6-D.rSIFN-co圆二色谱图

波长范围：250nm-190nm

灵敏度：2m°/cm

光程：0.20cm

仪器：圆二色谱仪J-500C

样品：含30μg/ml的rSIFN-co，5.9mg/ml的NaCl，3.8mg/ml的Na₂PO₄，pH 7.0

由以上的图谱可明显看出，rSIFN-co与

具有不同的二级甚至三级结构。

图7A-C.重组高效复合干扰素喷雾剂

高度：90mm

宽度：25mm(底)，6mm(顶)

重量：9g

每瓶容积：0.1ml

图7D.重组高效复合干扰素喷雾剂

首次使用喷雾剂时，取掉喷头罩，在空气中预喷几次直到有液体射出。以后使用喷雾剂时则无须如此。按照图示的方法使用，即：(1)预喷；(2)向下按压喷嘴以释放药物。

图8.不同干扰素对乙肝病毒基因表达抑制的比较。

图9A-1.A组受试者体温变化曲线(5人)

此图是A组5名受试者体温变化的记录。

图9A-2.A组受试者体温变化曲线(6人)

此图是A组另外6名受试者体温变化的记录。

图9B-1.B组受试者体温变化曲线(5人)

此图是B组5名受试者体温变化的记录。

图9B-2.B组受试者体温变化曲线(5人)

此图是B组另外5名受试者体温变化的记录。

图10.rSIFN-co晶体I

图11.rSIFN-co晶体II

图12.rSIFN-co晶体的X一射线衍射图谱

发明详述

本发明提供了一种生产改变空间构象且抗病毒活性增强的重组高效复合干扰素的方法，其中包括：

a)将使用优选密码子编码所述干扰素的核酸分子引入适当的宿主，和

b)将该宿主细胞置于适当的条件下以表达所说的复合干扰素。

本发明提供了一种生产干扰素的方法，其还包括收获表达的干扰素。

本发明提供了一种改变了空间构象的重组高效复合干扰素及其等效物。本发明发现，一级结构相同的蛋白质可能表现出不同的生物学活性。如以下实例所证明，本申请公开了两种具有相同氨基酸序列但具有不同活性的蛋白质。这些蛋白质的活性有时可能得到提高，有时由于空间结构的改变而表现出新的功效。

等效物是指一种在功能上与复合干扰素相似的分子。它可以是一种缺失体，替代物或原序列的置换突变型。另外，本发明也意图涵盖重组高效复合干扰素的模拟分子(mimics)。模拟分子可以是一种肽、多肽或小的化学个体。

在此所描述的干扰素包括，但不仅限于干扰素α、β或ω。在一个实例中，它是IFN-1α、IFN-2b或其它的突变体。

在另一实例中，展示了高效复合干扰素比美国专利No.4695623及No.4897471所描述的干扰素具有更强的效力。本高效复合干扰素被认为具有独特的二级或三级结构。(见图6)

在此所描述的高效复合干扰素空间构象的改变是源于其生产工艺的改变。

以上所描述的高效复合干扰素可能是由一个含有特殊启动子的高效表达系统所生产。在一个实例中，该启动子是P_BAD。其他普通技术人员所知的其它可诱导启动子如：热休克启动子或重金属诱导型启动子，也可能被用于该发明。

高效复合干扰素也可能是根据大肠杆菌密码子使用对野生型序列进行调整并人工合成cDNA而得。对密码子使用(偏爱性)的详细探论可在美国专利4,695,623中的第6栏，第41行-第7栏第35行中查到。

以上所描述的高效复合干扰素具有抗病毒和抗肿瘤活性，并因此被用于抑制、预防和治疗病毒性疾病、肿瘤或癌症。

在此，所说的病毒病毒性疾病包括但不仅限于：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其它类型的肝炎。由以下病毒引起的感染：EB病毒、细胞巨化病毒、单纯性疱症病毒、其它疱症病毒、乳头瘤病毒、痘病毒、细小核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒、或III型人T细胞白血病病毒。

病毒性上呼吸道感染，通用名伤风，感冒。这是一种上呼吸道接触性病毒感染，症状是黏膜发炎、喷嚏、咽喉痛。它通常由超过200种的不同病毒引起，被称为鼻病毒。感冒并不是由导致流感的相同病毒引起的。感冒通过患者咳嗽或喷嚏飞沫传播或被感染者通过与患者手接触传播。儿童中感冒发病率最高，并随着年龄增长发病率降低，因为疾病后对引起感冒的病毒的形成了免疫性。逐渐地，成人产生了对引起感冒的各种病毒的免疫力。儿童一年可能会患10次感冒，而成人一年可能会患3次感冒。

美国疾病控制和预防中心估计美国每年上呼吸道感染(URIs)的发病率约为4.29亿，导致直接和间接的25亿的医疗保健费用的支出。

感冒常常由数百种鼻病毒中的一种(52％)引起，但是冠状病毒(8％)或呼吸道合胞体病毒(7％)也可能导致感染。其他病毒，例如流感(6％)，副流感和腺病毒，可能产生呼吸道症状，但是这些常常伴随着肺炎、发热或发冷。

感冒为季节性发病，常常在9月中旬起发病和4月底、5月初结束。感冒是完全接触性传染的并且能通过人与人接触或空气播散飞沫传播。上呼吸道感染症状常常在接触后1-2天开始并持续1-2周，即使如此病毒脱落和接触传染仍然持续2到3周。症状存在发生并发症的可能，如鼻窦炎，或下呼吸道疾病如支气管炎或肺炎。

普通感冒有许多种明显症状，包括不适，鼻塞，流鼻涕，干咳，轻微咽喉痛，在一些病例中，有低烧。因为症状类似，感冒可能被误认为常年过敏性鼻炎，但是由于两者慢性的差异，变态反应通常可以被排除。

如果患者患病毒性上呼吸道感染，有多种治疗方法可用。因为大多数的这些感染都能自我控制，临床医师常常建议休息和饮水，但是其他的治疗包括环境疗法和营养治疗，非处方药和处方药及解充血药和抗组安剂产品，新抗组安剂和抗胆碱能药，抗生素。表1列出了常用咳嗽和感冒药及其副作用。

表1.常用咳嗽和感冒药及其副作用概况

药物	用途	副作用和注意事项
			雾化β2促效药(沙丁胺醇)	反向炎症后的支气管痉挛	提高心率并可能导致震颤
基于乙醇的液体组合产品	治疗多种症状	潜在的困倦和协调问题
			α1促效药(口服)(例如，伪麻黄碱，苯丙醇胺)	减轻充血	可能导致心动过速，神经过敏暂时性兴奋，头晕，困倦，血压升高
抗胆碱能化合物：异丙托铵溴化物(pratropiumbromide)，(局部)	干燥	可能导致鼻发干和偶见的鼻出血
			其他抗胆碱能类(例如，甲基东莨菪碱，阿托品，莨菪碱)	干燥	可能导致静态平衡位，热感调节异常，口干燥，便秘
抗组织胺类(口服)(例如，氯苯那敏，苯海拉明)	干燥	困倦，口干燥，直立性高血压
			苯佐那酯胶囊	咳嗽抑制，局部麻醉	咀嚼导致嘴麻；导致镇静，头晕
可待因，氢可酮	咳嗽抑制	困倦，便秘，恶心
			右美沙芬	咳嗽抑制	可能导致困倦，但是副作用不
		常见

愈创甘油醚	促进咳痰(粘液溶解)	无副作用；必须饮用大量水促进药效
			局部解充血药(如，羟甲唑啉，苯福林)	减轻充血	局部发热；长期使用可能产生依赖
锌和维生素C锭剂	可能减少症状的严重性和持续期	可能性味觉紊乱，如果是易感者，增加草酸盐结石。

摘要来自：

http://www.physsportsmed.com/issues/1998/02feb/swain.htm

用高效复合干扰素预防和治疗上呼吸道感染

几乎70-80％的上呼吸道感染是由以下病毒引起的：呼吸道综合病毒，腺病毒、鼻病毒，柯萨奇病毒，冠状病毒及其变异体，流感病毒A及其变异体，流感病毒B及其变异体，副流感病毒及其变异体，或肠道病毒及其变异体。成人上呼吸道感染的一个主要原因是鼻病毒。对于儿童来讲，上呼吸道感染的两个主要原因是呼吸道综合病毒和副流感病毒。

高效复合干扰素在抵抗引起上呼吸道感染的病毒中起着重要作用。高效复合干扰素主要通过两种机制发挥其抗病毒作用：

1.附着在敏感细胞表面并诱导它们产生抗病毒蛋白质，然后阻断病毒细胞在体内的复制和再生。

2.高效复合干扰素能够调节免疫反应，包括T细胞免疫反应，天然杀伤细胞活性，单核体的噬菌作用，甚至在体内生成某些抗体。

在治疗上呼吸道感染中，高效复合干扰素能通过喷雾剂直接作用于感染处。该治疗方法使干扰素首先到达靶细胞，因此，比通过口腔或注射施用干扰素更为安全有效。

使用高效复合干扰素预防和治疗SARS

在取得四川省SARS预防和控制工作组的同意的情况下，高效复合干扰素的分发工作于2003年5月开始进行。高效复合干扰素喷雾剂被分配给处于感染SARS高危区的医院的医生和护士以及预防和控制SARS的国家研究机构。2003年12月19日，3000名使用者中无关于使用喷雾剂产生副作用的报道。此外，四川省的医生和护士或其他使用重组高效复合干扰素喷雾剂的机构无人感染SARS。

因此，本发明提供了一种通过用上述病毒和感染细胞与有效量的高效复合干扰素或其等效物接触，从而抑制、预防或治疗病毒复制或病毒感染细胞的方法。

该高效复合干扰素能有效抑制、预防和治疗以下癌症或肿瘤：

患者1：一名女性卵巢癌患者开始接受注射。她于7月14日，7月16日，7月18日，7月20日和7月22日分别注射了15μg的rSFIN-co，7月14日检查到2000ml的腹水。患者于7月22日接受化疗。8月3日，患者接受腹腔手术，预计腹腔中会有超过2000ml的腹水，但是仅检测到200ml的腹水。卵巢左右两侧和淋巴结癌变，其他器官均正常。

患者2：一名肾癌患者按照如下方案进行治疗。该名患者在半个月内接受了3次9μg和3次15μg的rSFIN-co注射。此后的一个月内，他隔日接受9μg和15μg的rSFIN-co注射。经过该疗程的治疗后，肾活组织检查显示癌细胞没有转移。患者完全痊愈。患者康复后，每隔半年，接受一个月的rSFIN-co肌肉注射，共注射15次，每次15μg。

因此，本发明提供了一种通过与有效量的重组高效复合干扰素或其等效物与所述肿瘤或癌细胞接触，从而抑制肿瘤或癌症细胞生长的方法。

在另一实例中，高效复合干扰素能抑制乙肝病毒DNA的复制及HBsAg和HBeAg的分泌。

本发明还提供了高效复合干扰素或其等效物的人工基因编码序列。设计人工基因是一种普通的技术。在此之前对于合成核苷酸序列的许多方法及其它分子生物学技术已经有了描述。见例如：JosephSambrook and David W.Russell，Molecular Cloning(分子克隆)：Alaboratory Manual，December 2000，published by Cold SpringHarbor Laboratory Press.

本发明提供了一个含有高效复合干扰素或其等效物的基因的载体。

本发明提供了一个含有高效复合干扰素及其等效物的基因的载体的表达系统。其宿主细胞包括但不仅限于原核细胞或真核细胞。

本发明提供了一个包含含有编码高效复合干扰素及其等效物的基因的载体的宿主细胞。

本发明还提供了一种生产重组高效复合干扰素的方法，其中包括：将含有由优选选择的密码子合成的人工基因引入适当的宿主，并将所述说宿主细胞在适当的条件下培养并表达所述的复合干扰素，收获表达的复合干扰素。

该方法还可能包括从发酵液中提取高效复合干扰素，收集包函体，收获的蛋白质的变性及复性。

即使高效复合干扰素与特定浓度的试剂一起使用，该方法仍然保持高效。该过程还可能包括高效复合干扰素的分离及纯化。该过程还进一步包括用纯化的高效复合干扰素生产成冻干剂或液体注射剂。

本发明还提供通过以上方法生产的高效复合干扰素。

本发还提供了一种含有高效复合干扰素或其等效物及适当载体的的组合物。

本发还提供了一种含有重组高效复合干扰素或其等效物及适当药用载体的药用组合物。

本发明还提供了一种治疗或预防病毒性疾病或肿瘤的方法，其包括给予目标个体有效量的高效复合干扰素或其等效物。

本发明提供的上述方法所针对的病毒性疾病包括但不仅限于：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其它类型的肝炎。由以下病毒感染引起的疾病：EB病毒、细胞巨化病毒、单纯性疱疹病毒、其它疱疹病毒、乳头瘤病毒、痘病毒、细小核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒、或III型人T细胞白血病病毒。

本发明所提供的上述方法中高效复合干扰素是通过以下方法给药：口服、静脉注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻腔或粘膜给药、通过呼吸器吸入。

本发明所提供的上述方法中高效复合干扰素是通过以下方法给药，隔日注射9μg或15μg，一周三次，注射24周。

本发明惊奇地发现改变了蛋白质空间构象的重组高效复合干扰素，作为一种制剂不仅能抑制对乙型肝炎病毒DNA复制，而且能在2.2.15细胞中抑制HBsAg、HBeAg的分泌。

本发明的目的之一是提供一种重组高效复合干扰素制剂直接抑制乙肝病毒DNA的复制和表面抗原及e抗原的分泌，使之降低到正常水平。

在一个实施方案中，rSIFN-co是通过重组技术生产的。根据确定的氨基酸序列，根据大肠杆菌密码子的使用重新设计干扰素的DNA序列并人工合成rSIFN-co基因。再用DNA重组技术将rSIFN-co的cDNA序列克隆入大肠杆菌的高表达载体。rSlFN-co的高效表达是通过L-阿拉伯糖诱导/活化表达调控机制激活P_BAD启动子的转录。

这一阿拉伯糖诱导/活化表达调控系统比通常遗传工程生产中所采用的温控、pH调控、IPTG诱导等系统有明显的优点：(1)通常采用的几种调控系统都是以“去阻遏”的形式解除对启动子的抑制作用，从而启动子可介导下游基因的表达。改变温度、pH值本身以及加入IPTG诱导物等都对启动子无直接激活作用。在我们采用的系统中，L-阿拉伯糖不仅解除了对P_BAD启动子的抑制作用，同时又可直接激活P_BAD启动子转录并介导rSlFN-co的高效表达。所以阿拉伯糖诱导/活化调控系统是一种更有效的表达系统；(2)P_BAD启动子活化的程度与加入的L-阿拉伯糖剂量成线性关系。这样可以直接通过改变阿拉伯糖浓度而调节外源基因产物的表达量。加入阿拉伯糖比改变温度和pH值等更容易控制外源基因产物的表达.这一特性对改变包函体的形成等非常有意义。(3)L-阿拉伯糖来源丰富，价廉、安全，这克服其它诱导物如IPTG在这方面的缺点。

本发明实例中用L-阿拉伯糖诱导/活化系统建立了高效、稳定的rSIFN-co表达大肠杆菌工程菌株，通过对该菌株在适宜的条件下的培养发酵，收获菌体，超声破菌并反复洗涤得包函体，通过包函体的变性、复性及一系列纯化工艺，获得了大量高纯度的改变了空间构象的rSIFN-co蛋白质以用于本发明的研究和临床治疗。

以下是一些rSIFN-co的制剂如：片剂、胶囊、口服液、贴剂、注射剂、喷雾剂、栓剂、溶液制剂，推荐的剂型为注射剂。可皮下或静脉注射给药，药物组合物中的载体可使用任何一种适宜的可接受的药物载体，包括糖类、纤维素制品、粘合剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、增溶剂、缓冲剂、防腐剂、增稠剂、配合剂和其他佐剂。

本发还提供了一种含有以上组合物及适当药用载体的药用组合物。

根据本发明的不同目的，“可药用的载体”是指任何标准的药用载体。例如公知的适当载体包括但不仅限于任何标准药用的载体如：磷酸盐缓冲液及各种润湿剂。其它载体可能包括用于片剂、颗粒剂及胶囊等的添加剂。典型的载体常含有如：淀粉、乳液、糖、某种类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐类、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物油脂、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这此载体中也可能还含有调味剂及增色剂及其它成分。这些载体中的成分可用公知的传统方法调制。

本发明提供了一种通过与有效量的重组高效复合干扰素或其功能等效物接触，预防或治疗严重急性呼吸道综合症或病毒引起的上呼吸道疾病的方法。

在上述方法的一个实施方案中，干扰素是α、β或ω。

高效复合干扰素是通过以下方法给药：口服、静脉注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻腔或粘膜给药、通过呼吸器吸入。

在一个实施方案中，该干扰素是通过喷雾设备给药。

在一个具体的实施方案中，这种设备如图7所描述。

在一个实施方案中，干扰素是用冻干剂型。

本发明提供了一种通过用病原体与有效量的高效复合干扰素或其等效物接触，抑制严重急性呼吸道综合症的病原体或病毒引起的上呼吸道疾病的方法。

现已确认SARS的病原体是一种病毒。见Rota等(2003)，Characterization of a Novel Coronavirus Associated with SevereAcute Respiratory Syndrome.Science 1085952www.sciencexpress.org及Marra，et al.(2003)，The Genome Sepuence of the SARS-AssociatedCoronavirus.Science 1085853www.scencexpress.org.

本发明提供了一种所述病毒或细胞与有效量的重组高效复合干扰素及其等效物接触，抑制严重急性呼吸道综合症病毒或严重急性呼吸道综合症病毒感染的细胞或病毒引起的上呼吸道疾病或能够导致上呼吸道疾病的病毒感染的细胞的方法。所说的接触可是间接的，与可是直接的。

本发明提供了一种含有能抑制严重急性呼吸道综合症病毒或严重急性呼吸道综合症病毒感染的细胞或病毒引起的上呼吸道疾病或能够导致上呼吸道疾病的病毒感染细胞的有效量的重组高效复合干扰素同适当载体的组合物。

本发明提供了一种含有能预防或治疗严重急性呼吸道综合症或病毒引起的上呼吸道疾病的有效量的高效复合干扰素同适当载体的组合物。

本发明提供了一种含有能抑制严重急性呼吸道综合症病毒或严重急性呼吸道综合症病毒感染的细胞或病毒引起的上呼吸道疾病的有效量的重组高效复合干扰素同适当药用载体的药用组合物。

本发明提供了一种含有能预防或治疗严重急性呼吸道综合症或病毒引起的上呼吸道疾病的有效量的重组高效复合干扰素同适当药用载体的药用组合物。

本发明提供了一种施给以上所述药用组合物的设备。

在一个优选实例中，所施用的对象是人。显而易见，高效复合干扰素可以施用于其他动物和哺乳动物身上。

本发明提供了一种通过喷雾剂一日三次喷给人体重组高效复合干扰素制剂以预防严重急性呼吸道综合症或病毒引起的上呼吸道疾病的方法。该喷雾剂(spray)规格为3ml，含20mg相当于1千万单位的干扰素。

通过以下实施例将有助于更好地理解本发明。然而，具备专业技术的人应该知道，讨论一种具体的方法和结果只是对本文后所附的权利要求中所指发明的例证。

实施例

实施例1：

IFN-con是将几种天然人α型干扰素亚型中最常见的保守性氨基酸用遗传工程的方法建构而成的一种全新干扰素分子。已证明IFN-con具有广谱的干扰素活性，如较强的抗病毒和肿瘤抑制活性，特别是在抗慢性丙型肝炎方面。

根据已发表的

(interferon alfacon-1)编码DNA序列及推断的氨基酸序列(图1)，我们利用大肠杆菌优先表达密码子重新设计rSIFN-co的cDNA编码序列，然后人工合成rSIFN-co全长cDNA基因。

为了获得高纯度的rSIFN-co蛋白质，将rSIFN-co全长cDNA序列克隆到大肠杆菌高效表达载体中去，然后利用L-阿拉伯糖诱导激活载体中的强P_BAD启动子介导rSIFN-co基因高效表达。

大肠杆菌cDNA序列的合成

rSIFN-co cDNA序列的重新设计

为了在大肠杆菌中得到高效表达，根据大肠杆菌密码子使用重新设计rSIFN-co cDNA序列。由新设计的rSIFN-co cDNA序列推断其编码氨基酸序列与已发表的

(interferon alfacon-1)氨基酸原始序列完全一致(见图1)。

合成rSIFN-co cDNA序列

rSIFN-co cDNA 5′-端和3′-端半分子的合成

用PCR方法直接合成rSIFN-co cDNA 5′-端280bp(I片段)和3′-端268bp(II片段)两个半分子。片段I与片段II有41bp的重叠互补。

(1)化学合成如下寡聚脱氧核苷酸片段

寡聚物A：

5’ ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACC

寡聚物B：

5’CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAGAGGTTCGACGGTAACCAGTTCCAGAAGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTC 3’(SEQ ID NO：8)

寡聚物C：

5’GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCCAGCAGGGATTCGTCCCAAGCAGCGGAGGAGTCTTTGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC 3’(SEQ ID NO：9)

寡聚物D：

5’ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAAC 3’(SEQ ID NO：10)

寡聚物E：

5’GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG 3’(SEQ ID NO：11)

寡聚物F：

5’TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAACGCATGATTTCAGCACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGGGAGTATTTTTTTTCGGTCAGG 3’(SEQ ID NO：12)

PCR反应I合成片段I：用寡聚脱氧核苷酸片段B作为模板，A和C两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，合成长度为280bp的片段I。

PCR I反应混合物(单位：μl)：

无菌蒸馏水   39
	10×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产)       5dNTP组合物(dNTP浓度为2.5mmol/L)                2寡聚物A片段引物(25μmol/L)                     1寡聚物C片段引物(25μmol/L)                     1寡聚物B片段模板(1μmol/L)                      1Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl)  1

总体积                                         50μl

PCR反应周期：95I

2m→(95℃45s→65℃1m→72℃1m)×25周期→72℃10m→4℃

PCR反应II合成片段II：用寡聚脱氧核苷酸片段E作为模板，D和F两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，合成长度为268bp的片段II。

PCR II反应组合物：                       (单位：μl)

无菌蒸馏水                                    3910×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产)      5dNTP组合物(dNTP浓度为2.5mmol/L)               2寡聚物D片段引物(25μmol/L)                    1寡聚物F片段引物(25μmol/L)                    1寡聚物E片段模板(1μmol/L)                     1Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl) 1

总体积                                        50μl

PCR周期：同PCR I

rSIFN-co cDNA分子的组装

采用“重叠-延伸PCR”方法将片段I和片段II组装在一起从而得到完整的rSIFN-co cDNA全长分子序列。分别引入Nde I和Pst I限制性酶切位点，以便于将rSIFN-co cDNA序列克隆到质粒载体中去。

(1)化学合成引物

寡聚物G：5’ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC 3’(SEQ ID NO：13)

寡聚物H：5’ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC 3’(SEQID NO：14)

(2)重叠-延伸PCR反应

PCR反应组合物：                             (单位：μl)

38无菌蒸馏水10×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产) 5dNTP组合物(dNTP浓度为2.5mmol/L) 2引物G(25μmol/L) 1引物H(25μmol/L) 1*片段I PCR产物(1μmol/L) 1*片段II PCR产物(1μmol/L) 1Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl) 1总体积 50μl

*用美国Stratagen公司生产的StrataPrep PCR纯化试剂盒将PCR产物先进行分离纯化，然后溶于无菌蒸馏水中。

PCR周期：同PCR I。

rSIFN-co基因的克隆及序列分析

选用pLac T7质粒作为克隆载体。pLac T7质粒是经pBluescript IIKS(+)质粒(美国Stratagen公司生产)改造而成。(见图3)

用StrataPrep PCR纯化试剂盒将含rSIFN-co全长cDNA PCR产物进行纯化，然后用NdeI和PstI进行酶切；同时将pLac T7质粒进行NdeI和PstI双重酶切。将这二种酶切DNA片段在1％琼脂糖胶上进行电泳分离，然后纯化507bp长的rSIFN-co DNA片段和2.9kb的质粒酶切DNA片段。将二者经T4DNA连接酶催化连接成重组质粒。将连接反应组合物转化DH_{5 α}感受态细胞(美国Gibco公司生产)。经37℃培养过夜后，挑选阳性重组菌落，命名为pHY-1。

用DNA序列分析试剂盒(SequiTherm^TM Cycle Sequencing Kit，购自美国Epicentre Technologies公司)进行DNA序列测定，引物为通用T7和T3引物，DNA测序结果显示其与理论设计相符。

纯化的rSIFN-co蛋白进行N-末端氨基酸序列测定，测定结果与如下理论序列结果一致：

N-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-(SEQ ID NO：15)

表达载体的构建、转化、酶切鉴定及其遗传稳定性

表达载体的构建、转化

将大肠杆菌表达载体pHY-4质粒(见图3)先经Nde I酶解，使质粒线性化(Linearized)，然后用Xba I进行充分酶解。经1％琼脂糖凝胶电泳，再用德国QIAGEN公司生产的QIAEXII试剂盒纯化。

同时将pHY-1质粒进行Nde I和Xba I双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化出715bp大小的序列片段。将这两个rSIFN-co和pHY-4酶切片段在T4 DNA连接酶催化下连接成重组质粒(见图4)。将连接反应物转化DH_5α感受态细胞，然后将转化细胞涂于LB-Amp琼脂平板，置37℃培养过夜。

阳性克隆菌株的筛选

随机从上述LB平板中挑起单个细菌菌落，用核酸内切酶酶解，PCR分析的方法筛选含rSIFN-co的重组质粒菌株。将其中一个PCR阳性重组质粒命名为pHY-5。将含有pHY-5质粒的菌株命名为PVIII，扩增后加入甘油冻存液冻存于-80℃备用。

rSIFN-co基因在E.coli中的高效表达

在pHY-5质粒中，rSIFN-co基因处于强启动子P_BAD的调控之中，而P_BAD又受Ara C基因产物的正负调控。Ara C是与阿拉伯糖形成复合体的转录调节子。在没有阿拉伯糖存在的情况下，Ara C二聚体与O₂及I₂结合形成一个210bp的环。这一结构导致转录的完全抑制。当加入阿拉伯糖时，AraC二聚体与O₂脱离，并转而与I₁和I₂结合，解除对转录的抑制。阿拉伯糖结合失活、抑制、及激活PBAD启动子的转录，从而刺激P_BAD介导高水平的rSIFN-co表达。rSIFN-co表达水平可超过菌体总蛋白的50％。

总结

rSIFN-co是根据人α-干扰素中最常见的保守氨基酸而人工构建的新型干扰素分子。已证明它是一种有效的抗肝炎药物。为了获得充足来源的高纯度rSIFN-co蛋白，我们构建了一高效稳定表达rSIFN-co蛋白的大肠杆菌工程菌株。

首先，根据已发表的

(interferon alfacon-1)氨基酸序列，采用大肠杆菌密码子设计合成编码rSIFN-co的全长氨基酸cDNA，并对该DNA片段进行了测序分析，证明其全长501bp的编码基因序列，其与TAA终止密码子序列是有效的且与理论设计相符。并且在后续工作中用该基因表达的rSIFN-co重组蛋白进行氨基酸组成和N-末端序列分析也与预测结果一致。

将该rSIFN-co全长cDNA克隆到大肠杆菌高效表达载体pHY-4质粒中去，从而得到重组工程质粒pHY-5。进一步用pHY-4质粒转化大肠杆菌LMG194菌株而得到rSIFN-co高效稳定表达工程菌株。将工程菌传代30代后，分析表明：pHY-5重组质粒在大肠杆菌LMG194细胞中的传代，无异常且稳定，rSIFN-co的表达高效而稳定。

含重组pHY-5质粒的E.coli LMG194是一理想的高效稳定表达工程菌株。

参考文献

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8.Nishimura，A et al：A rapid and highly efficient method forpreparation of competent E.coli cells.Nuclei.Acids Res.1990，18：6169

9.本资料中所涉及的“分子克隆”技术均参考：Sambrook，J.，E.F.Fritsch and T.Maniatis.Molecular CLONING：Alaboratory manual，2nd ed.CSH Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY.1989.

10.Guzman，L.M et al：Tight regulation，modulation，andhigh-level express-ion by vectors containing the arabinose P_BADpromoter.J.Bacteriol.1995，177：4121-4130.

根据大肠杆菌优先表达密码子设计的rSIFN-co全长cDNA序列以及所推断的rSIFN-co氨基酸序列

5′            11          21        31         41          51

+1   M  C  D   L  P  Q  T   H  S  L   G  N  R   R  A  L  I   L  L  A

1  ATGTGCGACC TGCCGCAGAC CCACTCCCTG GGTAACCGTC GTGCTCTGAT CCTGCTGGCT

TACACGCTGG ACGGCGTCTG GGTGAGGGAC CCATTGGCAG CACGAGACTA GGACGACCGA

5′            71          81        91         101        111

+1   Q  M  R   R  I  S  P   F  S  C   L  K  D   R  H  D  F   G  F  P

61  CAGATGCGTC GTATCTCCCC GTTCTCCTGC CTGAAAGACC GTCACGACTT CGGTTTCCCG

GTCTACGCAG CATAGAGGGG CAAGAGGACG GACTTTCTGG CAGTGCTGAA GCCAAAGGGC

5′           131        141        151        161        171

+1  Q  E  E   F  D  G  N   Q  F  Q   K  A  Q   A  I  S  V   L  H  E

121 CAGGAAGAAT TCGACGGTAA CCAGTTCCAG AAAGCTCAGG CTATCTCCGT TCTGCACGAA

GTCCTTCTTA AGCTGCCATT GGTCAAGGTC TTTCGAGTCC GATAGAGGCA AGACGTGCTT

5′           191        201        211        221        231

+1  M  I  Q   Q  T  F  N   L  F  S   T  K  D   S  S  A  A   W  D  E

181 ATGATCCAGC AGACCTTCAA CCTGTTCTCC ACCAAAGACT CCTCCGCTGC TTGGGACGAA

TACTAGGTCG TCTGGAAGTT GGACAAGAGG TGGTTTCTGA GGAGGCGACG AACCCTGCTT

5′           251        261        271        281        291

+1  S  L  L   E  K  F  Y   T  E  L   Y  Q  Q   L  N  D  L   E  A  C

241 TCCCTGCTGG AAAAATTCTA CACCGAACTG TACCAGCAGC TGAACGACCT GGAAGCTTGC

AGGGACGACC TTTTTAAGAT GTGGCTTGAC ATGGTCGTCG ACTTGCTGGA CCTTCGAACG

5′           311        321        331        341        351

+1  V  I  Q   E  V  G  V   E  E  T   P  L  M   N  V  D  S   I  L  A

301 GTTATCCAGG AAGTTGGTGT TGAAGAAACC CCGCTGATGA ACGTTGACTC CATCCTGGCT

CAATAGGTCC TTCAACCACA ACTTCTTTGG GGCGACTACT TGCAACTGAG GTAGGACCGA

5′           371        381        391        401        411

+1  V  K  K   Y  F  Q  R   I  T  L   Y  L  T   E  K  K  Y   S  P  C

361 GTTAAAAAAT ACTTCCAGCG TATCACCCTG TACCTGACCG AAAAAAAATA CTCCCCGTGC

CAATTTTTTA TGAAGGTCGC ATAGTGGGAC ATGGACTGGC TTTTTTTTAT GAGGGGCACG

5′           431        441        451        461        471

+1  A  W  E   V  V  R  A   E  I  M   R  S  F   S  L  S  T   N  L  Q

421 GCTTGGGAAG TTGTTCGTGC TGAAATCATG CGTTCCTTCT CCCTGTCCAC CAACCTGCAG

CGAACCCTTC AACAAGCACG ACTTTAGTAC GCAAGGAAGA GGGACAGGTG GTTGGACGTC

5′           491        501

+1  E  R  L   R  R  K  E   # (SEQ ID NO.3)

481 GAACGTCTGC GTCGTAAAGA ATAA(SEQ ID NO.1)

CTTGCAGACG CAGCATTTCT TATT(SEQ ID NO.2)

实施例2

rSIFN-co的分离纯化

1、发酵

将重组菌种接种在LB培养基中37℃摇瓶(200rpm)培养过夜(约18小时)，发酵液加入浓度为30％的甘油至终浓度15％，分装成1ml每支，-20℃保存，作为生产菌种。

生产菌种按1％的比例加入LB培养基，37℃摇瓶(200rpm)培养过夜扩大菌种规模。按10％的比例加入RM培养基中，37℃培养。发酵至OD₆₀₀达到2.0左右加入阿拉伯糖(20％)至终浓度0.02％诱导。4小时后停止培养，离心，收菌。菌体沉淀用适量缓冲液A重混悬，置-20℃过液，取出融化后，用匀浆机破菌，离心，缓冲液B、C分别洗涤，再用蒸馏水洗涤一次。得到纯净的包函体。

2、变性及复性

用6mol/L盐酸胍(或尿素)溶解包函体得到稍混浊的变性液，10000rpm高速离心。取上清测定的蛋白浓度，该上清称为“变性液”。按终蛋白浓度0.3mg/ml，分三次将变性液加入已配制好的复性液中，并在4℃过夜。然后，依次对10mol/L、5mol/L的PB缓冲液及蒸馏水透析。然后用2mol/L的醋酸-醋酸钠调pH，静置，过滤。

3、纯化

HS阳离子交换层析：

柱体先用20mmol/L的醋酸-醋酸钠(pH 5.0)平衡，

↓

30ml/min的速度上样，

↓

20个柱体积的的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)清洗

↓

5个柱体积含0.15mol/L氯化钠+20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)清

洗

↓

3个柱体积含0.18mol/L氯化钠+20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)清

洗

↓

含0.25mol/L氯化钠+20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)洗脱目标蛋白

Chelating sepharose^TM快速层析：HS解离蛋白液加入0.2mol/L(pH 6.6)的PB缓冲液及4mol/L的氯化钠调到含1mol/L氯化钠pH 6.0后，备上样。

柱体用缓冲液D平衡

↓

1ml/min的速度上样

↓

缓冲液E清洗

↓

缓冲液F清洗

↓

缓冲液G洗脱

通过POROS HS/M进行样品浓缩。在某些情况下，如果要求样品纯度更高可通过分子筛(sephacryl S-100)进一步纯化。

注：

缓冲液A：100mmol/L Tris盐酸，pH 7.5-10mmol/L EDTA-100mmol/L氯化钠

缓冲液B：50mmol/L Tris盐酸，pH 7.5-1mol/L尿素-10mmol/LEDTA-0.5％Triton X-100

缓冲液C：50mmol/L Tris盐酸，pH 7.5-2mol/L尿素-10mmol/LEDTA-0.5％Triton X-100

缓冲液D：1mol/L氯化钠---50mmol/L磷酸氢二钠(pH 5.5)

缓冲液E：1mol/L氯化钠---50mmol/L磷酸氢二钠(pH 5.0)

缓冲液F：1mol/L氯化钠---50mmol/L磷酸氢二钠(pH 4.0)

缓冲液G：1mol/L氯化钠---50mmol/L磷酸氢二钠(pH 3.6)

复性缓冲液：0.5mol/L精氨酸-150mmol/L Tris盐酸pH 7.5-0.2mmol/LEDTA

LB培养基：1L

蛋白胨                10g

酵母膏                5g

氯化钠                10g

RM培养基：1L

酪蛋白                20g

氯化镁                1mmol/L(0.203g)

磷酸氢二钠            4g

磷酸二氢钾            3g

氯化钠                0.5g

氯化胺                1g

纯化以后，缓冲液换为PBS(PH 7.0)并伴随用POROS HS/M的冷凝步骤。其被称为“蛋白贮存溶液”。可以直接用于准备注射剂或喷雾剂、或贮存于2-8℃中。

注射用配方：

	溶液	冻干粉
			重组高效复合干扰素原液	34.5μg/ml	34.5μg/ml
磷酸盐缓冲液(pH7.0)	25mmol/L	10mmol/L
			甘氨酸	---------	0.4mol/L
氯化钠	0.1mol/L	----------

喷雾剂：

EDTA	0.01％
		吐温80	0.05％
柠檬酸三钠	10mmol/L
		丙三醇	1.26％
氯化钠	0.03％
		苯甲醇	0.5％
人血白蛋白	0.1％
		重组高效复合干扰素	10μg/ml

质量控制工艺

纯化过程的每-步都要进行蛋白质含量、蛋白质纯度、比活及热原的检测。在得到蛋白质原液后按下表顺序进行各种检测。

产品的质量控制按《中国生物制品规程》的要求进行。

1、初蛋白溶液

Lowry

注：“生物制品化学及其他检定方法”、“生物制品热原质试验规程”、“生物制品细菌内毒素试验规程”皆可在《中国生物制品规程》中找到。

《中国生物制品规程》，潘正安、张兴辉、段志兵等；中国生物制品标准化委员会；化学工业出版社；2000年。

实施例3

重组高效复合干扰素注射用冻干粉剂的稳定性

我们将重组高效复合干扰素冻干粉剂三批各二种规格样品进行稳定性试验，试验起始时间：2000年4月。

1.样品来源

样品由四川辉阳生命工程股份有限公司提供，批号分别为：990101-03、990101-05、990102-03、990102-05、990103-03、990103-05。

2.样品标准

进行本实验的各样品试验前应符合下表要求。

表1试验样品标准

指标	标准
		1.外观	白色疏松体
2.溶解时间	室温下注射用水溶解迅速(2分钟内)
		3.澄明度	无色或微带乳光的澄明液体，不应混浊、含有异物或摇不散的沉淀。
4.pH值	6.5-7.5
		5.效价(IU/支)	标示量的80％-150％(9μg：4.5×106IU，15μg：7.5×106IU)
6.水份	不大于3.0％(W/W)

3.试验内容

2-8℃考察样品：将待考察样品置于2-8℃冰箱中，分别设定在第1、3、6、9、12、18、24、30、36月测定上述指标，并作好记录。

25℃考察样品：将待考察样品置于25℃恒温箱中，分别设定在第1、3、6、9、12、18、24、30月测定上述指标，并作好记录。

37℃考察样品：将待考察样品置于37℃恒温箱中，分别设定在第1、3、6、9、12、18、24月测定上述指标，并作好记录。

4.结果与讨论

(1)样品在37℃观察，在不同时期取样检测各项指标，与试验前比较，第6个月开始效价呈下降趋势，三批样品效价变化相仿，其余检测指标无变化。

(2)样品在25℃观察，在不同时期取样检测各项指标，与试验前比较，9个月内，效价变化不大，三批样品效价变化相仿，其余检测指标无变化。

(3)样品在2-8℃观察，在不同时期取样检测各项指标，与试验前比较，9个月内效价稳定，其余检测指标无变化。

因此，我们建议，用于注射的冻干重组高效复合干扰素成品贮藏、运输应以低温为妥。没有条件的情况下，短时间内(即：3个月)可室温放置。

实施例3.5

rSIFN-co生产流程

1.生产方法

1.1发酵

用LB+M9组合物作为培养基，菌种接种量为1.5％，32℃摇瓶培养达OD₆₀₀＝0.4(约3.5小时)后，升温至42℃，继续摇瓶培养6小时，rSIFN-co表达量达最高水平。经SDS-PAGE电泳，凝胶扫描显示，rSIFN-co的表达量占总蛋白量的57％，为中国国内最高标准。

1.2纯化

离心收集菌体

↓

生理盐水洗涤两次

↓

加溶菌缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，1％Triton X

-100，

1-2M Urea)，超声波破菌20-30分钟

↓

沉淀用缓冲液洗涤数次，至纯白色

↓

用7M盐酸胍变性

↓

变性液稀释复性，过夜

↓

Sephadex G25柱层析脱盐

↓

用0.1M NaCl上样于CM-Sepharlse，

↓

梯度洗脱，收集活性峰

↓

活性峰脱盐后上样到HPLC阳性柱上

↓

用0.1MnaCl梯度洗脱，收集活性峰即为rSIFN-co成品

↓

加保护载体及冻干剂

↓

分装冻干物质(rSIFN-co)

按该工艺纯化所得的成品(rSIFN-co)，经SDS-PAGE电泳为一条带，分子量为14.5Kda，凝胶扫描其纯度大于95％；反相HPLC分析为单一峰，其纯度为97％，比活达1×10⁹IU/mg蛋白质。

1.3分装及检测

经HPLC纯化，加2％人血清白蛋白，1％蔗糖，1％葡萄糖，分装冻干后制得针剂样品，采用国际通用Wish-VVS系统检测，每支针剂活性为4.5×10⁸IU。按《中华人民共和国药典》的要求，对样品进行无菌检查和热原检查，其结果应为阴性，符合静脉注射要求。

2.质量控制

2.1生物学特性

(1)用LB+M9培养菌种，应呈典型的大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长；

(2)涂片作革兰氏染色在显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌；

(3)对抗生素的抗性应与原始菌种相符；

(4)电镜检查为典型大肠杆菌形态，没有检测到支原菌、病毒样颗粒及其他微生物污染；

(5)生化反应测试符合大肠杆菌生物学性状。

2.2干扰素表达质量控制

(1)干扰素表达量(在摇床中培养)应符合原始菌种的表达量；

(2)用抗干扰素血清作试验，证明有反应；

(3)质粒检查：酶切图谱与原质粒相符。

2.3菌种生产：

通过实例1.2中所示工艺制造的菌种称为生产菌种。

生产菌种应当按照以下步骤检定以确保没有其他：用LB平板分为2-3块并培养。培养后挑取平板中5-10个菌落分别进行干扰素表达量测定，至少重复2次。选其中干扰素表达量最高的一份供生产制备种子液用。

2.4种子液：

从生产菌种选出的菌种供作发酵用的称为种子液，种子液的量、培养时间和最适合OD值可根据不同菌种由生产者自行决定，但要有防止污染杂菌措施。

2.5菌种传代方法

菌种传代应在无菌室内进行，不得在同一无菌室内同时操作其他菌种。从原始菌种到种子液均用同一培养基，一般用LB培养基。

2.6发酵

(1)发酵室接种前应进行清洁，要进行无菌操作，在同一发酵时间内不得进行其他菌的发酵。

(2)发酵罐及管道均需清洁两次，分别在配制培养基前后。冷却到所需温度接种种子液；

(3)避免使用抗生素，它可能影响培养基中的细胞生长；

(4)发酵条件如温度、pH、溶氧、发酵时间等参数应根据不同菌种规定具体要求。

2.7收菌

(1)发酵后可用离心或其他方法收取菌体，用具要求保持清洁。离心后的废弃液经杀菌后才能排出；

(2)收获的菌体如在24小时内破菌裂解，可放在4-8℃，否则应冻存于-30℃以下的冰箱，在-30℃保存的菌体可使用6个月。

2.8菌体的裂解

(1)用适当的缓冲液平衡菌体，可用物理、化学或生物学的方法进行裂解，用高速离心机沉淀，上清液为粗制干扰素。

(2)如用化学方法裂解，不得应用对人体有害的化学试剂。

2.9纯化

(1)纯化方法应能去除绝大部分非干扰素物质，在纯化过程中不得加入对人体有毒有害的物质。

(2)如用异种抗体亲和层析纯化，应说明其来源及纯度，并提供此种抗体微量IgG的检测方法。

(3)纯化过程中应特别注意去除热原质，并采取措施防止容器污染而造成制品热原质增加。

(4)浓缩纯化后最后所得的纯化干扰素即为“半成品原液”，纯度检定后，立即加入人白蛋白，使其最终含量为2％，称为“加白蛋白半成品”，检定后，保存在-30℃，使用前应尽量避免冻融，“加白蛋白半成品”在-30℃保存不得超过半年。

(5)用作保护剂的人白蛋白应符合相应制检规程要求，RBSAG检查阴性，并说明单体、二聚体和多聚体的比例。

2.10制剂配制

(1)除菌过滤：用0.22μ薄膜过滤除菌，过滤后样品应作无菌试验，并取样测定干扰素效价；

(2)稀释：将“加白蛋白半成品”用无菌的2％白蛋白缓冲液稀释至所需浓度，不得加防腐剂，稀释后的“加白蛋白半成品”作热原测定并且在无菌试验合格后进行冻干。

2.11冷冻干燥

冻干工艺应不损害干扰素的活性，并保持冻干后制品的水分。

2.12检定

rSIFN-co可制成两种类型。一为注射用，另一为外用(topical use)，其质量标准不同，将分别予以规定，每种制品又分半成品和成品检定，注射用半成品指纯化干扰素、加白蛋白半成品，除菌半成品。注射用成品仅指冻干制品。外用干扰素半成品指纯化干扰素；外用成品仅指分装后液体形成的冻干制品。

2.13包装

外用与注射用干扰素的包装应有明显区别。

2.14保存

本制品保存在4℃，液体制品不得冻结保存。

2.15效期

冻干制品效期自冻干之日起2年，液体制品效期自分装之日起6个月。

实施例4

rSIFN-co抑制HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg的分泌

材料

溶剂及配制方法：每支瓶内加入1ml生理盐水，溶解后，再根据所设不同浓度用MEM培养液调配。现用现配。

对照药品：IFN-α2b(干扰能)为冻干制剂，先灵葆雅公司生产.每支3×10⁶U，用培养液配成3×10⁶IU/ml溶液。干复津(注射液)，安进公司生产，每支9μg，0.3ml，相当于9×10⁶IU，用培养液配成9×10⁶IU/ml溶液，4℃保存；2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2.2.15细胞株，美国MountSinai医学中心构建。

试剂：MEM干粉，美国Gibco公司产品.胎牛血清，美国HycloneLab公司产品.G-418(Geneticin)；MEM调剂，美国Gibco公司产品；L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装；HBsAg，HBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所；卡那霉素，华北制药厂产品；Lipofectin，美国Gibco公司产品。

实验用品及仪器：培养瓶，丹麦Tunclon^TM；24孔和96孔培养板，美国Corning公司产品：二氧化碳孵箱，美国Shel-Lab产品；MEM培养液100ml：含胎牛血清10％，谷氨酰胺0.03％，G418 380μg/ml，卡那毒素50U/ml。

试验方法：

2.2.15细胞培养：在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液终止消化并使细胞分散。以1∶3传代，10天长满。

毒性试验：实验分无药物细胞对照组和不同药物浓度给药组。细胞消化，配制成每毫升10万个细胞的溶液，接种96孔培养板，每孔200μl，37℃5％CO₂培养24小时，细胞长成单层后进行实验。

重组高效复合干扰素用配制成1.8×10⁷IU/ml溶液，而后2倍梯度稀释以制备一系列溶液。将其加入96孔细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液.8天后显微镜下观察细胞病变.完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算不同浓度药液平均细胞病变程度和抑制率。按Reed Muench法计算半数有毒浓度(TC₅₀)和最大无毒浓度(TC₀)。

${\mathrm{TC}}_{50}=\mathrm{Anti}\log (B+\frac{50-B}{A-B}\×C)$

A＝log＞50％药物浓度  B＝log＜50％药物浓度  C＝log稀释倍数(dilution power)

对HBeAg、HBsAg抑制试验：试验设HBeAg、HBsAg阳性对照组，阴性对照组，细胞对照组及不同药物浓度给药组。每毫升70万个2.2.15细胞接种6孔细胞培养板，每孔3ml，37℃5％CO₂培养24小时，3倍稀释试验药液以制备5个剃度稀释溶液(制备5个溶液，每个有不同的蛋白质浓度。溶液2比溶液1浓度低3倍，溶液3比溶液2浓度低3倍，等等)，分别为4.5×10⁶IU/ml、1.5×10⁶IU/ml、0.5×10⁶IU/ml、0.17×10⁶IU/ml、和0.056×10⁶IU/ml，每浓度1孔，37℃5％CO₂培养24小时，每4天换原浓度药液培养。第8天时收获所有培养液，-20℃保存。试验重复三批，分别用固相放射免疫测定盒(中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品)测定HBsAg和HBeAg。用γ-计数仪测定每孔cpm值。

药物效果计算：计算细胞对照组及每个浓度组cpm均值及其标准差，P/N值如抑制百分率，半数有效浓度(IC₅₀)及选择指数(SI)。

A＝细胞对照cpm；B＝给药组cpm；

2)计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC₅₀)：

A＝log＞50％药物浓度  B＝Iog＜50％药物浓度  C＝log稀释倍数

3)改变了空间构象的重组高效复合干扰素在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的选择指数(SI)：

$\mathrm{SI}=\frac{\mathrm{TC}50}{\mathrm{IC}50}$

4)以t检验法(student t test)计算各稀释度和对照组间cpm的差别

DNA印迹：(1)2.2.15细胞内HBV-DNA提取：细胞培养8天，吸除培养液(通过移除培养液将细胞从培养液中分离出)。加入细胞裂解液以裂解细胞，苯酚、氯仿、异戊醇组合物(1∶1∶1)抽提2次，高速10,000g离心。取上清，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20μl TE缓冲液中。(2)电泳：加入6X DNA样品缓冲液，将上样加于1.5％琼脂糖胶上电泳，IV/cm，恒压，14-18小时。(3)变性和杂交：将胶分别浸于HCl、变性液、中和液中。(4)转膜：按程序将DNA转至Hybond-N膜上。同斑点杂交一同进行烤膜、杂交、曝光。扫描光片，以gel-pro凝胶分析软件分析相对密度，计算抑制率及IC₅₀。

结果

表4.1、表4.2、表4.3中的结果表明：样品以最大无毒浓度指数加入2.2.15细胞培养8天，高效复合干扰素最大无毒浓度9.0±0×10⁶IU/ml对HBeAg的平均抑制率为46.0±5.25％(P＜0.001)，IC₅₀为4.54±1.32×10⁶IU/ml，选择指数SI为3.96；对HBsAg的平均抑制率为44.8±6.6％，IC₅₀ 6.49±0.42×10⁶IU/ml，选择指数SI为2.77。因此，重组高效复合干扰素能明显的抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原活性，而对照组干扰素和干复津则不具该功能。在临床也证实了重组高效复合干扰素能使乙型肝炎表面抗原和e抗原阳性降低或恢复到正常水平。

实施例5

rSIFN-co的制备

冻干注射剂的制备

冻干粉

重组高效复合干扰素                     34.5μg/ml

原液

磷酸盐缓冲液(pH7.0)                    10mmol/L

甘氨酸                                 0.4mol/L

制备工艺：按处方称料，用无菌无热原注射水溶解，用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，保存于6-10℃，取样作无菌无热原检查合格后分装入药瓶中，单剂量0.3ml/瓶，或0.5ml/瓶。分装后放置至冻干机中冷冻干燥。

水溶液注射剂的制备

溶液

重组高效复合干扰素                     34.5μg/ml

原液

pH7.0的磷酸盐缓冲                      25mmol/L

液

氯化钠                                 0.1mol/L

制备工艺：按处方称料，用无菌无热原注射水溶解，用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，保存于6-10℃，取样作无菌和热原检查合格后分装于密闭容器中，单剂量0.3ml/瓶，或0.5ml/瓶，置2-10℃下暗处保存。

实施例6

rSIFN-co急性毒性试验

本试验采用一次给小鼠肌肉注射高效复合干扰素(150μg/kg，相当于成人每公斤体重用量的1000倍)。观察动物急性毒性反应及死亡情况。结果表明：注射后24小时内动物未见异常情况，处死部分动物并尸解观察：无异常变化。余下的小鼠2周内亦未见异常反应，亦无一只死亡。于第14天称重发现，给药组与对照组小鼠体重均有所增加，且两组体重增加值无明显差异(P＞0.05)。两周后，这些小鼠的各主要脏器均没有观察到异常变化。

1.实验材料

1.1试验动物

成年健康小鼠40只，体重18-22g，雌雄各半。质量控制：四川省实验动物控制中心。

1.2试验药品

高效复合干扰素(四川辉阳生命工程股份有限公司提供)，无菌液体，0.15mg/ml，批号：981201。

用注射用生理盐水配成所需浓度即用。

2.试验方法

将40只小鼠随机分为2组，分别为生理盐水阴性对照组和高效复合干扰素组(150μg/kg)，分别给每只小鼠肌注生理盐水和相应药物，给药比率均为0.1ml/10g，注射后，观察各小鼠急性毒性反应。于给药后24小时将各组动物处死一半(雌雄各半)，尸解观察小鼠心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、十二指肠等主要脏器有无病变。余下的动物继续观察，于给药后第14天，称重后处死动物并尸解，观察各小鼠主要脏器有无病变，如有则做病理组织学检查，并将给药组小鼠体重变化值与阴性对照组小鼠体重值进行检验，判断有无显著性差异。

3.试验结果

结果表明，小鼠肌注一次给予高效复合干扰素150μg/kg，相当于人用剂量的1000倍，小鼠未出现毒性反应。给药后14天内，各小鼠摄食、饮水、活动、毛发、大小便等未见异常，亦无一只小鼠死亡。于给药后24小时观察小鼠各脏器无异常变化。余下的小鼠于给药后第14天处死并尸解，各主要脏器无异常变化，且给药组与阴性对照组小鼠体重均有所增加，其体重增加值与阴性对照组无显著差异(P＞0.05)，结果见表6.1。

表6.1高效复合干扰素给药后对小鼠体重的影响

组别	剂量	动物数	给药前体	给药后体	体重增加
									重(g)	重(g)	值(g)
对照组	0	20	19.8±1.7	30.8±2.8	11.0±2.9
						重组高效复合干扰素组	150	20	19.4±1.7	32.1±3.3	12.7±4.3

4.结论

在本试验条件下，一次肌注高效复合干扰素150μg/kg小鼠均未见毒性反应。因此，高效复合干扰素肌肉注射小鼠的最大耐受剂量大于150μg/kg，相当于正常成人每公斤用剂量的1000倍。

实施例7

重组高效复合干扰素(rSIFN-co)的临床效果

本发明的重组高效复合干扰素(rSIFN-co)主要用于病毒性疾病的治疗，特别是肝炎的治疗。同时，它还能抑制EB病毒、VSV、单纯疱疹病毒、冠状病毒、麻疹病毒等。以WISH细胞/VSV系统进行抗病毒活性检测，结果分别为：其它干扰素为0.9×10⁸U/mg，Intron A为2.0×10⁸U/mg，rSIFN-co为9×10⁸U/mg，其抗病毒活性明显高于前二者。

自2003年2月起，经中国国家食品药品监督管理局(SFDA)批准，在四川大学华西医院、重庆医科大学附属第二医院、浙江大学医学院附属第一医院做多中心双盲随机的治疗乙型肝炎的临床试验，IFN-α1b被用作对照，主要结果如下：

重组高效复合干扰素(rSIFN-co)与IFN-α1b治疗慢性活动性乙肝的疗效比较

1、患者入选标准：标准1-4对使用rSIFN-co(9μg)和IFN-α1b(5MU，50μg)的治疗均有效，标准1-5用于rSIFN-co(15μg)的治疗。

1)年龄18～65岁；

2)HBsAg持续阳性至少6个月以上，HBeAg阳性，PCR检测HBV-DNA≥10⁵拷贝数/ml；

3)ALT≥2倍正常值，

4)未曾接受过干扰素抗HBV治疗；或接受过拉米夫定治疗但无效或复发，

5)入选6月前采用过某种干扰素(3MU或5MU)进行按SDA规定疗程及剂量治疗，但无效或复发。

2、疗效判断：参考2000年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议，根据ALT水平，HBV-DNA和HBeAg测试，将疗效分为三级。

应答：ALT复常、HBV-DNA阴转、HBeAg阴转

部分应答：ALT复常、HBV-DNA阴转或HBeAg阴转

无应答：ALT未复常、HBV-DNA未阴转、HBeAg未阴转

应答和部分应答组被认为是有效的病例。

3、临床治疗效果比较

A组：rSIFN-co(9μg)治疗组

B组：IFN-α1b(5MU，50μg)治疗组

C组是使用过其他干扰素(3MU或5MU)进行抗HBV治疗，但无效或复发的13例慢性乙肝患者，rSIFN-co 15μg皮下注射，每48小时1次，连续24周。治疗后截至第十二周，13例中有7例(53.85％)患者临床显效，3例(23.08％)HBe抗原转阴，7例(53.85％)HBV-DNA转阴，11例肝功恢复正常(84.62％)。

4、rSIFN-co与IFN-α1b的副反应比较

干扰素类药的副反应包括发热、恶心、肌肉酸痛、食欲不振、脱发、白细胞及血小板减少等，IFN-α1b的临床最大使用剂量为每次5MIU，常规每次使用3MIU，采用常规使用剂量时，临床约有90％的患者表现出I-II级(WHO临床分级标准)的副反应，包括38℃以下的轻微发热、恶心、肌肉酸痛、食欲不振等。采用最大剂量时，副反应的发生率无明显上升，但各种临床症状程度明显加重。rSIFN-co的临床最大使用剂量为每次24μg，皮下注射，隔日注射3个月。常规每次使用9μg，临床约有不足50％的患者表现出I-II级(WHO临床分级标准)的副反应，包括38℃以下的轻微发热、恶心、肌肉酸痛、食欲不振、白细胞及血小板轻度降低等。使用最大剂量时约有50％的患者在用药一月时出现白细胞及血小板轻度降低，但停药一周后白细胞及血小板恢复正常，可安全地继续用药。

重组高效复合干扰素(rSIFN-co)治疗丙型肝炎的疗效观察

1.入选标准：

1)年龄18～65岁；

2)HCV抗体持续阳性

3)ALT≥1.5倍正常值，且持续6个月以上

2、疗效判断：参考干复津治疗丙型肝炎的判断标准，根据ALT水平和HCV-RNA测试，将疗效分为三级：

应答：ALT复常、HCV-RNA阴转

部分应答：ALT复常、HCV-RNA未阴转

无应答：ALT未复常、HCV-RNA未阴转

3、临床治疗效果

与治疗乙型肝炎试验同时进行的用rSIFN-co治疗丙型肝炎患者46例，每次9μg，皮下注射，每24小时1次，连续24周。治疗后26患者有显著临床效果(56.52％)，其中12例HCV-RNA转为阴性(26.08％)，26例肝功恢复正常(56.52％)。

实施例8

重组高效复合干扰素喷雾剂

主要成分：重组高效复合干扰素

性状：液体，无不溶物。

药理：重组高效复合干扰素具有广谱抗病毒作用，其体外抗病毒活性是现有其他干扰素(IFNs)的5-20倍，可以商购。它能抑制冠状病毒在细胞内的生长。其抗病毒机制主要通过干扰素同靶细胞表面的干扰素受体结合，诱导靶细胞内2’5’-A合成酶、蛋白激酶R等多种抗病毒蛋白，阻止病毒蛋白质的合成。并通过诱生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内的复制，增强天然杀伤(NK)细胞活性及其他免疫调节作用，有效地遏制病毒侵袭和感染的发生。

急性毒性：最大剂量(相当于成人用量的1000倍)皮下注射小鼠全部健存，无死亡，未测出LD50。

适应症和用途：预防严重急性呼吸道综合症。

剂量和用法：鼻腔、咽喉各喷一次，每日三次。

不良反应：目前尚无重组干扰素喷雾剂不良反应的报道，一般不会引起过敏，用药期间个别人员偶尔出现轻度刺激以及胃肠反应，若无其他明显反应，无须终止治疗，可自行缓解。

禁忌：已知对于扰素、大肠杆菌产物有过敏反应的患者不宜使用。

注意事项：本品在初次使用前须预喷两次(排除空气)。如有浑浊、沉淀、异物或过期失效，不宜使用。

儿童用药：尚不明确。

老年患者用药：尚不明确。

孕妇及哺乳期妇女用药：禁用

药物相互作用：尚不明确。

药物过量：该药在人体使用时的一次剂量超过150ug(7.5×10⁷IU)，发热、厌食、肌痛、发冷发生频率更高。未引起严重不良反应。

规格：1瓶/盒，20μg(1×10⁷IU)/3ml。

贮藏：在4-8℃冷藏避光条件下保存，勿冷冻。

有效期：约一年。

生产企业：四川辉阳生命工程股份有限公司

地址：四川省成都市玉沙路8号经典坐标A座902室

实施例9-A

一种新型重组复合干扰素对SARS相关冠状病毒的体外作用

样品提供：四川辉阳生命工程股份有限公司

试验单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，分子生物学研究室

原始资料保存处：军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室档案部

1、实验材料：

药品：新型基因重组高效复合干扰素，每支9μg。四川辉阳生命工程股份有限公司提供，批号20020501。

细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，由军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室提供。

病毒：SARS病毒，BJ-01株，由军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室提供。

细胞培养液：含10％胎牛血清的DMEM培养液。

2、实验条件：病毒测定在生物安全三级实验室。

3、实验方法：

CPE(细胞病变效应)法测定TCID₅₀

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×10⁴个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层，加入10倍稀释9个浓度的病毒培养液，每浓度4孔，37℃，5％CO₂温箱培养。每天用显微镜观察细胞病变(CPE)。细胞病变在25％以下为+，26-50％病变为++，51-75％病变为+++，76-100％病变为++++。记录细胞病变程度。用Reed-Muench法计算病毒半数感染剂量(TCID₅₀)。

药物对细胞毒性的测定：

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×10⁴个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。药物设5个浓度即36、18、9、4.5、2.259μg/ml(终浓度)，每浓度4孔。设正常细胞对照。每天观察给药组细胞病变，观察到5天，确定药物的无毒浓度。

CPE法测定药物抗SARS相关冠状病毒活性：

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×10⁴个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。将最大无毒浓度以下的药物对倍稀释5个浓度，分别加入细胞板中，每孔100μl，37℃，5％CO₂温箱培养24h后，再分别加入不同稀释度的病毒(10^-3、10^-4、10^-5)，共同培养48-72h，观察细胞病变CPE(细胞病变在25％以下为+，26-50％为++，51-75％为+++，76-100％为++++，正常细胞为-)，每个稀释度设4个孔，并设正常细胞对照、药物对照和不同稀释度(10^-3、10^-4、10^-5)的病毒对照，每天观察，待病毒对照出现细胞明显病变时，判定干扰素抗病毒的效应。试验重复1次，用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度IC₅₀。

4、实验结果：

病毒毒性测定：病毒的TCID₅₀是10^-8。

药物的细胞毒性：新型基因重组高效复合干扰素对细胞的无毒浓度为18μg/ml，在此浓度下细胞形态与正常对照相同，没有出现病变。

药物的抗病毒作用：试验结果见表9-A.1和表9-A.2。

表9-A.1、新型重组复合干扰素的抗病毒作用(实验1)

表9-A.2、新型重组复合干扰素的抗病毒作用(实验2)

5、结论：

新型高效复合干扰素对细胞的无毒浓度为18μg/ml。当SARS相关的冠状病毒浓度为10^-5(1000TCID₅₀)、10^-4(10000TCID₅₀)和10^-3(100000TCID₅₀)时，干扰素的IC₅₀分别为1.27、2.25和4.04μg/ml(表9-A.3)。

表9-A.3、干扰素对不同浓度病毒的IC50

病毒稀释度	干扰素(ug/ml)的IC50
		10-3	4.04
10-4	2.25
		10-5	1.27

实验负责人：王京燕

试验者：赵艳红、纪晓光、张敏、赵京花

原始资料保存处：军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室档案部

试验起止日期：2003年5月12-30日

实施例9-B

新型重组复合干扰素与重组干扰素-α2b注射对SARS相关冠状病毒的体外作用比较

样品提供：四川辉阳生命工程股份有限公司

试验单位：军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室

原始资料保存处：军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室保护房

1.实验材料：

药品：新型基因重组高效复合干扰素，618μg/ml，四川辉阳生命工程股份有限公司提供；安福隆(注射用重组干扰素α-2b)，天津华立达生物工程有限公司产品，30μg/支(300万单位IU/支)，批号20030105。

细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，由军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室提供；

病毒：SARS相关冠状病毒BJ-01株，由军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室提供；

实验条件：病毒测定在生物安全三级实验室。

2.实验方法：

CPE法测定细胞半数感染浓度(TCID₅₀)

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×10⁴个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层，加入10倍稀释9个浓度的病毒培养液，每浓度4孔，设细胞对照，37℃，5％CO₂温箱培养。每天用显微镜观察细胞病变(CPE)。细胞病变在25％以下为+，26-50％病变为++，51-75％病变为+++，76-100％病变为++++。记录细胞病变程度。用Reed-Muench法计算病毒半数感染剂量(TCID₅₀)。

MTT法测定干扰素对细胞的半数毒性浓度(TC₅₀)：

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×10⁴个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。吸去上清，分别加入不同稀释浓度的干扰素，每浓度4孔，设细胞对照。观察5天后加MTT染色4h，吸去液体加DMSO溶解0.5h，酶联检测仪测定OD_570nm吸收值，用Reed-Muench法计算TC₅₀。

MTT法测定干扰素的抗SARS相关冠状病毒活性：

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×10⁴个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。药物从最大无毒浓度向下5倍稀释共5个浓度，每浓度4孔，加入细胞板中，每孔100μl。37℃，5％CO₂温箱培养24h后，吸去干扰素液，加入不同稀释度的病毒(10000、1000、100TCID₅₀)，每个稀释度加4个孔，并设正常组、药物对照和不同稀释度(10000、1000、100TCID₅₀)的病毒对照，37℃，5％CO₂培养48-72h，待病毒对照组出现细胞明显病变时，记录细胞病变结果(细胞病变在25％以下为+，26-50％为++，51-75％为+++，76-100％为++++，正常细胞为-)，MTT染色法测定细胞活性，判定干扰素抗病毒的效应。试验重复3次，用Reed-Muench法计算病毒半数有效浓度IC₅₀。

3.实验结果：

病毒TCID₅₀测定：病毒的TCID₅₀为10^-7。

干扰素TC₅₀的测定：新型重组复合干扰素的无毒浓度为100μg/ml，注射用重组干扰素α-2b的无毒浓度为12.5μg/ml，在此浓度下细胞形态与正常对照相同；新型基因重组高效复合干扰素的TC₅₀为139.18μg/ml，注射用重组干扰素α-2b的TC₅₀为17.18μg/ml，

表9-B.1、干扰素细胞半数毒性浓度(TC₅₀)测定

干扰素的抗病毒活性测定：两种干扰素在体外均有抗病毒活性，实验结果见表9-B.2，治疗指数(TI)结果见表9-B.3。

表9-B.2、干扰素抗病毒活性测定结果

表9-B.3、干扰素抗病毒活性测定结果

4.结论：

体外实验显示新型重组复合干扰素和注射用重组干扰素α-2b均对Vero E6细胞有保护作用，具有抗病毒活性。三次实验测定新型基因重组高效复合干扰素对10000、1000和100TCID₅₀SARS病毒的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为0.92、0.18和0.10μg/ml，治疗指数为151.28、773.32和1391.80；注射用重组干扰素α-2b对10000、1000和100TCID₅₀SARS病毒的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为4.75、1.16和0.28μg/ml，治疗指数为3.62、14.78和61.36。

最重要的是，以上两个实验(见以上实施例9A及9B)皆证明rSIFN-co的抗SARS有效剂量是我国临床上使用的干扰素α-2b的1/5，其治疗指数(TI)却是干扰素α-2b的50倍。(见：重组复合干扰素与干扰素α2b对SARS相关冠状病毒的体外抑制作用比较-军事医学科学院微生物流行病研究所)

已有3万支rSIFN-co喷雾剂用于四川省的一线护士、医生及高危人群，结果四川省无一名护士及医生感染SARS。

实验负责人：王京燕

试验者：赵艳红、纪晓光、张敏、赵京花

试验起止日期：2003年7月1-30日

实施例10

不同干扰素对乙肝病毒基因表达的抑制作用的比较

乙型肝炎病毒(HBV)DNA包含反式激活蛋白的共有元件，这种蛋白质的结合活性是受干扰素调控的。用干扰素处理HBV转染的肝细胞导致HBV基因表达的抑制。本研究的目的是研究不同的干扰素对HBV转录调控的影响。用含HBV增强子EnHI、EnHII和核心启动子控制下的萤火虫荧光素酶基因的报道质粒(reporter plasmid)来瞬时转染人类肝癌细胞，申请人研究了三种不同干扰素对转录的生物活性影响。

材料和方法：

1.干扰素：IFN-con1(

)、IFN-Hui-Yang(rSIFN-co)及IFN-β1b。

2.报道质粒：用PCR制备包含HBV-增强子EnHI、EnHII和核心启动子的DNA片段，将其末端切平克隆入无增强子且无启动子的萤火虫荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic(Promega，WI，USA)的Smal I位点。所得到的报告质粒命名为pGL3-HBV-Luc。

3.细胞培养和DNA转染：将HepG2细胞培养于DMEM培养基中，该培养基补加10％FBS，100U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素。将细胞放置于温度30℃，含5％的CO₂的培养箱内。使用Boehringer的脂质体转染试剂盒用pGL3-HBV-Luc报告质粒转染细胞。经过18小时，移走含有转染试剂的培养基，注入含有或不含有干扰素的新鲜培养基，将细胞继续培养48小时。

4.荧光素酶测定：注入干扰素48小时后，收集并裂解细胞。该细胞溶解产物的蛋白质浓度由Bio-Rad蛋白质定量试剂盒检测。荧光素酶活性测定使用Promega的荧光素酶报告检测系统，按照制造商提供的指南进行。

实验结果：

不同干扰素处理的细胞溶解物中荧光素酶活性的表达

以上结果显示：rSIFN-co对HBV基因表达的抑制最有效。

实施例11

使用rSIFN-co的副作用及体温变化

现有干扰素类药的副反应较多。副反应包括：恶心、肌肉酸痛、食欲不振、脱发、白细胞减少(hypoleukmia；hypoleukocytosis；hypoleukia)及血小板减少等。

方法：

所有受试者分为两组。A组11名受试者注射9μg干复津，B组10名受试者注射9μgγSIFN-co。注射后，两组受试者临床观察48小时。注射1小时后进行第一次观察记录，此后每隔2小时观察记录一次。

表11.1列出的是9μgγSIFN-co与9μg干复津注射后患者的副反应对比。

表11.1副反应

结论：

注射γSIFN-co受试者的副反应比较小。其副反应为一般流感样症状，如：头痛，乏力，畏寒，肌肉疼痛，出汗，关节痛(关节疼痛，关节疼)。注射干复津受试者的副反应明显比注射γSIFN-co受试者的副反应大。

由附图9A-1、9A-2、9B-1和9B-2，可以观察到A组受试者的体温明显高于B组受试者。这些结果还反映出γSIFN-co比干复津具有更好的耐受性。

实施例12

γSIFN-co晶体生长及晶体学参数测定

γSIFN-co的晶体研究。经过系统的摸索与实验，目前已获得两种晶体。(见附图10-12)

1、晶体生长

用纯水(H₂O)溶解rSIFN-co蛋白质至浓度3mg/ml。结晶条件搜索使用Hampton公司的Hampton Research Crystal Screen I and II。采用气象悬滴扩散法(Drop Suspension Diffusion Method)，池液500μl，液滴1μl蛋白质+1μl池液，温度为293K。最初搜索得到两种不同类型的小晶体，见表12.1。

表12.1γSIFN-co晶体蛋白筛选

条件	I	II
			稀释剂	0.1M Tris-HClPH＝8.75	0.1M HEPESPH＝7.13
沉淀剂	17.5％(w/v)PEG550MME	10％(w/v)PEG6K
			添加剂	0.1M NaCl	3％(v/v)MPD
温度	293K	293K
			晶体大小(mm)	0.2×0.2×0.1	0.6×0.02×0.02
晶体衍射图	图10	图11

2、数据采集及处理

晶体I已用于X-射线衍射数据收集和初步晶体学分析，并完成晶体学参数测定。衍射数据收集在常温进行.将晶体I(条件I)封入薄壁石英管中。使用BrukerAXS Smart CCD探测器，光源采用Nonius FR591旋转阳极靶X光发生器产生的CuKα射线(

)。光源功率2000kw(40ky×50mA)，波长

曝光时间60秒，Δφ＝2°，晶体到探测器之间的距离为50mm。数据处理使用Bruker公司的Proteum程序包。晶体的衍射图谱(局部)见附图12。处理结果见表12.2。

表12.2晶体学参数测定结果

参数

a       82.67

b

      108.04

c

      135.01

α(°)       90.00

β(°)       90.00

γ(°)       98.35

空间群               P2或P2

分辨率                   

不对称分子#          10

溶出(dissolution)    57.6％

另外，按照已发表文献，γSIFN-co未有晶体长出。与γSIFN-co最为相近的结果是huIFN-α2b，但是其筛选条件非常复杂。经过三次接种晶体长到0.5×0.5×0.3mm，其分辨率为

空间群为P21，晶胞也很大，不对称分子有数为6，溶出为约60％。

序列表

<110>辉阳科技美国公司

四川省生物工程研究中心

<120>空间构象改变的干扰素及其应用

<160>15

 

<210>1

<211>504

<212>DNA

<213>合成序列

 

<220>

<221>CDS

<223>编码一种重组人干扰素的序列

 

<400>1

atg tgc gac ctg ccg cag acc cac tcc ctg ggt aac cgt cgt gct ctg    48

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

atc ctg ctg gct cag atg cgt cgt atc tcc ccg ttc tcc tgc ctg aaa    96

Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys

            20                  25                  30

gac cgt cac gac ttc ggt ttc ccg cag gaa gaa ttc gac ggt aac cag    144

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

        35                  40                  45

ttc cag aaa gct cag gct atc tcc gtt ctg cac gaa atg atc cag cag    192

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln

    50                  55                  60

acc ttc aac ctg ttc tcc acc aaa gac tcc tcc gct gct tgg gac gaa    240

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu

65                  70                  75                  80

tcc ctg ctg gaa aaa ttc tac acc gaa ctg tac cag cag ctg aac gac    288

Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

                85                  90                  95

ctg gaa gct tgc gtt atc cag gaa gtt ggt gtt gaa gaa acc ccg ctg    336

Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

            100                 105                 110

atg aac gtt gac tcc atc ctg gct gtt aaa aaa tac ttc cag cgt atc    384

Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile

        115                 120                 125

acc ctg tac ctg acc gaa aaa aaa tac tcc ccg tgc gct tgg gaa gtt    432

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val

    130                 135                 140

gtt cgt gct gaa atc atg cgt tcc ttc tcc ctg tcc acc aac ctg cag    480

Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln

145                 150                 155                 160

gaa cgt ctg cgt cgt aaa gaa taa                                    504

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

 

<210>2

<211>504

<212>DNA

<213>合成序列

 

<220>

<221>CDS

<223>编码一种重组人干扰素的序列

<400>2

tacacgctgg acggcgtctg ggtgagggac ccattggcag cacgagacta ggacgaccga 60

gtctacgcag catagagggg caagaggacg gactttctgg cagtgctgaa gccaaagggc 120

gtccttctta agctgccatt ggtcaaggtc tttcgagtcc gatagaggca agacgtgctt 180

tactaggtcg tctggaagtt ggacaagagg tggtttctga ggaggcgacg aaccctgctt 240

agggacgacc tttttaagat gtggcttgac atggtcgtcg acttgctgga ccttcgaacg 300

caataggtcc ttcaaccaca acttctttgg ggcgactact tgcaactgag gtaggaccga 360

caatttttta tgaaggtcgc atagtgggac atggactggc ttttttttat gaggggcacg 420

cgaacccttc aacaagcacg actttagtac gcaaggaaga gggacaggtg gttggacgtc 480

cttgcagacg cagcatttct tatt                                        504

 

<210>3

<211>167

<212>PRT

<213>合成序列

 

<220>

<223>编码一种重组人干扰素的序列

 

<400>3

 

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys

            20                  25                  30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

        35                  40                  45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln

    50                  55                  60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu

65                  70                  75                  80

Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

            100                 105                 110

Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile

        115                 120                 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val

    130                 135                 140

Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln

145                 150                 155                 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

 

<210>4

<211>360

<212>DNA

<213>合成序列

 

<220>

<223>编码一种重组人干扰素的序列

 

<400>4

atg tgt gat tta cct caa act cat tct ctt ggt aac cgt cgc gct ctg    48

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

att ctg ctg gca cag atg cgt cgt att tcc ccg ttt agc tgc ctg aaa    96

Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys

            20                  25                  30

gac cgt cac gac ttc ggc ttt ccg caa gaa gag ttc gat ggc aac caa    144

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

        35                  40                  45

ttc cag aaa gct cag gca atc tct gta ctg cac gaa atg atc caa cag    192

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln

    50                  55                  60

acc ttc aac ctg ttt tcc act aaa gac agc tct gct gct tgg gac gaa    240

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu

65                  70                  75                  80

agc ttg ctg gag aag ttc tac act gaa ctg tat cag cag ctg aac gac    288

Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

                85                  90                  95

ctg gaa gca tgc gta atc cag gaa gtt ggt gta gaa gag act ccg ctg    336

Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

            100                 105                 110

atg aac gtc gac tct att ctg gca                                    360

Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala

        115                 120

 

<210>5

<211>360

<212>DNA

<213>合成序列

 

<220>

<223>编码一种重组人干扰素的序列

 

<400>5

tacacactaa atggagtttg agtaagagaa ccattggcag cgcgagacta agacgaccgt 60

gtctacgcag cataaagggg caaatcgacg gactttctgg cagtgctgaa gccgaaaggc 120

gttcttctca agctaccgtt ggttaaggtc tttcgagtcc gttagagaca tgacgtgctt 180

tactaggttg tctggaagtt ggacaaaagg tgatttctgt cgagacgacg aaccctgctt 240

tcgaacgacc tcttcaagat gtgacttgac atagtcgtcg acttgctgga ccttcgtacg 300

cattaggtcc ttcaaccaca tcttctctga ggcgactact tgcagctgag ataagaccgt 360

 

<210>6

<211>120

<212>PRT

<213>合成序列

 

<220>

<223>编码一种重组人干扰素的序列

 

<400>6

 

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys

            20                  25                  30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

        35                  40                  45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln

    50                  55                  60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu

65                  70                  75                  80

Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

            100                 105                 110

Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala

        115                 120

<210>7

<211>108

<212>DNA

<213>合成

 

<220>

<223>化学合成

 

<400>7

atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg ggtaaccgtc gtgctctgat cctgctggct  60

cagatgcgtc gtatctcccc gttctcctgc ctgaaagacc gtcacgac               108

 

<210>8

<211>107

<212>DNA

<213>合成

 

<220>

<223>化学合成

 

<400>8

ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg caggagaggt tcgacggtaa ccagttccag  60

aagctcaggc tatctccgtt ctgcacgaaa tgatccagca gaccttc                107

 

<210>9

<211>103

<212>DNA

<213>合成

<220>

<223>化学合成

 

<400>9

gctgctggta cagttcggtg tagaat tttt ccagcaggga ttcgtcccaa gcagcggagg    60

agtctttggt ggagaacagg ttgaaggtct gctggatcat ttc                       103

 

<210>10

<211>103

<212>DNA

<213>合成

 

<220>

<223>化学合成

 

<400>10

atccctgctg gaaaaattct acaccgaact gtaccagcag ctgaacgacc tggaagcttg     60

cgttatccag gaagttggtg ttgaagaaac cccgctgatg aac                       103

 

<210>11

<211>106

<212>DNA

<213>合成

 

<220>

<223>化学合成

 

<400>11

gaagaaaccc cgctgatgaa cgttgactcc atcctggctg ttaaaaaata cttccagcgt     60

atcaccctgt acctgaccga aaaaaaatac tccccgtgcg cttggg                    106

<210>12

<211>112

<212>DNA

<213>合成

 

<220>

<223>化学合成

 

<400>12

ttattcttta cgacgcagac gttcctgcag gttggtggac agggagaagg aacgcatgat    60

ttcagcacga acaacttccc aagcgcacgg ggagtatttt ttttcggtca gg            112

 

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>合成

 

<220>

<223>化学合成

 

<400>13

atcggccata tgtgcgacct gccgcagacc c                                  31

 

<210>14

<211>40

<212>DNA

<213>合成

<220>

<223>化学合成

 

<400>14

actgccaggc tgcagttatt ctttacgacg cagacgttcc              40

 

<210>15

<211>15

<212>PRT    

<213>合成

 

<220>

<223>人工构造

 

<400>15

 

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Claims (10)

1.由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的重组干扰素，其特征是所述重组干扰素的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，与干复津

相比，所述重组干扰素具有改变的空间构象。

2.一种组合物，包含权利要求1所述的重组干扰素。

3.一种药用组合物，包含权利要求1所述的重组干扰素和适当药用载体。

4.编码权利要求1所述的重组干扰素的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5.一种载体，其包含权利要求4所述的基因。

6.一种宿主细胞，其中包含权利要求5所述的载体。

7.权利要求1所述的重组干扰素在制备预防或治疗受试体的严重急性呼吸道综合症的药物中的应用。

8.权利要求7所述的应用，其特征是所述重组干扰素的给药方式选自：口服、静脉注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻腔或粘膜给药、或通过呼吸器吸入给药。

9.权利要求7所述的应用，其特征是所述重组干扰素通过喷雾设备给予。

10.权利要求7所述的应用，其特征是所述重组干扰素是冻干的。

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