CN113045670B - 一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用。本发明融合蛋白包括鸡α干扰素与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白。本发明通过基因工程的方法，将鸡α干扰素基因与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因连接，并进行密码子优化，构建表达载体，诱导融合蛋白表达，来促进鸡α干扰素在表达系统中的可溶表达，从而解决了鸡α干扰素在原核系统呈不可溶的难题，提高了准确性和重复性。本发明提供的鸡α干扰素融合蛋白的生产方法操作简单、成本低，可实现鸡α干扰素规模化生产。本发明生产的鸡α干扰素融合蛋白具有良好的生物学活性和稳定性，对鸡病毒性传染病的防治具有重大的意义。

Description

一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术药物技术领域，具体涉及一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用。
背景技术
鸡α干扰素是一类能够广泛表达于多种单核细胞如巨噬细胞、树突状细胞及成纤维细胞等的细胞因子，在兽医临床中，因其具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多重功能而应用广泛。当病毒入侵动物体内，最先引起干扰素的分泌及抵御。干扰素的生物学功能主要有，增强免疫调节活性，抑制病毒增殖以及抑制肿瘤和相关细胞生长。干扰素功能多样，但过去因干扰素生产成本较高，家禽若非重大疫病，较少使用干扰素，也就意味着干扰素在家禽养殖市场并没有充分地体现其使用价值。
2018年非洲猪瘟疫情对中国养猪行业产生了巨大的冲击，家禽的供需进一步增加，这种状况，增加了中国大部分地区家禽的经济价值及食用价值，人们对肉食物质的追求，也造就了如今家禽供不应求的情况。据统计，2018年以来，蛋鸡价格经历了多轮上涨，蛋鸡养殖成效显著，家禽的经济价值得以体现，提高了家禽在养殖业的应用。家禽价值的提高，鸡α干扰素的功能在家禽临床得到更为充分的体现，通过一些易操作、成本低的手段来获得大量的鸡α干扰素迫不及待。
原核表达系统成本低、易操作，易获得大量的目的蛋白，较容易实现规模化生产，是获得大量鸡α干扰素的一种可靠方法。然而，鸡α干扰素在原核系统中以包涵体形式存在而难以通过原核表达系统实现规模化生产，阻碍了鸡α干扰素在临床中广泛应用。
发明内容
鉴于鸡α干扰素成本高，应用广，在原核表达系统中以包涵体形式存在，需要变复性，产量低，而难以通过原核表达系统实现规模化生产，阻碍了鸡α干扰素在临床中广泛应用，本发明的第一个目的在于提供一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白。这是一种在原核表达系统中，呈可溶性表达的鸡α干扰素，可实现规模化生产。
本发明的第二个目的在于提供编码上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白的基因。
本发明的第三个目的在于提供上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白的生产方法。
本发明的第四个目的在于提供上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白，包括鸡α干扰素与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白，鸡α干扰素与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白连接。
所述的可溶性鸡α干扰素融合蛋白还包括还包括连接肽，鸡α干扰素、连接肽与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白依次连接。
所述的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如下：
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINN NLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDTLNVQQK YKVSDTAATVTGYADTTIALDNSTFKASATGLGGTDQKIDGDLKFDDTTGKYYAKVTVTGGTGKDGYYEVSVDKTNGEVTLAGGATSPLTG GLPATATEDVKNVQVANADLTEAKAALTAAGVTGTASVVKMSYTDNNGKTIDGGLAVKVGDDYYSATQNKDGSISINTTKYTADDGTSKTA LNKLGGADGKTEVVSIGGKTYAASKAEGHNFKAQPDLAEAAATTTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSAR SRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR。
所述的鸡α干扰素的氨基酸序列为去除信号肽序列的鸡α干扰素氨基酸序列，其氨基酸序列如下：
CNHLRPQDATFSHDSLQLLRDMAPTLPQLCPQHNASCSFNDTILDTSNTRQADKTTHDILQHLFKILSSPSTPAHWNDSQRQSLLNR IHRYTQHLEQCLDSSDTRSRTRWPRNLHLTIKKHFSCLHTFLQDNDYSACAWEHVRLQARAWFLHIHNLTGNTRT。
所述的连接肽优选为柔性的连接肽；更优选为氨基酸序列为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的连接肽，式中所述n是2～10的整数；最优选为氨基酸序列为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3的连接肽。
优选地，所述的可溶性鸡α干扰素融合蛋白的氨基酸全序列为(亦如SEQ ID NO.1所示)：
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINN NLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDTLNVQQK YKVSDTAATVTGYADTTIALDNSTFKASATGLGGTDQKIDGDLKFDDTTGKYYAKVTVTGGTGKDGYYEVSVDKTNGEVTLAGGATSPLTG GLPATATEDVKNVQVANADLTEAKAALTAAGVTGTASVVKMSYTDNNGKTIDGGLAVKVGDDYYSATQNKDGSISINTTKYTADDGTSKTA LNKLGGADGKTEVVSIGGKTYAASKAEGHNFKAQPDLAEAAATTTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSAR SRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLRGGGGSGGGGSGGGGSCNHLRPQDATFSHDSLQLLRDMAPTLPQLCPQ HNASCSFNDTILDTSNTRQADKTTHDILQHLFKILSSPSTPAHWNDSQRQSLLNRIHRYTQHLEQCLDSSDTRSRTRWPRNLHLTIKKHFS CLHTFLQDNDYSACAWEHVRLQARAWFLHIHNLTGNTRT。
编码上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白的基因，可通过密码子规则得到；优选为依据宿主菌密码子使用偏好，进行密码子优化设计得到；最优选地，所述的鸡α干扰素融合蛋白的基因的序列如下所示(亦如SEQ ID NO.2所示)：
ATGGCTCAGGTCATTAATACGAACAGCTTGTCATTGCTGACGCAGAACAACCTCAATAAATCGCAATCAGCGTTGGGGACAGCCATC GAGCGGTTGTCGTCAGGTTTGCGCATTAACTCCGCTAAGGATGATGCAGCTGGCCAAGCAATTGCGAACCGCTTCACGGCAAACATTAAAG GCTTAACACAGGCCTCTCGTAACGCGAACGACGGGATTTCCATCGCACAGACGACGGAAGGTGCACTTAACGAAATCAACAATAACTTACA ACGTGTACGCGAGTTGGCTGTCCAGTCCGCGAACAGCACCAACTCTCAATCGGACTTGGATAGTATTCAAGCGGAGATCACCCAGCGTCTT AATGAAATCGACCGTGTATCGGGGCAGACTCAATTTAACGGCGTTAAGGTATTGGCCCAAGATAATACGTTAACTATTCAAGTGGGCGCAA ACGATGGTGAGACAATCGACATTGATCTCAAACAGATTAACAGTCAGACTCTCGGTCTGGACACACTCAACGTTCAACAGAAATATAAAGT GAGCGACACAGCGGCCACAGTAACGGGGTACGCAGATACAACTATTGCGCTCGATAATAGTACGTTTAAAGCATCCGCAACAGGTCTTGGT GGTACAGACCAAAAAATCGACGGTGATTTGAAGTTTGACGATACGACAGGGAAATATTACGCCAAGGTAACCGTAACTGGTGGCACGGGGA AGGATGGTTATTATGAGGTTAGCGTGGACAAAACCAATGGCGAAGTGACTCTGGCGGGGGGTGCTACCAGCCCGCTCACAGGTGGGCTCCC GGCCACCGCCACTGAGGACGTTAAGAACGTTCAAGTAGCAAATGCCGACCTTACTGAGGCGAAAGCGGCCCTGACCGCGGCCGGCGTAACA GGGACCGCAAGTGTGGTAAAGATGTCCTATACCGACAACAACGGGAAGACTATCGACGGGGGGCTTGCGGTCAAGGTGGGGGATGATTACT ATTCGGCTACTCAAAACAAAGATGGCTCGATTAGTATCAATACAACTAAGTACACGGCGGATGACGGTACCAGCAAGACCGCTTTAAACAA ATTAGGCGGCGCTGACGGGAAGACAGAAGTCGTTTCTATTGGTGGTAAAACATACGCGGCAAGCAAGGCCGAAGGGCACAACTTCAAGGCA CAGCCTGATTTGGCAGAAGCAGCCGCGACAACAACAGAAAACCCGCTGCAGAAGATCGACGCGGCCTTGGCCCAGGTTGACACCTTGCGCAGCGATTTGGGGGCGGTCCAGAATCGGTTCAACAGTGCAATTACAAATCTTGGTAACACTGTCAATAACCTGACGAGCGCCCGCTCGCGCAT CGAAGATTCCGACTACGCAACGGAGGTCTCCAACATGTCCCGGGCTCAAATCTTACAACAAGCGGGCACTTCCGTATTGGCGCAGGCGAAT CAGGTGCCACAGAATGTTCTCTCTCTGCTCCGGGGCGGCGGGGGGTCTGGCGGCGGTGGCTCTGGTGGTGGGGGTAGCTGTAATCACTTGC GTCCTCAGGACGCAACATTTAGTCACGATAGCTTGCAGTTGCTTCGCGATATGGCGCCAACCCTGCCTCAATTATGTCCTCAACACAATGC ATCCTGTTCCTTTAACGACACTATTCTTGATACTTCTAATACCCGCCAGGCGGACAAAACAACACATGACATTTTACAACATCTGTTTAAA ATTCTCTCGTCCCCGTCCACGCCTGCTCATTGGAATGATTCACAGCGTCAATCCTTGCTGAACCGCATTCATCGGTACACCCAACACCTGG AACAATGCCTCGATAGCTCGGATACACGTTCACGCACACGCTGGCCACGGAACCTGCACCTTACTATCAAGAAGCATTTTTCATGCCTCCA CACATTTCTTCAGGACAATGATTACTCGGCGTGTGCTTGGGAACATGTGCGCCTTCAGGCTCGTGCCTGGTTTTTACATATTCATAATCTC ACGGGCAATACACGCACATAA。
一种重组载体，含有上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白的编码基因；是将上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白的编码基因克隆入表达载体得到。
所述的表达载体优选为pET系列载体；更优选为pET-3a、pET-9a、pET-28a(+)、pET-22b(+)、 pET-26b(+)或pET-31b(+)；最优选为pET28a(+)。
一种重组表达菌株，含有上述重组载体；是将上述重组载体转入宿主菌株得到。
所述的宿主菌株选自细菌、酵母和真菌；优选为细菌；更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)；最优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白可通过化学合成方法得到，也可通过基因工程方法表达得到；优选为通过基因工程方法表达得到，具体包括如下步骤：培养上述重组表达菌株，诱导蛋白表达，分离纯化得到所述的可溶性鸡α干扰素融合蛋白。
一种利用基因工程技术生产上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将编码鸡α干扰素的基因、编码连接肽的基因和编码鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的基因依次连接，得到融合基因序列；
(2)将步骤(1)所得的融合基因序列克隆入表达载体，得到重组载体；
(3)将步骤(2)得到的重组载体转入宿主菌株，得到重组表达菌株；
(4)培养步骤(3)得到的重组表达菌株，表达，收集菌液，分离纯化获得可溶性鸡α干扰素融合蛋白。
步骤(1)中所述的融合基因序列优选为如SEQ ID NO.2所示。
步骤(2)中所述的表达载体优选为pET系列载体；更优选为pET-3a、pET-9a、pET-28a(+)、 pET-22b(+)、pET-26b(+)或pET-31b(+)；最优选为pET28a(+)。
步骤(3)中所述的宿主菌株选自细菌、酵母和真菌；优选为细菌；更优选为大肠杆菌 (Escherichia coli)；最优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
步骤(4)中所述的表达优选为诱导表达。
所述的诱导中的诱导剂优选为IPTG。
所述的IPTG的用量优选按终浓度为0.5～2mmol/L计；更优选为按终浓度为1.5mmol/L 计。
所述的诱导的时机是培养至菌液OD600为0.6～0.8时加入诱导剂进行诱导；更优选为培养至菌液OD600为0.8时加入诱导剂进行诱导。
步骤(4)中所述的分离纯化的方法优选为镍柱亲和层析法。
上述可溶性鸡α干扰素融合蛋白在制备鸡病毒性疾病药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过基因工程的方法，将鸡α干扰素基因与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因连接，并进行密码子优化，构建表达载体，诱导融合蛋白表达，来促进鸡α干扰素在表达系统中的可溶表达，从而解决了鸡α干扰素在原核系统呈不可溶的难题，提高了准确性和重复性。
(2)本发明提供的鸡α干扰素融合蛋白的生产方法操作简单、成本低，可实现鸡α干扰素规模化生产。
(3)本发明生产的鸡α干扰素融合蛋白具有良好的生物学活性和稳定性，对鸡病毒性传染病的防治具有重大的意义。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳检测鸡α干扰素融合蛋白可溶性表达的结果图；其中，条带1是Marker；条带2是菌液超声破碎后的上清的电泳结果；条带3是菌液破碎后的沉淀的电泳结果。
图2为SDS-PAGE电泳检测不同起始菌液浓度对融合蛋白诱导表达量影响的结果图；其中，泳道1为Marker、泳道2为OD600值为0.5、泳道3为OD600值为0.6、泳道4为OD60 值为0.7、泳道5为OD600值为0.8、泳道6 为OD600值为0.9。
图3为SDS-PAGE电泳检测不同诱导剂浓度对融合蛋白诱导表达量影响的结果图；其中，泳道1为Marker、泳道2为IPTG终浓度为0mmol/L、泳道3为IPTG终浓度为0.5mmol/L、泳道4为IPTG终浓度为1mmol/L、泳道5为IPTG终浓度为1.5mmol/L、泳道6 为IPTG终浓度为2mmol/L。
图4为鸡α干扰素融合蛋白纯化结果分析结果图；其中，泳道1为Marker、泳道2为流穿收集液1、泳道3为流穿收集液2、泳道4为洗涤收集液1、泳道5为洗涤收集液2、泳道6为洗脱收集液1、泳道7为洗脱收集液2、泳道8为洗脱收集液3、泳道9为洗脱收集液4。
图5为BCA蛋白定量标准曲线图。
图6为鸡α干扰素融合蛋白激活Mx蛋白启动子的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
实施例1：新型鸡α干扰素融合蛋白质粒pET28a-EcBoc的构建
根据NCBI上传的鸡α干扰素基因Chifn序列，根据软件分析将其与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliC片段的C末端进行连接，将密码子进行优化，得到优化后的连接片段核苷酸序列由上海通用公司合成，经测序正确后，获得大小为2028bp的融合基因，命名为EcBoc，使用引物gEcBoc-F、gEcBoc-R通过PCR将目的基因两端加上酶切位点NdeI/HindIII，得到带有酶切位点的EcBoc，其核苷酸序列如下(下划线部分为酶切位点)：
CATATGGCTCAGGTCATTAATACGAACAGCTTGTCATTGCTGACGCAGAACAACCTCAATAAATCGCAATCAGCGTTGGGGACAGCC ATCGAGCGGTTGTCGTCAGGTTTGCGCATTAACTCCGCTAAGGATGATGCAGCTGGCCAAGCAATTGCGAACCGCTTCACGGCAAACATTA AAGGCTTAACACAGGCCTCTCGTAACGCGAACGACGGGATTTCCATCGCACAGACGACGGAAGGTGCACTTAACGAAATCAACAATAACTT ACAACGTGTACGCGAGTTGGCTGTCCAGTCCGCGAACAGCACCAACTCTCAATCGGACTTGGATAGTATTCAAGCGGAGATCACCCAGCGT CTTAATGAAATCGACCGTGTATCGGGGCAGACTCAATTTAACGGCGTTAAGGTATTGGCCCAAGATAATACGTTAACTATTCAAGTGGGCG CAAACGATGGTGAGACAATCGACATTGATCTCAAACAGATTAACAGTCAGACTCTCGGTCTGGACACACTCAACGTTCAACAGAAATATAA AGTGAGCGACACAGCGGCCACAGTAACGGGGTACGCAGATACAACTATTGCGCTCGATAATAGTACGTTTAAAGCATCCGCAACAGGTCTT GGTGGTACAGACCAAAAAATCGACGGTGATTTGAAGTTTGACGATACGACAGGGAAATATTACGCCAAGGTAACCGTAACTGGTGGCACGG GGAAGGATGGTTATTATGAGGTTAGCGTGGACAAAACCAATGGCGAAGTGACTCTGGCGGGGGGTGCTACCAGCCCGCTCACAGGTGGGCT CCCGGCCACCGCCACTGAGGACGTTAAGAACGTTCAAGTAGCAAATGCCGACCTTACTGAGGCGAAAGCGGCCCTGACCGCGGCCGGCGTA ACAGGGACCGCAAGTGTGGTAAAGATGTCCTATACCGACAACAACGGGAAGACTATCGACGGGGGGCTTGCGGTCAAGGTGGGGGATGATT ACTATTCGGCTACTCAAAACAAAGATGGCTCGATTAGTATCAATACAACTAAGTACACGGCGGATGACGGTACCAGCAAGACCGCTTTAAA CAAATTAGGCGGCGCTGACGGGAAGACAGAAGTCGTTTCTATTGGTGGTAAAACATACGCGGCAAGCAAGGCCGAAGGGCACAACTTCAAG GCACAGCCTGATTTGGCAGAAGCAGCCGCGACAACAACAGAAAACCCGCTGCAGAAGATCGACGCGGCCTTGGCCCAGGTTGACACCTTGCGCAGCGATTTGGGGGCGGTCCAGAATCGGTTCAACAGTGCAATTACAAATCTTGGTAACACTGTCAATAACCTGACGAGCGCCCGCTCGCG CATCGAAGATTCCGACTACGCAACGGAGGTCTCCAACATGTCCCGGGCTCAAATCTTACAACAAGCGGGCACTTCCGTATTGGCGCAGGCG AATCAGGTGCCACAGAATGTTCTCTCTCTGCTCCGGGGCGGCGGGGGGTCTGGCGGCGGTGGCTCTGGTGGTGGGGGTAGCTGTAATCACT TGCGTCCTCAGGACGCAACATTTAGTCACGATAGCTTGCAGTTGCTTCGCGATATGGCGCCAACCCTGCCTCAATTATGTCCTCAACACAA TGCATCCTGTTCCTTTAACGACACTATTCTTGATACTTCTAATACCCGCCAGGCGGACAAAACAACACATGACATTTTACAACATCTGTTT AAAATTCTCTCGTCCCCGTCCACGCCTGCTCATTGGAATGATTCACAGCGTCAATCCTTGCTGAACCGCATTCATCGGTACACCCAACACC TGGAACAATGCCTCGATAGCTCGGATACACGTTCACGCACACGCTGGCCACGGAACCTGCACCTTACTATCAAGAAGCATTTTTCATGCCT CCACACATTTCTTCAGGACAATGATTACTCGGCGTGTGCTTGGGAACATGTGCGCCTTCAGGCTCGTGCCTGGTTTTTACATATTCATAATCTCACGGGCAATACACGCACATAAAAGCTT。
扩增引物的序列如下：
正向引物(gEcBoc-F)：CATATGGCTCAGGTCATTAATACG；
反向引物(gEcBoc-R)：AAGCTTTTATGTGCGTGTATTG；
扩增体系：Ex Taq酶25μL，正向引物(10pmol/μL)2μL，反向引物(10pmol/μL)2 μL，基因模板(模板的浓度是40ng/μL)2μL，ddH2O补足至50μL。
扩增反应条件：95℃5min；95℃50s、55℃50s、72℃90s，35个循环；72℃7min。
PCR反应完成之后，使用1％琼脂糖凝胶电泳将片段进行切胶回收，使用TaKaRa公司的内切酶NdeI/HindIII，进行双酶切；将酶切产物使用1％琼脂糖凝胶电泳将目的片段进行分离、切胶回收。
将载体pET28a(+)(含His标签)使用TaKaRa公司的内切酶NdeI/HindIII，进行双酶切；同样将载体的酶切产物使用1％琼脂糖凝胶电泳将目的片段进行分离、切胶回收备用。
将目的片段酶切产物与载体酶切产物使用T4 DNA连接酶进行连接，其中：
连接反应条件为：T4 DNA连接酶1μL，10倍浓度的T4 DNA缓冲液(10×T4 DNALigase Buffer)1μL，目的基因250ng，载体pET28a(+)100ng，无核酸酶水补足至10μL，将反应管放置16℃金属浴连接仪中连接过夜；将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将菌液涂含50μg/mL卡那霉素的LB板中，37℃进行培养；待菌长出，用上述引物gEcBoc-F/gEcBoc-R进行菌落PCR筛选；将PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，扩增出大小为2400bp左右的目的条带的克隆进一步测序，将测序正确的阳性克隆扩大培养，抽取质粒pET28a-EcBoc保存至-20℃冰箱，将菌液用含有15％～20％甘油的LB溶液放置-80℃进行保种。
实施例2：新型鸡α干扰素融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
将上述实施例1中保存的表达鸡α干扰素融合蛋白的菌液涂含卡那霉素的LB(含50mg/L 的卡那霉素(Kan))板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落重新转接涂板；将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100mL的液体LB培养基中，37℃、220rpm的摇床上摇菌；待菌液OD600值为0.6时，用IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为1mmol/L；诱导4h 后将菌液使用50mL离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清。
用无咪唑的蛋白裂解液Lysis buffer(6.9g NaH2PO4·H2O(MW 137.99g/mol)，17.54g NaCl (MW 58.44g/mol)，加入约900mL去离子水，搅拌溶解后，加入NaOH调节溶液pH值至 8.0，加入去离子水定容至1000mL)将保存的菌液重悬，使用超声破碎仪进行破碎，超声程序为破碎5s，间隔5s，超声15min；
将超声破碎后的产物8000rpm离心10min，收集上清与沉淀。分别取少量的上清及沉淀，加入5×SDS上样缓冲液，在沸水中煮10min后分别进行SDS-PAGE电泳，来判断目的蛋白是否可溶性表达，电泳结果如图1所示。结果显示，新型鸡α干扰素融合蛋白呈可溶性表达。
SDS-PAGE电泳分析：
配制SDS-PAGE分离胶：
(1)采用垂直式电泳槽装置，配制10％和15％的分离胶。检查玻璃板的密封性，按照分离胶体系(见表1和表2)，配制分离胶混合液，并将混合液迅速倒入玻璃板间，倒入分离液之后，再加入1mL的异丙醇溶液，来平衡液面，等待30～60min完全凝固后配制层积胶。
表1 10％的PAGE分离胶
Figure BDA0002342304330000071
表2 15％的PAGE分离胶
Figure BDA0002342304330000072
(2)待分离胶完全凝固后，将异丙醇倒出，并用吸水纸吸去多余的异丙醇，按照层积胶的体系(见表3)配制层积胶。将混合均匀的层积胶迅速倒入玻璃板中，并且插入合适的梳子，等待30min左右，待层积胶凝固。
(3)蛋白胶处理：待30min左右层积胶完全凝固后，将配置好的SDS-PAGE蛋白胶玻璃板固定在电泳槽上，加入电泳缓冲液，内槽电泳缓冲液没过玻璃板胶面，但是不溢出玻璃板，取出梳子，准备上样。
表3 SDS-PAGE层积胶
Figure BDA0002342304330000081
(4)样品处理：取出适量样品加入5×SDS上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，若加热后的样品有粘性产物，将样品进行瞬时离心后，取上清上样。
(5)上样：处理过的样品加入蛋白凝胶的样品孔中，同时加入等量的蛋白Marker跑胶。
(6)电泳：上样后进行电泳，将电泳电压调节至80V，跑胶30min，待条带从层积胶跑至分离胶调节电压至120V，电泳时间由样品中的溴酚蓝到达玻璃板下端的时间而定。
(7)考马斯亮蓝染色与脱色：将凝胶块从玻璃板中小心取出，轻轻置于含有考马斯亮兰染色液的槽中，将槽置于摇床中进行染色，室温下染色1h；将染色槽中的考马斯亮蓝溶液倒出，加入清水冲洗干净后，加入脱色液进行脱色，中间15～20min可换脱色液，直到条带清晰为止。
(8)将脱色后的胶块轻轻放置Odyssey双色红外激光成像系统中进行扫描，观察结果。
实施例3鸡α干扰素融合蛋白诱导条件优化
1、优化OD600的值
将上述实施例1中保存的表达鸡α干扰素融合蛋白的菌液，接种于100mL的LB(含50mg/L的卡那霉素(Kan))液体培养基，37℃恒温培养箱，设置诱导的OD值分别为0.5，0.6，0.7，0.8及0.9共5组，IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为1mmol/L，诱导时间4h；诱导后将菌液收集破碎进行SDS-PAGE电泳，观察诱导起始菌液浓度对蛋白表达量的影响。结果如图2所示，可见当诱导OD600值为0.8时，目的蛋白表达量最高，因此最佳诱导的OD600 值为0.8。
2、优化最佳诱导剂浓度
按照步骤1相同的方法将菌液培养至OD600为0.6～0.8，设置诱导剂IPTG终浓度分别为0mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L，1.5mmol/L及2mmol/L共5组，按照分组的标准分别加入诱导剂IPTG进行诱导，于37℃摇床中震荡培养4h，收集菌液后破碎进行SDS-PAGE电泳，观察IPTG诱导浓度对蛋白表达量的影响。结果如图3所示，可见当IPTG的终浓度为 1.5mmol/L时，目的蛋白的表达量最佳。
实施例4：鸡α干扰素融合蛋白的纯化、内毒素去除及定量分析
1、蛋白纯化
将表达的鸡α干扰素融合蛋白按照最佳优化条件，优化表达后的融合蛋白，采取BIOSCIENCES公司中镍柱亲和层析蛋白纯化原核表达的方法进行纯化目的蛋白，纯化步骤如下：
(1)平衡：取1mL镍填料加入纯化蛋白专用柱子中，加入10mL提前配好的裂解缓冲液(Lysis buffer，6.9g NaH2PO4·H2O(MW 137.99g/mol)，17.54g NaCl(MW 58.44g/mol)，0.68g咪唑(MW 68.08g/mol)，加入约900mL去离子水，搅拌溶解后，加入NaOH调节溶液pH值至8.0，加入去离子水定容至1000mL))进行平衡填料，重复3～5次。
(2)上样：在平衡过的柱子加入已超声破碎的裂解菌液，分批次加入，直至样品完全过柱。
(3)洗涤：往柱子中加入已配好的洗涤缓冲液(Wash buffer)清洗柱子，洗两次，每次 5mL。
(4)洗脱：在洗涤结束后，加入洗脱缓冲液(Elution buffer)将蛋白洗脱下来，每次400 μL，清洗6次。
(5)收集：每次洗脱均用不同的灭菌1.5mL的EP管进行标记、保存。
(6)样品处理：洗脱下来的每管分别吸取10μL的样品进行SDS-PAGE鉴定，结果如图4所示。对比纯化前后，可以看到较为单一的目的条带，纯化效果较好。
(7)保存：根据SDS-PAGE结果，将目的蛋白纯度较高的样品，加入20％的甘油进行保存。
2、去除内毒素
按照DNA-EZ Reagents P Endotoxin-Be-Gone液相内毒素消除剂说明书将浓度较高的样品进行内毒素去除操作，并使用鲎试剂(LAL)QCL-1000试剂盒检测样品中内毒素含量，直至内毒素最终浓度低于0.125EU/ug后将样品进行保存。
3、定量分析
使用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度，根据BCA试剂盒得出的数据建立标准曲线为：y＝4.50x-1.45(R2＝0.9959)，如图5所示。根据标准曲线计算出纯化后的蛋白浓度为： 2.22mg/mL。将测过浓度的蛋白分装后置于-20℃进行保存。
实施例5：新型鸡α干扰素融合蛋白的生物学活性检测
采用双荧光素酶报告基因的方法检测鸡α干扰素融合蛋白的生物学活性：
(1)构建双荧光素酶质粒pGL3 basic-Mxp：
根据NCBI公布的序列，选取Mx蛋白的完整启动子序列Mx-p，其核苷酸序列如下：
CACCATATCCCTCGGTGTCACATCCACACGGTCCTTGAACACTCCTAGAGATGACTCCACCACCTCTCTGGGCAGCCTGTGCCACTG CCTCACCACTCTTTCGGGGAATAAATGTTTCCTGATATCCAACCTGAAAAGGAAAGGGGCTGTTGCTCATAAGCAGTATTACCTAGCACCT GTGCCATCTGCCCTCTGATTGCTCTGCAGGAGAAGGAGAAACCACAGGACAAGGAGGGTAGTAGTGCATTGGAGTGGTTTTGTTACAGGGT TCTGCAAAGAACTGGGACGAAAATTGGCTAATGGATGAGGAATTTGAGTGAAACACACATCAGGATACTGTTTTCAATAATGAAAGCATTT TAGTTTCGTTTCTCCTTGTTTATGTCATGTAGGTGGAGTCTGTGTATAGAAAAGCATTCAGA；
设计引物，从鸡胚肌肉组织中通过PCR克隆出完整启动子序列Mxp；通过Snapgene等软件，分析克隆载体pGL3 basic序列及目的基因Mxp的序列；PCR克隆的时候通过设计携带有内切酶KpnI/HindIII的引物Mxp-F、Mxp-R，将Mxp基因两端加上酶切位点，获得带有酶切位点的Mxp，其中：
扩增引物序列(下划线部分为酶切位点)：
正向引物(Mxp-F)：5’-TTACCGGGTACCCACCATATCCCTCGGTGTCAC-3’；
反向引物(Mxp-R)：5’-TAAGGGAAGCTTTCTGAATGCTTTTCTATACAC-3’。
扩增体系：Ex Taq酶25μL，正向引物(10pmol/μL)2μL，反向引物(10pmol/μL)2 μL，基因模板(模板的浓度是40ng/μL)2μL，ddH2O补足至50μL；
扩增反应条件：95℃5min；95℃50s、55℃50s、72℃90s，35个循环；72℃7min。
PCR反应完成之后，使用1％琼脂糖凝胶电泳将片段进行切胶回收，使用TaKaRa公司的内切酶KpnI/HindIII，进行双酶切；将酶切产物使用1％琼脂糖凝胶电泳将目的片段进行分离、切胶回收；将载体pGL3 basic使用TaKaRa公司的内切酶KpnI/HindIII，进行双酶切；同样将载体的酶切产物使用1％琼脂糖凝胶电泳将目的片段进行分离、切胶回收备用；将目的片段酶切产物与载体酶切产物通过T4 DNA连接酶进行连接。
连接反应条件为：T4 DNA连接酶1μL，10倍浓度的T4 DNA缓冲液(10×T4 DNALigase Buffer)1μL，目的基因250ng，载体pGL3 basic 100ng，无核酸酶dH2O补足至10μL，将反应管放置16℃金属浴连接仪中连接过夜；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌感受态细胞中，将菌液涂含100μg/mL氨苄霉素的LB板中，37℃进行培养；将菌转接至含氨苄霉素的LB液体培养基中，摇菌，抽取质粒，PCR后测序，验证Mxp序列是否有突变，筛选正确的质粒，命名为pGL3 basic Mxp。将携带正确质粒的大肠杆菌DH5α感受态细胞扩大培养，抽取质粒置于-20℃备用。
(2)转染：
将本实验室保存的海参荧光素酶真核表达质粒pRL-tk(promega)转化至大肠杆菌DH5α感受态中，将菌液进行扩增培养，采取无内毒素质粒抽提，将抽提的质粒测浓度进行实验。
将pGL3 basic Mxp质粒和参荧光素酶真核表达质粒pRL-tk转染到鸡成纤维细胞DF1细胞(ATCC)中，步骤参考LipofectamineTM 2000操作说明书进行转染，具体操作步骤如下：
(A)转染前一天，将培养状态良好的DF1细胞进行铺板，细胞培养液为含10％FBS的DMEM培养基，按照1.0×105个细胞/mL接种于12孔细胞板内，每孔1mL，放入5％CO2、 37℃和95％湿度的细胞培养箱进行培养。
(B)第二天待细胞长至80％～90％时开始转染。
(C)转染试剂复合物的准备：取无菌的1.5mL EP管1支，计作管A：850μL
Figure BDA0002342304330000111
Ⅰ减血清培养基加入25μL LipofectamineTM 2000。再取另外1支无菌1.5mL EP管，计作管B： 850μL
Figure BDA0002342304330000112
Ⅰ减血清培养基加入12.5μg质粒pGL3 basicMxp。取第3支无菌1.5mL EP 管，计作管C：850μL
Figure BDA0002342304330000113
Ⅰ减血清培养基加入12.5μg质粒pRL-tk，将3管混合液分别轻轻吹打混匀，室温孵育5min。
(D)5min后，将稀释的脂质体A管、稀释的质粒B管和稀释的质粒C管混合在一起(总体积2550μL)，轻轻混匀，室温孵育20min，以利于脂质体-质粒复合物的形成。
(E)将长至80％～90％左右的细胞，吸弃细胞培养液，用PBS轻清洗2～3次。将孵育20min后的混合物，每孔分装200μL至12孔板中，混合物刚好能够完全覆盖12孔板底部。
(F)换液：5％CO2、37℃和95％湿度的细胞培养箱培养4～6h后，更换为1％的细胞维持液(含1％FBS的DMEM培养基)，24h后进行蛋白孵育。
(3)蛋白孵育：
根据实施例4的蛋白含量测量结果，对已经转染质粒的DF1细胞进行蛋白孵育，步骤如下：
(A)首先使用1％细胞培养液将实施例1得到的融合蛋白EcBoc进行稀释，将蛋白浓度稀释至终浓度为10ng/μL。
(B)将已经转染的细胞进行分组，第一列为融合蛋白EcBoc组，第二列为空白对照组。每组设置三个重复。将该实验重复三次，进行三次独立实验。
(C)将稀释好的蛋白按照实验设计方案加入每孔中进行刺激细胞，空白对照组只加入 1％细胞培养液，每孔1mL。
(D)将加样后的细胞，继续放入5％CO2、37℃和95％湿度的细胞培养箱进行培养，24h 后通过双荧光素酶报告基因系统观察结果。
(4)双荧光素酶报告基因检测结果：
36～48h后，将孵育过蛋白的细胞进行处理，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明书进行操作，具体步骤如下：
(A)使用去离子水将5×PLB裂解液稀释成1×PLB的裂解液，现用现配。
(B)处理细胞，吸弃细胞培养液，并加入适当的PBS进行清洗细胞，将多余的PBS吸弃。
(C)每孔加入100μL稀释好的细胞裂解液，置摇床摇20～30min，使细胞完全裂解。
(D)将裂解后的细胞转移至1.5mL EP管，2000rpm离心5min，转移50μL至新的1.5mLEP 管，每管先加入100μL预混好的Luciferase Assay Reagent II，2s后测数据，检测荧光素酶反应强度。
(E)测定结束后，再次加入100μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，读数检测内参海参荧光素酶反应强度。
(5)记录数据：读取萤火虫荧光素酶反应强度/内参海参荧光素酶反应强度，即Ratio (R)＝RLU1/RLU2。
(6)新型鸡α干扰素融合蛋白的生物学活性检测数据分析：通过GraphPad prism软件将荧光数据进行T检验分析。根据读数来判断实验组及对照组对质粒中启动子的激活情况，荧光素酶的表达量与荧光强度成正比，与启动子的作用强度成正比，结果如图6所示。
通过双荧光素酶报告基因检测结果显示：实验组融合蛋白EcBoc和空白对照组相比，经 T检验分析，P＜0.01，差异显著。
根据双荧光素酶基因数据检测结果可知，融合蛋白EcBoc能够明显激活Mx蛋白的启动子，具有和IFN-α一样的功能。
实验结果得出结论：融合蛋白EcBoc能够明显激活Mx蛋白的启动子，说明EcBoc和IFN-α具有同样的蛋白活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 可溶性鸡α干扰素融合蛋白氨基酸全序列
<400> 1
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln
165 170 175
Gln Lys Tyr Lys Val Ser Asp Thr Ala Ala Thr Val Thr Gly Tyr Ala
180 185 190
Asp Thr Thr Ile Ala Leu Asp Asn Ser Thr Phe Lys Ala Ser Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Gly Thr Asp Gln Lys Ile Asp Gly Asp Leu Lys Phe Asp
210 215 220
Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Val Thr Gly Gly Thr
225 230 235 240
Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Glu Val Ser Val Asp Lys Thr Asn Gly Glu
245 250 255
Val Thr Leu Ala Gly Gly Ala Thr Ser Pro Leu Thr Gly Gly Leu Pro
260 265 270
Ala Thr Ala Thr Glu Asp Val Lys Asn Val Gln Val Ala Asn Ala Asp
275 280 285
Leu Thr Glu Ala Lys Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gly Val Thr Gly Thr
290 295 300
Ala Ser Val Val Lys Met Ser Tyr Thr Asp Asn Asn Gly Lys Thr Ile
305 310 315 320
Asp Gly Gly Leu Ala Val Lys Val Gly Asp Asp Tyr Tyr Ser Ala Thr
325 330 335
Gln Asn Lys Asp Gly Ser Ile Ser Ile Asn Thr Thr Lys Tyr Thr Ala
340 345 350
Asp Asp Gly Thr Ser Lys Thr Ala Leu Asn Lys Leu Gly Gly Ala Asp
355 360 365
Gly Lys Thr Glu Val Val Ser Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Ala Ala Ser
370 375 380
Lys Ala Glu Gly His Asn Phe Lys Ala Gln Pro Asp Leu Ala Glu Ala
385 390 395 400
Ala Ala Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu
405 410 415
Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg
420 425 430
Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr
435 440 445
Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser
450 455 460
Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu
465 470 475 480
Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asn
500 505 510
His Leu Arg Pro Gln Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser Leu Gln Leu
515 520 525
Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys Pro Gln His Asn
530 535 540
Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr Ser Asn Thr Arg
545 550 555 560
Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His Leu Phe Lys Ile
565 570 575
Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser Gln Arg Gln
580 585 590
Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu Glu Gln Cys
595 600 605
Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro Arg Asn Leu
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His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr Phe Leu Gln
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Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg Leu Gln Ala
645 650 655
Arg Ala Trp Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn Thr Arg Thr
660 665 670
<210> 2
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 可溶性鸡α干扰素融合蛋白基因序列
<400> 2
atggctcagg tcattaatac gaacagcttg tcattgctga cgcagaacaa cctcaataaa 60
tcgcaatcag cgttggggac agccatcgag cggttgtcgt caggtttgcg cattaactcc 120
gctaaggatg atgcagctgg ccaagcaatt gcgaaccgct tcacggcaaa cattaaaggc 180
ttaacacagg cctctcgtaa cgcgaacgac gggatttcca tcgcacagac gacggaaggt 240
gcacttaacg aaatcaacaa taacttacaa cgtgtacgcg agttggctgt ccagtccgcg 300
aacagcacca actctcaatc ggacttggat agtattcaag cggagatcac ccagcgtctt 360
aatgaaatcg accgtgtatc ggggcagact caatttaacg gcgttaaggt attggcccaa 420
gataatacgt taactattca agtgggcgca aacgatggtg agacaatcga cattgatctc 480
aaacagatta acagtcagac tctcggtctg gacacactca acgttcaaca gaaatataaa 540
gtgagcgaca cagcggccac agtaacgggg tacgcagata caactattgc gctcgataat 600
agtacgttta aagcatccgc aacaggtctt ggtggtacag accaaaaaat cgacggtgat 660
ttgaagtttg acgatacgac agggaaatat tacgccaagg taaccgtaac tggtggcacg 720
gggaaggatg gttattatga ggttagcgtg gacaaaacca atggcgaagt gactctggcg 780
gggggtgcta ccagcccgct cacaggtggg ctcccggcca ccgccactga ggacgttaag 840
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ggctcgatta gtatcaatac aactaagtac acggcggatg acggtaccag caagaccgct 1080
ttaaacaaat taggcggcgc tgacgggaag acagaagtcg tttctattgg tggtaaaaca 1140
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tccacgcctg ctcattggaa tgattcacag cgtcaatcct tgctgaaccg cattcatcgg 1800
tacacccaac acctggaaca atgcctcgat agctcggata cacgttcacg cacacgctgg 1860
ccacggaacc tgcaccttac tatcaagaag catttttcat gcctccacac atttcttcag 1920
gacaatgatt actcggcgtg tgcttgggaa catgtgcgcc ttcaggctcg tgcctggttt 1980
ttacatattc ataatctcac gggcaataca cgcacataa 2019
<210> 3
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白氨基酸序列
<400> 3
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
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130 135 140
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145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln
165 170 175
Gln Lys Tyr Lys Val Ser Asp Thr Ala Ala Thr Val Thr Gly Tyr Ala
180 185 190
Asp Thr Thr Ile Ala Leu Asp Asn Ser Thr Phe Lys Ala Ser Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Gly Thr Asp Gln Lys Ile Asp Gly Asp Leu Lys Phe Asp
210 215 220
Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Val Thr Gly Gly Thr
225 230 235 240
Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Glu Val Ser Val Asp Lys Thr Asn Gly Glu
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275 280 285
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 鸡α干扰素氨基酸序列
<400> 4
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50 55 60
Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser Gln
65 70 75 80
Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His Leu Glu
85 90 95
Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro Arg
100 105 110
Asn Leu His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr Phe
115 120 125
Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg Leu
130 135 140
Gln Ala Arg Ala Trp Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly Asn Thr
145 150 155 160
Arg Thr
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 连接肽序列
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gEcBoc-F
<400> 6
catatggctc aggtcattaa tacg 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gEcBoc-R
<400> 7
aagcttttat gtgcgtgtat tg 22
<210> 8
<211> 2028
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带有酶切位点的EcBoc
<400> 8
catatggctc aggtcattaa tacgaacagc ttgtcattgc tgacgcagaa caacctcaat 60
aaatcgcaat cagcgttggg gacagccatc gagcggttgt cgtcaggttt gcgcattaac 120
tccgctaagg atgatgcagc tggccaagca attgcgaacc gcttcacggc aaacattaaa 180
ggcttaacac aggcctctcg taacgcgaac gacgggattt ccatcgcaca gacgacggaa 240
ggtgcactta acgaaatcaa caataactta caacgtgtac gcgagttggc tgtccagtcc 300
gcgaacagca ccaactctca atcggacttg gatagtattc aagcggagat cacccagcgt 360
cttaatgaaa tcgaccgtgt atcggggcag actcaattta acggcgttaa ggtattggcc 420
caagataata cgttaactat tcaagtgggc gcaaacgatg gtgagacaat cgacattgat 480
ctcaaacaga ttaacagtca gactctcggt ctggacacac tcaacgttca acagaaatat 540
aaagtgagcg acacagcggc cacagtaacg gggtacgcag atacaactat tgcgctcgat 600
aatagtacgt ttaaagcatc cgcaacaggt cttggtggta cagaccaaaa aatcgacggt 660
gatttgaagt ttgacgatac gacagggaaa tattacgcca aggtaaccgt aactggtggc 720
acggggaagg atggttatta tgaggttagc gtggacaaaa ccaatggcga agtgactctg 780
gcggggggtg ctaccagccc gctcacaggt gggctcccgg ccaccgccac tgaggacgtt 840
aagaacgttc aagtagcaaa tgccgacctt actgaggcga aagcggccct gaccgcggcc 900
ggcgtaacag ggaccgcaag tgtggtaaag atgtcctata ccgacaacaa cgggaagact 960
atcgacgggg ggcttgcggt caaggtgggg gatgattact attcggctac tcaaaacaaa 1020
gatggctcga ttagtatcaa tacaactaag tacacggcgg atgacggtac cagcaagacc 1080
gctttaaaca aattaggcgg cgctgacggg aagacagaag tcgtttctat tggtggtaaa 1140
acatacgcgg caagcaaggc cgaagggcac aacttcaagg cacagcctga tttggcagaa 1200
gcagccgcga caacaacaga aaacccgctg cagaagatcg acgcggcctt ggcccaggtt 1260
gacaccttgc gcagcgattt gggggcggtc cagaatcggt tcaacagtgc aattacaaat 1320
cttggtaaca ctgtcaataa cctgacgagc gcccgctcgc gcatcgaaga ttccgactac 1380
gcaacggagg tctccaacat gtcccgggct caaatcttac aacaagcggg cacttccgta 1440
ttggcgcagg cgaatcaggt gccacagaat gttctctctc tgctccgggg cggcgggggg 1500
tctggcggcg gtggctctgg tggtgggggt agctgtaatc acttgcgtcc tcaggacgca 1560
acatttagtc acgatagctt gcagttgctt cgcgatatgg cgccaaccct gcctcaatta 1620
tgtcctcaac acaatgcatc ctgttccttt aacgacacta ttcttgatac ttctaatacc 1680
cgccaggcgg acaaaacaac acatgacatt ttacaacatc tgtttaaaat tctctcgtcc 1740
ccgtccacgc ctgctcattg gaatgattca cagcgtcaat ccttgctgaa ccgcattcat 1800
cggtacaccc aacacctgga acaatgcctc gatagctcgg atacacgttc acgcacacgc 1860
tggccacgga acctgcacct tactatcaag aagcattttt catgcctcca cacatttctt 1920
caggacaatg attactcggc gtgtgcttgg gaacatgtgc gccttcaggc tcgtgcctgg 1980
tttttacata ttcataatct cacgggcaat acacgcacat aaaagctt 2028
<210> 9
<211> 422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mx-p序列
<400> 9
caccatatcc ctcggtgtca catccacacg gtccttgaac actcctagag atgactccac 60
cacctctctg ggcagcctgt gccactgcct caccactctt tcggggaata aatgtttcct 120
gatatccaac ctgaaaagga aaggggctgt tgctcataag cagtattacc tagcacctgt 180
gccatctgcc ctctgattgc tctgcaggag aaggagaaac cacaggacaa ggagggtagt 240
agtgcattgg agtggttttg ttacagggtt ctgcaaagaa ctgggacgaa aattggctaa 300
tggatgagga atttgagtga aacacacatc aggatactgt tttcaataat gaaagcattt 360
tagtttcgtt tctccttgtt tatgtcatgt aggtggagtc tgtgtataga aaagcattca 420
ga 422
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mxp-F
<400> 10
ttaccgggta cccaccatat ccctcggtgt cac 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mxp-R
<400> 11
taagggaagc tttctgaatg cttttctata cac 33

Claims (8)

1.一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白，其特征在于：包括鸡α干扰素、连接肽与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白，鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白、连接肽与鸡α干扰素依次连接；
所述的可溶性鸡α干扰素融合蛋白的氨基酸全序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的可溶性鸡α干扰素融合蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求2或3所述的可溶性鸡α干扰素融合蛋白的编码基因。
5.一种重组表达菌株，其特征在于：含有权利要求4所述的重组载体。
6.一种利用基因工程技术生产权利要求1所述的可溶性鸡α干扰素融合蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将编码鸡α干扰素的基因、编码连接肽的基因和编码鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的基因依次连接，得到融合基因序列；
（2）将步骤（1）所得的融合基因序列克隆入表达载体，得到重组载体；
（3）将步骤（2）得到的重组载体转入宿主菌株，得到重组表达菌株；
（4）培养步骤（3）得到的重组表达菌株，表达，收集菌液，分离纯化获得可溶性鸡α干扰素融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的利用基因工程技术生产可溶性鸡α干扰素融合蛋白的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的融合基因序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤（2）中所述的表达载体为pET28a(+)；
步骤（3）中所述的宿主菌株为大肠杆菌BL21（DE3）；
步骤（4）中所述的表达为诱导表达；诱导剂为IPTG；
所述的分离纯化的方法为镍柱亲和层析法。
8.权利要求1所述的可溶性鸡α干扰素融合蛋白在制备鸡病毒性疾病药物中的应用。
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