CN111205361A - 白介素21蛋白（il21）突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种一种白介素21蛋白(IL21)突变体及其应用，所述的突变体为，在野生型IL21的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键。所述的野生型IL21蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及包含所述的IL21蛋白突变体的融合蛋白，以及所述的IL21蛋白突变体或融合蛋白在制备药物中的应用，优选的，所述的药物是调节或激活免疫的药物或抗肿瘤药物。本发明还涉及所述的IL21蛋白突变体或融合蛋白在制备促进B细胞分化增殖，促进T细胞分化增殖，促进NK细胞分化增殖的制剂中的应用。

Description

白介素21蛋白(IL21)突变体及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及一种白介素21蛋白(IL21)突变体及其应用。
背景技术
针对肿瘤免疫治疗研究中的免疫抑制问题，细胞因子和小分子抑制剂治疗，能够起到免疫调节的作用，细胞因子和小分子抑制剂能针对抑制性细胞亚群，抑制其数量或功能，或者通过免疫刺激分子活化抗肿瘤效应细胞，增强患者的抗肿瘤免疫应答。IL2(白介素2)是免疫反应中的重要介导分子，也是已知最强有力的抗肿瘤细胞因子之一，具有广泛的生物学活性，IL2直接作用于胸腺T细胞，促进Treg细胞的分化，抑制自身免疫，也能够促进初始T细胞分化成为可被抗原刺激激活的效应T细胞与记忆T细胞，可帮助机体抵抗感染。然而，IL2的全身用药可导致较强的不良反应，使得IL2的治疗剂量受到限制[1-2]，而且血浆半衰期短(约0.5-2小时)[3]，在肿瘤局部微环境中不能达到治疗的最佳剂量，也限制了其临床应用。
在细胞因子家族中，IL2、IL15和IL21同属于共受体γ链家族，都有促进T细胞、NK细胞活性，增强其杀伤靶细胞的作用，这些特性使它们在研究肿瘤免疫治疗中成为有吸引力的细胞因子[4-5]。
IL21(白介素21)是2000年发现的Ⅰ型细胞因子，属于γc家族，由134个氨基酸组成，主要由CD4+T细胞亚群，如TH17细胞以及TFH(T follicular helper)细胞分泌产生，NKT细胞也能分泌较高水平的IL21[19-20]。有报道IL21受体IL21R在T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞和单核/巨噬细胞表面均有表达，是具有广泛免疫调节作用的细胞因子。
许多临床前实验指出，IL21通过多种机制抗肿瘤，包括先天免疫系统和获得性免疫系统[6]。IL21已被批准进入人体临床实验治疗黑色素瘤、肾癌，获得良好得治疗效果[7-8]；IL21可以增强NK细胞对西妥昔单抗预先包被的胰腺癌细胞的反应[9]；IL21与单克隆抗体Rituximab(anti-CD20)所构建融合蛋白在动物实验中显示可以直接诱导凋亡或通过效应效应细胞来杀伤非何杰金氏淋巴瘤(NHL)[10]。
我们的前期研究发现：在乳腺癌小鼠模型中，IL21可以通过将M2巨噬细胞(具有增加肿瘤耐药和恶性的作用)转化为M1巨噬细胞(具有抗肿瘤功能)大幅提升抗体乳腺癌抗体赫赛汀的肿瘤杀伤效果[11]。
但同时，在多项IL21临床应用研究中显示，虽然IL21毒副作用较相同剂量的IL2或IFN-α小，主要表现为发热、疲劳、头痛、皮疹等较轻症状，也有出现腹痛、血小板减少、低磷血症、肝功能损害等严重表现，但在30ug/kg通常给药量时，各种毒副作用的发生率仍达100％[12]，这是全身用药时需要慎重对待的问题。事实上，开展IL21临床应用研究多年，目前仍停留在临床前Ⅰ期、Ⅱ期阶段，存在毒副作用发生率高的问题是重要原因。
为解决提高细胞因子在肿瘤局部的有效浓度从而避免全身性毒性反应的问题，有研究者利用抗体靶向性传递细胞因子，使细胞因子的免疫治疗能力与抗体的靶向性抗肿瘤反应结合起来，在肿瘤局部获得高浓度的细胞因子，有效刺激细胞免疫反应，这种将细胞因子与细胞特异性的抗体偶联，将其命名为免疫细胞因子[13]。
但是，有临床研究发现IL21血浆半衰期较短，仅有约3.09小时[12]，即使IL21与单克隆抗体构建的融合蛋白分子量已达约180kD，血浆半衰期仍较短，IL21与Rituximab(anti-CD20)所构建融合蛋白在动物实验中血浆半衰期也仅有约18.94小时[10]，成药性仍然不高。因此，提高IL21稳定性是延长半衰期、提高成药性的重要条件。
结构分析显示，IL21的蛋白构象存在稳定与不稳定两种构象，这是IL21半衰期短的一个原因；有报道表明通过将IL21的蛋白结构中不稳定区域替换为IL4(白介素4)的同源区域构建了一种嵌合体IL21/4，结果显示嵌合体IL21/4的蛋白构象单一稳定，而且生物学活性有提高[14]。
在我们的前期工作中，已经建立了实现蛋白质构像体外控制的哺乳动物细胞表面蛋白质稳定展示系统，(参见CN201410803422，CN201810795499)，能够对蛋白进行理性设计突变及筛选、鉴定。在本发明中，我们使用该系统，对白介素21(IL21)的进行了稳定展示，并通过基于蛋白质结构分析的设计，优化并获得了一组突变体IL21蛋白。
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发明内容
本发明首先涉及一种白介素21(IL21)突变体，所述的突变体为：将野生型IL21的氨基酸序列的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键，所述的野生型IL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及一种白介素21(IL21)突变体，所述的突变体为：将野生型IL21的氨基酸序列的第16位ILE、第17位VAL、第70位SER、第112位LYS的都突变为CYS，并且形成16-70、17-112两组二硫键，所述的野生型IL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及一种白介素21和白介素4嵌合体蛋白(IL21/4)的突变体，所述的突变体为：将白介素21和白介素4嵌合体(IL21/4)的氨基酸序列的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键，所述的白介素21和白介素4嵌合体蛋白(IL21/4)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及一种白介素21和白介素4嵌合体蛋白(IL21/4)的突变体，所述的突变体为：将白介素21和白介素4嵌合体(IL21/4)的氨基酸序列的第16位ILE、第17位VAL、第70位SER、第106位LYS的都突变为CYS，并且形成16-70、17-106两组二硫键，所述的白介素21和白介素4嵌合体蛋白(IL21/4)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及编码所述IL21突变体、IL21/4突变体的核苷酸序列。
本发明还涉及包含所述的IL21突变体或IL21/4突变体的融合蛋白，所述的融合蛋白包括：
(1)功能片段1：IL21突变体或IL21/4突变体；
(2)功能片段2：单克隆抗体功能；
及连接不同功能片段的连接结构域。
本发明还涉及所述的IL21突变体或IL21/4突变体在制备药物中的应用，所述的药物是调节或激活免疫的药物或抗肿瘤药物。
本发明还涉及所述包含IL21突变体或IL21/4突变体的融合蛋白在制备药物中的应用，所述的药物是调节或激活免疫的药物或抗肿瘤药物。
本发明还涉及所述的IL21突变体或IL21/4突变体在制备促进B细胞分化增殖，促进T细胞分化增殖，促进NK细胞分化增殖的制剂中的应用。
本发明还涉及所述包含IL21突变体或IL21/4突变体的融合蛋白在制备促进B细胞分化增殖，促进T细胞分化增殖，促进NK细胞分化增殖的制剂中的应用。
本发明还涉及以所述IL21突变体或IL21/4突变体为活性成分的药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括治疗有效量的所述IL21突变体或IL21/4突变体，以及必要的药用辅料。
本发明还涉及以所述包含IL21突变体或IL21/4突变体的融合蛋白为活性成分的药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括治疗有效量的所述融合蛋白，以及必要的药用辅料。
附图说明
图1、展示IL21/4与Herceptin抗体的融合蛋白的重组替换质粒片段
图2、通过同源重组将FRT-IL21/4-Herceptin质粒替换入CHO工作细胞基因组示意图
图3、FRT-IL21/4-Herceptin质粒替换入CHO工作细胞后IL21/4-Herceptin展示率
左图为CHO工作细胞阴性对照组，右图为转染后实验组，纵坐标标识为与Herceptin重链恒定区结合后HerceptinHC展示率，p3区显示IL21/4-Herceptin成功替换后展示率，约0.269％。
图4、FRT-IL21/4-Herceptin质粒替换入CHO工作细胞后IL21/4-Herceptin展示率
左图为CHO工作细胞阴性对照组，右图为转染后实验组，横坐标标识与IL21受体IL21Rα胞外域结合后展示率；纵坐标标识与IL21受体γc胞外域结合后展示率，可见实验组与IL21Rα胞外域结合后展示率为17.2％，与γc胞外域结合后展示率<0.3％。
图5、展示IL21/4-Herceptin细胞与Mouse Anti-human IgG-APC antibody结合展示率
左图为CHO工作细胞阴性对照组，右图为转染后实验组，横坐标标识与IL21受体γc胞外域结合后展示率，纵坐标标识为与Herceptin重链恒定区结合后HerceptinHC展示率，结果显示融合蛋白结合后的Herceptin展示率2.54％。
图6、FRT-IL21/4-Herceptin通过突变二硫键后检测展示率结果
展示16c IL21/4-Herceptin、17c IL21/4-Herceptin及4c IL21/4-Herceptin蛋白的CHO细胞富集后检测展示率结果，横坐标标识与IL21受体IL21Rα胞外域结合后展示率；纵坐标标识与Herceptin重链恒定区与标记抗体Mouse Anti-human IgG-APC antibody结合后的展示率，可见16c IL21/4-Herceptin、4c IL21/4-Herceptin组与Herceptin重链恒定区结合后的展示率，且与受体IL21Rα胞外域结合后的展示率都较富集前明显提高；而17cIL21/4-Herceptin纵坐标显示与标记抗体Mouse Anti-human IgG-APC antibody结合后的展示率只有1％，与受体IL21Rα胞外域无明显结合，与control组结果相似。
图7、构建IL21；16c IL21；16c IL21/4各突变体蛋白表达质粒(结构图)，分别各突变体蛋白编码基因插入PCEP4载体构建表达质粒，并添加His标签。
图8、IL21及各突变体蛋白SDS-PAGE胶电泳结果图。
图9、16c IL21；16c IL21/4突变体蛋白的酶解后的质谱图。
图10、IL21、16c IL21、16c IL21/4三种蛋白熔解温度(Tm)以明确IL21及各突变体蛋白热稳定性，
图11、IL21、16c IL21与16c IL21/4蛋白刺激KOB细胞增殖结果。
图12、融合蛋白St-IL21/4-Herceptin与Herceptin小鼠体内刺激CD8+T细胞增殖效果。
具体实施方式
PCR、DNA酶切产物和质粒的回收纯化制备：
PCR和DNA酶切产物回收采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AXYGEN)试剂盒回收；质粒的小量提取纯化采用全式金(transgen,China)质粒小提试剂盒；质粒中量提取纯化使用Qiagen中提试剂盒；大量提取采用Tiangen无内毒素质粒大提试剂盒，具体操作按照说明书进行。
细胞培养：
CHO/dhFr-(二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞)：使用含10％小牛血清(Hyclone)、100U/mL双抗、0.1mM次黄嘌呤和0.016mM胸腺嘧啶的IMDM培养基，于37℃，5％的CO2培养箱中培养。
293F细胞：人胚肾细胞，用FreeStyleTM 293Expression Medium培养基，于37℃，5％的CO2培养箱，125rpm转速下摇瓶培养。
KOB细胞：高表达IL21受体成人T淋巴瘤细胞，由中科院生物物理研究所王盛典研究员组惠赠，用含10％小牛血清(Hyclone)、100U/mL双抗、RPMI1640培养基，于37℃，5％的CO2培养箱中培养。
细胞转染：
CHO细胞转染：
细胞准备：转染前一天以20万/孔的细胞量将细胞种于六孔板中，使其在转染时达到80％满度，分布均匀，生长良好；
配制转染复合物：将5ul Lipo2000与Opti-MEM无血清培养基150ul均匀混合；2ug目的质粒与Opti-MEM无血清培养基150ul均匀混合；室温放置5分钟后将两者混合配制成转染复合物，轻柔混匀，室温放置25分钟；
吸除六孔板中原有培养基，用Opti-MEM无血清培养基清洗三遍，然后将转染复合物滴加至细胞表面，再加入Opti-MEM无血清培养基500ul，4-6小时后换成普通培养基继续培养。
293F细胞转染(以50ml培养液为例)：
细胞准备：在转染前一天按6-7x105个细胞/ml接种细胞，待转染时细胞密度应在1x106个细胞/ml；
配制转染复合物：取50ug目的质粒用OptiPROTMSFM(Invitrogen)无血清培养基2ml稀释，充分混匀，制成DNA稀释液，取250uL转染试剂PEI加入到DNA稀释液中配制成转染复合物，充分混匀，室温放置15分钟；
将转染复合物加入293F细胞培养液中，37℃，5％的CO2培养箱，125rpm转速下继续摇瓶培养96小时。
蛋白质的表达与纯化
(1)真核细胞表达与纯化：用含有表达目的基因的质粒转染293F细胞后，摇床继续培养96h，200g离心3分钟弃去细胞沉淀，收取上清培养基，然后再次10000g离心15分钟去掉培养基中的杂质,再用0.45um滤膜过滤，然后用30kd浓缩管在3800rmp条件下，4℃离心，体积浓缩20倍。
(2)His标签蛋白的纯化：
使用填有硫酸镍(NiSO4)的Sepharose High Performance(AmershamBioscience)的层析柱；分别配制分别含有5、30、60、90、120、250mM咪唑的缓冲液：缓冲液其他成分为：20mM Tris-HCL、500mM NaCl、10％甘油；
清洗、平衡镍柱：，先用ddH2O50ml清洗镍柱，再用含有5mM咪唑的缓冲液50ml清洗平衡镍柱；
上样：将含有目的蛋白的上清滴加入镍柱中，可上样2-3遍；
洗脱：上完样后，用分别含有5、30、60、90、120、250mM咪唑的缓冲液30ml洗脱，收集洗脱液，根据目的蛋白分子量选用不同规格超滤管，将洗脱液用超滤管浓缩，体积浓缩50-100倍；
蛋白保存：将最后得到的蛋白分装，液氮速冻，-80℃保存。
(3)全长抗体及全长抗体融合蛋白的纯化：
使用Protein A SefinoseTM-5ml(Pre-Packed Gravity Column)层析柱，
预先配制：
binding buffer：0.1M Na3PO4，0.15M NaCl，PH 7.2；
elution buffer：0.1M citric acid,PH 2.7；
neutralizing buffer：1M Tris-HCl PH 9.0；
清洗平衡；先用ddH2O50ml冲洗后用elution buffer 50ml清洗层析柱，再用binding buffer 50ml平衡；
上样：将含有目的蛋白的上清滴加入层析柱中，可上样2-3遍；
洗脱：上完样后，用binding buffer 50ml清洗，以除去非特异性结合；准备10个15ml离心管，每个15ml离心管中加预先配制的neutralizing buffer 800ul；用elutionbuffer 30ml将蛋白洗脱下来，用已加入neutralizing buffer准备好的15ml离心管接洗脱液，每3ml换管；
分段回收：收集洗脱液，用nanodrop测定每管蛋白浓度，0.05mg/ml以下的弃用，根据目的蛋白分子量选用不同规格超滤管，将洗脱液用超滤管浓缩；
蛋白保存：将最后得到的蛋白分装，液氮速冻，—80℃保存。
清洗层析柱并保存：用bingding buffer 50ml清洗层析柱，再用ddH2O 50ml清洗，最后用20％乙醇50ml清洗并封存。
蛋白质熔解温度(Tm)测定
蛋白质熔解温度(Tm)测定原理：蛋白质随周围温度升高，到达熔解温度(Tm)时，蛋白质构象破坏，疏水核心打开，染料可以与疏水区结合发出荧光而被测定。
首先，将待测定蛋白质浓度调整至20-40uM，体积24ul；
染料用
Figure BDA0001876113080000051
orange protein(5000x)，用DMSO稀释至25x；
配制25ul检测体系：取96孔上样板，每孔加待测蛋白质浓度(20-40uM)24ul，再加
Figure BDA0001876113080000061
orange protein(25x)1ul，混匀，常温避光放置；
使用qPCR仪stepone software 2.1程序检测，按说明书操作并设置参数；
检测并保存实验结果；使用Protein Thermal Shift 3.1程序分析结果。
实施例1、建立能够稳定展示嵌合体IL21/4的CHO细胞株
IL21的蛋白构象存在稳定与不稳定两种构象，通过将IL21的蛋白结构中不稳定区域替换为IL4的同源区域构建了一种嵌合体IL21/4，结果显示嵌合体IL21/4的蛋白构象单一稳定，而且生物学活性有提高。并且考虑到构建IL21突变体分别与赫赛汀(Herceptin)融合蛋白是实验重要目的，选择将嵌合体IL21/4与Herceptin融合蛋白展示在CHO工作细胞表面后，通过对Herceptin重链恒定区的检测也有利于检测嵌合体IL21/4的展示效率，因此我们首先将嵌合体IL21/4与Herceptin融合蛋白展示在CHO工作细胞表面。
为了获得高效、稳定展示嵌合体IL21/4的CHO细胞株，我们利用前期本实验室通过结合重组酶介导的盒式替换技术(recombinase-mediated cassette exchange，RMCE)建立的蛋白质展示系统构建(具体可参见CN 201410803422)。
首先构建展示IL21/4与Herceptin融合蛋白的重组替换质粒片段(FRT-IL21/4-Herceptin质粒)，融合蛋白的片段依次为：带有信号肽的Herceptin轻链，IRES(核糖体结合位点)，Herceptin重链信号肽，IL21/4通过采用3(G4S)linker连接在Herceptin重链的N端，跨膜区(TM)连接在Herceptin重链的C端，这样能够将IL21/4与Herceptin融合蛋白通过跨膜区锚定展示在CHO工作细胞表面，融合蛋白的序列结构如图1所示(融合蛋白从左至右依次为：FRT重组位点、Herceptin轻链信号肽、Herceptin轻链、可以与核糖体结合起始翻译的IRES(核糖体结合位点)、Herceptin重链信号肽、IL21/4、linker采用3(G4S)、Herceptin重链、使蛋白分子锚定展示在细胞表面的跨膜区(TM)、LOXp重组位点。
利用实验室已经建立的CHO工作细胞(具体可参见CN 201410803422)，其基因组内已经插入单拷贝的可重组替换区FRT-puromysin-Loxp，用FRT-IL21/4-Herceptin质粒与实验室前期构建的pCI-2A质粒共同转染，可将FRT-IL21/4-Herceptin质粒中FRT、Loxp位点之间的IL21/4与Herceptin融合蛋白序列以单拷贝方式重组替换入CHO工作细胞基因组内，如图2所示。
转染后按时收集细胞，然后用Mouse Anti-human IgG-APC antibody标记，流式检测IL21/4-Herceptin替换后展示率。结果显示(图3)，展示率为0.269％，转染后能够发生重组替换的概率是很低的，因此这些替换成功检测结果有展示的细胞需要被富集后再次检测，为避免假阳性信号，将上图中左上象限p3区阳性信号较强细胞用流式FACSAriaIII分选出来，继续培养、扩增。
富集后再次检测，这次我们采用预先表达纯化的IL21Rα胞外域-linker-GFP-his融合蛋白，γc胞外域-linker-mRFP-his融合蛋白和Mouse Anti-human IgG-APC antibody标记，以同时检测IL21/4-Herceptin融合蛋白中IL21/4与Herceptin结构域的完整性。结果如图4、5所示，如图4所示，横坐标显示IL21/4-Herceptin融合蛋白中IL21/4与IL21受体IL21Rα胞外域结合后展示率(17.2％)；纵坐标显示IL21/4-Herceptin融合蛋白中IL21/4与IL21受体γc胞外域结合后展示率(<0.3％)，根据文献报道，IL21与受体γc结合的亲和力较与受体IL21Rα结合的亲和力低得多，本实验中也多次证实这一点。
如图5所示，横坐标显示IL21/4-Herceptin融合蛋白中IL21/4与IL21受体γc胞外域结合后展示率<0.3％，纵坐标显示融合蛋白中Herceptin重链恒定区与标记抗体MouseAnti-human IgG-APC antibody结合后的展示率2.54％；较富集前展示率0.26％有提高，结合IL21Rα胞外域-linker-GFP融合蛋白标记结果，可以认为融合蛋白中Herceptin重链恒定区与标记抗体Mouse Anti-human IgG-APC antibody亲和力较与IL21Rα胞外域--linker-GFP低。
将上述稳定展示IL21/4-Herceptin融合蛋白的CHO细胞用流式FACSAriaIII分选出来，命名为s0细胞。
上述将嵌合体IL21/4稳定展示在CHO细胞表面的分子生物学实验过程的质粒构建步骤如下：
1、构建pFRT-Herceptin LC-IRES-IL21/4-linker-Herceptin HC-TM-Loxp质粒，将突变体IL21/4稳定展示在CHO细胞表面：
(1)以IL21为模板设计引物，用overlap PCR得到IL21/4片段，
(2)用overlap PCR将IL21/4片段通过linker连接在Herceptin重链HC的N端，再将sp-IL21/4-linker-HerceptinHC片段替换入本实验室已构建的抗体展示质粒pFRT的重链部分，构建pFRT-Herceptin LC-IRES-IL21/4-linker-Herceptin HC-TM-Loxp质粒，该质粒能将突变体IL21/4稳定展示在CHO细胞表面。
2、构建IL21Rα-linker-GFP融合蛋白分泌表达质粒，分泌表达检测IL21功能活性的IL21受体α胞外结构域：
(1)查阅数据库，合成IL21受体IL21Rα链的胞外区，再设计引物以GFP为模板用PCR扩增出GFP片段，
(2)用overlap PCR将IL21Rα链的胞外区通过linker连接在GFP的N端，再将sp-IL21Rα链的胞外区-linker-GFP片段连接入pCEP4，构建IL21Rα-linker-GFP型融合蛋白分泌表达质粒。
3、构建γc-linker-mRFP融合蛋白分泌表达质粒，分泌表达检测IL21功能活性的IL21受体γc胞外结构域：
查阅数据库，合成IL21受体γc链的胞外区；再设计引物以mRFP为模板用PCR扩增出mRFP片段，再次用overlap PCR将γc链的胞外区通过linker连接在mRFP的N端，再将sp-γc链的胞外区-linker-mRFP片段连接入pCEP4，构建γc-linker-mRFP融合蛋白分泌表达质粒。
4、构建IL21突变体及融合蛋白分泌表达质粒
(2)构建IL21不同突变体稳定展示质粒：为将IL21其它突变体稳定展示在CHO细胞表面，我们采用点突变PCR方法构建质粒：以pFRT-Herceptin LC-IRES-IL21/4-linker-Herceptin HC-TM-Loxp质粒为模板，设计引物，构建IL21不同突变体稳定展示质粒。
(3)构建IL21突变体蛋白分泌表达质粒：以多种IL21突变体展示质粒为模板，设计引物，用PCR扩增出IL21突变体片段，再连接入pCEP4，构建IL21突变体蛋白分泌表达质粒。
实施例2、通过蛋白质设计引入不同位点的二硫键进行IL21/4稳定性研究
1、通过蛋白质结构分析和设计，选取IL21/4蛋白上的不同位点进行突变，引入二硫键，获得如下一组突变体。引入的二硫键如下：
(1)第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，引入16-70二硫键；命名为16cIL21/4；
(2)第17位ILE、第106位SER，都突变为CYS，引入17-106二硫键；命名为17cIL21/4；
(2)将第16位ILE、第70位SER、第17位VAL、第106位LYS，都突变为CYS，引入两组二硫键；命名为4cIL21/4。
2、获得能稳定展示IL21/4各突变体的CHO细胞
为了获得能稳定展示IL21/4各突变体的CHO细胞系，首先，以FRT-IL21/4-Herceptin为模板，利用点突变技术获得IL21/4各突变体的重组替换展示质粒，命名为：16cIL21/4-Herceptin；17cIL21/4-Herceptin；4cIL21/4-Herceptin；再次与预先已构建的pci-2A质粒共同转染CHO工作细胞，重组替换成功后富集，以标记抗体Mouse Anti-humanIgG-APC antibody结合检测展示率：
如图6所示，横坐标显示不同突变体IL21/4-Herceptin融合蛋白与IL21受体IL21Rα胞外域结合后展示率；纵坐标显示融合蛋白中Herceptin重链恒定区与标记抗体MouseAnti-human IgG-APC antibody结合后的展示率；可以看到，16c IL21/4-Herceptin；4cIL21/4-Herceptin的展示率都较富集前明显提高，且与受体IL21Rα胞外域结合良好；而对照组17c IL21/4-Herceptin纵坐标显示与标记抗体Mouse Anti-human IgG-APC antibody结合后的展示率只有1％，与受体IL21Rα胞外域无明显结合，说明对照组17c IL21/4-Herceptin这种突变体并无展示。
我们已经获得在CHO工作细胞膜表面稳定展示两种IL21/4突变体的细胞，接下来要对这两种IL21/4突变体做稳定性初步检测。
实施例3、IL21/4各突变体稳定性初步检测
为了检测IL21/4各突变体稳定性，将展示IL21/4-Herceptin的CHO工作细胞与展示突变体16cIL21/4-Herceptin、4c IL21/4-Herceptin的CHO工作细胞做实验组，在4-50℃不同温度梯度下加热，再用IL21受体IL21Rα胞外域-linker-GFP-his结合标记后，流式检测各组在不同温度梯度时与受体结合后展示率，由于随着温度变化，热稳定性差的蛋白会先发生变性，正常构象破坏，丧失与受体结合能力，可以检测各突变体的热稳定性。
具体实验方法如下：
(1)将在细胞膜表面稳定展示IL21突变体的CHO细胞用0.02％EDTA-PBS消化后，用带有血清的培养基洗脱，830g离心，3min，弃去上清，收集细胞；
(2)将细胞用4℃预冷的Opti-MEM无血清培养基1ml重悬，830g离心,3min,弃去上清，收集细胞，再用4℃预冷的Opti-MEM无血清培养基重悬，约5x106细胞/50ul；
(3)细胞悬液加入PCR管，用PCR仪设温度梯度加热，至预设温度时加热0.5h，然后4℃，15min，取出PCR管；
(4)按一定稀释比例加入相应的IL21受体胞外域与荧光蛋白融合蛋白混匀，4℃摇床，避光放置1h；
(5)830g离心3min，弃去上清，加新的4℃预冷的Opti-MEM洗涤二遍，分别离心，弃去上清，然后用4℃预冷的Opti-MEM 200ul重悬，标记后的细胞用FACSAriaIII(BD)或FACSCalibur进行检测或分选。
结果显示，
(1)4℃时，除阴性对照组外，各组与IL21受体IL21Rα胞外域均有结合，突变体16cIL21/4-Herceptin展示率为20％，结合率最高；
(2)经过49℃加热后，IL21/4-Herceptin组，4c IL21/4-Herceptin组与IL21受体IL21Rα胞外域结合均基本丧失，突变体16c IL21/4-Herceptin组还能检测到与IL21受体IL21Rα胞外域的结合，初步认为突变体16c IL21/4热稳定性有所提高。
实施例4、构建野生型IL21的突变体并初步检测稳定性
1、流式检测突变体的热稳定性
为了研究在野生型IL21分子中引入同样位置(16、70位)的二硫键对稳定性的影响，我们构建了另外二种结构：
IL21-Herceptin：野生型IL21与Herceptin的融合蛋白；
16c IL21-Herceptin：在同样位置，第16位ILE——第70位SER，将其都突变为CYS，引入二硫键的IL21，与Herceptin构建的融合蛋白；
同样通过转染，重组替换，将其展示在CHO工作细胞膜表面，与16c IL21/4-Herceptin及IL21/4-Herceptin比较，在4-55℃不同温度梯度下加热，再用IL21受体IL21Rα胞外域--linker-GFP-his，及标记抗体Mouse Anti-human IgG-APC antibody结合结合标记后，流式检测各组在不同温度梯度时与受体结合后展示率。
结果显示，引入16-70二硫键的16c IL21/4-Herceptin和16c IL21-Herceptin在加热至48℃后，与受体结合仍有部分展示率，说明稳定性较IL21/4-Herceptin和IL21-Herceptin有提高。这四种蛋白是融合蛋白，流式检测只是初筛，需要将每种IL21及突变体蛋白表达，纯化后进一步鉴定热稳定性。
2、表达IL21及各突变体蛋白并检测二硫键结构
为了获得IL21及各突变体蛋白，首先构建质粒，将IL21及各突变体编码基因分别插入PCEP4载体质粒，并添加His标签，构建了三种分别表达IL21；16c IL21；16c IL21/4各突变体蛋白的质粒(如图7)：
将IL21、16c IL21、16c IL21/4三种蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图8所示，根据结果，IL21、16c IL21、16c IL21/4三种蛋白跑胶条带位置与理论相符，从分子量的层面估计，这三种蛋白是目的蛋白。
为确认16c IL21/4蛋白中引入的目的二硫键是否形成，进一步行质谱检测，将16cIL21/4蛋白送质谱鉴定，跑胶时注意保护二硫键。样品蛋白首先用蛋白酶进行酶解，会切成不同大小肽段。蛋白质中的二硫键会影响酶解，在二硫键打开与否的条件下，样品蛋白会切成不同大小的肽段，会有不同的肽段质核比分布，根据是否与理论预测相符可判断样品蛋白是否存在预测二硫键。
本样品16c IL21/4二硫键分析：
理论上会产生二硫键的两个片段的氨基酸序列IINVCIK和QLIDCVDQLK。当在还原状态下酶解时，二硫键被打开，C上面会被烷基化(分子量增加57Da)，两个肽段质核比理论值分别为859.507和1231.635。从图9A中可以看出，在还原状态(加DTT)下，859.587和1231.769有比较明显的信号峰，在非还原状态下，这两个峰信号非常低。说明16cIL21/4样品蛋白加DTT时二硫键被打开，可以切出两个肽段；不加DTT时二硫键未打开，则无这两个肽段信号，这与理论预测的二硫键结构相符。
如果在非还原状态下酶解，这两个肽段之间的二硫键没有被打开，我们应该能检测到一个质核比为两个肽段质核比加和的肽段。在非还原状态下，加和肽段理论质核比为(859.587-57)+(1231.769-57)－2－1＝1974.356。在图9B中，我们可以看到在非还原状态下，有明显的质核比1974.230的峰，且该峰在还原状态下信号很差。说明当样品蛋白不加DTT二硫键未打开时，酶解产物会有一较大肽段信号；加DTT时二硫键被打开，较大肽段被切开，则此信号不存在。
上述结果在16c IL21蛋白的酶解过程中也同样观察到，表明16位C和70位C形成了正确的二硫键。
3、测定IL21及各突变体蛋白熔解温度(Tm)
确认16c IL21/4蛋白中16-70位cys间二硫键的形成后，我们测定了IL21、16cIL21、16c IL21/4三种蛋白熔解温度(Tm)以明确IL21及各突变体蛋白热稳定性，结果如图10所示：
根据结果，IL21、16c IL21、16c IL21/4三种蛋白Tm值比较：16c IL21(65.62℃)>16cIL21/4(56.52℃)>IL21(48.54℃)。
说明引入二硫键的两种突变体16cIL21、16cIL21/4蛋白较野生型IL21蛋白热稳定性均明显提高；可认为引入的二硫键是导致热稳定性提高的原因。
实施例5、测定IL21各突变体生物学活性
1、刺激KOB细胞增殖能力
为了检测IL21、16c IL21、16c IL21/4三种蛋白在热稳定性提高的同时生物学活性是否保留。KOB细胞表达IL21受体，可被IL21刺激而增殖。可通过刺激KOB细胞增殖能力来测定IL21各突变体生物学活性，具体方法如下：
(1)准备KOB细胞：用含10％小牛血清(Hyclone)、100U/mL双抗、RPMI1640培养基，于37℃，5％的CO2培养箱中培养；
(2)准备IL21及突变体蛋白：构建IL21及突变体蛋白(带His标签)表达质粒，转染293F细胞，常规培养、表达，镍柱纯化；BCA法测定浓度；
(3)生物学活性测定：用96孔板，KOB细胞以2x104/每孔接种，200ul培养基，每孔中分别加入IL21或突变体蛋白，设置梯度浓度为0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，37℃，5％的CO2培养箱中继续培养，96h后细胞计数统计。
结果如图11所示：
利用无重复双因素方差分析结果，ctr组与各蛋白组间p<0.05，说明组间存在显著差异；三种蛋白组间p>0.05，说明三种蛋白组间无显著差异；三种蛋白不同浓度组间比较p>0.05，说明三种蛋白不同浓度组间无显著差异；
由本次结果可知，三种蛋白都有刺激KOB细胞增殖的作用，且生物学活性统计学结果无显著差异，在加入蛋白梯度浓度为0.04ug/ml，0.2ug/ml，1ug/ml组间亦无显著差异。
可知，两种突变体16cIL21、16cIL21/4蛋白是具有热稳定性提高并保留生物学活性的蛋白。
2、IL21及各突变体与Herceptin融合蛋白小鼠体内血浆半衰期测试结果
为了明确IL21稳定性提高是否能够延长动物体内血浆半衰期，我们选择IL21-Herceptin以及突变的16c IL21-Herceptin融合蛋白、16c IL21/4-Herceptin融合蛋白进行对比检测，同时加Herceptin组做对照，检测小鼠体内血浆半衰期，结果如下表4所示：
表4：不同类型的IL21/融合蛋白的半衰期检测
Figure BDA0001876113080000101
由结果可知，16c IL21-Herceptin、16c IL21/4-Herceptin融合蛋白中包含的高稳定性IL21突变体使小鼠体内血浆半衰期较野生型IL21有了明显延长，以融合蛋白16cIL21/4-Herceptin最好，说明IL21稳定性的提高是其血浆半衰期延长的重要原因。
2、IL21融合蛋白刺激T细胞增殖功能测定
采用BT474乳腺癌荷瘤小鼠模型检测16c-IL21/4-Herceptin融合蛋白的功能活性，小鼠右侧腹背部接种1.5x107人BT474乳腺癌细胞，35天后给药，对16c-IL21/4-Herceptin融合蛋白与Herceptin刺激CD8+T细胞在小鼠体内增殖情况做了检测，结果见附图12所示。可见St-IL21/4-Herceptin融合蛋白在肿瘤接种后约53天开始明显出现CD8+T细胞在外周血中比例明显升高；同时Herceptin组反而出现T细胞缓慢下降的趋势。
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用做对本发明保护范围的限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 海珂分子（北京）科技有限责任公司
<120> 白介素21蛋白（IL21）突变体及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Asn Leu Trp Gly
65 70 75 80
Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys
85 90 95
Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met
100 105 110
Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Cys
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Cys Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Cys
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Cys Ile Lys Lys Leu Lys Arg Asn Leu Trp Gly
65 70 75 80
Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys
85 90 95
Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met
100 105 110
Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Cys
1 5 10 15
Cys Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Cys Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Cys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 6
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Cys
1 5 10 15
Cys Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Cys Ile Lys Lys Leu Lys Arg Asn Leu Trp Gly
65 70 75 80
Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys
85 90 95
Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Cys Ser Leu Leu Gln Lys Met
100 105 110
Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
115 120 125

Claims (7)

1.一种白介素21(IL21)突变体，所述的突变体为：
(1)将野生型IL21的氨基酸序列的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键，所述的野生型IL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
或(2)将野生型IL21的氨基酸序列的第16位ILE、第17位VAL、第70位SER、第112位LYS的都突变为CYS，并且形成16-70、17-112两组二硫键；
所述的野生型IL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种白介素21和白介素4嵌合体蛋白(IL21/4)的突变体，所述的突变体为：
(1)将白介素21和白介素4嵌合体(IL21/4)的氨基酸序列的第16位ILE、第70位SER，都突变为CYS，并在两个突变的CYS之间形成二硫键；
或(2)将白介素21和白介素4嵌合体(IL21/4)的氨基酸序列的第16位ILE、第17位VAL、第70位SER、第106位LYS的都突变为CYS，并且形成16-70、17-106两组二硫键；
所述的白介素21和白介素4嵌合体蛋白(IL21/4)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.编码权利要求1所述的IL21突变体或权利要求2所述的IL21/4突变体的核苷酸序列。
4.包含权利要求1所述的IL21突变体或权利要求2所述的IL21/4突变体的融合蛋白，所述的融合蛋白包括：
(1)功能片段1：IL21突变体或IL21/4突变体；
(2)功能片段2：单克隆抗体功能；
及连接不同功能片段的连接结构域。
5.权利要求1所述的IL21突变体、权利要求2所述的IL21/4突变体或权利要求4所述的融合蛋白在制备药物中的应用，所述的药物是调节或激活免疫的药物或抗肿瘤药物。
6.权利要求1所述的IL21突变体、权利要求2所述的IL21/4突变体或权利要求4所述的融合蛋白在制备促进B细胞分化增殖，促进T细胞分化增殖，促进NK细胞分化增殖的制剂中的应用。
7.以权利要求1所述的IL21突变体、权利要求2所述的IL21/4突变体或权利要求4所述的融合蛋白为活性成分的药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括治疗有效量的所述IL21突变体、所述IL21/4突变体或所述融合蛋白，以及必要的药用辅料。
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