CN108686202A - 肿瘤免疫疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及瘤内施用特定细胞因子组合来治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的肿瘤免疫疗法以及相应的药物组合物。

Description

肿瘤免疫疗法
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及瘤内施用特定细胞因子组合来治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的肿瘤免疫疗法以及相应的药物组合物。
背景技术
肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，带来了巨大的社会及经济问题。传统的治疗方法包括放疗、化疗、手术治疗、靶向药物治疗等。近年来，免疫治疗作为一种新疗法，在肿瘤治疗中显示出了巨大的潜力。
现阶段最主要的肿瘤免疫治疗方法包括嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)和免疫检查点疗法(Checkpoint)。前者通过改造T细胞，使其能够更加准确，有效的识别并杀死体内肿瘤细胞。而免疫检查点则是通过抗体结合来阻断肿瘤环境中抑制T细胞功能的信号通路，从而使得T细胞重新活化并杀伤肿瘤细胞。
一种广为接受的理论认为，突变的体细胞处于免疫系统的监视之下，要形成肿瘤，突变细胞需要经过免疫清除，免疫平衡和免疫逃逸这三个阶段。免疫系统与肿瘤之间一直是一个相互缠斗的状态，在肿瘤局部通常有大量的免疫细胞浸润。CAR-T和免疫检查点疗法的出现说明即便对于已经成形的肿瘤，在有外力协助下，免疫系统仍然有足够的能力清除肿瘤。然而，这两种疗法还远未达到理想的效果。CAR-T在实体瘤中效果不佳，其原因在于实体瘤是一个致密的，有很强的免疫抑制的环境，CAR-T细胞难于大量的进入肿瘤内部，同时即便进入以后，也可能在肿瘤微环境中被抑制功能。免疫检查点疗法的应答率不高，通常只有20-30%左右，说明仅仅释放T细胞，使其重新活化，可能在大部分情况下并不足以消灭已经成形的肿瘤。
肿瘤细胞通过分泌各种蛋白或者直接接触作用，在肿瘤内部建立起免疫抑制的微环境。多种免疫细胞，包括巨噬细胞、调节性T细胞(Treg)、骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)等都参与了这一作用。破解肿瘤免疫抑制微环境，是肿瘤免疫疗法能否成功的关键。让肿瘤部位的免疫功能恢复正常，才能将肿瘤重新纳入免疫系统的控制之下。在这一点上，CAR-T疗法和免疫检查点疗法都还做得不够。
细胞因子(Cytokine)是体内非常重要的免疫信号。各种细胞分泌不同的细胞因子，各种细胞因子又可以作用于不同的细胞，形成了一个复杂的交叉网络，其中既有促进免疫细胞活化的细胞因子，也有抑制免疫细胞功能的细胞因子。更复杂的是，同一细胞因子在不同的环境下可能作用于不同的细胞，从而发挥完全相反的功能。例如肿瘤坏死因子(TNFα)，既有可能抑制肿瘤生长，也有可能发挥促肿瘤作用。一些细胞因子包括白细胞介素2、干扰素α、肿瘤坏死因子α等，已经在临床中应用多年。细胞因子涵盖了大量的各种蛋白，到现在为止，已经使用的细胞因子或者其组合中，均没有在抗肿瘤中表现出令人完全满意的效果。
本领域仍然需要新的有效的肿瘤免疫治疗方法和药物组合物。
发明内容
本发明提供了基于特定细胞因子组合的高效肿瘤免疫治疗方法和药物组合物。
在第一方面，本发明提供了一种细胞因子组合，其包含至少3种、优选3种细胞因子，所述细胞因子选自：白细胞介素12（IL12）或其功能性变体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）或其功能性变体、Fms相关酪氨酸激酶3配体（FTL3L）或其功能性变体、白细胞介素2（IL2）或其功能性变体、白细胞介素15（IL15）或其功能性变体、和白细胞介素21（IL21）或其功能性变体。在一些实施方案中，所述细胞因子组合包含以下中任一项：
i) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL2或其功能性变体；
ii) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL15或其功能性变体；
iii) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL21或其功能性变体；
iv) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL2或其功能性变体；
v) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL15或其功能性变体；或
vi) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL21或其功能性变体。
在一些实施方案中，其中所述细胞因子是哺乳动物细胞因子例如鼠细胞因子或人细胞因子，优选人细胞因子。
在第二方面，本发明提供一种细胞或细胞混合物，其表达本发明的细胞因子组合。
在第三方面，本发明提供一种用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的药物组合物，其包含有效量的本发明的细胞因子组合、本发明的细胞或细胞混合物，以及药学可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为适于局部施用，优选瘤内施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为用于缓释施用，例如被配制于海藻酸钙凝胶、聚乳酸(PLA)微球或壳聚糖季铵盐溶液中。
在第四方面，本发明提供一种用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的方法，其中包括给所述对象施用有效量的本发明的细胞因子组合、本发明的细胞或细胞混合物、或本发明的药物组合物。在一些实施方案中，所述施用是局部施用，优选瘤内施用。
在第五方面，本发明提供本发明的细胞因子组合、本发明的细胞或细胞混合物、或本发明的药物组合物在制备用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的药物中的用途。
本发明上述各方面中，所述肿瘤是实体瘤，例如选自以下的实体瘤：肺癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、脑及中枢神经系统癌、胰腺癌、口腔癌、鼻咽癌、头颈癌、喉癌、骨癌、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌和淋巴瘤。所述对象是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫，优选是人。
附图说明
图1 mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠黑色素瘤(B16F10)的治疗效果。
图2 mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠结肠癌(CT26)的治疗效果。
图3 mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图4 mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠淋巴瘤(EL4)的治疗效果。
图5 不同比例mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图6 mIL12+mGMCSF+mIL2海藻酸钙凝胶对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图7 mIL12+mGMCSF+mIL2聚乳酸微球对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图8 表达mIL12+mGMCSF+mIL2的细胞对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图9 mIL12+mGMCSF+mIL15壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图10 mIL12+mGMCSF+mIL21壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图11 mIL12+mFLT3L+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图12 mIL12+mFLT3L+mIL15壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图13 mIL12+mFLT3L+mIL21壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图14 hIL12+hGMCSF+hIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图15 hIL12+hGMCSF+hIL15壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图16 hIL12+hGMCSF+hIL21壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图17 hIL12+hFLT3L+hIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图18 hIL12+hFLT3L+hIL15壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图19 hIL12+hFLT3L+hIL21壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌(4T1)的治疗效果。
图20小鼠乳腺癌(4T1)未治疗时肿瘤生长情况
图21 治愈小鼠对再次接种肿瘤的抵御效果。2/2表示注射2只，有2只长出肿瘤；0/5表示注射5只，有0只长出肿瘤。
mIL12，mGMCSF，mFLT3L，mIL2，mIL15，mIL21分别表示小鼠IL12，小鼠GMCSF，小鼠FLT3L，小鼠IL2，小鼠IL15，小鼠IL21；hIL12，hGMCSF，hFLT3L，hIL2，hIL15，hIL21分别表示人IL12，人GMCSF，人FLT3L，人IL2，人IL15，人IL21。
具体实施方式
本发明人令人惊奇地发现，同时将选自IL12、GMCSF、FLT3L、IL2、IL15和IL21的至少3种细胞因子的组合局部施用至肿瘤内部，能够在肿瘤内局部活化免疫系统，打破肿瘤免疫抑制微环境，激发针对肿瘤的免疫应答，从而有效清除肿瘤。
通过施用本发明的细胞因子组合，可以在对象体内激发抗肿瘤免疫反应，对象体内被活化的免疫系统能够识别并消灭肿瘤细胞，并且在清除肿瘤以后，获得性免疫反应能够产生全身性的免疫记忆。一方面，活化的特异性的针对肿瘤的免疫细胞能够通过血液及淋巴系统在全身循环，从而对其他部位的病灶也起到抑制乃至清除的效果；另一方面，免疫记忆的存在使得机体内再出现具有相似抗原的肿瘤细胞时，免疫系统能够迅速的识别并杀灭这些细胞，从而避免肿瘤的复发。此外，本发明的细胞因子作用于免疫系统，因此不存在类似于肿瘤靶向药物的耐药机制，可反复使用。例如，本发明实施例显示通过施用本发明的细胞因子组合成功清除肿瘤的小鼠，在一定时间后再次接种同种肿瘤细胞，无法再形成肿瘤。
因此，在第一方面，本发明提供一种用于治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的细胞因子组合，其包含至少3种细胞因子，所述细胞因子选自：IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体、IL2或其功能性变体、IL15或其功能性变体、和IL21或其功能性变体。
不受任何理论限制，由于不同细胞因子有不同的作用机制，本发明中使用了多种细胞因子的组合，因而可以同时活化天然免疫和获得性免疫，实现有效的肿瘤治疗。使用3种细胞因子的组合，能够同时活化所需的免疫系统组分，达到最佳的激发抗肿瘤免疫效果。如果采用更少细胞因子的组合，例如仅仅包含2种细胞因子的组合，将缺少对某些组分的激活能力，无法达到最佳效果。如果采用更多种细胞因子的组合，例如4种或4种以上的细胞因子的组合，一方面可能带来更大的副作用，另一方面由于细胞因子在体内复杂的作用机理，可能会造成对免疫系统紊乱，反而无法达到预期的免疫激活作用。因此，在一些优选实施方式中，本发明的细胞因子组合包含3种细胞因子。
在一些具体实施方式中，本发明的细胞因子组合包含以下中任一项：
i) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL2或其功能性变体；
ii) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL15或其功能性变体；
iii) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL21或其功能性变体；
iv) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL2或其功能性变体；
v) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL15或其功能性变体；或
vi) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL21或其功能性变体。
在一些实施方式中，所述细胞因子是哺乳动物细胞因子，例如鼠细胞因子或人细胞因子，优选人细胞因子。
在一些具体实施方式中，鼠细胞因子IL12 (mIL12)包含p35和p40两个亚基，p35亚基包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，p40亚基包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，鼠细胞因子GMCSF (mGMCSF)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，鼠细胞因子FLT3L (mFLT3L)包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，鼠细胞因子IL2 (mIL2)包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，鼠细胞因子IL15 (mIL15)包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，鼠细胞因子IL21 (mIL21)包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，人细胞因子IL12 (hIL12)包含p35和p40两个亚基，p35亚基包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，p40亚基包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，人细胞因子GMCSF (hGMCSF)包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，人细胞因子IL2 (hIL2)包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，人细胞因子IL2 (hIL2)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，人细胞因子IL15 (hIL15)包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，人细胞因子IL21 (hIL21)包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
如本文所用，细胞因子的“功能性变体”指的是这样的变体，其与所述细胞因子在氨基酸序列上存在一定差异，但是保留所述细胞因子至少部分或全部的生物学活性。功能性变体可以是天然变体(如等位基因变体)或可以是经人工修饰的变体。
例如，鼠细胞因子IL12 p35亚基的功能性变体包含与SEQ ID NO:1具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:1相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留鼠细胞因子IL12p35亚基至少部分或全部的生物学活性。鼠细胞因子IL12 p40亚基的功能性变体包含与SEQID NO:2具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:2相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留鼠细胞因子IL12 p40亚基至少部分或全部的生物学活性。鼠细胞因子GMCSF的功能性变体包含与SEQ ID NO:3具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:3相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留鼠细胞因子GMCSF至少部分或全部的生物学活性。鼠细胞因子FLT3L的功能性变体包含与SEQ ID NO:4具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:4相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留鼠细胞因子FLT3L至少部分或全部的生物学活性。鼠细胞因子IL2的功能性变体包含与SEQ ID NO:5具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:5相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留鼠细胞因子IL2至少部分或全部的生物学活性。鼠细胞因子IL15的功能性变体包含与SEQ ID NO:6具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:6相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留鼠细胞因子IL15至少部分或全部的生物学活性。鼠细胞因子IL21的功能性变体包含与SEQ ID NO:7具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:7相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留鼠细胞因子IL21至少部分或全部的生物学活性。
例如，人细胞因子IL12 p35亚基的功能性变体包含与SEQ ID NO:8具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:8相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留人细胞因子IL12p35亚基至少部分或全部的生物学活性。人细胞因子IL12 p40亚基的功能性变体包含与SEQID NO:9具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:9相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留人细胞因子IL12 p40亚基至少部分或全部的生物学活性。人细胞因子GMCSF的功能性变体包含与SEQ ID NO:10具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:10相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留人细胞因子GMCSF至少部分或全部的生物学活性。人细胞因子FLT3L的功能性变体包含与SEQ ID NO:11具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:11相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留人细胞因子FLT3L至少部分或全部的生物学活性。人细胞因子IL2的功能性变体包含与SEQ ID NO:12具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:12相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留人细胞因子IL2至少部分或全部的生物学活性。人细胞因子IL15的功能性变体包含与SEQ ID NO:13具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:13相比具有1或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留人细胞因子IL15至少部分或全部的生物学活性。人细胞因子IL21的功能性变体包含与SEQ ID NO:14具有至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%或至少大约99%序列相同性的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:14相比具有1或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，且保留人细胞因子IL21至少部分或全部的生物学活性。
序列“相同性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology, Lesk,A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G.,eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov,M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988))。
在肽或蛋白中，合适的保守型氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.,Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224)。
本发明的细胞因子或其功能性变体可以是分离自其天然来源，重组表达的或化学合成的。
本发明的细胞因子组合中，细胞因子之间的比例可以是任意的比例，条件是所述细胞因子各自达到治疗有效量。例如，所述细胞因子组合中三种不同细胞因子的比例可以是x:y:z，其中x、y和z独立地是选自1-5的整数。例如，所述比例可以是5:1:1、1:5:1、1:1:5、4:1:1、1:4:1、1:1:4、3:1:1、1:3:1、1:1:3、2:1:1、1:2:1、1:1:2或1:1:1。优选地，所述细胞因子组合中三种不同细胞因子的比例是1:1:1。
本发明的细胞因子组合中的细胞因子可以同时施用或在合适的时间间隔内分开施用。优选地，所述细胞因子同时施用。
细胞因子由于具有很强的活化免疫系统进而对抗肿瘤的能力，包括白细胞介素2、干扰素α、肿瘤坏死因子α等，已经在临床中应用多年。但正是由于其功能强大，少量的全身使用，便会带来比较严重的副作用，使其在肿瘤局部难以达到足够的作用浓度。在本发明中，通过在肿瘤部位直接施用细胞因子，可以获得在肿瘤内局部富集的效果，也避免了全身性的副作用。例如，如本发明实施例所示，瘤内注射本发明的细胞因子组合后的小鼠并未有特殊的异常反应，说明此细胞因子组合的使用，不会带来严重的副作用。因此，在本发明优选的实施方案中，所述细胞因子组合被配制为适于局部施用，优选瘤内施用。
然而，仅仅以水或生理盐水为载体注射到肿瘤部位，细胞因子不能长时间的停留，会快速的被循环系统带走，严重影响其发挥作用。在本发明中，可以通过缓释技术将细胞因子较长时间的富集在施用部位，从而获得较长的作用时间。例如，可以将细胞因子制备成聚乳酸(PLA)微球，制备于海藻酸钙凝胶中，或者通过添加壳聚糖季铵盐来增加细胞因子溶液粘度，可以将细胞因子较长时间地保留在注射位置。本领域已知许多的缓释技术，且选择适合于本发明的缓释技术属于本领域技术人员的能力范围内。
本发明的细胞因子组合可以通过任何合适的手段施用至肿瘤内。例如所述细胞因子组合可以直接注射至肿瘤部位。或者，可以通过与靶向肿瘤的物质(如抗体)偶联而使得静脉施用的细胞因子能够在肿瘤部位富集。
本发明还考虑向肿瘤部位施用表达本发明的细胞因子组合的细胞或细胞混合物。细胞在肿瘤部位持续表达本发明的细胞因子，可以使得肿瘤内较长时间的维持一定的细胞因子浓度，发挥抗肿瘤作用。
因此，在第二方面，本发明还提供细胞或细胞混合物，其表达本发明的细胞因子组合。在所述组合包含3种细胞因子的情况下，所述细胞可以表达全部3种细胞因子；或者，所述细胞混合物可以包含两种细胞，其中一种细胞表达一种细胞因子，另外一种细胞表达其它两种细胞因子；或者，所述细胞混合物可以包含3种细胞，其各自表达不同的细胞因子。
在一些实施方案中，所述细胞可以用包含编码本发明的细胞因子的核苷酸序列的表达构建体转化。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒或病毒载体(如痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等)。
在所述表达构建体中，编码本发明的细胞因子的核苷酸序列与表达调控序列可操作地连接。如本文所用，“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA 加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
可以通过本领域已知的任何合适手段将表达构建体导入细胞，包括但不限于磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染。
适于本发明的细胞优选是哺乳动物细胞，优选人细胞。例如，所述细胞可以分离自待治疗的对象，然后用本发明的表达构建体转化。所述细胞也可以是培养的细胞系，例如293细胞。
在第三方面，本发明提供一种用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的药物组合物，其包含有效量的本发明的细胞因子组合、本发明的细胞或细胞混合物，以及药学可接受的载体。
如本文所用，“对象”涵盖哺乳动物，如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫等。在优选的实施方案中，所述对象是人。
“有效量”的本发明的细胞因子或细胞因子组合优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的细胞因子或细胞因子组合优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10%，优选至少约20%，更优选至少约30%，更优选至少约40%，更优选至少约50%，更优选至少约60%，更优选至少约70%，更优选至少约80%。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。有效量的本发明的细胞因子或细胞因子组合能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状如预防和/或治疗转移或复发。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。
在具体的实施方案中，细胞因子的给药剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.005至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.01mg/kg体重、0.05mg/kg体重、0.1mg/kg体重、0.5mg/kg体重、1mg/kg体重或5mg/kg体重，或在0.01-20mg/kg范围内。示例性的给药方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。具体给药方案根据对象的疾病进展情况确定，例如小鼠肿瘤大小达到一定尺寸即可给药。
本文使用的“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、抗氧化剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物可以被配制为适于局部施用，优选被配置为瘤内施用。优选地，本发明的药物组合物被配制为用于缓释使用，例如被配制于海藻酸钙凝胶、聚乳酸(PLA)微球或壳聚糖季铵盐溶液中。
在第四方面，本发明提供一种用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的方法，其中包括给所述对象施用有效量的本发明的细胞因子组合、本发明的细胞或细胞混合物、或本发明的药物组合物。所述施用可以是局部施用，优选瘤内施用。所述施用可以是单次施用，也可以是多次施用。
在第五方面，本发明提供本发明的细胞因子组合、本发明的细胞或细胞混合物、或本发明的药物组合物在制备用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的药物中的用途。
本发明的细胞因子组合抗肿瘤作用的机制在于激活体内抗肿瘤免疫应答，因此可以作用于各种肿瘤。例如，本发明中所述肿瘤可以是实体瘤，包括但不限于肺癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、脑及中枢神经系统癌、胰腺癌、口腔癌、鼻咽癌、头颈癌、喉癌、骨癌、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、淋巴瘤等。
实施例
以下将结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
试剂：DMEM培养基，1640培养基，胎牛血清购自Life Technologies公司；细胞培养瓶，培养板购自Corning公司；Puromycin购自Life Technologies公司；限制性内切酶购自Takara和NEB公司；T4 DNA连接酶购自NEB公司；DNA聚合酶购自Takara公司；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒购自Omega Biotech公司；引物合成，基因合成和测序由LifeTechnologies公司完成。细胞因子mIL12，mGMCSF，mFLT3L，mIL2，mIL15，mIL21，hIL12，hGMCSF，hFLT3L，hIL2，hIL15，hIL21购于Peprotech公司。mIL12，mGMCSF，mFLT3L，mIL2，mIL15，mIL21分别表示小鼠IL12，小鼠GMCSF，小鼠FLT3L，小鼠IL2，小鼠IL15，小鼠IL21；hIL12，hGMCSF，hFLT3L，hIL2，hIL15，hIL21分别表示人IL12，人GMCSF，人FLT3L，人IL2，人IL15，人IL21。海藻酸钠、氯化钙、BSA、石油醚(petroleum ether)、二氯甲烷(methylenechloride)、聚乳酸(分子量20000)、聚乳酸(分子量5000)购于Sigma-Aldrich公司；壳聚糖季铵盐购于浙江金壳药业；6-8周龄雌性C57BL/6和Balb/c小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司。
实施例1. mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠黑色素瘤的治疗效果
消化培养的小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)，将2×105的细胞注射到C57BL/6小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子mIL12、mGMCSF和mIL2，使其终浓度均为20ng/µl，每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mGMCSF+ mIL2的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图1。经过注射的小鼠，100%均获得肿瘤消退。但是有60%的小鼠在肿瘤消退后一至两周左右，在原肿瘤部位会复发，对于复发的肿瘤，待其长到6-8mm时，用同样的方法再次注射mIL12+mGMCSF+mIL2的壳聚糖季铵盐溶液，100%的肿瘤均完全消退。
实施例2. mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠结肠癌的治疗效果
消化培养的小鼠结肠癌细胞(CT26)，将5×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子mIL12、mGMCSF和mIL2，使其终浓度均为20ng/µl，每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mGMCSF+ mIL2的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图2。经过注射的小鼠，100%均获得肿瘤完全消退。
实施例3. mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子mIL12、mGMCSF和mIL2，使其终浓度均为20ng/µl，每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+ mGMCSF + mIL2的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图3。经过注射的小鼠，100%均获得肿瘤完全消退。
实施例. 4 mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠淋巴瘤的治疗效果
消化培养的小鼠淋巴瘤细胞(EL4)，将2×106的细胞注射到C57BL/6小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子mIL12，mGMCSF和mIL2，使其终浓度均为20ng/µl，每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mGMCSF+mIL2的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图4。经过注射的小鼠，100%均获得肿瘤完全消退。
实施例5. 不同比例mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子mIL12、mGMCSF和mIL2，每种细胞因子配制20ng/µl和100ng/µl的溶液，取15µl 100ng/µl的mIL12和15µl 20ng/µl的mGMCSF和15µl 20ng/µl的mIL2进行混合，获得45µl mIL12+mGMCSF+mIL2 (5:1:1)的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。取15µl 20ng/µl的mIL12和15µl 100ng/µl的mGMCSF和15µl 20ng/µl的mIL2进行混合，获得45µl mIL12+mGMCSF+mIL2 (1:5:1)的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。取15µl20ng/µl的mIL12和15µl 20ng/µl的mGMCSF和15µl 100ng/µl的mIL2进行混合，获得45µlmIL12+mGMCSF+mIL2 (1:1:5)的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图5。经过注射的小鼠，100%均获得肿瘤完全消退，说明采用不同的细胞因子比例也能达到足够的抗肿瘤效果。
实施例6. mIL12+mGMCSF+mIL2海藻酸钙凝胶对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解购买的细胞因子mIL12，mGMCSF和mIL2，使其终浓度均为20ng/µl，每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mGMCSF+mIL2的混合液，然后加入1.5µl 2M氯化钙溶液，混匀，最后再加入45µl 1%海藻酸钠溶液，用枪头吹打混匀，形成凝胶。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子海藻酸钙凝胶，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图6。经过注射的小鼠，100%均获得肿瘤完全消退。
实施例7. mIL12+mGMCSF+mIL2聚乳酸微球对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
取2mg 聚乳酸(分子量20000和分子量5000的比例1:1)，0.02mg BSA和5µg细胞因子(mIL12或mGMCSF或mIL2)，加入到二氯甲烷中，混匀，然后快速倾倒到石油醚中，待其形成微球，然后将溶液抽滤，冻干，得到包被了细胞因子的聚乳酸微球。使用时，取mIL12微球0.3mg，mGMCSF微球0.3mg，mIL2微球0.3mg，混合后用100µl DMEM重悬，混匀后用28G的注射器缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图7。经过注射的小鼠，100%均获得肿瘤完全消退。
实施例8. 表达mIL12+mGMCSF+mIL2的细胞对小鼠乳腺癌的治疗效果
在EP管内酶切载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：质粒2µg，酶切缓冲液3µl，BamHI 1µl，XhoI 1µl，加水至总体积30µl，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3 µl 10×上样缓冲液，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收载体片段，待用。
分别合成mIL12、mGMCSF和mIL2基因编码区对应的DNA序列，合成时在其5’端加上BamHI酶切位点，在其3’端加上XhoI酶切位点。酶切合成的带有目的基因的质粒，体系如下：质粒5µg，酶切缓冲液4µl，BamHI 1µl，XhoI 1µl，加水至总体积40µl，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4 µl 10×上样缓冲液，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收mIL12、mGMCSF和mIL2片段，待用。
连接pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO和mIL12、mGMCSF、mIL2，体系如下：pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO 2µl，mIL12、mGMCSF或mIL2 2µl，连接酶缓冲液 1µl，T4 DNA 连接酶0.5µl，水4.5 µl。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体测序，确定构建成功。获得表达mIL12、mGMCSF和mIL2的病毒载体pLentis-CMV-mIL12-IRES-PURO、pLentis-CMV-mGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV- mIL2-IRES-PURO。
制备表达载体的病毒，方法如下：1) 消化培养的293FT细胞，计数后将3×106细胞/孔铺入10-cm培养皿中，培养液体积为10 ml，共铺5块板。2) 第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25 µM，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 6 µg+pSPAX2 15 µg+pLentis-CMV-mIL12-IRES-PURO或pLentis-CMV-mGMCSF-IRES-PURO或pLentis-CMV- mIL2-IRES-PURO 20 µg)，总体积为1045 µl，然后加入2M CaCl2 155 µl，混匀，最后再加入1200 µl 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。3) 第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。4)第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45µm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用200 µl HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
使用表达病毒转染293A细胞，方法如下：消化培养的293A细胞，按105 细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml。24小时后，加入10µl表达病毒，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养。待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，加入终浓度3µg/ml 嘌呤霉素(puromycin)，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持嘌呤霉素的浓度，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达细胞因子的细胞，分别为293A(mIL12)、293A(mGMCSF)、293A(mIL2)。
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
消化培养的293A(mIL12)、293A(mGMCSF)和293A(mIL2)细胞，离心收集，用培养基清洗，然后再离心。用培养基重悬细胞到2×107/ml，三种细胞各取15µl混合，获得45µl的混合液，然后加入1.5µl 2M氯化钙溶液，混匀，最后再加入45µl 1%海藻酸钠溶液，用枪头吹打混匀，形成凝胶。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取带有细胞因子表达细胞的海藻酸钙凝胶，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。第一次注射6天后，对于未消退的肿瘤，再次进行相同的注射操作。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图8。经过注射的小鼠，60%在一次注射后获得肿瘤完全消退，另外的40%的小鼠在第一次注射6天后进行第二次注射，注射后所有小鼠肿瘤完全消退。
实施例9. mIL12+mGMCSF+mIL15壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解购买的细胞因子mIL12、mGMCSF和mIL15，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mGMCSF+mIL15的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图9。经过注射的小鼠，60%的小鼠获得肿瘤完全消退，40%的小鼠肿瘤生长受到抑制。
实施例10. mIL12+mGMCSF+mIL21壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解购买的细胞因子mIL12、mGMCSF和mIL21，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mGMCSF+mIL21的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图10。经过注射的小鼠，80%的小鼠获得肿瘤完全消退，20%的小鼠肿瘤生长受到抑制。
实施例11. mIL12+mFLT3L+mIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解购买的细胞因子mIL12、mFLT3L和mIL2，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mFLT3L+mIL2的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图11。经过注射的小鼠，100%获得肿瘤完全消退。
实施例12. mIL12+mFLT3L+mIL15壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子mIL12、mFLT3L和mIL15，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mFLT3L+mIL15的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图12。经过注射的小鼠，60%的小鼠获得肿瘤完全消退，40%的小鼠肿瘤生长受到抑制。
实施例13. mIL12+mFLT3L+mIL21壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子mIL12、mFLT3L和mIL21，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl mIL12+mFLT3L+mIL21的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图13。经过注射的小鼠，80%的小鼠获得肿瘤完全消退，20%的小鼠肿瘤生长受到抑制。
实施例14. hIL12+hGMCSF+hIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子hIL12、hGMCSF和hIL2，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl hIL12+hGMCSF+hIL2的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图14。经过注射的小鼠，20%发生肿瘤消退，其他小鼠肿瘤生长也受到了显著的抑制。未经治疗的小鼠，肿瘤会迅速生长，见图20。
实施例15. hIL12+hGMCSF+hIL15壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子hIL12、hGMCSF和hIL15，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl hIL12+hGMCSF+hIL15的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图15。经过注射的小鼠，肿瘤生长均受到了显著抑制。
实施例16. hIL12+hGMCSF+hIL21壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子hIL12、hGMCSF和hIL21，使其终浓度均为20ng/µl，每种取15µl进行混合，获得45µl hIL12+hGMCSF+hIL21的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图16。经过注射的小鼠，肿瘤生长均受到了显著抑制。
实施例17. hIL12+hFLT3L+hIL2壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子hIL12、hFLT3L和hIL2，使其终浓度均为20ng/µl，每种取15µl进行混合，获得45µl hIL12+hFLT3L+hIL2的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图17。经过注射的小鼠，20%发生肿瘤消退，其他小鼠肿瘤生长也受到了显著的抑制。
实施例18. hIL12+hFLT3L+hIL15壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子hIL12、hFLT3L和hIL15，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl hIL12+hFLT3L+hIL15的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图18。经过注射的小鼠，肿瘤生长均受到了显著抑制。
实施例19. hIL12+hFLT3L+hIL21壳聚糖季铵盐溶液对小鼠乳腺癌的治疗效果
消化培养的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，将2×105的细胞注射到Balb/c小鼠身体右侧皮下，待肿瘤的长径达到7-9mm左右时开始进行治疗。
用无菌水溶解细胞因子hIL12、hFLT3L和hIL21，使其终浓度均为20ng/µl。每种取15µl进行混合，获得45µl hIL12+hFLT3L+hIL21的混合液，然后加入预先配置的3%的壳聚糖季铵盐溶液45µl，用枪头小心吹打混匀。将荷瘤小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，然后用29G的胰岛素注射器吸取配制的细胞因子壳聚糖季铵盐溶液，缓慢注射到肿瘤内，注射完后将针头滞留少许时间以减少溶液的溢出。注射完的小鼠放回笼内，注意保温，待其苏醒。观察并记录小鼠肿瘤的生长情况。
实验结果见图19。经过注射的小鼠，肿瘤生长均受到了显著抑制。
实施例20. 治愈小鼠对再次接种肿瘤的抵御效果
取经过mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液治疗的4T1荷瘤小鼠，待其肿瘤消退4周后，在第一次接种肿瘤的身体对侧皮下注射2×105 4T1肿瘤细胞，观察小鼠情况。实验结果见图21。第二次注射肿瘤细胞后未见有肿瘤长出，而同时注射的野生型小鼠均长出肿瘤。
取经过mIL12+mGMCSF+mIL2壳聚糖季铵盐溶液治疗的CT26荷瘤小鼠，待其肿瘤消退4周后，在第一次接种肿瘤的身体对侧皮下注射2×105 CT26肿瘤细胞，观察小鼠情况。实验结果见图21。第二次注射肿瘤细胞后未见有肿瘤长出，而同时注射的野生型小鼠均长出肿瘤。
SEQUENCE LISTING
<110> 张, 晋宇
<120> 肿瘤免疫疗法
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<170> PatentIn version 3.5
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Ser
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<213> Homo sapiens
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Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 9
<211> 306
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 10
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val
1 5 10 15
Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr
20 25 30
Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp
35 40 45
Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln
50 55 60
Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met
65 70 75 80
Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
85 90 95
Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp
100 105 110
Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
115 120 125
<210> 11
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
1 5 10 15
Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val
20 25 30
Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp
35 40 45
Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala
50 55 60
Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His
65 70 75 80
Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe
85 90 95
Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu
100 105 110
Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu
115 120 125
Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser
130 135 140
Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu
145 150 155 160
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala
165 170 175
Trp Cys Leu His Trp Gln Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly
180 185 190
Glu Gln Val Pro Pro Val Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu
195 200 205
His
<210> 12
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 13
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 14
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130

Claims (12)

1.一种细胞因子组合，其包含至少3种、优选3种细胞因子，所述细胞因子选自：IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体、IL2或其功能性变体、IL15或其功能性变体、和IL21或其功能性变体。
2.权利要求1的细胞因子组合，其包含以下中任一项：i) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL2或其功能性变体；ii) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL15或其功能性变体；iii) IL12或其功能性变体、GMCSF或其功能性变体，和IL21或其功能性变体；iv) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL2或其功能性变体；v) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL15或其功能性变体；或vi) IL12或其功能性变体、FLT3L或其功能性变体，和IL21或其功能性变体。
3.权利要求1或2的细胞因子组合，其中所述细胞因子是鼠细胞因子或人细胞因子，优选人细胞因子。
4.一种细胞或细胞混合物，其表达权利要求1-3中任一项的细胞因子组合。
5.一种用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的药物组合物，其包含有效量的权利要求1-3中任一项的细胞因子组合、权利要求4的细胞或细胞混合物，以及药学可接受的载体。
6.权利要求5的药物组合物，其被配制为适于局部施用，优选瘤内施用。
7.权利要求6的药物组合物，其被配制为用于缓释施用，例如被配制于海藻酸钙凝胶、聚乳酸(PLA)微球或壳聚糖季铵盐溶液中。
8.一种用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的方法，其中包括给所述对象施用有效量的权利要求1-3中任一项的细胞因子组合、权利要求4的细胞或细胞混合物、或权利要求5-7中任一项的药物组合物。
9.权利要求8的方法，其中所述施用是局部施用，优选瘤内施用。
10.权利要求1-3中任一项的细胞因子组合、权利要求4的细胞或细胞混合物、或权利要求5-7中任一项的药物组合物在制备用于在有需要的对象中治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发或转移的药物中的用途。
11.权利要求5-7中任一项的药物组合物、权利要求8或9的方法、或权利要求10的用途，其中所述肿瘤是实体瘤，例如选自以下的实体瘤：肺癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、脑及中枢神经系统癌、胰腺癌、口腔癌、鼻咽癌、头颈癌、喉癌、骨癌、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌和淋巴瘤。
12.权利要求5-7中任一项的药物组合物、权利要求8或9的方法、或权利要求10的用途，其中所述对象是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫，优选是人。
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