CN105420260A - 重组靶向Wnt融合蛋白及其在制备抗癌药中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组靶向的Wnt信号通路融合蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明构建了基于sFRP家族蛋白的CRD结构域和WIF-1的WD结构域，所构建的融合蛋白具有抑制Wnt信号并显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，通过裸鼠皮下异种移植模型，该融合蛋白能显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，其抑制率为80％(P<0.01)。可应用于抗肿瘤药物的制备或作为基因治疗的药物。

Description

重组靶向Wnt融合蛋白及其在制备抗癌药中的应用
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及一种重组靶向的Wnt信号通路融合蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
1.Wnt信号通路的概述
癌症是全世界主要的死亡病因，2030年预计全球约1200万人死于癌症，目前仍缺乏有效治疗药物。Wnt信号通路在胚胎发育、干细胞、免疫系统以及肿瘤发生等生理病理过程中发挥重要作用，该通路的持续激活与结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤等多种人类肿瘤的发生发展密切相关。Wnt信号通路是一种在进化中高度保守的信号通路，Wnt家族蛋白通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合，激活细胞内信号转导，进而调节Wnt靶基因的表达，而绝大多数Wnt靶基因都与生长和代谢密切相关。目前，Wnt信号通路主要可分为经典的Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路，其中经典Wnt信号通路即Wnt/beta-catenin通路，是Wnt信号中研究最清楚的一条通路，在整个进化过程中高度保守。研究表明，Wnt信号通路的异常与人类多种疾病的发生相关。Wnt信号过度激活导致下游目标原癌基因的大量表达，促使细胞发生恶性转化，对肿瘤的发生发展起着促进作用。在人非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌等多种癌症中均发现有Wnt蛋白的过度表达及各种Wnt配体调节分子(如sFRP，WIF1)的下调。在结直肠癌和肝癌中还分别发现APC和beta-catenin的组成型激活突变，从而导致Wnt信号在该类癌症中持续活化。因此，抑制或者阻断Wnt信号通路的蛋白拮抗剂或化学小分子可为恶性肿瘤的防治提供新的分子靶向策略。
2.分泌型的Wnt蛋白拮抗剂的概述
在Wnt信号通路的上游，除了Wnt配体和受体能够调节Wnt信号以外，另外还有三类分泌型的天然Wnt拮抗剂可以调控Wnt信号通路，即：分泌型卷曲相关蛋白(sFRP)家族，Dickkopf(Dkk)蛋白家族以及Wnt抑制因子1(WIF-1)。
sFRP家族蛋白具有一段与Frizzeled受体相似的保守半胱氨酸富集区域，即CRD结构域，该结构域可通过与胞外Wnt配体相互结合从而削弱或阻断受体信号的传导。专利CN101600449A公开了将卷曲蛋白、分泌型卷曲相关蛋白或Ror蛋白的CRD结构域与Fc免疫球蛋白构建嵌合的融合蛋白，可用于Wnt介导病症的治疗和诊断性检测。与sFRP家族蛋白不同的是，WIF-1不含有与Wnt相连接的CRD区域，而是通过其特有的WD区域(WIF-1domain)与Wnt相结合，实现其阻断Wnt信号的功能。国外专利WO2005112988A2公开了WIF-1的WD区域能够用于治疗WIF-1低表达的多种肿瘤。此外，至于Dickkopf(Dkk)蛋白家族则主要通过与细胞膜上Wnt辅助受体LRP5/6相结合，从而导致受体发生内吞作用降解。虽然目前已有研究人员运用现有技术将CRD或WD进行克隆或重组获得重组蛋白，并提示可运用于肿瘤的治疗，但是至今并没有相关临床研究使用的报道，表明单独的CRD或WD重组蛋白进入临床试验阶段还存在很大的问题。同时，基于Wnt配体蛋白家族的多样性，目前已发现19种Wnt蛋白参与活化Wnt信号通路，而CRD和WD具体分别与哪些Wnt配体或受体蛋白相结合尚不清楚，完全可能选择性地继续活化Wnt信号。因此，上述单一某个结构功能域的策略具有明显的技术缺陷，急需广谱型的Wnt信号大分子蛋白质抑制剂。
发明内容
针对现有技术存在问题，本发明的目的在于提供一种重组靶向Wnt信号通路的融合蛋白，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。构建基于sFRP家族蛋白的CRD结构域和WIF-1的WD结构域，所构建的融合蛋白具有抑制Wnt信号并显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，可应用于抗肿瘤药物的制备或作为基因治疗的药物。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种重组靶向Wnt拮抗剂CRD-WD融合基因，将sFRP家族蛋白的CRD区域与WIF-1的WD区域通过柔性氨基酸接头连接，柔性氨基酸序列为：GSGSGS。
上述重组靶向Wnt拮抗剂CRD-WD融合基因，其编码的蛋白质为重组靶向Wnt信号通路融合蛋白CRD-WD，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
所述重组靶向Wnt信号通路融合蛋白CRD-WD可通过XbaI、PmeI酶切位点克隆至慢病毒表达载体pLVX-puro。
所述的重组靶向Wnt信号通路融合蛋白CRD-WD可应用于制备对Wnt信号异常的病症的药物中，所述对Wnt信号异常的病症包括癌症。
本发明所述的Wnt信号通路融合蛋白CRD-WD可直接作为药物使用，其余辅料为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的药用载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明基于Wnt信号通路中复杂的蛋白质相互作用规律，将Wnt拮抗剂sFRP家族蛋白和WIF-1与Wnt配体蛋白结合的结构域通过融合PCR方法将两者融合，从而构建了重组靶向Wnt信号通路的融合蛋白CRD-WD，该融合蛋白能显著抑制肝癌HepG2细胞Wnt信号的活性，其抑制率为84％(P<0.01)。
(2)本发明基于重组靶向Wnt信号通路的融合蛋白CRD-WD，构建了该融合蛋白的慢病毒载体pLVX-puro-CRD-WD，并应用于肿瘤基因治疗的研究：该重组慢病毒感染肝癌HepG2细胞并经嘌呤霉素筛选获得稳定表达该融合蛋白的细胞株，通过裸鼠皮下异种移植模型，该融合蛋白能显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，其抑制率为80％(P<0.01)。
附图说明
图1为构建的CRD-WD融合基因的电泳检测结果图。
图2为该融合基因表达载体的酶切鉴定结果图。
图3为CRD-WD稳定细胞株鉴定的结果图。
图4为通过荧光素酶报告基因检测系统检测融合蛋白CRD-WD对宿主肿瘤细胞Wnt活性抑制的结果图。
图5为该融合蛋白在裸鼠皮下异种移植模型中的肿瘤增殖抑制结果图。
具体实施方式
本发明利用人源sFRP(secretedfrizzled-relatedprotein)家族蛋白的CRD结构域和WIF-1(Wntinhibitoryfactor1)的WD结构域均能结合Wnt配体特性，构建重组靶向Wnt拮抗剂CRD-WD融合基因。所构建的融合基因CRD-WD是分别克隆sFRP家族蛋白的CRD结构域和WIF-1的WD结构域，然后通过六个柔性氨基酸接头进行连接，采用融合PCR技术进行重组。下面结合该融合基因CRD-WD、表达载体的构建及重组慢病毒的制备，以及该融合蛋白抑制Wnt信号的活化和抑癌活性等功能性研究，对本发明做进一步地详细说明。
1、CRD-WD融合基因
1.1CRD和WD结构域的克隆
相关分子生物学实验技术按常规方法进行。根据Genbank中的sFRP3的CRD基因序列和WIF-1的WD基因序列分别设计扩增引物P1、P2和P3、P4，扩增引物对P2、P3用于融合基因的重组扩增，具体的引物序列分别为：
引物P1：
5’-CTAGTCTAGACCGCGGCCCCAGAAGTCTTA-3’
引物P2：
5’-CTCTCCGGAGGCCATCGGATCCGGATCCGGATCCGGGCCGCCGCAGGAGG-3’
引物P3：
5’-CCTCCTGCGGCGGCCCGGATCCGGATCCGGATCCGATGGCCTCCGGAGAG-3’
引物P4：
5’-CTAGGTTTAAACTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGCACTCAGCTT-3’
首先，扩增CRD的下游引物序列P2中引入WD基因片段的5’端的几个反向互补核苷酸，同时加入六个柔性氨基酸接头，P2和P3为反向互补配对序列。同时，在扩增CRD的上游引物中引物酶切位点XbaI，扩增WD的下游引物序列中引入酶切位点PmeI。其次，以现有的pLVX-puro-sFRP3质粒和pLVX-puro-WIF-1质粒为模板，分别以引物对P1和P2、P3和P4为扩增引物对，PCR扩增CRD和WD结构域，PCR扩增程序为：94℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃30s，35个循环。最后，收集PCR扩增产物，经胶回收纯化后分别获得CRD结构域和WD结构域。
1.2CRD-WD融合基因的构建
通过融合PCR技术，将扩增的CRD结构域基因与扩增的WD结构域基因进行基因融合，具体如下：
以扩增的CRD结构域基因与WD结构域基因等量混合物(1:1混合)为模板，以P2和P3引物对作为扩增引物，进行融合PCR，使CRD和WD相融合，PCR扩增程序为：94℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃1min，35个循环。收集融合PCR扩增的产物，纯化后获得CRD-WD融合基因。
对CRD、WD结构域基因以及CRD-WD融合基因进行凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中泳道M为Marker，CRD结构域片段大小为724bp，WD结构域片段大小为523bp，CRD-WD融合基因为1213bp，与预期设计相符合。
2、CRD-WD融合基因表达载体的构建
分别采用限制性内切酶XbaI、PmeI对CRD-WD融合基因和慢病毒表达载体pLVX-puro进行酶切，回收酶切片段之后，通过T4连接酶将CRD-WD融合基因片段与pLVX-puro空载体片段相连接。连接反应完成后，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养过夜后，挑取单克隆，37℃培养，提取质粒并进行XbaI/PmeI酶切鉴定，最后进行测序验证；将所构建成功的重组子命名为pLVX-puro-CRD-WD，此即为重组靶向Wnt拮抗剂融合基因表达载体。
该融合基因pLVX-puro-CRD-WD酶切鉴定的电泳结果如图2所示，其中泳道M为标准分子量Marker。与对照相比，在pLVX-puro-CRD-WD经酶切的两个片段中，一个与pLVX-puro载体片段大小一致，另一个大小约1.2kb。测序结果表明该重组慢病毒表达载体pLVX-puro-CRD-WD构建成功。
3、CRD-WD融合基因慢病毒的制备
本发明采用慢病毒表达体系，而慢病毒在基因递送、基因治疗和转基因动物研究中已展示出优异的应用前景。重组慢病毒表达载体pLVX-puro-CRD-WD在脂质体介导下与包装质粒(pSPAX2)、包膜质粒(pMD2G)共转染293T细胞，培养48-72小时后收集上清培养液，经浓缩获得重组的慢病毒并测定其滴度(7.0×1011v.p./mL)，随后该重组慢病毒可进行宿主细胞的感染或荷瘤鼠的局部注射。
4、CRD-WD融合蛋白稳定表达细胞株的构建
所用肝癌细胞株来自美国菌种保藏中心(ATCC)，相关细胞生物学实验技术按常规方法进行，细胞培养条件为37℃以及5％CO2。将上述制备的重组慢病毒感染肝癌HepG2细胞，48h后加入浓度为2μg/mL的嘌呤霉素筛选，经过两周的持续筛选，获得阳性克隆HepG2-CRD-WD细胞，提取细胞总蛋白，通过Westernblot检测Flag融合蛋白的表达，结果如图3所示，与空载体对照相比，HepG2-CRD-WD细胞大量表达CRD-WD融合蛋白，表明已成功地构建了稳定表达CRD-WD融合蛋白的细胞株。
5、CRD-WD融合蛋白抑制Wnt信号的活化
采用TOPFLASH分析技术检测Wnt信号的活性。TOPFLASH质粒含有3个LEF1/TCF结合位点从而启动萤火虫荧光素酶基因的表达，经荧光素底物结合后发出可检测的荧光，其对照为FOPFLASH，除LEF1/TCF结合位点突变外其余与FOPFLASH相同。pGL4.74的海肾荧光素酶活性用于表征转染效率。将人肝癌细胞HepG2及HepG2-CRD-WD细胞接种到24孔板中，然后共同转染SuperTOPflash质粒、SuperFOPflash质粒以及pGL4.74质粒，24小时后，裂解细胞，提取上清，通过Promega公司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，结果如图4所示，CRD-WD融合基因表达能够明显下调TCF-4的转录活性，表明CRD-WD融合蛋白能显著抑制Wnt信号的活化，抑制率为84％(P<0.01)。
6、CCRD-WD融合蛋白稳定表达细胞株的细胞致瘤性，抑制率为80％(P<0.01)
6.1CRD-WD融合蛋白稳定表达细胞的大规模制备
将HepG2-CRD-WD细胞接种到p100培养皿中。当细胞在培养皿中汇合度达到80％-90％时，0.25％胰酶消化细胞，加入含10％FBS的DMEM培养基终止消化。部分细胞用于Westernblot检测蛋白量，收集剩余大部分细胞，1500rpm离心5min，弃上清。用无FBS的DMEM培养基重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清。用已灭菌的1×PBS以同样方式清洗细胞三次，洗掉残留的血清和抗生素。收集细胞，用1×PBS制备细胞悬液。血球计数板计数。将细胞浓度调整为5×107cells/mL。
6.2肿瘤皮下异种移植模型的构建
选取雌性BALB/C裸鼠，待其生长到6周进行肿瘤生成实验。实验分为两组，每组十只。取1mL注射器(褐色针头，0.45×16RWLB)在无菌条件下吸取制备好的细胞悬液(5×107cells/mL)，每只裸鼠右颈部注射100μL细胞悬液(5×106cells/mouse)。标记每只裸鼠，在无菌条件下饲养。每隔两天测量裸鼠肿瘤长轴及短轴的长度，根据公式V＝0.5236×L1×L2计算肿瘤体积，其中L1为肿瘤长轴，L2为肿瘤短轴。30天后安乐处死裸鼠，剥离肿瘤，称取肿瘤重量。肿瘤经PBS清洗后，4％甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片和制备可以供显微镜观察的载玻片。组织切片进行苏木精伊红(H&E)染色和免疫组化，结果如图5所示，与对照相比，HepG2-CRD-WD细胞的致瘤性显著下降，抑瘤率为80％。上述结果清楚表明，靶向Wnt信号通路的CRD-WD融合蛋白具有显著的体内抗癌活性，可作为肿瘤基因治疗的药物或用于制备抗癌药物。
7、His-CRD-WD重组蛋白的表达、纯化及抗肿瘤应用
首先，通过上述的分子生物学手段将CRD-WD融合基因亚克隆到原核表达载体pET28a上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，当转化子生长至OD600值为0.5时，加入终浓度为0.4mM的IPTG于16℃条件下诱导目的蛋白Frzb的表达，4℃，2000×g离心15min收集细胞，采用冰浴裂解缓冲液(1×PBS,300mmol/LNaCl,pH7.4)重悬细胞，经超声裂解后于4℃,10000×g离心30min收集上清可溶部分。其次，采用固定化金属亲和层析(IMAC)方法纯化Frzb重组蛋白。取1mL镍-NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10mL平衡缓冲液平衡，破碎上清10mL样品以0.5mL/min上样，2mL/管分管收集，用含500mM咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，随后目的蛋白通过SephadexG15凝胶层析去除咪唑，并将缓冲体系更换为20mMTris-HCl，pH8.0。最后，将获得的重组蛋白应用于小鼠抗肿瘤作用。
通过人肝癌细胞HepG2皮下注射4-6周龄的雌性裸鼠构建移植瘤模型，具体为每只裸鼠皮下接种5×106个HepG2细胞，7天后，待肿瘤长至直径6-7mm时，将裸鼠随机分为三组，分别为对照组(PBS阴性对照)，小剂量组(5mg/kg)，大剂量组(20mg/kg)，然后将纯化后的融合蛋白通过皮下注射的方式处理分组后的裸鼠，间隔一天给药，给药10次，每天监测肿瘤的生长情况，待对照组的肿瘤体积达到2000mm3时，将所有老鼠处死，解剖，测定肿瘤体积和重量。最终实验结果显示，与对照组相比，高低剂量组移植瘤的生长均受到明显抑制，其抑制率分别为75％和60％，在实验治疗期间，动物体重有所增加，一般状况良好，表明动物可耐受所给剂量。因此，融合蛋白CRD-WD可以明显抑制并杀伤肿瘤细胞。
。

Claims (3)

1.一种重组靶向Wnt拮抗剂CRD-WD融合基因，其特征在于：将sFRP家族蛋白的CRD区域与WIF-1的WD区域通过柔性氨基酸接头连接，柔性氨基酸序列为：GSGSGS。
2.一种重组靶向Wnt信号通路融合蛋白CRD-WD，其特征在于：所述蛋白由权利要求1所述的重组靶向Wnt拮抗剂CRD-WD融合基因编码，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.如权利要求2所述的重组靶向Wnt信号通路融合蛋白CRD-WD在制备治疗Wnt信号异常的病症的药物中的应用。
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