CN101302256B - 一种新的重组融合分子及其抗肿瘤治疗作用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了人白介素-24与人Bax蛋白(也称为Bcl-2相关X蛋白，Bcl-2associated X protein)的融合蛋白(IL24-Bax融合蛋白)，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及含该融合蛋白的药物组合物。本发明的IL24-Bax融合蛋白既具有Bax诱导细胞调亡的功能，又具有IL-24的靶向性和促凋亡的作用，可以用于如肿瘤等疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本发明涉及人Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein，以下简称Bax蛋白)与人白介素-24(以下简称IL-24)的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在如肿瘤等疾病治疗中的应用。
背景技术
随着单克隆抗体技术和重组DNA技术的发展，已经发现了许多细胞特异性表面分子。并且，根据这些分子的差异表达谱，已经重组了一些由靶向性分子和毒素分子融合而成的免疫毒素或细胞毒素。
靶向性分子通常为完整的抗体或抗原结合性结构域，包括抗体的Fv段(免疫毒素)或生长因子和细胞因子(细胞毒素)，而毒素分子则为细菌或植物毒素的突变体。
目前应用得较多的是假单胞菌外毒素A(PE)和白喉毒素(diphtheria toxin，DT)。由于细胞对细胞表面的抗原-抗体复合物或配体-受体复合物能够快速内在化，以及单个内在化毒素分子可以导致细胞死亡，因此重组毒素可选择性靶向和杀伤导向分子针对的有害靶细胞，包括癌细胞以及与免疫系统紊乱有关的细胞。
目前在国际上，已有几个重组毒素进入临床试验。然而，这些重组毒素应用于临床的一个主要限制是毒素分子具有的高度免疫原性会引起人体免疫应答，而细菌或植物毒素无法用标准化技术将其人源化。另一个限制则是此类毒素都表现出一定程度的非特异性毒性，在浓度较高时会损伤不表达特异性靶抗原的正常细胞，从而限制给药剂量或持续给药。
因此，本领域迫切需要开发新的具有低免疫原性(或无免疫原性)和高特异性的细胞毒素。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的细胞毒素，所述的细胞毒素具有低免疫原性(或无免疫原性)和高特异性，具体地，所述的细胞毒素是IL-24和Bax的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种所述IL24-Bax融合蛋白的制备方法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括：
(a)白介素-24元件；
(b)Bax蛋白元件；以及
(c)任选的位于白介素-24元件和Bax蛋白元件之间的连接肽序列。
在另一优选例中，所述融合蛋白的的结构如式I所示：
Xa—L—Xb (式I)
式中，
Xa和Xb分别独立地选自(a)白介素-24元件，该元件具有人白介素-24或其活性片段的氨基酸序列，或(b)Bax蛋白元件，该元件具有人Bax蛋白或其活性片段的氨基酸序列；并且Xa和Xb不同时为Bax蛋白元件，也不同时为白介素-24元件；
L为无，或长度为1-50个(较佳地1-20个)氨基酸的连接肽序列。
在另一优选例中，所述的连接肽是长度为1-20个氨基酸的连接肽序列。
在另一优选例中，所述的白介素-24元件位于N端而Bax元件位于C端。
在另一优选例中，所述的白介素-24元件位于C端而Bax元件位于N端。
在另一优选例中，所述的Bax蛋白元件具有SEQ ID NO:2中第2-192位的氨基酸序列；
所述的白介素-24元件具有SEQ ID NO:4中第1-207位、50-207位的氨基酸序列；
而且，所述的接头肽序列含4-10个氨基酸。
在另一优选例中，所述的融合蛋白包括SEQ ID NO:6中第1-411位，第1-405位，第50-405位，或第50-411位所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了分离的DNA分子，它编码本发明上述的融合蛋白。较佳地，所述的DNA分子编码包括SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳地，它包括SEQID NO:5所示的核苷酸序列，尤其是对应于SEQ ID NO:6中第1-411位、第1-405位、第50-405位、或第50-411位的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。
在另一优选例中，所述的载体是腺病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体是5型腺病毒。
在另一优选例中，所述的载体是复制缺陷型5型重组腺病毒，其中缺少了结构基因E1和E3。
在另一优选例中，所述载体还含有可操作地连于所述融合蛋白的编码序列的缺氧诱导型启动子。
在本发明的第四方面，提供了一种产生本发明上述融合蛋白的方法，它包括步骤：
在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的(如0.001-99.9wt％)本发明的融合蛋白或本发明上述的载体。
在本发明的第六方面，提供了本发明融合蛋白或其编码序列或其载体的用途，它们被用于制备治疗肿瘤的药物。
附图说明
图1显示了Western blot检测转染细胞融合蛋白表达。各泳道如下：
1：PLC/PRF/5细胞；2：pcDNA3.1；3：pcDNA3.1-IL-24；4：pcDNA3.1-IL24-Bax；5：pGL3-promoter；6：PGL3-10HRE/VEGF385-promoter；7：PGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH。
图2显示了细胞爬片免疫化学染色检测IL-24表达(400×)。
A：pcDNA3.1；B：pcDNA3.1-IL-24；C：pcDNA3.1-IL24-Bax；D：pGL3-promoter；E：PGL3-10HRE/VEGF385-promoter；F：PGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH。
图3显示了缺氧诱导转染细胞融合蛋白的表达。各泳道如下：
1：不缺氧；2：缺氧4h；3：缺氧8h；4：缺氧16h
图4显示了IL24-Bax诱导PLC/PRF/5细胞生长抑制。
图5显示了荧光显微镜下观察的PLC/PRF/5细胞凋亡情况(TUNEL法，200×)。
A：空白组；B：pcDNA3.1；C：pcDNA3.1-IL-24；D：pcDNA3.1-IL24-Bax
图6显示了病毒感染细胞融合蛋白的表达情况。各泳道如下：
1：PLC/PRF/5；2：Ad.vector；3：Ad.IL-24；4：Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH
图7显示了缺氧诱导Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH感染细胞融合蛋白的表达情况。各泳道如下：
1：不缺氧；2：缺氧4h；3：缺氧8h；4：缺氧16h
图8A显示了BEL-7402经病毒处理后的生长曲线。
图8B显示了PLC/PRF/5经病毒处理后的生长曲线。
图8C显示了HepG2经病毒处理后的生长曲线。
图8D显示了L02经病毒处理后的生长曲线。
图9显示了病毒处理后各组裸鼠肿瘤组织HE染色(400×)。
A：Ad.vector；B：Ad.IL-24；C：Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH
图10显示了免疫组化染色检测肿瘤组织IL-24表达(400×)。
A：Ad.vector；B：Ad.IL-24；C：Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH
图11显示了TUNEL法检测的裸鼠肿瘤组织内细胞凋亡。
A：Ad.vector；B：Ad.IL-24；C：Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH
图12显示了免疫组化染色检测的肿瘤组织caspase-3活化情况(400×)。
A：Ad.vector；B：Ad.IL-24；C：Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH
图13显示了免疫组化染色检测的细胞增殖相关抗原ki-67表达情况(400×)。
A：Ad.vector；B：Ad.IL-24；C：Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH
图14显示了免疫组化染色检测的肿瘤组织微血管密度(MVD)(400×)。
A：Ad.vector；B：Ad.IL-24；C：Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH
图15A显示了融合基因真核表达载体的结构图。
图15B显示了融合基因的结构示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，将IL-24基因和Bax基因两个促凋亡分子融合在一起，形成IL24-Bax的融合蛋白。所述融合蛋白具有两者的生物学功能，既可通过Bax诱导细胞调亡而抗肿瘤，还可以通过IL-24导向地针对肿瘤细胞而特异性地抑制肿瘤。因此，本发明所得到的IL24-Bax融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，为抗肿瘤等治疗提供新的化合物。在此基础上完成了本发明。
融合蛋白
如本文所用，术语“白介素-24和Bax蛋白的融合蛋白”、“IL24-Bax融合蛋白”等可互换使用，都指由白介素-24元件的氨基酸序列和Bax蛋白元件的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。
本发明还包括IL24-Bax融合蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明IL24-Bax融合蛋白诱导调亡和特异性生物学功能的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“IL24-Bax融合蛋白”包括具有IL24-Bax融合蛋白活性的SEQ ID NO.6序列的多肽。该术语还包括具有与IL24-Bax融合蛋白相同功能的、SEQ ID NO.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括IL24-Bax融合蛋白的活性片段和活性衍生物。
例如，对于SEQ ID NO:6中第1-411位所示的全长IL24-Bax融合蛋白而言，一些具体的衍生或变异多肽包括：
SEQ ID NO:6第1-405位是去除了6His标签序列的多肽；
SEQ ID NO:6第50-405位是去除了信号肽和6His标签序列的多肽；
SEQ ID NO:6第50-411位是去除了信号肽的成熟多肽。
在本发明中，“IL24-Bax融合蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:5所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:6的蛋白质，但与SEQ ID NO:5所示的编码区序列有差别的核酸序列。
白介素-24元件
如本文所用，术语融合蛋白中“白介素-24元件”或“IL-24元件”可互换使用，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长白介素-24或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然白介素-24基本上相同的生物活性。优选的IL-24元件是人白介素-24，更佳地是全长的白介素-24或其活性片段，如SEQ ID NO:4中第1-207位、第50-207位、或第2-207位的氨基酸序列。
在本发明的融合蛋白中，IL-24不仅作为细胞毒素的导向分子，而且本身可选择性诱导肿瘤细胞凋亡。
IL-24原名为黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7，mda-7)，于2001年底重新命名为IL-24，是一种属于IL-10家族的分泌性细胞因子。
IL-24基因由7个外显子和6个内含子组成，定位于人类染色体Iq32.2-Iq41，其cDNA编码一个由206个氨基酸残基组成的蛋白质(SEQ ID NO:3和4)，分子量为23.8kDa。IL-24受体属于II类细胞因子受体家族，新近已鉴定出IL-24的2个异二聚体受体IL-22R1/IL-20R2和IL-20R1/IL-20R2。尽管迄今对IL-24作为细胞因子的功能了解甚少，但它具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡的潜能。一系列研究表明，用复制缺陷性腺病毒重组载体Ad.mda-7处理无内源性基础水平表达的多种类型肿瘤细胞株可导致生长抑制和凋亡。另一方面，Ad.mda-7对正常上皮细胞或成纤维细胞等各种类型正常细胞株并无抑制增殖或诱导凋亡的作用。体内实验证明，在乳腺癌、子宫癌、胰腺癌和肺癌等异种移植动物模型中，Ad.mda-7可抑制人类肿瘤形成和进展。肺癌异种移植裸小鼠的研究证实，Ad.mda-7还具有抗血管生成活性。而强大的肿瘤选择性促凋亡活性与抗血管生成特异性相结合，无疑使Ad.mda-7有潜能成为一个具有广阔前景的肿瘤基因治疗新型制剂。目前在美国，Ad.mda-7已进入II期临床试验，当Ad.mda-7注射到肿瘤后，在体外实验观察到的抗肿瘤效应在体内重现，并且病人表现了很好的耐受性。
由于IL-24可通过细胞膜受体导致许多类型肿瘤细胞生长抑制和凋亡，而对正常上皮细胞或成纤维细胞等各种类型正常细胞无抑制增殖或诱导凋亡的作用，因此，IL-24作为配体不仅可充当细胞毒素的导向分子，通过内在化将另一个促凋亡分子特异性引进肿瘤细胞，而且本身可选择性诱导肿瘤细胞凋亡。
Bax蛋白元件
如本文所用，术语融合蛋白中“Bax蛋白元件”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长Bax蛋白或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然Bax蛋白基本上相同的生物活性。优选的Bax蛋白元件是人Bax蛋白，更佳地是全长的人Bax蛋白或其活性片段，如SEQ ID NO:2中第2-192位或第1-192位的氨基酸序列。
在本发明蛋白中，Bax蛋白元件的作用是作为毒素样分子。迄今发现的Bcl-2家庭成员已有近20个之多，其中Bcl-XL，Bcl-W等与Bcl-2的作用相似，可抑制细胞凋亡；而Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak等则与此相反，可促进凋亡。在Bcl-2蛋白家族的促凋亡成员中，Bax更受关注。Bax是Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein)的缩写，最初通过与Bcl-2的关联而被鉴定。Bax基因全长约4.5kb，由6个外显子组成。由于RNA剪接方式不同，Bax基因产物有α、β和γ3种形式，其中Baxα的mRNA约1.0kb，编码由192个氨基酸残基组成的蛋白质(SEQ IDNO:1和2)，相对分子质量为21000。在体内，Bax与Bcl-2形成异二聚体，而Bcl-2/Bax比率直接决定细胞是否凋亡。若Bcl-2表达高，Bcl-2/Bax比例增加，则抑制细胞凋亡；反之，若Bax表达高，则促进细胞凋亡。Bax也能单独调节凋亡，即诱导Bax表达足以诱导凋亡，而不需要任何额外的死亡刺激。研究已表明，肿瘤细胞转导Bax后会引起致死性凋亡，而由Bax介导的基因疗法能抑制多种肿瘤生长。因此，在本发明的融合蛋白中，促凋亡蛋白Bax具有作为杀伤元件替代重组毒素中细菌或植物毒素分子的作用。
Bax蛋白和白介素-24的序列可以源自人，也可以源自非人的动物。然而，优选的是人的天然序列。
连接肽
如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指位于Bax蛋白元件的氨基酸序列和IL-24元件的氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为1-50个氨基酸，较佳地1-20个氨基酸，更佳地为3-10个氨基酸，最佳地为4-6个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法(如参见PNAS1998；95：5929-5934；Protein Eng，2000；13(5)：309-312；ProteinEng，2003；15(11)：871-879等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响Bax蛋白元件的氨基酸序列和IL-24元件的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。通常，Bax蛋白元件和IL-24元件的氨基酸序列不作为连接肽。
优选的连接肽例子包括(但并不限于)：为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用人IgG1的铰链区EASGGPE编码基因等序列作为连接臂是合适的(SEQ ID NO:6中第622-642位或SEQ ID NO:16)；为了有利于蛋白酶把IL24-Bax切割两个独立的蛋白分子，可用活性X因子的酶切位点(IEGR)作连接臂。相似的，糜蛋白酶1、木瓜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位点也可设计作为氨基酸连接臂；为了有利于纯化，可把6His作为连接臂，以用金属亲和层析纯化IL24-Bax融合蛋白；上述三种方案的结合也可设计成新的氨基酸连接臂，如NVVVHQAHHHHHHEFTYK连接臂就是融合了蛋白酶切位点(NIa蛋白酶)和金属亲和层析位点6His。
编码序列和制法
编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得Bax蛋白和或白介素-24的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)：能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞，293细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的IL24-Bax融合蛋白既具有Bax的诱导细胞调亡的功能，又具有IL-24的导向作用和促凋亡的作用。
另一方面，本发明还包括对IL24-Bax融合蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于IL24-Bax融合蛋白或片段。较佳地，指那些能与IL24-Bax融合蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的IL24-Bax融合蛋白结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型IL24-Bax融合蛋白，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或其抗体施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)：各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5-Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。
综上所述，本发明的主要优点如下：
(1)IL24-Bax融合蛋白，既具有Bax的诱导细胞调亡的功能，又具有IL-24的导向作用和促凋亡的作用，可叠加或放大杀伤肿瘤细胞，是一种治疗肿瘤的新型药物。
(2)给药方便。由于两者的有效作用剂量在大多数情况下接近，所以用融合蛋白同时给予，方便了单药的配比，同时受试者也减少了痛苦。
(3)具有肿瘤特异性和靶向性，对正常器官和组织毒性小。
(4)无免疫原性，不受用药剂量的限制。
(5)与化疗或放疗联合应用不仅可进一步提高疗效，而且可减轻化、放疗引起的毒副反应。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
IL-24基因真核表达载体的构建
合成一对引物用于扩增IL-24cDNA。
P1-IL24：5′-ag aag ctt atg aat ttt caa cag-3′(SEQ ID NO:7)(引入Hind III酶切位点aag ctt)；
P2-IL24：5′-ag ctc gag tca atg atg atg atg atg atg gag ctt gta gaa ttt ctg-3′(SEQ ID NO:8)(引入XhoI酶切位点ctc gag，6×His标签atg atg atg atg atg atg)。
以常规制备的人黑色素瘤组织mRNA为模板，PCR扩增获得人体IL-24cDNA，用胶回收试剂盒回收大小为658bp的DNA片段，回收片段及pcDNA3.1载体(Invitrogen公司)分别用HindIII和XhoI双酶切，回收目的片段，将酶切后的IL-24目的基因片段与酶切后的pcDNA3.1连接，连接产物转化常规的感受态JM109大肠杆菌，挑取生长的细菌单克隆，酶切鉴定并测序正确后命名为pcDNA3.1-IL-24。
实施例2
10HRE/VEGF385启动子的构建
合成3条引物用于扩增10HRE/VEGF385。
P1(76bp)：5′-agacgtgactacgtgctgcctaggtgactacgtgctgcctaggtgactacgtgct
gcctagtctgggcagctggcc-3′(SEQ ID NO:9)；
P2(78bp)：5′-agctagcgtgactacgtgctgcctaggtgactacgtgctgcctaggtgactacgt
gctgcctagacgtgactacgtgc-3′(SEQ ID NO：10，引入Nhe I酶切位点gct agc)；
P3(25bp)：5′-actcgagtg cagacatcaaagtgag-3′(SEQ ID NO:11，引入Xho I酶切位点ctc gag)。
先以人肝癌组织mRNA为模板，引物P1和P3用于第1次PCR扩增获得大小为453bp的DNA片段，然后再以该产物为模板，P2和P3用于进行第2次PCR扩增获得大小为515bp的DNA片段，回收该DNA片段，克隆入pUcm-T载体(购自BBI公司)，经酶切鉴定和测序正确后命名为pUcm-T-10HRE/VEGF385。经Sac I/Xho I双酶切获得10HRE/VEGF385片段(SEQ ID NO:17)，克隆入PGL3-SV40promoter vector(购自Promega公司)，酶切鉴定正确后命名为PGL3-10HRE/VEGF385-SV40promoter。
实施例3
IL24-Bax融合基因真核表达载体的构建
合成两对引物，分别用于扩增IL24-Linker和Linker-Bax。其中，Linker为人IgG1的铰链区EASGGPE编码基因，是一可弯曲的多肽，用于连接IL-24分子和Baxα链。
用IL24-Linker上游引物：5′-ag aag ctt atg aat ttt caa cag-3′(SEQ ID NO:12，引入HindIII酶切位点aag ctt)；和下游引物：5′-a ctc gag ctt gta gaa ttt ctg cat-3′(SEQ ID NO:13，引入XhoI酶切位点ctc gag)，以胶回收的IL-24DNA片段为模板，PCR扩增人体IL24-Linker cDNA，用胶回收试剂盒回收大小为633bp的DNA片段。
将回收片段及pcDNA3.1载体分别用HindIII和XhoI双酶切，回收目的片段，将酶切后的IL-24目的基因片段与酶切后的pcDNA3.1连接，连接产物转化感受态JM109，挑取生长的细菌单克隆，酶切鉴定并测序正确后命名为pcDNA3.1-IL24-Linker。
用Linker-Bax上游引物：5′-a ctc gag gct tct ggt ggt cct gaa gac ggg tcc ggg gagcag-3′(SEQ ID NO:14，引入XhoI酶切位点ctc gag)；和下游引物：5′-a tca atg atg atgatg atg atg gcc cat ctt ctt cca gat-3′(SEQ ID NO:15，引入6×His标签atg atg atg atgatg atg)，以抽提人外周血淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增得到含Bax编码序列和连接肽编码序列的扩增产物Linker-Bax cDNA。将该扩增产物与pUCm-T载体(购自BBI公司)进行酶切和连接，连接产物转化感受态JM109，挑取生长的细菌单克隆，酶切鉴定并测序正确后命名为pcDNA3.1-Linker-Bax。
XhoI酶切并回收pcDNA3.1-IL24-Linker和pUCm-T-Linker-Bax，将酶切、回收的Linker-Bax片段克隆入酶切、回收的pcDNA3.1-IL24-Linker，转化感受态JM109后筛选，酶切鉴定正确后命名为pcDNA3.1-IL24LBH
其中，IL24-Bax融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO:5所示，全长为1236bp，其中第1-147位为信号肽，第148-621位为IL24，第643-1215位为Bax蛋白的编码序列。编码的IL24-Bax融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，长度为412个氨基酸，其中第1-49位为信号肽，第50-207位为IL24，第215-405位为Bax蛋白编码序列，第406-411位为6his标签序列。
实施例4
PGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH融合基因真核表达载体的构建
pcDNA3.1-IL24LBH经Xbal/HindIII双酶切，获得IL24LBH片段(1236bp)。将该片断克隆入PGL3-10HRE/VEGF385-SV40promoter的883-2119位点，酶切鉴定并命名为PGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH(图15)。
实施例5
pAd-10HRE/VEGF385-IL24LBH融合基因腺病毒载体的构建
将pGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH用Kpn I/Sal I双酶切消化，获得片段约2.3kb(10HRE/VEGF385启动子+SV40Promoter+IL24LBH+Poly A)克隆入pShuttle载体(购自Quantum Biotech公司)，挑选kanr克隆，酶切鉴定正确后，用PmeI酶切成线性质粒，回收纯化，与Adeasy-1骨架(购自Quantum Biotech公司)同源重组(电穿孔)转染BJ5183大肠杆菌(购自Quantum Biotech公司)，筛选最小的kanr克隆，酶切鉴定正确后转染DH5a稳定表达，并命名为pAd-10HRE/VEGF385-IL24LBH。
实施例6
Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH包装293细胞、扩增并纯化
转染操作步骤按Lipofectamine产品说明书(购自GIBCO公司)进行。293细胞在T-25培养瓶中培养至汇合度为50-70％时，将实施例5中制备的重组腺病毒载体pAd-10HRE/VEGF385-IL24LBH经PacI酶切线性化，转染过夜，将293细胞均匀分配到6孔板内，贴壁6h后吸去孔内培养液，沿着侧壁缓慢加入1％SeaPlaque琼脂糖(购自Cambrex公司，用5％DMEM配制)，覆盖细胞层。于CO2孵箱内继续培养，每4天加铺1％SeaPlaque琼脂糖(1.5ml/孔)，并观察噬班形成情况。挑选独立的噬班，分别感染293细胞，继续培养，直至出现完全的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。通过离心收集上清，即为首次扩增的病毒储存液。
经293细胞包装并鉴定的重组腺病毒取名为Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH。-80℃贮存。
接种293细胞到T-75培养瓶，待细胞长至90％汇合率时，用相当于MOI＝5-10的病毒上清量感染，培养4d后收集细胞，反复冻融(-20℃冻/37℃融)4次，取1/3病毒上清再感染293细胞，大量扩增，4d后再收集细胞，反复冻融4次，如此循环进行扩增直到重组腺病毒第4代为止。扩增的病毒用CsCl2密度梯度离心纯化，用等体积的2×贮存缓冲液混合，分装后贮存于-80℃。
实施例7
Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH的感染性滴度(TCID50)检测
在本实施例中，按照快速腺病毒感染性滴度(TCID50)检测试剂盒(购自北京本元正阳公司)说明书进行操作。Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH样品在不同稀释度下于HEK293细胞中形成CPE，通过CPE形成的稀释度及细胞病变的孔数测定所得样品的感染性滴度为4×109。
实施例8
IL24-Bax蛋白在肝癌细胞的表达情况
接种PLC/PRF/5细胞(人肝癌细胞株，购自上海中科院细胞所)6孔板，5×105个/孔，于37℃、5％CO2孵箱内培养24h至细胞汇合率约70％。依照试剂盒提供的Lipofectin瞬时转染说明书分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24、pcDNA3.1-IL24-Bax和PGL3-SV40promoter vector、PGL3-10HRE/VEGF385-SV40promoter、PGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH。以相同条件转染pcDNA3.1/CT-GFP并在荧光显微镜下观察以检测转染率。细胞爬片采用免疫化学染色方法分别对IL-24和Bax进行蛋白定位，并收集细胞总蛋白用RIPA缓冲液制备细胞蛋白裂解液，以Bio-Rad公司的蛋白分析系统测定蛋白浓度，之后采用Western blot方法鉴定经转染、筛选的PLC/PRF/5细胞克隆表达重组蛋白的情况，抗体为IL-24抗体和Bax抗体(Pharmingen，SanDiego，CA，USA)，用ECL显色。
重组质粒瞬时转染PLC/PRF/5细胞，转染率可达到40％左右。
细胞免疫化学染色显示(见图1)，IL-24和Bax蛋白着棕黄色，均匀分布在部分转染细胞的细胞质中。
Western blot检测结果表明(见图2)，空载体pcDNA3.1、PGL3-SV40promoter vector和PGL3-10HRE/VEGF385-SV40promoter转染细胞不表达任何目的蛋白，pcDNA3.1-IL-24、pcDNA3.1-IL24-Bax和PGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH转染细胞分别表达相应的目的蛋白。
表达的IL-24蛋白分子量约为24kDa，表达的Bax蛋白分子量约为23kDa，IL24-Bax融合蛋白分子量约为47kDa。
实施例9
缺氧诱导IL24-Bax蛋白表达
接种PLC/PRF/5细胞6孔板，5×105个/孔，于37℃、5％CO2孵箱内培养24h至细胞汇合率约70％。依照试剂盒提供的Lipofectin瞬时转染说明书转染PGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH48h后，然后分为两组：一组给予正常氧条件(95％air，5％CO2)；另一组给予缺氧条件(95％N2and5％CO2)。换无血清培养基继续培养4、8、16h，分别收集细胞蛋白，采用Western blot方法检测各组细胞中IL24-Bax蛋白的表达变化。
结果显示(见图3)，PGL3-10HRE/VEGF385-IL24LBH转染细胞在缺氧条件下IL24-Bax蛋白的表达量明显高于不缺氧条件下的感染细胞，并随缺氧时间延长而增加。
实施例10
IL24-Bax蛋白诱导肝癌细胞株生长抑制
将PLC/PRF/5制备成单细胞悬液，计数，按每孔2.5×104个细胞接种到24孔板内。将上述细胞分成4组：空白对照组、载体对照组、IL-24组和IL24-Bax组，每组4孔，依照试剂盒提供的Lipofectin瞬时转染说明书进行转染。其中载体对照组、IL-24组和IL24-Bax组分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24和pcDNA3.1-IL24-Bax，空白对照组除不加质粒外其余的操作与其他3组相同。各组于转染后24、48、72和96h分别取出1孔细胞，弃细胞培养液，胰酶消化，台盼蓝染色，血细胞计数仪计数，取3次实验结果的平均值，最后以培养时间为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
结果如图4和表1所示。不同实验组、不同时间点细胞生长的差别都有统计学意义，而且实验组和时间点之间的交互作用差别也有统计学意义(P<0.05)，提示IL-24和IL24-Bax异位表达后能显著抑制人肝癌细胞PLC/PRF/5生长增殖，并且IL24-Bax的作用强于IL-24。
表1 台盼蓝染色计数法检测各组活细胞数(×104)
实施例11
IL24-Bax蛋白诱导肝癌细胞株凋亡
将PLC/PRF/5细胞按5×105个/孔的密度接种到已放置玻片的6孔板内，共接种4孔，培养过夜。依照试剂盒提供的Lipofectin转染说明书进行转染，其中3孔分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL24和pcDNA3.1-IL24-Bax，余1孔作空白对照，除不加质粒外其余的操作与其他3孔相同。转染后继续培养72h，将制备的细胞爬片取出固定、脱水后，依照Fluorescein-FragELTMDNA Fragmentation Detection试剂盒(购自Oncogene公司)说明书标记细胞，然后在荧光显微镜下观察分析。在400×视野下选择阳性细胞分布均匀的区域，连续计数300个细胞，并计数其中发荧光的阳性细胞，重复3次。在培养瓶内接种1×106个细胞，培养过夜，分别用不同的重组蛋白处理并培养一定时间后，胰蛋白酶消化，收集、洗涤、固定细胞，然后依照试剂盒说明书用荧光素细胞死亡检测试剂(Promega，USA)对细胞进行标记，上流式细胞仪分析。
结果如图5和表2所示。PLC/PRF/5瞬时转染pcDNA3.1-IL-24和pcDNA3.1-IL24-Bax后均出现明显的凋亡征象，并且IL24-Bax组比IL-24组更明显，而空白组和空载体组则无明显的凋亡征象。除空白组和空载体组差别无统计学意义(P>0.05)外，IL-24组和IL24-Bax组与其余3组的差别均有统计学意义(P<0.05)，提示IL-24和IL24-Bax均能诱导PLC/PRF/5细胞凋亡，但后者作用强于前者。
表2 TUNEL法检测各组细胞的凋亡率(％)
实施例12
Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH对肝癌细胞的感染率
随着MOI增加，Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH对人肝癌细胞PLC/PRF/5的转染率逐渐提高，呈明显的剂量-效应关系。当MOI大于25时，对细胞的转染效率可达90％以上。由于腺病毒对细胞有一定毒性，故选择的MOI值为25。用Ad.vector、Ad.IL-24和Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH分别感染细胞48h后，收集细胞蛋白，采用Western blot方法检测各组细胞中融合蛋白的表达变化。
结果如图6所示。用Bax抗体检测证实，Ad.10HRE/VEGF385-IL24LBH感染细胞有IL24-Bax融合蛋白表达，分子量约为47kDa，而其余三组均未检测到表达；用IL-24抗体检测证实，Ad.IL-24感染细胞有IL-24蛋白表达，分子量约为24kDa，Ad.10HRE/VEGF385-IL24LBH感染细胞有IL24-Bax融合蛋白表达，分子量约为47kDa，而未经病毒感染和Ad.vector感染细胞未检测到表达。
在以下实施例中，Ad.vector表示腺病毒空载体；Ad.IL-24表示表达IL24的腺病毒；Ad.10HRE/VEGF385-IL24LBH表示表达IL24-Bax融合蛋白的腺病毒，其中IL24-Bax融合蛋白在缺氧诱导启动子10HRE/VEGF385的调控下。
实施例13
缺氧条件下Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH感染细胞的表达情况
将PLC/PRF/5细胞按5×105个/孔的密度接种到6孔板，待细胞贴壁后，以MOI为25的Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH感染细胞48h，然后分为两组：一组给予正常氧条件(95％air，5％CO2)；另一组给予缺氧条件(95％N2and5％CO2)。换无血清培养基继续培养4、8、16h，分别收集细胞蛋白，采用Western blot方法检测各组细胞中融合蛋白的表达变化。
结果显示(见图7)，Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH感染细胞在缺氧条件下融合蛋白的表达量明显高于不缺氧条件下的感染细胞，并随缺氧时间延长而增加。
实施例14
Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH选择性诱导肝癌细胞生长抑制
(1)细胞病变效应实验(cytopathic effect，CPE)
培养肝癌细胞和正常肝细胞至对数生长期，接种24孔板，5×106细胞/孔，培养24h后换用无血清培养液，分别加入Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH，各孔MOI分别为0、0.01、0.1、1、10、100。放回CO2孵箱内，每15min轻摇1次。2h后换用5％血清培养液，继续培养7d，每日观察细胞生长情况。吸出培养液，PBS液体清洗2次，中性甲醛固定10min，龙胆紫固定。
实验结果显示，Ad.vector感染细胞，无论是人肝癌细胞株还是正常人肝细胞株，只有MOI值达到100时，才有部分细胞死亡。Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH分别处理人肝癌细胞株BEL-7402、HepG2、PLC/PRF/5，杀伤力均很强。当MOI值为1时，大部分细胞已死亡。当MOI值为10时，即可杀灭全部细胞。Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH分别处理正常人肝细胞株L02，在MOI值小于10的范围内，并没有随MOI值提高而表现出死亡增加的趋势。只有MOI值达到100时，才有部分细胞死亡。
(2)四氮唑蓝(MTT)细胞活力测定
培养细胞至对数生长期，接种96孔板，104细胞/100μl/孔，培养24h。加入100μl含Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH的无血清培养液，使各孔MOI分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、250、500、1000。每个MOI值设4个复孔。继续培养5d。弃去培养液，每孔加入100μl无血清培养液和20μlMTT溶液(5mg/ml)，于37℃孵育5h。然后小心吸去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，振荡10min，充分混合。最后用微板读数仪在570nm波长下测定各孔光吸收值，计算细胞存活率(细胞存活率＝实验组A值/对照组A值×100％)，并绘制出细胞生长曲线。同时计算细胞生长抑制率，抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％，并用SPSS统计软件包的概率单位法(Probit)计算细胞半数抑制浓度(IC50)。
结果如图8A、8B、8C和8D所示。当给予MOI值为0.1的Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH感染时，人肝癌细胞株BEL-7402、PLC/PRF/5、HepG2即开始出现增殖减缓、生长抑制的变化，随着MOI值增高，细胞生长受到明显抑制。而正常人肝细胞株L02经相同处理后，在MOI值小于10的范围内，其生长曲线趋势无明显变化。但是，Ad.vector感染细胞，无论是人肝癌细胞株还是正常人肝细胞株，其生长曲线趋势基本相似，在MOI值小于10的范围内均无明显变化。因此，Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理均可以选择性诱导体外培养的肝癌细胞株生长抑制。同时，Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理对肝癌细胞生长的半数抑制量IC50显著低于Ad.vector感染，并且Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH对3株人肝癌细胞生长抑制作用的敏感性相近。
表3病毒感染对不同细胞生长抑制的半数抑制量IC50(MOI)
实施例15
Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH选择性诱导肝癌细胞的凋亡作用
用MOI为10的Ad.vector、Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH分别处理人肝癌细胞株BEL-7402、PLC/PRF/5、HepG2和正常人肝细胞株L0296h，分别用胰酶-EDTA消化，离心收集细胞，洗后酒精固定，碘化丙啶(PI)染色30min，调整细胞浓度，然后上机分析。在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片。
结果显示(表4)，3株肝癌细胞用Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理后凋亡数量均高于Ad.IL-24处理细胞(P<0.05)；且Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理的3株肝癌细胞凋亡率均显著高于Ad.vector处理，具有统计学差异(P<0.01)。正常肝细胞用Ad.IL-24、Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理后细胞凋亡率高于Ad.vector处理，但差异没有统计学意义(P>0.05)。
表4病毒感染细胞的凋亡细胞百分率(％)
实施例16
瘤内注射Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH治疗肝癌裸鼠模型：
裸鼠购自中科院上海实验动物中心。先在SPF级动物实验室饲养观察裸鼠1周。将HepG2细胞悬液分别皮下接种于裸鼠背部，每个裸鼠接种100μl(5×106个细胞)。每天观察裸鼠体质量和肿瘤形成情况。5d后在接种区皮下开始出现结节，待肿块长至直径4-5mm时进行治疗试验。挑选20只肿块大小相近(直径4-5mm)的肝癌裸鼠进行平均分成Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH治疗组、Ad.IL-24治疗组和Ad.vector对照组。采用瘤内单点注射的方法，剂量为每个肿瘤2×108pfu/100μl。间隔3d注射1次，共3次。在第一次注射后3周采取后颈椎脱位处死裸鼠，连同包膜无菌剥出完整肿瘤组织，电子天平称瘤质量，游标卡尺测量瘤结节最长径(a)、最短径(b)，按公式V＝0.5×a×b2计算瘤体积。照相后浸入生理盐水漂洗，10％多聚甲醛固定，备用。
(1)Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理肝癌裸鼠对肿瘤大小的影响
皮下接种HepG2细胞后5d可在接种部位扪及大小约3mm的皮下结节，待肿块长至直径4-5mm时进行治疗试验。通过瘤内注射给予病毒后，可观察到Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH治疗组、Ad.IL-24治疗组大多数肿瘤比Ad.vector对照组肿瘤生长速度缓慢，3w后取出肿瘤并仔细测量每个肿瘤的最大径和最小径，计算肿瘤体积。结果显示(见表5)，Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH治疗组、Ad.IL-24治疗组的肿瘤体积和质量明显较Ad.vector对照组小，且Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH治疗组与Ad.IL-24治疗组的肿瘤体积和质量也具有统计学差异(P<0.05)。
表5病毒处理后各组肝癌裸鼠的肿瘤大小比较
(2)肿瘤组织病理切片HE染色
按常规方法制作病理切片，HE染色，在光镜下检查肿瘤组织结构。HE染色病理切片显示(见图9)，在裸鼠皮下接种形成的肿瘤组织中可见大量纤维间隔形成，肿瘤细胞核大深染，分裂像不规则。Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH和Ad.IL-24处理后肿瘤细胞形态不同于Ad.vector处理，细胞核浓缩明显。
(3)肿瘤组织IL-24蛋白的表达
依照S-P法免疫组化试剂盒说明书进行操作。IL-24抗体免疫组织化学染色结果显示(见图10)，在Ad.IL-24和Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理的肿瘤组织内，大多数肿瘤细胞深染棕黄色，均匀分布在胞浆内，表明高表达IL-24蛋白。而Ad.vector处理的肿瘤组织未着棕黄色，不表达IL-24蛋白。
(4)TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡
将肿瘤组织病理切片固定、脱水后，依照Fluorescein-FragELTMDNA FragmentationDetectionKit说明书标记细胞，然后在荧光显微镜下观察分析。在400×视野下选择阳性细胞分布均匀的区域，连续计数300个细胞，并计数其中发荧光的阳性细胞，重复3次，计算凋亡细胞所占的百分比和标准差。
结果显示(见图11和表6)，Ad.IL-24和Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理可引起广泛的凋亡征象，如胞浆减少、体积变小、核固缩、碎裂、荧光显微镜下反光增强等。而Ad.vector处理并未见广泛的凋亡征象。Ad.IL-24和Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理后裸鼠肝癌组织的凋亡率显著高于Ad.vector处理(P<0.01)，且Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理组凋亡率高于Ad.IL-24处理组(P<0.05)。
表6TUNEL法检测裸鼠肝癌的凋亡率(％)
(5)肿瘤组织凋亡蛋白caspase-3表达
依照EliVisionTM plus检测试剂盒(购自Zymed公司)说明书进行操作。第一抗体为兔抗人活化caspase-3多克隆抗体(可用于鼠活化caspase-3抗原的检测)，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，结果判断：在显微镜400×视野下选择阳性细胞分布均匀的区域，连续计数300个细胞以及其中染成棕黄色颗粒的阳性细胞，重复3次，计算阳性细胞所占的百分比和标准差。
活化形式的caspase-3特异性抗体免疫组织化学染色结果显示，染色阳性信号为细胞质或细胞核内出现棕黄色颗粒。在Ad.IL-24和Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理的肿瘤组织广泛深染棕黄色，表明caspase-3大量活化。而Ad.vector处理的肿瘤组织只有少量着色(见图12和表7)。Ad.IL-24和Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理后阳性细胞率明显高于Ad.vector处理(P<0.01)，且Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理后阳性细胞率高于Ad.IL-24处理组(P<0.05)。
表7活化的caspase-3细胞阳性率(％)
(6)肿瘤组织细胞增殖相关抗原ki-67表达
依照EliVisionTMplus检测试剂盒(购自Zymed公司)说明书进行操作。第一抗体为兔抗人ki-67单克隆抗体(可用于鼠ki-67抗原的检测)，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，参照阳性对照和阴性对照。每例随机观察5个高倍视野(×400)，每个视野连续计数200个肿瘤细胞，同时计数其中的阳性细胞数，再计算5个高倍镜的平均阳性细胞率，作为细胞增殖指数(proliferation index，PI)。
染色结果显示(见图13和表8)，ki-67主要定位于细胞核，阳性表现为核呈棕色。在Ad.vector处理的肿瘤组织内，大多数肿瘤细胞呈阳性，表现为细胞核深染棕黄色，说明肿瘤细胞增殖活跃。而Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理的肿瘤组织内，ki-67阳性细胞明显较Ad.IL-24处理组减少，细胞增殖受到抑制。
表8细胞增殖相关抗原ki-67表达细胞阳性率(％)
(7)肿瘤组织微血管密度(MVD)依照EliVisionTMplus检测试剂盒(购自Zymed公司)说明书进行操作。第一抗体为兔抗鼠CD31多克隆抗体，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，按照Weidner[47]等建立的人工计数方法，在低倍视野下扫视整个肿瘤组织切片，选择最密集的微血管标记区。确定微血管密集区后，在400×视野下计数所有微血管数。与邻近的微血管、肿瘤细胞及其他结缔组织成分不相连、标记清晰的内皮细胞或内皮细胞串均作为一个可计数的微血管。有较厚肌壁的大血管排除在计数范围之外。血管腔及腔内红细胞不是确定微血管的必要条件。记录5个视野内的微血管数，取其平均数作为该肿瘤的MVD值。
检测结果显示(见图14和表9)，所有肿瘤组织均有CD31标记的血管内皮细胞。内皮细胞被染成棕黄色，微血管有的形成管腔，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇。肿瘤边缘组织的MVD高于中央。Ad.IL-24和Ad5.10HRE/VEGF385-IL24LBH处理的肝癌组织内新生血管化明显低于Ad.vector对照组(P<0.01)。
表9肿瘤组织微血管密度(MVD)
实施例17
药物组合物
按制药领域中常用的混合法配制以下药物组合物。
(a)单用IL24-Bax融合蛋白的配方：
| 白蛋白1％ | 1g/100ml |
| 甘露醇5％ | 5g/100ml |
| 吐温800.02％ | 20mg/100ml |
| IL24-Bax融合蛋白* | 1mg/ml |
注：IL24-Bax融合蛋白为原核表达重组蛋白(rhIL24LBH)或真核表达重组蛋白(rhIL24LBH)，所述蛋白纯度(HPLC法测定)：>95％
(b)单用重组腺病毒(Ad5-10HRE/VEGF385-IL24LBH)的配方
| 吐温800.02％ | 20mg/100ml |
| Ad5-10HRE/VEGF385-IL24LBH | 4×109(TCID50/ml) |
其中所述的重组腺病毒(Ad5-10HRE/VEGF385-IL24LBH)为5型重组腺病毒，复制缺陷型，E1、E3缺失；物理滴度(v.p./ml)：2×1011；感染性滴度(TCID50/ml)：4×109；纯度(HPLC法测定)：100％。
rhIL24LBH抗血清产品说明书
免疫动物：雄性新西兰兔
抗血清效价：1：20
保存条件：-70℃
注意事项：避免反复冻融，避免-20度长期保存。
实施例18
制备抗IL24-Bax蛋白抗体
将实施例3中获得的重组IL24-Bax蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀IL24-Bax基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明的IL24-Bax融合蛋白发生结合。
讨论
IL-24/Bax融合蛋白对肿瘤细胞具有叠加或放大的选择性杀伤作用
目前对Bcl-2家族成员促凋亡的机制已比较清楚。现有的研究表明，Bax杀伤癌细胞的机制与DT不同，尽管它们的结构比较相似。Bax可引起细胞线粒体外膜通透，直接导致细胞色素C等凋亡分子从线粒体膜间隙释放出来。人们熟知的肿瘤抑制蛋白p53的一个主要抗肿瘤反应正是通过Bax和其它Bcl-2家族成员激活线粒体介导的凋亡。由于大多数肿瘤类型均有p53基因突变，从而削弱了肿瘤细胞内Bax和其它家族成员的活化。因此，肿瘤细胞丧失了一个通常能够核查自身的重要凋亡机制。在免疫毒素中应用Bax则可以提供一个再活化重要促凋亡蛋白的方法，从而直接参与启动原由于p53基因突变而沉默的线粒体介导的凋亡。
至于IL-24，尽管其选择性诱导肿瘤凋亡的作用早在几年前就已无可争议，但由于MDA-7只是在新近才被确认为分泌性细胞因子，因此对其作用机制和相关通路尚缺乏了解。不过，现已明确的是，IL-24对肿瘤细胞产生的生长抑制效应是由分泌性蛋白通过2个明确的受体亚单位转导信号的，并且有研究表明，这种效应不依赖于靶细胞内p53、p16、RB、Bax和caspase3等肿瘤抑制基因和凋亡相关基因的状况。因此，IL-24诱导肿瘤凋亡的作用机制和分子基础与Bax可能完全不同。
为了进一步提高效果，本发明人还选用了适合诱导缺氧细胞和肿瘤细胞中特异基因的表达的启动子。一种优选例就是HRE/VEGF385启动子。
几乎所有实体瘤都存在病理性缺氧区。处于这种异常环境中的肿瘤细胞往往对化疗和放疗具有很高的耐受性，因此缺氧也被视为肿瘤治疗的主要障碍。缺氧状态下的肿瘤细胞可导致肿瘤衍生的血管内皮生长因子(VEGF)表达增高并刺激血管生成，无论在体外或是体内，VEGF在实体肿瘤发生和血管生成中的关键作用已为实验所证明，VEGF表达主要受微环境因素如缺氧，酸中毒和低血糖症等调节，但缺氧是引起VEGF表达提高的最主要原因。在缺氧条件下缺氧诱导因子HIF-1表达增加，充当着VEGF5’侧区缺氧反应元件(HRE)的反式作用因子，激活VEGF基因表达。目前大量相关研究已表明[23-26]，在VEGF的启动子区插入多个拷贝的HRE位点可以加强靶细胞对缺氧的敏感性和特异性，并能使该启动子调控下的基因表达增高。HRE最早是从红细胞生成素和VEGF中分离出来的，现在已经被用于调控多种基因，如：自杀基因、凋亡基因在缺氧肿瘤细胞中的表达，并增强对肿瘤的杀伤力。
在本发明中，将IL-24和Bax这两个原本互不相干、均具有强大促凋亡活性而作用机制可能不同的分子构建一个细胞毒素样嵌合蛋白IL-24/Bax，其中IL-24还作为靶向性配体。
上述实验表明，这种新型细胞毒素被应用于肿瘤靶向性治疗具有以下特点：(1)能被肿瘤细胞内在化，将原本无法进入细胞的Bax带进肿瘤细胞；(2)对肿瘤特异性强，对正常器官和组织毒性小；(3)扩大凋亡细胞谱，具有叠加或放大杀伤肿瘤细胞的作用；(4)无免疫原性，不受用药剂量的限制；(5)与化疗或放疗联合应用不仅可进一步提高疗效，而且可减轻化、放疗引起的毒副反应。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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序列表
<110>中国人民解放军第二军医大学
<120>一种新的重组融合分子及其抗肿瘤治疗作用
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<170>PatentIn version3.1
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<223>10HRE/VEGF385片段
<400>17
Claims (11)
1.一种融合蛋白，其特征在于，它由以下部分组成：
(a)白介素-24元件，所述白介素-24元件为全长人白介素-24，或其序列如SEQ ID NO：4的第2-207位或第50-207位所示；
(b)Bax蛋白元件，所述Bax蛋白元件为全长人Bax蛋白，或其序列如SEQ IDNO：2的第2-192位所示；以及
(c)位于所述白介素-24元件和所述Bax蛋白元件之间的连接肽序列，所述连接肽序列的长度为1-20个氨基酸；
其中所述白介素-24元件位于N端而所述Bax元件位于C端。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由SEQ ID NO：6中第1-411位，第1-405位，第50-405位，或第50-411位所示的氨基酸序列组成。
3.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的融合蛋白。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的DNA分子。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体还含有可操作地连于所述融合蛋白的编码序列的缺氧诱导型启动子。
8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
9.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：
在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
10.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1所述的融合蛋白或权利要求5所述的载体。
11.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求5所述的载体的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130313 Termination date: 20190511 |