CN102633883B - 一种能与egfr、her2、vegf高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途 - Google Patents
一种能与egfr、her2、vegf高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种能与EGFR、HER2、VEGF高效结合的融合蛋白、其编码核苷酸序列及在治疗恶性肿瘤中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及其用途。更具体地说，本发明涉及一种能与EGFR、HER2、VEGF高效结合的融合蛋白、其编码核酸及在制备用于治疗恶性肿瘤的药物或基因治疗药物中的应用。
背景技术
单克隆抗体靶标明确，临床应用安全性好、疗效明显，目前共有10个肿瘤单克隆抗体经美国FDA批准上市销售，已成为多种类型恶性肿瘤治疗的一线药物。然而，全长抗体分子量大，不易进入实体瘤组织，难以在肿瘤内部达到有效治疗浓度，从而发挥抗肿瘤疗效。另一方面，肿瘤是由异质性细胞群体组成，单一靶点的治疗只针对一部分肿瘤细胞发挥疗效，而其它肿瘤细胞则可能逃脱治疗，成为肿瘤复发的根源。因而，非常必要研制分子量小、多靶点的类抗体蛋白药物。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)常在恶性肿瘤细胞中过表达，是肿瘤治疗的重要靶标。EGFR家族包括4个成员，分别为EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4，它们在多种类型肿瘤细胞中异常过量表达，与肿瘤的增殖与转移紧密相关(Nature.2001；411(6835)：355-65)。VEGF有促进血管生成的作用，肿瘤细胞可大量分泌VEGF，诱导肿瘤组织新生血管的生成，使肿瘤体积快速扩张(Nat Med.1999；5(12)：1359-64)。
Herstatin是EGFR家族信号通路的天然抑制因子，由HER2mRNA在转录后加工过程中选择性剪接形成的异构体所编码，其蛋白序列由HER2胞外区前两个结构域及Her2基因的第8个内含子所编码79个氨基酸所构成(Proc Natl Acad Sci U S A.1999；96(19)：10869-74)。Herstatin能与EGFR和HER2高亲和力结合，抑制EGFR家族成员形成异源或同源二聚体，降低受体酪氨酸磷酸化水平，抑制肿瘤细胞生长。研究表明，Herstatin C末端的79个氨基酸(HERIN)也具有与EGFR及HER2高效特异结合的特性(FEBS Lett.2004；568(1-3)：163-6)。VEGFR1(Vascular endothelial growth factor receptor 1，也称作FLT-1)，VEGFR2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，也称作KDR)是VEGF的受体。研究表明，Flt-1或KDR的胞外区多肽可在体外阻断VEGF信号通路，抑制血管内皮细胞的生长(Cancer Res.2002；9(8)：633-40)。通过基因工程技术，将Flt-1与KDR胞外区段中的某些特定免疫球蛋白样(Ig样)结构域(如Flt-1的第2Ig样结构域Flt1-D2，KDR的第3Ig样结构域KDR-D4)融合，也可有效阻断细胞VEGF信号通路(Proc Natl Acad Sci US A.2002；99(17)：11393-8.GeneTher.2009；16(1)：10-6)。然而，目前仍不存在能同时抑制EGFR、HER2、VEGF三条信号通路的蛋白类抑制分子。
发明内容
本发明涉及一种能与EGFR、HER2、VEGF高效结合的融合蛋白、其编码核酸及其在制备用于治疗恶性肿瘤的药物或基因治疗药物中的应用。具体而言，本发明包括以下内容：
本发明的第一方面涉及一种融合蛋白，其特征在于包含X、Y、Z三个来源的肽段，其中：
X为单拷贝或多拷贝的如SEQ ID NO：1所示的包含人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列且能高效结合EGFR与HER2的多肽；优选地，所述的多拷贝为双拷贝；
Y为SEQ ID NO：3所示的包含VEGF受体FLT-1的胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段序列或/和SEQ ID NO：5所示的KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段序列且能高效结合VEGF的多肽；
Z为包含人类免疫球蛋白的Fc段的多肽。
本发明第一方面所述的融合蛋白，其特征在于，所述的X、Y、Z的连接顺序为X、Y、Z依次连接，或者按照Y、X、Z的顺序连接，所述的连接是按照N末端向C末端的次序连接；
优选地，所述融合蛋白的X、Y可同源串联重复或间隔串联重复。
本发明第一方面所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的X、Y、Z可直接相连，或通过1个或多个spacer相连。
本发明第一方面所述的融合蛋白，其氨基酸序列包含选自SEQ IDNO：15至SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
本发明第一方面所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽X为包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列且能高效结合EGFR与HER2的多肽，或者为包含SEQ ID NO：1所示的经过1个或数个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加形成的氨基酸序列且能高效结合EGFR与HER2的多肽。
本发明第一方面所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽Y为包含SEQ ID NO：3或/和SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列且能高效结合VEGF的多肽，或者为包含SEQ ID NO：3或/和SEQ ID NO：5所示的经过1个或数个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加形成的氨基酸序列且能高效结合VEGF的多肽。
本发明第一方面所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽Z选自人类免疫球蛋白IgG各亚型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或者IgM、IgA的全长Fc段，或者Fc铰链区、CH2、CH3中的部分区段。
本发明第一方面所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽Z可选自人类免疫球蛋白IgG各亚型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或者IgM、IgA的Fc经过1个或数个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加形成的肽段。
本发明的第二方面涉及一种核酸，其特征在于编码本发明所述融合蛋白。
本发明第二方面所述的核酸，其特征在于其序列包含选自SEQ IDNO：25至SEQ ID NO：34的核苷酸序列或其简并性序列。
本发明的第三方面涉及一种载体，其可操作地连接有本发明所述的核酸。
本发明第三方面所述的载体，其中所述的载体选自质粒、重组病毒(例如重组腺病毒或重组腺相关病毒)、噬菌体，优选地，其中所述的质粒为真核表达质粒或原核表达质粒，例如pCDNA3.1、pDC315、pAAV-MCS。
本发明的第四方面涉及一种制备本发明所述的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
a.根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列，合成表达框；
b.将步骤a获得的表达框插入合适的载体，转化到合适的宿主细胞中，提取并纯化质粒；
c.将纯化后的质粒转染至合适的细胞，培养扩增转染细胞，收集培养物上清，经纯化获得融合蛋白；
优选地，步骤b中所述的合适的载体选自质粒、重组病毒(例如重组腺病毒或重组腺相关病毒)、噬菌体，优选地，其中所述的质粒为真核表达质粒或原核表达质粒，例如pCDNA3.1、pDC315、pAAV-MCS；
优选地，步骤b中所述的合适的宿主细胞为细菌或真菌，例如E.coli(例如DH5α)；
优选地，步骤c中所述的合适的细胞为真核表达宿主细胞，例如293细胞(胚肾细胞，购自美国典型物保藏中心，ATCC)。
本发明的第五方面涉及一种药物组合物，其包含本发明所述的融合蛋白或所述的核酸，任选地，该组合物还含有药学上可接受的载体、辅料或赋形剂。
本发明第六方面涉及所述的融合蛋白或核酸或载体或药物组合物用于制备抗肿瘤药物或转基因治疗药物的用途。
上述用途中，所述的肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。
在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白的结构示意图如图1所示。它们由Herstatin、Flt-1、KDR、人IgG1 Fc段的编码DNA通过基因工程技术构建获得。其中Sp1、Sp2分别是Spacer1与Spacer2的简写。其中：
EVP1：由HERIN、Flt1-D2、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP2：由Flt1-D2、HERIN、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP3：由HERIN、KDR-D3、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP4：由KDR-D3、HERIN、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP5：由HERIN、Flt1-D2、HERIN、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP6：由Flt1-D2、HERIN、KDR-D3、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP7：由HERIN、HERIN、Flt1-D2、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP8：由HERIN、Flt1-D2、KDR-D3、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP9：由HERIN、KDR-D3、HERIN、Flt1-D2、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
EVP10：由HERIN、HERIN、KDR-D3、Flt1-D2、人IgG1 Fc段依次通过蛋白Spacer连接构成。
在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白EVP1，EVP3，EVP7，EVP9用于治疗小鼠体内的肝癌移植瘤或用于制备治疗肝癌移植瘤的药物。
在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白EVP1，EVP3，EVP7，EVP9用于治疗小鼠体内的卵巢癌移植瘤，或用于制备治疗卵巢癌移植瘤的药物。
发明详述
如上文所述，本发明涉及一种能与EGFR、HER2、VEGF高效结合的融合蛋白、其编码核苷酸序列及其在制备用于治疗恶性肿瘤的药物或基因治疗药物中的应用。
本发明中术语“EGFR”是指人类表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor)，又简称为ERBB1或HER1，NCBI基因库的官方ID号为1956，对应蛋白序列编号有NP_005219.2，NP_958439.1，NP_958440.1，NP_958441.1。
本发明中术语“HER2”是指人类表皮生长因子受体家族的第2个成员(v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2)，NCBI的官方简称为ERBB2，gene ID号为2064，对应蛋白序列编号有NP_004439.2，NP_001005862.1。
本发明中术语“VEGF”是指人类血管生长因子A(vascularendothelial growth factor A)，NCBI官方简称为VEGFA，gene ID号为7422，对应蛋白编号有NP_001020537.2、NP_003367.4、NP_001020538.2、NP_001020539.2、NP_001020540.2、NP_001020541.2、NP_001028928.1、NP_001165093.1、NP_001165094.1、NP_001165095.1、NP_001165096.1、NP_001165097.1、NP_001165098.1、NP_001165099.1、NP_001165100.1、NP_001165101.1、NP_001191313.1、NP_001191314.1。
本发明中术语“Flt-1”是指人类血管生长因子受体1，NCBI官方全称为fms-related tyrosine kinase 1(vascular endothelial growthfactor/vascular permeability factor receptor)，又简称为VE GFR1，基因ID号为2321，对应蛋白编号有NP_002010.2、NP_001153392.1、NP_001153502.1、NP_001153503.1。
本发明中术语“KDR”是指人类血管生长因子受体2，NCBI官方全称为kinase insert domain receptor(a type III receptor tyrosinekinase)，又简称为VEGFR2，基因ID号为3791，对应蛋白编号有NP_002244.1。
本发明中术语“Herin”是指人类Her2的第8个内含子中编码Herstatin的C末端79个氨基酸的DNA序列。
本发明中术语“胞外区”是指膜蛋白位于细胞外的区段。
本发明中术语“结构域”是指蛋白质生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，常见结构域的氨基酸残基数在100～400个之间，最小的结构域只有40～50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。
本发明中术语“免疫球蛋白样结构域”是指该结构域可形成类似于免疫球蛋白的空间结构。
本发明中术语“同源串联重复”是指以一个氨基酸残基多肽为单元重复1次以上。
本发明中术语“间隔串联重复”是指一种氨基酸残基多肽后连接另一种氨基酸残基多肽，或以此为单元重复1次以上。
本发明中术语“Spacer”是指一段多肽，其作用是使两段相邻的肽段序列在空间结构上互不干扰。
本发明术语“简并性”是指，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象。
本发明所述的“高效结合EGFR、HER2、VEGF”是指亲和力常数Kd小于9.9×10-7mol/L，优选小于9.0×10-8mol/L，进一步优选小于2.0×10-8mol/L，更进一步优选5.0×10-9mol/L、特别优选小于7.0×10-10mol/L，最优选小于6.0×10-10mol/L。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的X为单个HERIN(人类Her2的第8个内含子编码的Herstatin的C末端79个氨基酸)。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的Y为Flt-1单个第2结构域肽段(Flt1-D2)。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的Y为KDR单个第3结构域肽段(KDR-D3)。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的X为HERIN，且重复2次。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的Y为单个Flt-1第2结构域肽段与单个KDR第3结构域肽段的异源组合。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的X与Y为同源串联重复。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的X与Y为间隔串联重复。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的X，Y，Z分别通过蛋白Spacer1(SEQ ID NO：11)与Spacer2(SEQ ID NO：13)连接。
在本发明的一个实施方案中，构成融合蛋白的X，Y，Z部分通过蛋白Spacer1(SEQ ID NO：11)、Spacer2(SEQ ID NO：13)连接，部分直接相连。
在本发明中还例示性地公开了融合蛋白的实际用途。例如，用于治疗小鼠体内的肝癌SMMC-7721与卵巢癌SK-OV3皮下移植瘤。
在本发明中还例示性地公开了融合蛋白编码序列用于基因治疗的实际用途。例如，分别利用质粒、重组腺病毒、重组腺相关病毒作为载体携带融合蛋白编码基因，用于治疗小鼠体内的肝癌Hep3B、肺癌NCI-H460、乳腺癌Bcap-37皮下移植瘤。优选地，其中所述的质粒为真核表达质粒。
本发明的融合蛋白可以通过以下方法制备，该方法包括以下步骤：
a.根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列，合成表达框；
b.将步骤a获得的表达框插入合适的载体，转化到合适的宿主细胞中，提取并纯化质粒；
c.将纯化后的质粒转染至合适的细胞，培养扩增转染细胞，收集培养物上清，经纯化获得融合蛋白；
在一个具体的实施例中，该方法具体地包括以下步骤：
a.根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列，合成表达框；
b.将步骤a获得的表达框插入pCDNA3.1(+)载体EcoRI位点，转化到E.coli(DH5α)，提取并纯化质粒；
c.将纯化后的质粒转染至293细胞，培养扩增转染细胞，收集培养物上清，经纯化获得融合蛋白。
在一个具体的实施例中，步骤c中是利用Lipofectamine 2000将步骤b获得的质粒转染至293细胞中。
在一个具体的实施例中，步骤c中，转染后，优选转染1～4天后，进一步优选转染2或3天后，将转染后的293细胞转移到具有新霉素的DMEM培养基中，并通过有限稀释法将细胞克隆化。
在一个具体的实施例中，将上述克隆细胞，经筛选后，建立具有新霉素抗性的稳定转染相应表达载体的细胞株。而后，通过摇瓶培养大量扩增稳定转染细胞，收集培养物上清。优选地，其中所述的筛选，时间为18～24天，优选为19～22天，进一步优选为21天。
在一个具体的实施例中，步骤c中，其中所述的纯化采用凝胶过滤亲和层析法。
发明的有益效果
与现有融合蛋白相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将具有高效结合EGFR与HER2能力的多肽，与具有高效结合VEGF能力的多肽融合，使融合蛋白能同时与EGFR、HER2、VEGF结合，同时封闭肿瘤细胞过活化的EGFR、HER2、VEGF三条通路，抑制肿瘤细胞生长，并促进其死亡。同时融合了抗体Fc肽段，有助于延长融合蛋白的体内半衰期，增加抗体的“抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用”(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，提高融合蛋白的抗肿瘤效果。
本发明的融合蛋白可以用于制备抗肿瘤药物，用于制备治疗肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌的药物。
附图说明
图1：融合蛋白EVP1、EVP2、EVP3、EVP4、EVP5、EVP6、EVP7、EVP8、EVP9、EVP10的结构示意图。它们由Herstatin、Flt-1、KDR、人IgG1 Fc段的编码DNA通过基因工程技术构建获得。Sp1、Sp2分别是Spacer1与Spacer2的简写。
图2：融合蛋白EVP1、EVP2、EVP3、EVP4、EVP5、EVP6、EVP7、EVP8、EVP9、EVP10以及对照组HERIN多肽与VEGF的亲和力。
图3：融合蛋白EVP1、EVP2、EVP3、EVP4、EVP5、EVP6、EVP7、EVP8、EVP9、EVP10以及对照组HERIN多肽与EGFR胞外区的亲和力。
图4：融合蛋白EVP1、EVP2、EVP3、EVP4、EVP5、EVP6、EVP7、EVP8、EVP9、EVP10以及对照组HERIN多肽与HER2胞外区的亲和力。
图5：表示对照组(PBS、HERIN多肽)与治疗组(EVP1、EVP3、EVP7、EVP9)不同时间段肝癌SMMC-7721移植瘤体积统计分析结果。
图6：表示对照组(PBS、HERIN多肽)与治疗组EVP1、EVP3、EVP7、EVP9不同时间段卵巢癌SK-OV3移植瘤体积统计分析结果。
图7：表示携带融合蛋白(EVP1、EVP5)编码序列的质粒用于治疗小鼠体内肝癌Hep3B移植瘤的疗效统计结果。
图8：表示携带融合蛋白编码序列的重组腺病毒(EVP5、EVP9)用于治疗小鼠体内NCI-H460移植瘤的疗效统计结果。
图9：表示携带融合蛋白(EVP1、EVP5)编码序列的重组腺相关病毒用于治疗小鼠体内乳腺癌Bcap-37移植瘤的疗效统计结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于例示性说明本发明的具体实施方案，其不限制本申请的保护范围，任何本领域技术人员可以根据现有技术进行的等价的改良都包含在本申请的保护范围之内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：融合蛋白表达框的合成与表达载体的构建
根据融合蛋白各组分的氨基酸序列与编码序列，拼接成整个融合的氨基酸序列与编码DNA表达框，其中：
HERIN的氨基酸残基序列为：
GTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEG(SEQ ID NO：1)
HERIN的编码序列为：
GGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGC(SEQ ID NO：2)
Flt1-D2的氨基酸残基序列为：
GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT(SEQ ID NO：3)
Flt1-D2的编码序列为：
GGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACC(SEQ ID NO：4)
KDR-D3的氨基酸残基序列为：
SVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVH(SEQ ID NO：5)
KDR-D3的编码序列为：
TCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCAT(SEQ ID NO：6)
改造后的人IgG1 Fc的氨基酸残基序列为：
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：7)
改造后的人IgG1Fc的编码序列为：
CCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG(SEQ ID NO：8)
信号肽的氨基酸残基序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGS(SEQ ID NO：9)
信号肽编码序列为：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCT(SEQ ID NO：10)
Spacer1的氨基酸残基序列为：
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：11)
Spacer1编码序列为：
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGA(SEQ ID NO：12)
Spacer2的氨基酸残基序列为：
GGGGGGGGG(SEQ ID NO：13)
Spacer2编码序列为：
GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT(SEQ ID NO：14)
融合蛋白EVP1依次由信号肽-HERIN-Spacer1-Flt1D2-Spacer2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：15)
融合蛋白EVP2依次由信号肽-Flt1D2-Spacer1-HERIN-Spacer2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGSGGGGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：16)
融合蛋白EVP3依次由信号肽-HERIN-Spacer1-KDRD3-Spacer2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHGGGGSGGGGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：17)
融合蛋白EVP4依次由信号肽-KDRD3-Spacer1-HERIN-Spacer2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHGGGGSGGGGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：18)
融合蛋白EVP5依次由信号肽-HERIN-Spacer1-Flt1D2-Spacer2-HERIN-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：19)
融合蛋白EVP6依次由信号肽-Flt1D2-Spacer1-HERIN-Spacer2-KDRD3-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGSGGGGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGGGGGGSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：20)
融合蛋白EVP7依次由信号肽-HERIN-Spacer1-HERIN-Spacer2-Flt1D2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：21)
融合蛋白EVP8依次由信号肽-HERIN-Spacer1-Flt1D2-Spacer2-KDRD3-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：22)
融合蛋白EVP9依次由信号肽-HERIN-KDRD3-Spacer1-HERIN-Spacer2-Flt1D2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHGGGGSGGGGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：23)
融合蛋白EVP10依次由信号肽-HERIN-Spacer1-HERIN-KDRD3-Spacer2-Flt1D2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHGGGGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：24)
分别按EVP1的DNA编码序列(SEQ ID NO：25)，EVP2的DNA编码序列(SEQ ID NO：26)，EVP3的DNA编码序列(SEQ ID NO：27)，EVP4的DNA编码序列(SEQ ID NO：28)，EVP5的DNA编码序列(SEQ ID NO：29)，EVP6的DNA编码序列(SEQ ID NO：30)，EVP7的DNA编码序列(SEQ ID NO：31)，EVP8的DNA编码序列(SEQ ID NO：32)，EVP9的DNA编码序列(SEQ ID NO：33)，EVP10的DNA编码序列(SEQ ID NO：34)，委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen)EcoRI位点，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。各融合蛋白编码序列如下：
EVP1编码序列：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：25)
EVP2编码序列：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：26)
EVP3编码序列：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCTCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：27)
EVP4编码序列：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTTCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：28)
EVP5编码序列：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：29)
EVP6编码序列：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTTCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：30)
EVP7编码序列：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCGAGGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAGCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：31)
EVP8编码序列：
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EVP10编码序列：
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实施例2：融合蛋白的表达与纯化
将实施例1中构建并纯化获得的各重组表达载体的高品质质粒，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染至293细胞(胚肾细胞，购自美国典型物保藏中心，ATCC)。2天后，将转染后的293细胞转移到具有新霉素的DMEM培养基中，并通过有限稀释法将细胞克隆化。经21天的筛选，建立具有新霉素抗性的稳定转染相应表达载体的细胞株。而后，通过摇瓶培养大量扩增稳定转染细胞，收集培养物上清，经凝胶过滤亲和层析法纯化各融合蛋白。EVP1、EVP2、EVP3、EVP4、EVP5、EVP6、EVP7、EVP8、EVP9、EVP10的分子量分别为48.7KD、48.7KD、47.8KD、47.8KD、57.0KD、58.6KD、57.0KD、58.6KD、66.9KD、66.9KD，纯化好的融合蛋白经ELISA方法确定浓度。
实施例3：融合蛋白与VEGF的亲和力测定
重组人VEGF 165蛋白(Sino Biological lnc.)被包埋在96孔中(每孔10pmol)，4℃孵育24小时，利用1％的BSA溶液封闭非特异性的结合位点。然后分别将不同浓度(0.001，0.005，0.01，0.05，1，5，10，50，100pM)的待测融合蛋白(实施例2制备的融合蛋白EVP1-EVP10)与对照HERIN(委托上海波泰生物科技有限公司合成)加入到孔中(每孔100μl)，37℃孵育2小时。利用人Quantikine VEGF ELISA试剂盒(R&D Systems)检测未结合的VEGF含量。结果显示随着融合蛋白浓度的提高，未结合的VEGF逐渐减少，表明融合蛋白EVP1、EVP2、EVP3、EVP4、EVP5、EVP6、EVP7、EVP8、EVP9、EVP10均能与VEGF高效结合，且同时包含Flt1-D2与KDR-D3的融合蛋白EVP6、EVP8、EVP9、EVP10与VEGF的亲和力相对较高，对照HERIN不能与VEGF结合(见图2)。
实施例4：融合蛋白与EGFR的亲和力测定
重组人EGFR蛋白(Sino Biological lnc.)被包埋在96孔中，4℃孵育24小时，利用1％的BSA溶液封闭非特异性的结合位点。然后将浓度为100nM或500nM的待测融合蛋白(实施例2制备的融合蛋白EVP1-EVP10)与对照肽段HERIN(委托上海波泰生物科技有限公司合成)加入到孔中(每孔100μl)，37℃孵育2小时，PBS洗掉未结合蛋白，通过Herstatin的ELISA检测试剂盒(Upstate Biotechnology)定量测定与EGFR结合的融合蛋白量。结果表明，融合蛋白EVP1、EVP2、EVP3、EVP4、EVP5、EVP6、EVP7、EVP8、EVP9、EVP10均能与EGFR高效结合，结合能力与对照HERIN无显著差异，包含两个拷贝HERIN的融合蛋白EVP5、EVP7、EVP9、EVP10与EGFR的结合能力相对较高(见图3)。
实施例5：融合蛋白与HER2的亲和力测定
重组人HER2蛋白(Sino Biological lnc.)被包埋在96孔中，4℃孵育24小时，利用1％的BSA溶液封闭非特异性的结合位点。然后将浓度为100nM或500nM的待测融合蛋白(实施例2制备的融合蛋白EVP1-EVP10)与对照肽段HERIN(委托上海波泰生物科技有限公司合成)加入到孔中(每孔100μl)，37℃孵育2小时，PBS洗掉未结合蛋白，通过Herstatin的ELISA检测试剂盒(Upstate Biotechnology)定量测定与HER2结合的融合蛋白量。结果表明，融合蛋白EVP1、EVP2、EVP3、EVP4、EVP5、EVP6、EVP7、EVP8、EVP9、EVP10均能与HER2高效结合，结合能力与对照HERIN无显著差异，包含两个拷贝HERIN的融合蛋白EVP5、EVP7、EVP9、EVP10与HER2的结合能力相对较高(见图4)。
实施例6：融合蛋白与EGFR、HER2、VEGF的亲和力常数测定
实施例2制备的融合蛋白EVP1、EVP2分别加入96孔板中(10μg/ml，200μl)中，然后负载至抗人IgG Fc捕获生物传感器上(Anti-Human IgG Fc Capture biosensor，Octet)，再应用生物大分子相互作用仪(Octet Red 96)分别测定其与不同浓度(800nM、400nM、200nM、100nM、50nM、25nM)的重组人EGFR、HER2、VEGF蛋白(200μl，Sino Biological lnc.)的亲和力，测得EVP1与EGFR、HER2、VEGF的亲和力常数Kd分别为4.55×10-9mol/L，1.87×10-8mol/L，6.28×10-10mol/L；EVP2与EGFR、HER2、VEGF的亲和力常数Kd分别为8.47×10-8mol/L，9.53×10-7mol/L，5.75×10-10mol/L。
实施例7：融合蛋白用于治疗小鼠体内肝癌SMMC-7721移植瘤
将4-5周龄的裸鼠皮下接种肝癌SMMC-7721细胞株(购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)1×107，两周后，每周给予荷瘤小鼠尾静脉注射对照多肽HERIN(委托上海波泰生物科技有限公司合成，注射剂量为2.5mg/kg)或融合蛋白EVP1、EVP3、EVP7、EVP9(注射剂量分别为2.5mg/kg)，空白对照组注射相同体积的PBS，统计肿瘤体积的随时间的变化情况。结果发现，其对照组3周后肿瘤体积增加5倍以上，而融合蛋白EVP1、EVP3、EVP7、EVP9治疗组肿瘤大小无明显变化，疗效显著优于对照多肽HERIN治疗组(见图5)。
实施例8：融合蛋白用于治疗小鼠体内卵巢癌SK-OV3移植瘤
将4-5周龄的裸鼠皮下接种卵巢癌SK-OV3(购自ATCC)细胞株1×107，两周后，每周给予荷瘤小鼠尾静脉注射对照多肽HERIN(委托上海波泰生物科技有限公司合成，注射剂量为2.5mg/kg)或融合蛋白EVP1、EVP3、EVP7、EVP9(注射剂量分别为2.5mg/kg)，空白对照组注射相同体积的PBS，统计肿瘤体积的随时间的变化情况。结果发现，其对照组3周后肿瘤体积增加8倍以上，而融合蛋白EVP1、EVP3、EVP7、EVP9治疗组肿瘤的大小无明显变化，疗效显著优于对照肽段HERIN治疗组(见图6)。
实施实例9：携带融合蛋白编码序列的质粒用于治疗小鼠体内肝癌Hep3B移植瘤
应用EntransterTM-in vivo转染试剂盒(Engreen Biosystem Co，Ltd)，制备包裹实施实例1获得的融合蛋白EVP1、EVP5表达质粒pCDNA3.1-EVP1、pCDNA3.1-EVP5，以及空载体pCDNA3.1的纳米颗粒溶液(按说明书步骤)，最终150μl的纳米颗粒溶液中含有质粒50μg。
将4-5周龄的裸鼠皮下接种肝癌Hep3B(购自ATCC)细胞株1×107。四周后，一次性给予荷瘤小鼠尾静脉注射包裹pCDNA3.1-EVP1、pCDNA3.1-EVP5的纳米-质粒DNA溶液(各150μl)，对照组注射相同体积的包裹pCDNA3.1的纳米-质粒DNA，统计肿瘤体积的随时间的变化情况。结果发现，其对照组3周后肿瘤体积增加4倍以上，而治疗组肿瘤的大小无明显变化(见图7)。
实施实例10：携带融合蛋白编码序列的重组腺病毒用于治疗小鼠体内肺癌NCI-H460移植瘤
将实施实例1合成的融合蛋白EVP5编码序列(SEQ ID NO：29)、EVP9(SEQ ID NO：33)插入pDC315载体(本元正阳基因技术有限公司)EcoRI位点，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取质粒。利用Lipofectamine(Invitrogen)将其分别与pBHGlox(delta)E1，3Cre(MicrobixBiosystems Inc)共转染至293细株(ATCC)，共转染后9-14天出现腺病毒空斑，经过三次腺病毒空斑纯化，包装获得携带EVP1或EVP5融合蛋白编码框的重组腺病毒Ad5-EVP5、Ad5-EVP9。腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒，应用TCID50法来检测腺病毒滴度。
将4-5周龄的裸鼠皮下接种肺癌NCI-H460(购自ATCC)细胞株5×106，二周后，一次性给予荷瘤小鼠尾静脉注射Ad5-EVP5、Ad5-EVP9(1×109pfu，100μl)，对照组注射相同体积的PBS，统计肿瘤体积的随时间的变化情况。结果发现，其对照组3周后肿瘤体积增加5倍以上，而治疗组肿瘤的大小无明显变化(见图8)。
实施实例11：携带融合蛋白编码序列的重组腺相关病毒用于治疗小鼠体内乳腺癌Bcap-37移植瘤
将实施实例1合成的融合蛋白EVP1(SEQ ID NO：25)、EVP5编码序列(SEQ ID NO：29)插pAAV-MCS载体(Stratagene)EcoRI位点，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取质粒。利用磷酸钙转染法将其分别与pAAV-RC及pHelper(Stratagene)共转染自293细胞(ATCC)，包装获得重组腺相关病毒rAAV-EVP1、rAAV-EVP5。
将4-5周龄的裸鼠皮下接种乳腺癌Bcap-37(购自ATCC)细胞株5×106，三周后，一次性给予荷瘤小鼠尾静脉注射rAAV-EVP1、rAAV-EVP5(2×1011vg，100μl)，对照组注射相同体积的PBS，统计肿瘤体积的随时间的变化情况。结果发现，其对照组5周后肿瘤体积增加10倍以上，而治疗组肿瘤的大小无明显变化(见图9)。
Claims (20)
1.融合蛋白，其氨基酸序列选自SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：24。
2.一种核酸，其特征在于编码权利要求1所述的融合蛋白，其序列为选自SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：34的核苷酸序列。
3.载体，其可操作地连接有权利要求2所述的核酸。
4.权利要求3所述的载体，其中所述的载体选自质粒、重组病毒、噬菌体。
5.权利要求4所述的载体，其中所述的重组病毒为重组腺病毒或重组腺相关病毒。
6.权利要求4所述的载体，其中所述的质粒为真核表达质粒或原核表达质粒。
7.权利要求4所述的载体，其中所述的质粒为pCDNA3.1、pDC315或pAAV-MCS。
8.制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
a.根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列，合成表达框；
b.将步骤a获得的表达框插入合适的载体，转化到合适的宿主细胞中，提取并纯化质粒；
c.将纯化后的质粒转染至合适的细胞，培养扩增转染细胞，收集培养物上清，经纯化获得融合蛋白。
9.权利要求8所述的方法，其中，步骤b中所述的合适的载体选自质粒、重组病毒、噬菌体。
10.权利要求9所述的方法，其中所述的重组病毒为重组腺病毒或重组腺相关病毒。
11.权利要求9所述的方法，其中所述的质粒为真核表达质粒或原核表达质粒。
12.权利要求9所述的方法，其中所述的质粒为pCDNA3.1、pDC315或pAAV-MCS。
13.权利要求8所述的方法，其中，步骤b中所述的合适的宿主细胞为细菌或真菌。
14.权利要求8所述的方法，其中，步骤b中所述的合适的宿主细胞为E.coli。
15.权利要求8所述的方法，其中，步骤b中所述的合适的宿主细胞为DH5α。
16.权利要求8所述的方法，其中，步骤c中所述的合适的细胞为真核表达宿主细胞。
17.权利要求8所述的方法，其中，步骤c中所述的合适的细胞为293细胞。
18.药物组合物，其包含权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的核酸，任选地，该组合物还含有药学上可接受的载体。
19.权利要求18所述的药物组合物，其中所述的药学上可接受的载体为辅料或赋形剂。
20.权利要求1所述融合蛋白或权利要求2所述的核酸或权利要求3至7任一项所述的载体或权利要求18所述的药物组合物用于制备抗肿瘤药物的用途，其中所述的肿瘤为肺癌、肝细胞癌、乳腺癌或卵巢癌。
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2012
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Patent Citations (1)
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| Receptor binding specificities of Herstatin and its intron 8-encoded domain;Lara S. Shamieh等;《FEBS Letters》;20040524;第568卷(第1-3期);图1、第164页右栏倒数第2段 * |
Also Published As
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