CN108840923B - 一种靶向pd-l1的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向PD‑L1蛋白的多肽、分离的核酸、核酸构建体、重组表达载体以及一种抗肿瘤药物。还提供了靶向PD‑L1蛋白的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。该多肽具有PD‑L1蛋白调节功能，能够降低PD‑L1蛋白在细胞中的表达量，降低肿瘤细胞结合PD‑1蛋白的能力，增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤，抑制肿瘤细胞在体内的生长。不同于目前常用的抗体阻断方法，本发明提供的技术方案有利于激活T细胞免疫应答和提高肿瘤免疫力，作为肿瘤免疫治疗方法的新突破，其在针对PD‑L1调控的生物医学和药学研究中具有广泛的意义。

Description

一种靶向PD-L1的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种用于靶向PD-L1蛋白的多肽、分离的核酸、核酸构建体、重组表达载体、抗肿瘤药物及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是我国发病率和死亡率均居前列的一类疾病，近年来临床诊断、手术、放化疗的发展使得一部分恶性肿瘤患者得到早期发现和有效治疗。然而在全世界范围内，寻找新的治疗方法和药物长期以来是肿瘤研究领域的热点。不同于传统的治疗方法，肿瘤免疫治疗能够激活或诱导人体建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发或转移的肿瘤细胞，并建立免疫记忆，组织肿瘤的复发、耐药和转移。程序性细胞死亡分子1(PD-L1)是免疫检查点蛋白之一，其在限制T细胞活性中起主要作用，所属T细胞提供了主要的免疫抵抗机制，通过这种限制作用肿瘤细胞能够躲过免疫监视。在活化的T细胞上表达的PD-1与在肿瘤细胞上表达的PD-L1的相互作用对免疫应答起负调节并减弱抗肿瘤免疫力。PD-L1在肿瘤上的表达与黑色素瘤、肺癌、食管癌和其它类型的癌症的生存率下降相关，突出了该通路进行PD-L1抑制过分表达可作为新的有前途的肿瘤免疫治疗靶点。

目前，已经有制药公司开发出了靶向PD-L1的抗体，在不同的肿瘤类型中显示出临床活性。PD-L1抗体通过在细胞表面与PD-L1结合，阻断PD-L1与PD-1的结合并激活T细胞的免疫应答，提高抗肿瘤免疫力。但是，对于PD-L1的表达量并降低，也不直接改变PD-L1的膜定位。目前这种基于PD-L1抗体的免疫检查点阻断疗法仍存在很大挑战及不足之处，例如有部分肿瘤患者对PD-L1抗体治疗反应疗效不佳，治疗的效果还可能随着用药时间的延长而有所降低。因此对研究靶向PD-L1抑制的新制剂或方法，进一步改善肿瘤患者的疗效存在很大需求。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种靶向PD-L1的多肽，激活T细胞的免疫应答，提高肿瘤免疫力，解决上述现有技术中肿瘤患者对PD-L1抗体治疗反应疗效不佳等不足之处。

发明内容

鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于针对现有技术的不足和对治疗肿瘤的需求，解决现有基于PD-L1抗体与PD-L1结合以并激活T细胞的免疫应答，从而达到提高抗肿瘤免疫活性的方法中存在疗效不佳等问题，本发明提供了一种能够降低肿瘤细胞中PD-L1蛋白质表达量的多肽、分离的核酸、核酸构建体、重组表达载体、抗肿瘤药物及其应用。

为实现上述目的，本发明在第一方面提供了一种多肽，该多肽靶向PD-L1蛋白，选自由以下多肽组成的组中的一种或几种：

(a)、与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有90％以上同一性的多肽；

(b)、包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；

(c)、包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入的氨基酸序列的多肽；

(d)、包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经乙酰化、磷酸化、糖基化、琥珀酰化和/或泛素化修饰的氨基酸序列的多肽。

本发明在第二方面提供了一种分离的核酸，该核酸包含编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核酸序列，该核酸的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明在第三方面提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含前述靶向PD-L1多肽的核酸序列，以及与该核酸序列可操作连接、可指导多肽在适当表达宿主中表达的一个或多个控制序列。在一个较优实施例中，该核酸构建体的功能片段示意图如图1所示。

本发明在第四方面提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含前述的核酸构建体。在一个较优实施例中，该载体的质粒信息如图2所示。

本发明在第五方面提供了一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包含前述靶向PD-L1的多肽。

本发明在第六方面提供了前述靶向PD-L1的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，前述靶向PD-L1的多肽具有调节PD-L1蛋白的功能。

进一步地，前述靶向PD-L1的多肽降低PD-L1蛋白在细胞中的表达量。

进一步地，前述靶向PD-L1的多肽降低肿瘤细胞结合PD-1蛋白的能力，增加T细胞对肿瘤细胞的杀伤，抑制肿瘤细胞在体内的生长。

较之于现有技术，本发明的优点在于：(1)本发明是基于前期的科研成果，即HIP1R蛋白质促进PD-L1溶酶体降解的作用。并进一步通过准确识别HIP1R与PD-L1结合、促进溶酶体降解的序列，通过保留关键功能序列而设计的新型多肽。(2)本发明所属的方法与现有方法在作用方式方面存在根本性的不同。相比于现有技术中PD-L1抗体通过与肿瘤细胞膜表面的PD-L1结合而减少PD-L1与PD-1的相互作用，存在PD-L1抗体因个体差异而存在的结合疗效不佳，以及存在因用药时间的延长而疗效有所降低的缺陷；本发明的多肽能够促进PD-L1蛋白质通过溶酶体降解，减少细胞表达的PD-L1含量，从根本上避免和减少了PD-L1与PD-1的相互作用，具有更好的抑制作用和治疗效果。

本发明的多肽能够促进PD-L1的降解，降低PD-L1在细胞中的表达，不同于目前常用的抗体阻断方法，有利于激活T细胞免疫应答和提高肿瘤免疫力，作为肿瘤免疫治疗方法的新突破，该制剂在针对PD-L1调控的生物医学和药学研究中具有广泛的意义。

附图说明

图1是本发明较优实施例中核酸构建体的功能片段示意图；

图2是本发明较优实施例中载体的质粒信息图；

图3是本发明较优实施例中表明HIP1R促进PD-L1通过溶酶体降解的示意图；

图4是本发明较优实施例中识别HIP1R和PD-L1相互结合的结构域的免疫共沉淀凝胶图；

图5是本发明较优实施例中证明HIP1R促进溶酶体降解的关键功能序列的结果示意图；

图6是本发明较优实施例中构建的不同的靶向PD-L1的多肽对PD-L1的表达量影响的结果示意图；

图7是本发明较优实施例中靶向PD-L1的多肽PD-LYSO促进PD-L1蛋白质与溶酶体共定位的免疫荧光染色图；

图8是本发明较优实施例中靶向PD-L1的多肽PD-LYSO降低肿瘤细胞表面PD-1结合力的结果示意图；

图9是本发明较优实施例中靶向PD-L1的多肽PD-LYSO增加T细胞对共培养的肿瘤细胞的杀伤能力的结果示意图；

图10是本发明较优实施例中靶向PD-L1的多肽PD-LYSO抑制小鼠荷瘤模型中肿瘤生长的结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明具体实施方式中使用的原料、设备可通过购买市售产品获得。

实施例1、确认靶向PD-L1的多肽的PD-L1相互作用的氨基酸序列、以及靶向溶酶体降解的关键氨基酸序列

1、证实HIP1R促进PD-L1通过溶酶体途径进行降解：

在人结直肠癌细胞HCT116中转染HIP1R真核表达载体，并通过免疫印迹的方法，以PD-L1特异性抗体检测PD-L1蛋白质的表达水平，发现HIP1R显著降低了PD-L1蛋白质的表达量，通过不同剂量的氯喹阻断溶酶体降级途径，使HIP1R的作用得到有效抑制(图3A)。利用溶酶体降解途径的特异性抑制剂氯喹(chloroquine)处理细胞(氯喹浓度分别为5,10,20,40μM)，发现能够抑制HIP1R的作用，并且呈现剂量依赖性(图3A)。如图3B所示，在人结直肠癌细胞HCT116中过表达HIP1R，增加了PD-L1与LAMP1标记的溶酶体的共定位，统计结果见图3B右侧。利用免疫荧光染色方法，检测PD-L1和溶酶体标记物LAMP1的共定位，发现HIP1R的过表达能够显著增加PD-L1与溶酶体的共定位，提示HIP1R促进了PD-L1的溶酶体降解(图3B)。如图3C所示，在结直肠癌组织中，免疫组化发现HIP1R的表达量和PD-L1呈现显著的反向相关性，统计结果见图3C右侧。在结直肠癌组织标本中利用免疫组化方法检测PD-L1和HIP1R的表达量，发现HIP1R与PD-L1呈现负相关(图3C)。

2、确定HIP1R和PD-L1相互作用的主要区域和氨基酸序列：

图4是识别HIP1R和PD-L1相互结合的结构域的免疫共沉淀凝胶图。上图表示HIP1R蛋白质具有的结构域以及构造的突变体所在的区间；下图是免疫共沉淀研究HIP1R和PD-L1相互结合的结构的结果。

HIP1R包含1068个氨基酸，主要包括ENTH结构域等，通过分子克隆方法构建不同的HIP1R结构域缺失突变体、利用免疫共沉淀的方法检测HIP1R突变体和PD-L1的结合，来定位两者相互作用的关键区域。实验结果表明HIP1R在缺失796-814氨基酸序列的情况下，不能与PD-L1发生结合(图4)。因此HIP1R蛋白质的796-814附近区域是与PD-L1结合所必须的。

3、确定HIP1R靶向溶酶体降解的关键氨基酸序列：

图5的结果证明HIP1R促进溶酶体降解的关键功能序列。图5A预测的HIP1R可能具备的溶酶体靶向序列模式；根据生物信息学预测，HIP1R的966-979氨基酸序列具有典型的溶酶体靶向序列特征，属于LL“双亮氨酸”模式；此外，在1059-1068区域在一定程度上类似YXXL模式的序列(另一种已知的溶酶体靶向序列)，但并不完全符合。图5B构建用于验证溶酶体靶向序列的绿色荧光蛋白载体，通过连接HA抗原标为标签和预测的溶酶体靶向序列到GFP绿色荧光蛋白，来检测这些序列对于蛋白质稳定性的影响。构建绿色荧光蛋白融合体是研究溶酶体靶向序列的有效方法，其原理是：融合于C末端的候选序列可能影响绿色荧光蛋白GFP的细胞内定位、降解速率；通过和对照的非融合蛋白相比较，可以确认序列的作用和功能。因此，采用构建绿色荧光蛋白融合体的方法，研究上述序列对蛋白质降解的影响，验证溶酶体靶向序列的存在。图5C显示了不同的GFP融合蛋白在细胞内与LAMP1标记的溶酶体的共定位结果，图5D为上述共定位结果的统计。免疫荧光实验表明，HIP1R(966-979)序列导致GFP与溶酶体产生强烈共定位(图5C-D)，而HIP1R(1059-1068)序列并无此作用。图5E为检测GFP融合蛋白降解程度的凝胶电泳图。表明位于HIP1R蛋白质966-979位点的氨基酸是靶向溶酶体降解的关键序列。图5F显示了放线菌酮CHX示踪实验，该结果表明HIP1R(966-979)加快了GFP蛋白质的降解，同时可以用氯喹阻断。这证实了溶酶体降解途径的关键作用。利用GFP特异性抗体进行免疫印迹实验，发现HIP1R(966-979)融合序列导致GFP表达量的显著下降，而HIP1R(1059-1068)序列并无此作用。进一步进行放线菌酮示踪试验，即利用放线菌酮处理表达了不同融合蛋白的细胞，在不同时间点(0,20,40min)分别检测GFP融合蛋白的表达量，结果显示：HIP1R(966-979)序列明显地加速了GFP蛋白质的降解速率，而氯喹的加入抑制了这一作用(图5F)。上述结果表明，HIP1R(966-979)序列是溶酶体靶向序列。

实施例2、构建靶向PD-L1的多肽以及其功能验证

1、构建靶向PD-L1的多肽：

由前述实验得知，HIP1R的(784-807)序列与PD-L1相结合，而HIP1R(1059-1068)序列靶向溶酶体，能够促进PD-L1蛋白质的溶酶体途径降解。利用上述原创发现，设计了带有与PD-L1相结合并靶向溶酶体降解的多肽，即HIP1R(784-807)-(966-979)，为方便下文表述，命名为PD-LYSO，其组成结构和具体序列如图6所示。同时作为对照，构建了PD-LYSO缺失N端部分氨基酸序列的多肽即PD-LYSO(mut)，以及在PD-LYSO的N端增加部分氨基酸序列的PD-LYSO(plus)。图6是验证上述构建的不同的PD-L1靶向多肽的实际效果的凝胶电泳图。由不同的多肽处理HCT116肿瘤细胞，再通过凝胶电泳检测PD-L1的表达量。结果提示PD-LYSO多肽(即SEQ ID NO.1)明显降低了PD-L1的表达量。在N段发生突变缺失10个氨基酸的多肽不具备此作用，而在N端额外增加8个氨基酸的多肽保留了PD-LYSO多肽的作用。上述结果表明PD-LYSO的多肽序列对于PD-L1的抑制是足够且必须的。

如图6所示，通过标准的Fmoc方案进行合成上述多肽，经HPLC纯化后和质谱鉴定。利用体外实验进行多肽功能的验证。将上述多肽以终浓度5μM加入HCT116人结直肠癌细胞培养基中，孵育24小时后，利用免疫印迹方法检测PD-L1表达量。结果提示，PD-LYSO和PD-LYSO(plus)多肽能够显著降低PD-L1表达量。而PD-LYSO(mut)不具有上述作用。这些结果表明，PD-LYSO即HIP1R(784-807)-(966-979)多肽可以降低PD-L1表达量。

2、确认靶向PD-L1的多肽PD-LYSO促进PD-L1蛋白质定位到溶酶体

为了进一步验证PD-LYSO多肽对PD-L1蛋白质通过溶酶体降解的促进作用，通过免疫荧光染色的方法，研究了PD-LYSO处理后的癌细胞中PD-L1的定位变化。人结直肠癌细胞HCT116用PD-LYSO多肽(浓度为5μM)孵育24小时后，分别用PD-L1的抗体(红色)和Lamp1抗体(绿色)标记相应蛋白、用DAPI染色细胞核。如图7显示了靶向PD-L1的多肽PD-LYSO促进PD-L1蛋白质与溶酶体共定位的免疫荧光染色图片。结果显示，PD-LYSO多肽处理后的癌细胞，PD-L1的膜定位显著减少，而与细胞内的溶酶体共定位显著增加。这些结果证明，PD-LYSO多肽确实促进PD-L1的溶酶体降解。

实施例3、靶向PD-L1的多肽在降低细胞中PD-L1表达量的功能验证

1、靶向PD-L1的多肽减少癌细胞结合PD-1的验证

靶向PD-L1的多肽可以降低肿瘤细胞表面PD-L1的结合能力。肿瘤细胞经过多肽处理24小时后，与抗体Fc段融合的PD-1蛋白质共同孵育结合，再利用抗PD-1抗体流式细胞仪检测结合的PD-1量，统计结果如图8所示。肿瘤细胞通过表达在细胞表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞的杀伤作用。因此首先验证了PD-L1靶向多肽(PD-LYSO)对癌细胞结合PD-1的能力。肿瘤细胞经过多肽处理24小时后，与抗体Fc段融合的PD-1蛋白质共同孵育结合，再利用抗PD-1抗体流式细胞仪检测结合的PD-1量，结果显示，PD-LYSO多肽处理后的肿瘤细胞结合PD-1的能力显著下降。

2、靶向PD-L1的多肽在T细胞对肿瘤杀伤作用的确认

靶向PD-L1的多肽增加T细胞对肿瘤细胞杀伤能力。肿瘤细胞经过靶向PD-L1的多肽处理24小时后，与激活的T细胞共同孵育培养，利用活细胞凋亡分析试剂盒检测24小时候后的肿瘤细胞凋亡水平，结果如图9所示。结果表明PD-LYSO多肽处理后T细胞对共培养的肿瘤细胞杀伤作用显著增强。

3、靶向PD-L1的多肽PD-LYSO对MC38小鼠结直肠癌细胞荷瘤小鼠的肿瘤生长的抑制作用的确认

图10显示了PD-L1靶向多肽抑制肿瘤体内生长的实验结果。将MC38小鼠结肠癌细胞注射于c57小鼠皮下形成荷瘤模型，并随机分为实验组和对照组。实验组小鼠给予PD-LYSO多肽注射(10μg/g体重)，对照组注射生理盐水。肿瘤生长的体积经测量后做生长曲线，结果显示PD-LYSO多肽显著抑制了肿瘤的生长。

综上所述，本发明技术方案所述的靶向PD-L1的多肽能够促进PD-L1的降解，降低癌细胞表达的PD-L1蛋白质表达水平，减少癌细胞表面结合的PD-1，激活T细胞杀伤肿瘤的活性，从而提高抗肿瘤免疫力，抑制肿瘤在体内的生长。因此该PD-LYSO多肽作为新的PD-L1靶向分子，可用于增强肿瘤免疫治疗的效果，具有十分重要的意义和应用价值。

以上详细描述了本发明的具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验得到的技术方案，皆应在权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> 一种靶向PD-L1的多肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Lys Glu Met Ala Ala Thr Ser Ala Ala Ile Glu Asp Ala Val Arg

1 5 10 15

Arg Ile Glu Asp Met Met Asn Gln Met Asp Phe Ser Gly Leu Ser Leu

20 25 30

Ile Lys Leu Lys Lys Gln

35

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Lys Glu Met Ala Ala Thr Ser Ala Ala Ile Glu Asp Ala Val Arg

1 5 10 15

Arg Ile Glu Asp Met Met Asn Gln

20

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Phe Ser Gly Leu Ser Leu Ile Lys Leu Lys Lys Gln

1 5 10

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gataaagaaa tggcggcgac cagcgcggcg attgaagatg cggtgcgccg cattgaagat 60

atgatgaacc agaaatttga acgccagcag aaaattctgg atcagcgctt ttttgaataa 120

Claims (3)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽靶向PD-L1蛋白，所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物至少包含如权利要求1所述的多肽。

3.如权利要求1所述的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述肿瘤为结直肠癌。

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