KR100909290B1 - 항암 항체 - Google Patents

Abstract

크립토-1 단백질, Pim-1 단백질 혹은 결장암 세포 용리물에 존재하는 항원의 분리된 결합 파트너를 개시한다. 상기 결합 파트너는 하나 이상의 암세포 종류의 증식을 억제하고 대상의 암에 걸린 대상을 치료하기 위한 항암제에 사용되기도 한다. 또한 결합 파트너는 암세포 내에 아폽토시스를 유발하는 방법 및, 세포독성 화합물에 대한 암세포의 감수성 유발을 위한 방법에도 사용된다. 또한, 크립토-1 단백질 (혹은 그의 항원성 단편), Pim-1 단백질 (혹은 그의 항원성 단편) 혹은 결장암 세포 용리물에 존재하는 항원이나 또는 별도로, 크립토-1 단백질 (혹은 그의 항원성 단편), Pim-1 단백질 (혹은 그의 항원성 단편) 혹은 결장암 세포 용리물에 존재하는 항원을 코딩하는 발현가능한 DNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 암백신에 대해서도 기술한다.

Description

항암 항체 {ANTIBODIES AGAINST CANCER}

본 발명은 항암제, 특히 인간 결장, 전립선 및 유방암 세포의 시험관내 및 생체내 증식을 억제하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항암 백신에 관한 것이다.

1980년대 초에는, 항암제 용도로서 모노클로날 항체(Mab)의 개발에 관한 관심이 지대하였다. 어떤 경우에는, 컨쥬게이션(conjugation) 방법에 의해 다양한 세포독성 화합물 (예, 톡신) 혹은 기타의 물질 (예, 동위원소 및 약물)을 암세포로 운반하기 위한 "매직 불릿"으로 디자인 되었다. 그러나, 저특이성 혹은 저투과성 (예, 딱딱한 종양에 대해) 또한 유도된 HAMA (예, 인간 항마우스 항체) 반응을 포함하는 수많은 이유 때문에, 이들 Mab형 항암제는 성공적이지 않으며 다수가 포기되었다.

근래에는, 이들을 Mab형 항암제에 대한 관심이 새롭게 조명되었고 종래에 경험했던 다수의 문제점은 유전공학기술을 응용하여 해소하였다(허드슨 PJ, "Recombinant antibody constructs in cancer therapy", Curr Opin Immunol, 11, pp548-557 (1999) 참조). 실제로, 현재 사용되거나 임상실험 중인 3개의 Mab (즉, HER2/neu 양성 유방암의 치료를 위한 제품 Transtuzumab으로 시판되는 인간화 (humanised) HER2/neu Mab, 논-호지킨 임파종의 치료를 위한 Rituxan 으로 공지된 인간화 항-CD20 Mab, 및 항-EGFR Mab인 C225)가 있다. 이들 항체는 일차적으로 세포독성 항체 역할을 하거나 Fc 매개성 염증 반응에 의한 작용을 하지 않고, 항원에 결합하여 세포 신호 전달 및 아폽토시스(apoptosis)에서의 간섭을 유도한다. 예컨대, HER2/neu Mab의 경우, 상기 항체는 성장 인자의 결합을 방해 혹은 "블록"하여 HER2/neu 양성 유방암 세포를 죽이는 결과를 가져온다.

기존의 암 치료를 돕기 위한 항암제에 대한 요구가 크게 증가하고 있다. 크립토-1 단백질 혹은 크립토-1 단백질의 항원성 부분 (Montuori N, et al. "isolation and characterisation of the CRIPTO autosomal gene and its X-linked related sequence", Am J Hum Genet, 49(3), pp 555-565(1991)), 특정 암세포 내에서 발현되는 것으로 알려진 단백질, Pim-1 단백질의 융합 단백질 (Friedmann M, et al. "Characterisation of the proto-oncogene pim-1: kinase activity and substrate recognition sequence", Arch Biochem Biophys, 298(2), pp 594-601 (1992)), 혹은 결장암 세포 융해물로 래트를 면역화함으로써 모노클로날 항체를 생성하였으며, 본 발명자는 이것이 놀랍게도, 각종 암세포주의 증식을 억제하고, 또한 어떤 경우에는 상기 암세포주의 아폽토시스를 야기할 수 있음을 발견하였다.

도 1은 72시간 배양후 ³H-티미딘 편입(Inc.)으로 측정시, Mab C4에 의해 야기된 시스플라틴(Cisplatin)에 대한 세포의 개선된 감수성과 더불어 Mab C4에 의한 LS174T 결장암 세포의 억제를 보여주는 그래프 상의 결과를 도시한다.

도 2는 결장암 세포주 LS174T 에 대한 C3, C4 및 C13 Mab 및 대조군 Mab BCP7 (항-뮤신 1 Mab)의 억제 효과를 나타내는 막대형 그래프를 도시한다.

도 3은 Mab C4 로 이뮤노페록시다제 염색한 유방암 조직(A) 및 정상 유방 조직(B)의 사진을 도시한다. 정상 유방 조직에서는 염색이 전혀 관찰되지 않았다.

도 4a는 SCID 마우스 내의 Mab C4의 억제 효과를 나타내는 그래프 결과를 도시한다. SCID 마우스는 2 x 10⁶ 의 전립선암 DU145 세포를 피하주사로 접종한 뒤 MabC4 로 처리하였다.

도 4b는 전립선암 DU145 세포 및 Mab C4 의 접종 24일 후 처리 및 처리되지 않은 SCID 마우스에 있어서 종양 크기 (중량단위)에 대한 Mab C4 의 영향을 나타내는 막대 그래프 형태의 결과를 도시한다.

도 5a는 SCID 마우스에서의 Mab C13의 억제 효과를 나타내는 그래프 결과를 도시한다. SCID 마우스는 2.5 x 10⁶ 의 결장암 LS174T 세포를 피하주사로 접종한 뒤 Mab C13으로 처리하였다.

도 5b는 결장암 LS174T 세포 및 Mab C13 의 접종 25일 후 처리 및 처리되지 않은 SCID 마우스에 있어서 종양 크기 (중량단위)에 대한 Mab C13 의 영향을 나타내는 막대 그래프 형태의 결과를 도시한다.

도 6은 항-크립토-1 Mab인 C3에 의해 유도된 아폽토시스 세포의 DNA 단편화에 대한 결과를 도시한다.

도 7은 Mab C4 및 대조군 Mab인 Mab BCP7으로 72 시간 동안 처리한 결장암 세포 LS174T에서, 아폽토시스의 표시자인 요오드화 프로피듐(PI) 염색을 결정하는 FACS 분석의 그래프 결과를 도시한다.

도 8a는 배지(레인 1), C3 (5,10㎍/ml)(레인 2,3), 시스플라틴(25,50㎍/ml) (레인 4,5); 또한 C3 (10㎍/ml) 및 시스플라틴(25,50㎍/ml)의 조합 (레인 6,7)으로 3시간씩 처리한 LS174T 세포 내에서의 JNK 및 p38 의 활성화를 도시한다. JNK 는 약량(dose) 의존적 방식으로 활성화된다. C3 및 시스플라틴(Cis)의 조합시 JNK의 활성도를 더 향상시켰다. P38은 C3 에 의해 영향을 받지 않았으나 시스플라틴에 의해서는 활성화 되었다.

도 8b는 10㎍/ml의 배지(m), C4에 의해 8시간, 24시간 혹은 16시간 동안 배양된 LS174T 세포 내에서의 JNK 및 p38의 활성화를 도시한다.

도 8c는 (1) 배지, (2) C3 (10㎍/ml), (4) C4 (10㎍/ml) 및 시스플라틴 (25㎍/ml), (5) 시스플라틴 (25㎍/ml), 및 (6) C13 (10㎍/ml)으로 16시간 동안 배양한 후 LS174T 내에서의 JNK 및 p38의 활성화를 도시한다.

도 8d는 배지(M), C4(10㎍/ml)로 24시간, 48시간 및 72시간 (레인 2,3,4); C3 (10㎍/ml), C13으로 48시간 (레인 5,6) 및 72시간 (레인 7,8); C3으로 48시간 (레인 9) 배양한 뒤 LS174T 세포 내에서의 JNK 및 p38의 활성화를 도시한다.

도 9는 항-크립토-1 Mab (예, C3 및 C13) 및 항-Pim-1 Mab (예, P4 및 P9)에 의한 CCRF-CEM 및 CEM/A7R 세포 (Austin Research Institute, Heidelberg, Victoria, Australia) 의 증식 억제를 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 10은 3개의 세포주, 즉 백혈병 세포 CEM A7, 약물 내성 변형체 CEM A7/R 및 마우스 티모마(흉선종:thymoma) 세포 E3에 대한 약물 에피루비신(Epirubicin)의 영향(A), 및 에피루비신으로 처리한 약물 내성 백혈병 세포주 CEM/A7R 및 마우스 티모마 세포 E3에 대한 Mab C4의 영향(각각 (B) 및 (c))을 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 11은 Mab C3 에 의한 전립선암 세포 PC3의 억제를 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 12는 시간 경과에 따른 항-크립토-1 Mab C3에 의한 전립선암 세포주 DU 145의 증식 억제를 나타내는 표 및 그래프 결과를 도시한다.

도 13은 전립선암 세포주 PC3 의 증식에 대한 저농도의 항-크립토-1 Mab인 C3 및 시스플라틴을 조합한 효과를 나타내는 표 및 그래프 결과를 도시한다.

도 14는 전립선암 세포주 DU 145의 증식에 대한 저농도의 항-크립토-1 Mab인 C3 및 시스플라틴을 조합한 효과를 나타내는 표 및 그래프 결과를 도시한다.

도 15는 Mab C3 및 에피루비신 (7.9-125㎍/ml)에 의한 LS174T 세포 증식의 억제를 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 16은 Mab C13 및 5FU (0-3.0㎍/ml)에 의한 LS174T 세포 증식의 억제를 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 17은 항-크립토-1 Mab인 C3 단독, 혹은 세포독성 약물 시스플라틴(Cis), 5-플루오리실(5FU) 혹은 카르보플라틴(Carb)(David Bull Laboratories, USA)과 조합한 경우, 이에 의한 유방암 세포주 MCF7 (ATCC, USA)의 증식 억제를 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 18은 유방암 세포 MCF-7에 대한 Mab C13 및 에피루비신(E)의 억제 효과를 도시한다.

도 19는 유방암 세포 MCF7에 대한 가교된 Mab C3의 억제 효과를 도시한다.

도 20은 24 내지 72시간 동안 항-크립토-1 Mab인 C3 및 C13과 항-Pim-1 Mab인 P4 및 P9 의 존재하에서, 마우스 티모마 E3 세포 (Austin Research Institute, Heidelberg, Victoria, Australia)의 배양 결과를 그래프 형태로 도시한 것으로서, In50 농도가 20ng 일 때 Mab들, 대조군 항체 BC3, 항-뮤신 1 항체 (Austin Research Institute, Heidelberg, Victoria, Australia) 및 약물 에피루비신 (David Bull Laboratories, USA)에 대해 노출되지 않았던 세포와 비교할 때의 세포수의 감소를 나타낸다(a). 도 20(b)는 도 20(a)에서 나타낸 동일한 실험의 결과를 그래프로 도시하였으나 세포 증식 억제는 Mab가 존재하지 않은 대조군의 백분율로서 세포 증식 억제율을 표시하였다.

도 21은 대조군 항체 BC3과 비교하여, 항-크립토-1 Mab인 C3 및 항-Pim-1 Mab인 P4에 의한 결장암 세포주 HT29 (ATCC, USA)의 증식 억제를 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 22는 항-Pim-1 Mab인 P4 단독, 혹은 이를 증가하는 농도의 시스플라틴과 조합하였을 때, 이에 의한 결장암 세포주 LS174T의 증식 억제를 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 23은 Mab 1.14, 1.68, 2.20 및 3.60, 또한 대조군으로서 항-뮤신 1 항체 BCP7에 의한 결장암 세포주 LS174T (ATCC, USA) 및 유방암 세포주 MCF7의 증식 억제를 ³H-티미딘 편입 변화 백분율 형태로 나타내는 그래프 결과를 도시한다.

도 24는 전립선암 세포주 DU 145의 성장에 대한 Mab 1.14 (결장암 세포 용리물에 대항하여 생성됨) 및 시스플라틴의 조합 효과를 도시한다.

도 25는 37-mer 크립토-1 펩티드 피복된 플레이트를 사용하는 ELISA로 시험한 마우스 혈정의 적정 결과를 도시한다.

도 26은 IFNγ 분비에 대한 ELISPOT 분석 결과를 도시한다. 면역화된 및 보통(naive) 마우스 (정상 1 및 2)로부터 얻은 마우스 비장세포를 37-mer 펩티드가 있거나 없는 조건에서 하룻밤 자극시킨 뒤 해부현미경으로 스폿형성단위(SFU)를 계수하였다.

도 27은 72시간 동안 배양된 증가하는 농도의 Mab C4에 대한 함수로서, 폐암 Ben 및 Colo 338 세포의 ³H-티미딘 편입 변화 백분율을 도시하고, 여기서 Mab C4 에 의해 Ben 및 Colo338의 90% 및 60% 억제율이 각각 유도되었다. 점, 3개의 실험 결과의 평균치, 막대값, 표준편차(SD) 등을 표시하였다.

첫번째 측면에서, 본 발명은 암세포를 크립토-1 단백질의 결합 파트너 (예, 모노클로날 항체나 그의 단편)로 처리하는 것을 포함하는 암세포 내의 아폽토시스 유발 방법을 제공한다.바람직하게는, 상기 결합 파트너는 크립토-1 단백질에 특이적으로 결합하고, 더 바람직하게는 실질적으로:CPPSFYGRNCEHDVRKE (서열번호 1)혹은ELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKE (서열번호 2)에 상응하는 크립토-1 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다.

두번째 측면에서, 본 발명은 크립토-1 단백질에 특이적으로 결합하는 것으로서, 암세포 내에 아폽토시스를 유발할 수 있는 모노클로날 항체 혹은 그의 단편을 제공한다.

세번째 측면에서, 본 발명은 상기 두번째 측면의 모노클로날 항체 혹은 그의 단편을 경우에 따라 약제학적 수용가능한 담체 혹은 희석제와 조합한 것을 포함하는 항암제를 제공한다.

네번째 측면에서, 본 발명은 상기 세번째 측면에 따른 항암제를 유효량으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서의 암 치료방법을 제공한다.

다섯번째 측면에서, 본 발명은 크립토-1 단백질이나 그의 항원성 단편, 혹은 크립토-1 단백질이나 그의 항원성 단편을 코딩하는 발현가능한 DNA 분자를 경우에 따라 약제학적 수용가능한 부형제 혹은 보조제와 조합하여 포함하는 암백신을 제공한다.

여섯번째 측면에서, 본 발명은 상기 다섯번째 측면에 따른 암백신을 유효량으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서의 암 치료방법을 제공한다.

일곱번째 측면에서, Pim-1 단백질에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 암세포 종류의 증식을 억제하는 Pim-1 단백질의 분리된 결합 파트너를 제공한다.여덟번째 측면에서, 본 발명은 상기 일곱번째 측면의 결합 파트너를 경우에 따라서 약제학적 수용가능한 담체 혹은 희석제와 조합하여 포함하는 항암제를 제공한다.아홉번째 측면에서, 본 발명은 상기 여덟번째 측면에 따른 항암제를 유효량으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서의 암 치료방법을 제공한다.열번째 측면에서, 본 발명은 결장암 세포 용리물 내에 존재하는 항원의 분리된 결합 파트너를 제공하며, 이때 상기 항원은 SDS-PAGE로 계산시 16kd 혹은 30kd 의 분자량을 갖고, 또한 상기 결합 파트너는 상기 항원에 특이적으로 결합하고 또한 하나 이상의 암세포 종류의 증식을 억제한다.열한번째 측면에서, 본 발명은 상기 열번째 측면의 결합 파트너를 경우에 따라 약제학적 수용가능한 담체 혹은 희석제와 조합하여 포함하는 항암제를 제공한다.또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 열한번째 측면에 따른 항암제를 유효량으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서의 암 치료방법을 제공한다.

본 발명의 결합 파트너는 바람직하게는 하나 이상의 결장암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 백혈병 세포 및 폐암 세포의 증식을 억제하며, 크립토-1 단백질, Pim-1 단백질 혹은 결장암 세포 내에 존재하는 항원에 결합하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 상기 결합 파트너는 항체나 그의 단편이지만, 크립토-1 단백질 (Bianco C. et al., "Cripto-1 indirectrly stimulates the tyrosine phosphorylation of erb B-4 through a novel receptor", J. Biol Chem, 274(13), pp 8624-8629 (1999)), Pim-1 단백질 혹은 결장세포 용리물 항원에 대한 수용체 단백질 혹은, 그렇지 않을 경우, 상기 크립토-1 단백질, Pim-1 단백질 또는 결장세포 용리물 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 다른 펩티드, 폴리펩티드 혹은 단백질이 될 수도 있다. 본 명세서에 있어서, "특이적으로 결합하는" 이란 용어는 크립토-1 단백질, Pim-1 단백질 또는 결장세포 용리물 항원에 대해 독점적으로 결합하거나 또는 기타의 포유류 단백질과의 교차반응이 극소인 펩티드, 폴리펩티드 혹은 단백질의 결합 특성을 의미하는 것으로 이해된다.

더 바람직하게는, 본 발명에 따른 결합 파트너는 항체나 그의 단편 중에서 선택되고 특히, 다음의 아미노산 서열:

CPPSFYGRNCEHDVRKE (서열번호 1)

에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 크립토-1 단백질, Pim-1 단백질, 또는 결장암 세포 용리물 내에 존재하는 항원의 항원성 결정인자에 결합하는 모노클로날 항체나 그의 단편 중에서 선택되며, 여기서 상기 항원은 SDS-PAGE로 계산하였을 때 16Kd 혹은 30Kd 의 분자량을 갖는다. 16Kd 및/또는 30Kd 항원은 결장암 세포 및/또는 유방암 세포의 증식에 필요한 성장인자일 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 공지된 임의의 표준방법에 의해 제조될 수 있다. F(ab')₂, Fab 및 Fc 와 같은 모노클로날 항체의 단편은 예컨대 공지된 표준방법인 펩신 및 파파인 절단이나 또는 하이브리도마 세포주나 항체-생성 동물세포로부터 분리된 항체 유전자의 발현을 수반하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 특히 바람직한 항체 단편은 단일사슬 Fv(scFv) 항체 단편이다. scFv의 제조방법은 Pluckthun A (Bio/Technology, 9, pp 545-551 (1991))및 미국특허 제4,946,778호에 개시되어 있다. 상기 2가지 문헌에 포함된 내용은 본 명세서에 참조로 포함되는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 항체 단편은 고형 종양, 특히 큰 종양에 대한 침투력이 향상되므로 모노클로날 항체 및 다른 "대형" 결합 파트너 형태보다 우수한 장점을 제공할 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체 및 항체 단편은 미국특허 제5,225,539호에 개시된 기술 (개시된 내용은 본 명세서에서 참조로 포함됨)에 따라 인간화할 수 있다.

모노클로날 항체 및 항체 단편은 또한, 인간 항체 혹은 항체 단편을 제조하기 위하여, 인간 골수종 세포주 (예, Karpas 707H 인간 골수종 세포주; Karpas A, et al. "A human myeloma cell line suitable for the generation of human monoclonal antibodies", Proc Natl Acad Sci USA, 98, pp 1799-1804 (2001)) 에 융합된 면역화된 동물 (예, 마우스나 래트) 유래의 비장세포를 이용하여 제조할 수도 있다. 키메라형 마우스/인간 모노클로날 항체는 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 Mount PF, et al. 의 방법 ("Chimeric (mouse/human) 항-결장암 항체 c30.6 inhibits the growth of human colorectal cancer xenografts in scid/scid mice", Cancer Research, 54, pp 6160-6166 (1994))에 따라 제조될 수 있다.

모노클로날 항체 및 항체 단편은 표준방법 (예, 발효기를 사용하여 조직 배양 혹은 혈청 부재 상태에서의)에 의해 대량으로 제조되고, 단백질 A (예, 뮤린 Mab용), 단백질 G(예, 래트 Mab용) 혹은 MEP HYPERCEL (예, IgM 및 IgG Mab용) 같은 친화성 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다.

본 발명의 결합 파트너는 세포독성 화합물 혹은 상술한 바와 같은 그 외의 물질에 콘쥬게이트될 수 있다. 바람직한 세포독성 화합물은 안트라사이클린 (Idarubicin, Doxorubicin, Daunorubicin 및 Epirubicin 등의), 5FU, 토포이소머라제 억제제 (Irinotecan 등의), 시스플라틴, 카르보플라틴 및 탁솔 같은 제1차 화학요법제를 포함한다.

본 발명의 결합 파트너는 또한 1차 결합 단백질과 결합되는 2차 결합 단백질 (예, 아비딘)을 투여하여 결합 파트너들 간의 가교화를 가능하게 하는 1차 결합 단백질 (예, 비오틴)에 콘쥬게이트될 수 있다. 하기의 실시예 11에서 설명하는 바와 같은 시험관내 실험에서, 2차 항체와의 가교화는 유방암 세포의 증식 억제력 증가를 달성한다. 또한 예비실험은 유사한 결과를 결장암 세포에 대해서도 달성할 수 있음을 나타낸다.

또한, 본 발명의 결합 파트너는 파노렉스 (Centacor, Glaxo), 리툭신 (Genentech, Roche) 혹은 헤르셉틴 (Genentech, Roche) 같은 항체들에 가교화될 수도 있다. 이들 2차 항체는 각각 결장암, 임파종 및 유방암에 대해 효과적인 것으로 알려져 있다.

바람직하게는, 본 발명의 결합 파트너는 적절한 약제학적 수용가능한 담체 혹은 희석제와 조합되어 항암제 (인간 혹은 동물에 사용되는)를 형성한다. 적절한 담체 혹은 희석제는 등장성 식염수액, 예컨대 인산염 완충 식염수를 포함한다. 조성물은 비경구형, 근육내, 정맥내, 피하내, 비강내, 구강내 혹은 피부내 투여 용도로서 제형화 될 수 있다. 전형적으로, 결합 파트너 (예, 항체나 항체 단편)는 약 0.01 내지 30mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 10mg/kg 체중의 약량으로 투여된다. 그러나, 투여 경로 및 상술한 약량은 당해 분야의 업자라면 대상 및 암의 상태에 따라 최적의 투여 경로 및 약량을 쉽게 결정할 수 있을 것이므로 가이드로서 제시된 것에 불과함을 이해할 것이다.

항암제는 대상의 암을 치료하는 방법에 이용될 수 있다. 상기 방법은 암의 크기를 감소시키거나 혹은 적어도, 더이상의 증식 및/또는 확대(spread)를 억제할 수 있다. 상기 방법은 또한 방사선요법, 화학요법 (예, 안트라사이클린, 5FU, 토포이소머라제 억제제, 시스플라틴 및 카르보플라틴을 사용), 혹은 호르몬 요법 혹은 호르몬 변화제 (예, 카타목시펜) 를 활용하는 요법과 같은 전통적인 암치료법과 병행하여 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 암 용도의 백신 및 이들을 대상의 암을 치료하는 방법에 사용하는 용도로 확대된다. 이러한 백신은 크립토-1 단백질 (혹은 그의 항원성 단편), Pim-1 단백질 (혹은 그의 항원성 단편) 또는 결장암 세포 용리물 내에 존재하는 항원이나 또는, 다른 한편으로는 크립토-1 단백질 (혹은 그의 항원성 단편), Pim-1 단백질 (혹은 그의 항원성 단편) 또는 결장암 세포 용리물 내에 존재하는 항원을 코딩하는 발현가능한 DNA 분자를 포함할 수 있다.

전형적으로, 이러한 백신은 주사물 특히 액상 용액이나 현탁액 형태로 제조된다; 주입전에 액상으로 되는 용액이나 현탁액을 수용하기에 적절한 고체 형태로도 제조될 수 있다. 제조물은 또한 에멀젼화 되거나, 단백질 혹은 DNA가 리포좀 속에 캡슐화된다. 단백질 또는 DNA는 또한 약제학적 수용가능한 부형제나 보조제와 혼합해도 좋다. 적절한 부형제는 예컨대, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올류 및 그의 조합물이다. 적절한 보조제는 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 및 알루미늄 칼륨 설페이트 (알럼)를 포함한다.

본 발명은 또한 암세포 내에 아폽토시스를 유발하기 위한 방법으로서, 상기 세포를 크립토-1 단백질, Pim-1 단백질 혹은 결장암 세포 용리물 내에 존재하는 항원의 결합 파트너로 처리하는 것을 포함하는 방법으로 확대된다. 암세포를 치료하는데 이용되는 결합 파트너의 양은 특정한 결합 파트너의 성질과 동일성, 또한 암세포의 환경 (예, 시험관내 세포 배양 혹은 종양 모델 혹은 암 환자 같은 생체내 셋팅에서)에 따라 변화하게 된다. 그러나, 당해분야의 지식을 가진 경우라면 결합 파트너의 아폽토시스-유발 효과량을 결정하는 것이 어렵지 않다.

본 발명은 또한 세포독성 화합물에 대해 암세포를 감작시키는 방법으로서, 상기 세포를 크립토-1 단백질, Pim-1 단백질 혹은 결장암 세포 용리물 내에 존재하는 항원의 결합 파트너로 처리하는 것을 포함하는 방법으로 확대된다. 암 세포를 감작하는데 이용되는 결합 파트너의 양은 특정한 결합 파트너의 성질과 동일성, 또한 암세포의 환경 (예, 시험관내 세포 배양 혹은 종양 모델 혹은 암 환자 같은 생체내 셋팅에서), 및 세포가 감작할 세포독성 세포의 성질과 동일성에 따라 변화하게 된다. 그러나, 당해분야의 지식을 가진 경우라면 결합 파트너의 효과적인 감작 함량을 결정하는 것이 어렵지 않다.

마지막으로, 본 발명은 대상에게 실질적으로 다음에 상응하는 아미노산 서열:

ELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKE (서열번호 2)

혹은 그 항원성 단편을 포함하는 유효량의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암세포에 대한 CTL 반응을 유도하는 방법으로 확대된다.

본 명세서에서 "포함한다" 혹은 "(복수개를) 포함한다" 나 "포함하는" 과 같은 상기 용어의 변형은 언급된 성분, 숫자 혹은 단계나 또는 일군의 성분, 숫자 혹은 단계들을 포함하는 것을 의미하나, 그외의 다른 성분, 숫자 혹은 단계나 또는 일군의 성분, 숫자 혹은 단계들을 배제하는 것은 아니다.

아미노산 서열과 관련하여 언급한 "실질적으로 상응하는" 이란 용어는 특정한 아미노산 서열뿐만 아니라 실질적으로 특정한 아미노산 서열의 생물학적 활성을 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 혹은 부가를 포함하는 것만 상이한 연관된 아미노산 서열을 포괄하는 것을 의미한다. 특히, 이 문장은 하나 이상의 보존형 아미노산의 치환을 포함하는 것에서만 상이한 연관된 아미노산 서열을 포괄하는 것을 의미한다. 보존형 아미노산 치환물에 있어서, 원하는 조합은 G,A; V,I,L,M; D,E; N,Q; S,T; K,R,H; F,Y,W,H; 및 P, Nα-알킬아미노산 이다.

본 발명의 상세한 설명에 포함된 공지문헌, 실험, 재료, 장치, 제품 등에 대한 검토는 본 발명의 배경을 설명하기 위한 목적에 불과하다. 이들 사항은 본 발명의 출원 우선일 이전에 존재하였으므로 어느 것도 공지기술의 일부를 구성하는 것에 관하여 허가를 받지 아니하거나 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식에 해당하였다.

본 발명은 다음의 비제한적인 실시예 및 첨부 도면을 참조하여 상세히 기술된다.

실시예:

서문

결장암의 경우 방사선요법에 전혀 반응하지 않고 또한 5FUDR, 레바마졸 같은 약물에 대하여 거의 반응하지 않으나 최근들어 토포이소머라제 억제제인 이리노테칸에서는 몇가지 개선점이 발견되었다. 결절을 통한 원거리의 전이(Dukes D)에까지 국지적으로 전파된 병이 심화된 결장암 환자 (예, Dukes B, C, D)의 예후는 나쁘다; Dukes D 에서, 진단 후 1년간 생존한 환자는 거의 없다.

유방암의 경우, 초기암 환자가 아니어도 그 예후가 훨씬 양호하며 다수의 환자가 세포독성/호르몬 및 방사선요법 치료가 잘 듣는다. 유방암은 HER-2/neu 양성 (대체로 환자의 약 30%에서)이면, 일부 환자들이 상술한 HER-2/neu Mab 에 대해 양호하게 반응한다.

결장암 및 유방암에 관한 새로운 치료법을 확인 및 개발하기 위한 지속적인 노력이 요망된다.

항체의 제조

(1) 루이스 래트를 다음의 서열을 가진 크립토-1 단백질 유래의 KLH-커플링 17-아미노산 펩티드를 이용하여 공지의 표준 방법에 따라 면역화 하였다 : CPPSEYGRNCEHDVRKE (서열번호 1). 이 서열은 인간 및 마우스 크립토-1 단백질의 97-113 잔기에 상응한다. 이는 EGF 족의 다른 멤버(member)들과 구별되는 크립토-1의 변형 EGF-유사 모티프의 일부를 형성한다 (Brandt R, et al. "Identification and biological characterization of an epidermal growth factor-related protein: cripto-1", J Biol Chem, 269, pp 17320-17328 (1994); Salomon DS. "Cripto: a novel epidermal growth factor (EGF)-related peptide in mammary gland developmentand neoplasia", Bioassays, 21, pp 61-70 (1999) 참조).

(2) Balb C 마우스를 종양 조직을 동결건조한 뒤 해동하고 이를 3회 반복하여 제조한 결장세포 용리물을 이용하여 종래의 표준 방법에 따라 면역화하였다. 동결/해동 시료는 다시 프로테아제 억제제를 함유하는 인산염 완충 식염수로 각 회당 1분간 3회 균질화 하였다.

(3) Balb C 마우스를 글루타티온-S-트랜스페라제(GST)와 융합된 59kD의 Pim-1의 융합 단백질을 이용하여 표준 방법에 따라 면역화 하였다 (Dr Nancy S Magnuson, Department of Microbiology, Washington State University, USA에 의해 제공됨).

면역화된 래트에서 나온 비장세포를 분리 및 미엘로마 NS1 세포로 융합하여 항체-분비 하이브리도마를 제조하였다 (Xing PX, et al. "Monoclonal antibodies to mucin VNTR peptides", Methods Mol Biol, 125, pp 369-381 (2000) 참조). 하이브리도마는, 50㎍/ml (1 x 10⁵)의 항-크립토-1 Mab (C3 및 C13)의 존재하에서 혹은 존재하지 않을 때에, 25cm² 플라스크 (10ml 배지를 함유함) 내에서 LS174T 및 MCF7 세포 (1 x 10⁵)의 증식을 포함하는 간단한 분석을 이용하여, 시험관내에서 암세포주 (예, 결장 세포주 LS174T 및 HT29, 또한 유방암 세포주 MCF7)의 증식을 억제하는 항체-함유 상등액의 능력을 평가하여 초기에 스크리닝하였다. 배양 6일째 위상차 현미경으로 살아있는 세포를 계수하였다.

암세포 증식의 억제에 대한 분석

증식 억제는 또한 트리티에이트(tritiated) 티미딘의 흡수 억제를 측정하고, 트리판 블루 배타 분석법 혹은 세포의 세포성 단백질 함량을 측정하기 위한 신속하고 민감한 방법으로서 비색계 세포독성 분석 SRB (술포호다민 B)를 이용하여 수작업으로 세포수를 세어 평가하였다 (Skehan P, "New calorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening", J Natl Cancer Inst. 82, pp 1107-1112 (1999) 참조).

실시예 1: 항-크립토-1 항체의 분리 및 실험 결과의 요약

분리된 두가지 Mab (즉, C3 및 C13)는 세포 생존 및 증식을 촉진하는 성장 인자로 나타나고 또한 배아 발달 및 암에서 중요하며(Brandt R, 상기 참조), 다수종(예, 제노푸스, 제브라피쉬, 마우스 및 인간)에서 언급한 바 있는 가용성, 혹은 가능하다면, 세포 표면 (Mr 36Kd) GPI-결합 단백질인 크립토-1 (인간의 CR1, 마우스의 tdgfl 에 의해 코딩되는 EGF 패밀리 멤버)에 결합한다. 중요한 것은, 본 발명에 있어서, 크립토-1의 발현이 인간의 결장암, 위암, 췌장암, 유방암 및 폐암에서 수배로 증가되며, 이러한 증가가 전암(前癌) 상태의 병변에서 검출할 수 있다는 것이다 (Brandt R, 상기 참조; Saeki T. et al. "Differential immunohistochemical detection of amphiregulin and cripto in human normal colon and colorectal tumours", Cancer Res, 52, pp 3467-3473 (1992); Salomon DS, 상기 참조; Panico L. et al. "Differential immunohistochemical detection of transforming growth factor alpha, amphireguliln and CRIPTO in human normal and malignant tissues", Int J Cancer, 65, pp 51-56 (1996) 참조). 예를 들어, 정상 결장 및 유방세포는 크립토-1를 함유하지 않으나 결장 및 유방암의 경우 85% 에서 발견된다.

이들 항-크립토-1 Mab 는 아직 이들이 (특히 인간 유선의 발달, 수유 및 임신중일 때) 결합하는 조직의 분포에 관하여는 완전히 특징화 되지 않았으나, 신선한 혹은 포르말린 고정된 인간 조직에 이뮤노페록시다제 염색을 사용하는 경우, Mab가 암특이적이고 또한 결장암 (60%) 및 유방암(70%)에 존재하나 정상 결장 조직에서는 결핍되어 있는 항원에 결합한다는 것을 보여준다. 또한, 본 발명은 항-크립토-1 Mab가 마우스 종양과 반응하는 것을 관측하였다. 더 중요하게는, 이들 항체가 조직 배양시 결장암 세포주 LS174T 및 유방암 세포주 MCF7의 증식을 현저하게 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 이들 Mab는 백혈병, 폐암 세포 및 전립선암 세포도 억제하는 것으로 나타났다.

다른 실험에서, 상기 항체를 2차 항-래트 항체와 시험관내에서 가교시 아폽토시스의 증가를 달성할 수 있음이 밝혀졌다. 약량 반응 실험 역시 5FU, 시스플라틴 및 카르보플라틴을 포함하는 세포독성 화합물을 이용하여 시험관내에서 시행하였으며, 그 결과 Mab를 세포독성 화합물과 병용하는 경우 실질적인 암세포 분할 및 증식의 억제 수준의 증가를 달성하게 되는 것 뿐만 아니라, 세포수의 감소를 실현할 수 있음이 입증되었고, 이는 Mab 가 암세포의 아폽토시스를 유도하였음을 가리킨다.

실시예 2: 모노클로날 항체 C4 내지 크립토-1

항-크립토-1 모노클로날 항체 Mab인 C4는 Mab C3 및 C13을 얻는 것과 동일한 방법으로 얻었다. 각 크립토-1 Mab는 (a) 타겟 조직에 대한 항체의 결합을 측정하기 위한 이뮤노페록시다제 염색의 검출, (b) 선택된 세포주 내의 ³H-티미딘 분석 등과 같은 세포 증식 억제력 분석 (티미딘 편입에 의한 억제력이 >60% 인 항체) 및 (c) 트리판 블루 배타법에 의해 측정시 세포수의 2배 감소 검출에 의해 선택되었다. 도 1의 상단선은 공동 배양 72시간 후 Mab C4 에 의한 LS174T 결장암 세포주의 억제력을, 도 2는 10ml 배지가 들어있는 25cm² 플라스크 내에서 1 x 10⁴의 세포주를 30㎍/ml의 각 Mab와 함께 배양한지 7일후의 Mab C4, C3 및 C13에 의해 세포수가 감소한 것을 도시한다. 항체는 또한 약물처리되는 세포에 대해 Mab를 첨가하는 경우 0.0938 내지 0.75㎍/ml의 약물로 단독 배양하는 것과 비교하여 ³H-티미딘 편입이 감소함으로써 시스플라틴에 대한 LS174T의 감수성을 향상시켰다.

유사한 결과를 에피루비신 및 5FU에 대해서도 얻었다. 0, 10, 20 및 30㎍/ml Mab C4로 72시간 배양한 후, LS174T 세포에 의한 트리티에이트 티미딘의 편입은 0.04, 0.08, 0.1625 및 0.125㎍/ml의 약물의 존재하에서 50 내지 90%로 억제되었다. 5FU의 경우, 티미딘 편입은 1.5, 1.9, 2.1 및 2.4㎍/ml의 약물의 존재하에서 50 내지 90%로 억제되었다. 5FU는 결장직장암의 치료의 기조이며 항대사제이다. 5FU, 시스플라틴, 에피루비신의 병용시 얻어지는 상승효과는 임상적으로 유용할 것이다.

실시예 3: 암 및 정상 조직에 대한 항-크립토-1 항체의 결합 시험

항-크립토-1 Mab는 FACS 및 이뮤노페록시다제 염색으로 시험했을 때 LS174T, HT29(결장암), MCF7, T47D(유방암), DU145 및 PC3(전립선암), Ben 및 Colo 235(폐암) 과 같은 다수의 암세포주와 반응하였으나, 배아 신장 세포주 293과는 반응하지 않았다. 상기 3가지 Mab는 또한 이뮤노페록시다제 염색으로 시험했을 때 결장암(7/9), 유방암(5/7), 모든 종류의 폐암(18/20), 위(3/4), 췌장(1/2)과 같은 포르말린-고정된 조직들과는 반응하였으나, 정상의 유방(0/4), 결장(0/8), 폐(0/4), 위(0/2), 췌장(0/2), 간(0/3) 및 임파구(0/3)과는 반응하지 않았다. 염색 강도 및 백분율은 음성에서 매우 강한 양성까지 다양하였으며, 이는 크립토-1의 발현이 다양한 암에서 다양하게 변한다는 것을 나타낸다. 도 3a는, 도 3b에서 항체에 의한 정상 유방 조직의 염색이 전혀 없는 것과 비교하여, Mab C4에 의해 유방암 조직이 이뮤노페록시다제 염색되는 것을 나타낸다.

실시예 4: 마우스 내에서 결장 및 전립선암 세포의 증식에 대한 항-크립토-1 항체의 생체내 억제 효과

SCID 마우스(6-8 주령)를 제0일에 2 x 10⁶ 전립선암 세포주 DU145를 피하주사하여 접종하고, 6시간 후 마우스에 500㎍의 Mab C4를 복강 투여하여 처리한 뒤 제2일, 4일, 7일, 9일 및 10일에는 250㎍을 또한 제14일 및 17일에는 125㎍를 투여하여 처리하였다. 인산염 완충 식염수(PBS)(0.5ml)을 대조군으로 사용했다. 제24일에 종양을 제거하고 측정했다. 종양 크기와 중량은 Mab C4의 처리에 의해 현저하게 감소했다 (도 4a 및 4b).

유사한 결과가 LS174T 세포 접종후 Mab C13을 500㎍으로 사용하고 다시 제2일, 7일, 9일, 11일 및 13일에 250㎍ 으로 사용하는 결장암 모델에서도 나타났다 (도 5a 및 5b). 중량을 측정하기 위해 제25일에 종양을 절제했다.

실시예 5: 항-크립토-1 항체에 의해 유도된 아폽토시스

항-크립토-1 모노클로날 항체는 ³H-티미딘 흡수의 감소에 의해 측정된 바와 같이 세포 분열을 중지시켰고 세포수를 감소시켰으며(각각 도 1 및 2), 이는 Mab 가 암세포의 아폽토시스를 유발하였음을 나타낸다. 이것은 또한 DNA 단편화 및 FACS 분석에 의해서도 확인되었다 (도 6 및 7).

도 6에서, 가용성 DNA는 50㎍/ml의 Mab C3으로 72시간 동안 처리한 LS174T로부터 추출하였고, 2% 아가로스겔로 전기영동 처리하였다. 대조군 시료는 세포배양 배지로 처리한 세포로부터 얻었다.

도 7은 30㎍/ml Mab C4로 72시간 동안 처리하거나 대조군 항체 Mab BCP7로 처리한 LS174T 세포를 도시하며, 그 뒤 아폽토시스의 표시자인 요오드화 프로피듐(PI) 염색성을 측정하기 위해 유세포 분석법으로 분석하였다. 그 결과 시험 Mab로 처리한 세포에서의 PI 염색성 증가가 나타났다.

실시예 6: 항-크립토-1 항체에 의해 매개된 신호 전달

(i) 항-크립토-1 Mab 유도성 JNK 활성화

단백질 키나제 모듈에 의해 제어된 신호 전달 경로는 세포 증식, 분화 및 아폽토시스를 포함한 중요한 세포 기능을 조절한다. 아폽토시스를 조절하는 3가지 주요 키나제 캐스캐이드가 동정되었으며, 3가지 상이한 미토겐-활성화된 단백질 키나제군의 활성화에서 정점에 달한다. 세포외 신호-조절된 키나제 (ERK), JNK/SAPK 및 p38. ERK는 미토겐 및 생존 인자에 의해 활성화 되고 반면에, JNK/SAPK 및 p38 은 스트레스 신호에 의해 자극된다. JNK/SAPK 및 p38 경로를 포함하는 스트레스-활성화된 키나제 캐스캐이드는 상이한 아폽토시스 자극에 반응하여 활성화 되며 아폽토시스 과정에서 결정적인 역할을 하는 것으로 보인다.

항-크립토-1 매개성 아폽토시스에서의 JNK 및 p38 활성화의 역할을 상이한 농도의 Mab 및 다양한 배양 시간을 이용하는 결장암 LS174T에서 조사하였다. 특히, JNK/SPAK는 약량 의존 방식으로 항-크립토-1 Mab로 3시간 배양한 뒤에 LS174T 세포에서 활성화 되었다 (도 8a). JNK 활성화는 24시간 노출후 최고 레벨이 되었으며 (도 8b 및 8d), 48시간 이내에 감소하여 배양후 72시간이 되면 기저 레벨로 복귀하였는데 (도 8d), 이는 항-크립토-1 항체에 의한 JNK가 시간 의존성임을 나타낸다.

(ii) p38 활성화에 선행하는 항-크립토-1 항체에 의한 JNK 활성화

스트레스 관련 p38 경로를 항-크립토-1 Mab 처리 뒤 LS174T 세포 내에서 조사하였다. p38 활성화는 활성화된 JNK 레벨이 감소한 때인 Mab 노출 48시간 뒤에 일어났다. p38은 상승된 JNK가 기저 레벨로 복귀한 때인 72시간에 더 활성화 되었다 (도 8d). 따라서, JNK 활성화는 Mab 에 의해 유도된 아폽토시스에 앞서서 일어난 반면에 p38은 아폽토시스가 일어나고 있는 시기 동안에 활성화 되었는데, 이는 양측의 신호가 Mab 유발 아폽토시스에 수반될 수 있음을 제시한다. 대조적으로, 시스플라틴은 JNK 및 p38 MAPK 활성화를 모두 유발하였으며 (도 8a 및 8c), 이는 Mab가 시스플라틴과 다른 방식으로 JNK 및 p38을 활성화 하였음을 나타낸다. 항-크립토-1 Mab 에 의한 시스플라틴 세포독성의 전위차 측정 결과(도 1)는 JNK 포스포릴화 (도 8a) 및 p38 MAPK (도 8b)의 증가에 동반하는 것이다.

따라서, 항-크립토-1 Mab 는 JNK 및 p38 양측의 활성화를 통해 종양 세포 아폽토시스를 유발한다.

(iii) ERK 및 Akt 포스포릴화 및 크립토-1 발현

ERK 및 Akt 생존 경로의 억제에 대한 Mab의 효과는 나타나지 않았다 (도 8b 및 8d). Mab 처리뒤 크립토-1 발현의 레벨 변화도 관측되지 않았다 (8b 및 8d). 이러한 예비 신호화 연구는 항-크립토-1 Mab가 JNK 활성화 경로를 통해 아폽토시스를 일으키는 것을 명확히 보여준다.

실시예 7: 항-크립토-1 항체에 의한 백혈병 세포의 억제

도 9는 Mab C3 및 C13가 T세포 임파세포성 백혈병 세포주 CCRF-CEM의 증식을 억제했음을 보여주는 결과를 나타낸다. 항체는 또한 이 세포주의 내약물성 변형체로서, P-글리코프로테인의 과잉발현에 의하여 그 특성을 취득하는 CEM/A7R의 증식도 억제하였다. 따라서, 이 세포주는 정상적으로는 다양한 종류의 자연 유도된 화학요법제에 대한 내성을 갖는다.

Mab C4는 내약물성 세포주 CEM/A7 및 CEM/A7R 뿐만 아니라 약물 감수성 마우스 티모마 세포주 (즉, E3)에 대해 유사한 억제효과를 나타내었다. E3과 비교하여, CEM/A7 및 CEM/A7R는 에피루비신에 대하여 각각 약 80 내지 40배의 내성을 나타낸다 (도 10a). 상기 항체는 에피루비신에 대한 내약물성 세포 (도 10b)와 약물 감수성 세포 (도 10c)를 감작하는 것을 보여준다. 따라서, C4는 급성 백혈병에서의 공통적인 문제인 내약물성을 극복할 수 있다.

실시예 8: 전립선암에 대한 항-크립토-1 항체의 효과

전립선암 세포주 PC3으로부터 나온 세포를 30㎍/ml Mab C3으로 6일간 배양했다. 세포수는 제2일, 3일 및 6일에 계수하였다. 도 11은 항체의 존재하에서 세포수가 현저하게 감소하였음을 도시한다. 유사한 효과를 도 12에서 도시한 바와 같이 내약물성 DU 145 세포에서 관측할 수 있었다.

Mab C3 은 또한 도 13 및 14에서 각각 도시한 바와 같이 약물 에피루비신에 대한 PC3 세포 및 약물 시스플라틴에 대한 DU 145 세포를 감작할 수 있었다.

실시예 9: 항-크립토-1 항체 및 항암 약물의 효과

결장암 세포 LS174T 내의 시스플라틴 같은 세포독성 약물의 억제 효과를 향상시키는 Mab C4의 능력이 상기 실시예 2에서 도시되어 있다. 유사한 효과가 도 15 및 16에서 각각 도시한 바와 같이 에피루비신 및 5FU에 관련하여 Mab C3 및 C13에 대해서 관측되었다.

실시예 10: 항-크립토-1 항체 및 유방암

도 17에서 보는 바와 같이, Mab C3은 유방암 세포 MCF7의 증식을 억제했고 또한 시스플라틴, 카르보플라틴 및 5FU 에 대해 세포를 감작시켰다. 유사한 결과를 Mab C13 및 에피루비신에 대해서 관측하였다 (도 18).

실시예 11: 항-크립토-1 항체의 가교화

Mab C3 은 항-래트 항체에 의해 가교화 되었다. Mab 가교화의 효과를, 2시간동안 상기 항체와 배양한 뒤 다시 4시간 동안 래빗-항 래트 항체로 배양하고 이어서 PI 염색함으로써 유방암 세포주 MCF7에서 조사하였다. 가교화 되지 않은 BCP7 및 Mab C3 를 대조군으로 사용했다. 도 19는 PI 염색을 이용하는 유세포 분석법으로 측정했을 때, Mab 가교화로 세포 사멸이 현저히 증가하는 것을 보여주었다.

실시예 12: 항-Pim-1 항체의 분리

2개의 분리된 Mab (즉, P4 및 P9)는 Pim-1 암유전자(oncogene)의 생성물에 대하여 발생하였다. 이 유전자는 ser-트레오닌 키나제류의 단백질에 속하는 단백질을 코딩한다. 항-Pim-1 항체는 마우스 티모마 E3 세포 (도 20)의 증식을 억제했으며 또한 결장암(도 21 및 22) 및 유방암 세포주의 시험에 따라 이들 항체는 백혈병 및 전립선암 세포주의 억제도 보여주었다 (데이터는 미제시).

실시예 13: 결장세포 용리물 항원에 대한 항체의 분리

5개의 분리된 Mab (즉, 1.14, 1.68, 2.20, 3.60 및 4.57)는 래트를 신선한 결장암 조직의 용리물로 면역화시킴으로써 미지의 항원에 대하여 발생되었다. 이들은 또한 조직 배양에서 결장암 세포주 LS1747 및 유방암 세포주 MCF7의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (도 23). 이들 항체는 또한 특별히 시스플라틴과 병용하는 경우 전립선암 세포주 DU145의 억제를 나타내었다 (도 24).

실시예 14: 항체의 인간화

완전한 인간 항-크립토-1 항체는 면역화를 위하여 KLH와 커플링된 2개의 펩티드 즉, (1) Mab C3, C4 및 C13의 제조를 위하여 이용된 17-mer (97-113)펩티드 (서열번호 1) 및 (2) 상기 17-mer 펩티드와 크립토-1의 추정되는 결합 위치 및 그의 수용체 ELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKE (서열번호 2)를 포함하는 37-mer 펩티드 p47 (77-113)을 항원으로 사용하고, 이것을 래트-항-크립토-1 Mab 의 제조를 위한 상술한 바와 동일한 방식으로 시험관내 및 생체내에서 시험함으로써 제조된다.

항원은 마우스를 면역화하고 이어서 비-분비형 미엘로마 세포주 NSO-bcl 2 (면역글로부린 유전자를 갖지 않음)과의 세포융합 및 스크린되거나, 혹은 그렇지 않은 경우 인간 Ig 마우스 (예, 제노마우스)를 면역화하는 것에 이용되는데, 여기서 상기 마우스의 면역글로부린 유전자는 "녹아웃" 되고, 이들이 인간 항체만을 생성하는 방식으로 인간 유전자로 대체되며 (nb 다중 면역화를 실행할 수 있고 마우스를 고친화성 항체의 존재에 대해 스크린하는), 이어서 마이크로플레이트형 세포 증식 억제 분석을 이용하여 억제 기능성을 갖는 항체를 생성하는 B-세포를 동정한다. 억제형 항체를 생성하는 개별 B-세포의 항체 코딩 유전자는 그 후 회수하여 적절한 재조합 후보 항체 생성물의 패널을 제조하는데 이용되며 각각은 스케일업 제조를 위한 것이다.

실시예 15: 항체의 임상적 사용

실시예 14에서 기술된 절차에 따라 제조된 인간 Mab를 0.5mg - 10mg/kg체중의 약량으로 정맥주사하여 환자에게 투여하게 된다. 환자는 또한 적절한 항암약물도 투여받을 수 있다.

실시예 16: 크립토-1 면역화

"수동적으로" 수용자에게 투여되는 항체와 대조적으로, 크립토 단백질 혹은 그의 항원성 단편을 "능동적으로" 면역화 하는데 이용하여 백신을 제조할 수 있다. 이러한 방법에서, 크립토 항원을 담체 (예, 알럼, 만난, 비이드 혹은 기타의 보조제)와 조합하여 암에 걸린 대상을 면역화하여 암예방을 위해 사용할 수 있다. 후발 면역반응은:

(a) 상술한 내용을 제한없이 포함하는 항체의 생성;

(b) MHC I 및 II 분자에 의해 제공되는 크립토 항원을 인지하는 T세포의 생산 (후발 T세포 반응은 다음과 같은 이펙터(effector) 세포로서 측정할 수 있다: 세포독성 T세포, 사이토카인 (예, ELISPOT이나 기타 다른 방법에 의한 인토페론 생성 세포), T세포 증식, 및/또는 생체내 지연형 과민성 반응); 및/또는

(c) 항체 및 세포성 면역의 조합일 수 있다.

따라서 크립토-1는 수용자에게 투여되는 항체를 생성하는데 사용되거나 또는 항체, T세포 혹은 양쪽을 모두 생성하도록 환자를 "백신화" 하는데 사용될 수 있다.

마우스는 실시예 14에서 언급한 KLH와 컨쥬게이트된 크립토-1 37-mer 펩티드를 CFA로 유화시킨 것을 사용하여 면역화하였다. 면역반응은 ELISA 및 ELISPOT IFNγ 분석법으로 시험했다. 마우스는 항체 및 INFγ 생성에 모두 반응했다 (도 25 및 26 참조).

실시예 17: 항-크립토-1 항체 및 폐암

Mab C4 는 또한 약량 의존 방식으로 폐암세포인 Ben 및 Colo 38 내의 ³H-티미딘의 편입을 억제했다. Ben 세포의 경우, 상기 편입은 대조군 세포와 비교하여 Mab로 72시간 배양한 뒤 90%로 억제되었다. Colo 38 세포에서는 억제율이 60% 이었다 (도 27).

폐암 세포주 Ben 혹은 폐암 조직의 이뮤노페록시다제 염색 결과를 또한 Mab C3 에 대하여 나타내었다: 폐암 세포의 세포 표면 및 세포질 모두에서 염색이 관측된 반면에 정상의 폐조직에서는 염색이 나타나지 않았다.

당해 분야의 전문가라면 특별한 구체예에서 보는 바와 같이, 본 발명의 사상 혹은 범위에서 벗어나지 않는 한도에서 본 발명으로부터 다수의 변형 및/또는 수정이 가능함을 이해할 것이다. 이들 구체예는 본 발명의 여러 측면을 예시하기 위한 것이다.

본 발명에 따른 결합 파트너는 결장암, 전립선암 및 유방암 세포의 증식을 억제할 수 있으며 또한 암세포 내의 아폽토시스를 유발하거나 세포독성에 대한 암세포의 감수성을 일으키는 방법에 이용될 수 있다.

<110> THE AUSTIN RESEARCH INSTITUTE <120> ANTIBODIES AGAINST CANCER <130> MOD:13135464 <150> PCT/AU PR 3958 <151> 2001-03-26 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys 1 5 10 15 Glu <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Leu Asn Arg Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly 1 5 10 15 Ser Phe Cys Ala Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His 20 25 30 Asp Val Arg Lys Glu 35

Claims (32)

1. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 크립토-1 단백질에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 크립토-1 단백질의 항원 결정 부위에 결합하는 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 항체 또는 항원 결합 단편은 암의 성장 또는 확대를 억제하는 약학적 조성물.
3. 청구항 1에 있어서,

   상기 항체 또는 항원 결합 단편은 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 결합 단편인 약학적 조성물.
4. 청구항 3에 있어서,

   상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화된 모노클로날 항체 또는 인간화된 모노클로날 항원 결합 단편인 약학적 조성물.
5. 청구항 4에 있어서,

   상기 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항원 결합 단편은 인간 모노클로날 항체 또는 인간 모노클로날 항원 결합 단편인 약학적 조성물.
6. 청구항 3에 있어서,

   상기 항체 또는 항원 결합 단편은 키메릭 모노클로날 항체 또는 키메릭 모노클로날 항원 결합 단편인 약학적 조성물.
7. 청구항 1에 있어서,

   상기 암은 대장암인 약학적 조성물.
8. 청구항 1에 있어서,

   상기 암은 유방암인 약학적 조성물.
9. 청구항 1에 있어서,

   상기 암은 전립선암인 약학적 조성물.
10. 청구항 1에 있어서,

    상기 암은 백혈병인 약학적 조성물.
11. 청구항 1에 있어서,

    상기 암은 폐암인 약학적 조성물.
12. 청구항 1에 있어서,

    상기 항체 또는 항원 결합 단편은 JNK나 p38 키나제 캐스캐이드의 활성화를 통해 아폽토시스를 유도하는 약학적 조성물.
13. 청구항 1에 있어서,

    상기 항체 또는 항원 결합 단편은 세포독성 화합물에 컨쥬게이트된 약학적 조성물.
14. 청구항 13에 있어서,

    상기 세포독성 화합물은 안트라사이클린, 5FU, 토포이소머라제 억제제, 시스플라틴, 카르보플라틴 및 탁솔로 구성된 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
15. 청구항 14에 있어서,

    상기 안트라사이클린은 이다루비신, 독소루비신, 다우노루비신 및 에피루비신으로 구성된 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
16. 청구항 14에 있어서,

    상기 세포톡성 화합물은 토포이소머라제 억제제 이리노테칸인 약학적 조성물.
17. 청구항 2에 있어서,

    암의 성장 또는 확대의 억제는 아폽토시스에 의한 것인 약학적 조성물.
18. 청구항 2에 있어서,

    암의 성장 또는 확대의 억제는 세포독성에 의한 것인 약학적 조성물.
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제