CN103764170A - 新的结合剂-药物缀合物(adc)及其用途 - Google Patents

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H-G.勒亨
S.埃尔谢赫
R.贝尔
S.布鲁德
B.斯特尔特-路德维希
H.耶里森
C.马勒特
S.格勒文
H.佩特鲁尔
J.舒马赫
L.林登
J.威卢达
C.C.科皮茨
S.戈尔菲尔
I.黑斯勒
A.哈伦加
K-H.蒂劳赫
S.博尔科夫斯基
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Abstract

本发明涉及针对靶标表皮生长因子受体(EGFR，基因ID1956)的N，N-二烷基耳他汀的新的结合剂-药物缀合物(ADC)，涉及这些ADC的活性代谢物，涉及合成这些ADC的方法，涉及这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途，以及涉及这些ADC用于生产药物的用途，所述药物用于治疗和／或预防疾病，尤其是过度增生性疾病和／或血管生成性疾病，例如癌症。此类治疗可以作为单一疗法或者与其它药物或其它治疗性措施联用来实施。

Description

新的结合剂-药物缀合物(ADC)及其用途
本申请涉及N，N-二烷基耳他汀的新的结合剂-药物缀合物(抗体-药物缀合物，ADC)，尤其是针对靶标表皮生长因子受体(EGFR，基因ID1956)的那些，涉及这些ADC的活性代谢物，涉及合成这些ADC的方法，涉及这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途，以及涉及这些ADC用于生产药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防疾病，尤其是过度增生性疾病和／或血管生成性疾病，例如，各种形式的癌症。此类治疗可以作为单一疗法或者与其它药物或其它治疗性措施联用来实施。
癌症是很多种组织的不受控制的细胞生长的结果。在很多情况下，所述细胞生长进现有组织(侵袭性生长)或者转移至远端器官。癌症发生在很多种器官中，并且该病变经常具有组织特异性的进程。因此，作为通用术语的该术语描述了不同器官、组织和细胞类型的一大群特定疾病。
在某些情况下，早期肿瘤可以通过手术和放疗措施除去。转移的肿瘤通常仅可通过化疗剂施用姑息性治疗。在该情况下目标是实现改善生命质量和延长寿命的最佳组合。
目前胃肠外给药的大部分化疗剂不是以靶向方式分布至肿瘤组织或肿瘤细胞，而是通过其全身性给药在患者体内非特异性地分布，即在经常不希望暴露于该药物的位置，例如健康细胞、组织和器官。这可能导致不良作用或甚至严重的一般毒性效应，然后该毒性效应经常严重限制治疗上有用的药物剂量范围，或必须完全停止用药。
因此，一方面，这些化疗剂在肿瘤细胞或立即包围组织中的改进的且选择性的可用性和相关的效果提高，以及另一方面，毒性副作用的最小化，已成为多年来开发新化疗剂的焦点。至今人们已作出很多尝试以开发将药物引入靶细胞的有效方法。但是，优化药物和细胞内靶标之间的关联以及使药物向例如相邻细胞的细胞间分布最小化仍然构成棘手的问题。
例如，单克隆抗体适用于肿瘤组织和肿瘤细胞的靶向定位。近年来，此类用于临床治疗癌症的抗体的重要性已经显著提高，这是基于此类试剂的效力，所述试剂例如曲妥珠单抗(赫赛汀)、利妥昔单抗(Rituxan)、西妥昔单抗(爱必妥)和贝伐珠单抗(阿伐他汀)，所述试剂此时已被批准用于治疗单独的具体肿瘤疾病(参见，例如，G.P.Adams和L.M.Weiner，Nat.Biotechnol.23，1147-1157(2005))。因此，对所谓的免疫缀合物(诸如前述ADC)的兴趣也已显著增加，例如，其中针对肿瘤相关抗原的内化抗体通过连接单元(“接头”)与细胞毒性剂共价结合。在将ADC引入至肿瘤细胞中并随后切割缀合物之后，细胞毒性剂本身或另一种由细胞毒性剂形成的细胞毒性的代谢物然后在肿瘤细胞内释放，其在肿瘤细胞中可以直接地且选择性地发挥其作用。与癌症的常规化疗相比，以该方式可以将对正常组织的损伤保持在显著更窄的限度内(参见，例如，J.M.Lambert，Curr.Opin.Pharmacol.5，543-549(2005)；A.M.Wu和P.D.Senter，Nat.Biotechnol.23，1137-1146(2005)；P.D.Senter，Curr.Opin.Chem.Biol.13，235-244(2009)；L.Ducry和B.Stump，Bioconjugate Chem.21，5-13(2010))。
除了抗体，小分子药物领域的结合剂也可以用作选择性地结合特定靶标(例如受体)的结合剂(参见，例如，E.Ruoslahti等人，Science，279，377-380(1998)；D.Karkan等人，PLoS ONE3(6)，e2469(2008年6月25日))。还已知细胞毒性药物和定位配体(addressing ligand)的缀合物在配体和药物之间存在确定的切割点用于药物的释放。一种这样的“预定的断裂点”可能由肽链组成，例如，该肽链可在特定位点通过位于作用位置的特异性酶而选择性地被切割(参见，例如，R.A.Firestone和L.A.Telan，美国专利申请US 2002／0147138)。
单克隆的抗体特别适合用于肿瘤组织和肿瘤细胞的靶向定位，特别是针对靶EGFR的那些。“表皮生长因子受体”(EGFR，基因ID1956)是一种属于酪氨酸激酶亚家族的跨膜糖蛋白(170kDa)。尽管EGF受体在许多正常细胞中表达，它在许多形式的人癌症中过表达，包括大肠和小肠的癌症、头颈癌、胰腺癌和神经胶质瘤。该过表达的程度与预后不良相关联(Galizia，G.等人，Ann.Surg.Oncol.，2006年6月，13(6)：823-35)。
配体EGF与EGF受体的结合会导致受体的二聚化和细胞内激酶结构域的活化。这些激酶结构域发生自磷酸化，并从而活化促增生性信号级联(包括经由促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Akt的那些)。这些信号级联调节在细胞生长和细胞存活、运动性和增殖中涉及的基因的转录。
通过EGF受体的信号转导也会导致野生型KRAS基因的活化，但是癌细胞内的KRAS基因的活化体细胞突变的存在会导致信号途径的调节异常和对EGFR抑制性治疗的抗性(Allegra等人，J.Clin.Oncol.，204月2009，27(12)：2091-6)。
在一个ADC方案中，除了抑制配体和受体之间的相互作用以外，可以通过连接的细胞毒性剂实现额外的抗肿瘤作用。
下述出版物一般性地描述了EGF受体和抗-EGFR抗体：WO 00069459A1，WO2010145796A2，WO02100348A2，EP00979246B1，EP00531472B1，Mendelsohn，J.，Baselga，J.，Oncogene(2000)19，6550-6565；M.L.Janmaat和G.Giaccone，Drugs of Today，第39卷，增刊C，2003，第61-80页；Normanno.N.，等人，Gene，2006年1月17日，366(1)：2-16，Epidermal growthfactor receptor(EGFR)signaling incancer。
耳他汀E(AE)和单甲基耳他汀E(MMAE)是多拉司他汀的合成类似物，是线性假肽的特定集合，所述线性假肽最初从海洋源分离，并且其中的一些对于肿瘤细胞具有极有效的细胞毒性活性(关于综述，参见，例如，g.R.Pettit，Prog.Chem.Org.Nat.Prod.70，1-79(1997)；G.R.Pettit等人，Anti-Cancer DrugDesign10，529-544(1995)；G.R.Pettit等人，Anti-Cancer DrugDesign13，243-277(1998))。
但是，MMAE具有较高全身毒性的缺点。为了提高肿瘤选择性，MMAE具体地与可酶促切割的缬氨酸-瓜氨酸接头结合以ADC方式使用，用于靶向肿瘤治疗(WO 2005／081711A2；S.O.Doronima等人，Bioconugate Chem.17，114-124(2006))。在蛋白水解性裂解以后，MMAE优选地从对应的ADC在细胞内释放。
但是，当以抗体-药物缀合物(ADC)的形式使用时，MMAE与抗体和药物之间的连接单元(接头)不相容，所述连接单元不具有任何可酶促切割的预定断裂点(S.O.Doronina等人，Bioconugate Chem.17，114-124(2006))。
单甲基耳他汀F(MMAF)是具有C-末端苯丙氨酸单元的耳他汀衍生物，与MMAE相比，其仅具有中等抗增殖活性。这极可能可归因于游离羧基，该羧基由于它的极性和电荷而对该化合物的细胞生存力具有负面效应。在该背景下，MMAF的甲基酯(MMAF-OMe)已被描述为具有中性电荷且可以穿过细胞膜的前药衍生物；对于各种癌细胞系，与MMAF相比，它也具有增加了多个数量级的体外细胞毒性(S.O.Doronina等人，Bioconugate Chem.17，114-124(2006))。可假定该作用由MMAF本身产生，所述MMAF在前药已经整合进细胞中以后通过细胞内的酯水解而快速释放。
Figure BDA0000432948840000041
但是，基于简单酯衍生物的药物化合物通常具有由于非特异性酯水解造成的化学不稳定性的风险，该非特异性酯水解不依赖于目标作用部位，例如通过存在于血浆中的酯酶来进行水解。这可以极大地限制此类化合物在治疗中的可用性。
已经在WO 2005／081711 A2中公开了单甲基耳他汀F(MMAF)及其各种酯衍生物和酰胺衍生物。在WO 01／18032 A2中描述了其它具有C-末端酰胺取代的苯丙氨酸单元的其它耳他汀类似物。在WO 02／088172 A2和WO 2007／008603 A1中要求保护涉及苯丙氨酸的侧链改性的MMAF类似物。WO 2007／008848 A2描述了其中苯丙氨酸的羧基被改性的MMAF类似物。最近，在WO 2009／117531 A1中描述了通过C-末端连接的耳他汀缀合物(也参见S.O.Doronina等人，Bioconjugate Chem.19，1960-1963(2008))。
此外，耳他汀衍生物诸如MMAE和MMAF也是被许多肿瘤细胞表达的转运蛋白等蛋白的底物，这可能导致对这些药物的抗性的发展。
本发明的目的是，提供新的结合剂-药物缀合物(ADC)，其由于新的N，N-二烷基耳他汀衍生物与合适的新接头和结合剂的组合而表现出非常有吸引力的活性谱，例如，以它们的特异性肿瘤效应和/或在细胞内形成的代谢物作为转运蛋白等蛋白的底物的潜力减小的方式，并且它们因此适合用于治疗和/或预防例如过度增生性疾病和/或血管生成性疾病，诸如癌症。
本发明的主题是，通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
Figure BDA0000432948840000051
其中
n代表1-50的数字，
AK代表结合剂，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
基团§-G-L1-B-L2-§§代表接头，
其中
§表示与基团AK的连接位点，且
§§表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000061
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000062
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000071
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000072
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000081
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
本发明的化合物包括式(I)的化合物和它们的盐和溶剂合物以及所述盐的溶剂合物，被式(I)涵盖的下面给出的式的化合物和它们的盐和溶剂合物以及所述盐的溶剂合物，以及下文作为示例性实施方案提及的并且由式(I)涵盖的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，在一定程度上在下面列出并且由式(I)涵盖的化合物并非已经存在的盐和溶剂合物以及所述盐的溶剂合物。
根据它们的结构，本发明的化合物可以不同的立体异构体形式存在，即以构型异构体的形式或者任选地也作为构象异构体(对映异构体和/或非对映异构体，包括阻转异构体形式的异构体)存在。因此，本发明包括对映异构体和非对映体及其各自的混合物。可以通过已知的方式从此类对映异构体和/或非对映体的混合物中分离立体异构体均一的组分。为此目的，优选使用色谱法，尤其是在非手性相或手性相上的HPLC色谱法。
如果本发明的化合物可以以互变异构形式存在，那么本发明还包括所有互变异构形式。
本发明也包括本发明的化合物的所有合适的同位素变体。本发明的化合物的同位素变体在这里被理解为是指这样的化合物：其中在本发明的化合物内至少一个原子已经被替换为相同原子序数的另一原子，但是所述另一原子的原子质量不同于在自然界中通常存在或优势存在的原子质量。可以掺入本发明化合物中的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，诸如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I和131I。本发明化合物的特定同位素变体(如特别是其中已经掺入一种或多种放射性同位素的那些)可能是有用的，例如，用于研究或药物在体内的作用机理或分布；由于比较而言容易的合成和检测，用3H或14C同位素标记的化合物特别适用于这些目的。另外，由于化合物的更大代谢稳定性，同位素(例如氘)的掺入例如可以导致某些治疗益处，例如延长体内半衰期，或减小必需的活性剂量。因此，本发明化合物的这种改性也可以任选构成本发明的优选的实施方案。通过本领域技术人员熟悉的方法，例如根据在下面描述的方法和在示例性实施方案中给出的操作，通过使用各自的试剂和/或起始化合物的相应的同位素改性，可以合成本发明化合物的同位素变体。
在本发明范围内，优选的盐是本发明化合物生理学上安全的盐。这还包括这样的盐：尽管该盐本身不适合于药物应用，但可将其用于例如分离或纯化本发明的化合物。
本发明化合物的生理学上安全的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如以下酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸。
本发明化合物的生理学上安全的盐还包括常规碱的盐，例如(仅为示例性并优选)碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)和衍生自氨或含有1-16个碳原子的有机胺的铵盐，所述有机胺例如(仅为示例性并优选)乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苯甲酰胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1，2-乙二胺。
在本发明范围内，溶剂合物表示这些形式的本发明化合物：所述化合物通过与溶剂分子配位而形成的固态或液态形式的复合物。水合物是溶剂合物的一种具体形式，其具有配位的水分子。在本发明范围内，水合物是优选的溶剂合物。
另外，本发明还包括本发明化合物的前药。本文中术语“前药”表示这样的化合物：该化合物本身可为生物活性或无生物活性的，但其在体内停留过程中转化为本发明的化合物(例如通过代谢或水解)。
在本发明范围内，除非另有说明，取代基具有下述含义：
在本发明范围内，(C 1 -C 4 )-烷基代表具有1-4个碳原子的直链或支链烷基残基。作为例子且优选地，可以提及下述的：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、1-甲基丙基和叔丁基。
在本发明范围内，烷二基代表在每种情况下具有指定的碳原子数目的直链α，ω-二价烷基残基。作为例子且优选地，可以提及下述的：亚甲基、乙烷-1，2-二基(1，2-亚乙基)、丙烷-1，3-二基(1，3-亚丙基)、丁烷-1，4-二基(1，4-亚丁基)、戊烷-1，5-二基(1，5-亚戊基)、己烷-1，6-二基(1，6-亚己基)、庚烷-1，7-二基(1，7-亚己基)、辛烷-1，8-二基(1，8-亚辛基)、壬烷-1，9-二基(1，9-亚壬基)、癸烷-1，10-二基(1，10-亚癸基)。
在本发明范围内，(C 3 -C 7 )-环烷基和/或3-7元碳环代表具有3-7个碳原子的单环饱和环烷基。作为例子且优选地，可以提及下述的：环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
在R19的定义中的α-氨基酸的侧基是指，不仅包括天然存在的α-氨基酸的侧基，而且包括这些α-氨基酸的同系物和异构体的侧基。所述α-氨基酸可以以L或D构型存在，或者作为这些L和D形式的混合物存在。可以提及的侧基的例子包括：甲基(丙氨酸)、丙烷-2-基(缬氨酸)、丙烷-1-基(正缬氨酸)、2-甲基丙烷-1-基(亮氨酸)、1-甲基丙烷-1-基(异亮氨酸)、丁-1-基(正亮氨酸)、叔丁基(2-叔丁基甘氨酸)、苯基(2-苯基甘氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、p-羟基苄基(酪氨酸)、吲哚-3-基甲基(色氨酸)、咪唑-4-基甲基(组氨酸)、羟基甲基(丝氨酸)、2-羟基乙基(高丝氨酸)、1-羟基乙基(苏氨酸)、巯基甲基(半胱氨酸)、甲硫基甲基(S-美司坦)、2-巯基乙基(高半胱氨酸)、2-甲硫基乙基(蛋氨酸)、氨甲酰基甲基(天冬酰胺)、2-氨甲酰基乙基(谷氨酰胺)、羧甲基(天冬氨酸)、2-羧基乙基(谷氨酸)、4-氨基丁-1-基(赖氨酸)、4-氨基-3-羟基丁-1-基(羟基赖氨酸)、3-氨基丙烷-1-基(鸟氨酸)、2-氨基乙基(2，4-二氨基丁酸)、氨基甲基(2，3-二氨基丙酸)、3-胍基丙烷-1-基(精氨酸)、3-脲基丙烷-1-基(瓜氨酸)。在R19的定义中优选的α-氨基酸侧基包括甲基(丙氨酸)、丙烷-2-基(缬氨酸)、2-甲基丙烷-1-基(亮氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、咪唑-4-基甲基(组氨酸)、羟基甲基(丝氨酸)、1-羟基乙基(苏氨酸)、4-氨基丁-1-基(赖氨酸)、3-氨基丙烷-1-基(鸟氨酸)、2-氨基乙基(2，4-二氨基丁酸)、氨基甲基(2，3-二氨基丙酸)、3-胍基丙烷-1-基(精氨酸)。L构型在每种情况下是优选的。
在本发明范围内，4-7元杂环代表具有共计4-7个环原子的单环饱和杂环，其含有一个或两个选自系列N、O、S、SO和/或SO2的环杂原子，且经由环碳原子或任选的环氮原子连接。优选的是，具有一个或两个选自系列N、O和/或S的环杂原子的5-7元杂环，特别优选是具有一个或两个选自系列N和/或O的环杂原子的5或6元杂环。例子包括：氮杂环丁基、氧杂环丁基、吡咯烷基、吡唑烷基、四氢呋喃基、硫杂环戊烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、硫代吗啉基、六氢氮杂环庚三烯基和六氢-1，4-二氮杂环庚三烯基。优选的例子包括：吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基和吗啉基。
在分别可以由A、B、D、G、L1、L2、L4、R1、R2、R3、R4和／或R5代表的基团的式中，符号#6、＊、＊＊、#3、#1、#2、##1、##2、##3、##4、＊＊＊、＊＊＊＊、#4、#5、#6、#7、#8和/或#9所在的线的端点不代表碳原子或CH2基团，而是与在每种情况下指定的、A、B、D、G、L1、L2、L4、R1、R2、R3、R4和/或R5所键合的原子形成的键的组分。
在本发明范围内，所有多次出现的残基具有其彼此独立的含义。如果本发明化合物中的残基是经取代的，除非另有说明，所述残基可以被取代一次或多次。优选用一个取代基或两个相同的或不同的取代基进行取代。特别优选用一个取代基进行取代。
在本发明范围内，除非另外指出，使用的术语具有下述含义：
术语“接头”在最宽的含义上被理解为这样的化学单元：其包含使结合剂与药物共价连接的共价键或一系列原子。术语“接头”优选地被理解为，在本发明意义上使结合剂与药物共价连接的一系列原子。此外，接头可以是二价化学单元，诸如烷基二基、芳基二基、杂芳基二基、杂环基二基、二羧酸酯、二羧酸酰胺。
术语“结合剂”在最宽的含义上被理解为结合靶分子的分子，所述靶分子存在于要用结合剂-药物缀合物定位的特定靶细胞群体上。术语“结合剂”应当以它的最宽解释进行理解，其也包括，例如，凝集素、能够结合特定糖链的蛋白或磷脂结合蛋白。这样的结合剂包括，例如，高分子量蛋白(结合蛋白)、多肽或肽(结合肽)、非肽分子(例如适体(US5,270,163；综述文章参见Keefe AD.，等人，Nat.Rev.Drug Discov.2010；9：537-550)或维生素)和所有其它的结合细胞的分子或物质。结合蛋白包括，例如，抗体和抗体片段或抗体模拟物例如，亲和体(affibodies)、adnectins、anticalins、DARPins、亲和体(avimers)、纳米抗体(nanobodies)(综述文章参见Gebauer，M.等人，Curr.Opinion in Chem.Biol.2009；13：245-255；Nuttall，S.D.等人，Curr.Opinion in Pharmacology，2008；8：608-617)。结合肽包括，例如，配体-受体对的配体，诸如配体-受体对VEGF／KDR中的VEGF，诸如配体-受体对转铁蛋白／转铁蛋白受体中的转铁蛋白，或细胞因子／细胞因子受体，诸如配体受体对TNFα／TNFα受体中的TNFα。
根据本发明的优选结合剂包括抗体(尤其是人或人源化的单克隆抗体)或结合EGFR的结合抗原的抗体片段。在抗体诸如抗-EGFR抗体的情况下，n(即每个抗体分子的毒性基团分子的数目)优选地是在1-10的范围内，特别优选2-8。
“靶分子”在最宽的含义上被理解为这样的分子：其存在于靶细胞群体中，且可以是蛋白(例如生长因子的受体)或非肽分子(例如糖或磷脂)。优选地，它是受体或抗原。
术语“细胞外的”靶分子描述了这样的靶分子：其附着于细胞且位于细胞外侧上，或者位于细胞外侧上的靶分子的一部分，即结合剂可以结合完整细胞的细胞外靶分子。细胞外靶分子可以锚定在细胞膜中，或者可以是细胞膜的一部分。本领域技术人员已知鉴别细胞外靶分子的方法。对于蛋白而言，这可以通过确定跨膜结构域和通过蛋白在膜中的取向来实现。在蛋白数据库(例如SwissProt)中一般地记录了这些规范。
术语“癌症靶分子”描述了这样的靶分子：与相同组织类型的非癌细胞相比，其存在于一种或多种癌细胞类型上。与相同组织类型的非癌细胞相比，癌症靶分子优选地选择性地存在于一种或多种癌细胞类型上，其中术语“选择性的”描述了与相同组织类型的非癌细胞相比，在癌细胞上的至少2倍富集(“选择性的癌症靶分子”)。癌症靶细胞的应用允许用本发明的缀合物对癌细胞进行选择性治疗。
结合剂可以经由键连接至接头。从文献中已知将有机分子与抗体共价联接(缀合)的多种可能性。结合剂的连接可以借助于结合剂的杂原子而完成。本发明的结合剂的可用于连接的杂原子包括硫(在一个实施方案中，借助于结合剂的巯基)、氧(借助于本发明的结合剂的羧基或羟基)和氮(在一个实施方案中，借助于结合剂的伯胺或仲胺基团或酰胺基)。根据本发明优选的是，经由抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子，和/或经由抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团，将毒性基团缀合至抗体。这些杂原子可以存在于天然的结合剂中，或者可以通过化学或分子生物学方法引入。根据本发明，结合剂与毒性基团的连接对结合剂与靶分子的结合活性仅具有低影响。在一个优选的实施方案中，所述连接对结合剂与靶分子的结合活性没有影响。
术语“抗体”根据本发明在它的最宽的含义上进行理解，且包括免疫球蛋白分子，例如，完整的或改性的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。免疫球蛋白分子优选地包括具有4条通常通过二硫键连接的多肽链的分子，所述4条多肽链为2个重链(H链)和2个轻链(L链)。每个重链包含一个重链可变结构域(缩写为VH)和一个重链恒定结构域。重链恒定结构域可以包括，例如，3个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含一个可变结构域(缩写为VL)和一个恒定结构域。轻链的恒定结构域包含一个结构域(缩写为CL)。所述VH和VL结构域可以进一步细分成高变异性区域(也被称作互补性决定区，缩写为CDR)，和较低序列变异性区域(“框架区”，缩写为FR)。每个VH和VL区域通常由3个CDR和至多4个FR组成，例如，从氨基端至羧基端按照下述次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可以得自适合于所述抗体的任意物种，例如，兔、美洲驼(llama)、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，所述抗体具有人或鼠起源。抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
术语“单克隆的”抗体表示，从基本上同质的抗体的群体得到的抗体，即除了可能以小量发生的天然存在的突变以外为相同的群体的单个抗体。单克隆抗体会高特异性地识别单个抗原结合位点。术语“单克隆抗体”不是基于特定合成方法。
术语“完整的”抗体表示这样的抗体：其不仅包含抗原结合结构域，而且包含轻链和重链的恒定结构域。所述恒定结构域可以是天然存在的结构域或其变体，在所述变体中，几个氨基酸位置已经被改变。
术语“改性的完整的”抗体表示这样的完整抗体：其已经经由其氨基端或羧基端借助于共价键(例如肽键)与另一种非源自抗体的多肽或蛋白融合。此外，通过在确定的位置引入反应性的半胱氨酸，也可以将抗体改性，从而促进与毒性基团的偶联(参见Junutula等人，Nat.Biotechnol.，2008年8月；26(8)：925-32)。
术语“人”抗体表示这样的抗体：其可以从人类得到，或者是合成的人抗体。“合成的”人抗体是这样的抗体：其可以完全地或部分地从计算机合成序列(其基于人抗体序列的分析)得到。人抗体可以由例如核酸编码，所述核酸分离自具有人起源的抗体序列文库。这样的抗体的一个例子参见：
Figure BDA0000432948840000141
等人，Nature Biotech.2000，18：853-856。
术语“人源化的”或“嵌合的”抗体描述了由人序列组分和非人序列组分组成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白(受体)的序列的一部分被非人免疫球蛋白(供体)的序列组分替代。所述供体经常为鼠免疫球蛋白。在人源化抗体中，受体中的CDR的氨基酸被供体的氨基酸替代。在某些情况下，框架的氨基酸也被供体的对应氨基酸替代。在许多情况下，所述人源化抗体含有这样的氨基酸：其既不存在于受体中也不存在于供体中，而是在抗体优化过程中插入。在嵌合抗体中，供体免疫球蛋白的可变结构域与人抗体的恒定区融合。
术语互补性决定区(CDR)在这里用于表示抗体可变结构域中的、与抗原结合所必需的氨基酸。可变区通常具有3个CDR区域，被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3。每个CDR区域可以包含根据Kabat的定义的氨基酸和／或根据Chotia定义的高变环的氨基酸。根据Kabat的定义包括，例如，可变轻链的大约氨基酸位置24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)的区域，和可变重链的大约氨基酸位置31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)的区域(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。根据Chotia的定义包括，例如，可变轻链的大约氨基酸位置26-32(CDR1)、50-52(CDR2)和91-96(CDR3)的区域，和可变重链的大约氨基酸位置26-32(CDR1)、53-55(CDR2)和96-101(CDR3)的区域(Chotia和Lesk；J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。在许多情况下，CDR可以包含来自如Kabat和Chotia定义的CDR区域的氨基酸。
根据重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分成几个不同的类别。存在5大类完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们中的几类可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别相对应的重链的恒定结构域被鉴别为[alpha／α]、[delta／δ]、[epsilon／ε]、[gamma/γ]和[mu／μ]。抗体的三维结构和亚基结构是已知的。
术语抗体／免疫球蛋白的“功能片段”或“结合抗原的抗体片段”被定义为这样的抗体／免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变结构域)：其仍然包含抗体／免疫球蛋白的抗原结合结构域。抗体的“抗原结合结构域”通常包含抗体的一个或多个高变区，例如CDR1、CDR2和/或CDR3区域。但是，抗体的“框架”区域也可以在抗体与抗原的结合方面起作用。框架区形成CDR的框架。抗原结合结构域优选地至少包括可变轻链的氨基酸1-103和可变重链的氨基酸5-109，更优选可变轻链的氨基酸3-107和可变重链的氨基酸4-111，特别优选的是完整可变轻链和重链，即VL的氨基酸1-109和VH的氨基酸1-113(根据WO97／08320编号)。
本发明的“功能片段”或“结合抗原的抗体片段”非最终性地包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、双体、单结构域抗体(DAb)、直链抗体、单链抗体(单链Fv，缩写为ScFv)；和多特异性抗体，诸如由抗体片段形成的双和三特异性抗体。(C.A.K.Borrebaeck，编著(1995)，Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology)，Oxford University Press；R.Kontermann和S.Duebel，编著(2001)，Antibody Engineering(SpringerLaboratory Manual)，Springer Verlag)。除了“多特异性的”或“多功能的”抗体以外的抗体包括具有相同结合位点的那些抗体。多特异性抗体可以对抗原的不同表位是特异性的，或者可以对超过一种抗原的表位是特异性的(参见，例如，WO 93／17715；WO 92／08802；WO 91／00360；WO 92／05793；Tutt等人，1991，J.Immunol.147：60-69；美国专利4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；或Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553)。可以构建F(ab’)2或Fab分子，从而可以减少或者完全阻止Ch1和CL结构域之间发生的分子间二硫键相互作用的数目。
“功能片段”或“结合抗原的抗体片段”可以经由其氨基端或羧基端借助于共价键(例如肽键)与另一种非源自抗体的多肽或蛋白融合。此外，通过在确定的位置引入反应性的半胱氨酸，可以将抗体和抗原结合片段改性，从而促进与毒性基团的偶联(参见Junutula等人，Nat.Biotechnol.，2008年8月，26(8)：925-32)。
通过本领域普通技术人员熟悉的方法，可以合成多克隆抗体。通过本领域技术人员熟悉的方法，可以合成单克隆抗体(
Figure BDA0000432948840000161
和Milstein，Nature，256：495-497，1975)。通过本领域普通技术人员熟悉的方法，可以合成人和／或人源化的单克隆抗体(Olsson等人，Meth.Enzymol.92：3-16和/或Cabilly等人，US4,816,567或Boss等人，US 4,816,397)。
本领域普通技术人员知晓用于合成人抗体及其片段的不同方法，例如，借助于转基因小鼠(N.Lonberg和D.Huszar，Int.Rev.Immunol.1995；13(1)：65-93)或噬菌体展示技术(Clackson等人，Nature，1991年8月15日，352(6336)：624-628)。可以从重组抗体文库得到本发明的抗体，所述重组抗体文库由多个抗体(其从大量健康志愿者受试者产生)的氨基酸序列组成。借助于已知的重组DNA技术，也可以合成抗体。抗体的核酸序列可以通过常规测序得到，或者可从公众可接近的数据库得到。
“分离的”抗体或结合剂已经经过纯化，以除去细胞的其它组分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞污染成分可以是，例如，细胞的酶、激素或其它肽或非肽组分。基于抗体和/或结合剂的重量，抗体或结合剂已经被纯化至超过95％(例如通过Lowry方法、紫外-可见光光谱法或SDS毛细管凝胶电泳来确定)。此外，抗体已经被纯化纯化至可以确定氨基端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的程度，或者其已经被纯化至同质性点，所述同质性通过在还原或非还原条件下的SDS-PAGE来确定(可以借助于考马斯蓝染色或优选地通过银染色来进行检测)。但是，通常通过至少一个纯化步骤来合成抗体。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”表示，结合预定的抗原／靶分子的抗体或结合剂。抗体或结合剂的特异性结合通常描述了这样抗体：即，具有至少10-7M(作为Kd值；即优选具有小于10-7M的Kd值的那些)的亲和力的结合剂)，其中所述抗体或(即，结合剂)对预定抗原／靶分子的亲和力高是作为非预定抗原／靶分子或密切相关的抗原／靶分子的非特异性抗原／靶分子(例如，牛血清白蛋白或酪蛋白)的至少2倍。
对癌细胞抗原特异性的抗体可以由本领域普通技术人员使用他熟悉的方法(例如重组表达)来合成，或者可以商业获得(例如从Merck KGaA，德国)。在癌症治疗中已知的商购可得抗体的例子包括爱必妥(西妥昔单抗，Merck KGaA)，阿伐他汀
Figure BDA0000432948840000172
(贝伐珠单抗，Roche)和赫赛汀
Figure BDA0000432948840000173
(曲妥珠单抗，Genentech)。曲妥珠单抗是IgG1κ型重组人源化单克隆抗体，其在基于细胞的测定中以高亲和力(Kd=5nM)结合人表皮生长受体的细胞外结构域。所述抗体在CHO细胞中重组合成。
式(I)的化合物构成式(Ia)的化合物的亚组。
本发明的优选主题是，通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-50的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合剂(优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体)，其通过所述结合剂的硫原子连接至基团G，
AK2代表结合剂(优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体)，其通过所述结合剂的氮原子连接至基团G，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000181
其中
#1表示与结合剂的硫原子的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840000182
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C10)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000191
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键或(C2-C4)-烷二基，
L6代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000192
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢或(C1-C4)-烷基，
R30代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R29和R30与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R31代表氢或(C1-C4)-烷基，
R32代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R31和R32与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
L1B代表直链(C2-C10)-烷二基，
且
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000201
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键或下式的基团
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢、或者α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
R36代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
或者
R36和R37与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000221
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000222
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000231
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000241
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000242
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-50的整数，
AK代表结合剂，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
基团§-G-L1-B-§§代表接头
其中
§表示与基团AK的连接位点，且
§§表示与氮原子的连接位点，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000251
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000261
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000262
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000263
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000271
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题涉及如上给出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-50的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合剂(优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体)，其经由结合剂的硫原子与基团G连接，
AK2代表结合剂(优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体)，其经由结合剂的氮原子与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000291
其中
#1表示与结合剂的硫原子的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基、下式的基团
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C10)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000293
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键或(C2-C4)-烷二基，
L6代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000301
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢或(C1-C4)-烷基，
R30代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R29和R30与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R31代表氢或(C1-C4)-烷基，
R32代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R31和R32与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
L1B代表直链(C2-C10)-烷二基，
且
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环包括任选地位于它们之间的碳原子，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000311
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000312
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起可以形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然存在的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
R36代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
或者
R36和R37与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000321
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000331
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起可以形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000332
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
环A与其它所含的N-O基团一起代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000342
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000351
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题涉及通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-20的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合EGFR的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表结合EGFR的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000361
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840000362
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C6)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000363
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键，
L6代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000371
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢，
R30代表氢，
R31代表氢或甲基，
R32代表氢或甲基，
L1B代表直链(C2-C6)-烷二基，
且
其中(C2-C6)-烷二基可以被1-2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000372
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000381
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或甲基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
R27代表氢，
R36代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
或者
R36和R37与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000391
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代。
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000392
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起可以形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000401
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000402
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起可以形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000403
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起可以形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000411
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题涉及如上面指出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-20的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合EGFR的抗体或结合抗原的抗体片段，且通过结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表结合EGFR的抗体或结合抗原的抗体片段，且通过结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000421
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840000422
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C6)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000431
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键，
L6代表键或下式的基团
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢，
R30代表氢，
R31代表氢或甲基，
R32代表氢或甲基，
L1B代表直链(C2-C6)-烷二基，
且
其中(C2-C6)-烷二基可以被1-2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000441
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000442
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、甲基羰基、叔丁基氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或甲基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
R27代表氢，
R36代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000451
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000461
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
环A与其中所含的N-O基团一起代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000462
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起可以形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起可以形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000472
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题涉及通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000481
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840000482
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000491
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000492
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表哌啶-1，4-二基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢，
R36代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000501
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000502
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000511
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000512
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000513
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9或-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000521
其中
#9表示与-CHCH2-苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题涉及如上面指出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000531
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表哌啶-1，4-二基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000551
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000552
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000553
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、1-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9或-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000562
其中
#9表示与-CHCH2-苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题涉及如上面指出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK2
其中
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
G代表羰基，
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000571
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000572
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000581
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000582
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢，
R9代表氢或苄基，
R35代表甲基。
本发明的优选主题涉及如上面指出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK2，
其中
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
G代表羰基，
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000592
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000602
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000603
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢，
R9代表氢或苄基，
R35代表甲基。
本发明的优选主题涉及如上面指出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
G代表下式的基团
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表键、直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000612
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000621
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000622
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
L2代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000623
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000631
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000632
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000641
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢，
R9代表氢或苄基，
R35代表甲基。
本发明的优选主题涉及如上面指出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1，
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
G代表下式的基团
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表键、直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000652
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000653
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000654
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
L2代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000661
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000662
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000663
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000671
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000672
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢，
R9代表氢或苄基，
R35代表甲基。
本发明的另一个主题涉及式(XXXa)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
Figure BDA0000432948840000681
其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840000682
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C10)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000683
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键或(C2-C4)-烷二基，
L6代表键，
R29代表氢或(C1-C4)-烷基，
R30代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R29和R30与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R31代表氢或(C1-C4)-烷基，
R32代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R31和R32与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
L1B代表直链(C2-C10)-烷二基，
且
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基
且
其中所述烷二基链的2个碳原子以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000691
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000701
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000711
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-基基团
Figure BDA0000432948840000712
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000713
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000731
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题是如上面指出的式(XXXa)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840000733
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C6)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000741
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键，
L6代表键，
R29代表氢，
R30代表氢，
R31代表氢或甲基，
R32代表氢或甲基，
L1B代表直链(C2-C6)-烷二基，
且
其中(C2-C6)-烷二基可以被1-2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000742
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000752
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000761
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000762
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000763
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000771
其中
#9表示与-CHCH2-苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题是如上面指出的式(XXXa)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，L1代表键或直链(C2-C6)-烷二基，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000772
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键，
L4代表键，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000782
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000783
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000791
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000792
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢，
R8代表氢，
R9代表氢，
R35代表甲基。
本发明的优选主题是如上面指出的式(XXXa)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，L1代表键或直链(C2-C6)-烷二基，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840000801
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键，
L4代表键，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000802
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000803
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000812
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000813
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢，
R8代表氢，
R9代表氢，
R35代表甲基。
本发明的另一个主题涉及式(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
Figure BDA0000432948840000821
其中
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840000822
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C10)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000823
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键或(C2-C4)-烷二基，
L6代表键，
R29代表氢或(C1-C4)-烷基，
R30代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R29和R30与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R31代表氢或(C1-C4)-烷基，
R32代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R31和R32与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
L1B代表直链(C2-C10)-烷二基，
且
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，
B代表键或下式的基团
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000841
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000851
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000852
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000853
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000871
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题是如上面指出的式(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R27代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成苯基环，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000891
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000892
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000893
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000901
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000902
其中
#9表示与-CHCH2-苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题是如上面指出的式(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000921
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000923
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢，
R8代表氢，
R9代表氢，
R35代表甲基。
本发明的优选主题是如上面指出的式(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000931
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000932
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000941
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000942
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000943
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢，
R8代表氢，
R9代表氢，
R35代表甲基。
本发明的优选主题涉及选自以下的式(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物：
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐，
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
本发明的另一个优选主题涉及通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
Figure BDA0000432948840000961
其中
n代表1-50的数字，
AK代表结合剂，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
基团§-G-L1-B-L2-§§代表接头，
其中
§表示与基团AK的连接位点，且
§§表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000971
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840000972
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840000973
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840000981
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基。
本发明的优选主题涉及通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-50的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1表示结合剂，其通过结合剂的氮原子连接至基团G，优选地表示嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
AK2代表结合剂，其通过结合剂的氮原子连接至基团G，优选地代表嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000991
其中
#1表示与结合剂的硫原子的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基或者代表下式的基团
Figure BDA0000432948840000992
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001001
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001002
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001011
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
D具有上面给出的含义。
本发明的优选主题是通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
其中
n代表1-50的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表抗体或结合抗原的抗体片段，且经由硫原子与基团G连接，优选地代表嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
AK2代表抗体或结合抗原的抗体片段，且经由氮原子与基团G连接，优选地代表嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
G、L1、B、L2和D具有上面给出的含义。
本发明的优选主题是通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
其中
n代表1-20的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合EGFR的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表结合EGFR的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基或者代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001031
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001032
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001033
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
Q2代表环戊基或环己基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或甲基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001041
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001042
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001051
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001052
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001061
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基。
本发明的特别优选的主题是通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001071
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001074
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001081
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001082
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001091
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001092
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9或-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢或下式的基团
Figure BDA0000432948840001093
其中
#9表示与-CHC(R26)苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代。
本发明的另一个主题涉及式(XXX)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
Figure BDA0000432948840001101
其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基或者代表下式的基团
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
和
其中所述烷二基链的2个碳原子以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001111
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001112
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
Q1代表3-7元碳环或4-7元氮杂杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元氮杂杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001121
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001131
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001132
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001133
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001141
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001142
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基。
另外，在本发明范围内特别优选的式(XXX)的化合物是这样的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物：其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001151
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001152
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001161
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001172
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001173
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢或下式的基团
Figure BDA0000432948840001181
其中
#9表示与-CHC(R26)苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代。
在本发明范围内，这样的式(Ia)的化合物也是优选的，其中
n=1-20，特别优选地n=1-10，且最特别优选地n=2-8。
在本发明范围内，这样的式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物是优选的，其中
AK代表AK1
其中
AK1代表结合EGFR的抗体或结合抗原的抗体片段，且通过结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001182
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
且
n、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
AK代表AK2
其中
AK2代表结合EGFR的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
G代表羰基，
且
n、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
AK代表AK1
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001191
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
且
n、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
AK代表AK2
其中
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
G代表羰基，
且
n、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的通式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
AK代表AK2
其中
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
G代表羰基，
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001201
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
n、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的通式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
AK代表AK1
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
G代表下式的基团
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表键、直链(C3-C5)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001212
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001213
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001214
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
L2代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001221
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
且
n、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001222
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
且
n、AK、Cys、G、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表直链(C1-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001231
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001232
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001233
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R36代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
或者
R36和R37与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
n、AK、G、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001251
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001252
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R36代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
或者
R36和R37与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
且
n、AK、G、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)和(XXXa)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001262
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001263
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001264
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键，
L2代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001271
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
且
n、AK1、Cys、D、R16和R17具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)和(XXXa)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001272
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键，
n、AK、Cys、G、L1、L2、D、R16、R17和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键、直链(C3-C5)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001281
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001282
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键，
L4代表键
R16代表氢，
R17代表氢，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001283
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
n、AK、Cys、G、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001291
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
n、AK、Cys、G、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001292
其中
m代表2或3的数字
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001294
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键，
L4代表键
R16代表氢，
R17代表氢，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001301
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
n、AK、Cys、G、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表2-8、优选2-5的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合C4.4a的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表结合C4.4a的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C3-C5)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001303
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001311
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键，
L4代表键
R16代表氢，
R17代表氢，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001312
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
且
D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表2-8、优选2-5的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合C4.4a的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表结合C4.4a的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001321
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001322
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表2-8、优选2-5的数字，
AK代表AK1，
其中
AK1代表结合C4.4a的抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001331
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001332
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001333
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键，
L4代表键
R16代表氢，
R17代表氢，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键、直链(C3-C5)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001341
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C6)-烷二基，
B1代表下式的基团
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键或乙烷-1，2-二基，
L6代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001343
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、(C1-C4)-烷基羰基或叔丁基氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢或甲基，
R30代表氢或甲基，
R31代表氢或甲基，
R32代表氢或甲基，
L1B代表直链(C3-C6)-烷二基，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001351
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001361
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、(C1-C4)-烷基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R36代表氢、(C1-C4)-烷基羰基或叔丁基氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
或者
R36和R37与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
L1代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001363
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
B代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001371
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001372
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表哌啶-1，4-二基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
R23代表甲基，
R24代表氢，
R36代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001381
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001382
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001391
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001392
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001393
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001401
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
且
n、AK、Cys、G、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001411
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的杂环
Figure BDA0000432948840001412
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢，
R8代表氢，
R9代表氢，
n、AK、Cys、G、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001421
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的杂环
Figure BDA0000432948840001422
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R8代表氢，
R9代表氢，
n、AK、Cys、G、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001423
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的杂环
Figure BDA0000432948840001431
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R8代表氢，
R9代表氢，
n、AK、Cys、G、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R3代表氢，
R4代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢，
R8代表氢，
R9代表氢，
n、AK、Cys、G、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001441
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R3代表氢，
R4代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R8代表氢，
R9代表氢，
n、AK、Cys、G、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001442
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001451
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001452
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
且
n、AK、Cys、G、L1、B、L2和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001461
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001462
其中
#6表示与羰基的连接位点，
且
n、AK、Cys、G、L1、B、L2和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
R35代表羟基，
且
n、AK、Cys、G、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)、(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
R35代表甲基，
且
n、AK、Cys、G、L1、B、L2、D和R35具有上面给出的含义。
在本发明范围内也特别优选的是这样的式(XXXa)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
Cys代表L-半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子。
在本发明范围内也优选的是这样的式(I)和(XXX)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001471
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001481
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001482
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
n、AK、Cys、G、L1、L2和B具有上面给出的含义。
在本发明范围内也特别优选的是这样的式(Ia)和(XXXa)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001483
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001491
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的杂环
Figure BDA0000432948840001492
其中
#6表示与羰基的连接位点，
n、AK、Cys、G、L1、L2和B具有上面给出的含义。
本发明的另一个特别优选的主题是这样的式(I)的化合物，其中
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001493
其中
T1代表-C(=O)-OH或-C(=O)-NH2且
n、AK、G、L1、B、L2、#3、R3和R4具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是这样的式(I)的化合物，其中
n=1-20，特别优选地n=1-10，且最特别优选地n=2-8。
在本发明范围内也优选的是这样的式(Ia)和(XXX)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001501
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键，
n、AK、Cys、G、L1、L2、D、R16和R17具有上面给出的含义。
在本发明范围内特别优选的是这样的式(I)和(XXX)的化合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001502
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3和L4代表键，
n、AK、Cys、G、L1、L2、D、R10和R17具有上面给出的含义。
在本发明范围内也优选的是通式(I)的结合剂-药物缀合物，其中
AK代表AK1
其中
AK1代表结合剂，其经由结合剂的硫原子连接至基团G，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001503
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基或者代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001511
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
和
其中所述烷二基链的2个碳原子以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001512
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键或下式的基团
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
Q1代表4-7元杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001521
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物.
在本发明范围内也优选的是通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
AK代表AK2
其中
AK2代表结合剂，其经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基连接至基团G，
G代表羰基，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001531
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
和
其中所述烷二基链的2个碳原子以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001532
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001541
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环。
本发明的优选主题是如上面指出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-20的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合剂，其经由结合剂的硫原子连接至基团G，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
AK2代表结合剂，其经由结合剂的氮原子与基团G连接，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001551
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001552
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C6)-烷二基，
B1代表下式的基团
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键，
L6代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001561
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢，
R30代表氢，
R31代表氢或甲基，
R32代表氢或甲基，
L1B代表直链(C2-C6)-烷二基，
且
其中(C2-C6)-烷二基可以被1-2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001562
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或甲基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
R27代表氢，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001581
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001591
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001601
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
本发明的优选主题是如上面指出的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合剂，其经由结合剂的硫原子连接至基团G，
AK2代表结合剂，其经由结合剂的氮原子连接至基团G，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001611
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001612
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001613
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001621
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表哌啶-1，4-二基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001622
其中
p代表2.6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001631
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001632
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure BDA0000432948840001633
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、1-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure BDA0000432948840001641
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9或-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001642
其中
#9表示与-CHCH2-苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
在本发明范围内特别优选的是式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表2-8的数字，
AK代表AK1或AK2，
其中
AK1代表结合剂，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子连接至基团G，优选地表示嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
AK2代表结合剂，其经由结合剂的赖氨酸残基的氮原子连接至基团G，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001652
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001661
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001662
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表哌啶-1，4-二基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001671
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001672
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
在其中含有N-O基团的环A代表
Figure BDA0000432948840001673
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-NR8R9的基团，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基或乙基，
R35代表甲基。
在本发明范围内特别优选的是式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表2-8、优选2-5的数字，
AK代表AK1，
其中
AK1代表结合剂，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子连接至基团G，优选地表示嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001681
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表戊烷-1，5-二基，
B代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001682
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键，
L4代表键，
R16代表氢，
R17代表氢，
L2代表丙烷-1，3-二基，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
在其中含有N-O基团的环A代表
Figure BDA0000432948840001692
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-NR8R9的基团，
R8代表氢，
R9代表氢，
R35代表甲基。
在本发明范围内特别优选的是式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表2-8、优选2-5的数字，
AK代表AK1，
其中
AK1代表结合剂，其经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子连接至基团G，优选地表示嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001701
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表键，
B代表键，
L2代表己烷-1，6-二基，
且D具有上面给出的含义。
在本发明范围内特别优选的是式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表2-8、优选2-5的数字，
AK代表AK2，
其中
AK2代表结合剂，其经由结合剂的氮原子与基团G连接，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
G代表羰基，
L1代表键，
B代表键，
L2代表戊烷-1，5-二基，
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001702
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
在其中含有N-O基团的环A代表
Figure BDA0000432948840001711
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-NR8R9的基团，
R8代表氢，
R9代表氢，
R35代表甲基。
在本发明范围内特别优选的是式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物，其中
n代表2-8、优选2-5的数字，
AK代表AK2，
其中
AK2代表结合剂，其经由结合剂的赖氨酸残基的氮原子连接至基团G，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
G代表羰基，
L1代表键，
B代表键，
L2代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001712
其中
p代表数字3，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
且D具有上面给出的含义。
根据本发明，所述药物-结合剂缀合物优选地包含下述化合物，具体地，其中n代表2-8、优选2-5的数字，且AK代表结合间皮素、C4.4a或EGFR的嵌合抗体、人抗体或人源化抗体或结合抗原的抗体片段：
Figure BDA0000432948840001721
Figure BDA0000432948840001731
另外，根据本发明，所述药物-结合剂缀合物特别优选地选自下述化合物：
Figure BDA0000432948840001732
Figure BDA0000432948840001741
其中
n代表2-8、优选2-5的数字，
且
AK1A、AK1B、AK2A、AK3和AK4代表指示的抗体。
AK
下式Ia的结合剂-药物缀合物以及它们的盐和溶剂合物、以及所述盐的溶剂合物
Figure BDA0000432948840001742
其中
n代表2-8的数字；
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合间皮素、EGFR或C4.4a的嵌合抗体、人抗体或人源化抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表结合间皮素、EGFR或C4.4a的嵌合抗体、人抗体或人源化抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
R35代表甲基；
D代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001751
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
其中含有N-O基团的环A代表
Figure BDA0000432948840001752
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
T1代表式-C(=O)-NR8R9的基团，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基或乙基，
基团§-G-L1-B-L2-§§代表接头，
其中
§表示与基团AK的连接位点，且
§§表示与氮原子的连接位点，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001761
其中
#1表示与结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure BDA0000432948840001762
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001763
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure BDA0000432948840001771
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表哌啶-1，4-二基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点。
特别优选的是下式的缀合物，
Figure BDA0000432948840001781
其中
n代表2-8、优选2-5的数字；
AK代表结合间皮素、EGFR或C4.4a的人或人源化抗体或结合抗原的抗体片段，且经由结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
X1代表NH2或者
Figure BDA0000432948840001782
且
X2代表4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基。
当毒性基团连接至抗体的半胱氨酸残基时，接头
Figure BDA0000432948840001783
可以被例如下述接头替代：
Figure BDA0000432948840001784
当毒性基团连接至抗体的赖氨酸残基的NH基团时，所述接头可以被下述接头替代：
Figure BDA0000432948840001791
根据本发明，所述药物-结合剂缀合物具体地包含下述化合物，其中n代表2-8、优选2-5的数字，且AK代表结合间皮素、EGFR或C4.4a的嵌合抗体、人抗体或人源化抗体或结合抗原的抗体片段：
Figure BDA0000432948840001801
在这些式中，AK1F、AK1B和AK2B可以被其它嵌合的、人的或人源化的抗-C4.4a抗体、抗-EGFR抗体或抗-间皮素抗体替代。
在残基的各种组合和／或优选组合中给出的残基的定义具体地还可以被其它组合的残基定义替代，所述替代独立于给出的各种残基组合。
最优选的是2个或更多个上述优选范围的组合。
本发明的另一个主题是，一种合成根据本发明的式(Ia)的化合物的方法，其特征在于，将结合剂的溶液(优选地在PBS缓冲液中)
[A]与合适的还原剂例如二硫苏糖醇或二硫苏糖醇或三(2-羧基乙基)膦盐酸盐混合，随后与式(IIa)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001802
其中D、L1、B、L2和R35各自具有上面给出的含义，
以形成式(I-A)的化合物
Figure BDA0000432948840001811
其中n、AK1、D、L1、B、L2和R35各自具有上面给出的含义，
或者
[B]与式(IIIa)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001812
其中D、L1、B、L2和R35各自具有上面给出的含义，
以形成式(Ia-B)的化合物
Figure BDA0000432948840001813
其中n、AK2、D、L1、B、L2和R35各自具有上面给出的含义。
本发明的另一个主题是，一种合成根据本发明的式(I)的化合物的方法，其特征在于，将结合剂在PBS缓冲液中的溶液
[A]与合适的还原剂例如二硫苏糖醇或三(2-羧基乙基)膦盐酸盐混合，随后与式(II)的化合物反应
其中D、L1、B和L2各自具有上面给出的含义，
以形成式(I-A)的化合物
Figure BDA0000432948840001822
其中n、AK1、D、L1、B和L2各自具有上面给出的含义，
或者
[B]与式(III)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001823
其中D、L1、B和L2各自具有上面给出的含义，
以形成式(I-B)的化合物
其中n、AK2、D、L1、B和L2各自具有上面给出的含义。
半胱氨酸偶联：
根据本领域技术人员熟悉的方法，参见，例如，Ducry等人，Bioconj.Chem.2010，21，5和其中的参考文献，Klussman等人，Bioconj.Chem.2004，15(4)，765-773，进行抗体的部分还原，以及随后(部分地)还原的抗体与式(II)和/或(IIa)的化合物的缀合。抗体的温和还原如下实现：将2-6当量的TCEP加给抗体，所述抗体存在于合适的缓冲溶液、优选磷酸盐缓冲液中，并在15-40℃之间的温度(优选在室温)搅拌30-180分钟。然后如下进行缀合：将式(II)和／或(IIa)的化合物在DMSO、乙腈或DMF中的溶液加入(部分地)还原的抗体在PBS缓冲液中的溶液中，随后在0℃至+40℃(更具体地+10℃至+30℃)的温度反应30分钟至6小时(更具体地1-2小时)的时段。
赖氨酸偶联：
首先，通过常规肽化学方法，合成式(III)和/或(IIa)的化合物或可比较的活化的羧基组分。然后将这些化合物溶解于惰性溶剂诸如DMSO或DMF中，并加给抗体，所述抗体优选地存在于中性pH的磷酸盐缓冲液中。将该溶液在15-40℃之间的温度(优选室温)搅拌1-16小时。
然后基于下面的路线图(路线图1和2)，通过实施例阐明了上述的合成方法：
路线图1
[a)：1.AK，TCEP，PBS缓冲液，室温；2.加入马来酰亚胺衍生物在DMSO中的溶液，RT]。
路线图2
Figure BDA0000432948840001841
[a)：AK，PBS缓冲液，在室温与接头-药物组分的活化的羧基衍生物混合]。
可以如下合成式(II)的化合物，其中L1和B代表键：
将式(IV)的化合物
Figure BDA0000432948840001842
其中D具有上面给出的含义
在惰性溶剂中用式(V)的化合物还原胺化
Figure BDA0000432948840001843
其中
L2A具有上面定义的L2的定义，但是其烷基链长度缩短了1个碳原子，
PG1代表氨基保护基，例如，(9H-芴-9-基甲氧基)羰基、叔丁氧基羰基或苄氧基羰基，
以形成式(VI)的化合物
Figure BDA0000432948840001851
其中D、L2和pG1具有上面给出的含义，
通过本领域技术人员熟悉的方法，从该化合物消除保护基pG1，然后使去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的碱存在下与2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯反应，以形成式(II-A)的化合物
Figure BDA0000432948840001852
其中D和L2各自具有上面给出的含义。
可以如下合成式(II)的化合物，其中B代表式(B1)的基团
其中＊、＊＊、R14和R15各自具有上面给出的含义，
通过本领域技术人员熟悉的方法，从式(VI)的化合物消除保护基pG1，然后使去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的碱存在下与式(VII)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001861
其中L1具有上面给出的含义
以形成式(II-B)的化合物
Figure BDA0000432948840001862
其中D、L1和L2各自具有上面给出的含义。
可以如下合成式(II)的化合物，其中B代表式(B2)的基团
Figure BDA0000432948840001863
其中＊、＊＊、L3、R16和R17各自具有上面给出的含义、
将式(IV)的化合物在惰性溶剂中用式(VIII)的化合物还原胺化
Figure BDA0000432948840001864
其中
L2A具有上面关于L2给出的含义，但是其烷基链长度缩短了1个碳原子，
以形成式(IX)的化合物
Figure BDA0000432948840001865
其中D和L2具有上面给出的含义
和使该化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与式(X)的化合物反应，
Figure BDA0000432948840001871
其中L1和L3各自具有上面给出的含义，
以形成式(II-C)的化合物
Figure BDA0000432948840001872
其中D、L1、L2和L3各自具有上面给出的含义。
可以如下合成式(II)的化合物，其中B代表式(B3)的基团
Figure BDA0000432948840001873
其中＊、＊＊、L3、R16和R17各自具有上面给出的含义，且
L4A代表下式的基团
Figure BDA0000432948840001874
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
使式(IX)的化合物在惰性溶剂中在有合适的碱和合适的偶联剂存在下与式(XI-A)或(XI-B)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001881
其中R25和PG1各自具有上面给出的含义且
PG2代表合适的羧基保护基，尤其是苄基，
以形成化合物(XII-A)和／或(XII-B)
Figure BDA0000432948840001882
或者
Figure BDA0000432948840001883
其中D、pG1、pG2和L2具有上面给出的含义，
随后，通过本领域技术人员已知的方法，从该化合物消除保护基PG2，并使去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与式(X)的化合物反应，然后，通过本领域技术人员熟悉的方法，从该化合物消除保护基PG1，以形成式(II-D-A)和/或(II-D-B)的化合物
Figure BDA0000432948840001891
或者
其中D、L1、L2和L3具有上面给出的含义。
可以如下合成式(II)的化合物，其中B代表式(B4)的基团
Figure BDA0000432948840001893
其中＊、＊＊各自具有上面给出的含义且
Q1A代表N-连接的4-7元杂环，
使式(IX)的化合物在惰性溶剂中在有合适的碱和合适的偶联剂存在下与式(XXI)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001894
其中PG1和Q1A各自具有上面给出的含义，
以形成式(XXII)的化合物
Figure BDA0000432948840001901
其中pG1、Q1A、D和L2具有上面给出的含义
然后通过本领域技术人员熟悉的方法，从该化合物消除保护基pG1，随后使去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与式(XXIII)的化合物反应
其中L1具有上面给出的含义
以形成式(II-D)的化合物
Figure BDA0000432948840001903
其中Q1A、D、L1和L2具有上面给出的含义。
可以如下合成式(III)的化合物，其中L1和B代表键：使式(IX)的化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与N-羟基琥珀酰亚胺反应，以形成式(III-A)的化合物：
Figure BDA0000432948840001911
其中D和L2各自具有上面给出的含义。
可以如下合成式(III)的化合物，其中L1代表键，且B代表式(B5A)的基团
Figure BDA0000432948840001912
其中＊、＊＊和P各自具有上面给出的含义且
Q2A代表3-7元碳环，
使式(IX)的化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与式(XIII)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001913
其中P、Q2A和PG2各自具有上面给出的含义，
以形成式(XIV)的化合物
Figure BDA0000432948840001914
其中D、P、Q2A、L2和PG2各自具有上面给出的含义，
通过本领域技术人员熟悉的方法，从该化合物消除保护基PG2，随后使去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的碱存在下与N-羟基琥珀酰亚胺反应，以形成式(III-B)的化合物
Figure BDA0000432948840001921
其中D、P、Q2A和L2各自具有上面给出的含义。
可以如下合成式(III)的化合物，其中L1代表键，且B代表式(B6)的基团
Figure BDA0000432948840001922
其中＊、＊＊、R18、R19和R20各自具有上面给出的含义，
使式(IX)的化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与式(XV)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001923
其中R18、R19、R20和PG2各自具有上面给出的含义，
以形成式(XVI)的化合物
Figure BDA0000432948840001924
其中D、R18、R19、R20、L2和PG2各自具有上面给出的含义，
通过本领域技术人员熟悉的方法，从该化合物消除保护基PG2，随后使去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与N-羟基琥珀酰亚胺反应，以形成式(III-C)的化合物
Figure BDA0000432948840001931
其中D、R18、R19、R20和L2各自具有上面给出的含义。
可以如下合成式(III)的化合物，其中L1代表键，且B代表式(B7)的基团
Figure BDA0000432948840001932
其中＊、＊＊、R21和R22各自具有上面给出的含义，
通过本领域技术人员熟悉的方法，从式(VI)的化合物消除保护基PG1，然后使得到的去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的碱存在下与式(XVII)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001933
其中R21和R22各自具有上面给出的含义，
以形成式(III-D)的化合物
Figure BDA0000432948840001934
其中D、R21、R22和L2各自具有上面给出的含义。
可以如下合成式(III)的化合物，其中B代表式(B8)的基团
Figure BDA0000432948840001941
其中＊、＊＊、R23和R24各自具有上面给出的含义，
使式(IX)的化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与式(XVIII)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001942
其中R23、R24和PG1各自具有上面给出的含义
以形成式(XIX)的化合物
其中D、R23、R24、L2和PG1各自具有上面给出的含义，
通过本领域技术人员熟悉的方法，从该化合物消除保护基PG1，随后使去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的偶联剂和合适的碱存在下与式(XX)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001944
其中
L1A代表直链(C1-C10)-烷二基或下式的基团
Figure BDA0000432948840001945
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
且
其中烷二基链的彼此处于1，2、1，3或1，4关系的2个碳原子(包括任选地位于它们之间的碳原子)可以桥连以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，
以形成式(III-E)的化合物
其中D、R23、R24、L1A和L2各自具有上面给出的含义。
可以如下合成式(III)的化合物，其中B代表式(B5B)的基团
Figure BDA0000432948840001952
其中＊和＊＊各自具有上面给出的含义且
Q2B代表N-连接的4-7元杂环，
使式(IX)的化合物在惰性溶剂中在有合适的碱和合适的偶联剂存在下与式(XXIV)的化合物反应
Figure BDA0000432948840001953
其中pG1和Q2B各自具有上面给出的含义，
以形成式(XXV)的化合物
Figure BDA0000432948840001954
其中pG1、Q2B、D和L2具有上面给出的含义，
通过本领域技术人员熟悉的方法，从该化合物消除保护基pG1，
并随后使去保护的化合物在惰性溶剂中在有合适的碱存在下与式(XX)的化合物反应，得到式(III-F)的化合物
Figure BDA0000432948840001961
其中Q2B、D、L1A和L2具有上面给出的含义。
任选地在有作为催化剂的酸和/或除水剂存在下，在常见溶剂中进行反应(IV)+(V)→(VI)和(IV)+(VIII)→(IX)，所述溶剂典型地用于还原胺化，且在反应条件下是惰性的。这样的溶剂包括，例如，醇类诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇，醚类诸如四氢呋喃、1，4-二噁烷、1，2-二甲氧基乙烷或双(2-甲氧基乙基)醚，或其它溶剂诸如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺和水。也可能使用这些溶剂的混合物。优选的溶剂是1，4-二噁烷／水混合物，其在加入乙酸或稀盐酸作为催化剂的情况下使用。
适合用于该反应的还原剂具体地是，硼氢化物复合物，例如，硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、四正丁基硼氢化铵或硼烷-吡啶复合物。优选地使用氰基硼氢化钠或硼烷-吡啶复合物。
通常在0℃至+120℃的温度范围，优选地在+50℃至+100℃，进行反应(IV)+(V)→(VI)和(IV)+(VIII)→(IX)。所述反应可以在常压、增压或减压(例如0.5-5巴)下进行。通常在常压下进行。
通过标准的肽化学方法(参见，例如，M.Bodanszky，Principles ofPeptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin，1993；M.Bodanszky和A.Bodanszky，The Practice ofPeptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin，1984；H.-D.Jakubke和H.Jeschkeit，
Figure BDA0000432948840001971
Peptide，Proteine[AminoAcids，Peptides，Proteins]，Verlag Chemie，Weinheim，1982)，进行上述的偶联反应(IX)+(X)→(II-C)、(XII-A)和／或(XII-B)+(X)→(II-D-A)和／或(II-D-B)、(IX)+(XIII)→(XIV)、(IX)+(XV)→(XVI)和(XXII)+(XXIII)→(II-D)(从各自的胺组分和羧酸组分形成的酰胺)。
用于这些偶联反应的惰性溶剂包括，例如，醚类诸如二乙基醚、二异丙基醚、叔丁基甲基醚、四氢呋喃、1，4-二噁烷、1，2-二甲氧基乙烷或双(2-甲氧基乙基)醚，烃类诸如苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、庚烷、环己烷或石油馏分，卤代烃类诸如二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、1，2-二氯乙烷、三氯乙烯或氯苯，或偶极非质子溶剂类诸如丙酮、甲基乙基酮、乙腈，乙酸乙酯、吡啶、二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N′-二甲基丙烯脲(DMPU)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)。也可能使用这样的溶剂的混合物。优选的是N，N-二甲基甲酰胺。
用于这些偶联反应的合适的活化剂／缩合剂包括，例如，碳二亚胺类诸如N，N′-二乙基碳二亚胺、N，N′-二丙基碳二亚胺、N，N′-二异丙基碳二亚胺、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或N-(3-二甲基氨基异丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，光气衍生物类诸如N，N′-羰基二咪唑(CDI)或氯甲酸异丁酯，1，2-噁唑鎓化合物类诸如2-乙基-5-苯基-1，2-噁唑鎓3-硫酸盐或2-叔丁基-5-甲基异噁唑鎓高氯酸盐，酰基氨基化合物类诸如2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉，磷化合物类诸如丙烷膦酸酸酐、氰基膦酸二乙酯、双(2-氧代-3-噁唑烷基)磷酰氯、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐或苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)，或脲鎓化合物类诸如O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TPTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)或O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU)，上述试剂任选地与其它助剂相组合，诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)，以及碱诸如碱金属碳酸盐，例如碳酸钠或碳酸钾，或叔胺碱诸如三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、N，N-二异丙基乙胺、吡啶或4-N，N-二甲基氨基吡啶。
在本发明范围内，用于这样的偶联反应的优选活化剂／缩合剂包括：与1-羟基苯并三唑(HOBt)和N，N-二异丙基乙胺相组合的N-(3-二甲基氨基异丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，或者与N，N-二异丙基乙胺相组合的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)等。
通常在-20℃至+60℃的温度范围，优选地在0℃至+40℃，进行偶联反应(IX)+(X)→(II-C)、(XII-A)和／或(XII-B)+(X)→(II-D-A)和／或(II-D-B)、(IX)+(XIII)→(XIV)、(IX)+(XV)→(XVI)和(XXII)+(XXIII)→(II-D)。所述反应可以在常压、增压或减压(例如0.5-5巴)下进行。通常在常压下进行。
与上述的酰胺偶联反应类似地进行酯形成反应(IX)+(XVIII)→(XII)和(IX)+(XI-A)和／或(XI-B)→(XII-A)和／或(XII-B)、(IX)+(XXIV)→(XXV)以及(IX)+(XXI)→(XXII)。优选地，使用N-(3-二甲基氨基异丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4-二甲基氨基吡啶，在+50℃至100℃的温度，在常压下，在二氯甲烷中进行这些反应。
如果有用或需要的话，在上述方法步骤中，任选地存在于化合物中的官能团(具体而言，诸如氨基、羟基和羧基)还可以以暂时受保护的形式存在。根据肽化学中已知的常规方法引入和除去这样的保护基(参见，例如，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groupsin Organic Synthesis，Wiley，New York，1999；M.Bodanszky和A.Bodanszky，The Practice of PeptideSynthesis，Springer Verlag，Berlin，1984)。当存在多个受保护的基团时，可以任选地在一锅反应中同时将它们再释放，或者也可以在分开的反应步骤中再释放。
优选的氨基保护基PG1包括叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(1)或(9H-芴-9-基甲氧基)羰基(Fmoc)；对于羟基或羧基官能团，优选使用叔丁基或苄基作为保护基PG2。叔丁基或叔丁氧基羰基通常通过在惰性溶剂中使用强酸处理来消除，所述强酸例如盐酸，氢溴酸或三氟乙酸，所述惰性溶剂例如乙醚、1，4-二噁烷、二氯甲烷或乙酸。任选地，该反应还可在不加入惰性溶剂的情况下进行。在苄基或苄氧基羰基作为保护基的情况下，这样的保护基优选在有合适的钯催化剂(例如，活性炭载钯)存在下通过氢解来除去。(9H-芴-9-基甲氧基)羰基通常使用仲胺碱(例如二乙基胺或哌啶)来除去。
反应(VI)→(II-A)在溶剂中进行，所述溶剂在反应条件下为惰性的，例如，醚类诸如四氢呋喃、1，4-二噁烷、1，2-二甲氧基乙烷或双(2-甲氧基乙基)醚，醇类诸如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇，或偶极非质子溶剂类诸如丙酮、甲基乙基酮、乙腈、乙酸乙酯、吡啶、二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N′-二甲基丙烯脲(DMPU)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)或水。也可能使用这样的溶剂的混合物。优选使用1，4-二噁烷和水的混合物。
对于反应(VI)→(II-A)而言合适的碱包括，例如，碱金属碳酸盐诸如碳酸钾、碳酸钠或碳酸锂，碱金属碳酸氢盐诸如碳酸氢钠或碳酸氢钾，或碱金属烷醇盐诸如甲醇钠、乙醇钠或叔丁醇钾。碳酸氢钠是优选的。
反应(VI)→(II-A)在0℃至+50℃的温度范围内进行，优选地在+10℃至+30℃。所述反应可以在常压下、在增压下或在减压下(例如0.5-5巴)下进行。通常在常压下进行。
反应(VI)+(VII)→(II-B)在溶剂中进行，所述溶剂在反应条件下为惰性的，例如，醚类诸如四氢呋喃、1，4二噁烷、1，2-二甲氧基乙烷或双(2-甲氧基乙基)醚，醇类诸如甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或叔丁醇，或偶极非质子溶剂类诸如丙酮、甲基乙基酮、乙腈、乙酸乙酯、吡啶、二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N′-二甲基丙烯脲(DMPU)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)或水。也可能使用这样的溶剂的混合物。DMF是优选的。
对于反应(VI)+(VII)→(II-B)而言合适的碱包括，例如，叔胺碱类诸如三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、N，N-二异丙基乙胺、吡啶或4-N，N-二甲基氨基吡啶。N，N-二异丙基乙胺是优选的。
反应(VI)+(VII)→(II-B)在0℃至+50℃的温度范围内进行，优选地在+10℃至+30℃。所述反应可以在常压下、在增压下或在减压下(例如0.5-5巴)下进行。通常在常压下进行。
反应(IX)→(III-A)、(XIV)→(III-B)和(XVI)→(III-C)以及(VI)+(XVII)→(III-D)、(XIX)+(XX)→(III-E)和(XXV)+(XX)→(III-F)在溶剂中进行，所述溶剂在反应条件下为惰性的。合适的溶剂包括，例如，醚类诸如二乙基醚、二异丙基醚、叔丁基甲基醚、四氢呋喃、1，4-二噁烷、1，2-二甲氧基乙烷或双(2-甲氧基乙基)醚，烃类诸如苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、庚烷、环己烷或石油馏分，卤代烃类诸如二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、1，2-二氯乙烷、三氯乙烯或氯苯，或偶极非质子溶剂类诸如丙酮、甲基乙基酮、乙腈、乙酸乙酯、吡啶、二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N′-二甲基丙烯脲(DMPU)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)。也可能使用这样的溶剂的混合物。N，N-二甲基甲酰胺是优选的。
对于这些反应而言合适的碱包括，例如，叔胺类诸如三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、N，N-二异丙基乙胺、吡啶或4-N，N-二甲基氨基吡啶。N，N-二异丙基乙胺是优选的，任选地加入4-N，N-二甲基氨基吡啶。
反应(IX)→(III-A)、(XIV)→(III-B)和(XVI)→(III-C)以及(VI)+(XVII)→(III-D)和(XIX)+(XX)→(III-E)在0℃至+50℃的温度范围内进行，优选地在+10℃至+30℃。所述反应可以在常压下、在增压下或在减压下(例如0.5-5巴)下进行。通常在常压下进行。
式(II)、(III)、(I-A)和／或(I-B)的化合物属于式(IIa)、(IIIa)、(Ia-A)和／或(Ia-B)的化合物子集，其中R35代表甲基。与如上所述的式(II)和(III)的化合物的合成类似地，合成化合物(IIa)和(IIIa)。
通过例如下述合成路线图(路线图3-13、18)解释了上述方法：
路线图3
Figure BDA0000432948840002011
[a)：1.水／二噁烷，1N HCl，100℃；2.H2，Pd／C，甲醇，室温；b)：NaHCO3，H2O，二噁烷，室温]。
路线图4
Figure BDA0000432948840002021
[a)：二异丙基乙胺，DMF，室温]。
路线图5
Figure BDA0000432948840002031
[a)：水／二噁烷，1N HCl，100℃；b)：HATU，二异丙胺，DMF，室温]。
路线图6
Figure BDA0000432948840002041
[a)：1.EDCI，DMAP，二氯甲烷，室温；2.H2，甲醇，室温；b)：1.EDCI，HOBt，二异丙胺，DMF，室温；2.二氯甲烷，室温]。
路线图7
Figure BDA0000432948840002051
[a)：1.EDCI，DMAP，二氯甲烷，室温；2.H2，甲醇，室温；b)：HATU，二异丙胺，DMF，室温]。
路线图8
[a)：EDCI，二氯甲烷，室温]。
路线图9
Figure BDA0000432948840002071
[a)：HATU，二异丙基乙胺，DMF，室温；2.H2，甲醇，室温；b)：EDCI，DMAP，二氯甲烷，室温]。
路线图10
Figure BDA0000432948840002081
[a)：1.HATU，二异丙基乙胺，DMF，室温；2.二氯甲烷，室温；b)：EDCI，DMAP，二氯甲烷，室温]。
路线图11
Figure BDA0000432948840002091
[a)：二异丙基乙胺，DMF，室温]。
路线图12
[a)：1.EDCI，DMAP，二氯甲烷，室温；2.二氯甲烷，室温；b)：二异丙胺，DMAP，二氯甲烷，室温]。
路线图13
Figure BDA0000432948840002111
[a)：DMAP，二异丙胺，二氯甲烷，室温]。
路线图18
Figure BDA0000432948840002121
[a)：1.水／二噁烷，1N HCl，100℃；2.H2，Pd／C，甲醇，室温；b)：HATU，二异丙基乙胺，室温]。
与从文献已知的方法类似地，使用标准肽化学方法，且如实验部分中所述，从商购可得的氨基酸结构单元或由文献已知的那些结构单元(参见，例如，Pettit等人，Synthesis1996，719；Shioiri等人，Tetrahedron Lett.1991，32，931；Shioiri等人，Tetrahedrn1993，49，1913；Koga等人，TetrahedronLett.1991，32，2395；Vidal等人，Tetrahedron2004，60，9715；Poncet等人，Tetrahedron1994，50，5345.Pettit等人，J.Org.Chem.1994，59，1796)，可以合成式(IV)的化合物。下面的合成路线图(路线图14-16)作为示例解释了该合成方法。
路线图14
[a)：盐酸羟胺，KOH，MeOH，0℃→室温；b)：BrCH2(CH2)2CH2Br，K2CO3，丙酮，回流]。
路线图15
[a)：1.二异丙基乙胺，BEP，二氯甲烷，-10℃→室温；2.MeOH]。
路线图16
Figure BDA0000432948840002141
[a)：1.二异丙基乙胺，BEP，DMF，室温；2.二氯甲烷；b)：1.HATU，二异丙基乙胺，DMF，室温；2.二氯甲烷，室温；c)：1.HATU，二异丙基乙胺，DMF，室温；2.哌啶，DMF，室温]。
式(XI)、(XIII)、(XV)、(XVII)和(XXI)的化合物(如果合适，包括其手性或非对映异构形式)是商购可得的或如文献中所述的此类化合物，或者其可通过对本领域技术人员显而易见的方式，以与文献中公开的方法类似的方法进行合成。在关于起始化合物和中间体的合成的部分中，实验部分还给出了许多关于起始原料合成的详尽的说明和文献信息。
式(V)、(VII)、(VIII)、(X)、(XVIII)、(XX)和(XXIII)的化合物(如果合适，包括其手性或非对映异构体形式)是从文献中已知的，或者其可通过对本领域技术人员显而易见的方式，以与文献中公开的方法类似的方法进行合成。在关于起始化合物和中间体的合成的部分中，实验部分还给出了许多关于起始原料合成的详尽的说明和文献信息。
可替换地，合成顺序的各个步骤可以以不同的次序进行。在下面的合成路线图(路线图17、19和20)中作为示例解释了该方案。
路线图17
Figure BDA0000432948840002151
[a)：硼烷-吡啶复合物，乙酸，MeOH；b)：1.HOBt，EDCI，二异丙基乙胺，DMF，室温；2.TFA，二氯甲烷，室温；c)：HATU，二异丙基乙胺，DMF，室温；d)1.Pd／C，MeOH，室温；2.NaHCO3，二噁烷，水]。
路线图19
Figure BDA0000432948840002161
[a)：1.HATU，二异丙基乙胺，DMF，室温；2.TFA，二氯甲烷，室温；3.((H3C)3C(C=O))2O，DMF，二异丙基乙胺；b)：二异丙基乙胺，BEP，DMF，室温；c)：1.H2，Pd／C(10％)。甲醇，室温；2.HATU，二异丙基乙胺，DMF，室温；3.TFA，二氯甲烷，室温]。
路线图20
Figure BDA0000432948840002171
[a)：硼烷-吡啶复合物，乙酸，MeOH；b)：1.HOBt，EDCI，二异丙基乙胺，DMF，室温；2.TFA，二氯甲烷，室温；c)：1.H2，Pd／C，MeOH，室温；2.NaHCO3，二噁烷，水；d)：HATU，二异丙基乙胺，DMF，室温]。
在一个实施方案中，所述结合剂结合存在于癌细胞上的靶分子。在一个优选的实施方案中，所述结合剂结合癌症靶分子。
在另一个优选的实施方案中，所述靶分子是选择的癌症靶分子。
在一个特别优选的实施方案中，所述靶分子是蛋白。
在一个实施方案中，所述靶分子是细胞外靶分子。在一个优选的实施方案中，所述细胞外的靶分子是蛋白。
癌症靶分子是本领域技术人员已知的。其例子列出在下面。
癌症靶分子的例子包括：
(1)EGF受体(NCBI参照序列NP_005219.2)
序列(1210个氨基酸)：
>gi|29725609|ref|NP_005219.2|表皮生长因子受体异形体a前体[智人]MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITY VQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRN LQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQ KLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQ MDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIG EFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRT DLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQ KTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECI QCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPN CTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
细胞外结构域标有下划线进行强调。
(2)间皮素(SwissProt索引Q13421-3)
序列(622个氨基酸)：
>sp|Q13421-3|间皮素OS的MSLN_HUMAN异形体2=智人GN=MSLN
MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA
其中间皮素由氨基酸296-598编码。氨基酸37-286编码“巨核细胞-增强因子”。间皮素通过GPI锚而锚定在细胞膜中，且在细胞外局部化。
(3)碳酸酐酶IX(SwissProt索引Q16790)
序列(459个氨基酸)：
>sp|Q16790|CAH9_HUMAN碳酸酐酶9OS=智人GN=CA9PE=1SV=2
MAPLCPSPWLPLLIPAPAPGLTVQLLLSLLLVPVHPQRLPRMQEDSPLGGGSSGEDDPL GEEDLPSEEDSPREEDPPGEEDLPGEEDLPGEEDLPEVKPKSEEEGSLKLEDLPTVEAPG DPQEPQNNAHRDKEGDDQSHWRYGGDPPWPRVSPACAGRFQSPVDIRPQLAAFCPALRPL ELLGFQLPPLPELRLRNNGHSVQLTLPPGLEMALGPGREYRALQLHLHWGAAGRPGSEHT VEGHRFPAEIHVVHLSTAFARVDEALGRPGGLAVLAAFLEEGPEENSAYEQLLSRLEEIA EEGSETQVPGLDISALLPSDFSRYFQYEGSLTTPPCAQGVIWTVFNQTVMLSAKQLHTLS DTLWGPGDSRLQLNFRATQPLNGRVIEASFPAGVDSSPRAAEPVQLNSCLAAGDILALVFGLLFAVTSVAFLVQMRRQHRRGTKGGVSYRPAEVAETGA
细胞外结构域标有下划线进行强调。
(4)C4.4a(NCBI参照序列NP_055215.2；同义词LYPD3)
序列(346个氨基酸)：
>gi|93004088|ref|NP_055215.2|含有ly6／PLAUR结构域的蛋白3前体[智人]
MDPARKAGAQAMIWTAGWLLLLLLRGGAQALECYSCVQKADDGCSPNKMKTVKCAPGVDVCTEAVG AVETIHGQFSLAVRGCGSGLPGKNDRGLDLHGLLAFIQLQQCAQDRCNAKLNLTSRALDPAGNESAYPP NGVECYSCVGLSREACQGTSPPVVSCYNASDHVYKGCFDGNVTLTAANVTVSLPVRGCVQDEFCTRDG VTGPGFTLSGSCCQGSRCNSDLRNKTYFSPRIPPLVRLPPPEPTTVASTTSVTTSTSAPVRPTSTTKPMPAP TSQTPRQGVEHEASRDEEPRLTGGAAGHQDRSNSGQYPAKGGPQQPHNKGCVAPTAGLAALLLAVAAGVLL
成熟的细胞外结构域标有下划线进行强调(SEQ ID NO：1)。
(5)CD52(NCBI参照序列NP_001794.2)
>gi|68342030|ref|NP_001794.2|阿仑单抗(CAMPATH)-1抗原前体[智人]
MKRFLFLLLTISLLVMVQIQTGLSGQNDTSQTSSPSASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFS
(6)HER2(NCBI参照序列NP_004439.2)
>gi|54792096|ref|NP_004439.2|受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2异形体a[智人]
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV
(7)CD20(NCBI参照序列NP_068769.2)
>gi|23110987|ref|NP_068769.2|B-淋巴细胞抗原CD20[智人]
MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP
(8)淋巴细胞活化抗原CD30(SwissProtID P28908)
>gi|68348711|ref|NP_001234.2|肿瘤坏死因子受体超家族成员8异形体1前体[智人]
MRVLLAALGLLFLGALRAFPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSRARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
(9)淋巴细胞粘附分子CD22(SwissProtID P20273)
>gi|157168355|ref|NP_001762.2|B-细胞受体CD22异形体1前体[智人]MHLLGPWLLLLVLEYLAFSDSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFHNPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGSQVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILPWHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACAACNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFDWNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRSPLSTLTVYYSPETIGRRVAVGLGSCLAILILAICGLKLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH
(10)髓系细胞表面抗原CD33(SwissProtID P20138)
>gi|130979981|ref|NP_001763.3|髓系细胞表面抗原CD33异形体1前体[智人]
MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ
(11)跨膜糖蛋白NMB(SwissProtID Q14956)
>gi|52694752|ref|NP_001005340.1|跨膜糖蛋白NMB异形体a前体[智人]
MECLYYFLGFLLLAARLPLDAAKRFHDVLGNERPSAYMREHNQLNGWSSDENDWNEKLYPVWKRGDMRWKNSWKGGRVQAVLTSDSPALVGSNITFAVNLIFPRCQKEDANGNIVYEKNCRNEAGLSADPYVYNWTAWSEDSDGENGTGQSHHNVFPDGKPFPHHPGWRRWNFIYVFHTLGQYFQKLGRCSVRVSVNTANVTLGPQLMEVTVYRRHGRAYVPIAQVKDVYVVTDQIPVFVTMFQKNDRNSSDETFLKDLPIMFDVLIHDPSHFLNYSTINYKWSFGDNTGLFVSTNHTVNHTYVLNGTFSLNLTVKAAAPGPCPPPPPPPRPSKPTPSLATTLKSYDSNTPGPAGDNPLELSRIPDENCQINRYGHFQATITIVEGILEVNIIQMTDVLMPVPWPESSLIDFVVTCQGSIPTEVCTIISDPTCEITQNTVCSPVDVDEMCLLTVRRTFNGSGTYCVNLTLGDDTSLALTSTLISVPDRDPASPLRMANSALISVGCLAIFVTVISLLVYKKHKEYNPIENSPGNVVRSKGLSVFLNRAKAVFFPGNQEKDPLLKNQEFKGVS
(12)粘附分子CD56(SwissProtID P13591)
>gi|94420689|ref|NP_000606.3|神经细胞粘附分子1异形体1[智人]
MLQTKDLIWTLFFLGTAVSLQVDIVPSQGEISVGESKFFLCQVAGDAKDKDISWFSPNGEKLTPNQQRISVVWNDDSSSTLTIYNANIDDAGIYKCVVTGEDGSESEATVNVKIFQKLMFKNAPTPQEFREGEDAVIVCDVVSSLPPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNYLQIRGIKKTDEGTYRCEGRILARGEINFKDIQVIVNVPPTIQARQNIVNATANLGQSVTLVCDAEGFPEPTMSWTKDGEQIEQEEDDEKYIFSDDSSQLTIKKVDKNDEAEYICIAENKAGEQDATIHLKVFAKPKITYVENQTAMELEEQVTLTCEASGDPIPSITWRTSTRNISSEEKTLDGHMVVRSHARVSSLTLKSIQYTDAGEYICTASNTIGQDSQSMYLEVQYAPKLQGPVAVYTWEGNQVNITCEVFAYPSATISWFRDGQLLPSSNYSNIKIYNTPSASYLEVTPDSENDFGNYNCTAVNRIGQESLEFILVQADTPSSPSIDQVEPYSSTAQVQFDEPEATGGVPILKYKAEWRAVGEEVWHSKWYDAKEASMEGIVTIVGLKPETTYAVRLAALNGKGLGEISAASEFKTQPVQGEPSAPKLEGQMGEDGNSIKVNLIKQDDGGSPIRHYLVRYRALSSEWKPEIRLPSGSDHVMLKSLDWNAEYEVYVVAENQQGKSKAAHFVFRTSAQPTAIPANGSPTSGLSTGAIVGILIVIFVLLLVVVDITCYFLNKCGLFMCIAVNLCGKAGPGAKGKDMEEGKAAFSKDESKEPIVEVRTEEERTPNHDGGKHTEPNETTPLTEPEKGPVEAKPECQETETKPAPAEVKTVPNDATQTKENESKA
(13)表面分子CD70(SwissProtID P32970)
>gi|4507605|ref|NP_001243.1|CD70抗原[智人]
MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP
(14)表面分子CD74(SwissProt ID P04233)
>gi|10835071|ref|NP004346.1|HLA II类组织相容性抗原γ链异形体b[智人]
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM
(15)B-淋巴细胞抗原CD19(SwissProtID P15391)
>gi|296010921|ref|NP001171569.1|B-淋巴细胞抗原CD19异形体1前体[智人]
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLAGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR
(16)表面蛋白粘蛋白1(SwissProtID P15941)
>gi|65301117|ref|NP002447.4|粘蛋白-1异形体1前体[智人]
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNALSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL
(17)表面蛋白CD138(SwissProt ID P18827)
>gi|29568086|ref|NP002988.3|多配体聚糖-1前体[智人]
MRRAALWLWLCALALSLQPALPQIVATNLPPEDQDGSGDDSDNFSGSGAGALQDITLSQQTPSTWKDTQLLTAIPTSPEPTGLEATAASTSTLPAGEGPKEGEAVVLPEVEPGLTAREQEATPRPRETTQLPTTHQASTTTATTAQEPATSHPHRDMQPGHHETSTPAGPSQADLHTPHTEDGGPSATERAAEDGASSQLPAAEGSGEQDFTFETSGENTAVVAVEPDRRNQSPVDQGATGASQGLLDRKEVLGGVIAGGLVGLIFAVCLVGFMLYRMKKKDEGSYSLEEPKQANGGAYQKPTKQEEFYA
(18)整联蛋白αV(GenBank登记号NP002201.1)
>gi|4504763|ref|NP002201.1|整联蛋白α-V异形体1前体[智人]
MAFPPRRRLRLGPRGLPLLLSGLLLPLCRAFNLDVDSPAEYSGPEGSYFGFAVDFFVPSASSRMFLLVGAPKANTTQPGIVEGGQVLKCDWSSTRRCQPIEFDATGNRDYAKDDPLEFKSHQWFGASVRSKQDKILACAPLYHWRTEMKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDADGQGFCQGGFSIDFTKADRVLLGGPGSFYWQGQLISDQVAEIVSKYDPNVYSIKYNNQLATRTAQAIFDDSYLGYSVAVGDFNGDGIDDFVSGVPRAARTLGMVYIYDGKNMSSLYNFTGEQMAAYFGFSVAATDINGDDYADVFIGAPLFMDRGSDGKLQEVGQVSVSLQRASGDFQTTKLNGFEVFARFGSAIAPLGDLDQDGFNDIAIAAPYGGEDKKGIVYIFNGRSTGLNAVPSQILEGQWAARSMPPSFGYSMKGATDIDKNGYPDLIVGAFGVDRAILYRARPVITVNAGLEVYPSILNQDNKTCSLPGTALKVSCFNVRFCLKADGKGVLPRKLNFQVELLLDKLKQKGAIRRALFLYSRSPSHSKNMTISRGGLMQCEELIAYLRDESEFRDKLTPITIFMEYRLDYRTAADTTGLQPILNQFTPANISRQAHILLDCGEDNVCKPKLEVSVDSDQKKIYIGDDNPLTLIVKAQNQGEGAYEAELIVSIPLQADFIGVVRNNEALARLSCAFKTENQTRQVVCDLGNPMKAGTQLLAGLRFSVHQQSEMDTSVKFDLQIQSSNLFDKVSPVVSHKVDLAVLAAVEIRGVSSPDHIFLPIPNWEHKENPETEEDVGPVVQHIYELRNNGPSSFSKAMLHLQWPYKYNNNTLLYILHYDIDGPMNCTSDMEINPLRIKISSLQTTEKNDTVAGQGERDHLITKRDLALSEGDIHTLGCGVAQCLKIVCQVGRLDRGKSAILYVKSLLWTETFMNKENQNHSYSLKSSASFNVIEFPYKNLPIEDITNSTLVTTNVTWGIQPAPMPVPVWVIILAVLAGLLLLAVLVFVMYRMGFFKRVRPPQEEQEREQLQPHENGEGNSET
(19)畸胎癌-衍生的生长因子1蛋白TDGF1(GenBank登记号：NP003203.1)
>gi|4507425|ref|NP003203.1|畸胎癌-衍生的生长因子1异形体1前体[智人]
MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYY
(20)前列腺-特异性的膜抗原PSMA(SwissProtID：Q04609)
>gi|4758398|ref|NP004467.1|谷氨酸羧肽酶2异形体1[智人]
MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
(21)酪氨酸蛋白激酶EPHA2(SwissProtID：P29317)
>gi|32967311|ref|NP004422.2|ephrin A型受体2前体[智人]
MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAVIGGVAVGVVLLLVLAGVGFFIHRRRKNQRARQSPEDVYFSKSEQLKPLKTYVDPHTYEDPNQAVLKFTTEIHPSCVTRQKVIGAGEFGEVYKGMLKTSSGKKEVPVAIKTLKAGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVISKYKPMMIITEYMENGALDKFLREKDGEFSVLQLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEATYTTSGGKIPIRWTAPEAISYRKFTSASDVWSFGIVMWEVMTYGERPYWELSNHEVMKAINDGFRLPTPMDCPSAIYQLMMQCWQQERARRPKFADIVSILDKLIRAPDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVSEWLESIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTNDDIKRIGVRLPGHQKRIAYSLLGLKDQVNTVGIPI
(22)表面蛋白SLC44A4(GenBank登记号NP001171515)
>gi|295849282|ref|NP001171515.1|胆碱转运蛋白-样蛋白4异形体2[智人]
MGGKQRDEDDEAYGKPVKYDPSFRGPIKNRSCTDVICCVLFLLFILGYIVVGIVAWLYGDPRQVLYPRNSTGAYCGMGENKDKPYLLYFNIFSCILSSNIISVAENGLQCPTPQTVITSLQQELCPSFLLPSAPALGRCFPWTNVTPPALPGITNDTTIQQGISGLIDSLNARDISVKIFEDFAQSWYWILVALGVALVLSLLFILLLRLVAGPLVLVLILGVLGVLAYGIYYCWEEYRVLRDKGASISQLGFTTNLSAYQSVQETWLAALIVLAVLEAILLLMLIFLRQRIRIAIALLKEASKAVGQMMSTMFYPLVTFVLLLICIAYWAMTALYLATSGQPQYVLWASNISSPGCEKVPINTSCNPTAHLVNSSCPGLMCVFQGYSSKGLIQRSVFNLQIYGVLGLFWTLNWVLALGQCVLAGAFASFYWAFHKPQDIPTFPLISAFIRTLRYHTGSLAFGALILTLVQIARVILEYIDHKLRGVQNPVARCIMCCFKCCLWCLEKFIKFLNRNAYIMIAIYGKNFCVSAKNAFMLLMRNIVRVVVLDKVTDLLLFFGKLLVVGGVGVLSFFFFSGRIPGLGKDFKSPHLNYYWLPIMTSILGAYVIASGFFSVFGMCVDTLFLCFLEDLERNNGSLDRPYYMSKSLLKILGKKNEAPPDNKKRKK
(23)表面蛋白BMPR1B(SwissProt：O00238)
(24)运输蛋白SLC7A5(SwissProt：Q01650)
(25)上皮前列腺抗原STEAP1(SwissProt：Q9UHE8)
(26)卵巢癌抗原MUC16(SwissProt：Q8WXI7)
(27)运输蛋白SLC34A2(SwissProt：O95436)
(28)表面蛋白SEMA5b(SwissProt：Q9P283)
(29)表面蛋白LYPD1(SwissProt：Q8N2G4)
(30)内皮缩血管肽受体B型EDNRB(SwissProt：P24530)
(31)环指蛋白RNF43(SwissProt：Q68DV7)
(32)前列腺癌相关蛋白STEAP2(SwissProt：Q8NFT2)
(33)阳离子通道TRPM4(SwissProt：Q8TD43)
(34)补体受体CD21(SwissProt：P20023)
(35)B-细胞抗原受体复合物相关蛋白CD79b(SwissProt：P40259)
(36)细胞粘附抗原CEACAM6(SwissProt：P40199)
(37)二肽酶DPEP1(SwissProt：P16444)
(38)白介素受体IL20Rα(SwissProt：Q9UHF4)
(39)蛋白聚糖BCAN(SwissProt：Q96GW7)
(40)ephrine受体EPHB2(SwissProt：P29323)
(41)前列腺干细胞相关蛋白PSCA(GenBank登记号NP_005663.2)
(42)表面蛋白LHFPL3(SwissProt：Q86UP9)
(43)受体蛋白TNFRSF13C(SwissProt：Q96RJ3)
(44)B-细胞抗原受体复合物相关蛋白CD79a(SwissProt：P11912)
(45)受体蛋白CXCR5(SwissProt：P32302)
(46)离子通道P2X5(SwissProt：Q93086)
(47)淋巴细胞抗原CD180(SwissProt：Q99467)
(48)受体蛋白FCRL1(SwissProt：Q96LA6)
(49)受体蛋白FCRL5(SwissProt：Q96RD9)
(50)MHC II类分子Ia抗原HLA-DOB(GenBank Accession No：NP_002111.1)
(51)T-细胞蛋白VTCN1(SwissProt：Q7Z7D3)。
(52)I型单跨膜蛋白“程序性细胞死亡1配体1”
(同义词：CD274、B7H1、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1)(SwissProt：Q9NZQ7)-二者都是异形体
>sp|Q9NZQ7|PD1L1_HUMAN程序性细胞死亡1配体1OS=智人GN=CD274PE=1SV=1
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
(53)I型单跨膜蛋白“ICOSLG”(同义词：B7H2、B7RP1、ICOSL、KIAA0653、CD275)-(SwissProt：O75144)，二者都是异形体
>sD|O75144|ICOSL_HUMANICOS配体OS=智人GN=ICOSLG PE=1SV=2
MRLGSPGLLFLLFSSLRADTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAATWSILAVLCLLVVVAVAIGWVCRDRCLQHSYAGAWAVSPETELTGHV
(54)酪氨酸激酶“成纤维细胞生长因子受体3”(FGFR-3，EC=2.7.10.1，CD333，JTK4)、(SwissProt：P22607)-four异形体(选择性剪接)
>sp|P22607|FGFR3HUMAN成纤维细胞生长因子受体3OS=智人GN=FGFR3PE=1SV=1
MGAPACALALCVAVAIVAGASSESLGTEQRVVGRAAEVPGPEPGQQEQLVFGSGDAVELSCPPPGGGPMGPTVWVKDGTGLVPSERVLVGPQRLQVLNASHEDSGAYSCRQRLTQRVLCHFSVRVTDAPSSGDDEDGEDEAEDTGVDTGAPYWTRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPAAGNPTPSISWLKNGREFRGEHRIGGIKLRHQQWSLVMESVVPSDRGNYTCVVENKFGSIRQTYTLDVLERSPHRPILQAGLPANQTAVLGSDVEFHCKVYSDAQPHIQWLKHVEVNGSKVGPDGTPYVTVLKTAGANTTDKELEVLSLHNVTFEDAGEYTCLAGNSIGFSHHSAWLVVLPAEEELVEADEAGSVYAGILSYGVGFFLFILVVAAVTLCRLRSPPKKGLGSPTVHKISRFPLKRQVSLESNASMSSNTPLVRIARLSSGEGPTLANVSELELPADPKWELSRARLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAIGIDKDRAAKPVTVAVKMLKDDATDKDLSDLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQGGPLYVLVEYAAKGNLREFLRARRPPGLDYSFDTCKPPEEQLTFKDLVSCAYQVARGMEYLASQKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDVHNLDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRVYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGIPVEELFKLLKEGHRMDKPANCTHDLYMIMRECWHAAPSQRPTFKQLVEDLDRVLTVTSTDEYLDLSAPFEQYSPGGQDTPSSSSSGDDSVFAHDLLPPAPPSSGGSRT
(55)I型单跨膜蛋白“TYRP1”(CAS2、TYRP、TYRRP、DHICA氧化酶、5，6-二羟基吲哚-2-甲酸氧化酶、过氧化氢酶B、糖蛋白75、黑素瘤抗原gp75、酪氨酸酶相关的蛋白1)、(SwissProt：P17643)
>sp|P17643|TYRP1HUMAN5，6-二羟基吲哚-2-甲酸氧化酶OS=智人GN=TYRP1PE=1SV=2
MSAPKLLSLGCIFFPLLLFQQARAQFPRQCATVEALRSGMCCPDLSPVSGPGTDRCGSSSGRGRCEAVTADSRPHSPQYPHDGRDDREVWPLRFFNRTCHCNGNFSGHNCGTCRPGWRGAACDQRVLIVRRNLLDLSKEEKNHFVRALDMAKRTTHPLFVIATRRSEEILGPDGNTPQFENISIYNYFVWTHYYSVKKTFLGVGQESFGEVDFSHEGPAFLTWHRYHLLRLEKDMQEMLQEPSFSLPYWNFATGKNVCDICTDDLMGSRSNFDSTLISPNSVFSQWRVVCDSLEDYDTLGTLCNSTEDGPIRRNPAGNVARPMVQRLPEPQDVAQCLEVGLFDTPPFYSNSTNSFRNTVEGYSDPTGKYDPAVRSLHNLAHLFLNGTGGQTHLSPNDPIFVLLHTFTDAVFDEWLRRYNADISTFPLENAPIGHNRQYNMVPFWPPVTNTEMFVTAPDNLGYTYEIQWPSREFSVPEIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRARRSMDEANQPLLTDQYQCYAEEYEKLQNPNQSVV
(56)细胞膜蛋白，裂解成分泌的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3、OCI5、GTR2-2、肠蛋白OCI-5、MXR7)、(SwissProt：P51654)
>sp|P51654|GPC3HUMAN磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3OS=智人GN=GPC3PE=1SV=1
MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGLKWVPETPVPGSDLQVCLPKGPTCCSRKMEEKYQLTARLNMEQLLQSASMELKFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMFKNNYPSLTPQAFEFVGEFFTDVSLYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLKVFGNFPKLIMTQVSKSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSKDCGRMLTRMWYCSYCQGLMMVKPCGGYCNVVMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVNGMYRIYDMENVLLGLFSTIHDSIQYVQKNAGKLTTTIGKLCAHSQQRQYRSAYYPEDLFIDKKVLKVAHVEHEETLSSRRRELIQKLKSFISFYSALPGYICSHSPVAENDTLCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIdKLKHINQLLRTMSMPKGRVLDKNLDEEGFESGDCGDDEDECIGGSGDGMIKVKNQLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLKLLTSMAISVVCFFFLVH
在本发明的一个优选主题中，所述癌症靶分子选自癌症靶分子(1)至(56)。
在本发明的另一个优选主题中，所述结合剂结合选自以下的细胞外癌症靶分子：癌症靶分子(1)至(56)。
在本发明的另一个优选主题中，所述结合剂特异性地结合选自以下的细胞外癌症靶分子：癌症靶分子(1)至(56)。
在本发明的一个特别优选主题中，所述癌症靶分子选自：EGF受体(NP_005219.2)、间皮素(Q13421-3)、C4.4a(NP_055215.2)、碳酸酐酶IX(CAIX；Q16790、NP_001207.2)、HER2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、TYRP1、成纤维细胞生长因子受体3、I型单跨膜蛋白ICOSLG和程序性细胞死亡1配体1。
在本发明的另一个特别优选主题中，所述结合剂结合选自以下的细胞外癌症靶分子：EGF受体(NP_005219.2)、间皮素(Q13421-3)、C4.4a(NP_055215.2)、碳酸酐酶IX(CA IX；Q16790、NP_001207.2)、HER2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、TYRP1、成纤维细胞生长因子受体3、I型单跨膜蛋白ICOSLG和程序性细胞死亡1配体1。
在一个优选的实施方案中，所述结合剂在结合它在靶细胞上的细胞外靶分子以后，作为所述结合的结果，被靶细胞内化。这种效应是靶细胞吸收结合剂-药物缀合物(其可以是免疫缀合物或ADC)的效应。
在一个实施方案中，所述结合剂是结合蛋白。在一个优选的实施方案中，所述结合剂是抗体、结合抗原的抗体片段、多特异性抗体或抗体模拟物。
优选的抗体模拟物包括亲和体(affibodies)、adnectins、anticalins、DARPins、亲和体(avimers)或纳米抗体(nanobodies)。优选的多特异性抗体包括双特异性抗体和三特异性抗体。
在一个优选的实施方案中，所述结合剂是抗体或结合抗原的抗体片段；更优选地，它是分离的抗体或分离的结合抗原的抗体片段。
优选的结合抗原的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、双体、Dabs、直链抗体和scFv，Fab、双体和scFv是特别优选的。
在一个特别优选的实施方案中，所述结合剂是抗体。特别优选的是单克隆抗体或其结合抗原的抗体片段。进一步特别优选的是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其结合抗原的抗体片段。
本领域普通技术人员使用已知方法，例如重组合成或重组表达，可以合成结合癌症靶分子的抗体或结合抗原的抗体片段。癌症靶分子的结合剂可以商业获得，或者可以由本领域普通技术人员使用已知方法(例如，化学合成或重组表达)合成。在WO 2007070538(参见第22页“抗体”)中描述了合成抗体或结合抗原的抗体片段的其它方法。本领域技术人员知晓诸如产生文库的所谓的噬菌体展示技术等方法(例如，Morphosys HuCALGold)，且可以用于发现抗体或结合抗原的抗体片段(参见WO 200707058，第24ff页，和第70页的实施例1，第72页的实施例2)。在例如WO2007070538的第26页上描述了使用得自B-细胞的DNA文库合成抗体的其它方法。用于人源化抗体的方法描述于WO2007070538的第30-32页，并且详细地描述于Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：10029-10033，1989或WO 90／0786。另外，本领域技术人员熟知用于重组表达一般蛋白和特别是抗体的方法(参见，例如，Berger和Kimmel，Guideto Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.；Sambrook，等人，Molecular Cloning：4LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989，第1-3卷；Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausabel等人(编)，Current Protocols，Green Publishing Associates，Inc.，John Wiley&Sons，Inc.；Harlow等人，Monoclonal Antibodies：4Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，19881，Paul(编)；Fundamental Immunology，(Lippincott Williams&Wilkins，1998；和Harlow，等人，Using Antibodies：4Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1998。本领域技术人员熟知表达蛋白／抗体所必需的对应载体、启动子和信号肽。常规方法也描述于WO 2007070538的第41-45页。合成IgG1抗体的方法描述于WO 2007070538，例如，实施例6的第74ff页；例如，在WO 2007070538的第80上描述的这些方法，使得在抗体与它的抗原结合以后内化所述抗体成为可能。类似地，本领域技术人员可以利用在WO 2007070538中描述的方法合成碳酸酐酶IX(Mn)抗体，以合成具有其它靶分子特异性的抗体。
根据本发明的特别优选的结合剂是抗体，尤其是人或人源化抗体。所述抗体优选地具有至少10-7M的亲和力(作为Kd值；即，优选地具有比10-7M更小的Kd值的那些)，优选至少10-8M，特别优选地在10-9M至10-11M范围内。这些Kd值可以例如通过表面等离子体共振光谱法来确定。
根据本发明的抗体-药物缀合物也具有在这些范围内的亲和力。所述亲和力优选地不受活性成分的缀合显著影响(所述亲和力经常减小小于1个数量级，例如，从最大值10-8M至10-7M)。
根据本发明使用的抗体还优选地特征在于高选择性。在下述情况下，选择性较高：根据本发明的抗体对靶蛋白的亲和力优于另一种独立抗原(例如，人血清白蛋白)，所述亲和力高了2倍、5倍、10倍或特别优选地100倍(所述亲和力可以例如通过表面等离子体共振光谱法来确定)。
此外，根据本发明使用的抗体优选地是交叉反应性的。为了促进临床前试验，例如，毒理学研究或效力研究(例如在异种移植小鼠中)，并能够更好地解释它们，有利的是，根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白，而且结合这些研究所用的物种的物种靶蛋白。在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除了对根据本发明使用的抗体具有交叉反应性以外，还对至少一种其它物种的人靶蛋白具有交叉反应性。对于毒理学研究和效力研究而言，啮齿类动物、狗和非人灵长类动物科的物种是特别优选的。优选的啮齿动物物种包括小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物包括恒河猴、黑猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外，还对至少一种其它物种的靶蛋白具有交叉反应性，所述其它物种选自小鼠、大鼠和长尾猕猴(成束猴)。根据本发明使用的除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外还至少对小鼠靶蛋白具有交叉反应性的抗体是特别优选的。优选的是这样的交叉反应性抗体：其对其它非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不超过50倍，具体地不超过10倍。
EGFR抗体
结合癌症靶分子EGFR的抗体的例子包括西妥昔单抗(INN No.7906)、帕木单抗(INN No.8499)和尼妥珠单抗(INN No.8545)。西妥昔单抗(DrugBank登录号DB00002)是在SP2／0小鼠骨髓瘤细胞中生产的一种嵌合的抗-E GFR1抗体，且由ImClone Systems Inc.／Merck KGaA／Bristol-MyersSquibb Co.销售。西妥昔单抗被指示用于治疗转移性的、表达EGFR的、具有野生型K-Ras基因的结肠直肠癌。它具有10-10M的亲和力。
序列：
西妥昔单抗轻链(κ)：
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
西妥昔单抗重链：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
帕木单抗(INN No.8499)(Drug Bank登录号DB01269)是一种特异性地结合人EGF受体1的重组单克隆人IgG2抗体，且由Abgenix／Amgen销售。帕木单抗源自转基因小鼠(XenoMouse)的免疫接种。这些小鼠能够生产人免疫球蛋白(轻链和重链)。选择一种生产针对EGFR的抗体的特定B-细胞克隆，且用CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)将该克隆永生化。这些细胞现在被用于生产100％人抗体。帕木单抗被指示用于治疗表达EGFR的、转移性的结肠直肠癌，该癌对使用氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康的化学疗法治疗具有抗性。它具有10-11M的亲和力。
序列：
帕木单抗轻链(κ)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
帕木单抗重链：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
尼妥珠单抗(INN No.8545)(EP00586002，EP00712863)是特异性地结合人EGF受体1的人源化的单克隆IgG1抗体，且由YM BioSciences Inc.(Mississauga，加拿大)销售。它在非分泌性的NSO细胞(哺乳动物细胞系)中生产。尼妥珠单抗被批准用于治疗头和颈肿瘤、高度恶性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤(不是在欧洲和美国)和胰腺癌(罕用药，EMA)。它具有10-8M的亲和力。
EGFR抗体的其它实施方案包括：
·扎芦木单抗／2F8／HuMax-EGFr，Genmab Co.A／S(WO 02100348，WO 2004056847，INN No.8605)
·奈昔木单抗／11F8，ImClone／IMC-11F8，ImClone Systems Inc.(EliLilly&Co.)(WO 2005090407，(EP 01735348-A1，US 20070264253-A1，US 07598350，WO 2005090407 A1)，INN No.9083)
·马妥珠单抗／抗-EGFR mAb，Merek KGaA／抗-EGFR mAb，Takeda／EMD72000／EMD-6200／EMD-72000和EMD-55900／mAb425／单克隆抗体425，Merek KGaA／Takeda(WO 09215683，INN No.8103(马妥珠单抗))
·RG-7160／GA-201／GA201／R-7160／R7160／RG7160／RO-4858696／RO-5083945／RO4858696／RO5083945，Glycart Biotechnology AG(RocheHolding AG)(WO 2010112413 A1，WO 2010115554)
·GT-MAB5.2-GEX／CetuGEX，Glycotope GmbH(WO 2008028686 A2，EP 01900750 A1，EP 01911766 A1，EP 02073842 A2，US 20100028947 A1)
·ISU-101，Isu Abxis Inc.(ISU Chemical Co.Ltd.)／Scancell(专利：WO 2008004834 A1)
·ABT-806／mAb806／ch-806／抗-EGFR单克隆抗体806，LudwigInstitute for Cancer Research／Abbott／Life Science Pharmaceuticals(WO02092771，WO2005081854和WO-2009023265)
·SYM-004(由2种嵌合IgG1抗体(992和1024)组成)，Symphogen A／S(WO 2010022736A2)
·MR1-1／MR1-1KDEL，IVAX Corp(Teva Pharmaceutical IndustriesLtd.)(Duke University)、(专利：WO 2001062931 A2)
·针对缺失突变体的抗体，EGFRvIII，Amgen／Abgenix(WO2005010151，US 07628986)
·SC-100，Scancell Ltd.(WO-2001088138-A1)
·MDX-447／EMD82633／BAB-447／H447／MAb，E GFR，Medarex／Merck KGaA，Bristol-Myers Squibb(US)／Merck KGaA(DE)／Takeda(JP)(WO 09105871，WO 09215683)
·抗-EGFR mAb，Xencor(WO 2005056606)
·DXL-1218／抗-EGFR单克隆抗体(癌症)，InNexus，InNexusBiotechnology Inc.，药物项目PH048638
在一个优选的实施方案中，所述抗-EGFR抗体选自：西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎芦木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
在一个特别优选的实施方案中，所述抗-EGFR抗体选自：西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎芦木单抗、奈昔木单抗和马妥珠单抗。
技术人员熟知可以用于通过序列变异从上述抗体的CDR区域合成其它抗体的方法，所述其它抗体对靶分子具有类似的或更好的亲和力和/或特异性。
在另一个实施方案中，所述抗-EGFR抗体或结合抗原的抗体片段选自：
这样的抗体或结合抗原的抗体片段，其包含下述抗体之一的轻链的3个CDR区域和重链的3个CDR区域：西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎芦木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
在另一个优选的实施方案中，所述抗-EGFR抗体或结合抗原的抗体片段选自：
这样的抗体或结合抗原的抗体片段，其包含下述抗体之一的轻链的3个CDR区域和重链的3个CDR区域：西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎芦木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗。
碳酸酐酶IX抗体
根据本发明的特别优选的结合剂包括抗-CAIX抗体，尤其是人或人源化的抗-CAIX抗体。所述抗体优选地具有至少10-7M的亲和力(作为Kd值，即优选具有小于10-7M的Kd值的那些)，优选至少10-8M，特别优选地在10-9M至10-11M的范围内。所述Kd值可以例如通过表面等离子体共振光谱法来确定。
根据本发明的抗体-药物缀合物也具有在这些范围内的亲和力。所述亲和力优选地不受活性成分的缀合显著影响(所述亲和力经常减小小于1个数量级，例如，从最大值10-8M至10-7M)。
根据本发明使用的抗体还优选地特征在于高选择性。在下述情况下，存在高选择性：根据本发明的抗体对靶蛋白的亲和力比对另一种独立抗原(例如，人血清白蛋白)的亲和力高至少2倍、5倍、10倍或特别优选地100倍(所述亲和力可以例如通过表面等离子体共振光谱法来确定)。
此外，根据本发明使用的抗体优选地是交叉反应性的。为了促进临床前试验，例如，毒理学研究或效力研究(例如在异种移植小鼠中)，并能够更好地解释它们，有利的是，根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白，而且结合这些研究所用的物种的物种靶蛋白。在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外，还对至少一种物种的靶蛋白具有交叉反应性。对于毒理学研究和效力研究而言，优选使用的物种是啮齿类动物、狗和非人灵长类动物科的物种。优选的啮齿动物物种包括小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物包括恒河猴、黑猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外，还对至少一种其它物种的靶蛋白具有交叉反应性，所述其它物种选自小鼠、大鼠和长尾猕猴(成束猴)。根据本发明使用的除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外还至少对小鼠靶蛋白具有交叉反应性的抗体是特别优选的。优选的是这样的交叉反应性抗体：其对其它非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不超过50倍，具体地不超过10倍。抗-CAIX抗体包括例如在WO 2007／070538 A2中描述的那些。这些抗体可以根据本发明使用。
在WO 2007／070538 A2(例如，权利要求1-16)中描述了结合癌症靶分子碳酸酐酶IX的抗体的例子。
在一个优选的实施方案中，所述抗-碳酸酐酶IX抗体或结合抗原的抗体片段选自：抗-碳酸酐酶IX抗体或结合抗原的抗体片段3ee9(在WO2007070538A2中的权利要求4(a))、3ef2(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(b))、1e4(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(c))、3a4(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(d))、3ab4(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(e))、3ah10(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(f))、3bb2(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(g))、1aa1(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(h))、5a6(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(i))和5aa3(在WO 2007070538 A2中的权利要求4(j))。
在一个优选的实施方案中，所述抗-碳酸酐酶IX抗体或结合抗原的抗体片段选自：
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗原片段，它们包含抗体3ee9(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体3ef2(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体1e4(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体3a4(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体3ab4(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体3ah10(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体3bb2(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体1aa1(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体5a6(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，和
这样的抗-碳酸酐酶IX抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体5aa3(得自WO 2007070538 A2)轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列。
给出的CDR区域的序列显示在WO 2007070538 A2的第128-130页的图2a-2c中。
在一个优选的实施方案中，所述抗-碳酸酐酶IX抗体或结合抗原的抗体片段选自：
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体3ee9的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第137页上的图4b中所定义，
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体3ef2的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第138页上的图4c和/或第137页上的图4b中所定义，
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体1e4的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第136页上的图4a中所定义，
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体3a4的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第136页上的图4a中所定义，
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体3ab4的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第136页上的图4a中所定义，
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体3ah10的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第136页上的图4a中所定义，
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体3bb2的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第137页上的图4b中所定义，
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体1aa1的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第136页上的图4a中所定义，
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体5a6的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第137页上的图4b中所定义，且
这样的抗体或抗原结合片段，其由抗体5aa3的可变轻链和可变重链的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如在WO 2007070538 A2的第137页上的图4b中所定义。
在一个特别优选的实施方案中，所述抗-碳酸酐酶IX抗体是得自WO2007070538 A2的抗体3ee9。
在一个特别优选的实施方案中，所述抗-碳酸酐酶IX抗体或所述结合抗原的抗体片段包含：抗体3ee9的可变重链的CDR区域的氨基酸序列(VH3-CDR1：GFTFSSYGMS；VH3-CDR2：GISSLGSTTYYADSVKG；VH3-CDR3：TGSPGTFMHGDH，参见WO 2007070538 A2中的第128页的图2a)和抗体3ee9的可变轻链的CDR区域的氨基酸序列(VLk1-CDR1：RASQDINNYLS；VLk1-CDR2：YGASNLQS；VLk1-CDR3：QQYYGRPT，参见WO 2007070538 A2中的第129页的图2b)。
在一个特别优选的实施方案中，所述抗-碳酸酐酶IX抗体或所述结合抗原的抗体片段包含抗体3ee9的可变重链的氨基酸序列(VH3：ELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVSGISSLGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGSPGTFMHHGDHWGQGTLVTVSS，参见WO2007070538 A2中的第137页的图4b)和抗体3ee9的可变轻链的氨基酸序列
(VLk1：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRaSQDINNYLSWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISLQPEDFAVYYCQQYYGRPTTFGQGTKVEIKRT，参见WO 2007070538 A2中的第137页的图4b)。
在一个优选的实施方案中，所述抗-碳酸酐酶IX抗体3ee9是IgG抗体。
在一个特别优选的实施方案中，所述抗-碳酸酐酶IX抗体3ee9是IgG1抗体(3ee9-IgG1)，
其中所述重链的氨基酸序列包含下述序列：
QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVSGISSLGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGSPGTFMHGDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
且所述轻链的氨基酸序列包含下述序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRYTITCRASQDINNYLSWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYYGRPTTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗-碳酸酐酶IX抗体3ee9-IgG1：
本发明的另一个方面是，提供抗-碳酸酐酶IX抗体3ee9-IgG1。
C4.4a抗体：
根据本发明的特别优选的结合剂是抗-C4.4a抗体，尤其是人或人源化的抗-C4.4a抗体。这些抗体具有优选至少10-7M的亲和力(作为Kd值，即，优选地具有小于10-7M的Kd值的那些)，优选至少10-8M，最特别优选地在10-9M至10-11M范围内。所述Kd值可以例如通过表面等离子体共振光谱法来确定。
根据本发明的抗体-药物缀合物也具有在这些范围内的亲和力。所述亲和力优选地不受活性成分的缀合显著影响(所述亲和力经常减小小于1个数量级，例如，从最大值10-8M至10-7M)。
根据本发明使用的抗体还优选地特征在于高选择性。在下述情况下，存在高选择性：根据本发明的抗体对靶蛋白的亲和力比对另一种独立抗原(例如，人血清白蛋白)的亲和力高至少2倍、优选5倍或特别优选地10倍(所述亲和力可以例如通过表面等离子体共振光谱法来确定)。
此外，根据本发明使用的抗体优选地是交叉反应性的。为了促进临床前试验，例如，毒理学研究或效力研究(例如在异种移植小鼠中)，并能够更好地解释它们，有利的是，根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白，而且结合这些研究所用的物种的物种靶蛋白。在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外，还对至少一种物种的靶蛋白具有交叉反应性。对于毒理学研究和效力研究而言，优选使用的物种是啮齿类动物、狗和非人灵长类动物科的物种。优选的啮齿动物物种包括小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物包括恒河猴、黑猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外，还对至少一种其它物种的靶蛋白具有交叉反应性，所述其它物种选自小鼠、大鼠和长尾猕猴(成束猴)。根据本发明使用的特别优选的抗体包括：除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外还至少对小鼠靶蛋白具有交叉反应性的那些抗体。优选的交叉反应性的抗体是这样的抗体：其对其它非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不超过50倍，具体地不超过10倍。
抗-C4.4a抗体描述于例如WO 01／23553或WO 2011070088中。根据本发明可以使用这些抗体。
下面描述了C4.4a抗体和抗原结合片段的例子。在表1中给出了抗体的序列，其中每一行显示了在第1列中列出的抗体的可变轻链和/或可变重链的各个CDR氨基酸序列。该表还显示了在第1列中列出的各种抗体的可变轻链和可变重链的氨基酸序列以及所述抗体的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段结合C4.4a的S1结构域S1(SEQ ID NO：1的氨基酸位置1-85)。
在一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段与人C4.4a(SEQ ID NO：1)和鼠C4.4a(SEQ ID NO：2)具有交叉反应性。
在一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或其结合抗原的抗体片段在结合表达C4.4a的细胞以后被所述细胞内化。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段会与抗体M31-B01和／或与抗体M20-D02-S-A竞争对C4.4a的结合。抗体M31-B01和M20-D02-S-A会竞争对C4.4a的结合。针对B01-12的抗体B01-1借助于亲和力成熟从M31-B01合成，且与M31-B01竞争对C4.4a的结合。针对D02-13的抗体D02-1借助于亲和力成熟从M20-D02-S-A合成，且与M20-D02-S-A竞争对C4.4a的结合。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段包含在表1或表2中列出的至少1个、2个或3个CDR氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段包含在表1或表2中列出的抗体的至少1个、2个或3个CDR氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段包含在表1或表2中列出的抗体的可变轻链的至少1个、2个或3个CDR氨基酸序列和可变重链的至少1个、2个或3个CDR氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段与在表1或表2中列出的抗体的可变轻链的CDR氨基酸序列和可变重链的CDR氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％同一性。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或抗原结合片段的CDR序列包含：
与CDR序列SEQ ID NO：297(CDR H1)、SEQ ID NO：298(CDR H2)和SEQ ID NO：299(CDR H3)一致的重链CDR序列，和与CDR序列SEQID NO：300(CDR L1)，SEQ ID NO：22(CDR L2)和SEQ ID NO：301(CDR L3)一致的轻链CDR序列，或者
与CDR序列SEQ ID NO：302(CDR H1)、SEQ ID NO：303(CDR H2)和SEQ ID NO：304(CDR H3)一致的重链CDR序列，和与CDR序列SEQID NO：305(CDR L1)、SEQ ID NO：306(CDR L2)和SEQ ID NO：307(CDR L3)一致的轻链CDR序列。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段与在表1或表2中列出的抗体的可变轻链和可变重链具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％同一性。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段包含在表1或表2中列出的抗体的可变轻链的3个CDR氨基酸序列和可变重链的3个CDR氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段包含在表1或表2中列出的抗体的可变轻链和/或可变重链。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体或所述结合抗原的抗体片段包含在表1或表2中列出的抗体的可变轻链和可变重链。
在一个优选的实施方案中，所述C4.4a抗体和所述结合抗原的抗体片段选自：
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：75-77代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：78-80代表的可变轻链的CDR序列(B01-10)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：5、9和13代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：17、21和25代表的可变轻链的CDR序列(M31-B01)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：6、10和14代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：18、22和26代表的可变轻链的CDR序列(M20-D02-S-A)，
这样的抗体，其包含由代表的可变重链的CDR序列序列SEQ ID NO：7，11和15，且其包含由代表的可变轻链的CDR序列序列SEQ ID NO：19，23和27(M60-G03)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：8、12和16代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：20、24和28代表的可变轻链的CDR序列(36-H02)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：45-47代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：48-50代表的可变轻链的CDR序列(B01-3)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：55-57代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：58-60代表的可变轻链的CDR序列(B01-5)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：65-67代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：68-70代表的可变轻链的CDR序列(B01-7)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：85-87代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：88-90代表的可变轻链的CDR序列(B01-12)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：95-97代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：98-100代表的可变轻链的CDR序列(D02-4)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：105-107代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：108-110代表的可变轻链的CDR序列(D02-6)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：115-117代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：118-120代表的可变轻链的CDR序列(D02-7)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：125-127代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：128-130代表的可变轻链的CDR序列(D02-11)且
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：135-137代表的可变重链的CDR序列，且其包含由序列SEQ ID NO：138-140代表的可变轻链的CDR序列(D02-13)。
在一个优选的实施方案中，所述C4.4a抗体和所述结合抗原的抗体片段选自：
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：81代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：82代表的可变轻链的氨基酸序列(B01-7)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：33代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：29代表的可变轻链的氨基酸序列(M31-B01)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：34代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：30代表的可变轻链的氨基酸序列(M20-D02S-A)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：35代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：31代表的可变轻链的氨基酸序列(M60-G03)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：36代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：32代表的可变轻链的氨基酸序列(M36-H02)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：51代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：52代表的可变轻链的氨基酸序列(B01-3)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：61代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：62代表的可变轻链的氨基酸序列(B01-5)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：71代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：72代表的可变轻链的氨基酸序列(B01-7)
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：91代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：92代表的可变轻链的氨基酸序列(B01-12)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：101代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：102代表的可变轻链的氨基酸序列(D02-4)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：111代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：112代表的可变轻链的氨基酸序列(D02-6)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：121代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：122代表的可变轻链的氨基酸序列(D02-7)，
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：131代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：132代表的可变轻链的氨基酸序列(D02-11)，和
这样的抗体，其包含由序列SEQ ID NO：141代表的可变重链的氨基酸序列，且其包含由序列SEQ ID NO：142代表的可变轻链的氨基酸序列(D02-13)。
在另一个实施方案中，所述抗-C4.4a抗体包含在表2中列出的抗体的轻链和重链。
在一个优选的实施方案中，所述抗-C4.4a抗体包含在表2中列出的抗体的轻链和重链。
在一个特别优选的实施方案中，所述C4.4a抗体选自：
这样的抗体，其包含由SEQ ID NO：346代表的轻链的氨基酸序列，且其包含由SEQ ID NO：347代表的重链的氨基酸序列(M31-B01)，
这样的抗体，其包含由SEQ ID NO：352代表的轻链的氨基酸序列，且其包含由SEQ ID NO：353代表的重链的氨基酸序列(B01-3)，
这样的抗体，其包含由SEQ ID NO：364代表的轻链的氨基酸序列，且其包含由SEQ ID NO：365代表的重链的氨基酸序列(B01-10)，和
这样的抗体，其包含由SEQ ID NO：382代表的轻链的氨基酸序列，且其包含由SEQ ID NO：383代表的重链的氨基酸序列(D02-6)。
表1：C4.4a抗体的序列
Figure BDA0000432948840002431
Figure BDA0000432948840002441
表2：C4.4a抗体的轻链和重链的序列
Figure BDA0000432948840002442
Figure BDA0000432948840002451
抗-C4.4a抗体IgG：
本发明的另一个方面是，提供抗-C4.4a IgG1抗体，其包含在表2中列出的抗体的轻链和重链的氨基酸序列。
结合癌症靶分子HER2的抗体的一个例子是曲妥珠单抗(Genentech)。曲妥珠单抗是用于治疗尤其是乳腺癌的人源化抗体。结合癌症靶分子CD20的抗体的一个例子是利妥昔单抗(Genentech)。利妥昔单抗(CAS No.174722-31-7)是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗体。结合癌症靶分子CD52的抗体的一个例子是阿仑珠单抗(Genzyme)。阿仑珠单抗(CAS No.216503-57-0)是用于治疗慢性淋巴性白血病的人源化抗体。
间皮素抗体
根据本发明，一种特别优选的结合剂是抗-间皮素抗体，尤其是人或人源化的抗-间皮素抗体。所述抗体优选地具有至少10-7M的亲和力(作为Kd值，即，优选地具有小于10-7M的Kd值的那些)，优选地至少10-8M，特别优选地在10-9M至10-11M的范围内。所述Kd值可以通过表面等离子体共振光谱法来确定。
根据本发明的抗体-药物缀合物也具有在这些范围内的亲和力。所述亲和力优选地不受活性成分的缀合显著影响(所述亲和力经常减小小于1个数量级，例如，从最大值10-8M至10-7M)。
根据本发明使用的抗体还优选地特征在于高选择性。在下述情况下，存在高选择性：根据本发明的抗体对靶蛋白的亲和力比对另一种独立抗原(例如，人血清白蛋白)的亲和力高至少2倍、优选5倍或特别优选10倍(所述亲和力可以例如通过表面等离子体共振光谱法来确定)。
此外，根据本发明使用的抗体优选地是交叉反应性的。为了促进临床前试验，例如，毒理学研究或效力研究(例如在异种移植小鼠中)，并能够更好地解释它们，有利的是，根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白，而且结合这些研究所用的物种的物种靶蛋白。在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外，还对至少一种物种的靶蛋白具有交叉反应性。对于毒理学研究和效力研究而言，优选使用的物种是啮齿类动物、狗和非人灵长类动物科的物种。优选的啮齿动物物种包括小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物包括恒河猴、黑猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外，还对至少一种其它物种的靶蛋白具有交叉反应性，所述其它物种选自小鼠、大鼠和长尾猕猴(成束猴)。根据本发明使用的除了对人靶蛋白具有交叉反应性以外还至少对小鼠靶蛋白具有交叉反应性的抗体是特别优选的。优选的是这样的交叉反应性抗体：其对其它非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不超过50倍，具体地不超过10倍。
根据本发明使用的抗体另外优选地特征在于与间皮素的不变结合。不变结合的特征在于，例如，根据本发明使用的抗体结合间皮素的未被其它细胞外蛋白掩蔽的表位。这样的其它细胞外蛋白是，例如，卵巢癌抗原125蛋白(CA125)。使用的抗体优选地特征在于，它们结合未被CA125阻断的间皮素。
抗-间皮素抗体描述于例如WO 2009／068204中。根据本发明可以使用这些抗体。
本发明的另一个方面是，提供新的抗-间皮素抗体(MF-Ta)，其氨基酸序列包含由序列SEQ ID NO：398(HCDR1)、SEQ ID NO：399(HCDR2)和SEQ ID NO：400(HCDR3)代表的可变重链的CDR序列和由序列SEQ IDNO：401(LCDR1)、SEQ ID NO：402(LCDR2)和SEQ ID NO：403(LCDR3)代表的可变轻链的CDR序列。
在一个优选的实施方案中，抗-间皮素抗体MF-Ta或结合抗原的抗体片段的氨基酸序列包含由序列SEQ ID NO：404代表的可变重链序列和由序列SEQ ID NO：405代表的可变轻链序列。在一个优选的实施方案中，抗-间皮素抗体MF-Ta或结合抗原的抗体片段的氨基酸序列包含由核酸序列SEQ ID NO：406编码的可变重链序列和由核酸序列SEQ ID NO：407编码的可变轻链序列。
在一个特别优选的实施方案中，抗-间皮素抗体MF-Ta的氨基酸序列包含由序列SEQ ID NO：408代表的重链序列和由序列SEQ ID NO：409代表的轻链序列。
在一个特别优选的实施方案中，抗-间皮素抗体MF-Ta的氨基酸序列包含由核酸序列SEQ ID NO：410编码的重链序列和由核酸序列SEQ IDNO：411编码的轻链序列。
结合癌症靶分子间皮素的抗体的其它例子是技术人员熟知的，且描述于例如WO 2009／068204中，并且可以用于本发明的结合剂-药物缀合物。
在结合剂-药物缀合物的一个实施方案中，所述结合剂是抗-间皮素抗体或结合抗原的抗体片段，其中所述抗体结合间皮素和表现出不变的结合。
在结合剂-药物缀合物的一个实施方案中，抗-间皮素抗体或结合抗原的抗体片段包含在WO 2009／068204 A1(第61-63页表7)中描述的抗体的轻链的3个CDR区域的氨基酸序列和重链的3个CDR区域的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述间皮素抗体或结合抗原的抗体片段选自：
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MF-Ta的轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MF-J(WO 2009／068204 A1；第61页表7)的轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MOR06640(WO 2009／068204 A1；第61页表7)的轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MF-226(WO 2009／068204 A1；第61页表7)的轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列，和
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MOR06626(WO 2009／068204 A1；第61页表7)的轻链的3个CDR区域的序列和重链的3个CDR区域的序列。
在一个特别优选的实施方案中，所述间皮素抗体或结合抗原的抗体片段选自：
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MF-Ta的可变轻链序列和可变重链序列，
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MF-J(WO 2009／068204 A1；第61页表7)的可变轻链序列和可变重链序列，
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MOR06640(WO 2009／068204 A1；第61页表7)的可变轻链序列和可变重链序列，
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MF-226(WO 2009／068204 A1；第61页表7)的可变轻链序列和可变重链序列，
这样的抗-间皮素抗体或其结合抗原的抗体片段，它们包含抗体MOR06626(WO 2009／068204 A1；第61页表7)的可变轻链序列和可变重链序列。
其它抗体：
曲妥珠单抗(Genentech)是结合癌症靶分子HER2的抗体的一个例子。曲妥珠单抗是用于治疗尤其是乳腺癌的人源化抗体。利妥昔单抗(Genentech)是结合癌症靶分子CD20的抗体的一个例子。利妥昔单抗(CAS No.174722-31-7)是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗体。阿仑珠单抗(Genzyme)是结合癌症靶分子CD52的抗体的一个例子。阿仑珠单抗(CAS No.216503-57-0)是用于治疗慢性淋巴性白血病的人源化抗体。
除了曲妥珠单抗(INN No.7637，CAS No.180288-69-1)和帕妥珠单抗(CAS No.：380610-27-5)以外，结合HER2的抗体的其它例子包括诸如在WO 2009123894 A2、WO2008140603 A2或WO 2011044368 A2中公开的抗体。抗-HER2缀合物的一个例子是曲妥珠单抗emtansine(INN No.9295)。
结合癌症靶分子CD30且可以用于治疗癌症(例如霍奇金淋巴瘤)的抗体的例子包括brentuximab、伊妥木单抗和在WO 2008092117、WO2008036688或WO 2006089232中公开的抗体。抗-CD30缀合物的一个例子是Brentuximab vedotine(INN No.9144)。
结合癌症靶分子CD22且可以用于治疗癌症(例如淋巴瘤)的抗体的例子包括伊珠单抗或依帕珠单抗。抗-CD22缀合物的例子包括inotuzumabozagamycin(INN No.8574)或抗-CD22-MMAE和抗-CD22-MC-MMAE(CAS No.：139504-50-0和/或474645-27-7)。
结合癌症靶分子CD33且可以用于治疗癌症(例如白血病)的抗体的例子包括吉妥珠单抗或林妥珠单抗(INN No.7580)。抗-CD33缀合物的一个例子是gemtuzumab ozagamycin。
结合癌症靶分子NMB且可以用于治疗癌症(例如黑素瘤或乳腺癌)的抗体的一个例子是glembatumumab(INN No.9199)。抗-NMB缀合物的一个例子是Glembatumumab vedotin(CAS No.：474645-27-7)。
结合癌症靶分子CD56且可以用于治疗癌症(例如多发性骨髓瘤、小细胞肺癌、MCC或卵巢癌)的抗体的一个例子是lorvotuzumab。抗-CD56缀合物的一个例子是lorvotuzumab mertansine(CAS No.：139504-50-0)。
结合癌症靶分子CD70且可以用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤或肾细胞癌)的抗体的例子公开于WO 2007038637 A2或WO 2008070593A2。抗-CD70缀合物的一个例子是SGN-75(CD70MMAF)
结合癌症靶分子CD74且可以用于治疗癌症(例如多发性骨髓瘤)的抗体的一个例子是米拉珠单抗。抗-CD74缀合物的一个例子是米拉珠单抗多柔比星(CAS No.：23214-92-8)。
结合癌症靶分子CD19且可以用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤)的抗体的一个例子公开于WO 2008031056 A2。抗-CD19缀合物(SAR3419)的其它抗体和例子公开于WO 2008047242 A2。
结合癌症靶分子粘蛋白-1且可以用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤)的抗体的例子包括clivatuzumab或在WO 2003106495 A2、WO2008028686 A2中公开的抗体。抗-粘蛋白缀合物的例子公开于WO2005009369 A2。
结合癌症靶分子CD138及其缀合物且可以用于治疗癌症(例如多发性骨髓瘤)的抗体的例子公开于WO 2009080829 A1、WO 2009080830 A1。
结合癌症靶分子整联蛋白αV且可以用于治疗癌症(例如黑素瘤、肉瘤或癌)的抗体的例子包括英妥木单抗(CAS No.：725735-28-4)、阿昔单抗(CAS No.：143653-53-6)、埃达珠单抗(CAS No.：892553-42-3)或在US 7,465,449 B2、EP 719859 A1、WO 2002012501 A1或WO 2006062779A2中公开的抗体。抗-整联蛋白αV缀合物的例子包括英妥木单抗DM4和在WO 2007024536 A2中公开的其它ADC。
结合癌症靶分子TDGF1且可以用于治疗癌症的抗体的例子包括在WO 2002077033 A1、US 7,318,924、WO 2003083041 A2和WO 2002088170A2中公开的抗体。抗-TDGF1缀合物的例子公开于WO2002088170-A2。
结合癌症靶分子PSMA且可以用于治疗癌症(例如前列腺癌)的抗体的例子是在WO 199735615 A1、WO 199947554 A1和WO 2001009192 A1中公开的抗体。抗-PSMA缀合物的例子公开于WO 2009026274 A1。
结合癌症靶分子EPHA2、可以用于生产缀合物且可以用于治疗癌症的抗体的例子公开于WO 2004091375 A2。
结合癌症靶分子SLC44A4、可以用于生产缀合物且可以用于治疗癌症(例如胰腺癌或前列腺癌)的抗体的例子公开于WO 2009033094A2和US20090175796 A1。
结合癌症靶分子HLA-DOB的抗体的一个例子是抗体Lym-1(CASNo.：301344-99-0)，其可以用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤。抗-HLA-DOB缀合物的例子公开于例如WO 2005081711 A2。
结合癌症靶分子VTCN1、可以用于生产缀合物且可以用于治疗癌症(例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌或乳腺癌)的抗体的例子公开于WO2006074418 A2。
可以用于结合癌症靶分子PDL1的抗体的一个例子是得自专利WO2007005874 A2的抗体3G10。所述抗体3G10可以例如以人IgG1形式使用，并用作在示例性实施方案中使用的抗-PDL1，其中所述抗体包含下述序列；
轻链：
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重链：
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结合癌症靶分子ICOSLG的抗体的一个例子是得自WO 2007011941A2的抗体16H(SEQ ID NO：70和45)，抗-ICOSLG抗体16H可以以人IgG1形式使用，并用作在示例性实施方案中使用的抗-ICOSLG，其中所述抗-ICOSLG包含下述序列；
轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDSYPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链.
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结合靶分子FGFR3的抗体的一个例子是得自WO 2010002862 A2的抗体15D8(重链具有SEQ ID NO：74，轻链具有SEQ ID NO：76)。抗-FGFR3抗体15D8可以例如以人IgG1形式使用，并用作在该示例性实施方案中使用的抗-FGFR3，该抗体包含下述序列：
轻链：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMYWFQQKPGKAPKPLIYLTSYLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链：
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结合靶癌症分子5，6-二羟基吲哚-2-甲酸氧化酶(TYRP1)的抗体的一个例子是得自专利WO 2009114585A1的抗体20D7S(SEQ ID NO：30和32)。在该示例性实施方案中，抗-TYRP1抗体20D7S可以例如以人IgG1形式使用，且当用作抗-TYRP1时，所述抗体包含下述序列：
轻链
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWLMYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链：
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结合癌症靶分子磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的抗体的一个例子是从专利US07776329B2已知的抗体，且其包含氨基酸序列SEQ ID NO：84和92(人小鼠嵌合体)。上述的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体可以例如以人IgG1形式使用，并用作在该示例性实施方案中使用的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，该抗体具有下述序列：
轻链：
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链：
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本发明的化合物具有有价值的药理学性质，且可以用于预防和治疗人类和动物的疾病。
本发明的式(Ia)的结合剂-药物缀合物(ADC)表现出对肿瘤细胞的较高的且特异性的细胞毒性活性，这可以基于在实验部分(C-1至C-7e)中进行的测定来证实。本发明的式(Ia)的结合剂-药物缀合物(ADC)的这种较高的且特异性的细胞毒性活性通过用接头对新的N，N-二烷基耳他汀衍生物和结合剂的适当组合来实现，所述接头不仅表现出酶促地、水解地或还原地可切割的预定断裂点(用于释放毒性基团)，而且没有任何这样的预定断裂点。更具体地，通过使用稳定接头，非常特异性地限制对肿瘤细胞的活性，所述接头不具有任何酶促地、水解地或还原地可切割的预定断裂点(用于释放毒性基团)，并且其在ADC被摄入肿瘤细胞中以后和在抗体的完全细胞内酶促降解以后仍然保持完全或部分完整性。ADC和稳定接头之间的相容性预先假定，尤其是，可以以足够的效力形成在细胞内形成的代谢物，其能够到达它们的靶标，且能够在那里以足够的效能发挥它们对靶标的抗增殖活性，无需预先用转运蛋白等蛋白从肿瘤细胞取出。在本发明的式(Ia)的化合物被摄入以后，在细胞内形成的代谢物表现出降低的作为转运蛋白等蛋白的底物的潜力，由此通过毒性基团自身抑制它们在体循环中的再分布，并从而抑制潜在不良作用的触发。另外，新的N-烷基结合会保留在单甲基耳他汀肽的氨基端处的基本特征。具体地，利用本发明的式(Ia)的结合剂-药物缀合物(ADC)，抗体的总电荷保持恒定，不论毒性基团-接头电荷的数目如何。
ADC与稳定接头化学试剂和与各个靶标之间的相容性，连同在相对较低的程度上代表转运蛋白等蛋白的底物的代谢物，会提供扩大的治疗窗。
因为性质的这种特性，因此本发明化合物通常在一定程度上适合于治疗人和哺乳动物的过度增生性疾病。这些化合物在一方面能够阻断、抑制、减少或降低细胞增殖和细胞分裂，在另一方面，其可增强细胞凋亡。
可使用本发明化合物治疗的过度增生性疾病具体包括癌症和肿瘤疾病。在本发明范围内，具体而言，所述疾病应理解为包括、但不限于以下疾病：乳腺癌和乳腺肿瘤(导管和小叶形式，以及原位的)、呼吸道肿瘤(小细胞癌和非小细胞癌，支气管癌)、脑肿瘤(例如，脑干的脑肿瘤和下丘脑的脑肿瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层肿瘤和松果体肿瘤)、消化道(食道、胃、胆囊、小肠、大肠、直肠)的肿瘤、肝肿瘤(包括肝细胞癌、胆管细胞癌和混合的肝细胞和胆管细胞癌)、头颈区域(喉、下咽、鼻咽、口咽、唇和口腔)的肿瘤、皮肤肿瘤(鳞状上皮癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌和非黑色素瘤型皮肤癌)、软组织肿瘤(包括软组织肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤)、眼睛的肿瘤(包括眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、内分泌腺和外分泌腺(例如甲状腺和甲状旁腺、胰腺和食道腺)的肿瘤、泌尿道的肿瘤(膀胱、阴茎、肾、肾盂和输尿管的肿瘤)以及生殖器官的肿瘤(女性的子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌，男性的前列腺癌和睾丸癌)。这些还包括呈固体形式的和作为循环血细胞的增殖性血液疾病，例如淋巴瘤、白血病和骨髓增生性疾病，例如，急性髓性白血病、急性淋巴母细胞、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病和多毛细胞白血病以及AIDS相关的淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和中枢神经系统的淋巴瘤。
抗-CA9结合剂-药物缀合物的优选过度增生性疾病
可以优选地使用本发明的化合物进行治疗的过度增生性疾病包括过表达CA9的肿瘤、乳腺癌和乳腺肿瘤(例如导管和小叶形式，以及原位的)；呼吸道肿瘤(例如小细胞癌和非小细胞癌、支气管癌)，其中优选非小细胞肺癌；脑肿瘤(例如脑干的脑肿瘤和下丘脑的脑肿瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤和/或神经外胚层肿瘤和松果体肿瘤)；消化器官(食道、胃、胆囊、小肠、大肠、直肠)的肿瘤，其中特别优选的是胃肿瘤和肠肿瘤；肝肿瘤(包括肝细胞癌、胆管上皮癌和混合的肝细胞和胆管上皮癌)；头颈区域(例如喉、下咽、鼻咽、口咽、唇、口腔、舌和食道)的肿瘤；泌尿道的肿瘤(膀胱、阴茎、肾、肾盂和输尿管的肿瘤)，其中特别优选肾和膀胱的肿瘤；和/或生殖器官的肿瘤(女性的子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌和/或男性的前列腺癌和睾丸癌)，其中特别优选子宫颈癌和子宫癌。
抗-EGFR结合剂-药物缀合物的优选过度增生性疾病
可以优选地使用本发明的化合物进行治疗的过度增生性疾病包括过表达EGFR的肿瘤、呼吸道肿瘤(例如小细胞癌和非小细胞癌、支气管癌)，其中特别优选非小细胞肺癌；消化道(例如食道、胃、胆囊、小肠、大肠、直肠)的肿瘤，其中特别优选肠肿瘤；内分泌腺和外分泌腺(例如甲状腺和甲状旁腺、胰腺和唾液腺)的肿瘤，其中特别优选胰腺肿瘤；头颈区域(例如喉、下咽、鼻咽、口咽、唇、口腔、舌和食道)的肿瘤；和/或神经胶质瘤。
抗-间皮素结合剂-药物缀合物的优选过度增生性疾病
可以优选地使用本发明的化合物进行治疗的过度增生性疾病包括过表达间皮素的肿瘤、生殖器官的肿瘤(女性的子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌和/或男性的前列腺癌和睾丸癌)，其中优选卵巢癌；内分泌腺和外分泌腺(例如甲状腺和甲状旁腺、胰腺和唾液腺)的肿瘤，其中优选胰腺肿瘤；呼吸道肿瘤(例如小细胞癌和非小细胞癌、支气管癌)，其中优选非小细胞肺癌；和/或间皮瘤。
抗-C4.4a结合剂-药物缀合物的优选过度增生性疾病
可以优选地使用本发明的化合物进行治疗的过度增生性疾病包括过表达C4.4a的肿瘤、鳞状上皮细胞癌(例如子宫颈、外阴、阴道、肛管、子宫内膜、输卵管、阴茎、阴囊、食道、乳房、膀胱、胆管、子宫内膜、子宫和卵巢的鳞状上皮细胞癌)；乳腺癌和乳腺肿瘤(例如导管和小叶形式，以及原位的)；呼吸道肿瘤(例如小细胞癌和非小细胞癌、支气管癌)，其中优选非小细胞肺癌、以及肺鳞状上皮细胞癌和肺腺癌；头颈区域的肿瘤(例如喉、下咽、鼻咽、口咽、唇、口腔、舌和食道的肿瘤，头颈区域的鳞状上皮细胞癌)；泌尿道的肿瘤(膀胱、阴茎、肾、肾盂和输尿管的肿瘤，膀胱的鳞状上皮细胞癌)，特别优选的肾和膀胱的肿瘤；皮肤肿瘤(鳞状上皮细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌和非黑色素瘤型皮肤癌)，特别优选黑素瘤；内分泌腺和外分泌腺(例如甲状腺和甲状旁腺、胰腺和唾液腺)的肿瘤，其中优选胰腺肿瘤；消化器官的肿瘤(例如食道、胃、胆囊、小肠、大肠、直肠)，其中特别优选结肠直肠癌；和/或生殖器官的肿瘤(女性的子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌和/或男性的前列腺癌和睾丸癌)，其中特别优选子宫癌。
这些广泛地描述的人疾病也可以与可比较的病原学一起发生在其它哺乳动物中，且可以用本发明的化合物进行治疗。
在本发明范围内，术语“治疗”或“处理”以其常规含义使用，表示照顾、治疗和护理患者，目的在于对抗、减轻、减弱、缓解疾病或健康异常，并提高由该疾病损害的生活质量(例如，在癌症中)。
因此，本发明的另一个主题是，本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病、尤其是上述疾病的用途。
本发明的另一个主题是，本发明的化合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防疾病、尤其是上述疾病。
本发明的另一个主题是，本发明的化合物在用于治疗和/或预防疾病、尤其是上述疾病的方法中的用途。
本发明的另一个主题是，一种用于治疗和/或预防疾病、尤其是上述疾病的方法，其中使用有效量的至少一种本发明的化合物。
本发明的药物缀合物被优选地用于治疗患者的癌症，其中要治疗的患者的癌细胞表达靶标(优选EGFR、CA9、间皮素或C4.4a)，优选地具有比在非肿瘤组织中更大的该靶标表达。
一种鉴别对治疗癌症所用的抗-靶标结合剂-药物缀合物有利地做出应答的患者的方法包括：确定患者的癌细胞中的靶标表达。在一个实施方案中，所述靶标表达通过靶基因表达分析来确定。本领域技术人员熟知基因表达分析的方法，诸如RNA检测、定量或定性聚合酶链式反应或荧光原位杂交(FISH)。在另一个优选的实施方案中，借助于使用抗-靶标抗体的免疫组织化学，确定靶标表达。优选地在甲醛固定的组织上进行免疫组织化学。用于免疫组织化学中的抗体是也在缀合物中使用的相同抗体。用于免疫组织化学中的抗体是优选地特异性地识别靶蛋白／靶标的第二抗体。
本发明的化合物可单独使用，或者如果需要的话，与一种或多种其它药理学活性物质联用，只要该联用不会导致不利的和不可接受的作用即可。因此，本发明的另一个主题涉及药物，该药物含有至少一种本发明化合物以及一种或多种其它活性成分，尤其是用于治疗和/或预防上述疾病。
例如，本发明化合物可与已知的用于治疗癌症的抗过度增生性、抑制细胞生长的或细胞毒性的物质联用。作为示例，可提及的合适的联用活性成分和药物包括：
阿地白介素、阿仑膦酸、干扰素、阿利维A酸、别嘌醇、别嘌醇钠、帕洛诺司琼(aloxi)、六甲蜜胺、氨鲁米特、氨磷汀、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、甲磺酸多拉司琼、阿法达贝泊汀(aranesp)、阿格拉宾、三氧化二砷、阿诺新、5-氮胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗(BCG)或tice种卡介苗(tice-BCG)、苯丁抑制素、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、贝沙罗汀、硫酸博来霉素、溴尿苷、硼替佐米、白消安、降钙素、阿仑单抗(campath)、卡培他滨、卡铂、康士得、赛孚松(cefesone)、西莫白介素、柔红霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯屈膦酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、枸橼酸柔红霉素脂质体(DaunoXome)、地卡特隆、磷酸地塞米松(Decadron phosphate)、戊酸雌二醇、地尼白介素2、甲基泼尼松龙、地洛瑞林、右丙亚胺、己烯雌酚、大扶康、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、屈大麻酚、DW-166HC、醋酸亮丙瑞林、拉布立酶(elitek)、盐酸表柔比星、阿瑞吡坦(emend)、表柔比星、红细胞生成素-α、促红细胞生成素(epogen)、依他铂、左旋咪唑、雌二醇片(estrace)、雌二醇、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、阿密磷定、依替膦酸、凡毕复、依托泊苷、法倔唑、法斯通(farstone)、非格司亭、非那雄胺、fligrastim、氟尿苷、氟康唑、氟达拉滨、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟甲睾酮、氟他胺、福美坦、fosteabine、福莫司汀、氟维司群、Gammagard、吉西他滨、吉妥珠单抗、格列卫、卡氮芥糯米纸胶囊剂(gliadel)、戈舍瑞林、盐酸格拉司琼、组氨瑞林和美新、氢化可的松、赤式-羟基壬基腺嘌呤、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素-α、干扰素-α-2、干扰素-α-2α、干扰素-α-2β、干扰素-α-n1、干扰素-α-n3、干扰素-β、干扰素-γ-1α、白介素-2、甘乐能、易瑞沙、伊立替康、凯特瑞、硫酸香菇多糖、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、左旋叶酸钙盐、左甲状腺素钠、左甲状腺素钠片、洛莫司汀、氯尼达明、屈大麻酚、氮芥、甲钴胺、醋酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、美法仑、酯化雌激素(Menest)、6-巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、氨基乙酰丙酸甲酯(Metvix)、米替福新、米诺环素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、曲洛司坦、多柔比星脂质体(Myocet)、奈达铂、聚乙二醇非格司亭(Neulasta)、奥普瑞白介素(Neumega)、优保津、尼鲁米特、诺瓦得士、NSC-631570、OCT-43、奥曲肽、盐酸昂丹司琼、泼尼松龙(Orapred)、奥沙利铂、紫杉醇、泼尼松磷酸钠制剂(Pediapred)、培门冬酶、派罗欣、喷司他丁、溶血性链球菌制剂、盐酸毛果芸香碱、吡柔比星、普卡霉素、卟吩姆钠、泼尼莫司汀、泼尼松龙、泼尼松、倍美力、丙卡巴肼、阿法依泊汀(Procrit)、雷替曲塞、利比、依替膦酸铼-186、利妥昔单抗、罗荛愫、罗莫肽、盐酸毛果芸香碱片(Salagen)、善宁、沙格司亭、司莫司汀、西佐喃、索布佐生、甲强龙、链佐星、氯化锶-89、左甲状腺素钠(Synthroid)、他莫昔芬、坦洛新、他索那敏、tastolactone、泰索帝、替西白介素、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、甲睾酮胶囊剂(Testred)、硫鸟嘌呤、塞替派、促甲状腺素、替鲁膦酸、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维A酸、甲氨蝶呤(Trexall)、三甲基三聚氰胺、三甲曲沙、醋酸曲普瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、优福定(uft)、尿苷、戊柔比星、维司力农、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、维鲁利秦、右雷佐生、净司他丁斯酯、枢复宁；ABI-007、acolbifen、actimmune、affinitak、氨基蝶呤、阿佐昔芬、阿索立尼、阿他美坦、阿曲生坦、阿伐他汀、BAY43-9006(索拉非尼)、CCI-779、CDC-501、西乐葆、西妥昔单抗、克立那托、醋酸环丙孕酮、地西他滨、DN-101、多柔比星-MTC、dSLIM、度他雄胺、艾特咔林、依氟鸟氨酸、依沙替康、芬维A胺、二盐酸组胺、组氨瑞林水凝胶植入物、钬-166DOTMP、伊班膦酸、干扰素-γ、干扰素-PEG、伊沙匹隆、钥孔戚血蓝素、L-651582、兰瑞肽、拉索昔芬、libra、氯那法尼、米泼昔芬、米诺膦酸盐、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、新伐司他、诺拉曲塞、奥利美生、onko-TCS、osidem、聚谷氨酸紫杉醇、帕米膦酸二钠、PN-401、QS-21、夸西泮、R-1549、雷洛昔芬、豹蛙酶(ranpirnas)、13-顺式-维甲酸(13-cis-retic acid)、沙铂、西奥骨化醇、T-138067、特罗凯、二十二碳六烯酸紫杉醇、胸腺素-α-1、噻唑羧胺核苷、替匹法尼、替拉扎明、TLK-286、托瑞米芬、transMID-107R、伐司朴达、伐普肽、伐拉尼布、维替泊芬、长春氟宁、Z-100、唑来膦酸和这些的组合。
在一个优选的实施方案中，本发明化合物可与抗过度增生剂联用，作为示例(而非限制性)，所述抗过度增生剂包括以下的：
氨鲁米特、L-门冬酰胺酶、硫唑嘌呤、5-氮胞苷、博来霉素、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、门冬酰胺酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、己烯雌酚、2′，2′-二氟脱氧胞苷、多西他赛、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、埃博霉素及其衍生物、赤式-羟基壬基腺嘌呤、炔雌醇、依托泊苷、磷酸氟达拉滨、5-氟脱氧尿苷、5-氟脱氧尿苷单磷酸、5-氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、六甲蜜胺、羟基脲、己酸羟孕酮、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素、伊立替康、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、美法仑、6-巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、紫杉醇、喷司他丁、正膦酰基乙酰基-L-天冬氨酸酯(PALA)、普卡霉素、泼尼松龙、泼尼松、丙卡巴肼、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、丙酸睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、托泊替康、三甲基三聚氰胺、尿苷、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
在一个非常有前景的方面，本发明化合物也可以与生物治疗剂例如抗体(例如阿伐他汀、Rituxan、爱必妥、赫赛汀)联用。本发明化合物还在与针对血管生成的治疗(例如，与阿伐他汀、阿昔替尼、recentin、瑞戈非尼、索拉非尼或舒尼替尼)联用中实现积极效果。由于其有利的副作用的特性，与蛋白酶体抑制剂和mTOR抑制剂的联用以及与抗激素和甾体代谢酶抑制剂的联用也是特别合适的。
通常，通过本发明化合物与具有抑制细胞生长的或细胞毒性作用的其它试剂联用可追求以下目的：
·与使用单一活性成分的治疗相比，在延缓肿瘤生长、减少其尺寸或甚至使其完全消除方面，具有提高效力；
·与单一治疗相比，以较低的剂量使用化疗剂的可能性；
·与单独给药相比，具有少量不良作用且可耐受的治疗的可能性；
·治疗更广范围的肿瘤的可能性；
·实现对治疗较高的应答率；
·与目前标准治疗相比，患者的存活时间更长。
另外，本发明化合物还可用于与放射疗法和/或外科手术联用。
本发明的另一个主题是药物，该药物含有至少一种本发明化合物，并且通常与一种或多种惰性、无毒、药学上合适的赋形剂一起，以及它们用于上述目的的用途。
本发明化合物可全身性地和/或局部地起作用。为此目的，以合适的方式(例如，口服地或胃肠外地)施用它们。本发明化合物可全身性地和／或局部地起作用。为此目的，以合适的方式(例如，胃肠外地，可能通过吸入，或作为植入物和/或支架)施用它们。
就这些施用方法而言，本发明化合物可以以合适的剂型施用。
为了不经过吸收步骤(例如静脉内、动脉内、贲门内、椎管内或腰椎内)或同时包括吸收(例如肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)，可以实施胃肠外施用。适合于胃肠外施用的给药形式包括以溶液剂、混悬剂、乳剂或冻干粉剂的形式的输注和注射制剂。
胃肠外施用、尤其是静脉内施用是优选的。
静脉内溶液：
本发明的化合物可转化为指定的剂型。这可以通过已知的方式，通过与惰性、无毒、药学上合适的赋形剂(例如，缓冲物质、稳定剂、增溶剂、防腐剂)“混合”和/或“溶解”来实施。这些赋形剂可以包括，例如：氨基酸(甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和其它氨基酸)、糖和有关的物质(葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、山梨醇)、甘油、钠、钾、铵和钙盐(例如，NaCl、KCl或Na2HPO4和许多其它盐)、乙酸盐／乙酸缓冲液系统、磷酸盐缓冲液系统、柠檬酸和柠檬酸盐缓冲液系统、氨丁三醇(TRIS和TRIS盐)、聚山梨酯(例如，聚山梨酯80和聚山梨酯20)、泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188和泊洛沙姆171)、聚乙二醇(PEG衍生物，例如，3350)、TritonX-100、EDTA盐、谷胱甘肽、白蛋白(例如，人)、脲、苯甲醇、苯酚、氯甲酚、间甲酚、苯扎氯铵和许多其它赋形剂。
通常而言，已证实在胃肠外施用的情况下为了实现有效的结果，大约0.001-1mg／kg、优选地大约0.01-0.5mg／kg体重的施用剂量是有益的。
但是，根据以下情况可能需要发生与所述量的偏差，即取决于体重、施用方法、对活性成分的个体应答、制剂的类型、和进行给药的时间点或间隔。因此，在许多情况下，可能低于上述最小量即可，而在其它情况下，必须超过前述上限。在给药量较大的情况下，可建议将所述较大量分配成在一天内的几个单独剂量。
呈现下述实施例来解释本发明，但是本发明不限于这些实施例。
除非另有说明，在以下试验和实施例中指出的百分比量是重量百分数(重量％)，份数表示重量份。液体-液体溶液的溶剂比、稀释比和浓度数据各自基于体积。
A.实施例
缩写和首字母简略词：
A431NS    人肿瘤细胞系
A549      人肿瘤细胞系
ABCB1     ATP-结合盒亚家族B成员1(同义词P-gp和MDR1)
abs.      绝对
ADC       抗体-药物-缀合物
Ac        乙酰基
aq.       水性的，水溶液
ATP       腺苷三磷酸
BCRP      乳腺癌抗性蛋白，一种流出转运蛋白
Boc       叔丁氧基羰基
br.       宽(在NMR中)
Ex.       实施例
ca.       约，大约
CAIX      碳酸酐酶IX
CI        化学电离(MS中)
d         双峰(在NMR中)
d         天
TLC       薄层色谱法
DCI       直接化学电离(MS中)
dd        双峰的双峰(在NMR中)
DMAP      4-N，N-二甲基氨基吡啶
DME       1，2-二甲氧基乙烷
DMEM      Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(用于细胞培养的标准化营养培养基)
DMF               N，N-二甲基甲酰胺
DMSO              二甲亚砜
DPBS，D-PBS，PBS  Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水溶液
                  PBS=DPBS=D-PBS，pH7.4，得自Sigma，NO.D8537
                  组成：
                  0.2g KCl
                  0.2g KH2PO4(无水)
                  8.0gNaCl
                  1.15g Na2HPO4(无水)
                  用H2O补至1l
dt                三重峰的双峰(在NMR中)
DTT               DL-二硫苏糖醇
EDC               N′-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐
EGFR              表皮生长因子受体
EI                电子碰撞电离(MS中)
ELISA             酶联免疫吸附测定
eq.               当量
ESI               电喷射电离(MS中)
ESI-MicroTofq     ESO-MicroTofq(质谱仪的名称，其中Tof=飞行时间，q=四极子)
FCS               胎牛血清
Fmoc              (9H-芴-9-基甲氧基)羰基
sat.              饱和的
GTP               鸟苷5′-三磷酸
h                 小时
HATU              O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HCT-116           人肿瘤细胞系
HEPES             4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸
HOAc              乙酸
HOBt              1-羟基-1H-苯并三唑水合物
HOSu              N-羟基琥珀酰亚胺
HPLC              高压、高效液相色谱法
HT29              人肿瘤细胞系
IC50              半数最大抑制浓度
i.m.              肌肉内的，施用进肌肉内
i.v.              静脉内的，施用进静脉内
conc.             浓缩的
LC-MS             液相色谱法-质谱法联用
LLC-PK1细胞       Lewis肺癌猪肾细胞系
L-MDR             人MDR1转染的LLC-PK1细胞
m                 多重峰(在NMR中)
MDR1              多药抗性蛋白1
min               分钟
MS                质谱法
MTT               3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑溴化物
NCI-H292         人肿瘤细胞系
NCI-H520         人肿瘤细胞系
NMM               N-甲基吗啉
NMP               N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR               核磁共振光谱测定法
NMRI              小鼠品系，源自Naval Medical Research Institute(NMRI)
裸鼠              实验动物
NSCLC    非小细胞肺癌(非小细胞性的支气管癌)
PBS      磷酸盐缓冲盐水溶液
Pd／C    活性炭载钯
P-gp     P-糖蛋白，一种转运蛋白蛋白质
PNGaseF  用于糖消除的酶
quant.   定量(对于收率)
quart    四重峰(在NMR中)
quint    五重峰(在NMR中)
Rf      保留指数(对于TLC)
RT       室温
Rt        保留时间(对于HPLC)
s        单峰(在NMR中)
s.c.     皮下的，施用于皮肤下
SCC-4    人肿瘤细胞系
SCC-9    人肿瘤细胞系
SCID小鼠 具有重症联合免疫缺陷的实验小鼠
t        三重峰(在NMR中)
tert     叔
TFA      三氟乙酸
THF      四氢呋喃
UV       紫外光谱测定法
v／v     (溶液的)体积／体积比
z        苄氧基羰基
HPLC和LC-MS方法：
方法1(LC-MS)：
仪器：Waters Acquity SQD UPLC System；柱：Waters Acquity UPLCHSS T31.8μ50mm x1mm；洗脱液A：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min90％A→1.2min5％A→2.0min5％A；流速：0.40ml／min；恒温箱：50℃；紫外检测：210-400nm。
方法2(LC-MS)：
仪器：Micromass QuattroPremier with Waters UPLC Acquity；柱：Thermo Hypersil GOLD1.9μ50mm x1mm；洗脱液A：1l水+0.5ml50％浓度的甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min90％A→0.1min90％A→1.5min10％A→2.2min10％A；流速：0.33ml／min；恒温箱：50℃；紫外检测：210nm。
方法3(LC-MS)：
仪器：Micromass Quattro Micro MS with HPLC Agilent Series1100；柱：Thermo Hypersil GOLD3μ20mm x4mm；洗脱液A：1l水+0.5ml50％浓度的甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min100％A→3.0min10％A→4.0min10％A→4.01min100％A(流速2.5ml／min)→5.00min100％A；恒温箱：50℃；流速：2ml／min；紫外检测：210nm。
方法4(LC-MS)：
MS仪器：Micromass ZQ；HPLC仪器：HP1100Series；UV DAD；柱：Phenomenex Gemini3μ30mm x3.00mm；洗脱液A：1l水+0.5ml50％浓度的甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min90％A→2.5min30％A→3.0min5％A→4.5min5％A；流速：0.0min1ml／min→2.5min／3.0min／4.5min2ml／min；恒温箱：50℃；紫外检测：210nm。
方法5(HPLC)：
仪器：HP1090Series II；柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e，50mm x4.6mm；前置柱：Merck Chromolith Guard Cartridge KitRP-18e，5mm x4.6mm；注射体积：5μl；洗脱液A：70％的HClO4水溶液(4ml/升)，洗脱液B：乙腈；梯度：0.00min20％B→0.50min20％B→3.00min90％B→3.50min90％B→3.51min20％B→4.00min20％B；流速：5ml／min；柱温度：40℃。
方法6(HPLC)：
仪器：带有DAD996的Waters2695；柱：Merek ChromolithSpeedROD RP-18e，50mm x4.6mm；Ord.No.：1.51450.0001，前置柱：Merek Chromolith Guard Cartridge Kit RP-18e，5mm x4.6mm；Ord.No.：1.51470.0001，洗脱液A：70％的HClO4水溶液(4ml／升)，洗脱液B：乙腈；梯度：0.00min5％B→0.50min5％B→3.00min95％B→4.00min95％B；流速：5ml／min。
方法7(LC-MS)：
MS仪器：Waters ZQ；HPLC仪器：Agilent1100Series；UV DAD；柱：Thermo Hypersil GOLD3μ20mm x4mm；洗脱液A：1l水+0.5ml50％浓度的甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min100％A→3.0min10％A→4.0min10％A→4.1min100％A(流速2.5ml／min)；恒温箱：55℃；流速：2ml/min；紫外检测：210nm。
方法8(LC-MS)：
MS仪器：Waters ZQ；HPLC仪器：Agilent1100Series；UV DAD；柱：Thermo Hypersil GOLD3μ20mm x4mm；洗脱液A：1l水+0.5ml50％浓度的甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min100％A→2.0min60％A→2.3min40％A→3.0min20％A→4.0min10％A→4.2min100％A(流速2.5ml/min)；恒温箱：55℃；流速：2ml/min；紫外检测：210nm。
方法9(LC-MS)：
仪器：Waters Acquity SQD UPLC System；柱：Waters Acquity UPLCHSS T31.8μ50mm x1mm；洗脱液A：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min95％A→6.0min5％A→7.5min5％A；恒温箱：50℃；流速：0.35ml/min；紫外检测：210-400nm。
方法10(HPLC)：
仪器：Agilent1200Series；柱：Agilent Eclipse XDB-C185μ4.6mm x150mm；前置柱：Phenomenex KrudKatcher Disposable Pre-Column；注射体积：5μl；洗脱液A：1l水+0.01％三氟乙酸；洗脱液B：1l乙腈+0.01％三氟乙酸；梯度：0.00min10％B→1.00min10％B→1.50min90％B→5.5min10％B；流速：2ml／min；柱温度：30℃。
对于以下未明确描述其制备的所有反应物或试剂，其均从通常可得的来源市售获得。对于以下同样未描述其制备的所有其它反应物或试剂，并且其不是市售可得的或其来源不是通常可得的，给出了描述其制备方法的公开文献。
方法11(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC System；柱：Waters AcquityUPLC HSS T31.8μ30x2mm；洗脱液A：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min90％A→1.2min5％A→2.0min5％A；恒温箱：50℃；流速：0.60ml／min；紫外检测：208-400nm。
方法12(HPLC)：
仪器：带有柱恒温箱和DAD的Agilent1200Series；柱：MerckChromolith SpeedROD Rp-18e，50mm x4.6mm；Ord.No.：1.51450.0001；前置柱：Merck Chromolith Guard Cartridge Kit Rp-18e，5mm x4.6mm；Ord.No.：1.51470.0001；洗脱液A：70％的HClO4水溶液(4ml/升)，洗脱液B：乙腈；梯度：0.00min5％B→0.50min5％B→3.00min95％B→4.00min95％B；流速：5ml／min；柱温度：30℃。
方法13(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)Quattro Micro；仪器HPLC：Agilent1100Series；柱：YMC-Triart C183μ50x3mm；洗脱液A：1l水+0.01mol碳酸铵，洗脱液B：1l乙腈；梯度：0.0min100％A→2.75min5％A→4.5min5％A；恒温箱：40℃；流速：1.25ml／min；紫外检测：210nm。
起始化合物和中间体：
起始化合物1
(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(Boc-多拉脯氨酸)
可以根据文献方法通过各种途径合成标题化合物；参见，例如，Pettit等人，Synthesis1996，719；Shioiri等人，Tetrahedron Lett.1991，32，931；Shioiri等人，Tetrahedron1993，49，1913；Koga等人，Tetrahedron Lett.1991，32，2395；Vidal等人，Tetrahedron2004，60，9715；Poncet等人，Tetrahedron1994，50，5345。将其合成为游离酸或与二环己胺的1：1盐。
起始化合物2a
(3R，4S，5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基氨基)庚酸叔丁酯盐酸盐
(多拉异亮氨酸-OtBu x HCl)
Figure BDA0000432948840002671
可以根据文献方法通过各种途径合成标题化合物；参见，例如，Pettit等人，J.Org.Chem.1994，59，1796；Koga等人，Tetrahedron Lett.1991，32，2395；Shioiri等人，Tetrahedron Lett.1991，32，931；Shioiri等人，Tetrahedron1993，49，1913。
起始化合物2b
(3R，4S，5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基氨基)庚酸叔丁酯
(多拉异亮氨酸-OtBu)
Figure BDA0000432948840002672
与起始化合物2a类似地合成所述化合物，但是在没有加入1N盐酸下进行氢化。
起始化合物3
Nα-(叔丁氧基羰基)-N-羟基-L-苯基丙氨酰胺
Figure BDA0000432948840002673
通过文献方法(A.Ritter等人，J.Org.Chem.1994，59，4602)，合成标题化合物。
收率：750mg(理论值的75％)
LC-MS(方法3)：Rt=1.67min；MS(ESIpos)：m／z=281(M+H)+。
起始化合物4
1，2-噁唑烷盐酸盐
标题化合物可以通过文献方法(参见，例如，H.King，J.Chem.Soc.1942，432)来合成；它也代表商购可得的。
起始化合物5
1，2-噁嗪烷盐酸盐
Figure BDA0000432948840002682
标题化合物可以通过文献方法(参见，例如，H.King，J.Chem.Soc.1942，432)来合成。
起始化合物6
2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯
Figure BDA0000432948840002683
通过文献方法(参见，例如，C.Johnson等人，Tetrahedron Lett.1998，39，2059)，可以合成Boc保护形式的标题化合物；通过三氟乙酸处理和随后中和，以常规方式实现去保护。
收率：149mg(理论值的89％)
起始化合物7
(1S，2R)-1-(羟基氨甲酰基)-2-苯基环丙基氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000432948840002684
通过文献方法(A.Ritter等人，J.Org.Chem.1994，59，4602)，从商购可得的(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-苯基环丙烷甲酸开始，合成标题化合物(C.Cativiela等人，Chirality1999，11，583)。
收率：339mg(理论值的59％)
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m／z=293(M+H)+。
中间体1
(3R，4S，5S)-4-[{N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯
Figure BDA0000432948840002691
将10.65g(41.058mmol)(3R，4S，5S0-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基氨基)-庚酸叔丁酯(起始化合物2b)溶解于250ml二氯甲烷中，并将溶液冷却至-10℃。然后，在搅拌下，加入10.317g(41.058mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸、16.866g(61.586mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)和28.6mlN，N-二异丙基乙胺，随后将混合物在室温搅拌20h。然后用二氯甲烷稀释反应混合物，并与饱和氯化钠溶液一起摇动2次，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物，使用4：1石油醚／乙酸乙酯作为洗脱液。浓缩对应的级分，并在高真空下干燥残余物过夜。得到10.22g(理论值的51％)标题化合物，为微黄色油。
HPLC(方法5)：Rt=2.3min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.59min；MS(ESIpos)：m／z=493(M+H)+。
中间体2
(3R，4S，5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(L-缬氨酰基)氨基]庚酸叔丁酯
Figure BDA0000432948840002701
将500mg(1mmol)(3R，4S，5S)-4-[{N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基}(甲基)氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(中间体1)溶解在50ml甲醇中，并在加入100mg10％活性炭载钯以后，在标准氢压力下在室温氢化1h。然后滤出催化剂，并在减压下除去溶剂。得到370mg(定量)标题化合物，为基本上无色的油。
HPLC(方法5)：Rt=1.59min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m／z=359(M+H)+。
中间体3
N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-叔丁氧基-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840002702
将4.64g(13.13mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酸溶解在20ml DMF中，并接连地与4.28g(11.94mmol)(3R，4S，5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(L-缬氨酰基)氨基]庚酸叔丁酯(中间体2)、2.75g(14.33mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2.2g(14.33mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物混合。将混合物在室温搅拌过夜。然后将反应混合物倒入半饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯的混合物中。取出有机相，接连地用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物不经进一步纯化直接用于下一阶段。
收率：9.1g(定量，60％纯度)
HPLC(方法5)：Rt=2.7min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.99min；MS(ESIpos)：m／z=694(M+H)+。
中间体4
N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840002711
将9.1g粗产物N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-叔丁氧基-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体3)溶解于56.6ml二氯甲烷中，加入56.6ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌2h。随后，在真空中浓缩反应混合物，并通过快速色谱法纯化剩余的残余物，使用二氯甲烷、3：1二氯甲烷／乙酸乙酯和15：5：0.5二氯甲烷／乙酸乙酯／甲醇作为洗脱液。在纯化对应的级分和浓度以后，得到5.8g(理论值的86％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.3min；MS(ESIpos)：m／z=638(M+H)+。
中间体5
(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000432948840002712
将500mg(1.9mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-苯丙氨酸溶解在10mlDMF中，并接连地与466mg(3.8mmol)1，2-噁嗪烷盐酸盐(起始化合物5)、433mg(2.3mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、382mg(2.8mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和731mg(5.7mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌过夜。然后将反应混合物倒入半饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯的混合物中。取出有机相，接连地用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。得到620mg(理论值的98％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.62min；MS(ESIpos)：m／z=235(M-C4H8-CO2+H)+。
中间体6
(2S)-2-氨基-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-3-苯基丙烷-1-酮三氟乙酸盐
将620mg(1.85mmol)(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基氨基甲酸叔丁酯(中间体5)溶解于5ml二氯甲烷中，加入10ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物，将剩余的残余物从水／乙腈低压冻干。以此方式，得到779mg(理论值的91％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=0.45min；
LC-MS(方法3)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m／z=235(M+H)+。
中间体7
(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002731
将360mg(1.25mmol)(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(起始化合物1)溶解于10ml DMF中，并接连地与579.2mg(1.25mmol)(2S)-2-氨基-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-3-苯基丙烷-1-酮三氟乙酸盐(中间体6)、714.5mg(1.88mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和655μlN，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌16h。然后浓缩反应混合物，将残余物溶解于乙酸乙酯中，并通过首先与5％柠檬酸水溶液一起摇动、然后与5％碳酸氢钠水溶液一起摇动、随后与饱和氯化钠溶液一起摇动，进行萃取。浓缩有机相，并通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物，使用16：4二氯甲烷／甲醇作为洗脱液。合并对应的级分，并在真空中除去溶剂。在已经在高真空下干燥残余物以后，得到503.5mg(理论值的74％)Boc-保护的中间体(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m／z=504(M+H)+。
将503mg(1mmol)该中间体溶解于20ml二氯甲烷中，加入10ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物，并与二氯甲烷一起再蒸馏。用正戊烷使剩余的残余物从乙酸乙酯中沉淀，并倾析出溶剂。将如此得到的残余物溶解在水中，并通过与乙酸乙酯一起摇动进行萃取，随后将水相低压冻干。以此方式，得到462mg(理论值的89％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法12)：Rt=1.53min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.57min；MS(ESIpos)：m／z=404(M+H)+。
中间体8
N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840002741
将51mg(0.08mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)溶解在10ml DMF中，并加入0.5ml哌啶。在室温搅拌10min以后，在真空中浓缩反应混合物，并将残余物与二乙基醚一起搅拌。将不溶性的组分滤出，并用二乙基醚重复洗涤。，然后，将滤渣溶解于5ml二噁烷／水中，并用1N氢氧化钠溶液将溶液调节至pH11。在超声处理下，分成几份加入共349mg(1.6mmol)二碳酸二叔丁酯，在此过程中，使溶液的pH保持在11。反应已经结束后，蒸发出二噁烷，并用柠檬酸将水溶液调节至2-3的pH。每次用50ml乙酸乙酯，将混合物萃取2次。合并有机相，经硫酸镁干燥，并在减压下浓缩。将残余物溶解于二乙基醚中，并用戊烷沉淀标题化合物。通过倾析，除去溶剂。将残余物用戊烷消化几次，最后在高真空下干燥。如此得到40mg(理论值的97％)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.32min；MS(ESIpos)：m／z=516(M+H)+。
中间体9
(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
Figure BDA0000432948840002751
与中间体5、6和7的制备类似地，经3个阶段制备标题化合物：使商购可得的(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-苯基环丙烷甲酸与1，2-噁嗪烷盐酸盐(起始化合物5)偶联，随后用三氟乙酸去保护，并与起始化合物1偶联。通过制备型HPLC，纯化终产物。
HPLC(方法5)：Rt=2.12min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.25min；MS(ESIpos)：m／z=516(M+H)+。
中间体1o
N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840002752
将315mg(0.494mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)溶解在12ml DMF中，并与104mg(0.543mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和83mg(0.543mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物混合，并将混合物在室温搅拌90min。随后，加入112μl N，N-二异丙基乙胺和149mg(0.494mmol)(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酸三氟乙酸盐，后者已经预先借助于三氟乙酸消除Boc保护基而从起始化合物1制备。将混合物在室温搅拌2h，然后在高真空下浓缩。通过制备型HPLC，将剩余的残余物纯化2次。得到无色泡沫形式的140mg(理论值的35％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=2.40min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m／z=807(M+H)+。
中间体11
N-[(苄氧基)羰基]-N-甲基-L-苏氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840002761
首先，如下从237mg(0.887mmol)它的二环己胺盐中释放N-[(苄氧基)羰基]-N-甲基-L-苏氨酸：将其溶解在乙酸乙酯中，并与5％硫酸水溶液一起萃取摇动。有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物溶解于16mlDMF中，并接连地与365mg(1mmol)(3R，4S，5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-[甲基(L-缬氨酰基)氨基]庚酸叔丁酯(中间体2)、185mg(0.967mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和148mg(0.967mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物混合。将混合物在室温搅拌2h。然后将反应混合物倒入半饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯的混合物中。取出有机相，接连地用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物。如此得到283mg(理论值的53％)叔丁基酯中间体N-[(苄氧基)羰基]-N-甲基-L-苏氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-叔丁氧基-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
HPLC(方法5)：Rt=2.17min。
将283mg(0.466mmol)该中间体溶解于5ml二氯甲烷中，加入5ml无水三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌2h。随后，将反应混合物在高真空下浓缩，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。得到156mg(理论值的61％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.50min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m／z=552(M+H)+。
中间体12
N-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-苯基丙氨酸苄酯三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002771
在第一步中，如下从600mg(1.28mmol)对应的二环己基铵盐中释放起始化合物1：将所述盐溶解于100ml乙酸乙酯中，并首先与50ml0.5％硫酸一起，然后与饱和氯化钠溶液一起，进行萃取摇动。然后，有机相经硫酸镁干燥，过滤，浓缩，并立即与中间体7的制备类似地与L-苯基丙氨酸苄酯反应，然后去保护。
收率：650mg(94％，经2个阶段)
HPLC(方法6)：Rt=1.76min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.68min；MS(ESIpos)：m／z=425(M+H)+。
中间体13
(βS)-N-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-β-甲基-L-苯基丙氨酸苄酯三氟乙酸盐
首先，如下从351mg(0.75mmol)二环己胺盐(起始化合物1)中释放出(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸：将它溶解于乙酸乙酯中，并与5％硫酸氢钾水溶液一起进行萃取摇动。有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物溶解于10ml DMF中，并接连地与373mg(0.75mmol)(βS)-β-甲基-L-苯基丙氨酸苄酯三氟乙酸盐[通过EDC／DMAP介导的与苯甲醇的酯化，随后用三氟乙酸除去Boc保护基，从商购可得的(βS)-N-(叔丁氧基羰基)-β-甲基-L-苯丙氨酸制备]、428mg(1.125mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和392μl N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌20h。然后将反应混合物倒在半饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯的混合物上。取出有机相，接连地用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，随后浓缩。借助于制备型HPLC纯化残余物。得到230mg(理论值的57％)Boc-保护的中间体(βS)-N-{(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰基}-β-甲基-L-苯基丙氨酸苄酯。
HPLC(方法6)：Rt=2.3min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m／z=539(M+H)+。
将230mg(0.42mmol)该中间体溶解于5ml二氯甲烷中，加入5ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物。剩余的残余物为在真空中进一步干燥的反应混合物，然后从乙腈／水低压冻干。以此方式，得到230mg(定量)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=1.6min。
中间体14
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
将143mg(0.223mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)溶解于15ml DMF中，并接连地与141mg(0.22mmol)(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐(中间体7)、102mg(0.27mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和128μl(0.74mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌3h。然后将反应混合物倒入半饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯的混合物中。取出有机相，接连地用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。得到275mg(定量)Fmoc-保护的中间体N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
HPLC(方法5)：Rt=2.73min；
LC-MS(方法4)：Rt=3.19min；MS(ESIpos)：m／z=1023(M+H)+。
将46mg(0.045mmol)该中间体溶解在4ml DMF中。已经加入1ml哌啶以后，将反应混合物在室温搅拌1h。随后，在真空中浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物(洗脱液：乙腈+0.01％TFA／水+0.01％TFA)。得到22mg(理论值的54％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.68min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m／z=801(M+H)+
1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ=8.8(m，2H)，8.7(m，1H)，8.42和8.15(2d，1H)，7.3-7.1(m，5H)，5.12和4.95(2m，1H)，4.70和4.62(2m，1H)，4.62和4.50(2t，1H)，4.1-3.9(m，3H)，3.85(m，1H)，3.75-3.6(m，2H)，3.23，3.18，3.17，3.14，3.02和2.96(6s，9H)，3.1-2.9和2.75(2m，2H)，2.46(m，3H)，2.4-2.1(m，2H)，2.05(br.m，2H)，1.85-1.55(br.m，6H)，1.5-1.2(br.m，3H)，1.1-0.8(m，18H)，0.75(t，3H)[其它信号被隐藏在H2O峰下]。
中间体15
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002801
将126mg(0.198mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)溶解于10ml DMF中，并接连地与105mg(0.198mmol)(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐(中间体17)、41.6mg(0.217mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、33mg(0.217mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和79μl(0.454mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌过夜。然后将反应混合物倒入半饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯的混合物中。取出有机相，接连地用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。得到220mg(定量)Fmoc-保护的中间体N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
HPLC(方法5)：Rt=2.77min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.5min；MS(ESIpos)：m／z=1037(M+H)+。
将220mg(0.212mmol)该中间体溶解在5ml DMF中。已经加入1ml哌啶以后，将反应混合物在室温搅拌1h。随后，在真空中浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物(洗脱液：乙腈+0.01％TFA／水+0.01％TFA)。得到91mg(理论值的46％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.71min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m／z=815(M+H)+
1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ=8.87和8.80(2d，2H)，8.75(m，1H)，8.40和7.98(2d，1H)，7.3-7.1(m，5H)，5.45和5.2(2t，1H)，4.78和4.62(2m，1H)，4.73和4.58(2t，1H)，4.2-4.0(m，3H)，3.7-3.6(m，1H)，3.35，3.20，3.18，3.14，3.12和3.00(6s，9H)，3.1和2.95(2m，2H)，2.46(m，3H)，2.4-2.0(m，4H)，1.9-1.6(m，4H)，1.6-1.2(m，5H)，1.1-0.75(m，21H)，0.80(t，3H)[其它信号被隐藏在H2O峰下]。
中间体16
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002811
将617mg(1.2mmol)(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体24)溶解于44ml二氯甲烷中，加入4.4ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物，并将剩余的残余物从二噁烷／水低压冻干。得到702mg(定量)去保护的化合物(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐，为粗产物，其不经进一步纯化用于以后的阶段中。
将470mg(0.74mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)溶解于57ml DMF中，并接连地与390mg(大约0.74mmol)上面得到的(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐、336mg(0.88mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和423μl(2.4mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌2h。然后将反应混合物倒入半饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯的混合物中。取出有机相，接连地用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物。得到453mg(理论值的59％)Fmoc-保护的中间体N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
HPLC(方法5)：Rt=2.58min；
LC-MS(方法1)：Rt=3.10min；MS(ESIpos)：m／z=1035(M+H)+。
将453mg(0.438mmol)该中间体溶解在24ml DMF中。已经加入2.4ml哌啶以后，将反应混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物，并通过制备型HPLC(洗脱液：乙腈／0.1％的TFA水溶液)纯化残余物。得到260mg(理论值的64％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.64min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=813(M+H)+
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ=8.8(m，2H)，8.65(m，2H)，7.3-7.1(m，5H)，4.8-4.05(m，2H)，4.0和3.82(2m，2H)，3.8-3.5(m，8H)，3.32，3.29，3.20，3.19，3.12和3.00(6s，9H)，2.65(t，1H)，2.5-2.45(m，3H)，2.4-1.3(m，15H)，1.15-0.85(m，18H)，0.8和0.75(2d，3H)[其它信号被隐藏在H2O峰下]。
中间体17
N-苄基-N-甲基-L-苯基丙氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002831
将1000mg(3.77mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-苯丙氨酸溶解在10mlDMF中，并与457mg(3.77mmol)N-甲基苄胺、2150mg(5.65mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和657μlN，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌30min，然后在真空中浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷中，并通过与水一起摇动萃取3次。有机相经硫酸镁干燥，并浓缩。通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物，使用3：1石油醚／乙酸乙酯作为洗脱液。浓缩产物级分，并在高真空下干燥残余物。得到1110mg(理论值的75％)Boc-保护的中间体N-苄基-Nα-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-苯基丙氨酰胺。
HPLC(方法6)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.14min；MS(ESIpos)：m／z=369(M+H)+。
将1108mg(3,007mmol)该中间体溶解于30ml二氯甲烷中，加入10ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物，将剩余的残余物与二氯甲烷一起搅拌，并蒸馏出溶剂。将残余物与戊烷一起搅拌另外2次，每次再次倾析出溶剂，最后在高真空下干燥标题化合物。如此得到1075mg(理论值的93％)作为树脂的标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.6min；MS(ESIpos)：m／z=269(M+H)+。
中间体18
N-苄基-Nα-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-N-甲基-L-苯基丙氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002841
首先，如下从141mg(0.491mmol)它的二环己胺盐中释放出(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(起始化合物1)：将它溶解于乙酸乙酯中，并与5％硫酸水溶液一起萃取摇动。有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物溶解于10ml DMF中，并加入187.6mg(0.49mmol)N-苄基-N-甲基-L-苯基丙氨酰胺三氟乙酸盐(中间体9)、190.3mg(1.47mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和256μl N，N-二异丙基乙胺。将混合物在室温搅拌1h。然后浓缩反应混合物，将残余物溶解于乙酸乙酯中，随后如下萃取溶液：接连地与饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液和水一起摇动。有机相经硫酸镁干燥，并浓缩。通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物，使用30：1乙腈／水作为洗脱液。浓缩产物级分，并在高真空下干燥残余物。得到168mg(理论值的64％)Boc-保护的中间体(2S)-2-[(1R，2R)-3-({(2S)-1-[苄基(甲基)氨基]-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
HPLC(方法6)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.22min；MS(ESIpos)：m／z=538(M+H)+。
将168mg(0.312mmol)该中间体溶解于15ml二氯甲烷中，加入3ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物。将剩余的残余物首先与二氯甲烷一起搅拌，然后与二乙基醚一起搅拌，每次重新蒸馏出溶剂。在高真空下干燥以后，得到作为树脂的170mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m／z=438(M+H)+。
中间体19
N-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-苯基丙氨酸甲酯三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002851
与中间体18的制备类似地，从(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(起始化合物1)(其从二环己胺盐中释放出)和L-苯基丙氨酸甲酯盐酸盐开始，制备标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=0.6min；
LC-MS(方法3)：Rt=1.17min；MS(ESIpos)：m／z=349(M+H)+。
中间体20
N-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-色氨酸苄酯三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002852
与中间体18的制备类似地，从(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(起始化合物1)(其从二环己胺盐中释放出)和L-色氨酸苄酯开始，制备标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.8min；MS(ESIpos)：m／z=464(M+H)+。
中间体21
(1S，2R)-1-({(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}氨基)-2-苯基环丙烷甲酸苄酯三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002861
与中间体18的制备类似地，从(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(起始化合物1)(其从二环己胺盐中释放出)和(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷甲酸苄酯开始，制备标题化合物。(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷甲酸苄酯已经预先通过标准方法如下制备：用苯甲醇酯化商购可得的(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-苯基环丙烷甲酸，随后用三氟乙酸除去Boc。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法2)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m／z=437(M+H)+。
中间体22
6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N′-甲基己烷酰肼三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002862
将100mg(473μmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸溶解在71μl DMF中，然后与139mg(947μmol)1-甲基肼甲酸叔丁酯、182mg(947μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和145mg(947μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从二噁烷／水低压冻干以后，得到129mg(理论值的80％)受保护的中间体，为无色泡沫。
随后，用2ml三氟乙酸在8ml二氯甲烷中的溶液将所述129mg(380μmol)去保护。在室温搅拌1h以后，在真空中浓缩反应混合物。从乙腈／水低压冻干残余物，得到125mg(理论值的83％)标题化合物，为无色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=0.38min；MS(ESIpos)：m／z=240(M+H)+
中间体23
N-(2-氨基乙基)-4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基丁酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002872
首先，在5ml DMF中混合35mg(164μmol)2-(甲基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐三氟乙酸盐、30mg(164μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸、75mg(197μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和57μl N，N-二异丙基乙胺，并在室温搅拌过夜。随后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。浓缩对应的级分，并且通过从二噁烷／水中低压冻干，得到35mg(理论值的63％)受保护的中间体。
HPLC(方法12)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.71min；MS(ESIpos)：m／z=340(M+H)+。
随后，用1ml三氟乙酸在5ml二氯甲烷中的溶液将全部量的受保护的中间体去保护，得到28mg(理论值的77％)标题化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=0.75min；MS(ESIpos)：m／z=240(M+H)+。
中间体24
4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[2-(甲基氨基)乙基]丁酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002871
首先，在5ml DMF中混合35mg(164μmol)(2-氨基乙基)甲基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐三氟乙酸盐、30mg(164μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸、75mg(197μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和57μl N，N-二异丙基乙胺，并在室温搅拌30min。随后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。浓缩对应的级分，并且通过从二噁烷／水中低压冻干，得到51mg(理论值的91％)受保护的中间体。
HPLC(方法12)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=340(M+H)+。
随后，用1ml三氟乙酸在5ml二氯甲烷中的溶液将全部量去保护，得到45mg(理论值的69％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.19min；MS(ESIpos)：m／z=240(M+H)+。
中间体25
(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酸苄酯三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002881
首先，如下从1.82g(3.88mmol)它的二环己胺盐中释放出(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸：将它溶解于150ml乙酸乙酯中，并与100ml0.5％硫酸一起进行萃取摇动。有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物溶解于10ml二噁烷和10ml水中，加入1517mg(4.66mmol)碳酸铯，并将混合物在超声浴中处理5min，然后在真空中浓缩，并与DMF一起再蒸馏1次。然后将残余物溶解于15ml二氯甲烷中，并向其中加入1990mg(11.64mmol)苄基溴。将混合物在超声浴中处理15min，然后在真空中浓缩。将残余物在乙酸乙酯和水之间分配，取出有机相，并通过与饱和氯化钠溶液一起摇动进行萃取，然后浓缩。然后通过制备型HPLC纯化残余物。得到1170mg(理论值的80％)Boc-保护的中间体。
随后，立即用5ml三氟乙酸在15ml二氯甲烷中的溶液将这些1170mg去保护。在室温搅拌15min以后，在真空中浓缩反应混合物。将残余物从二噁烷低压冻干。在高真空下干燥以后，剩下1333mg(理论值的84％)标题化合物，为黄色油。
HPLC(方法6)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.59min；MS(ESIpos)：m／z=278(M+H)+。
中间体26
N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将1200mg(2.33mmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体5)与910.8mg(2.33mmol)(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酸苄酯三氟乙酸盐(中间体14)、1327mg(3.49mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和2027μl N，N-二异丙基乙胺一起在50ml DMF中混合，并将混合物在室温搅拌5min。此后，在真空中除去溶剂。将剩余的残余物溶解于乙酸乙酯中，并通过将其接连地与5％柠檬酸水溶液和饱和碳酸氢钠溶液一起摇动进行萃取。取出有机相，并浓缩。借助于制备型HPLC纯化残余物。将产物级分合并和浓缩，并在高真空下干燥残余物。得到1000mg(理论值的55％)作为树脂的苄基酯中间体N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-(苄氧基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
LC-MS(方法1)：Rt=1.56min；MS(ESIpos)：m／z=775(M+H)+。
将全部量的得到的该中间体溶解于25ml甲醇和二氯甲烷(20：1)的混合物中，并用10％活性炭载钯作为催化剂，通过在标准氢压力下氢化，除去苄基酯基。在室温搅拌30min后，滤出催化剂，并在真空中浓缩滤液。得到803mg(理论值的91％)标题化合物，为白色固体。
HPLC(方法6)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m／z=685(M+H)+。
中间体27
(1S，2R)-1-氨基-2-苯基-N-丙基环丙烷羧酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002901
如下制备标题化合物：在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)存在下，将商购可得的(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-苯基环丙烷甲酸与正丙胺偶联，随后用三氟乙酸除去Boc(收率：经2个阶段，理论值的85％)。
HPLC(方法6)：Rt=1.2min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.52min；MS(ESIpos)：m／z=219(M+H)+。
中间体28
(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷甲酸乙酯三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002902
如下制备标题化合物：通过标准方法，通过用乙醇酯化商购可得的(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-苯基环丙烷甲酸，随后用三氟乙酸除去Boc。
LC-MS(方法1)：Rt=0.50min；MS(ESIpos)：m／z=206(M+H)+。
中间体29
4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁酸
Figure BDA0000432948840002911
在0℃，向1.39g(8.95mmol)N-甲氧基羰基马来酰亚胺在44ml饱和碳酸氢钠溶液中的溶液中，加入1.5g(8.95mmol)4-氨基-2，2-二甲基丁酸，并将混合物搅拌40min。随后，除去冷却浴，并将反应混合物搅拌另外1h。然后在用冰冷却的同时，通过加入硫酸将反应混合物调节至pH3，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机相经硫酸镁干燥，并浓缩。得到1.17g(79％纯度，理论值的49％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.64min；m／z=212(M+H)+。
中间体30
2-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁酰基]肼甲酸叔丁酯
Figure BDA0000432948840002912
在0℃，向50mg(237μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁酸在2ml THF中的溶液中，首先加入26μl(237μmol)4-甲基吗啉，然后加入31μl(237μmol)氯甲酸异丁酯。除去冷却浴并在室温搅拌另外15min以后，加入31.3mg(237μmol)叔丁基氧基羰基酰肼。将反应混合物搅拌过夜，然后浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物。得到50.8mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.71min；m／z=324(M-H)-。
中间体31
4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁烷酰肼三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002921
将50mg(154mmol)2-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁酰基]肼甲酸叔丁酯溶解在2ml二氯甲烷中，并加入0.4ml三氟乙酸。将反应混合物在室温搅拌30min，然后浓缩。得到55.2mg(93％纯度，理论值的99％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.36min；m／z=226(M+H)+。
中间体32
N-(叔丁氧基羰基)-L-苯基丙氨酸金刚烷-1-基甲酯
Figure BDA0000432948840002922
在室温，向500mg(1.89mmol)N-Boc-L-苯丙氨酸在25ml二氯甲烷中的溶液中，加入1192mg(6.2mmol)EDC、578μl(4.1mmol)三乙胺、345mg(2.8mmol)DMAP和345mg(2.1mmol)1-金刚烷基甲醇。将反应混合物搅拌过夜，然后用50ml二氯甲烷稀释，并接连地用10％柠檬酸水溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥，然后浓缩，并通过制备型HPLC纯化残余物。得到769mg(理论值的90％)标题化合物。
LC-MS(方法2)：Rt=1.84min；m／z=414(M+H)+。
中间体33
L-苯基丙氨酸金刚烷-1-基甲酯盐酸盐
Figure BDA0000432948840002923
将769mg(1.86mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-苯基丙氨酸金刚烷-1-基甲酯(中间体13)溶解在25ml4N的氯化氢在二噁烷中的溶液中，并在室温搅拌1h。随后，浓缩反应混合物，并在真空中干燥残余物。得到619mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；m／z=314(M+H)+。
中间体34
N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(金刚烷-1-基甲氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840002931
在室温，向20mg(29μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺在1ml DMF中的溶液中，加入15.3μl(88μmol)N，N-二异丙基乙胺、6.7mg(44μmol)HOBt和6.7mg(35μmol)EDC，并将混合物搅拌30min。随后，加入10.1mg(32μmol)L-苯基丙氨酸金刚烷-1-基酯盐酸盐。搅拌过夜后，通过制备型HPLC将反应混合物直接地分离成它的组分。得到27.5mg(理论值的93％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.70min；m／z=980(M+H)+。
中间体35
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(金刚烷-1-基甲氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002941
将27.5mg(28μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)1-{(S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(金刚烷-1-基甲氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在1.8ml二氯甲烷中，并加入361μl TFA。将反应混合物搅拌30min，然后浓缩。将残余物溶解于水中，并低压冻干。得到22.7mg(理论值的81％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.14min；m／z=880(M+H)+。
中间体36
(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-基氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000432948840002942
在氩气氛下，将500mg(1.99mmol)N-Boc-L-苯基丙氨醇溶解在5mlDMF中，并冷却至0℃。随后，加入159mg(3.98mmol)60％的氢化钠在石蜡油中的混悬液。将反应混合物搅拌至气体产生结束，然后加入260μl(2.19mmol)苄基溴。除去冷却浴，并将反应混合物在室温搅拌2h。此后，浓缩反应混合物，将残余物溶解于冰水中，并用二氯甲烷萃取混合物。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸镁干燥，并浓缩。借助于制备型HPLC纯化残余物。得到226mg(理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.28min；m／z=342(M+H)+。
中间体37
(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-胺盐酸盐
Figure BDA0000432948840002951
将220mg(644μmol)(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-基氨基甲酸叔丁酯溶解在11ml4N的氯化氢在二噁烷中的溶液中，并在室温搅拌1h。然后，浓缩反应混合物，并在真空中干燥残余物。得到138mg(理论值的77％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.65min；m／z=242(M+H)+。
中间体38
N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
在室温，向20mg(29μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺在1ml DMF中的溶液中，加入15.3μl(88μmol)N，N-二异丙基乙胺，6.7mg(44μmol)HOBt和6.7mg(35μmol)EDC，并将混合物搅拌30min。随后，加入7.8mg(32μmol)(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-胺盐酸盐。搅拌过夜后，通过制备型HPLC，将反应混合物直接地分离成它的组分。得到26mg(理论值的98％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.51min；m／z=909(M+H)+。
中间体39
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002961
将26mg(29μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在1.8ml二氯甲烷中，并加入370μl TFA。将反应混合物在室温搅拌30min，然后浓缩。将残余物溶解于水中，并低压冻干。得到26.4mg(定量)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；m／z=809(M+H)+。
中间体40
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840002962
在10ml DMF中将50mg(70μmol)中间体26和11mg(70μmol)(1S，2R)-2-氨基-1-苯基丙烷-1-醇与42mg(0.11μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和25μl N，N-二异丙基乙胺混合，并将反应混合物在室温搅拌5min。这之后借助于制备型HPLC浓缩和纯化残余物。合并对应的级分、浓缩和在高真空下干燥以后，得到49mg(81％)受保护的中间体。随后，通过已知的条件，用三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液除去Boc基团。浓缩之后，通过制备型HPLC纯化标题化合物，得到26mg(52％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.65min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=718(M+H)+。
中间体41
3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002971
将150mg(541μmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯溶解在3ml二氯甲烷中，并加入1.5ml三氟乙酸，将反应混合物在室温搅拌1h，然后浓缩。
得到181mg(理论值的100％)标题化合物。
MS(EI)：m／z222(M+H)+
中间体42
3-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸
Figure BDA0000432948840002972
将186mg(555μmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸三氟乙酸盐溶解在2.6ml饱和碳酸氢钠溶液中，并在0℃与86mg(555μmol)N-甲氧基羰基马来酰亚胺混合。将反应混合物在0℃搅拌40min和在室温搅拌1h，然后再次冷却至0℃，用硫酸调节至pH3，并用25ml乙酸乙酯萃取3次。合并的有机相经硫酸镁干燥和浓缩。
得到126mg(理论值的75％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.53min；m／z=302(M+H)+。
中间体43
15-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-氧代-7，10，13-三氧杂-2，3-二氮杂十五烷-1-酸叔丁酯
在0℃，将125mg(417μmol)3-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸溶解在2.1ml THF中，并与46μl(417mmol)4-甲基吗啉和54.5μl(417μmol)氯甲酸异丁酯混合。除去冰浴，并将反应混合物在室温搅拌30min。随后，在0℃，加入55mg(417μmol)叔丁基氧基羰基酰肼。将反应混合物温热至室温过夜，浓缩，并通过制备型HPLC进行纯化。
得到60mg(理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.66min；m／z=416(M+H)+。
中间体44
3-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙烷酰肼三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002991
将60mg(145μmol)15-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4-氧代-7，10，13-三氧杂-2，3-二氮杂十五烷-1-酸叔丁酯溶解在1ml二氯甲烷中，并加入0.2ml三氟乙酸。将反应混合物在室温搅拌30min，然后浓缩。
得到62mg(理论值的100％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.35min；m／z=316(M+H)+。
中间体45
(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷甲酸苄酯三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840002992
如下制备标题化合物：通过标准方法，通过用苯甲醇酯化商购可得的(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-苯基环丙烷甲酸，随后用三氟乙酸除去Boc。
LC-MS(方法1)：Rt=0.72min；MS(ESIpos)：m／z=268(M+H)+。
中间体46
N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003001
在15ml DMF中将383mg(0.743mmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体8)与485mg(0.743mmol)N-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-苯基丙氨酸苄酯三氟乙酸盐(中间体12)、424mg(1.114mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和388μl N，N-二异丙基乙胺混合，并将混合物在室温搅拌10min。随后，在真空中除去溶剂。将剩余的残余物溶解于乙酸乙酯中，并通过接连地与5％柠檬酸水溶液和饱和碳酸氢钠溶液一起摇动进行萃取。取出有机相并浓缩，并借助于制备型HPLC纯化残余物。将产物级分合并和浓缩，并在高真空下干燥残余物。得到335mg(理论值的48％)苄基酯中间体，为泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m／z=922(M+H)+。
将100mg(0.11mmol)该中间体溶解于15ml甲醇中，并用10％活性炭载钯作为催化剂，通过在标准氢压力下氢化，除去苄基酯基。在室温搅拌1h后，滤出催化剂，并在真空中浓缩滤液。从二噁烷低压冻干以后，得到85mg(理论值的94％)标题化合物，为固体。
HPLC(方法12)：Rt=2.4min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m／z=832(M+H)+。
中间体47
N-苄基-L-色氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003011
将202mg(0.5mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-色氨酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯和45mg(0.42mmol)苄胺溶解在10ml DMF中，并加入110μl(630μmol)N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温搅拌3h。随后，在真空中浓缩反应混合物，并通过在硅胶上的快速色谱法(洗脱液：20：0.5：0.05二氯甲烷／甲醇／17％水溶液氨)纯化残余物。合并对应的级分，并浓缩。用二乙基醚消化得到的残余物，然后在高真空下干燥。随后，将该残余物溶解于10ml二氯甲烷中，并加入3ml无水三氟乙酸。在室温搅拌45分钟以后，浓缩混合物，并通过制备型HPLC纯化残余物。在真空中干燥以后，得到117mg(经2个阶段，理论值的57％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.66min；MS(ESIpos)：m／z=294(M+H)+。
中间体48
(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷羧酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003012
将50mg(180μmol)商购可得的(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-苯基环丙烷甲酸溶解在5ml DMF中，加入94μl(541μmol)N，N-二异丙基乙胺、31mg(270μmol)N-羟基琥珀酰亚胺和41.5mg(216μmol)EDC，然后将混合物在室温搅拌过夜。然后浓缩反应混合物，将残余物溶解于二噁烷中，加入71mg(901μmol)碳酸氢铵，然后将反应混合物在室温静置3天。然后用乙酸乙酯和水的1：1混合物稀释反应混合物。取出有机相，经硫酸镁干燥，并浓缩。随后将得到的残余物溶解于3ml二氯甲烷中，并加入3ml无水三氟乙酸。在室温搅拌1h，然后浓缩。将残余物与戊烷一起搅拌，抽滤出，并从二噁烷中低压冻干。以此方式，得到32mg(经2个阶段，理论值的62％)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=0.38min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.20min；MS(ESIpos)：m／z=177(M+H)+。
中间体49
Nα-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-色氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003021
与中间体13的制备类似地，从起始化合物1和L-色氨酰胺盐酸盐，制备标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.4min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m／z=473(M+H)+。
中间体50
2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基氨基甲酸-4-硝基苯酯
Figure BDA0000432948840003022
将813mg(3.1mmol)三苯基膦溶解在25ml THF中，并在氩下冷却至-70℃。逐滴加入627mg(3.1mmol)偶氮二甲酸二异丙酯以后，将混合物搅拌5min。随后，将逐滴加入溶解在5ml THF中的500mg(3.1mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯，并将反应混合物在-70℃搅拌另外5min。然后，加入136.6mg(1.55mmol)2，2-二甲基-1-丙醇(溶解在1ml THF中)和301mg(3.1mmol)马来酰亚胺，将反应混合物在-70℃搅拌另外10min，然后将混合物温热至室温。在室温搅拌另外16h以后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC纯化残余物。得到463mg(62％)受保护的中间体。
在标准条件下除去Boc保护基以后，得到652mg作为三氟乙酸盐的1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮。
将112.9mg(543μmol)氯甲酸硝基苯酯溶解在30ml THF中，并且在加入100mg(271.6μmol)1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮三氟乙酸盐以后，将混合物在室温搅拌30min。过滤混合物，并将滤液浓缩至干燥，然后用二乙基醚制浆。抽滤和干燥以后，得到60mg(理论值的95％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=0.65min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m／z=306(M+H)+。
中间体51
(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003031
首先在0℃，将200mg(0.75mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-苯丙氨酸提供在5.5ml二氯甲烷中，并向其中加入128mg(0.79mmol)1，1′-羰基二咪唑。30min以后，加入103mg(0.75mmol)苯甲酰基酰肼。在0℃另外45min以后，最后加入500mg(1.5mmol)四溴化碳和395mg(1.5mmol)三苯基膦。将反应混合物首先在0℃搅拌2h，然后在室温搅拌过夜。随后在旋转蒸发器上浓缩混合物，并在高真空下干燥残余物。借助于制备型HPLC，纯化如此得到的粗产物。得到217mg(理论值的78％)Boc-保护的中间体(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法12)：Rt=1.15min；MS(ESIpos)：m／z=366(M+H)+
将217mg(0.59mmol)该中间体溶解于3ml二氯甲烷中，并加入0.6ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物。剩余的残余物为反应混合物，并在真空中进一步干燥，然后从二噁烷低压冻干。以此方式，得到214mg(理论值的90％)标题化合物。
LC-MS(方法11)：Rt=0.62min；MS(ESIpos)：m／z=266(M+H)+
中间体52
中间体52
(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003041
首先在0℃将200mg(0.75mmol)N-(叔丁氧基羰基)-D-苯丙氨酸提供在5.5ml二氯甲烷中，并向其中加入128.3mg(0.79mmol)1，1′-羰基二咪唑。30min以后，加入103mg(0.75mmol)苯甲酰基酰肼。在0℃另外45min以后，最后加入500mg(1.5mmol)四溴化碳和395mg(1.5mmol)三苯基膦。将反应混合物首先在0℃搅拌2h，然后在室温搅拌过夜。随后在旋转蒸发器上浓缩混合物，并在高真空下干燥残余物。借助于制备型HPLC，纯化如此得到的粗产物。得到219mg(理论值的80％)Boc-保护的中间体(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法2)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m／z=366(M+H)+
将219mg(0.6mmol)该中间体溶解于3ml二氯甲烷中，加入0.6ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物。剩余的残余物为反应混合物，并在真空中进一步干燥，然后从二噁烷低压冻干。以此方式，得到196mg(理论值的86％)标题化合物，为固体。
HPLC(方法10)：Rt=2.41min
中间体53
(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-胺
首先将200mg(1.13mmol)(4S)-4-苄基-1，3-噁唑烷-2-酮提供在3ml叔丁醇中，并向其中加入280mg(2.26mmol)苄基硫醇。随后将混合物在回流下加热2天。此后，在旋转蒸发器上浓缩反应混合物，并将得到的中间体(2S)-1-(苄基硫烷基)-3-苯基丙烷-2-胺中间体不经后处理直接进一步转化。
HPLC(方法10)：Rt=2.63min
LC-MS(方法1)：Rt=0.67min；MS(ESIpos)：m／z=258(M+H)+
将上面得到的粗制中间体溶解在2ml30％过氧化氢和5ml甲酸的溶液中，并将混合物在室温搅拌12h。然后，将反应混合物加入饱和硫酸钠溶液中，并用乙酸乙酯萃取3次。有机相经硫酸镁干燥，并在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化得到的粗产物。如此得到343mg(理论值的61％)标题化合物。
HPLC(方法10)：Rt=2.40min；
LC-MS(方法12)：Rt=0.65min；MS(ESIpos)：m／z=290(M+H)+
中间体54
(2S，3E)-1，4-二苯基丁-3-烯-2-胺
Figure BDA0000432948840003052
将552.7mg(9.85mmol)氢氧化钾溶解在甲醇中，吸附在1.1g中性氧化铝上，然后在高真空下干燥。在5-10℃，向240mg(0.82mmol)(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-胺和1.56g如此制备的氧化铝负载的氢氧化钾在6.2ml正丁醇中的溶液中，逐滴加入307μl(3.3mmol)二溴二氟甲烷。将反应混合物在室温搅拌2h，然后穿过硅藻土(Celite)过滤，此后用二氯甲烷彻底洗涤残余物。浓缩滤液，并在真空中干燥得到的残余物。借助于制备型HPLC，纯化如此得到的粗产物。得到98mg(理论值的35％)标题化合物，E／Z非对映异构体比例为4：1。
HPLC(方法10)：Rt=2.46min；
LC-MS(方法12)：Rt=0.75min；MS(ESIpos)：m／z=224(M+H)+
将上面得到的E／Z非对映异构体混合物溶解在2ml乙醇和0.2mlN，N-二异丙基乙胺中，并借助于在手性相上的HPLC[柱：Daicel ChiralpakAD-H，5μm250mm x20mm，洗脱液：己烷／(乙醇+0.2％二乙胺)50：50v／v；紫外检测：220nm；温度：30℃]进行分离。在旋转蒸发器上浓缩适当的级分，并在真空中干燥残余物。得到45mg标题化合物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ[ppm]=2.62-2.83(m，2H)3.52-3.71(m，1H)6.18-6.30(m，1H)6.34-6.46(m，1H)6.98-7.57(m，10H)[其它信号被隐藏在溶剂峰下]。
中间体55
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
将20mg(29μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在1ml DMF中，加入13.3mg(35μmol)HATU和15.3μl(88μmol)N，N-二异丙基乙胺，并将混合物在室温搅拌30min。随后，加入12.2mg(32μmol)(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙胺三氟乙酸盐。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后通过制备型HPLC进行分离。得到22mg(理论值的81％)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
LC-MS(方法12)：Rt=1.45min；MS(ESIpos)：m／z=933(M+H)+
通过随后用三氟乙酸除去BOC保护基，如此得到22.4mg(理论值的98％)标题化合物。
LC-MS(方法11)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=833(M+H)+
中间体56
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003071
与中间体55的制备类似地，通过使20mg(29μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺与12.2mg(32μmol)(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙胺三氟乙酸盐反应，制备N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
收率：17mg(理论值的64％)
HPLC(方法10)：Rt=3.74min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.45min；MS(ESIpos)：m／z=933(M+H)+
通过随后用三氟乙酸除去BOC保护基，如此得到17.1mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法10)：Rt=2.55min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=833(M+H)+
中间体57
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003081
与中间体55的制备类似地，通过使20mg(29μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺与9.3mg(20μmol)(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-胺反应，制备N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
收率：19.2mg(理论值的68％)
HPLC(方法10)：Rt=3.5min；
LC-MS(方法12)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m／z=957(M+H)+
通过随后用三氟乙酸除去BOC保护基，如此得到19.3mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法10)：Rt=2.52min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=857(M+H)+
中间体58
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3E)-1，4-二苯基丁-3-烯-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003091
与中间体55的制备类似地，通过使20mg(29μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺与7.1mg(32μmol)(2S，3E)-1，4-二苯基丁-3-烯-2-胺反应，制备N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3E)-1，4-二苯基丁-3-烯-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
收率：15.1mg(理论值的58％)
HPLC(方法10)：Rt=4.2min；
LC-MS(方法12)：Rt=1.51min；MS(ESIpos)：m／z=891(M+H)+
通过随后用三氟乙酸除去BOC保护基，如此得到15.7mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法10)：Rt=2.62min；
LC-MS(方法12)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m／z=791(M+H)+
中间体61
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003101
将50mg(0.054mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体16)溶解在8ml二噁烷／水中，并向其中加入70ml(0.108mmol)15％的4-氧代丁酸在水中的溶液。随后将反应混合物在100℃搅拌1h。冷却至室温后，加入3.7mg(0.059mmol)氰基硼氢化钠，并通过加入约300μl0.1N盐酸，将混合物调节至pH3。然后将反应混合物在100℃搅拌另外2h。冷却后，加入另外70ml(0.108mmol)15％4-氧代丁酸溶液，并将反应混合物再次在100℃搅拌1h。然后，加入另外3.7mg(0.059mmol)氰基硼氢化钠，并随后使用约300μl0.1N盐酸将pH重调至3。然后将反应混合物在100℃搅拌另外2h。在转化仍然不完全的情况下，重复该操作第三次。最后浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物。以此方式，得到无色泡沫形式的32mg(理论值的65％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.64min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.76min；MS(ESIpos)：m／z=899(M+H)+
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ=8.95和8.8(2m，1H)，8.88和8.65(2s，1H)，7.4-7.1(m，5H)，5.0，4.78，4.65和4.55(4m，2H)，4.1-3.7(m，5H)，3.32，3.29，3.20，3.12，3.1和3.0(6s，9H)，2.75(m，2H)，2.63(t，1H)，2.4-2.2(m，4H)，2.1-1.2(m，12H)，1.2-0.8(m，16H)，0.75(m，3H)[其它信号被隐藏在H2O和DMSO峰下]。
中间体62
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与中间体61的制备类似地，通过使50mgN-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体14)与4-氧代丁酸反应，制备标题化合物。
收率：34mg(理论值的70％)
HPLC(方法5)：Rt=1.64min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.77min；MS(ESIpos)：m／z=887(M+H)+。
中间体63
N-(4-羧基苄基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003121
与中间体61的制备类似地，通过使15mgN-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体16)与4-甲酰基苯甲酸反应，制备标题化合物。
收率：7.5mg(理论值的48％)
HPLC(方法5)：Rt=1.75min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m／z=947(M+H)+。
中间体64
N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003122
将10mg(0.011mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体16)溶解在2ml二噁烷／水中，并向其中加入2.8mg(0.022mmol)6-氧代己酸。随后将反应混合物在100℃搅拌1h。冷却至室温后，加入0.75mg(0.012mmol)氰基硼氢化钠，并通过加入0.1N盐酸，将混合物调节至pH3。然后将反应混合物在100℃搅拌另外1小时。冷却后，加入另外2.8mg(0.022mmol)6-氧代己酸，并将反应混合物再次在100℃搅拌1h。加入另外0.75mg(0.012mmol)氰基硼氢化钠，随后使用0.1N盐酸将pH重调至3。然后将反应混合物在100℃搅拌另外1h。然后将该操作重复第三次。最后浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化粗产物。得到6.4mg(理论值的64％)无色泡沫形式的标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.68min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.86min；MS(ESIpos)：m／z=927(M+H)+。
中间体65
N-(2-氨基乙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺双三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003131
如下制备标题化合物：使68mgN-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体14)与2-氧代乙基氨基甲酸叔丁酯反应，随后用三氟乙酸除去Boc保护基。
收率：49mg(经2个阶段，理论值的62％)
HPLC(方法5)：Rt=1.58min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.05min；MS(ESIpos)：m／z=844(M+H)+
1H NMR(600MHz，DMSO-d6)：δ=8.25(m，1H)，8.45和8.15(2d，1H)，7.65-7.55(m，3H)，7.23-7.1(m，5H)，5.12和4.95(2m，1H)，4.72和4.62(2m，1H)，4.6和4.52(2t，1H)，4.2-3.8(m，4H)，3.7(d，1H)，3.23，3.20，3.19，3.18，3.03和2.98(6s，9H)，3.0-2.7(m，6H)，2.4-1.2(m，15H)，1.05，1.0，0.88和0.82(4d，6H)，0.92(m，6H)，0.73(m，6H)[其它信号被隐藏在H2O峰下]。
中间体66
N-(3-氨基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003141
与中间体65的制备类似地，通过使25mg(0.027mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体16)与3-氧代丙基氨基甲酸苄酯反应，随后氢解除去z保护基(用10％炭载钯作为催化剂，在作为溶剂的乙醇中)，制备标题化合物。
收率：11mg(经2个阶段，理论值的41％)
HPLC(方法5)：Rt=1.53mmin；
LC-MS(方法1)：Rt=0.72mmin；MS(ESIpos)：m／z=870(M+H)+。
中间体67
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(金刚烷-1-基甲氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将26mg(26μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(金刚烷-1-基甲氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐和33.9μl15％琥珀醛酸水溶液(53μmol)溶解在957μl1：1-二噁烷／水混合物中，并加热至100℃保持1h。短暂冷却后，加入1.81mg(29μmol)氰基硼氢化钠。通过加入0.1N盐酸，将反应混合物调节至pH3，并将混合物加热至100℃保持另外2h。再次加入相同量的琥珀醛酸溶液、氰基硼氢化钠和盐酸以后，将混合物再次加热至100℃保持2h。然后借助于制备型HPLC，将反应混合物直接分离成它的组分。如此得到18.5mg(理论值的73％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.17min；m／z=967(M+H)+。
中间体68
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003152
将24mg(26μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐和33.7μl15％琥珀醛酸水溶液(52μmol)溶解在953μl1：1-二噁烷／水混合物中，并加热至100℃保持1h。短暂冷却后，加入1.80mg(29μmol)氰基硼氢化钠。通过加入0.1N盐酸，将反应混合物调节至pH3，并将混合物加热至100℃保持另外2h。再次加入相同量的琥珀醛酸溶液、氰基硼氢化钠和盐酸以后，将混合物再次加热至100℃保持2h。然后借助于制备型HPLC，将反应混合物直接分离成它的组分。如此得到15.2mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；m／z=895(M+H)+
中间体69
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将53mg(84μmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)和45mg(84μmol)N-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-苯基丙氨酸苄酯三氟乙酸盐(中间体12)溶解于2ml DMF中，加入19μl N，N-二异丙基乙胺、14mg(92μmol)HOBt和17.6mg(92μmol)EDC，然后将混合物在室温搅拌过夜。随后，浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物。得到59mg(理论值的68％)Fmoc-保护的中间体N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
LC-MS(方法1)：Rt=1.55min；m／z=1044(M+H)+。
在5ml DMF中，用1.2ml哌啶处理57mg(0.055mmol)该中间体，以除去Fmoc保护基。借助于制备型HPLC浓缩和纯化以后，得到39mg(理论值的76％)游离胺中间体N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；m／z=822(M+H)+。
将37mg(0.045mmol)该中间体溶解在5ml二噁烷／水中，并与中间体66中的化合物的制备类似地，在有氰基硼氢化钠存在下与15％的4-氧代丁酸水溶液反应。得到无色泡沫形式的16mg(理论值的39％)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m／z=908(M+H)+。
中间体70
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003171
首先，与在中间体14中描述的制备类似地，从中间体4和26开始，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
将30mg(0.032mmol)该化合物溶解在6ml二噁烷／水中，并向其中加入41μl(0.063mmol)15％的4-氧代丁酸水溶液。随后将反应混合物在100℃搅拌1h。冷却至室温后，加入2.2mg(0.035mmol)氰基硼氢化钠，并通过加入约300μl0.1N盐酸，将混合物调节至pH3。然后将反应混合物在100℃搅拌另外2h。冷却后，加入另外41μl(0.063mmol)15％4-氧代丁酸溶液，并将反应混合物再次在100℃搅拌1h。然后，加入另外2.2mg(0.035mmol)氰基硼氢化钠，随后使用约300μl0.1N盐酸将pH重调至3。然后将反应混合物在100℃搅拌另外2h。在转化仍然不完全的情况下，将该操作重复第三次。最后浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化粗产物。得到24mg(理论值的82％)无色泡沫形式的标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法9)：Rt=5.15min；MS(ESIpos)：m／z=922(M+H)+。
中间体71
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003181
首先，与在中间体14中描述的制备类似地，从中间体4和39开始，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。然后与中间体61的制备类似地，通过使7mg(0.009mmol)该化合物在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到2mg(理论值的22％)无色泡沫形式的标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt＝1.9min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.06min；MS(ESIpos)：m／z=832(M+H)+。
中间体72
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003191
将212mg(411μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体8)和237mg(411μmol)N-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-色氨酸苄酯三氟乙酸盐(中间体20)溶解于30ml DMF中，并加入188mg(493μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和215μl N，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温搅拌20h，然后在真空中浓缩，并借助于制备型HPLC纯化残余物。将产物级分合并和浓缩，并在高真空下干燥残余物。得到315mg(理论值的80％)Boc-保护的中间体N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为无色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=1.45min；m／z=961(M+H)+。
用1ml三氟乙酸在9ml二氯甲烷中的溶液处理50mg(52μmol)该中间体，以除去Boc保护基。借助于制备型HPLC浓缩和纯化以后，得到29mg(理论值的57％)游离胺中间体N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；m／z=861(M+H)+。
将29mg(0.03mmol)该中间体溶解在6ml二噁烷／水中，并向其中加入39μl(0.059mmol)15％的4-氧代丁酸水溶液。随后将反应混合物在100℃搅拌1h。冷却至室温后，加入2mg(0.033mmol)氰基硼氢化钠，并通过加入约300μl0.1N盐酸，将混合物调节至pH3。然后将反应混合物在100℃搅拌另外2h。冷却后，加入另外39μl(0.059mmol)15％4-氧代丁酸溶液，并将反应混合物再次在100℃搅拌1h。然后，加入另外2mg(0.033mmol)氰基硼氢化钠，并随后使用约300μl0.1N盐酸将pH重调至3。然后将混合物在100℃搅拌另外2h。此后，将反应混合物倒在半饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯的1：1混合物上。取出有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥，并浓缩。从水／乙腈冷冻干燥残余物。得到27mg(理论值的94％)无色泡沫形式的标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法9)：Rt=5.04min；MS(ESIpos)：m／z=947(M+H)+。
中间体73
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-({(2S)-1-[苄基(甲基)氨基]-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003201
首先，与在中间体14中描述的制备类似地，从中间体4和38开始，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-({(2S)-1-[苄基(甲基)氨基]-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。然后使用25mg(0.026mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到13mg(理论值的54％)无色泡沫形式的标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法9)：Rt=5.01min；MS(ESIpos)：m／z=921(M+H)+。
中间体74
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-({(1S，2R)-1-[(苄氧基)羰基]-2-苯基环丙基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003211
将50mg(73μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和28mg(73μmol)(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷甲酸苄酯三氟乙酸盐(中间体45)溶解于5ml DMF中，并加入42mg(110μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和38μlN，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温搅拌5h，然后在真空中浓缩，并借助于制备型HPLC纯化残余物。合并产物级分，并浓缩。从二噁烷／水低压冻干以后，得到35mg(理论值的51％)Boc-保护的中间体N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-({(1S，2R)-1-[(苄氧基)羰基]-2-苯基环丙基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为无色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=1.52min；m／z=934(M+H)+。
用1ml三氟乙酸在5ml二氯甲烷中的溶液处理35mg该中间体，以除去Boc保护基。浓缩和从二噁烷／水低压冻干以后，得到34mg(理论值的97％)游离胺中间体N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-({(1S，2R)-1-[(苄氧基)羰基]-2-苯基环丙基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；m／z=834(M+H)+。
然后与中间体66的制备类似地，通过使11mg(0.011mmol)该中间体在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到2.5mg(理论值的24％)无色泡沫形式的标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法9)：Rt=5.1min；MS(ESIpos)：m／z=920(M+H)+。
中间体75
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S，2R)-2-苯基-1-(丙基氨甲酰基)环丙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003221
首先，与在中间体74中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和(1S，2R)-1-氨基-2-苯基-N-丙基环丙烷羧酰胺三氟乙酸盐(中间体27)偶联，随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S，2R)-2-苯基-1-(丙基氨甲酰基)环丙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用14mg(0.016mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到11.3mg(理论值的83％)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.27min；MS(ESIpos)：m／z=871(M+H)+。
中间体76
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-(乙氧基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
首先，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使中间体46(N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)与中间体48((1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷甲酸乙酯三氟乙酸盐)偶联和随后除去Boc，制备起始化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-(乙氧基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐。然后与中间体61类似地，通过使用70mg(0.079mmol)该起始原料与4-氧代丁酸反应，得到46mg(理论值的68％)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.28min；MS(ESIpos)：m／z=858(M+H)+
中间体77
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003241
首先，与在中间体75中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和L-苯基丙氨酰胺盐酸盐偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用47mg(0.049mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到39mg(理论值的96％)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.44min；MS(ESIpos)：m／z=817(M+H)+
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ=8.95和8.8(2m，1H)，8.25和8.0(2d，1H)，7.45，7.35和7.0(3s，宽峰，2H)，7.3-7.1(m，5H)，4.8-4.4(2m，3H)，3.95(m，1H)，3.82(m，1H)，3.72(d，1H)，3.22，3.18，3.15，3.05和3.00(5s，9H)，2.85-2.7(m，4H)，2.45-1.6(m，12H)，1.5-1.2(m，3H)，1.1-0.7(m，21H)[其它信号被隐藏在溶剂峰下]。
中间体78
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003251
与中间体66类似地，经2个阶段制备该化合物：从20mg(16μmol)得自中间体14和(6-氧代己基)氨基甲酸苄酯的化合物开始，在作为溶剂的甲醇中进行氢化。
收率：7.6mg(理论值的55％，经2个阶段)
HPLC(方法6)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.7min；MS(ESIpos)：m／z=901(M+H)+。
中间体79
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003252
将36mg(43μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体46)和4.6mg(43μmol)苄胺溶解于5ml DMF中，加入7.5μl(88μmol)N，N-二异丙基乙胺、10mg(65μmol)HOBt和10mg(52μmol)EDC，然后将混合物在室温搅拌过夜。随后，浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物。得到29mg(理论值的73％)Boc-保护的中间体N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
LC-MS(方法1)：Rt=1.43min；m／z=921(M+H)+。
用1ml三氟乙酸在6ml二氯甲烷中的溶液处理29mg该中间体，以除去Boc保护基。浓缩和从二噁烷／水低压冻干以后，得到30mg(定量)游离胺中间体N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；m／z=821(M+H)+。
然后使用17mg(0.018mmol)该中间体，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到13mg(理论值的80％)无色泡沫形式的标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.97min；MS(ESIpos)：m／z=907(M+H)+。
中间体80
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
首先，与在中间体74中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和N-苄基-L-色氨酰胺三氟乙酸盐(中间体47)偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用10mg(0.01mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到2.5mg(理论值的26％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m／z=946(M+H)+。
中间体81
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-氨甲酰基-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003281
首先，与在中间体74中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷羧酰胺三氟乙酸盐(中间体48)偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-氨甲酰基-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用14mg(0.0163mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到8mg(理论值的57％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.64min；MS(ESIpos)：m／z=829(M+H)+。
中间体82
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003282
首先，与在中间体69中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)和Nα-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-色氨酰胺三氟乙酸盐(中间体49)偶联，并随后借助于哌啶除去Fmoc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用78mg(0.088mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到68mg(理论值的90％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.49min；MS(ESIpos)：m／z=856(M+H)+。
中间体83
N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003291
与在中间体82中的化合物类似地，从20mg(26μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐开始，在有制备的氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，制备该化合物。
收率：5mg(理论值的25％)
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.72min；MS(ESIpos)：m／z=884(M+H)+。
中间体84
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(吗啉-4-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003301
首先，与在中间体79中描述的制备类似地，通过在有EDC和HOBT存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体46)和吗啉偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(吗啉-4-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用30mg(0.033mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到22mg(理论值的76％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.58min；MS(ESIpos)：m／z=887(M+H)+。
中间体85
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3R)-1-(苄基氨基)-3-羟基-1-氧代丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003311
首先，与在中间体79中描述的制备类似地，通过在有HATU存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体46)和N-苄基-L-苏氨酰胺三氟乙酸盐偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3R)-1-(苄基氨基)-3-羟基-1-氧代丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用21mg(0.024mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到20mg(理论值的97％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.54min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.49min；MS(ESIpos)：m／z=861(M+H)+。
中间体86
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003321
首先，与在中间体74中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和L-苯基丙氨酸叔丁酯盐酸盐偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基得到叔丁基酯(与三氟乙酸一起在二氯甲烷中搅拌40分钟)，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用22mg(0.02mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到16mg(理论值的94％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法9)：Rt=5.05min；MS(ESIpos)：m／z=874(M+H)+。
中间体87
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003322
与在中间体86中描述的制备类似地，从230mg(336μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和L-色氨酸叔丁酯盐酸盐开始，经3个阶段制备该化合物。
收率：95mg(理论值的31％，经3个阶段)
HPLC(方法5)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法9)：Rt=5.05min；MS(ESIpos)：m／z=913(M+H)+。
中间体88
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003331
首先，与在中间体69中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)和Nα-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-色氨酰胺三氟乙酸盐(中间体49)偶联，并随后借助于哌啶除去Fmoc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用30mg(0.03mmol)该化合物，与中间体61的化合物的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与(6-氧代己基)氨基甲酸苄酯(其已经预先通过氧化(6-羟基己基)氨基甲酸苄酯而得到)反应，得到17mg(理论值的45％)Z-保护的化合物。随后，在10％钯／活性炭上在甲醇中进行氢解，得到标题化合物。
收率：14mg(理论值的95％)
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m／z=869(M+H)+。
中间体89
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
首先，与在中间体86中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和L-色氨酸叔丁酯盐酸盐偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基得到叔丁基酯(与1：10三氟乙酸／二氯甲烷一起搅拌30min)，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用71mg(0.075mmol)该化合物，与中间体61的化合物的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与(6-氧代己基)氨基甲酸苄酯(其已经预先通过氧化(6-羟基己基)氨基甲酸苄酯而得到)反应，得到35mg(理论值的44％)Z-保护的化合物。随后，在10％钯／活性炭上在甲醇中进行氢解，得到标题化合物。
收率：30mg(理论值的98％)
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=926(M+H)+。
中间体90
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003351
首先，与在中间体74中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和2-(1H-吲哚-3-基)乙胺偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用100mg(0.119mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到50mg(理论值的49％)标题化合物。在这里通过在硅胶上的快速色谱法纯化标题化合物，使用二氯甲烷／甲醇／17％氨作为洗脱液，在此过程中，将混合比从最初的15／2／02转换至15／4／0.5。
HPLC(方法6)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=813(M+H)+。
中间体91
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-{(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺
首先，与在中间体74中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和苯基乙胺偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-{(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。然后使用57mg(0.071mmol)该化合物，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到44mg(理论值的80％)标题化合物。在这里也通过在硅胶上的快速色谱法纯化标题化合物，使用二氯甲烷／甲醇／17％氨作为洗脱液(15／2／02->15／4／0.5)。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.64min；MS(ESIpos)：m／z=774(M+H)+。
中间体92
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
使用100mg(0.139mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体40)，与中间体61的制备类似地，通过在有氰基硼氢化钠存在下与4-氧代丁酸反应，得到94mg(理论值的84％)标题化合物。通过制备型HPLC纯化标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.46min；MS(ESIpos)：m／z=804(M+H)+。
中间体93
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003372
将22.4mg(24μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐溶解在1.4ml二噁烷／水中，并且与中间体61的制备类似地，在有氰基硼氢化钠存在下与15％的4-氧代丁酸水溶液反应。从二噁烷低压冻干以后，得到白色固体形式的8.2mg(理论值的38％)标题化合物。
HPLC(方法10)：Rt=2.54min
LC-MS(方法12)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=919(M+H)+
中间体94
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003381
将17.1mg(18μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐溶解在1.1ml二噁烷／水中，并且与中间体61的制备类似地，在有氰基硼氢化钠存在下与15％的4-氧代丁酸水溶液反应。从二噁烷低压冻干以后，得到白色固体形式的14.8mg(理论值的89％)标题化合物。
HPLC(方法10)：Rt=2.54min；
LC-MS(方法12)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m／z=919(M+H)+
中间体95
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003391
将19.3mg(20μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐溶解在1.2ml二噁烷／水中，并且与中间体61的制备类似地，在有氰基硼氢化钠存在下与15％的4-氧代丁酸水溶液反应。从二噁烷低压冻干以后，得到固体形式的8.6mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法11)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=943(M+H)+
中间体96
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3E)-1，4-二苯基丁-3-烯-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003392
将15.5mg(10μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3E)-1，4-二苯基丁-3-烯-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐溶解在1.0ml二噁烷／水中，并且与中间体61的制备类似地，在有氰基硼氢化钠存在下与15％的4-氧代丁酸水溶液反应。从二噁烷低压冻干以后，得到白色固体形式的10.3mg(理论值的68％)标题化合物。
HPLC(方法10)：Rt=2.59min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=877(M+H)+
中间体97
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
如下制备标题化合物：与中间体66的制备类似地，使200mg(0.108mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体16)与(6-氧代己基)氨基甲酸苄酯反应，随后氢解除去Z保护基(用5％炭载钯作为催化剂，在作为溶剂的甲醇中)。
收率：69mg(理论值的65％，经2个阶段)
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m／z=912(M+H)+。
中间体98
N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与在中间体80中描述的制备类似地制备该化合物。通过制备型HPLC实现纯化。
收率：40mg(理论值的29％，经3个阶段)
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m／z=974(M+H)+。
中间体99
(2S)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)丙烷-1-酮三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003412
将324mg(0.81mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-色氨酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯溶解在20ml DMF中，并加入200mg(1.62mmol)1，2-噁嗪烷盐酸盐(起始化合物5)和850μlN，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在50℃搅拌过夜，然后在真空中浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷中，并用水萃取。有机相经硫酸镁干燥，并浓缩。通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物，使用4：1二氯甲烷／乙酸乙酯作为洗脱液。浓缩产物级分，并在高真空下干燥残余物。得到147.5mg(理论值的48％)Boc-保护的中间体。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m／z=374(M+H)+。
使用166mg(444.5μmol)该中间体，在标准条件下，用3ml三氟乙酸在20ml二氯甲烷中的溶液，除去Boc保护基，并且在HPLC纯化以后，得到155mg(理论值的86％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.43min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.56min；MS(ESIpos)：m／z=274(M+H)+。
中间体100
N-(6-{[(苄氧基)羰基]氨基}己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将177mg(260μmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和100mg(260μmol)(2S)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)丙烷-1-酮三氟乙酸盐(中间体99)溶解于15ml DMF中，并加入118mg(310μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和140μlN，N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温搅拌30min，然后在真空中浓缩，并借助于制备型HPLC纯化残余物。合并产物级分，并浓缩。从二噁烷低压冻干以后，得到170mg(理论值的68％)Boc-保护的中间体。
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；m／z=940(M+H)+。
将170mg该中间体用3ml三氟乙酸在30ml二氯甲烷中的溶液处理30min，以除去Boc保护基。然后，在真空中浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物，得到155mg(理论值的86％)去保护的N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺中间体。
HPLC(方法12)：Rt=1.85min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=840(M+H)+。
然后使用50mg(0.052mmol)该中间体，与中间体97的制备类似地，在有氰基硼氢化钠存在下与(6-氧代己基)氨基甲酸苄酯反应，随后氢解除去Z保护基(用5％炭载钯作为催化剂，在作为溶剂的甲醇中)，得到标题化合物。
收率：21mg(理论值的37％)
HPLC(方法12)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.02min；MS(ESIpos)：m／z=1073(M+H)+。
中间体101
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003431
将26.7mg(24.87μmol)中间体100溶解在10ml甲醇中，并在标准氢压力下在钯／活性炭(5％)上氢化30min。滤出催化剂，并在真空中蒸发出溶剂。在已经在高真空下干燥残余物以后，得到22.5mg(理论值的96％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m／z=939(M+H)+。
中间体102
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(吗啉-4-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003441
与在中间体157中描述的制备类似地，从N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(吗啉-4-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼，制备该化合物。
收率：8mg(理论值的71％)
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=1094(M+H)+。
中间体103
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3R)-1-(苄基氨基)-3-羟基-1-氧代丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003451
与在中间体157中描述的制备类似地，从N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3R)-1-(苄基氨基)-3-羟基-1-氧代丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼，制备该化合物。
收率：3mg(理论值的22％)
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m／z=1069(M+H)+。
中间体104
N-{4-[(反式-4-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)氨基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003452
首先，如下从反式-4-氨基环己烷甲酸制备反式-4-氨基环己烷甲酸苄酯三氟乙酸盐：引入Boc保护基，然后引入苄基酯保护基，随后通过常规肽化学方法除去Boc保护基。
然后将15mg(18μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在5ml二甲基甲酰胺中，随后与13mg(35μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、9μlN，N-二异丙基乙胺和15mg(44μmol)反式-4-氨基环己烷甲酸苄酯三氟乙酸盐混合。将混合物在室温搅拌1h，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。合并对应的级分，并在真空中蒸发出溶剂。在已经在高真空下干燥残余物以后，得到14.7mg(理论值的78％)受保护的中间体，为无色泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m／z=1072(M+H)+。
从该受保护的中间体，首先通过氢解方式除去苄基酯，并以定量收率得到游离羧基组分。将14mg(14μmol；1当量)去保护的化合物溶解于5mlDMF中，并在有4.1mg(21μmol；1.5当量)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、7.5μl(44μmol；3.1当量)N，N-二异丙基乙胺和0.9mg(7μmol；0.5当量)4-二甲基氨基吡啶存在下与3.3mg(29μmol；2.1当量)N-羟基琥珀酰亚胺混合，并将混合物在室温搅拌过夜。然后，加入另外10当量的N-羟基琥珀酰亚胺、5当量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5当量的N，N-二异丙基乙胺和0.5当量的4-二甲基氨基吡啶，并将反应混合物在超声浴中处理5h。随后，蒸发出溶剂，借助于制备型HPLC纯化残余物，合并对应的级分，并浓缩。从二噁烷低压冻干残余物以后，得到9.7mg(理论值的62％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=1078(M+H)+。
中间体105
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003471
与在中间体157中描述的制备类似地，从4-{[(2S)-1-{[(2S)-1-{[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基](甲基)氨基}-3-甲基丁-2-基]氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基](甲基)氨基}丁酸和商购可得的6-(2，5-氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼开始，制备该化合物。以42％收率，得到酯中间体。在第二步中，用三氟乙酸叔丁基酯裂解6mg(6μmol)该中间体。HPLC纯化以后，得到3.4mg(理论值的48％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.66min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.04min；MS(ESIpos)：m／z=1025(M+H)+。
中间体106
N-[6-(2，5-氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003472
将14mg(16μmol)N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体88)溶解于750μl二噁烷中，并与1.5ml饱和碳酸氢钠溶液混合，然后与3.2mg(21μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯混合。将反应混合物在室温搅拌1h，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到5.5mg(理论值的36％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m／z=949(M+H)+。
中间体107
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003481
将38mg(47μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在37ml DMF中，然后与71mg(187μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、33μlN，N-二异丙基乙胺和37mg(140μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌1h。这之后，在高真空下浓缩，并借助于制备型HPLC纯化剩余的残余物。从而得到12.2mg(理论值的26％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=1020(M+H)+。
中间体108
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-{(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-[(2S)-2-{(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基}吡咯烷-1-基]-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基}-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003491
与中间体107类似地制备所述化合物。
收率：2.5mg(理论值的30％)
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m／z=981(M+H)+。
中间体109
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003492
与中间体107类似地，从中间体92的化合物制备所述化合物。
收率：35mg(理论值的65％)
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m／z=1011(M+H)+。
中间体110
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与中间体147类似地，从中间体83的化合物制备所述化合物。
收率：2.4mg(理论值的24％)
HPLC(方法6)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=981(M+H)+。
中间体111
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-1-甲基肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003502
与中间体140类似地，从中间体82和中间体22制备所述化合物。
收率：6.5mg(理论值的51％)
HPLC(方法6)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=4.71min；MS(ESIpos)：m／z=1077(M+H)+。
中间体112
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-氨甲酰基-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003511
与中间体157类似地，从中间体81的化合物制备所述化合物。
收率：5.7mg(理论值的57％)
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=1036(M+H)+。
中间体113
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003512
将95mg(104μmol)4-{[(2S)-1-{[(2S)-1-{[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基](甲基)氨基}-3-甲基丁-2-基]氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基](甲基)氨基}丁酸溶解在DMF中，然后与79.5mg(209μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、73μlN，N-二异丙基乙胺和68mg(261μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌2h。这之后，在高真空下浓缩，并借助于制备型HPLC纯化剩余的残余物。从而得到104mg(理论值的89％)标题化合物的叔丁基酯，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m／z=1121(M+H)+。
将中间体溶解于33.4ml二氯甲烷中，加入17ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌1h。随后，在真空中浓缩反应混合物，并通过制备型HPLC纯化残余物。
从而得到61mg(理论值的62％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1064(M+H)+。
中间体114
N-[6-({[2-(2，5-氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨甲酰基}氨基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003521
将5mg(5μmol)N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解于885μlDMF中，并与5.3mg(8μmol)2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基氨基甲酸-4-硝基苯酯和2.8μl N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌2h，然后浓缩至干燥。借助于制备型HPLC纯化残余物。
收率：0.58mg(理论值的11％)无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m／z=1035(M+H)+。
中间体115
N-{4-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与中间体147中的化合物类似地，从8mg(9μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺开始，制备该化合物。浓缩后，借助于制备型HPLC纯化活化的酯，并且，在真空中除去溶剂以后，立即与抗体反应。
收率：3mg(理论值的27％)(水解敏感的)
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=996(M+H)+。
中间体116
N-{4-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与中间体147中的化合物类似地，从5mg(6μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺开始，制备该化合物。浓缩后，借助于制备型HPLC纯化活化的酯，并且，在真空中除去溶剂以后，立即与抗体反应。
收率：3.2mg(理论值的43％)(水解敏感的)
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m／z=984(M+H)+。
中间体117
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003541
与中间体157类似地，从中间体86的化合物制备所述化合物。
收率：7mg(理论值的42％)
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=1081(M+H)+。
中间体118
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2R)-1-(苄氧基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003551
与中间体157类似地，从7mg(7.8μmol)中间体68中的化合物制备目标化合物。收率：6.3mg(理论值的53％)
LC-MS(方法1)：Rt=1.00min；MS(ESIpos)：m／z=1102(M+H)+。
中间体119
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003552
与中间体157类似地，使7.4mg(8.1mmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和6.3mg(24.2mmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼盐酸盐偶联，并后处理。得到1.6mg(理论值的13％)作为固体的标题化合物。
LC-MS(方法11)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m／z=1126(M+H)+
中间体120
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与中间体157类似地，使12.8mg(13.9mmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1R)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和10.9mg(41.8mmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼盐酸盐偶联，并后处理。得到10.8mg(理论值的59％)作为固体的标题化合物。
LC-MS(方法11)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m／z=1126(M+H)+
中间体121
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003562
与中间体157类似地，使7.4mg(7.9mmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基磺酰基)-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和6.2mg(23.5mmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼盐酸盐偶联，并后处理。得到6.9mg(理论值的74％)作为固体的标题化合物。
LC-MS(方法11)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=1150(M+H)+
中间体122
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3E)-1，4-二苯基丁-3-烯-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003571
与中间体157类似地，使8mg(9.1mmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3E)-1，4-二苯基丁-3-烯-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和7.2mg(27.4mmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼盐酸盐偶联，并后处理。得到8.2mg(理论值的82％)作为白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法11)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m／z=1083(M+H)+
中间体123
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003572
将30mg(30μmol)中间体89溶解于2ml1，4-二噁烷中，并与4ml饱和碳酸氢钠溶液混合，然后与7.5mg(50μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯混合。将反应混合物在室温搅拌1h，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到24mg(理论值的74％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m／z=1006(M+H)+。
中间体124
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003581
使22mg(20μmol)中间体123与4ml三氟乙酸在8ml二氯甲烷中在室温反应1h。此后，在真空中浓缩反应混合物。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到11mg(理论值的54％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；LC-MS(方法11)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=950(M+H)+。
中间体125
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S0-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003582
将22.5mg(20μmol)中间体101溶解于2ml1：1二噁烷／水中，然后与5.6mg(40μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯和与0.25ml饱和碳酸氢钠溶液混合。将反应混合物在室温搅拌30min。然后，加入另外0.25ml饱和碳酸氢钠溶液，并将反应混合物在室温搅拌另外15min，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到12.8mg(理论值的50％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m／z=1019(M+H)+。
中间体126
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003591
将64mg(70μmol)N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体97)溶解于3ml1：1二噁烷／水中，然后用4ml饱和碳酸氢钠溶液调节至pH9，随后与16.3mg(110μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯混合。将反应混合物在室温搅拌1h，然后在真空中浓缩。然后，加入另外8mg(55μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯，并将反应混合物再次调至pH9，并在室温搅拌另外1小时。这之后进行浓缩，并借助于制备型HPLC纯化剩余的残余物。最初得到31mg仍未环化的中间体。将27mg该中间体再次溶解于2ml1：1二噁烷／水中，然后与250μl饱和碳酸氢钠溶液混合。在室温搅拌2小时以后，浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物。低压冻干以后，得到20mg(理论值的29％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.96min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m／z=992(M+H)+。
中间体127
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003601
将17mg(18μmol)N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体98)溶解在2.8ml二氯甲烷中，并与20mg(174mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮混合，然后与10mg(52μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.21mg(0.17μmol)DMAP混合。在室温搅拌4h以后，在真空中浓缩反应混合物。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到8.2mg(理论值的43％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m／z=1071(M+H)+。
中间体128
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003611
将5mg(5.6μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在845μlDMF中，然后与3.2mg(17μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.6mg(17μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、1.96μl N，N-二异丙基乙胺和5.9mg(22.5μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到2.2mg(理论值的36％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m／z=1094(M+H)+。
中间体129
N-(6-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003612
将4mg(4.3μmol)N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在646μlDMF中，然后与2.5mg(13μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.0mg(13μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、2.25μl N，N-二异丙基乙胺和4.5mg(17μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌3h，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到1.9mg(理论值的39％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.9min；MS(ESIpos)：m／z=1134(M+H)+。
中间体130
N-(4-{[(2R)-1-({5-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}氨基)丙烷-2-基]氧基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003621
将10.5mg(11.7μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在3.7ml二氯甲烷中，然后与6.7mg(35μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.7mg(5.8μmol)4-二甲基氨基吡啶和8.2mg(47μmol)商购可得的[(2R)-2-羟丙基]氨基甲酸叔丁酯混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到7.5mg(理论值的61％)Boc-保护的中间体，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m／z=1056(M+H)+。
随后，用三氟乙酸除去Boc保护基。然后将4.9mg(0.005mmol)去保护的粗产物不经进一步纯化溶解于1.8ml二氯甲烷中，并与3.7mg(0.011mmol)1，1′-[(1，5-二氧代戊烷-1，5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2，5-二酮、2.4μl(0.014mmol)N，N-二异丙基乙胺和0.6mg(5μmol)4-二甲基氨基吡啶混合。将混合物在室温搅拌2h，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到0.77mg(理论值的15％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m／z=1167(M+H)+。
中间体131
N-{4-[(1-{5-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}哌啶-4-基)氧基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003631
将10mg(11μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在2ml二氯甲烷中，然后与4.3mg(22μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.88mg(6μmol)4-二甲基氨基吡啶和5.2mg(22μmol)商购可得的4-羟基哌啶-1-甲酸苄酯混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到5mg(理论值的40％)1-保护的中间体，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.04min；MS(ESIpos)：m／z=1116(M+H)+。
随后，通过在钯／活性炭上在乙醇中的氢解方式，除去Z保护基。然后将4.6mg(0.005mmol)去保护的粗产物不经进一步纯化溶解于1.8ml二氯甲烷中，并与3.8mg(0.012mmol)1，1′-[(1，5-二氧代戊烷-1，5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2，5-二酮、0.8μl(0.005mmol)N，N-二异丙基乙胺和0.6mg(5μmol)4-二甲基氨基吡啶混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到0.96mg(理论值的16％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=1193(M+H)+。
中间体132
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003641
将15mg(16.7μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在2500μlDMF中，然后与9.6mg(50μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、7.6mg(50μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、5.8μl N，N-二异丙基乙胺和17.4mg(67μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到11.2mg(理论值的52％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m／z=1106(M+H)+。
中间体133
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003651
将5.8mg(6.3μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在943μl DMF中，然后与3.6mg(19μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.9mg(19μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、2.2μl N，N-二异丙基乙胺和6.6mg(25μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到4.5mg(理论值的64％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m／z=1129(M+H)+。
中间体134
N-[3-({[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨甲酰基}氨基)丙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
首先，在标准条件下，从商购可得的1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮三氟乙酸盐和氯碳酸-4-硝基苯酯开始，制备2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基氨基甲酸-4-硝基苯酯。
将5mg(6μmol)N-(3-氨基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在1000μl DMF中，然后与2μl N，N-二异丙基乙胺和2.2mg(9μmol)[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酸-4-硝基苯酯混合。将混合物在室温搅拌1h，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到1.6mg(理论值的23％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m／z=1036(M+H)+。
中间体135
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003671
将10mg(11μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在4000μlDMF中，然后与6.3mg(33μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4.5mg(33μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、5.7μl N，N-二异丙基乙胺和11.5mg(44μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到2.6mg(理论值的14％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m／z=1115(M+H)+。
中间体136
N-(4-{4-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基]哌嗪-1-基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003672
首先，在标准条件下，从哌嗪-1-甲酸叔丁酯和4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸开始，经2个阶段制备1-[4-氧代-4-(哌嗪-1-基)丁基]-1H-吡咯-2，5-二酮三氟乙酸盐。
将5mg(5.6μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在1000μlDMF中，然后与2.1mg(11μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.7mg(11μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、2μlN，N-二异丙基乙胺和3.5mg(5.6μmol)1-[4-氧代-4-(哌嗪-1-基)丁基]-1H-吡咯-2，5-二酮三氟乙酸盐混合。将混合物在室温搅拌过夜。然后，加入2.1mg(5.6μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，并将反应混合物在室温搅拌另外3h。随后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。浓缩对应的级分，并且，通过从水低压冻干，得到0.6mg(理论值的10％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m／z=1132(M+H)+。
中间体137
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-1-甲基肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003681
首先，在标准条件下，从商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸和1-甲基肼甲酸叔丁酯开始，经2个阶段制备6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N′-甲基己烷酰肼三氟乙酸盐。
将6.9mg(8μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在2540μlDMF中，然后与3.6mg(9μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、3μl N，N-二异丙基乙胺和4.1mg(12μmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N′-甲基己烷酰肼三氟乙酸盐混合。将混合物在室温搅拌过夜。随后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到3.9mg(理论值的45％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m／z=1108(M+H)+。
中间体138
N-{4-[(2-{[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
首先从2-(甲基氨基)乙基氨基甲酸叔丁基甲酯和4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸开始，经2个阶段，制备4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基-N-[2-(甲基氨基)乙基]丁酰胺三氟乙酸盐。
将6.6mg(7.3μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在2000μl DMF中，然后与5.6mg(14.7μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、2.6μl N，N-二异丙基乙胺和4.1mg(9μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基-N-[2-(甲基氨基)乙基]丁酰胺三氟乙酸盐混合。在室温搅拌3h以后，再次加入相同量的HATU和N，N-二异丙基乙胺，然后将反应混合物在室温搅拌过夜。随后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到4mg(理论值的44％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m／z=1134(M+H)+。
中间体139
(3R，4S，7S，10S)-4-[(2S)-丁-2-基]-7，10-二异丙基-3-(2-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5，11-二甲基-6，9-二氧代-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酸-(2R，3S)-3-氨基-4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁-2-基酯
将13mg(14.7μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在10ml二氯甲烷中，然后与8.4mg(44μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5.4mg(44μmol)4-二甲基氨基吡啶和9mg(29.3μmol)商购可得的N-(叔丁氧基羰基)-L-苏氨酸苄酯混合。将混合物在室温搅拌5h。随后，通过与水和有机相一起摇动，将反应混合物萃取2次，经硫酸钠干燥，并在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从二噁烷／水低压冻干以后，得到14mg(理论值的81％)受保护的中间体，为无色泡沫。
HPLC(方法12)：Rt=2.3min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m／z=1178(M+H)+。
随后，通过在10％钯／活性炭上在甲醇中的氢解方式，除去Z保护基。然后将9.5mg(0.0087mmol)去保护的粗产物不经进一步纯化溶解于5mlDMF中，并与5mg(26.2μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4mg(26.2μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、54.6μl N，N-二异丙基乙胺和9.1mg(34.9μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌1h，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从二噁烷低压冻干以后，得到9.5mg(理论值的84％)Boc-保护的中间体。
HPLC(方法12)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m／z=1295(M+H)+。
随后，用0.5ml三氟乙酸在2ml二氯甲烷中的溶液，将9.5mg(7.3μmol)Boc-保护的中间体去保护，从二噁烷低压冻干以后，得到9mg(理论值的82％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法12)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m／z=1195(M+H)+。
中间体140
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-1-甲基肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003711
将4.1mg(12μmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N′-甲基己烷酰肼三氟乙酸盐(中间体22)与6.9mg(8μmol)得自中间体61的化合物一起溶解在2.5ml DMF中，然后与3.5mg(9μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和3μl N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从二噁烷低压冻干以后，得到2.6mg(理论值的30％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LCMS(方法1)：Rt=0.90和0.91min；MS(ESIpos)：m／z=1120(M+H)+。
中间体141
N-[4-({1-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基]哌啶-4-基}氧基)-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003721
将44mg(49μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在2ml二氯甲烷中，然后与18.8mg(98μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、3.8mg(24μmol)4-二甲基氨基吡啶和23mg(98μmol)商购可得的4-羟基哌啶-1-甲酸苄酯混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到22mg(理论值的40％)Z-保护的中间体，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.04min；MS(ESIpos)：m／z=1116(M+H)+。
随后，通过在钯／活性炭上在乙醇中的氢解方式，除去Z保护基。
然后将19mg(19μmol)去保护的粗产物不经进一步纯化溶解于4mlDMF中，并与7mg(39μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸、11mg(29μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和5μlN，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌1h，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从二噁烷低压冻干以后，得到7.5mg(理论值的34％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=1147(M+H)+。
中间体142
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003731
将9mg(9.5μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体72)溶解在1000μlDMF中，然后与10mg(38μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼、7.2mg(19μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和8μl N，N-二异丙基乙胺混合，并将反应混合物在室温搅拌1h。随后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。浓缩对应的级分，并通过低压冻干法得到6.4mg(理论值的58％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m／z=1154(M+H)+。
中间体143
N-(4-{2-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003741
与中间体142类似地，使6mg(6.7μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体61)与3mg(8.7μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁烷酰肼三氟乙酸盐反应，得到2mg(理论值的27％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法3)：Rt=1.92min；MS(ESIpos)：m／z=1106(M+H)+。
中间体144
N-(4-{2-[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003751
向5mg(5.6μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺在1ml DMF中的溶液中，加入7.65mg(22.5μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁烷酰肼三氟乙酸盐、3.2mg(16.9μmol)EDC、1.96μl(11.3μmol)二异丙基乙胺和2.6mg(16.9μmol)HOBT。将反应混合物在室温搅拌3h。随后，加入另外0.95mg(2.8μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，2-二甲基丁烷酰肼三氟乙酸盐。搅拌过夜后，浓缩反应混合物，并通过制备型HPLC进行纯化。得到3.5mg(85％纯度，理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=1.86min；m／z=1094(M+H)+。
中间体145
N-[3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将12mg(14μmol)N-(3-氨基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体66)溶解于750μl二噁烷中，并与1.5ml饱和碳酸氢钠溶液混合，然后与3.2mg(21μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯混合。将反应混合物在室温搅拌1h，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到4.2mg(理论值的32％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=950(M+H)+。
中间体146
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-({(2S)-1-[苄基(甲基)氨基]-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003761
与中间体133类似地，使9mg(9.8μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-({(2S)-1-[苄基(甲基)氨基]-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基}氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体73)与10mg(39μmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼反应，得到1.8mg(理论值的15％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法9)：Rt=5.11min；MS(ESIpos)：m／z=1128(M+H)+。
中间体147
N-{4-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003771
将16mg(17μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S，3S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体70)溶解在2ml二氯甲烷中，并与2.6mg(23mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮混合，然后与4mg(21μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合。在室温搅拌2h以后，再次加入相同量的1-羟基吡咯烷-2，5-二酮和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。然后，在室温搅拌过夜，在真空中浓缩反应混合物。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到10mg(理论值的56％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=2.0min；
中间体148
N-{4-[(2-{[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基](甲基)氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003781
将6mg(7μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体61)与2.8mg(8μmol)N-(2-氨基乙基)-4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基丁酰胺三氟乙酸盐、10.1mg(27μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和5μl N，N-二异丙基乙胺在2ml DMF中混合，并在室温搅拌过夜。然后，加入另外5mg(23.5μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和3μl N，N-二异丙基乙胺。在室温搅拌另外5h以后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。浓缩对应的级分，并通过从二噁烷低压冻干，得到1.3mg(理论值的15％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m／z=1120(M+H)+。
中间体149
N-{4-[(2-{[4-(2，5-二.氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基]氨基}乙基)(甲基)氨基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003782
将6mg(7μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体61)与3.1mg(9μmol)4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[2-(甲基氨基)乙基]丁酰胺三氟乙酸盐、10.1mg(27μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐和5μl N,N-二异丙基乙胺在2ml DMF中混合，并将混合物在室温搅拌4h。然后，在真空中除去溶剂，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。浓缩对应的级分，并通过从二噁烷低压冻干，得到1mg(理论值的13.4％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m／z=1121(M+H)+。
中间体150
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S，2R)-2-苯基-1-(丙基氨甲酰基)环丙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003791
将7.9mg(9μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S，2R)-2-苯基-1-(丙基氨甲酰基)环丙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在3ml DMF中，然后与10.4mg(54μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、8.3mg(54μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、9μl N，N-二异丙基乙胺和9.5mg(36μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到4.3mg(理论值的22％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.93min；MS(ESIpos)：m／z=1078(M+H)+。
中间体151
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-氨甲酰基-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003801
与中间体150类似地，从中间体81中的化合物开始，制备所述化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=1036(M+H)+。
中间体152
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-(乙氧基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003802
将10mg(12μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-(乙氧基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在3ml DMF中，然后与8.9mg(23μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、10μlN，N-二异丙基乙胺和12mg(47μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将混合物在室温搅拌1h。这之后，在高真空下浓缩，并借助于制备型HPLC纯化剩余的残余物。从而得到5.8mg(理论值的37％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.99min；MS(ESIpos)：m／z=1066(M+H)+。
中间体153
N-[1-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-12，15-二氧代-3，6，9-三氧杂-13，14-二氮杂十八烷-18-基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003811
向5mg(5.6μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺在1ml DMF中的溶液中，加入9.7mg(22.5μmol)3-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙烷酰肼三氟乙酸盐、3.2mg(16.9μmol)EDC、1.96μl(11.3μmol)N，N-二异丙基乙胺和2.6mg(16.9μmol)HOBT。将反应混合物在室温搅拌3h。随后，加入另外1.2mg(2.8μmol)3-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙烷酰肼三氟乙酸盐。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后通过制备型HPLC进行纯化。
得到3.6mg(理论值的51％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；m／z=1185(M+H)+。
中间体154
(3R，4S，7S，10S)-4-[(2S)-丁-2-基]-7，10-二异丙基-3-(2-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5，11-二甲基-6，9-二氧代-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酸-(2R，3S)-3-氨基-4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁-2-基酯
Figure BDA0000432948840003821
将15mg(17μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在10ml二氯甲烷中，然后与12.8mg(67μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、10mg(83μmol)4-二甲基氨基吡啶和10.3mg(33μmol)商购可得的N-(叔丁氧基羰基)-L-苏氨酸苄酯混合。将混合物加热至回流保持4h。然后，再次加入相同量的偶联剂和4-二甲基氨基吡啶，并将反应混合物在回流下加热过夜。随后，用二氯甲烷稀释反应混合物，并通过与水一起摇动1次进行萃取，取出有机相，并在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到7.7mg(理论值的37％)受保护的中间体，为无色泡沫。
HPLC(方法12)：Rt=2.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m／z=1190(M+H)+。
随后，通过在标准氢压力下在10％钯／活性炭上在甲醇中氢化，除去苄基酯保护基，如在中间体151中所述，将如此得到酸与6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼偶联。在最后一步中，用三氟乙酸除去Boc保护基。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从而得到0.22mg(理论值的2.5％，经3个阶段)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m／z=1207(M+H)+。
中间体155
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003831
与在中间体152中描述的制备类似地，从N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼制备该化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m／z=1024(M+H)+。
中间体156
N-(3-{[(1-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环丙基)羰基]氨基}丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003841
与在中间体131的最后阶段中描述的制备类似地，从N-(3-氨基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和1，1′-[环丙烷-1，1-二基双(碳酰氧基)]二吡咯烷-2，5-二酮(其已经预先从对应的二羧酸得到)制备该化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m／z=1080(M+H)+。
中间体157
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003842
将15mg(18μmol)(N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在3.8ml DMF中，然后与27mg(70μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、12μlN，N-二异丙基乙胺和14mg(53μmol)商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼混合。将反应混合物在室温搅拌1h。这之后，在高真空下浓缩，并借助于制备型HPLC纯化剩余的残余物。从而得到6.2mg(理论值的33％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=1063(M+H)+。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，特征信号)：δ=10.8(d，1H)，9.8-9.7(m，2H)，9.6和9.4(2m，1H)，8.9，8.88，8.78和8.75(4d，1H)，8.08和7.85(2d，1H)，7.6-6.9(m，9H)，4.7-4.4(m，3H)，3.4(t，2H)，3.23，3.2，3.18，3.0，和2.99(5s，9H)，2.8(m，3H)，2.1(t，2H)，1.06和1.01(2d，3H)，0.95-0.8(m，15H)，0.8-0.75(dd，3H)。
中间体158
N-[4-({(2R)-1-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基}氨基)-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003851
将13mg(14.7μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在4ml二甲基甲酰胺中，然后与9.4mg(25μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、6μl N，N-二异丙基乙胺和7mg(31μmol)商购可得的D-亮氨酸叔丁酯盐酸盐混合。将混合物在室温搅拌5h，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从二噁烷／水低压冻干以后，得到6.5mg(理论值的49％)受保护的中间体，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m／z=1076(M+H)+。
首先使用三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液从该受保护的中间体除去Boc保护基，得到6.2mg(理论值的99％)去保护的化合物。将5.2mg(5μmol)该中间体溶解于1.5ml二氯甲烷中，并在有1.2mg(6μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.16mg(1μmol)4-二甲基氨基吡啶存在下与0.8mg(7μmol)N-羟基琥珀酰亚胺反应。在室温搅拌2h以后，浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC进行纯化。得到1.3mg标题化合物，将其中的一些水解为浸提物。
中间体159
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003861
与在中间体157中描述的制备类似地，从N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼，制备该化合物。
收率：6mg(理论值的53％)
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=1114(M+H)+。
中间体160
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003871
与在中间体157中描述的制备类似地，从20mg(21μμmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼，制备该化合物。
收率：13mg(理论值的52％)
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m／z=1153(M+H)+。
中间体161
N-(6-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003872
与在中间体157中描述的制备类似地，从N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼，制备该化合物。
收率：0.8mg(理论值的16％)
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m／z=1092(M+H)+。
中间体162
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003881
将18mg(20μmol)N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体64)溶解在3.2ml二氯甲烷中，并与22mg(190mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮混合，然后与11mg(60μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.24mg(0.17μmol)DMAP混合。在室温搅拌2h以后，加入另外22mg(190mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮、11mg(60μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.24mg(0.17μmol)DMAP，并将反应混合物在室温搅拌另外1小时。这之后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到8.2mg(理论值的41％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m／z=1024(M+H)+。
中间体163
[(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙基](1，4-二氢-3H-2，3-苯并噁嗪-3-基)甲酮三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003891
首先，与文献方法(参见H.King，J.Chem.Soc.1942，432)类似地，从265mg(0.82mmol)(1S，2R)-1-(羟基氨甲酰基)-2-苯基环丙基氨基甲酸叔丁酯(起始化合物7)开始，通过与1，2-双(溴甲基)苯反应，制备Boc-保护的中间体[(1S，2R)-1-(1，4-二氢-3H-2，3-苯并噁嗪-3-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基甲酸叔丁酯。
收率：108mg(理论值的34％)
LC-MS(方法2)：Rt=1.3min；MS(ESIpos)：m／z=395(M+H)+。
将108mg(0.27mmol)该中间体溶解于3.7ml二氯甲烷中，加入1.8ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌15min。这之后在真空中浓缩，并从二噁烷中低压冻干剩余的残余物。以定量收率得到112mg标题化合物，为无色泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=0.7min；MS(ESIpos)：m／z=295(M+H)+。
中间体164
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-(1，4-二氢-3H-2，3-苯并噁嗪-3-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003901
将166mg(0.196mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体10)溶解于40ml DMF中，并接连地与80mg(0.196mmol)[(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙基](1，4-二氢-3H-2，3-苯并噁嗪-3-基)甲酮三氟乙酸盐(中间体163)、112mg(0.294mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和682μl(3.9mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。随后将混合物在室温搅拌过夜。然后在真空中浓缩反应混合物，将残余物溶解于乙酸乙酯中，并用饱和氯化钠水溶液洗涤溶液。有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。最后通过制备型HPLC纯化残余物。以此方式，得到19mg(理论值的9％)Fmoc-保护的中间体N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-(1，4-二氢-3H-2，3-苯并噁嗪-3-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
HPLC(方法5)：Rt=1.68min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.51min；MS(ESIpos)：m／z=1083(M+H)+。
将19mg(0.015mmol)该中间体溶解在4ml DMF中。加入817μl哌啶以后，将反应混合物在室温搅拌5min。这之后在真空中浓缩，并首先用二乙基醚消化残余物，然后借助于制备型HPLC(洗脱液：乙腈+0.1％TFA／0.1％水溶液TFA)进行纯化。合并对应的级分，在真空中除去溶剂，然后将残余物从二噁烷／水低压冻干。得到12mg(理论值的92％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=861(M+H)+。
中间体165
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-(1，4-二氢-3H-2，3-苯并噁嗪-3-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
使用20mg(0.021mmol)中间体164，与中间体97的制备类似地，在有氰基硼氢化钠存在下与(6-氧代己基)氨基甲酸苄酯反应，随后氢解除去Z保护基(用5％炭载钯作为催化剂，在作为溶剂的甲醇中)，以制备标题化合物。
收率：4.5mg(理论值的23％，经2个阶段)
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m／z=960(M+H)+。
中间体166
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-(1，4-二氢-3H-2，3-苯并噁嗪-3-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003921
将4.4mg(4.5μmol)中间体165溶解于1ml1：1二噁烷／水中，然后与1mg(6.8μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯和50μl饱和碳酸氢钠水溶液混合。将反应混合物在室温搅拌30min。然后，加入另外50μl饱和碳酸氢钠水溶液，并将反应混合物在室温搅拌另外15min，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。低压冻干以后，得到1mg(理论值的21％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法12)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m／z=1040(M+H)+。
中间体167
3-{2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸苄酯
Figure BDA0000432948840003922
如下从6g(21.55mmol)商购可得的3-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸制备标题化合物：首先在标准条件下，用苄基氯和碳酸铯进行酯化，随后用三氧化硫-吡啶复合物进行氧化。
收率：611mg(理论值的10％，经2个阶段)
LC-MS(方法2)：Rt=1.69min；MS(ESIpos)：m／z=311(M+H)+。
中间体168
N-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003931
首先，与在中间体69中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，NμlN′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)和Nα-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-色氨酰胺三氟乙酸盐(中间体49)偶联，并随后借助于哌啶除去Fmoc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。
将25mg(0.028mmol)该化合物和17.5mg(0.06mmol)中间体167在2ml甲醇中混合，并与12.6mg(0.14mmol)硼烷-吡啶复合物和2.5ml乙酸混合。将反应混合物在室温搅拌过夜。然后，再次加入相同量的硼烷-吡啶复合物和乙酸，并将反应混合物在室温搅拌另外24h。这之后在真空中浓缩，并借助于制备型HPLC纯化残余物。浓缩对应的级分和从1：1二噁烷／水低压冻干以后，得到26.5mg(理论值的88％)Z-保护的标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.04min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m／z=1064(M+H)+。
将25mg(0.024mmol)该中间体溶解于10ml甲醇中，并在10％活性炭载钯上在标准氢压力下在室温氢化45min。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。从二噁烷低压冻干以后，得到19.7mg(理论值的85％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m／z=974(M+H)+。
中间体169
N-{2-[2-(2-{3-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003941
将10mg(10μmol)中间体168溶解在3ml DMF中，并与3.5mg(30mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮混合，然后与2.4mg(10μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5μl N，N-二异丙基乙胺混合。在室温搅拌20h以后，加入8mg(0.02mmol)HATU，并将反应混合物再次在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从二噁烷低压冻干以后，得到8.6mg(理论值的64％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m／z=1071(M+H)+。
中间体170
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003942
与中间体101类似地，从26mg(0.028mmol)中间体15开始，经2个阶段制备所述化合物。
收率：16.7mg(理论值的63％，经2个阶段)
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m／z=914(M+H)+。
中间体171
N-(6-{[4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基]氨基}己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003951
将6.7mg(7.3μmol)从中间体170形成的化合物和3mg(14.7μmol)商购可得的4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸溶解于2ml DMF中，并与5.6mg(14.7μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和2μl N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌30min。浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物。合并对应的级分，在真空中除去溶剂，然后将残余物从二噁烷低压冻干。从而得到4.5mg(理论值的56％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m／z=1079(M+H)+。
中间体172
2-{2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酸苄酯
Figure BDA0000432948840003952
如下从商购可得的2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙醇，制备标题化合物：首先在标准条件下引入Z保护基，然后用三氧化硫-吡啶复合物氧化。
HPLC(方法12)：Rt=1.4min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.65min；MS(ESIpos)：m／z=326(M+H)+。
中间体173
{2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]乙基氨基甲酸苄酯
Figure BDA0000432948840003961
与中间体172类似地，如下从商购可得的2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇制备标题化合物：首先在标准条件下引入Z保护基，然后用三氧化硫-吡啶复合物氧化。
HPLC(方法12)：Rt=1.3min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.68min；MS(ESIpos)：m／z=282(M+H)+。
中间体174
N-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与中间体167的制备类似地，在有硼烷-吡啶复合物存在下，用2-{2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基氨基甲酸苄酯对47mg(0.05mmol)中间体16还原胺化。随后，用5％炭载钯作为催化剂和在作为溶剂的甲醇中，通过氢解方式除去Z保护基，并制备38mg(理论值的66％，经2个阶段)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.8min；MS(ESIpos)：m／z=988(M+H)+。
中间体175
N-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与中间体166类似地，从34mg(0.03mmol)中间体174开始，进行制备。
收率：8.3mg(理论值的23％)
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m／z=1068(M+H)+。
中间体176
N-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003972
如下进行制备：与中间体174和175类似地，从用中间体173还原胺化中间体16开始，随后去保护和形成马来酰亚胺。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.8min；MS(ESIpos)：m／z=981(M+H)+。
中间体177
N-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003981
如下进行制备：与中间体174和175类似地，从用中间体172还原胺化中间体16开始，随后去保护和形成马来酰亚胺。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1025(M+H)+。
中间体178
N-{4-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840003982
与中间体162类似地，从6mg中间体82开始，进行制备。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m／z=953(M+H)+。
中间体179
4-[(1E，3S)-3-氨基-4-苯基丁-1-烯-1-基]苯磺酸三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840003991
将13.6mg(0.06mmol)乙酸钯(II)、469mg(1.46mmol)4-碘苯磺酸钾、300mg(1.21mmol)1-苯基丁-3-烯-2-基氨基甲酸-(S)-叔丁酯、16.5mg(0.12mmol)苯基脲和167.6mg(1.21mmol)碳酸钾在7.5ml DMF中的混合物在微波中加热至160℃保持15min。随后通过制备型HPLC直接纯化粗产物。得到312mg31％的BOC-保护的化合物和69％的游离胺的混合物。
随后将该混合物溶解于30ml二氯甲烷中，与1ml三氟乙酸混合，并在室温搅拌20h。在真空中浓缩以后，将残余物与二乙基醚一起搅拌，并抽滤出形成的沉淀物，用二乙基醚洗涤。得到200mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法11)：Rt=0.44min；MS(ESIpos)：m／z=304(M+H)+。
中间体180
4-[(3R)-3-氨基-4-苯基丁基]苯磺酸
Figure BDA0000432948840003992
将100mg(0.25mmol)4-[(1E，3S)-3-氨基-4-苯基丁-1-烯-1-基]苯磺酸三氟乙酸盐悬浮于10ml乙酸以及几滴DMF和水中，与70mg(0.07mmol)炭载钯(10％)混合，并在2.2巴氢压力下氢化24h。过滤溶液，并通过制备型HPLC纯化滤液。
得到29mg(76％纯度，理论值的21％)产物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.46min；MS(ESIpos)：m／z=306(M+H)+。
中间体181
N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S，3E)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-3-烯-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004001
向90mg(0.13mmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺在4ml DMF中的溶液中，加入60mg(0.16mmol)HATU和69μl(0.39mmol)Hünig碱。将反应混合物在室温搅拌30min，然后与60mg(0.15mmol)60.3mg(0.13mmol)4-[(1E，3S)-3-氨基-4-苯基丁-1-烯-1-基]苯磺酸三氟乙酸盐混合。搅拌过夜后，通过制备型HPLC纯化反应混合物。得到127mg标题化合物和已经去保护的胺的44：56混合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m／z=971(M+H)+；Rt=0.84min；对于去保护的化合物，MS(ESIpos)：m／z=871(M+H)+。
中间体182
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S，3E)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-3-烯-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
将90mg中间体180溶解在4.6ml二氯甲烷中，并向其中加入0.92ml三氟乙酸。将反应混合物在室温搅拌30min，然后浓缩。通过制备型HPLC，纯化得到的粗产物。
得到91mg(理论值的98％)目标化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=871(M+H)+
中间体183
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S，3E)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-3-烯-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004012
首先将16.7μl(0.03mmol)15％琥珀醛水溶液提供在943μl甲醇中，并与17mg(0.02mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S，3E)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-3-烯-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体181)和1.1μl(0.02mmol)乙酸混合。将反应混合物在室温搅拌5min，然后加入2.9μl(0.02mmol)硼烷-吡啶复合物。1h以后，加入各自另外2当量的琥珀醛、乙酸和硼烷-吡啶复合物，并将混合物在室温搅拌20h。然后通过制备型HPLC纯化反应混合物。
得到20mg(83％纯度，理论值的80％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=957(M+H)+
中间体184
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S，3E)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-3-烯-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004021
将8mg(7.5μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S，3E)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-3-烯-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺、2.8mg(8.2μmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼三氟乙酸盐、3.4mg(9μmol)HATU和3.9μl Hünig碱在0.77ml DMF中在室温搅拌20h。随后，通过制备型HPLC纯化反应混合物。
得到3mg(理论值的31％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m／z=1164(M+H)+
中间体185
N-{4-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S，3E)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-3-烯-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
向8mg(7.5μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2S，3E)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-3-烯-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺在2ml DMF中的溶液中，加入8.6mg(74.8μmol)N-羟基琥珀酰亚胺、8.5mg(22.4μmol)EDCI和0.1mg(0.75μmol)DMAP。将反应混合物在室温搅拌20h。随后，加入1.3μl(7.5μmol)Hünig碱，并将混合物搅拌另外1h。然后通过制备型HPLC纯化反应混合物。得到2.6mg(72％纯度，理论值的21％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m／z=1054(M+H)+
中间体186
N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2R)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004041
向43mg(0.06mmol)N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺在1.9ml DMF中的溶液中，加入29mg(0.07mmol)HATU和33μl(0.19mmol)Hünig碱。将反应混合物在室温搅拌30min，然后与29mg(0.07mmol)4-[(3R)-3-氨基-4-苯基丁基]苯磺酸三氟乙酸盐混合。搅拌过夜后，通过制备型HPLC纯化反应混合物。得到58mg标题化合物和已经去保护的胺的45：55混合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m／z=973(M+H)+；Rt=0.87min；对于去保护的化合物，MS(ESIpos)：m／z=873(M+H)+。
中间体187
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2R)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004042
将58mg中间体186溶解在4.1ml二氯甲烷中，加入0.41ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。在真空中浓缩以后，通过制备型HPLC纯化粗产物。
得到50mg(90％纯度，理论值的85％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=873(M+H)+
中间体188
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2R)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004051
首先将171μl(0.26mmol)15％琥珀醛水溶液提供在2.5ml甲醇中，并与50mg(0.05mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2R)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐和11.6μl(0.2mmol)乙酸混合。将反应混合物在室温搅拌5min，然后加入30μl(0.24mmol)硼烷-吡啶复合物。搅拌24小时以后，加入另外等量的硼烷-吡啶复合物，并将混合物搅拌另外2h。然后通过制备型HPLC纯化反应混合物。
得到40mg(90％纯度，理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m／z=959(M+H)+
中间体189
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2R)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004061
将10mg(9.3μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2R)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺、3.5mg(10.3μmol)6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼三氟乙酸盐、4.3mg(11.2μmol)HATU和4.9μl(28μmol)Hünig碱在1ml DMF中在室温搅拌20h。随后，通过制备型HPLC纯化反应混合物。
得到4.2mg(92％纯度，理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m／z=1166(M+H)+
中间体190
N-{4-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2R)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004062
向10mg(9.3μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(2R)-1-苯基-4-(4-磺苯基)丁-2-基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺在2.5ml DMF中的溶液中，加入10.7mg(93μmol)N-羟基琥珀酰亚胺、10.6mg(28μmol)EDCI和0.12mg(0.9μmol)DMAP。将反应混合物在室温搅拌20h，然后通过制备型HPLC进行纯化。
得到3.8mg(72％纯度，理论值的25％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m／z=1055(M+H)+
中间体191
(2R，3R)-N-[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004071
与中间体7的制备类似地，从起始化合物1和(2S)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)丙烷-1-酮三氟乙酸盐(中间体99)开始，经2个阶段制备标题化合物。
2个阶段的收率：62mg(理论值的67％)
HPLC(方法6)：Rt=1.65min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.7min；MS(ESIpos)：m／z=443(M+H)+。
中间体192
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004081
将1015mg(1.59mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)溶解于50ml DMF中，与654mg(2.39mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)和2.8mlN，N-二异丙基乙胺混合，然后在室温搅拌10min。然后，加入1083mg(1.75mmol)(2R，3R)-N-[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐(中间体191)，然后将混合物在超声浴中在室温处理30min。然后将反应混合物在真空中浓缩，并将残余物溶解于300ml乙酸乙酯中。将有机相接连地用5％柠檬酸水溶液和5％碳酸氢钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将如此得到的粗产物(1684mg不经进一步纯化溶解于20ml乙腈中，向其中加入2ml哌啶，然后将反应混合物在室温搅拌10min。然后，将混合物在真空中浓缩，并将残余物与二乙基醚一起混合。通过再次蒸发来浓缩溶剂，并通过在硅胶上的快速色谱法(洗脱液：15：1：0.1->15：2：0.2二氯甲烷／甲醇／17％氨水溶液)纯化残余物。合并对应的级分，在真空中除去溶剂，并将残余物从乙腈／水低压冻干。从而得到895mg(67％，经2个阶段)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m／z=840(M+H)+。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ=10.8(d，1H)，8.3和8.05(2d，1H)，8.0(d，1H)，7.5(m，1H)，7.3(m，1H)，7.15和7.08(2s，1H)7.05-6.9(m，2H)，5.12和4.95(2m，1H)，4.65(m，1H)，4.55(m，1H)，4.1-3.8(m，4H)，3.75(d，1H)，3.23，3.18，3.17，3.12，2.95和2.88(6s，9H)，3.1-3.0和2.85(2m，2H)，2.65(d，1H)，2.4-2.2(m，3H)，2.15(m，3H)，1.95(br.m，2H)，1.85-0.8(br.m，11H)，1.08和1.04(2d，3H)，0.9-0.75(m，15H)，0.75-0.65(dd，3H)[其它信号被隐藏在H2O峰下]。
中间体193
N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004091
将50mg(0.052mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体192)和204μl15％的4-氧代丁酸水溶液在2ml甲醇中混合，并与23.4mg(0.252mmol)硼烷-吡啶复合物和6μl乙酸混合。将反应混合物在室温搅拌过夜。这之后在真空中浓缩，并借助于制备型HPLC纯化残余物。浓缩对应的级分以后，得到38mg(理论值的78％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法9)：Rt=4.7min；MS(ESIpos)：m／z=926(M+H)+。
中间体194
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004101
与在中间体157中描述的制备类似地，从10mg(11μmol)N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺和商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼，制备该化合物。
收率：4.4mg(理论值的35％)
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m／z=1133(M+H)+。
中间体195
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004102
与中间体166类似地，从9mg(0.010mmol)中间体170开始，制备所述化合物。
收率：1.1mg(理论值的10％)
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m／z=994(M+H)+。
中间体196
(2S)-2-氨基-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-3-苯基丙烷-1-酮三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004111
将41mg(0.37mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-苯基丙氨酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯溶解于10ml DMF中，并与149mg(0.41mmol)2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯(起始化合物6)和72μl(0.41mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌1h。然后在真空中除去溶剂，将残余物溶解于乙酸乙酯中，并通过与5％柠檬酸水溶液一起摇动，然后与5％碳酸氢钠水溶液一起摇动，进行萃取。浓缩有机相，并使用10：1甲苯／乙醇作为洗脱液，通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物。合并对应的级分，并在真空中除去溶剂。在已经在高真空下干燥残余物以后，如此得到69mg(理论值的47％)Boc-保护的中间体(2S)-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基氨基甲酸叔丁酯，为非对映异构体混合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.1min；MS(ESIpos)：m／z=359(M+H)+。
将64mg(0.18mmol)该中间体溶解于10ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌30min。这之后在真空中浓缩，并将剩余的残余物从水／二噁烷中低压冻干。以此方式，得到66mg(定量)标题化合物，为泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=1.45min；
LC-MS(方法3)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m／z=259(M+H)+。
中间体197
(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(2S)-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004121
首先，如下从83mg(0.18mmol)它的二环己胺盐中释放出(2R，3R)-3-[(2S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酸(起始化合物1)：将它溶解于乙酸乙酯中，并与5％硫酸氢钾溶液水溶液一起萃取摇动。有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物溶解于10ml DMF中，并接连地与66mg(0.18mmol)(2S)-2-氨基-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-3-苯基丙烷-1-酮三氟乙酸盐(中间体196)、101mg(0.266mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和93μl(0.53mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌30min。然后浓缩反应混合物，并通过制备型HPLC纯化残余物。得到52mg(理论值的56％)Boc-保护的中间体(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
HPLC(方法6)：Rt=2.13min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m／z=528(M+H)+。
将52mg(0.1mmol)该中间体溶解于10ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸，并将混合物在室温搅拌20min。这之后在真空中浓缩，并与20ml二乙基醚一起搅拌剩余的残余物。10min以后，过滤混合物，并在高真空下干燥滤渣。以此方式，得到39mg(理论值的72％)标题化合物。
HPLC(方法6)：Rt=1.62min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.68min；MS(ESIpos)：m／z=428(M+H)+。
中间体198
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
将44.5mg(0.071mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)溶解于10ml DMF中，并接连地与38.6mg(0.071mmol)(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-N-[(2S)-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰胺三氟乙酸盐(中间体197)、32.5mg(0.086mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和41μl(0.235mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌1h。然后在真空中浓缩反应混合物，将残余物溶解于乙酸乙酯中。将有机相接连地用5％柠檬酸水溶液和5％碳酸氢钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。得到73mg(理论值的98％)Fmoc-保护的中间体N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
HPLC(方法6)：Rt=2.78min；
LC-MS(方法3)：Rt=2.96min；MS(ESIpos)：m／z=1047(M+H)+。
将73mg(0.071mmol)该中间体溶解在5ml DMF中。加入0.5ml哌啶以后，将反应混合物在室温搅拌10min。这之后在真空中浓缩，并用二乙基醚重复消化残余物。已经倾析出二乙基醚以后，通过制备型HPLC(洗脱液：乙腈／0.1％水溶液TFA)纯化残余物。得到16mg(理论值的26％)标题化合物，为泡沫。
HPLC(方法6)：Rt=1.94min；
LC-MS(方法3)：Rt=1.71min；MS(ESIpos)：m／z=825(M+H)+
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ=8.9-8.6(m，3H)，8.4，8.3，8.1和8.0(4d，1H)，7.3-7.1(m，5H)，6.7-6.5(m，2H)，5.2-4.8(m，3H)，4.75-4.55(m，3H)，4.05-3.95(m，1H)，3.7-3.4(m，4H)，3.22，3.17，3.15，3.05，3.02和2.95(6s，9H)，3.0和2.7(2br.m，2H)，2.46(m，3H)，2.4-1.2(br.m，13H)，1.1-0.85(m，18H)，0.75(m，3H)[其它信号被隐藏在H2O峰下]。
中间体199
N-(4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004141
与中间体193和194类似地，从23mg(24μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S)-1-(2-氧杂-3-氮杂双环[2.2.2]辛-5-烯-3-基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体198)开始，制备标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法2)：Rt=2.1min；MS(ESIpos)：m／z=1118(M+H)+。
中间体200
N-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004151
如下进行制备：与中间体174和175类似地，从用中间体172将中间体192还原烷基化开始，随后去保护和形成马来酰亚胺。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1025(M+H)+。
中间体201
N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004152
将22mg(0.023mmol)N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体101)溶解在9.5ml THF中，并与4.2μl三乙胺在0℃混合。逐滴加入溴乙酰氯在THF中的溶液，并将反应混合物在0℃搅拌30min。浓缩反应混合物，并通过制备型HPLC纯化残余物。从而得到6.9mg(理论值的26％)标题化合物，为泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m／z=1059和1061(M+H)+。
中间体202
N-{2-[2-(2-{3-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004161
如下进行制备：最初与中间体168类似地，从用中间体167将中间体192还原烷基化开始，随后对N-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺的苄基酯进行氢解裂解。
将13mg(10μmol)该中间体溶解在5ml DMF中，并与2.1mg(20mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮、6.5μl N，N-二异丙基乙胺和7.1mg(0.02mmol)HATU混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从乙腈／水低压冻干以后，得到9.2mg(理论值的62％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法2)：Rt=2.1min；MS(ESIpos)：m／z=1141(M+H)+。
中间体203
(6-肼基-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000432948840004171
如下制备该化合物：通过标准肽化学方法，在有EDCI和HOBT存在下，使6-[(叔丁氧基羰基)氨基]己酸与肼甲酸苄酯偶联，随后氢解除去苄氧基羰基保护基。
LC-MS(方法11)：Rt=0.59min；MS(ESIpos)：m／z=246(M+H)+。
中间体204
N-{4-[2-(6-氨基己酰基)肼基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004172
将146mg(50μmol)(N-(3-羧基丙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺溶解在5ml DMF中，然后与30.6mg(80μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、19μl N，N-二异丙基乙胺和22.4mg(60μmol)(6-肼基-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯混合。将反应混合物在室温搅拌1.5h。这之后，在高真空下浓缩，并借助于制备型HPLC纯化剩余的残余物。从而得到43mg(理论值的68％)受保护的中间体，然后将其溶解于10ml二氯甲烷中，并用1ml三氟乙酸去保护。浓缩反应混合物，将残余物与二氯甲烷一起搅拌，并再次在真空中除去溶剂。从而得到45mg(理论值的68％，经2个阶段)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.66min；MS(ESIpos)：m／z=983(M+H)+。
中间体205
N-(4-{2-[6-({[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨甲酰基}氨基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004181
与中间体114类似地，从中间体50和204开始，制备所述化合物。
收率：4mg(理论值的78％)
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m／z=1149(M+H)+。
中间体206
N-(6-{[3-({3-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙基}二硫烷基)丙酰基]氨基}己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将8mg(10μmol)中间体101溶解在2ml DMF中，并与8.6mg(20μmol)1，1′-{二硫烷二基双[(1-氧代丙烷-3，1-二基)氧基]}二吡咯烷-2，5-二酮和3.7μlN，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌2h，然后在真空中蒸发出溶剂，并通过制备型HPLC纯化残余物。得到7.2mg(理论值的68％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=615[1/2(M+2H+]
中间体207
(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷甲酸三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004191
通过用三氟乙酸将210mg(0.76mmol)商购可得的(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-苯基环丙烷甲酸去保护，以定量收率得到标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.23min；MS(ESIpos)：m／z=178(M+H)+。
中间体208
(6-氧代己基)氨基甲酸-9H-芴-9-基甲酯
通过在标准条件下用三氧化硫-吡啶复合物氧化，从1g(2.95mmol)商购可得的(6-羟基己基)氨基甲酸-9H-芴-9-基甲酯制备标题化合物。得到840mg(理论值的85％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.1min；MS(ESIpos)：m／z=338(M+H)+。
中间体209
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羧基-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
首先，与在中间体75中描述的制备类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和(1S，2R)-1-氨基-2-苯基环丙烷甲酸三氟乙酸盐(中间体207)偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，制备胺化合物N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羧基-2-苯基环丙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。
然后，向22mg(0.026mmol)该化合物在10ml甲醇中的溶液中，加入17mg(0.05mmol)(6-氧代己基)氨基甲酸-9H-芴-9-基甲酯(中间体208)和2.3mg乙酸以及11.4mg(0.12mmol)硼烷-吡啶复合物。将反应混合物在室温搅拌过夜。然后，再次加入相同量的硼烷-吡啶复合物和乙酸以及8mg(6-氧代己基)氨基甲酸芴-9-基甲酯，并将反应混合物在室温搅拌另外24h。这之后在真空中浓缩，并借助于制备型HPLC纯化残余物。浓缩对应的级分以后，将产物立即用于下一阶段。
将33mg仍然被污染的中间体溶解于5ml DMF中，并加入1ml哌啶。在室温搅拌15min以后，浓缩反应混合物，并通过制备型HPLC纯化得到的残余物。从而得到11mg(理论值的55％，经2个阶段)氨基羧酸中间体。
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.7min；MS(ESIpos)：m／z=843(M+H)+。
将6mg(7.12μmol)该中间体溶解于1ml二噁烷中，然后与6.6mg(42.7μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯和5μl饱和碳酸氢钠水溶液混合。将反应混合物在室温搅拌1h。然后，加入另外3部分各自为50μl的饱和碳酸氢钠水溶液，并将反应混合物在室温搅拌另外30min。然后，用三氟乙酸将反应混合物酸化至pH2，并随后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从乙腈／水低压冻干以后，得到4mg(理论值的60％)标题化合物，为泡沫。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m／z=923(M+H)+。
中间体210
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004211
首先，通过文献方法(J.Org.Chem.58，1993，2196-2200)，制备6-氧代己酸。
在9ml甲醇中混合80mg(0.08mmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体192)和65.4mg(0.5mmol)6-氧代己酸，并与10μl乙酸和37.4mg(0.4mmol)硼烷-吡啶复合物混合。将反应混合物在室温搅拌过夜。这之后在真空中浓缩，并将残余物溶解于1：1乙腈／水中，并用三氟乙酸调节至pH2。再次浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物。浓缩对应的级分以后，得到70mg(理论值的86％)N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=955(M+H)+。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6，特征信号)：δ=12.0(br.M，1H)，10.8(s，1H)，9.4(m，1H)，8.9和8.8(2d，1H)，8.3和8.02(2d，1H)，7.5(m，1H)，7.3(m，1H)，7.15和7.1(2s，1H)7.05-6.9(m，2H)，5.12和4.95(2m，1H)，4.7-4.5(m，2H)，4.1-3.8(m，4H)，3.75(d，1H)，3.25，3.2，3.18，3.13，2.98和2.88(6s，9H)，2.8(m，3H)，1.08和1.04(2d，3H)，0.95-0.8(m，15H)，0.8-0.65(dd，3H)。
将22mg(23μmol)该中间体溶解在1.8ml二氯甲烷中，并与13.2mg(70μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、26.5mg(230μmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮和0.28mg(2μmol)二甲基氨基吡啶混合，并将反应混合物在室温搅拌2h。随后，在真空中浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从乙腈／水低压冻干以后，得到21.3mg(理论值的88％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m／z=1052(M+H)+。
中间体211
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004221
与中间体210类似地，用6-氧代己酸将15mg(20μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐(中间体15)还原烷基化。
收率：9.2mg(理论值的61％)
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=929(M+H)+。
将9mg(10μmol)该中间体溶解在3ml DMF中，并与5.6mg(48μmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮、5μl N，N-二异丙基乙胺和5.5mg(0.015mmol)HATU混合，并将反应混合物在超声浴中处理6h。在此过程中，每小时重新加入5.5mg HATU。随后，在真空中浓缩反应混合物，并将残余物溶解于乙腈／水中，并用三氟乙酸调节至pH2。在真空中再次浓缩以后，借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从乙腈／水低压冻干以后，得到5.8mg(理论值的57％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m／z=1027(M+H)+。
中间体212
N-{2-[2-(2-{3-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004231
如下进行制备：最初与中间体168类似地，从用中间体167将中间体15还原烷基化开始，随后进行N-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(2S，3S)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代-3-苯基丁-2-基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺的苄基酯的氢解裂解。
将8.4mg(8μmol)该中间体溶解在3ml DMF中，并与9.5mg(80μmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮、10μl N，N-二异丙基乙胺和9.4mg(25μmol)HATU混合，并将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。随后，在真空中浓缩反应混合物，并将残余物溶解于乙腈／水中，用三氟乙酸调节至pH2。在真空中再次浓缩以后，借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从乙腈／水低压冻干以后，得到4mg(理论值的32％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m／z=1117(M+H)+。
中间体213
N-{6-[(反式-4-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)氨基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004241
与中间体104类似地，从N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(其制备描述在中间体210下)开始，制备所述化合物。得到9.3mg标题化合物(理论值的37％，经3个阶段)。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m／z=1177(M+H)+。
中间体214
N-{4-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004251
与中间体210类似地，通过将中间体92转化成活性酯，制备所述化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m／z=901(M+H)+。
中间体215
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
首先，与中间体183类似地，将中间体40与硼烷-吡啶复合物一起用于制备N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。与中间体210类似地，然后从该化合物制备活性酯。得到34mg(理论值的36％，经2个阶段)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=930(M+H)+。
中间体216
N-(4-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苄基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004261
首先，与中间体183的制备类似地，使中间体192与4-甲酰基苯甲酸和硼烷-吡啶复合物反应，得到N-(4-羧基苄基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。然后与中间体210类似地，使用该化合物制备11mg(理论值的68％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m／z=1072(M+H)+。
中间体217
N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004271
将53mg(84μmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(2R，3S，4S)-1-羧基-2-甲氧基-4-甲基己烷-3-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体4)和45mg(84μmol)N-{(2R，3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-[(2S)-吡咯烷-2-基]丙酰基}-L-苯基丙氨酸苄酯三氟乙酸盐(中间体12)溶解于2ml DMF中，加入19μl N，N-二异丙基乙胺、14mg(92μmol)HOBt和17.6mg(92μmol)EDC，然后将混合物在室温搅拌过夜。随后，浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物。得到59mg(理论值的68％)Fmoc-保护的中间体N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
LC-MS(方法1)：Rt=1.55min；m／z=1044(M+H)+。
在5ml DMF中用1.2ml哌啶处理57mg(0.055mmol)该中间体，以除去Fmoc保护基。借助于制备型HPLC浓缩和纯化以后，得到39mg(理论值的76％)游离胺中间体N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，为三氟乙酸盐。
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；m／z=822(M+H)+。
与中间体210类似地，在有硼烷-吡啶复合物存在下，使60mg(0.06mmol)该中间体与6-氧代己酸反应。得到45mg(理论值的75％)标题化合物，为泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m／z=9936(M+H)+。
中间体218
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄氧基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
通过将42mg(0.05mmol)中间体217转化成活性酯，制备该化合物。
收率：26mg(54％)
HPLC(方法5)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m／z=1034(M+H)+。
中间体219
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004282
将20mg(0.02mol)得自中间体218的化合物溶解于2.4ml甲醇中，并在5％活性炭载钯上在标准氢压力下在室温氢化30min。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。从1：1乙腈／水低压冻干残余物。得到14mg(理论值的92％)标题化合物，为无色泡沫。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=944(M+H)+。
中间体220
N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将0.5g(1.01mmol)中间体1与1ml三氟乙酸在10ml二氯甲烷中混合。在超声浴中处理30min以后，浓缩该批料，首先与DCM一起再蒸馏，然后与二乙基醚一起再蒸馏，然后在高真空下干燥。将油状残余物不经进一步纯化用于下一阶段。
将500mg该中间体溶解在20ml DMF中，并与466mg(3.8mmol)中间体191、382mg(1.01mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和440μl(2.5mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌1h，然后浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷中，并通过首先与5％柠檬酸水溶液一起摇动、然后与饱和碳酸氢钠水溶液一起摇动，进行萃取。浓缩有机相，并通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物，使用95：5二氯甲烷／甲醇作为洗脱液。合并对应的级分，并在真空中除去溶剂。在已经在高真空下干燥残余物以后，得到562mg(65％理论值的，经2个阶段)Z-保护的中间体。
将562mg(0.57mmol)该中间体溶解于50ml甲醇中，并用155mg10％活性炭载钯在标准氢压力下在室温氢化20min。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。通过制备型HPLC纯化残余物。合并对应的级分，在真空中蒸发出溶剂，并将残余物从二噁烷低压冻干。得到361mg(理论值的87％)标题化合物，为泡沫。
HPLC(方法5)：具有Rt=1.75和1.86min的双峰；
LC-MS(方法1)：在Rt=0.84min和0.91min的双峰，具有相同质量；MS(ESIpos)：m／z=944(M+H)+。
中间体221
N-{(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-苯基丙基}-N-甲基-L-缬氨酸
Figure BDA0000432948840004301
在22ml甲醇中混合100mg(0.76mmol)商购可得的N-甲基-L-缬氨酸和285mg(1.14mmol)商购可得的(2S)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基氨基甲酸叔丁酯，并与340mg(3.66mmol)硼烷-吡啶复合物和70μl乙酸混合。将反应混合物在室温搅拌过夜。这之后在真空中浓缩，并通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物，使用二氯甲烷／甲醇／17％氨水溶液作为洗脱液。浓缩对应的级分和从1：1二噁烷／水低压冻干以后，得到259mg(理论值的93％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m／z=365(M+H)+。
中间体222
N-[(2S)-2-氨基-3-苯基丙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004302
将40mg(0.11mmol)N-{(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-苯基丙基}-N-甲基-L-缬氨酸(中间体221)溶解在5ml DMF中，并与80mg(0.11mmol)N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体220)、50mg(0.13mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和57μl(2.5mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌1h，然后浓缩。将残余物溶解于乙酸乙酯中，并首先用5％柠檬酸水溶液洗涤，然后用水洗涤。浓缩有机相，并借助于制备型HPLC纯化残余物。合并对应的级分，并在真空中除去溶剂。从二噁烷低压冻干以后，得到60mg(理论值的50％)受保护的中间体。
HPLC(方法12)：Rt=2.2min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.17min；MS(ESIpos)：m／z=1073(M+H)+。
将60mg(0.05mmol)该中间体溶解于10ml二氯甲烷中，加入2ml三氟乙酸，并将反应混合物在室温搅拌1.5h。随后，在真空中浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。合并对应的级分，在真空中除去溶剂，并将残余物从二噁烷／水低压冻干。以此方式，得到25mg(理论值的42％)标题化合物，为泡沫。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m／z=974(M+H)+。
中间体223
N-[(2S)-2-({[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨甲酰基}氨基)-3-苯基丙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
与中间体134类似地，从5mg(4.6μmol)中间体222开始，进行制备。得到3.4mg(理论值的65％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m／z=1140(M+H)+。
中间体224
N-[(2S)-2-({[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨甲酰基}氨基)丙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004321
与中间体223的制备类似地进行制备。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m／z=1064(M+H)+。
中间体225
N-(2-氨基乙基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004322
在20ml甲醇中混合100mg(0.76mmol)商购可得的N-甲基-L-缬氨酸和182mg(1.14mmol)商购可得的2-氧代乙基氨基甲酸叔丁酯，并与340mg(3.66mmol)硼烷-吡啶复合物和65μl乙酸混合。将反应混合物在室温搅拌过夜。这之后在真空中浓缩，并通过在硅胶上的快速色谱法纯化残余物，使用二氯甲烷／甲醇／17％氨水溶液(15／4／0.5)作为洗脱液。浓缩对应的级分和从1：1二噁烷／水低压冻干以后，得到190mg39％纯度(理论值的35％)的中间体，将其不经进一步纯化进行转化。
将50mg(0.07mmol)该中间体溶解在10ml DMF中，并与52mg(0.07mmol)N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体220)、32mg(0.09mmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和37μl(0.2mmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩。将残余物溶解于乙酸乙酯中，并通过首先与5％柠檬酸水溶液一起摇动、然后与水一起摇动，进行萃取。浓缩有机相，并借助于制备型HPLC纯化残余物。合并对应的级分，并在真空中除去溶剂。从二噁烷低压冻干以后，得到53mg(理论值的76％)受保护的中间体。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.02min；MS(ESIpos)：m／z=984(M+H)+。
将53mg(0.05mmol)该中间体溶解于10ml二氯甲烷中，加入2ml三氟乙酸，并将反应混合物在室温搅拌30min。随后，在真空中浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。合并对应的级分，在真空中除去溶剂，并将残余物从二噁烷／水低压冻干。以此方式，以65％纯度得到21mg(理论值的40％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=884(M+H)+。
中间体226
N-[2-({[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨甲酰基}氨基)乙基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004341
与中间体134的制备类似地，从中间体225进行制备。得到11.6mg(理论值的59％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m／z=1050(M+H)+。
中间体227
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S-1-(苄氧基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004342
与中间体218类似地，通过转化成活性酯，制备所述化合物。
收率：18mg(理论值的51％)
HPLC(方法5)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m／z=1073(M+H)+。
中间体228
(2R，3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁-2-基(3R，4S，7S，10S)-4-[(2S)-丁-2-基]-7，10-二异丙基-3-(2-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5，11-二甲基-6，9-二氧代-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酸酯
Figure BDA0000432948840004351
通过使在中间体154的制备中得到的Boc-保护的中间体与商购可得的6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼偶联，制备标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m／z=1308(M+H)+。
中间体229
(3R，4S，7S，10S)-4-[(2S)-丁-2-基]-7，10-二异丙基-3-(2-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-5，11-二甲基-6，9-二氧代-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酸-(2R，3S)-3-乙酰氨基-4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁-2-基酯
Figure BDA0000432948840004352
通过在有0.4μl N，N-二异丙基乙胺存在下，用2.3μl乙酸酐在1ml DMF中的溶液乙酰化，从7.5mg(2.5μmol)中间体154制备标题化合物。
收率：1.4mg(理论值的40％)
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1250(M+H)+。
中间体230
(3R，4S，7S，10S)-4-[(2S)-丁-2-基]-3-(2-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-7，10-二异丙基-5，11-二甲基-6，9-氧代-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酸-(2R，3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁-2-基酯
Figure BDA0000432948840004361
与中间体228类似地，从中间体193开始，制备所述化合物。得到16mg(理论值的30％，经3个阶段)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=2.0min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.02min；MS(ESIpos)：m／z=1335(M+H)+。
中间体231
(3R，4S，7S，10S)-4-[(2S)-丁-2-基]-3-(2-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-7，10-二异丙基-5，11-二甲基-6，9-二氧代-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酸-(2R，3S)-3-乙酰氨基-4-{2-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁-2-基酯
Figure BDA0000432948840004362
如下从8mg(6umol)中间体230制备该化合物：首先用三氟乙酸去保护，随后在有N，N-二异丙基乙胺存在下在DMF中用乙酸酐乙酰化。得到2mg(理论值的37％，经2个阶段)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m／z=1277(M+H)+。
中间体232
N-[(4-硝基苯氧基)羰基]-β-丙氨酸苄酯
将200mg(0.57mmol)商购可得的β-丙氨酸-4-甲基苯磺酸-苄酯和229mg(1.14mmol)氯碳酸-4-硝基苯酯溶解于15ml四氢呋喃中，然后将反应混合物加热至回流保持30min。随后，在真空中浓缩反应混合物，并借助于制备型HPLC纯化残余物。浓缩对应的级分和在高真空下干燥残余物以后，得到86mg(理论值的44％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m／z=345(M+H)+。
中间体233
N-{2-[({3-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙基}氨甲酰基)氨基]乙基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004372
将13mg(10μmol)中间体225和6.7mg(20μmol)中间体232溶解在3ml DMF中，然后加入7μl N，N-二异丙基乙胺。将混合物在室温搅拌过夜，然后在高真空下浓缩。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。浓缩对应的级分和在高真空下干燥残余物以后，得到5.4mg(理论值的38％)受保护的中间体。
HPLC(方法5)：Rt=2.1min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.6in；MS(ESIpos)：m／z=1089(M+H)+。
将5.4mg(5μmol)该中间体溶解在5ml甲醇中，并在加入2mg10％活性炭载钯以后，在标准氢压力下在室温氢化20min。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。在高真空下干燥残余物以后，得到5mg(定量)酸中间体。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m／z=999(M+H)+。
将5mg(10μmol)该中间体溶解在1ml DMF中，并与5.8mg(50mmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮混合，然后与2.6μl N，N-二异丙基乙胺和3.8mg(10μmol)HATU混合。在室温搅拌20h以后，在真空中浓缩反应混合物。借助于制备型HPLC，纯化剩余的残余物。从1：1二噁烷／水低压冻干以后，得到1.1mg(理论值的20％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=1096(M+H)+。
中间体234
N-(6-{[(苄氧基)羰基]氨基}己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004381
将25mg(30μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体55)和45mg(180μmol)(6-氧代己基)氨基甲酸苄酯溶解于3ml甲醇中，并用乙酸酸化。随后在室温加入15μl(144μmol；9.4M)硼烷-吡啶复合物。随后将该批料在室温搅拌24h，并在8h以后再次加入乙酸和15μl(144μmol；9.4M)硼烷-吡啶复合物。随后用TFA将反应混合物调节至pH2，并借助于制备型HPLC进行纯化。将产物级分合并和浓缩，并在高真空下干燥残余物。得到15mg(理论值的46％)标题化合物，为泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；m／z=1066(M+H)+。
中间体235
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004391
将15mg(14μmol)N-(6-{[(苄氧基)羰基]氨基}己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体234)溶解于3ml甲醇中，并加入1.8mg炭载钯(5％)。随后将反应混合物在标准氢压力下在室温氢化2h。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。从1：1乙腈／水低压冻干残余物。得到11mg(理论值的86％)标题化合物，为泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；m／z=932(M+H)+。
中间体236
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004401
将11mg(12μmol)N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体235)溶解于500μl1：1二噁烷／水中，并与253μl1M碳酸氢钠水溶液混合，然后与2.8mg(18μmol)2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯混合。将反应混合物在室温搅拌30min，然后用三氟乙酸酸化。借助于制备型HPLC纯化反应混合物。低压冻干以后，得到0.8mg(理论值的7％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；m／z=1012(M+H)+。
中间体237
N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004402
将25mg(30μmol)N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体55)和23mg(180μmol)6-氧代己酸溶解于3ml甲醇中，并用乙酸酸化。随后在室温加入15μl(144μmol；9.4M)硼烷-吡啶复合物。随后将反应混合物在室温搅拌20h，并在8h以后再次加入乙酸和15μl(144μmol；9.4M)硼烷-吡啶复合物。随后用三氟乙酸将反应混合物调节至pH2，并借助于制备型HPLC进行纯化。将产物级分合并和浓缩，并将残余物低压冻干。如此得到21mg(理论值的74％)标题化合物，为泡沫。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；m／z=947(M+H)+。
中间体238
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(5-苯基-1，3，4-噁二唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004411
将21mg(22μmol)中间体237溶解在1ml DMF中，并与38mg(333μmol)1-羟基吡咯烷-2，5-二酮混合，然后与2.4mg(10μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和19μl N，N-二异丙基乙胺混合。在室温搅拌2h以后，借助于制备型HPLC，纯化反应混合物。从二噁烷低压冻干以后，得到22mg(理论值的96％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；m／z=1044(M+H)+。
中间体239
N-甲基-L-苏氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004421
首先，如下从237mg(0.887mmol)它的二环己胺盐中释放出N-[(苄氧基)羰基]-N-甲基-L-苏氨酸：将它溶解于乙酸乙酯中，并与5％硫酸水溶液一起萃取摇动。有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将14.7mg(0.055mmol)N-[(苄氧基)羰基]-N-甲基-L-苏氨酸溶解于3ml DMF中，并接连地与40mg(0.055mmol)中间体220、12.7mg(0.066mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10mg(0.066mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物混合。随后将混合物在室温搅拌2h。然后在真空中除去溶剂，并通过制备型HPLC纯化残余物。如此得到29mg(理论值的54％)Z-保护的中间体。
LC-MS(方法1)：Rt=1.15min；MS(ESIpos)：m／z=976(M+H)+。
将29mg(0.003mmol)该中间体溶解在5ml甲醇中，并在5mg5％钯／炭上在室温和标准压力下氢化1h。随后滤出催化剂，并蒸发出溶剂。通过制备型HPLC纯化剩余的残余物。得到17mg(理论值的54％)标题化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=842(M+H)+。
中间体240
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-苏氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004431
与中间体210类似地，从15.6mg(0.016mmol)中间体239，制备所述化合物。得到10.8mg(理论值的67％，经2个阶段)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=1053(M+H)+。
中间体241
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(4-羟基苯基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840004432
首先，与中间体5类似地，制备三氟乙酸-(2S)-2-氨基-3-(4-羟基苯基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)丙烷-1-酮(1：1)。然后使用该组分，与在中间体75中描述的制备类似地，在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下，与N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基，以得到标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=817(M+H)+。
中间体242
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(4-羟基苯基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004441
与中间体210类似地，在有硼烷-吡啶复合物存在下，使50mg(0.05mmol)中间体241与6-氧代己酸反应。随后，将22.5mg(0.02mmol)得到的酸转化成活化的酯。得到13.5mg(理论值的36％，经2个阶段)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1028(M+H)+。
中间体243
N-(6-氨基己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(4-羟基苯基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004442
如下进行制备：与中间体78类似地，用(6-氧代己基)氨基甲酸苄酯和硼烷-吡啶复合物将中间体241还原烷基化，和随后在作为溶剂的甲醇中氢化。
收率：17.5mg(理论值的34％，经2个阶段)
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.63min；MS(ESIpos)：m／z=916(M+H)+。
中间体244
N-[6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(4-羟基苯基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004451
与中间体166类似地，从中间体243开始，进行制备。
收率：1.3mg(理论值的12％)
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m／z=996(M+H)+。
中间体245
O-[(3R，4S，7S，10S)-4-[(2S)-丁-2-基]-3-(2-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-7，10-二异丙基-5，11-二甲基-6，9，15-三氧代-2-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-苏氨酰基-β-丙氨酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
首先，如关于中间体154所述，使中间体193与N-(叔丁氧基羰基)-L-苏氨酸苄酯反应，然后，通过氢解除去苄基酯。然后在有HATU存在下使如此得到的30mg(0.027mmol)N-[4-({(1S，2R)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-羧基丙烷-2-基}氧基)-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺与β-丙氨酸-4-甲基苯磺酸-苄酯偶联，并再次通过氢解除去苄基酯(收率：24mg(理论值的71％，经2个阶段))。最后，将10mg(0.008mmol)得到的酸转化成活化的酯。HPLC纯化以后，得到2.7mg(理论值的23％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m／z=1295(M+H)+
中间体246a
(2S)-2-氨基-1-(4-羟基-1，2-噁唑烷-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙烷-1-酮三氟乙酸盐(非对映异构体1)
Figure BDA0000432948840004461
将1.6g(3.982mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-色氨酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯溶解在15ml DMF中，并与500mg(3.982mmol)1，2-噁唑烷-4-醇和100μl N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜。然后，加入另外100μl N，N-二异丙基乙胺，并将混合物首先在超声浴中处理5h，然后在室温搅拌过夜，随后在真空中浓缩。将剩余的残余物溶解于乙酸乙酯中，并首先用5％柠檬酸水溶液萃取2次，然后用饱和碳酸氢钠水溶液萃取，最后用水萃取。浓缩有机相，并通过在硅胶上的快速色谱法，使用95：5二氯甲烷／甲醇作为洗脱液，将残余物分离成非对映异构体。合并两种非对映异构体的对应级分，并在真空中除去溶剂。在高真空下干燥残余物以后，得到272mg(理论值的18％)非对映异构体1(Rf=0.18(95：5二氯甲烷／甲醇)和236mg(理论值的16％)非对映异构体2(Rf=0.13(95：5二氯甲烷／甲醇)，以及333mg(理论值的22％)Boc-保护的中间体的混合级分。
在标准条件下，使用5ml三氟乙酸在20ml二氯甲烷中的溶液从272mg(725μmol)该中间体的非对映异构体1除去Boc保护基，并在从二噁烷／水低压冻干以后，以75％纯度得到290mg(定量)标题化合物，并不经进一步纯化用于下一阶段。
HPLC(方法12)：Rt=1.1min；
LC-MS(方法13)：Rt=1.80min；MS(ESIpos)：m／z=276(M+H)+
中间体246b
(2S)-2-氨基-1-(4-羟基-1，2-噁唑烷-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙烷-1-酮三氟乙酸盐(非对映异构体2)
在标准条件下，使用5ml三氟乙酸在20ml二氯甲烷中的溶液从236mg(630μmol)在246a中描述的中间体的非对映异构体2除去Boc保护基，浓缩、与二乙基醚一起搅拌和在高真空下干燥残余物以后，得到214mg(76％)标题化合物。
LC-MS(方法13)：Rt=1.84min；MS(ESIpos)：m／z=276(M+H)+
中间体247a
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(4-羟基-1，2-噁唑烷-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(非对映异构体1)
Figure BDA0000432948840004481
为了制备该化合物，首先如关于中间体74所述，使中间体26和246a偶联，然后除去Boc保护基。随后，在有硼烷-吡啶复合物存在下，用6-氧代己酸烷基化，随后如关于中间体210所述，将所述酸转化成活性酯。通过制备型HPLC纯化标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1053(M+H)+
中间体247b
N-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(4-羟基-1，2-噁唑烷-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(非对映异构体2)
Figure BDA0000432948840004482
为了制备该化合物，首先如关于中间体74所述，使中间体26和246b偶联，然后除去Boc保护基。随后，在有硼烷-吡啶复合物存在下，用6-氧代己酸烷基化，随后如关于中间体210所述，将所述酸转化成活性酯。通过制备型HPLC纯化标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1053(M+H)+
中间体248
N-(5-羧基戊基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-叔丁氧基-3-(4-羟基苯基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004491
首先，与在中间体86中描述的合成类似地，通过在有O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐存在下使N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(中间体26)和L-酪氨酸叔丁基酯偶联，并随后借助于三氟乙酸除去Boc保护基得到叔丁基酯(与三氟乙酸一起在二氯甲烷中搅拌40min)，制备胺化合物N-[(2R，3R)-3-甲氧基-3-{(2S)-1-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲基{(2S)-3-甲基-2-[(N-甲基-L-缬氨酰基)氨基]丁基}氨基)庚酰基]吡咯烷-2-基}-2-甲基丙酰基]-L-酪氨酸叔丁酯，为三氟乙酸盐。然后使用38mg(0.04mmol)该化合物，与中间体210的制备类似地，通过在有硼烷-吡啶复合物存在下与6-氧代己酸反应，得到31mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m／z=918(M+H)+。
示例性实施方案：
使用的抗-EGFR1抗体
西妥昔单抗(INN No.7906)
其它名称：IMC-225，C225，EMR-62202，BMS-564717，Fab C225
西妥昔单抗(DrugBank登记号DB00002)是在SP2／0小鼠骨髓瘤细胞中生产的一种嵌合的抗-EGFR1-抗体，且由ImClone Systems Inc.／MerckKGaA／Bristol-Myers Squibb Co.销售。
西妥昔单抗被指示用于治疗转移性的、表达EGFR的、具有野生型K-Ras基因的结肠直肠癌。它具有10-10M的亲和力。
序列：
轻链(κ)：
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
帕木单抗(INN No.8499)
帕木单抗(其它名称：ABX-EGF，E7.6.3)(Drug Bank登记号DB01269)是一种特异性地结合人EGF受体1的重组单克隆人IgG2抗体，且由Abgenix／Amgen销售。
帕木单抗源自转基因小鼠(XenoMouse)的免疫接种。这些小鼠能够生产人免疫球蛋白(轻链和重链)。选择一种生产针对EGFR的抗体的特定B细胞克隆，且用CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)将该克隆永生化。这些细胞现在被用于生产100％人抗体。
帕木单抗被指示用于治疗表达EGFR的、转移性的结肠直肠癌，该癌对使用氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康的化学疗法治疗具有抗性。它具有10-11M的亲和力。
序列：
轻链(κ)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
尼妥珠单抗(INN No.8545)
尼妥珠单抗(其它名称：TheraCIM-h-R3；h-R3；Theraloc；BioMAb；BIOMAb-EGFR；Vecthix；KI-0501)(专利EP00586002，EP00712863)是特异性地结合人EGF受体1的人源化的单克隆IgG1抗体，且由YMBioSciences Inc.(Mississauga，加拿大)销售。它在非分泌性的NSO细胞(哺乳动物细胞系)中生产。
尼妥珠单抗被批准用于治疗头和颈肿瘤、高度恶性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤(不是在欧洲和美国)和胰腺癌(罕用药，EMA)。它具有10-8M的亲和力。
B.ADC的生产
根据下述方法，可以将上述的中间体连接至例如抗-EGF受体抗体西妥昔单抗、尼妥珠单抗或帕木单抗，以及下面列出的其它抗体，并且这样的连接可以任选地经由抗体蛋白的半胱氨酸或赖氨酸侧链。
B-1.1在缀合之前对EGFR抗体的后处理
从药店商购得到爱必妥市售产品(爱必妥
Figure BDA0000432948840004511
5mg／mL输注溶液100mL，PXN0493540，N1，500mg，Merek)、Vectibix市售产品(用于制备输注溶液的Vectibix
Figure BDA0000432948840004512
20mg／mL浓缩液，1个可穿刺瓶(N1)100mg，20mL，PZN6078606，Amgen)或CIMAher市售产品(CIMAher
Figure BDA0000432948840004513
50mg AMP4×10mL，从Cuba，YM BioSciences Inc.(Mississauga，加拿大)进口)。
为了除去在制剂中含有的聚山梨酯80，使它结合至蛋白A(MabSelectSure)，并用15％异丙醇冲洗。在用酸性的乙酸盐缓冲液洗脱后，在D-PBS上凝胶过滤后重新缓冲该混合物，并将得到的物质偶连至各个毒性基团。
B-1.2在哺乳动物细胞中表达抗体的一般规程
通过用合适的基于CMV启动子的表达质粒瞬时转染HEK2936E细胞，在哺乳动物细胞培养物中生产抗体，例如，抗-PDL1或针对不同靶标的其它抗体。将抗体的轻链和重链在单载体系统中一起克隆，或者在双载体系统中分开克隆。使细胞培养物标准品在搅拌烧瓶中增加至1.5L或在“Wave Bag”中增加至10L。在补充有胰蛋白胨TN1(Organotechnie)的含有1％“FCS超低IgG”(Invitrogen)和0.5mM丙戊酸的F17培养基(Invitrogen)中，在37℃进行表达5-6天。表达收率为7-310mg／L。
B-1.3从细胞上清液纯化抗体的一般方法
从细胞培养物上清液得到抗体，例如，PDL1或针对不同靶标的其它抗体。通过离心细胞，澄清细胞培养物上清液。然后，通过在MabSelectSure(GE Healthcare)色谱柱上的亲和色谱法，纯化上清液。因此在DPBS(pH7.4)(Sigma／Aldrich)中平衡柱，施加细胞上清液，并用大约10柱体积的DPBS(pH7.4)+500mM氯化钠洗涤柱。将抗体在50mM醋酸钠(pH3.5)+500mM氯化钠中洗脱，然后通过在Superdex200柱(GE Healthcare)上的凝胶过滤色谱法在DPBS(pH7.4)中进一步纯化。
B-1.4与半胱氨酸侧链偶联的一般方法
在偶联反应中使用下述抗体：
抗-EGFR1抗体：
西妥昔单抗
尼妥珠单抗
帕木单抗
其它抗体：
抗-PDL1
抗-ICOSLG
抗-FGFR3
赫赛汀
抗-TYRP1
抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3
向浓度范围在1mg／mL至10mg／mL之间的对应抗体在PBS缓冲液中的溶液中，加入3当量的溶解在PBS缓冲液中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)，并在室温搅拌1小时。然后，取决于期望的载荷，加入2-10当量的要偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物(中间体102、103、105-109、111-114、117-126、128、129、132-146、148-155、157、159-161、166、171、175-177、184、189、194-195、199-201、205、209、223-224、226、228-231、236和244)，作为在DMSO中的溶液。DMSO的量应当不超过总体积的10％。将该批料在室温搅拌60-120分钟，然后应用于在PBS中平衡的PD10柱(SephadexG-25，GE Healthcare)，然后用PBS缓冲液洗脱。如果必要的话，通过超速离心进一步增加浓度。
除非另有说明，通常使用在PBS缓冲液中的5mg对应抗体进行还原和下述偶联。在PD10柱上纯化以后，分别得到对应的ADC在3.5mL PBS缓冲液中的溶液。然后为这些溶液各自确定指定的蛋白浓度。另外，通过下述方法，确定抗体的载荷(药物／mAb比)。
根据该方法，制备在实施例1-34、36-37、39-41、43-44、52-53、55、338-339、341-344、349、351-352、354、356-358和374中合成的免疫缀合物。
在呈现的结构式中，AK1A-AK1J具有下述含义：
AK1A=西妥昔单抗(部分地还原)-S§1
AK1B=尼妥珠单抗(部分地还原)-S§1
AK1C=帕木单抗(部分地还原)-S§1
AK1D=抗-PDL1(部分地还原)-S§1
AK1E=抗-ICOSLG(部分地还原)-S§1
AK1F=抗-FGFR3(部分地还原)-S§1
AK1G=赫赛汀(部分地还原)-S§1
AK1H=抗-TYRP1(部分地还原)-S§1
AK1J=抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(部分地还原)-S§1
其中
§1表示与琥珀酰亚胺基团的连接
且
S代表部分地还原的抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-1.5与赖氨酸侧链偶联的一般方法
在偶联反应中使用下述抗体：
抗-EGFR1抗体：
西妥昔单抗
尼妥珠单抗
帕木单抗
其它抗体：
抗-PDL1
抗-ICOSLG
抗-FGFR3
赫赛汀
抗-TYRP1hIgG1-kapp
抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3
将2-5当量的要从中间体104、110、115、116、127、130、131、147、156、158、162、169、178、185、190、202、206、210-216、218、219、227、233、238、240、242、245、247a和247b偶联的前体化合物(作为在DMSO中的溶液)加入到对应的抗体在PBS缓冲液中的溶液(浓度范围在1mg／mL至10mg／mL之间，取决于期望的载荷)。在室温搅拌30分钟以后，再次加入相同量的在DMSO中的前体化合物。DMSO的量应当不超过总体积的10％。在室温搅拌另外30分钟后，将该批料倒在PD10柱(
Figure BDA0000432948840004541
G-25)上然后用PBS缓冲液洗脱。任选地通过超滤进行另一个浓缩步骤。如果必要的话，为了更好地分离低分子组分，在用PBS缓冲液再次稀释后，重复超滤浓缩步骤。
除非另有说明，通常使用5mg在PBS缓冲液中的对应抗体进行偶联。在PD10柱上纯化以后，得到对应的ADC在3.5mL PBS缓冲液中的溶液。然后对于这些溶液中的每一种，确定给出的各种蛋白浓度，并根据下述方法确定抗体的载荷(药物／mAb比)。
根据该方法，制备在实施例35、38、42、54、337、340、345-348、350、353、355、359、363、375和376中描述的免疫缀合物。
在这里显示的结构式中，AK2A、AK2B、AK2C、AK2D、AK2E、AK2F、AK2G、AK2H和AK2J具有下述含义：
AK2A=西妥昔单抗-NH§2
AK2B=尼妥珠单抗-NH§2
AK2C=帕木单抗-NH§2
AK2D=抗-PDL1-NH§2
AK1E=抗-ICOSLG-NH§2
AK2F=抗-FGFR3-NH§2
AK2G=赫赛汀-NH§2
AK2H=抗-TYRP1-NH§2
AK2J=抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3-NH§2
其中
§2表示与羰基的连接
且
NH代表抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-1.6a制备半胱氨酸加合物的一般方法
将10μmol上述的马来酰亚胺前体化合物放入3mL DMF中，中，并与2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来通过制备型HPLC进行纯化。
在这里显示的结构式中，Cys具有以下含义：
Figure BDA0000432948840004551
其中
§3表示与接头毒性基团单元的连接。
B-1.6b制备赖氨酸加合物的一般方法：
将10μmol上述的活性酯前体化合物放入5mL DMF中，并在有30μmol N，N-二异丙基乙胺存在下与α-氨基-保护的L-赖氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来通过制备型HPLC进行纯化。然后，通过已知方法除去保护基。
根据本发明的缀合物的进一步纯化和表征
成功反应以后，将反应混合物浓缩，在某些情况下通过例如超速离心进行浓缩，然后脱盐，并使用例如Sephadex
Figure BDA0000432948840004561
G-25柱通过色谱法进行纯化。使用例如磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)进行洗脱。然后，将溶液无菌过滤和冷冻。可替换地，可以将缀合物低压冻干。
B-1.7毒性基团载荷的确定
对在示例性实施方案中所述的得到的缀合物在PBS缓冲液中的溶液，如下确定毒性基团载荷：
通过质谱法确定各种缀合的物质的分子量，从而确定赖氨酸-连接的ADC的毒性基团载荷。首先将抗体缀合物用PNGaseF去糖基化，将样品酸化，接着在HPLC分离后，使用ESI MicroTofQ(Bruker Daltonik)通过质谱法分析样品。将TIC(总离子色谱图)中的信号上的所有波谱累加，并基于MaxEnt解卷积来计算不同缀合物物质的分子量。在不同物质的信号积分以后，计算DAR(药物／抗体比)。
为了蛋白鉴别，在去糖基化和/或变性以后，除了分子量确定以外，进行胰蛋白酶消化，从而基于在变性、还原和衍生化以后鉴别的胰蛋白酶肽来证实蛋白的身份。
通过还原的和变性的ADC的反相色谱法，确定半胱氨酸-连接的缀合物的毒性基团载荷。将盐酸胍(GuHCl，28.6mg)和DL-二硫苏糖醇溶液(DTT，500mM，3μL)加入到ADC溶液(1mg／mL，50μL)中。将混合物在55℃温育1小时，然后通过HPLC进行分析。
在辅助1260HPLC系统上进行HPLC分析，在220nm检测，使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合反相柱(目录号PL1912-3802)(2.1×150mm，8μm粒度，
Figure BDA0000432948840004562
)，流速为1mL／min，具有下述梯度：0min，25％B；3min，25％B；28min，50％B。洗脱液A由0.05％的三氟乙酸(TFA)在水中的溶液组成，洗脱液B由0.05％的三氟乙酸在乙腈中的溶液组成。
基于保留时间与未缀合的抗体的轻链(L0)和重链(H0)的对比，分配检测到的峰。将仅在缀合的样品中检测到的峰分配给具有1个毒性基团的轻链(L1)和具有1、2和3个毒性基团的重链(H1、H2、H3)。
从峰面积计算抗体的平均毒性基团载荷，所述峰面积如下积分确定：所有峰的积分结果的总和×2，用毒性基团的数目加权，除以具有单一加权的所有峰的积分结果的总和。在分离的情况下，可能发生这样的情形：由于一些峰的共洗脱，不能准确地确定毒性基团载荷。
B-1.8试验ADC的抗原结合
在成功偶联以后，试验了结合剂的结合靶分子的能力。本领域技术人员熟知多种用于实现该目的的方法；例如，借助于ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcoreTM测量)，可以试验缀合物的亲和力。技术人员可以使用常规方法，例如，抗体缀合物的蛋白测定(也参见Doronina等人，NatureBiotechnol.2003；21：778-784和Polson等人，Blood2007，1102：616-623)，测量缀合物浓度。
B2生产抗体-药物缀合物(ADC)
使用下述方法，将上述的中间体连接至抗-间皮素抗体MF-Ta，例如，利用任选地经由抗体蛋白的半胱氨酸或赖氨酸侧链发生的连接。通过与在WO 2009／068204 A1中描述的那些类似的方法，生产抗-间皮素抗体MF-Ta。在真核CHO细胞(稳定细胞系)中表达抗体MF-Ta，并通过蛋白A和凝胶过滤进行纯化，然后进行在DPBS缓冲液中的缀合。
B-2.1一般工作操作1(经由半胱氨酸的偶联)：
向浓度范围在1mg／mL至10mg／mL之间的对应抗体在PBS缓冲液中的溶液中，加入3当量的溶解在PBS缓冲液中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)，并在室温搅拌1小时。接着，取决于期望的载荷，加入2-10当量的要偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物(中间体128、129、132-146、148-155、157、159-161、171、175-177、184、189、194-195、199-201、205、209、223-224、226、228-231、236和244)，作为在DMSO中的溶液。DMSO的量应当不超过总体积的10％。将反应混合物在室温搅拌60-120分钟，然后应用于PD10柱(
Figure BDA0000432948840004571
G-25)，并用PBS缓冲液洗脱。然后任选地通过超滤浓缩溶液。如果必要的话，在用PBS缓冲液再次稀释后，重复超滤浓缩，以实现低分子组分的更好分离。
除非另有说明，通常使用在PBS缓冲液中的5mg对应抗体进行还原和下述偶联。在PD10柱上纯化以后，如此得到对应的ADC在3.5mL PBS缓冲液中的溶液。然后为这些溶液各自确定指定的蛋白浓度。另外，通过在B-4中描述的方法，确定抗体的载荷(药物／mAb比)。
通过该方法，制备在实施例56、57、60-74、76-83、85、86、88-92、94-101、103、106-112、114、115、126、128-131、133-135、137-139、141-142、151、153-154、366和377中合成的免疫缀合物。
在给出的结构式中，AK3具有以下含义
AK3=MF-Ta(部分地还原)-S§1，
其中
§1表示与琥珀酰亚胺基团的连接，
MF-Ta(部分地还原)代表部分地还原的MF-Ta抗体(重链SEQ ID NO：408和轻链SEQ ID NO：409)，
且
S代表部分地还原的抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-2.2一般工作操作2(经由赖氨酸侧链偶联)：
将2-5当量的要偶联的前体化合物(中间体104、110、115、116、127、130、131、147、156、158、162、169、178、185、190、202、206、210-216、218、219、227、233、238、240、242、245、247a和247b)作为在DMSO中的溶液加入到对应的抗体在PBS缓冲液中的溶液(浓度范围在1mg／mL至10mg／mL之间，取决于期望的载荷)中。在室温搅拌30分钟以后，加入相同量的在DMSO中的前体化合物。DMSO的量应当不超过总体积的10％。在室温搅拌另外30分钟后，将该批料倒在PD10柱(
Figure BDA0000432948840004581
G-25)上并用PBS缓冲液洗脱。还任选地进行另一次超滤浓缩。如果必要的话，在用PBS缓冲液再次稀释后，重复超滤浓缩，以提高低分子组分的分离。
除非另有说明，通常使用5mg在PBS缓冲液中的对应抗体进行偶联。在PD10柱上纯化以后，得到对应的ADC在3.5mL PBS缓冲液中的溶液。然后对于这些溶液，确定给出的蛋白浓度，并通过在B-4下描述的方法确定抗体的载荷(药物／mAb比)。
按照该方法，制备了在实施例58、59、75、84、87、93、102、104、105、113、116、127、132、136、140、143-150、152、367-369和378-380中合成的免疫缀合物。
在给出的结构式中，AK4具有以下含义
AK4=MF-Ta-NH§2，
其中
§2表示与羰基的连接
MF-Ta代表未还原的MF-Ta抗体(重链SEQ ID NO：408和轻链SEQID NO：409)
且
NH代表抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-2.3a合成半胱氨酸加合物的一般方法：
将10μmol上述的马来酰亚胺前体化合物溶解在3mL DMF中，并与2.1mg(10μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，并通过制备型HPLC进行纯化。
在下面给出的结构式中的Cys具有以下含义
其中
§3表示与接头毒性基团单元的连接。
B-2.3b制备赖氨酸加合物的一般方法：
将10μmol上述的活性酯前体化合物放入5mL DMF中，并在有30μmol N，N-二异丙基乙胺存在下，与α-氨基-保护的L-赖氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来通过制备型HPLC进行纯化。然后，通过已知方法除去保护基。
根据本发明的缀合物的进一步纯化和表征
成功反应以后，在某些情况下，将反应混合物通过例如超速离心进行浓缩，然后脱盐，并使用例如Sephadex
Figure BDA0000432948840004592
G-25柱通过色谱法进行纯化。使用例如磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)进行洗脱。然后，将溶液无菌过滤和冷冻。可替换地，可以将缀合物低压冻干。
B-2.4确定毒性基团载荷
对在示例性实施方案中所述的得到的缀合物在PBS缓冲液中的溶液，如下确定毒性基团载荷：
通过质谱法确定各种缀合的物质的分子量，从而确定赖氨酸-连接的ADC的毒性基团载荷。首先将抗体缀合物用PNGaseF去糖基化，然后将样品酸化；接着在HPLC分离后，使用ESI MicroTofQ(Bruker Daltonik)通过质谱法分析样品。将TIC(总离子色谱图)中的信号上的所有波谱累加，并基于MaxEnt解卷积来计算不同缀合物物质的分子量。在不同物质的信号积分以后，计算DAR(药物／抗体比)。
为了蛋白鉴别，在去糖基化和/或变性以后，除了分子量确定以外，进行胰蛋白酶消化，从而基于在变性、还原和衍生化以后鉴别的胰蛋白酶肽来证实蛋白的身份。
通过还原的和变性的ADC的反相色谱法，确定半胱氨酸-连接的缀合物的毒性基团载荷。将盐酸胍(GuHCl，28.6mg)和DL-二硫苏糖醇溶液(DTT，500mM，3μL)加入到ADC溶液(1mg／mL，50μL)中。然后将混合物在55℃温育1小时，通过HPLC进行分析。
在辅助1260HPLC系统上进行HPLC分析，在220nm检测，使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合反相柱(目录号PL1912-3802)(2.1×150mm，8μm粒度，
Figure BDA0000432948840004601
)，流速为1mL／min，具有下述梯度：0min，25％B；3min，25％B；28min，50％B。洗脱液A由0.05％的三氟乙酸(TFA)在水中的溶液组成，洗脱液B由0.05％的三氟乙酸在乙腈中的溶液组成。
基于保留时间与未缀合的抗体的轻链(L0)和重链(H0)的对比，分配检测到的峰。将仅在缀合的样品中检测到的峰分配给具有1个毒性基团的轻链(L1)和具有1、2和3个毒性基团的重链(H1、H2、H3)。
从峰面积计算抗体的平均毒性基团载荷，所述峰面积如下积分确定：所有峰的积分结果的总和×2，用毒性基团的数目加权，除以具有单一加权的所有峰的积分结果的总和。在分离的情况下，可能发生这样的情形：由于一些峰的共洗脱，不能准确地确定毒性基团载荷。
B-2.5试验ADC的抗原结合
在成功偶联以后，试验了结合剂的结合靶分子的能力。本领域技术人员熟知多种用于实现该目的的方法；例如，借助于ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcoreTM测量)，可以试验缀合物的亲和力。技术人员可以使用常规方法，例如，抗体缀合物的蛋白测定(也参见Doronina等人，NatureBiotechnol.2003；21：778-784和Polson等人，Blood2007，1102：616-623)，测量缀合物浓度。
B3抗体-药物缀合物(ADC)的合成
B-3.1制备抗-C4.4a抗体的一般方法
通过针对重组人C4.4a SEQ ID NO：1和鼠C4.4a SEQ ID NO：2和针对表达C4.4a的细胞来筛选噬菌体展示文库，制备由表1和表2的序列描述的抗-C4.4a抗体。将以此方式得到的抗体重新格式化为人IgG1格式，并用于本文中描述的示例性实施方案。
B-3.2在哺乳动物细胞中表达抗-C4.4a抗体的一般方法
在哺乳动物细胞培养物中生产抗体，例如M31-B01(轻链SEQ ID NO：346和重链SEQ ID NO：347)或表2的其它抗体。为此目的，用合适的基于CMV启动子的表达质粒，瞬时转染HEK2936E细胞。将抗体的重链和轻链一起克隆进单载体系统中，或分别地克隆进双载体系统中。将细胞培养物标准品放大至1.5L(在摇瓶中)或10L(在“Wave Bag”中)。使细胞在F17培养基(Invitrogen)中在37℃表达5-6天，所述F17培养基补充了胰蛋白胨TN1(Organotechnie)，且含有1％“FCS超低IgG”(Invitrogen)和0.5mM丙戊酸。表达产率在100mg／L至600mg／L之间。
B-3.3从细胞上清液纯化抗体的一般方法
从细胞培养物上清液得到抗体，例如M31-B01(轻链SEQ ID NO：346和重链SEQ ID NO：347)或表2的其它抗体。通过离心，澄清细胞上清液以除去细胞。随后，通过在MabSelectSure(GE Healthcare)色谱柱上的亲和色谱法，纯化细胞上清液。为此目的，在DPBS(pH7.4)(Sigma／Aldrich)中平衡柱，应用细胞上清液，并用约10柱体积的DPBS(pH7.4)+500mMNaCl洗涤柱。在50mM醋酸钠(pH3.5)+500mM NaCl中洗脱抗体，随后通过在Superdex200柱(GE Healthcare)上的凝胶过滤色谱法在DPBS(pH7.4)中进一步纯化。
B-3.4与半胱氨酸侧链偶联的一般方法
在偶联反应中使用下述抗体：
抗-C4.4a M31-B01
抗-C4.4a B01-3
抗-C4.4a B01-10
抗-C4.4a B01-7
抗-C4.4a D02-4
抗-C4.4a D02-6
抗-C4.4a D02-7
向对应的抗体在PBS缓冲液中的溶液(浓度范围在1mg／mL至10mg／mL之间)中，加入3当量的溶解在PBS缓冲液中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)，并在室温搅拌1小时。随后，取决于期望的载荷，加入2-10当量的要偶联的得自中间体128、129、132-146、148-155、157、159-161、166、171、175-177、184、188、190、194-195、199-201、205、209、223-224、226、228-231、236和244的马来酰亚胺前体化合物，作为在DMSO中的溶液。DMSO的量应当不超过总体积的10％。将该批料在室温搅拌60-120分钟，然后应用于在PBS中平衡过的PD10柱(Sephadex
Figure BDA0000432948840004621
G-25，GEHealthcare)，并用PBS缓冲液洗脱。如果必要的话，通过超速离心进一步浓缩。
除非另有说明，通常使用5mg在PBS缓冲液中的对应抗体进行还原和随后的偶联。在PD10柱上纯化以后，得到对应的ADC在3.5mL PBS缓冲液中的溶液。然后对于这些溶液，确定给出的蛋白浓度。另外，根据下述方法确定抗体的载荷(药物／mAb比)。
通过该方法，生产在实施例163-165、167-192、194-198、200-221、223-228、230-232、242、244-247、249、250、254-257、259-260、269、271-275、371和385中制备的免疫缀合物。
在显示的结构式中，AK5A至AK5G具有下面给出的含义：
AK5A=抗-C4.4a抗体M31-B01(部分地还原)-S§1
AK5B=抗-C4.4a抗体B01-3(部分地还原)-S§1
AK5C=抗-C4.4a抗体B01-10(部分地还原)-S§1
AK5D=抗-C4.4a抗体B01-7(部分地还原)-S§1
AK5E=抗-C4.4a抗体D02-4(部分地还原)-S§1
AK5F=抗-C4.4a抗体D02-6(部分地还原)-S§1
AK5G=抗-C4.4a抗体D02-7(部分地还原)-S§1
其中
§1表示与琥珀酰亚胺基团的连接
且
S代表部分地还原的抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-3.5与赖氨酸侧链偶联的一般方法：
在偶联反应中使用下述抗体：
抗-C4.4a抗体M31-B01
抗-C4.4a抗体B01-3
取决于期望的载荷，向对应的抗体在PBS缓冲液中的溶液(浓度范围在1mg／mL至10mg／mL之间)中，加入2-5当量的要偶联的前体化合物(得自中间体104、110、115、116、127、130、131、147、156、158、162、169、178、185、190、202、206、210-216、218-219、227、233、238、240、242、245、247a和247b)，作为在DMSO中的溶液。在室温搅拌30分钟以后，再次加入相同量的在DMSO中的前体化合物。在此过程中，DMSO的量应当不超过总体积的10％。在室温搅拌另外30分钟后，将该批料应用于PD10柱(
Figure BDA0000432948840004631
G-25)上并用PBS缓冲液洗脱。任选地通过超滤进一步浓缩该批料。为了更好地分离低分子组分，如果必要的话，在用PBS缓冲液再次稀释后，重复超滤浓缩步骤。
除非另有说明，通常使用5mg在PBS缓冲液中的对应抗体进行偶联。在PD10柱上纯化以后，如此得到对应的ADC在3.5mL PBS缓冲液中的溶液。然后对于这些溶液，确定给出的特定蛋白浓度，并根据下述方法确定抗体的载荷(药物／mAb比)。
通过该方法，制备在实施例166、193、199、222、229、243、248、251-253、258、261-268、270、276、370、372-373和386-388中合成的免疫缀合物。
在给出的结构式中，AK6A和AK6B具有下述含义
AK6A=抗-C4.4a抗体M31-B01-NH§2
AK6B=抗-C4.4a抗体B01-3-NH§2
其中
§2表示与羰基的连接
且
NH代表抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-3.6合成半胱氨酸加合物的一般方法：
将10μmol上述的马来酰亚胺前体化合物放入3mL DMF中，并与2.1mg(10μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，并通过制备型HPLC进行纯化。
在下面给出的结构式中的Cys具有以下含义
Figure BDA0000432948840004641
其中
§3表示与接头毒性基团单元的连接。
B-3.6合成半胱氨酸加合物的一般方法2.3a：
将10μmol上述的马来酰亚胺前体化合物放入3mL DMF中，并与2.1mg(10μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，并通过制备型HPLC进行纯化。
在下面给出的结构式中的Cys具有以下含义
Figure BDA0000432948840004642
其中
§3表示与接头毒性基团单元的连接。
根据本发明的缀合物的进一步纯化和表征
成功反应以后，在某些情况下，将反应混合物通过例如超速离心进一步浓缩，然后脱盐，并使用例如Sephadex
Figure BDA0000432948840004651
G-25柱通过色谱法进行纯化。然后使用例如磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)进行洗脱。然后，将溶液无菌过滤和冷冻。可替换地，可以将缀合物低压冻干。
B-3.7确定毒性基团载荷
对在示例性实施方案中所述的得到的缀合物在PBS缓冲液中的溶液，如下确定毒性基团载荷：
通过质谱法确定各种缀合的物质的分子量，从而确定赖氨酸-连接的ADC的毒性基团载荷。首先将抗体缀合物用PNGaseF去糖基化，将样品酸化，然后在HPLC分离后，使用ESI MicroTofQ(Bruker Daltonik)通过质谱法分析样品。将TIC(总离子色谱图)中的信号上的所有波谱累加，并基于MaxEnt解卷积来计算不同缀合物物质的分子量。然后在不同物质的信号积分以后，计算DAR(药物／抗体比)。
为了蛋白鉴别，在去糖基化和/或变性以后，除了分子量确定以外，进行胰蛋白酶消化，从而基于在变性、还原和衍生化以后鉴别的胰蛋白酶肽来证实蛋白的身份。
通过还原的和变性的ADC的反相色谱法，确定半胱氨酸-连接的缀合物的毒性基团载荷。将盐酸胍(GuHCl，28.6mg)和DL-二硫苏糖醇溶液(DTT，500mM，3μL)加入到ADC溶液(1mg／mL，50μL)中。然后将混合物在55℃温育1小时，通过HPLC进行分析。
在辅助1260HPLC系统上进行HPLC分析，在220nm检测，使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合反相柱(目录号PL1912-3802)(2.1×150mm，8μm粒度，
Figure BDA0000432948840004652
)，流速为1mL／min，具有下述梯度：0min，25％B；3min，25％B；28min，50％B。洗脱液A由0.05％的三氟乙酸(TFA)在水中的溶液组成，洗脱液B由0.05％的三氟乙酸在乙腈中的溶液组成。
基于保留时间与未缀合的抗体的轻链(L0)和重链(H0)的对比，分配检测到的峰。将仅在缀合的样品中检测到的峰分配给具有1个毒性基团的轻链(L1)和具有1、2和3个毒性基团的重链(H1、H2、H3)。从峰面积计算抗体的平均毒性基团载荷，所述峰面积如下积分确定：所有峰的积分结果的总和×2，用毒性基团的数目加权，除以具有单一加权的所有峰的积分结果的总和。在分离的情况下，可能发生这样的情形：由于一些峰的共洗脱，不能准确地确定毒性基团载荷。
B-3.8试验ADC的抗原结合
在成功偶联以后，试验了结合剂的结合靶分子的能力。本领域技术人员熟知多种用于实现该目的的方法。例如，借助于ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcoreTM测量)，可以试验缀合物的亲和力。技术人员可以使用常规方法，例如，抗体缀合物的蛋白测定(也参见Doronina等人，NatureBiotechnol.2003；21：778-784和Polson等人，Blood2007，1102：616-623)，测量缀合物浓度。
B4生产抗体-药物缀合物(ADC)
下述方法，将上述的中间体连接至抗-CA9抗体(3ee9)，例如，利用任选地经由抗体蛋白的半胱氨酸或赖氨酸侧链发生的连接。
B-4.1制备抗-CA9抗体的一般方法
通过针对重组抗原淘选HuCAL GOLD噬菌体展示文库，得到针对CA9的抗体，例如，抗体3ee9。将如此分离的Fab抗体片段重新克隆至IgG形式(WO 2007／070538 A2)。
B-4.2在哺乳动物细胞中表达抗-CA9抗体和纯化的一般方法
通过HEK293的瞬时转染，表达抗-CA9IgG抗体(例如，3ee9)，并通过本领域技术人员已知的方法，从它们的细胞上清液纯化。这些方法描述于WO 2007／070538 A2。
B-4.3与半胱氨酸侧链偶联的一般方法
向对应的抗-CA9抗体(例如，3ee9)的溶液(其可能存在于PBS缓冲液或Tris缓冲液中，浓度范围在例如1mg／mL至10mg／mL之间)中，加入3当量的溶解在PBS缓冲液中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)，并在室温搅拌1小时。然后，取决于期望的载荷，加入2-10当量的要偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物(得自中间体102、103、105-109、111-114、117-126、128、129、132-146、148-155、157、159-161、166、171、175-177、184、189、194-195、199-201、205、209、223-224、226、228-231、236和244)，作为在DMSO中的溶液。DMSO的量应当不超过总体积的10％。将该批料在室温搅拌60-120分钟，然后应用于PD10柱(Sephadex
Figure BDA0000432948840004671
G-25，GE Healthcare)，并用PBS缓冲液洗脱。任选地通过超速离心进行进一步浓缩。为了更好地分离低分子组分，如果必要的话，在用PBS缓冲液再次稀释后，重复超滤浓缩步骤。
除非另有说明，通常使用5mg在PBS缓冲液中的对应抗体进行偶联。在PD10柱上纯化以后，得到对应的ADC在3.5mL PBS缓冲液中的溶液。然后对于这些溶液中的每一种，确定给出的各种蛋白浓度。另外，通过下述方法确定抗体的载荷(药物／mAb比)。
根据该方法，制备了在实施例280-289、291-302、304-305、313、315-318、320-321、324-325、327-328和330-331中合成的免疫缀合物。
在显示的结构式中，AK1具有以下含义
AK7=3ee9(部分地还原)-S§1，
其中
§1    表示与琥珀酰亚胺基团的连接
3ee9(部分地还原)代表部分地还原的抗-CA93ee9抗体，
且
S代表部分地还原的抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-4.4    与赖氨酸侧链偶联的一般方法
向浓度范围在1mg／mL至10mg／mL之间的对应的抗-CA抗体3ee9在PBS缓冲液中的溶液中，取决于期望的载荷，加入2-5当量的要偶联的前体化合物(得自中间体104、110、115、116、127、130、131、147、156、158、162、169、178、185、190、202、206、210-216、218、219、227、233、238、240、242、245、247a和247b)，作为在DMSO中的溶液。在室温搅拌30分钟以后，再次加入相同量的在DMSO中的前体化合物。DMSO的量应当不超过总体积的10％。在室温搅拌另外30分钟后，将该批料应用于PD10柱(
Figure BDA0000432948840004672
G-25)，并用PBS缓冲液洗脱。任选地进行进一步超滤浓缩步骤。为了更好地分离低分子组分，如果必要的话，在用PBS缓冲液稀释以后，重复超滤浓缩。
除非另有说明，通常使用5mg在PBS缓冲液中的对应抗体进行偶联。在PD10柱上纯化以后，得到对应的ADC在3.5mL PBS缓冲液中的溶液。然后对于这些溶液中的每一种，确定给出的各种蛋白浓度，并根据下述方法确定抗体的载荷(药物／mAb比)。
根据该方法，制备了在实施例290、303、306、314、319、322-323、326、329、332-333和384中合成的免疫缀合物。
在给出的结构式中，AK2具有以下含义
AK8=抗-CA9-NH§2
其中
§2    表示与羰基的连接
抗-CA9代表未还原的CA9抗体3ee9，
且
NH代表抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-4.5a    合成半胱氨酸加合物的一般方法
将10μmol上述的马来酰亚胺前体化合物放入3mL DMF中，并与2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，并通过制备型HPLC进行纯化。
在给出的结构式中的Cys具有以下含义：
Figure BDA0000432948840004681
其中
§3表示与接头毒性基团单元的连接。
B-4.5b合成赖氨酸加合物的一般方法：
将10μmol上述的活性酯前体化合物放入5mL DMF中，并在有30μmol N，N-二异丙基乙胺存在下与α-氨基-保护的L-赖氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来通过制备型HPLC进行纯化。然后，通过已知方法除去保护基。
根据本发明的缀合物的进一步纯化和表征
成功反应以后，在某些情况下，将反应混合物通过例如超速离心进行浓缩，然后脱盐，并使用例如Sephadex
Figure BDA0000432948840004691
G-25柱通过色谱法进行纯化。使用例如磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)进行洗脱。然后，将溶液无菌过滤和冷冻。可替换地，可以将缀合物低压冻干。
B-4.6确定毒性基团载荷
对在示例性实施方案中所述的得到的缀合物在PBS缓冲液中的溶液，如下确定毒性基团载荷：
通过质谱法确定各种缀合的物质的分子量，从而确定赖氨酸-连接的ADC的毒性基团载荷。首先将抗体缀合物用PNGaseF去糖基化，将样品酸化，接着在HPLC分离后，使用ESI MicroTofQ(Bruker Daltonik)通过质谱法分析样品。将TIC(总离子色谱图)中的信号上的所有波谱累加，并基于MaxEnt解卷积来计算不同缀合物物质的分子量。在不同物质的信号积分以后，计算DAR(药物／抗体比)。
为了蛋白鉴别，在去糖基化和/或变性以后，除了分子量确定以外，进行胰蛋白酶消化，从而基于在变性、还原和衍生化以后鉴别的胰蛋白酶肽来证实蛋白的身份。
通过还原的和变性的ADC的反相色谱法，确定半胱氨酸-连接的缀合物的毒性基团载荷。将盐酸胍(GuHCl，28.6mg)和DL-二硫苏糖醇溶液(DTT，500mM，3μL)加入到ADC溶液(1mg／mL，50μL)中。然后将混合物在55℃温育1小时，然后通过HPLC进行分析。
在辅助1260HPLC系统上进行HPLC分析，在220nm检测，使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合反相柱(目录号PL1912-3802)(2.1×150mm，8μm粒度，
Figure BDA0000432948840004692
)，流速为1mL／min，具有下述梯度：0min，25％B；3min，25％B；28min，50％B。洗脱液A由0.05％的三氟乙酸(TFA)在水中的溶液组成，洗脱液B由0.05％的三氟乙酸在乙腈中的溶液组成。
基于保留时间与未缀合的抗体的轻链(L0)和重链(H0)的对比，分配检测到的峰。将仅在缀合的样品中检测到的峰分配给具有1个毒性基团的轻链(L1)和具有1、2和3个毒性基团的重链(H1、H2、H3)。
从峰面积计算抗体的平均毒性基团载荷，所述峰面积如下积分确定：所有峰的积分结果的总和×2，用毒性基团的数目加权，除以具有单一加权的所有峰的积分结果的总和。在分离的情况下，可能发生这样的情形：由于一些峰的共洗脱，不能准确地确定毒性基团载荷。
B-4.7试验ADC的抗原结合
在成功偶联以后，试验了结合剂的结合靶分子的能力。本领域技术人员熟知多种用于实现该目的的方法；例如，借助于ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcoreTM测量)，可以试验缀合物的亲和力。技术人员可以使用常规方法，例如，抗体缀合物的蛋白测定(也参见Doronina等人，NatureBiotechnol.2003；21：778-784和Polson等人，Blood2007，1102：616-623)，测量缀合物浓度。
实施方案
实施例1
Figure BDA0000432948840004701
蛋白浓度：1.27mg／ml
药物／mAb比：1.5
实施例2
Figure BDA0000432948840004702
蛋白浓度：0.64mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例3
Figure BDA0000432948840004711
蛋白浓度：0.61mg／ml
药物／mAb比：5.1
实施例4
Figure BDA0000432948840004712
蛋白浓度：0.61mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例5
Figure BDA0000432948840004713
蛋白浓度：1.37mg／ml
药物／mAb比：1.9
实施例6
蛋白浓度：1.12mg／ml
药物／mAb比：1.3
实施例7
Figure BDA0000432948840004721
现在使用270mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.46mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例8
蛋白浓度：1.86mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例9
Figure BDA0000432948840004723
蛋白浓度：1.39mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例10
Figure BDA0000432948840004731
蛋白浓度：0.66mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例11
Figure BDA0000432948840004732
蛋白浓度：0.66mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例12
Figure BDA0000432948840004733
蛋白浓度：0.9mg／ml
药物／mAb比：1.1
实施例13
Figure BDA0000432948840004734
蛋白浓度：1.52mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例14
Figure BDA0000432948840004741
蛋白浓度：1.44mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例15
Figure BDA0000432948840004742
蛋白浓度：1.23mg／ml
药物／mAb比：2.7
实施例16
Figure BDA0000432948840004743
蛋白浓度：1.27mg／ml
药物／mAb比：1.3
实施例17
蛋白浓度：1.61mg／ml
药物／mAb比：4.7
实施例18
Figure BDA0000432948840004751
蛋白浓度：1.24mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例19
蛋白浓度：1.49mg／ml
药物／mAb比：1.9
实施例20
Figure BDA0000432948840004753
蛋白浓度：1.49mg／ml
药物／mAb比：2.0
实施例21
Figure BDA0000432948840004761
蛋白浓度：1.46mg／ml
药物／mAb比：>0.9
实施例22
Figure BDA0000432948840004762
蛋白浓度：1.28mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例23
Figure BDA0000432948840004763
蛋白浓度：1.33mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例24
Figure BDA0000432948840004771
蛋白浓度：1.39mg／ml
药物／mAb比：>0.8
实施例25
蛋白浓度：1.26mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例26
Figure BDA0000432948840004773
蛋白浓度：1.51mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例27
Figure BDA0000432948840004781
蛋白浓度：1.6mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例28
Figure BDA0000432948840004782
蛋白浓度：1.21mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例29
Figure BDA0000432948840004783
蛋白浓度：1.53mg／ml
药物／mAb比：2.7
实施例30
Figure BDA0000432948840004784
蛋白浓度：1.4mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例31
Figure BDA0000432948840004791
蛋白浓度：1.66mg／ml
药物／mAb比：2.2
实施例32
Figure BDA0000432948840004792
蛋白浓度：1.21mg／ml
药物／mAb比：2.2
实施例33
Figure BDA0000432948840004793
蛋白浓度：1.46mg／ml
药物／mAb比：2
实施例34
Figure BDA0000432948840004794
蛋白浓度：1.2mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例35
Figure BDA0000432948840004801
蛋白浓度：1.66mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例36
Figure BDA0000432948840004802
蛋白浓度：1.48mg／ml
药物／mAb比：2.2
实施例37
蛋白浓度：1.45mg／ml
药物／mAb比：2.7
实施例38
Figure BDA0000432948840004811
蛋白浓度：1.5mg／ml
药物／mAb比：0.15
实施例39
Figure BDA0000432948840004812
蛋白浓度：1.5mg／ml
药物／mAb比：2.1
实施例40
Figure BDA0000432948840004813
蛋白浓度：1.54mg／ml
药物／mAb比：>0.9
实施例41
Figure BDA0000432948840004814
蛋白浓度：1.39mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例42
Figure BDA0000432948840004821
蛋白浓度：1.52mg／ml
药物／mAb比：1.5
实施例43
Figure BDA0000432948840004822
蛋白浓度：1.44mg／ml
药物／mAb比：2.6
实施例44
Figure BDA0000432948840004823
蛋白浓度：1.45mg／ml
药物／mAb比：1.9
实施例for半胱氨酸加合物
实施例45
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004831
将10mg(10μmol)中间体113溶解于5.2ml DMF中，并与2.28mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到6mg(理论值的54％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=1185(M+H)+。
实施例46
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004832
将9mg(8.3μmol)中间体132溶解于4ml DMF中，并与3mg(24.4μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到6.8mg(理论值的68％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt＝1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m／z=1227(M+H)+。
实施例47
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004841
将10mg(10μmol)中间体106溶解于5.8ml DMF中，并与2.5mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到5.2mg(理论值的46％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.71min；MS(ESIpos)：m／z=1070(M+H)+。
实施例48
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004842
将10mg(10μmol)中间体124溶解于4ml DMF中，并与2.5mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到7.2mg(理论值的64％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt＝1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.8min；MS(ESIpos)：m／z=1071(M+H)+。
实施例49
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004851
将10mg(10μmol)中间体125溶解于4ml DMF中，并与2.4mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到7.7mg(理论值的69％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.91min；MS(ESIpos)：m／z=1140(M+H)+。
实施例50
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004852
将10mg(10μmol)中间体160溶解于3ml DMF中，并与2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到8.1mg(理论值的73％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1274(M+H)+。
实施例51
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840004861
将10mg(10μmol)中间体157溶解于5.2ml DMF中，并与2.28mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到5.8mg(理论值的48％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.45min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m／z=1184(M+H)+。
实施例52
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.73mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例53
Figure BDA0000432948840004871
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：0.86mg／ml
药物／mAb比：4.9
实施例54
Figure BDA0000432948840004872
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.64mg／ml
药物／mAb比：0.7
实施例55
Figure BDA0000432948840004873
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.43mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例56
蛋白浓度：0.96mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例57
Figure BDA0000432948840004882
蛋白浓度：0.44mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例58
Figure BDA0000432948840004883
蛋白浓度：1.09mg／ml
药物／mAb比：2.1
实施例59
蛋白浓度：0.87mg／ml
药物／mAb比：3.8
实施例60
Figure BDA0000432948840004892
蛋白浓度：0.45mg／ml
药物／mAb比：6.5
实施例61
Figure BDA0000432948840004893
蛋白浓度：0.15mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例62
蛋白浓度：0.94mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例63
Figure BDA0000432948840004901
蛋白浓度：0.45mg／ml
药物／mAb比：0.9
实施例64
Figure BDA0000432948840004902
蛋白浓度：0.51mg／ml
药物／mAb比：6.6
实施例65
蛋白浓度：0.47mg／ml
药物／mAb比：4.2
实施例66
Figure BDA0000432948840004911
蛋白浓度：0.45mg／ml
药物／mAb比：5.9
实施例67
Figure BDA0000432948840004912
蛋白浓度：0.47mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例68
蛋白浓度：0.53mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例69
Figure BDA0000432948840004914
蛋白浓度：0.92mg／ml
药物／mAb比：3.5
实施例70
Figure BDA0000432948840004921
蛋白浓度：0.09mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例71
蛋白浓度：0.62mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例72
Figure BDA0000432948840004923
蛋白浓度：0.55mg／ml
药物／mAb比：3.8
实施例73
Figure BDA0000432948840004931
蛋白浓度：0.54mg／ml
药物／mAb比：4.4
实施例74
Figure BDA0000432948840004932
蛋白浓度：0.56mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例75
Figure BDA0000432948840004933
蛋白浓度：1.1mg／ml
药物／mAb比：0.3
实施例76
蛋白浓度：0.61mg／ml
药物／mAb比：0.9
实施例77
Figure BDA0000432948840004942
蛋白浓度：0.57mg／ml
药物／mAb比：1.2
实施例78
Figure BDA0000432948840004943
现在使用100mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.2mg／ml
药物／mAb比：3.4
实施例79
Figure BDA0000432948840004951
蛋白浓度：1.56mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例80
蛋白浓度：0.60mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例81
Figure BDA0000432948840004953
蛋白浓度：0.584mg／ml
药物／mAb比：2.6
实施例82
Figure BDA0000432948840004954
蛋白浓度：0.39mg／ml
药物／mAb比：0.8
实施例83
现在使用100mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩.。
蛋白浓度：13.2mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例84
Figure BDA0000432948840004962
蛋白浓度：0.98ml
药物／mAb比：1.1
实施例85
蛋白浓度：0.55mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例86
Figure BDA0000432948840004971
现在使用40mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.6mg／ml
药物／mAb比：4.1
实施例87
Figure BDA0000432948840004972
蛋白浓度：0.96mg／ml
药物／mAb比：0.4
实施例88
Figure BDA0000432948840004973
现在使用70mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：12.7mg／ml
药物／mAb比：3.6
实施例89
Figure BDA0000432948840004981
蛋白浓度：1.1mg／ml
药物／mAb比：2.7
实施例90
Figure BDA0000432948840004982
蛋白浓度：1.24mg／ml
药物／mAb比：2.6
实施例91
Figure BDA0000432948840004983
蛋白浓度：0.99mg／ml
药物／mAb比：2.3
实施例92
Figure BDA0000432948840004984
蛋白浓度：1.22mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例93
Figure BDA0000432948840004991
蛋白浓度：1.34mg／ml
药物／mAb比：1.2
实施例94
蛋白浓度：1.28mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例95
Figure BDA0000432948840004993
现在使用70mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.9mg／ml
药物／mAb比：5.1
实施例96
Figure BDA0000432948840005001
现在使用100mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.3mg／ml
药物／mAb比：4.3
实施例97
Figure BDA0000432948840005002
蛋白浓度：1.08mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例98
Figure BDA0000432948840005003
蛋白浓度：1.24mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例99
Figure BDA0000432948840005011
蛋白浓度：1.28mg／ml
药物／mAb比：3.8
实施例100
Figure BDA0000432948840005012
蛋白浓度：1.07mg／ml
药物／mAb比：3.0
实施例101
Figure BDA0000432948840005013
蛋白浓度：1.35mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例102
Figure BDA0000432948840005021
现在使用100mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：12.2mg／ml
药物／mAb比：5.6
实施例103
Figure BDA0000432948840005022
蛋白浓度：1.32mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例104
Figure BDA0000432948840005023
蛋白浓度：1.01mg／ml
药物／mAb比：0.9
实施例105
蛋白浓度：1.03mg／ml
药物／mAb比：0.3
实施例106
Figure BDA0000432948840005032
蛋白浓度：0.62mg／ml
药物／mAb比：3.1
通过Vivaspin离心，浓缩该ADC，并再次稀释，随后再次浓缩和稀释。
实施例107
Figure BDA0000432948840005033
蛋白浓度：1.26mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例108
Figure BDA0000432948840005041
蛋白浓度：1.55mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例109
蛋白浓度：1.23mg／ml
药物／mAb比：3.5
实施例110
Figure BDA0000432948840005043
蛋白浓度：1.44mg／ml
药物／mAb比：4.1
实施例111
Figure BDA0000432948840005051
蛋白浓度：0.92mg／ml
药物／mAb比：3.5
实施例112
Figure BDA0000432948840005052
现在使用5mg MF-T在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：0.77mg／ml
药物／mAb比：>1.5(不可准确检测)
实施例113
Figure BDA0000432948840005053
蛋白浓度：1.3mg／ml
药物／mAb比：2.0
实施例114
Figure BDA0000432948840005061
现在使用500mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.2mg／ml
药物／mAb比：3.7
实施例115
Figure BDA0000432948840005062
现在使用100mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.4mg／ml
药物／mAb比：3.9
实施例116
现在使用60mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.5mg／ml
药物／mAb比：4.4
实施例117
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将10mg(10μmol)中间体157溶解于5.2ml DMF中，并与2.28mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到5.8mg(理论值的48％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.45min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m／z=1184(M+H)+。
实施例118
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005072
将10mg(10μmol)中间体113溶解于5.2ml DMF中，并与2.28mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到6mg(理论值的54％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=1185(M+H)+。
实施例119
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005081
将9mg(8.3μmol)中间体132溶解于4ml DMF中，并与3mg(24.4μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到6.8mg(理论值的68％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m／z=1227(M+H)+。
实施例120
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-41H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005091
将10mg(10μmol)中间体106溶解于5.8ml DMF中，并与2.5mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到5.2mg(理论值的46％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.71min；MS(ESIpos)：m／z=1070(M+H)+。
实施例121
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将10mg(10μmol)中间体124溶解于4ml DMF中，并与2.5mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到7.2mg(理论值的64％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.8min；MS(ESIpos)：m／z=1071(M+H)+。
实施例122
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005101
将10mg(10μmol)中间体125溶解于4ml DMF中，并与2.4mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到7.7mg(理论值的69％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.91min；MS(ESIpos)：m／z=1140(M+H)+。
实施例123
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005102
将10mg(10μmol)中间体160溶解于3ml DMF中，并与2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到8.1mg(理论值的73％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1274(M+H)+。
实施例124
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005111
将3.5mg(3μmol)中间体159溶解于1ml DMF中，并与0.76mg(6μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到2.6mg(理论值的65％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.75min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=1235(M+H)+。
实施例125
N-(6-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将3.6mg(3μmol)中间体129溶解于1ml DMF中，并与0.77mg(6μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到1.55mg(理论值的39％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=1255(M+H)+。
实施例126
Figure BDA0000432948840005121
现在使用5mg MF-T[a]在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：0.9mg／ml
药物／mAb比：1
实施例127
Figure BDA0000432948840005122
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.86mg／ml
药物／mAb比：2.9
实施例128
Figure BDA0000432948840005131
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.05mg／ml
药物／mAb比：4.4
实施例129
Figure BDA0000432948840005132
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.13mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例130
Figure BDA0000432948840005133
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.41mg／ml
药物／mAb比：3.9
实施例131
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.38mg／ml
药物／mAb比：4.3
实施例132
Figure BDA0000432948840005142
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.32mg／ml
药物／mAb比：1
实施例133
Figure BDA0000432948840005143
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.14mg／ml
药物／mAb比：5.3
实施例134
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.25mg／ml
药物／mAb比：4.8
实施例135
Figure BDA0000432948840005152
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.12mg／ml
药物／mAb比：1.7
实施例136
Figure BDA0000432948840005153
现在使用150mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩，用PBS再次稀释，并再次浓缩。
蛋白浓度：12.2mg／ml
药物／mAb比：4.1
实施例137
Figure BDA0000432948840005161
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：0.86mg／ml
药物／mAb比：3.4
实施例138
Figure BDA0000432948840005162
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.43mg／ml
药物／mAb比：3.7
实施例139
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：0.8mg／ml
药物／mAb比：0.7
实施例140
Figure BDA0000432948840005172
现在使用50mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩，用PBS再次稀释，并再次浓缩。
蛋白浓度：9.5mg／ml
药物／mAb比：2.9
实施例141
Figure BDA0000432948840005173
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.52mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例142
Figure BDA0000432948840005181
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.25mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例143
Figure BDA0000432948840005182
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.47mg／ml
药物／mAb比：1.6
实施例144
Figure BDA0000432948840005183
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：0.99mg／ml
药物／mAb比：5.5
实施例145
Figure BDA0000432948840005191
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.02mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例146
Figure BDA0000432948840005192
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.63mg／ml
药物／mAb比：3.8
实施例147
Figure BDA0000432948840005201
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.27mg／ml
药物／mAb比：3.0
实施例148
Figure BDA0000432948840005202
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.58mg／ml
药物／mAb比：0.6
实施例149
Figure BDA0000432948840005203
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.31mg／ml
药物／mAb比：6.6
实施例150
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.75mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例151
Figure BDA0000432948840005212
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.44mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例152
Figure BDA0000432948840005221
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.96mg／ml
药物／mAb比：5.6
实施例153
Figure BDA0000432948840005222
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.58mg／ml
药物／mAb比：4.2
实施例154
Figure BDA0000432948840005223
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.48mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例155
Figure BDA0000432948840005231
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.5mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例156
Figure BDA0000432948840005232
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：mg／ml
药物／mAb比：
实施例157
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.62mg／ml
药物／mAb比：2.2
实施例158
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.37mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例159
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.43mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例160＊＊
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840005243
将15.5mg(15μmol)中间体210溶解于5ml DMF中，并与4.4mg(18μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和7.7μL(44μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC纯化残余物。得到14mg(理论值的81％)标题化合物的受保护的中间体，然后将其溶解于1ml二氯甲烷中，并用1ml三氟乙酸去保护。将反应混合物浓缩，并在从乙腈／水1：1低压冻干残余物以后，得到15mg(理论值97％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min；MS(ESIpos)：m／z=1083(M+H)+。
实施例161
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005251
将40mg(40μmol)中间体226溶解于5ml DMF中，并与11.5mg(40μmol)N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸和13μl(80μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到32.5mg(理论值的70％)标题化合物的受保护的中间体。
将这32.5mg中间体溶解在10ml甲醇中，并在加入2mg10％活性炭载钯以后，在标准氢压力下在室温氢化30min。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。从二噁烷／水1：1低压冻干残余物以后，得到26mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m／z=1014(M+H)+。
实施例162
N-[(18S)-18-氨基-18-羧基-12-氧代-3，6，9-三氧杂-13-氮杂十八-1-基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840005261
将3.5mg(3μmol)中间体202溶解于2ml DMF中，并与0.8mg(3μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和1.6μl(10μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。将残余物溶解于乙腈／水1：1中，用三氟乙酸调节至pH2，然后借助于制备型HPLC进行纯化。得到1mg(理论值的25％)标题化合物的受保护的中间体，然后将其溶解于500μl二氯甲烷中，并用500μl三氟乙酸去保护。将反应混合物浓缩并在从乙腈／水1：1低压冻干残余物以后，得到1mg(理论值的89％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m／z=1173(M+H)+。
实施例163
Figure BDA0000432948840005262
现在使用70mg抗-C4.4a M31-B01在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：12.2mg／ml
药物／mAb比：1.5
实施例164
Figure BDA0000432948840005271
蛋白浓度：0.87mg／ml
药物／mAb比：5.8
实施例165
蛋白浓度：1.16mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例166
Figure BDA0000432948840005273
蛋白浓度：1.24mg／ml
药物／mAb比：1.6
实施例167
Figure BDA0000432948840005274
蛋白浓度：0.88mg／ml
药物／mAb比：6.9
实施例168
蛋白浓度：1.2mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例169
Figure BDA0000432948840005282
蛋白浓度：0.9mg／ml
药物／mAb比：3.9
实施例170
蛋白浓度：0.52mg／ml
药物／mAb比：1.6
实施例171
Figure BDA0000432948840005291
蛋白浓度：0.47mg／ml
药物／mAb比：6.6
实施例172
Figure BDA0000432948840005292
蛋白浓度：0.77mg／ml
药物／mAb比：6.9
实施例173
Figure BDA0000432948840005293
蛋白浓度：0.47mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例174
Figure BDA0000432948840005294
蛋白浓度：1.46mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例175
Figure BDA0000432948840005301
蛋白浓度：0.45mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例176
蛋白浓度：0.98mg／ml
药物／mAb比：3.6
实施例177
Figure BDA0000432948840005303
70
现在使用70mg抗-C4.4a M31-B01在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：9.42mg／ml
药物／mAb比：4.1
实施例178
Figure BDA0000432948840005311
蛋白浓度：0.65mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例179
Figure BDA0000432948840005312
蛋白浓度：1.07mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例180
Figure BDA0000432948840005313
蛋白浓度：0.47mg／ml
药物／mAb比：4.4
实施例181
Figure BDA0000432948840005321
蛋白浓度：0.43mg／ml
药物／mAb比：4.8
实施例182
Figure BDA0000432948840005322
蛋白浓度：1.01mg／ml
药物／mAb比：2.6
实施例183
Figure BDA0000432948840005323
蛋白浓度：0.53mg／ml
药物／mAb比：0.6
实施例184
Figure BDA0000432948840005324
蛋白浓度：0.55mg／ml
药物／mAb比：1.3
实施例185
Figure BDA0000432948840005331
蛋白浓度：0.65mg／ml
药物／mAb比：1.1
实施例186
蛋白浓度：1.04
药物／mAb比：3.5
实施例187
Figure BDA0000432948840005333
蛋白浓度：0.62mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例188
Figure BDA0000432948840005334
现在使用90mg抗-C4.4a M31-B01在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.2mg／ml
药物／mAb比：2.3
实施例189
Figure BDA0000432948840005341
蛋白浓度：1.11mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例190
Figure BDA0000432948840005342
现在使用70mg抗-C4.4a M31-B01在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.7mg／ml
药物／mAb比：2.2
实施例191
Figure BDA0000432948840005343
蛋白浓度：0.87mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例192
Figure BDA0000432948840005351
蛋白浓度：1.3mg／ml
药物／mAb比：2.1
实施例193
Figure BDA0000432948840005352
蛋白浓度：1.3mg／ml
药物／mAb比：0.3
实施例194
Figure BDA0000432948840005353
现在使用70mg抗-C4.4a M31-B01在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：12.0mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例195
现在使用90mg抗-C4.4a M31-B01在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.2mg／ml
药物／mAb比：4.3
实施例196
Figure BDA0000432948840005362
蛋白浓度：1.37mg／ml
药物／mAb比：2.6
实施例197
Figure BDA0000432948840005363
蛋白浓度：1.14mg／ml
药物／mAb比：2.0
实施例198
Figure BDA0000432948840005371
蛋白浓度：1.07mg／ml
药物／mAb比：3.5
实施例199
Figure BDA0000432948840005372
蛋白浓度：1.14mg／ml
药物／mAb比：1.9
实施例200
Figure BDA0000432948840005373
蛋白浓度：1.22mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例201
Figure BDA0000432948840005374
蛋白浓度：1.3mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例202
蛋白浓度：1.23mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例203
Figure BDA0000432948840005382
蛋白浓度：1.64mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例204
Figure BDA0000432948840005383
蛋白浓度：1.07mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例205
Figure BDA0000432948840005391
蛋白浓度：1.14mg／ml
药物／mAb比：2.3
实施例206
Figure BDA0000432948840005392
蛋白浓度：1.23mg／ml
药物／mAb比：3.4
实施例207
Figure BDA0000432948840005393
蛋白浓度：1.22mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例208
Figure BDA0000432948840005394
蛋白浓度：1.22mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例209
Figure BDA0000432948840005401
蛋白浓度：1.32mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例210
Figure BDA0000432948840005402
蛋白浓度：1.44mg／ml
药物／mAb比：2.3
实施例211
现在使用250mg抗-C4.4a B01-10在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：12.8mg／ml
药物／mAb比：5.2
实施例212
Figure BDA0000432948840005411
蛋白浓度：0.9mg／ml
药物／mAb比：2
实施例213
Figure BDA0000432948840005412
现在使用250mg抗-C4.4a B01-3在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：8.0mg／ml
药物／mAb比：4.5
实施例214
Figure BDA0000432948840005413
现在使用250mg抗-C4.4a B01-10在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：12.3mg／ml
药物／mAb比：5.2
实施例215
Figure BDA0000432948840005421
现在使用250mg抗-C4.4a B01-10在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.2mg／ml
药物／mAb比：4.4
实施例216
Figure BDA0000432948840005422
现在使用50mg抗-C4.4a B01-3在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.5mg／ml
药物／mAb比：5.2
实施例217
Figure BDA0000432948840005423
现在使用250mg抗-C4.4a D02-6在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：13mg／ml
药物／mAb比：5.2
实施例218
Figure BDA0000432948840005431
现在使用250mg抗-C4.4a B01-3在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10.3mg／ml
药物／mAb比：4.9
实施例219
Figure BDA0000432948840005432
蛋白浓度：0.88mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例220
Figure BDA0000432948840005433
蛋白浓度：1.18mg／ml
药物／mAb比：3.4
实施例221
Figure BDA0000432948840005434
蛋白浓度：1.23mg／ml
药物／mAb比：3.0
实施例222
Figure BDA0000432948840005441
蛋白浓度：1.3mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例223
蛋白浓度：1.11mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例224
Figure BDA0000432948840005443
蛋白浓度：1.25mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例225
蛋白浓度：0.88mg／ml
药物／mAb比：5.0
实施例226
Figure BDA0000432948840005452
蛋白浓度：1.23mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例227
Figure BDA0000432948840005453
蛋白浓度：0.93mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例228
Figure BDA0000432948840005461
蛋白浓度：0.85mg／ml
药物／mAb比：5.3
实施例229
Figure BDA0000432948840005462
蛋白浓度：1.51mg／ml
药物／mAb比：1.4
实施例230
Figure BDA0000432948840005463
现在使用150mg抗-C4.4a B01-3在DPBS pH7.4中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.0mg／ml
药物／mAb比：4.5
实施例231
Figure BDA0000432948840005471
蛋白浓度：1.2mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例232
蛋白浓度：1.25mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例233
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005473
将10mg(10μmol)中间体157溶解于5.2ml DMF中，并与2.28mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到5.8mg(理论值的48％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.45min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m／z=1184(M+H)+。
实施例234
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005481
将10mg(10μmol)中间体113溶解于5.2ml DMF中，并与2.28mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到6mg(理论值的54％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=1185(M+H)+。
实施例235
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005482
将9mg(8.3μmol)中间体132溶解于4ml DMF中，并与3mg(24.4μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到6.8mg(理论值的68％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m／z=1227(M+H)+。
实施例236
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005491
将10mg(10μmol)中间体106溶解于5.8ml DMF中，并与2.5mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到5.2mg(理论值的46％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.71min；MS(ESIpos)：m／z=1070(M+H)+。
实施例237
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005501
将10mg(10μmol)中间体124溶解于4ml DMF中，并与2.5mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到7.2mg(理论值的64％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.8min；MS(ESIpos)：m／z=1071(M+H)+。
实施例238
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005502
将10mg(10μmol)中间体125溶解于4ml DMF中，并与2.4mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到7.7mg(理论值的69％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.91min；MS(ESIpos)：m／z=1140(M+H)+。
实施例239
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005511
将10mg(10μmol)中间体160溶解于3ml DMF中，并与2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到8.1mg(理论值的73％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1274(M+H)+。
实施例240
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005512
将3.5mg(3μmol)中间体159溶解于1ml DMF中，并与0.76mg(6μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到2.6mg(理论值的65％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.75min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m／z=1235(M+H)+。
实施例241
N-(6-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005521
将3.6mg(3μmol)中间体129溶解于1ml DMF中，并与0.77mg(6μmol)L-半胱氨酸混合。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到1.55mg(理论值的39％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m／z=1255(M+H)+。
实施例242
Figure BDA0000432948840005522
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：0.83mg／ml
药物／mAb比：1.6
实施例243
Figure BDA0000432948840005531
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.59mg／ml
药物／mAb比：3.1
药物／mAb比：2.9
实施例244
Figure BDA0000432948840005532
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.25mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例245
Figure BDA0000432948840005541
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.27mg／ml
药物／mAb比：3.6
实施例246
Figure BDA0000432948840005542
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.54mg／ml
药物／mAb比：4.7
实施例247
Figure BDA0000432948840005543
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.73mg／ml
药物／mAb比：4.7
实施例248
Figure BDA0000432948840005551
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将反应混合物通过超速离心进行浓缩并再次稀释。
蛋白浓度：1.66mg／ml
药物／mAb比：1.3
实施例249
Figure BDA0000432948840005552
蛋白浓度：2.11mg／ml
药物／mAb比：5.5
实施例250
Figure BDA0000432948840005561
蛋白浓度：1.53mg／ml
药物／mAb比：3.4
实施例251
蛋白浓度：1.5mg／ml
药物／mAb比：0.2
实施例252
Figure BDA0000432948840005563
蛋白浓度：1.32mg／ml
药物／mAb比：0.1
实施例253
Figure BDA0000432948840005571
现在使用80mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，用PBS再次稀释，并再次浓缩。
蛋白浓度：10.3mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例254
Figure BDA0000432948840005572
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.09mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例255
Figure BDA0000432948840005573
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.52mg／ml
药物／mAb比：4.2
实施例256
Figure BDA0000432948840005581
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.1mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例257
Figure BDA0000432948840005582
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.43mg／ml
药物／mAb比：4.8
实施例258
Figure BDA0000432948840005591
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，m用PBS再次稀释，并再次浓缩。
蛋白浓度：1.36mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例259
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.33mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例260
Figure BDA0000432948840005593
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.33mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例261
Figure BDA0000432948840005601
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.47mg／ml
药物／mAb比：1.6
实施例262
Figure BDA0000432948840005602
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.49mg／ml
药物／mAb比：4.5
实施例263
Figure BDA0000432948840005603
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.29mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例264
Figure BDA0000432948840005611
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.74mg／ml
药物／mAb比：3.5
实施例265
Figure BDA0000432948840005612
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.09mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例266
Figure BDA0000432948840005613
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.63mg／ml
药物／mAb比：0.2
实施例267
Figure BDA0000432948840005621
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.41mg／ml
药物／mAb比：7.6
实施例268
Figure BDA0000432948840005622
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：2.0mg／ml
药物／mAb比：1.6
实施例269
Figure BDA0000432948840005631
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.67mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例270
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.91mg／ml
药物／mAb比：5.3
实施例271
Figure BDA0000432948840005633
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.82mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例272
Figure BDA0000432948840005641
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.9mg／ml
药物／mAb比：4.2
实施例273
Figure BDA0000432948840005642
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.89mg／ml
药物／mAb比：2.7
实施例274
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.73mg／ml
药物／mAb比：2.3
实施例275
Figure BDA0000432948840005651
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.71mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例276
Figure BDA0000432948840005652
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.47mg／ml
药物／mAb比：3.9
实施例277
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840005653
将15.5mg(15μmol)中间体210溶解于5ml DMF中，并与4.4mg(18μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及7.7μL(44μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。接着，借助于制备型HPLC纯化残余物。得到14mg(理论值的81％)标题化合物的受保护的中间体，随后将其溶解于1ml二氯甲烷中，并用1ml三氟乙酸去保护。将该批料浓缩，并在从乙腈／水(1：1)低压冻干残余物以后，得到15mg(理论值的97％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min；MS(ESIpos)：m／z=1083(M+H)+。
实施例278
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005661
将40mg(40μmol)中间体227溶解于5ml DMF中，并与11.5mg(40μmol)N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸以及13μl(80μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到32.5mg(理论值的70％)标题化合物的受保护的中间体。
将这些32.5mg中间体溶解在10ml甲醇中，并在加入2mg10％活性炭载钯以后，在标准氢压力下在室温氢化30min。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。从二噁烷／水1：1低压冻干残余物以后，得到26mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m／z=1014(M+H)+。
实施例279
N-[(18S)-18-氨基-18-羧基-12-氧代-3，6，9-三氧杂-13-氮杂十八-1-基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840005671
将3.5mg(3μmol)中间体202溶解于2ml DMF中，并与0.8mg(3μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及1.6μl(10μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。接着，将残余物溶解于乙腈／水(1：1)中，用三氟乙酸调节至pH2，并借助于制备型HPLC进行纯化。得到1mg(理论值的25％)标题化合物的受保护的中间体，随后将其溶解于500μl二氯甲烷中，并用500μl三氟乙酸去保护。将该批料浓缩，并在从乙腈／水(1：1)低压冻干残余物以后，得到1mg(理论值的89％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m／z=1173(M+H)+。
实施例280
Figure BDA0000432948840005672
蛋白浓度：0.9mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例281
Figure BDA0000432948840005681
蛋白浓度：1.08mg／ml
药物／mAb比：1.1
实施例282
Figure BDA0000432948840005682
蛋白浓度：0.98mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例283
Figure BDA0000432948840005683
蛋白浓度：1.23mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例284
Figure BDA0000432948840005684
现在使用100mg抗-CA9进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。然后将溶液再次稀释，再次浓缩，并再次重复该过程。
蛋白浓度：9.2mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例285
蛋白浓度：1.21mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例286
Figure BDA0000432948840005692
蛋白浓度：1.26mg／ml
药物／mAb比：4.2
实施例287
Figure BDA0000432948840005693
蛋白浓度：1.01mg／ml
药物／mAb比：3.0
实施例288
Figure BDA0000432948840005701
蛋白浓度：1.28mg／ml
药物／mAb比：2.3
实施例289
蛋白浓度：1.12mg／ml
药物／mAb比：2.6
实施例290
蛋白浓度：1.4mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例291
蛋白浓度：1.3mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例292
Figure BDA0000432948840005711
蛋白浓度：1.27mg／ml
药物／mAb比：2.6
实施例293
Figure BDA0000432948840005712
蛋白浓度：1.55mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例294
Figure BDA0000432948840005713
现在使用100mg抗-CA9进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.8mg／ml
药物／mAb比：4.4
实施例295
Figure BDA0000432948840005721
现在使用100mg抗-CA9进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：12.29mg／ml
药物／mAb比：3.8
实施例296
Figure BDA0000432948840005722
蛋白浓度：1.1mg／ml
药物／mAb比：1.6
实施例297
Figure BDA0000432948840005723
蛋白浓度：1.00mg／ml
药物／mAb比：1.9
实施例298
现在使用100mg抗-CA9进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.5mg／ml
药物／mAb比：4.9
实施例299
Figure BDA0000432948840005732
蛋白浓度：0.98mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例300
Figure BDA0000432948840005733
蛋白浓度：0.99mg／ml
药物／mAb比：2.0
实施例301
Figure BDA0000432948840005741
蛋白浓度：0.87mg／ml
药物／mAb比：2.1
实施例302
Figure BDA0000432948840005742
现在使用100mg抗-CA9进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：12.2mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例303
Figure BDA0000432948840005743
蛋白浓度：1.58mg／ml
药物／mAb比：1.9
实施例304
Figure BDA0000432948840005751
现在使用70mg抗-CA9进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.5mg／ml
药物／mAb比：3.9
实施例305
Figure BDA0000432948840005752
现在使用60mg抗-CA9进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：11.6mg／ml
药物／mAb比：3.9
实施例306
Figure BDA0000432948840005753
现在使用60mg抗-CA9进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。
蛋白浓度：10mg／ml
实施例307
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005761
将10mg(10μmol)中间体113溶解于5.2ml DMF中，并与2.28mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到6mg(理论值的54％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m／z=1185(M+H)+。
实施例308
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-{[(1S，2R)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基羰基)-2-苯基环丙基]氨基}-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005762
将9mg(8.3μmol)中间体132溶解于4ml DMF中，并与3mg(24.4μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到6.8mg(理论值的68％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m／z=1227(M+H)+。
实施例309
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005771
将10mg(10μmol)中间体106溶解于5.8ml DMF中，并与2.5mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到5.2mg(理论值的46％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法11)：Rt=0.71min；MS(ESIpos)：m／z=1070(M+H)+。
实施例310
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005772
将10mg(10μmol)中间体124溶解于4ml DMF中，并与2.5mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到7.2mg(理论值的64％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.6min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.8min；MS(ESIpos)：m／z=1071(M+H)+。
实施例311
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-341H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005781
将10mg(10μmol)中间体125溶解于4ml DMF中，并与2.4mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到7.7mg(理论值的69％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法2)：Rt=1.91min；MS(ESIpos)：m／z=1140(M+H)+。
实施例312
N-(4-{2-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-1-(苄基氨基)-1-(1H-吲哚-3-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005791
将10mg(10μmol)中间体160溶解于3ml DMF中，并与2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸混合。将该批料在室温搅拌2小时，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到8.1mg(理论值的73％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m／z=1274(M+H)+。
实施例313
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.23mg／ml
药物／mAb比：～1-1.5
实施例314
Figure BDA0000432948840005793
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.98mg／ml
药物／mAb比：2.8
实施例315
Figure BDA0000432948840005801
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.0mg／ml
药物／mAb比：3
实施例316
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.59mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例317
Figure BDA0000432948840005803
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.75mg／ml
药物／mAb比：3.3
实施例318
Figure BDA0000432948840005811
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.54mg／ml
药物／mAb比：3.5
实施例319
Figure BDA0000432948840005812
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：2mg／ml
药物／mAb比：1.1
实施例320
Figure BDA0000432948840005821
蛋白浓度：1.66mg／ml
药物／mAb比：4.9
实施例321
Figure BDA0000432948840005822
蛋白浓度：1.7mg／ml
药物／mAb比：3.0
实施例322
Figure BDA0000432948840005823
蛋白浓度：1.08mg／ml
药物／mAb比：1.9
实施例323
Figure BDA0000432948840005831
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.57mg／ml
药物／mAb比：2.9
实施例324
Figure BDA0000432948840005832
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.7mg／ml
药物／mAb比：1.4
实施例325
Figure BDA0000432948840005833
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.53mg／ml
药物／mAb比：3.6
实施例326
Figure BDA0000432948840005841
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.77mg／ml
药物／mAb比：6.1
实施例327
Figure BDA0000432948840005842
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.14mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例328
Figure BDA0000432948840005843
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.57mg／ml
药物／mAb比：3.8
实施例329
Figure BDA0000432948840005851
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.72mg／ml
药物／mAb比：3.9
实施例330
Figure BDA0000432948840005852
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.56mg／ml
药物／mAb比：2.9
实施例331
Figure BDA0000432948840005853
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.81mg／ml
药物／mAb比：3.5
实施例332
Figure BDA0000432948840005861
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.54mg／ml
药物／mAb比：1.3
实施例333
Figure BDA0000432948840005862
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.72mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例334
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840005871
将15.5mg(15μmol)中间体210溶解于5ml DMF中，并与4.4mg(18μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及7.7μl(44μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。接着，借助于制备型HPLC纯化残余物。得到14mg(理论值的81％)标题化合物的受保护的中间体，然后将其溶解于1ml二氯甲烷中，并用1ml三氟乙酸去保护。将反应混合物浓缩，并在从乙腈／水(1：1)低压冻干残余物以后，得到15mg(理论值的97％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min；MS(ESIpos)：m／z=1083(M+H)+。
实施例335
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
将40mg(40μmol)中间体227溶解于5ml DMF中，并与11.5mg(40μmol)N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸以及13μl(80μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到32.5mg(理论值的70％)标题化合物的受保护的中间体。
将32.5mg该中间体溶解在10ml甲醇中，并在加入2mg10％活性炭载钯以后，在标准氢压力下在室温氢化30min。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。从二噁烷／水(1：1)低压冻干残余物以后，得到26mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m／z=1014(M+H)+。
实施例336
N-[(18S)-18-氨基-18-羧基-12-氧代-3，6，9-三氧杂-13-氮杂十八-1-基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
将3.5mg(3μmol)中间体202溶解于2ml DMF中，并与0.8mg(3μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及1.6μl(10μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。接着，将残余物溶解于乙腈／水(1：1)中，用三氟乙酸调节至pH2，然后借助于制备型HPLC进行纯化。得到1mg(理论值的25％)标题化合物的受保护的中间体，随后将其溶解于500μl二氯甲烷中，并用500μl三氟乙酸去保护。浓缩反应混合物，并在从乙腈／水(1：1)低压冻干残余物以后，得到1mg(理论值的89％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m／z=1173(M+H)+。
实施例337
Figure BDA0000432948840005891
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.57mg／ml
药物／mAb比：4.6
实施例338
Figure BDA0000432948840005892
现在使用5mg西妥昔单抗进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.48mg／ml
药物／mAb比：3.4
实施例339
Figure BDA0000432948840005893
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.21mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例340
Figure BDA0000432948840005901
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.75mg／ml
药物／mAb比：3.4
实施例341
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.69mg／ml
药物／mAb比：2.9
实施例342
Figure BDA0000432948840005903
现在使用5mg西妥昔单抗进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.27mg／ml
药物／mAb比：2.9
实施例343
现在使用5mg帕木单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.27mg／ml
药物／mAb比：不可检测
实施例344
Figure BDA0000432948840005912
现在使用5mg西妥昔单抗进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.55mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例345
Figure BDA0000432948840005913
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.67mg／ml
药物／mAb比：3.5
实施例346
Figure BDA0000432948840005921
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.44mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例347
Figure BDA0000432948840005922
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.73mg／ml
药物／mAb比：1.2
实施例348
Figure BDA0000432948840005931
现在使用2mg抗-PDL1在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.04mg／ml
药物／mAb比：4.8
实施例349
Figure BDA0000432948840005932
现在使用3mg抗-PDL1在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.7mg／ml
药物／mAb比：2.3
实施例350
现在使用2mg抗-ICOSLG在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.77mg／ml
药物／mAb比：3.7
实施例351
Figure BDA0000432948840005941
现在使用4mg抗-FGFR3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.41mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例352
Figure BDA0000432948840005942
现在使用3mg赫赛汀在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.49mg／ml
药物／mAb比：2.3
实施例353
Figure BDA0000432948840005943
现在使用5mg赫赛汀在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.62mg／ml
药物／mAb比：5.0
实施例354
Figure BDA0000432948840005951
现在使用5mg赫赛汀在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.63mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例355
Figure BDA0000432948840005952
现在使用5mg赫赛汀在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.65mg／ml
药物／mAb比：3.9
实施例356
Figure BDA0000432948840005953
现在使用5mg赫赛汀在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.78mg／ml
药物／mAb比：3.1
实施例357
Figure BDA0000432948840005961
现在使用5mg赫赛汀在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.72mg／ml
药物／mAb比：3.2
实施例358
Figure BDA0000432948840005962
现在使用5mg赫赛汀在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.95mg／ml
药物／mAb比：～3.7
实施例359
Figure BDA0000432948840005963
现在使用5mg赫赛汀在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.79mg／ml
药物／mAb比：9.1
实施例360
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840005971
将15.5mg(15μmol)中间体210溶解于5ml DMF中，并与4.4mg(18μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及7.7μl(44μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。借助于制备型HPLC纯化残余物。得到14mg(理论值的81％)标题化合物的受保护的中间体，然后将其溶解于1ml二氯甲烷中，并用1ml三氟乙酸去保护。将该批料浓缩，并在从乙腈／水(1：1)低压冻干残余物以后，得到15mg(理论值的97％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.8min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min；MS(ESIpos)：m／z=1083(M+H)+。
实施例361
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺
Figure BDA0000432948840005981
将40mg(40μmol)中间体227溶解于5ml DMF中，并与11.5mg(40μmol)N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸以及13μl(80μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩，接下来借助于制备型HPLC进行纯化。得到32.5mg(理论值的70％)标题化合物的受保护的中间体。
将32.5mg该中间体溶解于10ml甲醇中，并在加入2mg10％活性炭载钯以后，在标准氢压力下在室温氢化。然后滤出催化剂，并在真空中除去溶剂。从二噁烷／水(1：1)低压冻干残余物以后，得到26mg(理论值的99％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.76min；MS(ESIpos)：m／z=1014(M+H)+。
实施例362
N-[(18S)-18-氨基-18-羧基-12-氧代-3，6，9-三氧杂-13-氮杂十八-1-基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840005982
将3.5mg(3μmol)中间体202溶解于2ml DMF中，并与0.8mg(3μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及1.6μl(10μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在真空中浓缩。将残余物溶解于乙腈／水(1：1)中，用三氟乙酸调节至pH2，然后通过制备型HPLC进行纯化。得到1mg(理论值的25％)标题化合物的受保护的中间体，随后将其溶解于500μl二氯甲烷中，并用500μl三氟乙酸去保护。将该批料浓缩，并在从乙腈／水(1：1)低压冻干残余物以后，得到1mg(理论值的89％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.9min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m／z=1173(M+H)+。
实施例363
Figure BDA0000432948840005991
现在使用2.2mg抗-TYRP1在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.14mg／ml
药物／mAb比：4.1
实施例364
现在使用3mg抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.17mg／ml
药物／mAb比：3.0
实施例365
Figure BDA0000432948840006001
现在使用3mg抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.25mg／ml
药物／mAb比：2.9
实施例366
Figure BDA0000432948840006002
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：0.81mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例367
Figure BDA0000432948840006003
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.06mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例368
Figure BDA0000432948840006011
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.36mg／ml
药物／mAb比：7.2
实施例369
现在使用5mg MF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.57mg／ml
药物／mAb比：2.9
实施例370
Figure BDA0000432948840006021
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：0.89mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例371
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：0.57mg／ml
药物／mAb比：1.5
实施例372
Figure BDA0000432948840006023
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.39mg／ml
药物／mAb比：7.1
实施例373
Figure BDA0000432948840006031
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.54mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例374
Figure BDA0000432948840006032
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.55mg／ml
药物／mAb比：1.8
实施例375
现在使用5mg西妥昔单抗进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.36mg／ml
药物／mAb比：1.9
实施例376
Figure BDA0000432948840006041
现在使用5mg西妥昔单抗在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.73mg／ml
药物／mAb比：3.7
实施例377
Figure BDA0000432948840006042
现在使用5mgMF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.44mg／ml
药物／mAb比：2.5
实施例378
Figure BDA0000432948840006051
现在使用5mgMF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并再次稀释。
蛋白浓度：1.74mg／ml
药物／mAb比：3.6
实施例379(非对映异构体1)
Figure BDA0000432948840006052
现在使用中间体247a和5mgMF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.57mg／ml
药物／mAb比：4.2
实施例380(非对映异构体2)
Figure BDA0000432948840006053
现在使用中间体247a和5mgMF-Ta在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩。并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.42mg／ml
药物／mAb比：4.0
实施例381
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-苏氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840006061
将8.6mg(8μmol)中间体240溶解于5ml DMF中，并与4.0mg(16μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及2μl(16μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌4小时，然后再次与相同量的N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和N，N-二异丙基乙胺混合，并在室温搅拌过夜。然后将该批料在真空中浓缩。接着，借助于制备型HPLC纯化残余物。得到7mg(理论值的72％)标题化合物的受保护的中间体，然后将其溶解于1ml二氯甲烷中，并用0.5ml三氟乙酸去保护。将该批料浓缩，并通过制备型HPLC纯化残余物。在高真空下干燥以后，得到3.3mg(理论值的47％)标题化合物。
HPLC(方法5)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.8min；MS(ESIpos)：m／z=1084(M+H)+。
实施例382
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(4-羟基苯基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840006071
将8mg(8μmol)中间体242溶解于3ml DMF中，并与2.9mg(12μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及2.7μl(16μmol)N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后再次与相同量的N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和N，N-二异丙基乙胺混合，然后在室温搅拌另外4小时。然后将该批料在真空中浓缩。接着，借助于制备型HPLC纯化残余物。从乙腈／水低压冻干以后，得到6.5mg(理论值的72％)标题化合物的受保护的中间体，然后将其溶解于5ml二氯甲烷中，并用0.75ml三氟乙酸去保护。将该批料浓缩，并在从二噁烷／水低压冻干残余物以后，得到5mg(理论值的76％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.7min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.69min；MS(ESIpos)：m／z=1059(M+H)+。
实施例383
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(4-羟基苯基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐
Figure BDA0000432948840006072
首先将38mg(41μmol)中间体248转化成N-羟基琥珀酰亚胺酯。将72mg得到的粗产物溶解于5ml DMF中，并与24mg(100μmol)N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸以及23μl N，N-二异丙基乙胺混合。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后再次与16mg N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和12μl N，N-二异丙基乙胺混合，最后在超声浴中处理另外2小时。然后将该批料在真空中浓缩，并通过制备型HPLC纯化残余物。从乙腈／水低压冻干以后，得到20mg(理论值的50％)标题化合物的受保护的中间体。
然后将15mg(12μmol)该中间体溶解于3ml二氯甲烷中，并与1ml三氟乙酸混合。在室温搅拌40min以后，加入另外1.5ml三氟乙酸，并将该批料在超声浴中处理1h。然后将将该批料浓缩，并在从二噁烷／水低压冻干残余物以后，得到13mg(理论值的90％)标题化合物。
HPLC(方法12)：Rt=1.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.68min；MS(ESIpos)：m／z=990(M+H)+。
实施例384
Figure BDA0000432948840006081
现在使用5mg抗-CA9在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.4mg／ml
药物／mAb比：3.0
实施例385
Figure BDA0000432948840006082
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.48mg／ml
药物／mAb比：2.4
实施例386
Figure BDA0000432948840006091
现在使用5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的缓冲液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并再次稀释。
蛋白浓度：1.43mg／ml
药物／mAb比：3.6
实施例387非对映异构体1
Figure BDA0000432948840006092
现在使用中间体247a和5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.45mg／ml
药物／mAb比：3.8
实施例388非对映异构体2
Figure BDA0000432948840006101
现在使用中间体247a和5mg抗-C4.4a B01-3在PBS中的溶液进行偶联，并且在Sephadex柱上纯化以后，将该批料通过超速离心进行浓缩，并用PBS再次稀释。
蛋白浓度：1.42mg／ml
药物／mAb比：4.0
C.生物效能评价
通过体外和体内试验，诸如本领域技术人员熟知的那些，可以证实本发明的化合物的生物活性。
在下述的测定中，揭示了本发明的化合物的生物学效应：
C-1.1体外细胞增殖试验
使用人表达EGFR的肿瘤细胞试验抗-EGFR ADC的效力。所述细胞可以是，例如，具有高表达的NCI-H292或A431。使用具有低EGFR表达的细胞(诸如HT29)或实际上不表达EGFR的细胞(诸如NCI-H520)作为EGFR依赖性的细胞毒性的对照。
实验的描述
第1天：以100μL／孔，将细胞铺板在96-孔板(Perkin Elmer，white，catalog6005680)中的培养基中。在平行板中将细胞铺板，用于确定时间零点。将所有平板在37℃温育过夜。
第2天：制备试验物在培养基中的3倍稀释系列，并将100μL3倍稀释物转移进平板的每个孔中。将平板在培养箱中在37℃温育96小时。测量时间零点平板：将100μL/孔的CTG溶液(Promega Cell Titer Glo溶液(目录号G755B和G756B))转移进对应的孔中，并在振荡器上温育2min，在暗处温育+10分钟。接着，使用VICTOR V仪器(Perkin Elmer)测量发光。
第6天：测量所有其它批次：将100μL／孔的CTG溶液(Promega CellTiter Glo溶液(目录号G755B和G756B))转移进对应的孔中，并在振荡器上温育2min，在暗处温育+10分钟。接着，使用VICTOR V仪器(PerkinElmer)测量发光。
使用发光作为活细胞的数目的标志物。
将时间零点平板的测量值视作零，并缉拿该仅在不含活性成分的培养基中温育的细胞的测量值视作100％。结果为S形剂量-响应曲线，从该曲线可以确定IC50(GraphPad Prism软件)。
A431：2500个细胞／孔，培养基：DMEM Hams，Biochrom，#FG4815+10％FCS
NCI-H292：2500个细胞／孔，培养基：RPMI1640；Biochrom，#FG1215+10％FCS
HT29L2500个细胞／孔，培养基：DMEM Hams；Biochrom，#FG4815+10％FCS
在<1×10-7M抑制细胞增殖的物质被分类为有效的。
在<1×10-9M抑制细胞增殖的物质被分类为特别有效的。
下面的表3列出了得自该测定的代表性的示例性实施方案的IC50值1)。
表3
1)给出的效力数据是基于在这里具体描述的ADC批次，且可以偏移具有不同药物／抗体比的其它批次。
C-1.2含有短物质温育的增殖测定(脉冲测定)的方案
如上所述执行方案，但是在与试验物一起温育4小时以后，通过抽吸除去物质，并用新鲜培养基替换。在共计96小时以后，如上所述执行分析。
下面的表4列出了得自该测定的代表性的示例性实施方案的IC50值1，2)
表4
实施例 抗体 A431 NCIH292
7 西妥昔单抗 0.99 0.01
8 尼妥珠单抗 >200 34.4
9 帕木单抗 90.5 26.4
10 西妥昔单抗 0.0526 0.0884
14 西妥昔单抗 0.258 0.248
15 西妥昔单抗 13.4 3.5
16 西妥昔单抗 0.943 0.689
17 西妥昔单抗 0.285 0.133
18 西妥昔单抗 17.4 3.63
19 西妥昔单抗 0.89
20 西妥昔单抗 31.9 42.3
21 尼妥珠单抗 54.6 120
22 帕木单抗 44.3 51.8
23 西妥昔单抗 88.1 124
24 尼妥珠单抗 111 >200
25 帕木单抗 53 77
26 西妥昔单抗 10.6 3.02
27 尼妥珠单抗 11.4 20.4
28 帕木单抗 5.78 8.6
29 西妥昔单抗 0.37 0.03
30 帕木单抗 23.2 3.34
实施例 抗体 A431 NCIH292
31 尼妥珠单抗 13.71 4.24
32 西妥昔单抗 50.8 20.4
33 尼妥珠单抗 49 42
34 帕木单抗 51.1 32.2
35 西妥昔单抗 0.716 0.125
36 西妥昔单抗 0.357 0.0589
37 西妥昔单抗 0.52 0.17
38 西妥昔单抗 7.21
39 西妥昔单抗 1.49 0.03
40 尼妥珠单抗 36 2.38
41 帕木单抗 110 6.91
42 西妥昔单抗 2.84 0.0949
43 西妥昔单抗 2.44 0.587
44 西妥昔单抗 0.456 0.571
52 西妥昔单抗 >200 0.961
53 西妥昔单抗 0.253 0.133
54 西妥昔单抗 166 1.83
55 西妥昔单抗 1.47 0.11
337 西妥昔单抗 0.175 0.0746
338 西妥昔单抗 1.79 0.152
339 西妥昔单抗 2.57 0.194
340 西妥昔单抗 0.225 0.101
341 西妥昔单抗 2.25 0.232
342 西妥昔单抗 24.5 0.267
343 帕木单抗 >200 20.3
1)给出的效力数据是基于在这里具体描述的ADC批次，且可以偏移具有不同药物／抗体比的其它批次。
2)这显示了2个实验(A431)或3个(NCI-H292)实验的平均值。
C-1.3对微管蛋白聚合的影响的确定
癌细胞是退化细胞，其经常由于增加的细胞分裂而导致肿瘤的发展。微管形成纺锤体的纺锤丝，且是细胞周期的必需组分。微管有规律的合成和降解使得染色体在子细胞中精确分裂，并构成连续的动态过程。该动态过程的破坏会导致不正确的细胞分裂，并最终导致细胞死亡。然而，癌细胞细胞分裂的增加也会使其对纺锤丝毒素特别敏感，所述纺锤丝毒素是化学疗法的固定组分。纺锤丝毒素(诸如紫杉醇或埃博霉素)会造成微管的聚合速率急剧升高，而长春花生物碱或单甲基耳他汀E(MMAE)会造成微管的聚合速率急剧降低。这些情况涉及细胞周期的必要动力学的敏感破坏。在本发明范围内试验的化合物导致微管的聚合速率降低。
使用来自Cytoskeleton(Denver，Colorado，USA，订单号BK011)的“基于荧光的微管聚合测定试剂盒(Fluorescence-Based MicrotubulePolymerization Assay Kit)”对微管蛋白聚合进行研究。在该测定中，向未聚合的微管蛋白添加GTP，使得聚合可以自发地进行。该测定是基于荧光团4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)与微管蛋白的结合。游离的DAPI和结合的DAPI可基于它们的不同的发射波谱进行区分。由于与未聚合的微管蛋白相比，DAPI对聚合的微管蛋白具有显著的高亲和力，因此通过结合的DAPI荧光团的荧光增加可以跟踪微管蛋白聚合。
为了实施该测定，用水将溶解在DMSO中的试验物从其10mM的初始浓度稀释至1μM。除了缓冲对照以外，包括增加聚合的紫杉醇作为测定对照，另一方面，还包括增加聚合的长春碱。使用具有半底部区域的96孔板进行测定，从而在37℃在荧光计中跟踪微管蛋白聚合的动力学1小时。激发波长为355纳米，并且在460纳米跟踪发射。对于最初10分钟内的线性增加区域，计算每分钟的荧光变化(AF／min)，所述变化表示微管的聚合速率。所述试验物的效力基于各自的聚合速率降低来定量。
将在1μM浓度时MMAF的抑制值设定为100％。
表5显示了代表性的示例性实施方案的微管蛋白聚合的抑制数据。
表5
毒性基团MMAF和示例性实施方案以浓度依赖性的方式抑制微管蛋白聚合。100μM MMAF完全抑制微管蛋白聚合。1μM的实施例115将微管蛋白聚合速率抑制至在1μM MMAF时测得的值的45％。
C-1.4体内效力试验
在体内试验了根据本发明的缀合物的效力，例如，借助于异种移植物模型。本领域技术人员熟知用于试验根据本发明的缀合物的效力的现有技术方法(参见，例如，WO 2005081711；Polson等人，Cancer Res.2009年3月15日，69(6)：2358-64)。例如，将表达结合剂的靶分子的肿瘤细胞系植入啮齿类动物(例如，小鼠)中。然后，将根据本发明的缀合物或对照抗体或等渗盐水溶液施用给植入物动物。施用所述物质一次或多次。在几天的培养时间以后，与用缀合物治疗的动物和与对照组进行对比，确定肿瘤大小。
C-1.4a小鼠中的实验肿瘤的生长抑制／消退
将表达ADC的抗原的人肿瘤细胞皮下地注射进用于接种的免疫抑制小鼠(例如，裸鼠或SCID小鼠)的胁腹中。从细胞培养物中分离出100-1000万个细胞，离心，并用Medium或Medium／Matrigel再悬浮。然后将细胞混悬液皮下地注射进小鼠。
然后使肿瘤生长几天。在建立肿瘤大小为20mm2的肿瘤以后，开始治疗。为了研究更大肿瘤的影响，可以仅在肿瘤大小达到50-100mm2时才开始治疗。
经由向小鼠尾静脉中的静脉内途径，进行ADC治疗。以5mL／kg的体积施用ADC。
治疗方案取决于抗体的药代动力学。标准治疗由每个第四天治疗共3次组成。但是，治疗也可以进一步继续，或者可以在更靠后的时间点之后进行第二个3天治疗的循环。
每个治疗组使用8只动物作为标准。如果肿瘤生长存在特别大的波动或者根据预见到的治疗，该数字可以增加。除了接受活性物质的组以外，一个组(作为对照组)根据相同的方案仅用缓冲液治疗。
在该实验的情况下，使用测径器在2个维度(长度／宽度)定期测量肿瘤的面积。通过长度×宽度来确定肿瘤的面积。
在实验结束时，将肿瘤切离并称重。将治疗组的平均肿瘤重量与对照组的对比报告为T／C。
C-1.4b在BxPC3胰腺癌肿瘤模型中的效力
将200万个BxPC3细胞皮下地注射进用于接种的雌性NMRI裸鼠的胁腹中。
在第15天肿瘤细胞为40mm2时，用10mg／kg的静脉内剂量开始治疗(第15、19、22天)。在治疗后，跟踪肿瘤生长至第77天。由于大肿瘤的兽医原因，对照组的动物在第50天必须处死。
裸抗-EGFR抗体在大约14天显示出延迟的肿瘤生长。
在第77天实验结束之前，用抗-EGFR ADC(实施例7和实施例10)治疗的动物没有表现出任何进一步肿瘤生长。
C-1.4c在NCI-H292NSCLC肿瘤模型中的效力
将500万个NCI-H292细胞皮下地注射进用于接种的雌性NMRI裸鼠的胁腹中。
在第15天肿瘤大小为100mm2时，用3mg／kg的静脉内剂量开始治疗(第15、19、23天)。在治疗后，跟踪肿瘤生长至第77天。在实验结束时，将肿瘤切离并称重。由于大肿瘤，对照组的动物必须安乐死，所以实验在第27天终止。用裸抗-EGFR抗体治疗的动物表现出受抑制的肿瘤生长。用抗-EGFR ADC治疗的动物表现出肿瘤消退。在几天的培养时间以后，将缀合物治疗的动物与对照组进行对比(T／C)，确定肿瘤大小。用缀合物治疗的动物具有更小尺寸的肿瘤。
ADC的T／C比在0.05(实施例10)至0.1(实施例7)之间，而裸抗-EGFR抗体的T／C比为0.3。
C-2.1体外细胞增殖试验
通过将内源地或重组地表达结合剂的靶分子的哺乳动物细胞与根据本发明的缀合物一起温育，在体外细胞增殖试验中试验了根据本发明的缀合物的细胞毒性效应。在数小时至数天的培养时间以后，基于相对于没有添加缀合物的对照的细胞计数，确定细胞增殖。可以加入单独的未缀合的毒性基团作为额外对照，和/或可以使用不表达结合剂的靶分子的细胞。通过本领域技术人员熟知的方法，例如，通过计数或通过使用允许基于测量ATP来确定细胞计数的试验试剂盒(例如，ATPliteTM，Perkin Elmer)，确定细胞计数。以此方式确定根据本发明的缀合物的IC50值。通过对比携带结合剂的靶分子的细胞和不携带该分子的细胞上测得的缀合物的IC50值，可以确定缀合物的选择性。
C-2.2抗-间皮素ADC对人结肠癌细胞系HT29的抗增殖作用的确 定
将确定的细胞数目的人结肠癌细胞系HT29wt(2500个细胞／孔，野生型)接种在96-孔MTP内的完全培养基(10％FCS RPMI)中，并在37℃、5％二氧化碳下温育过夜。平行地，将具有稳定的间皮素表达的转染的HT29细胞铺板在96-孔MTP内的完全培养基中，并温育过夜(2500个细胞／孔，37℃，5％二氧化碳)。
18小时以后，用含10％FCS的新鲜培养基替代接种培养基。通过加入本发明的化合物，开始治疗。在这里相同地处理转染的细胞和HT29wt细胞。
在10-5M至1014M的浓度范围内(1：10稀释系列)，确定要试验的物质的剂量-响应曲线。
选择48-96小时的培养时间。
借助于MTT测定(ATCC，Manassas，Virginia，USA，目录号30-1010K)，确定增殖。已经经历选择的时间以后，将HT29wt细胞与MTT一起温育4小时，然后通过加入去污剂裂解细胞过夜。
在570nm检测如此形成的染料。
将100％值定义为没有试验物但是在其它方面相同地处理的细胞的增殖。从该试验得到的数据代表一式三份测定，并进行至少2个独立实验。
下面的表6列出了该测定的代表性的示例性实施方案的IC50值1)：
表6
Figure BDA0000432948840006181
Figure BDA0000432948840006191
1)这里列出的效力数据是基于使用指示的药物／mAb比的实验部分中描述的示例性实施方案。所述值可以偏离不同的药物／mAb比。
C-2.3使用间皮素转染的HT29细胞和非转染的细胞的HT29肿瘤模 型的药代动力学
静脉内施用16mg／kg的实施例60以后，与可能存在的代谢物(诸如实施例119的那些)一起测量实施例60的血浆和肿瘤浓度。在具有间皮素转染的肿瘤的动物的血浆中，得自实施例119的化合物的曲线下面积(AUC)是大约0.50mg·h／L；在肿瘤中，得自实施例119的化合物的暴露高大约400倍(AUC=203mg·h／L)。在具有非转染的肿瘤的动物中，实施例119在血浆中的暴露等于具有转染的肿瘤的动物的血浆中的暴露。但是，非转染的动物的肿瘤中的AUC是转染的动物的大约1／8。这指示在有抗原存在下在肿瘤中的明确靶向效应。
得自实施例119的化合物的定量分析
在用甲醇沉淀蛋白以后，通过与串联质谱仪(MS)联用的高压液相色谱法(HPLC)，测量血浆和肿瘤中的得自实施例119的化合物。
对于100μL血浆的后处理，将它与400μL甲醇和10μL内部标准品(ISTD，50ng／mL甲醇)混合，并搅拌10秒。在16,000g离心5分钟以后，将250μL上清液转移至自动采样瓶，补加用250μL乙酸铵缓冲液(AAC，10mM，pH6.8)，并再次搅拌。
在肿瘤的后处理中，将它与4倍量的甲醇混合。以30次冲击/分钟，将样品在Tissuelyser II(Quiagen)中粉碎6分钟，然后在16,000g离心5分钟；将50μL上清液转移至自动采样瓶，并补加50μL乙酸铵缓冲液(10mM，pH6.8)和5μL ISTD。再次搅拌后，肿瘤样品准备好用于测量。
最后，借助于得自SCIEX公司的API4000仪器上的涡轮离子喷射接口(TISP)，在HPLC偶联的大气压电离／串联质谱仪上进行两种基质样品的测量。测量下述m／z转变：
实施例119(计量器)614.652→570.9
实施例119(质量器1)614.652→555.0
实施例119(质量器2)614.652→500.4
内部标准品(ISTD)726.665→694.5
使用Gemini柱(5uL C18110A，50×3mm，Phenomenex)，在下述梯度条件下在HP1100泵(Agilent)上进行HPLC／LC MSMS(TISP)分析；流速0.4mL/min；梯度：0.0min至1.0min10％乙腈／90％AAC，1.0min至3.0min10％乙腈／90％AAC→50％乙腈／50％AAC，3.0min至5.5min50％乙腈／50％AAC，5.5min至5.6min50％乙腈／50％AAC→10％乙腈／90％AAC，5.6min至6.0min10％乙腈／90％AAC。
对于校准，混合具有0.5-2000μg／L浓度的血浆样品。定量限(LOQ)为2μg／L。线性范围为2-1000μg／L。
对于肿瘤样品的校准，混合具有0.5-200ug／L浓度的未治疗的肿瘤的上清液。定量限为5ug／L。线性范围为5-200ug／L。
用于有效性试验的质量对照含有5和50ug／L，在血浆含有额外的500ug／L。在这些样品上确定的浓度从理想值偏离多达20％(未包括数据)。
C-2.4体内效力试验
使用例如异种移植物模型，在体内试验了根据本发明的缀合物的效力。本领域技术人员熟知用于试验根据本发明的缀合物的效力的现有技术方法(参见，例如，WO 2005081711；Polson等人，Cancer Res.2009年3月15日，69(6)：2358-64)。例如，将表达结合剂的靶分子的肿瘤细胞系植入啮齿类动物(例如，小鼠)中。然后，将根据本发明的缀合物或对照抗体或等渗盐水溶液施用给植入物动物。施用所述物质一次或多次。在几天的培养时间以后，与用缀合物治疗的动物和与对照组进行对比，确定肿瘤大小。在用缀合物治疗的动物中，肿瘤尺寸更小。
C-2.4a在小鼠的实验肿瘤中试验抗-间皮素ADC
将表达间皮素的人肿瘤细胞皮下地注射进免疫抑制的小鼠(例如，裸鼠或SCID小鼠)的胁腹中；从细胞培养物中分离出100-1000万个细胞，离心，并再悬浮于100uLMedium或1：1Medium／Matrigel。然后将细胞混悬液皮下地注射进小鼠。
然后使肿瘤生长几天。在建立肿瘤大小为20mm2的肿瘤以后，开始治疗。为了研究更大肿瘤的影响，可以仅在肿瘤大小达到50-100mm2时才开始治疗。
经由向小鼠尾静脉中的静脉内途径，进行ADC治疗。将ADC溶解于PBS中，并以5mL／lg的体积施用。
治疗方案取决于抗体的药代动力学。标准治疗由每个第四天治疗共3次组成。但是，治疗也可以进一步继续，或者可以在更靠后的时间点之后进行第二个3天治疗的循环。
每个治疗组使用8只动物作为标准。如果肿瘤生长存在特别大的波动或者根据预见到的治疗，该数字可以增加。除了接受活性物质的组以外，一个组(作为对照组)根据相同的方案仅用缓冲液治疗。
在该实验的情况下，使用测径器在2个维度(长度／宽度)定期测量肿瘤的面积。通过长度×宽度来确定肿瘤的面积。
在实验结束时，将肿瘤切离并称重。将治疗组(T)的平均肿瘤重量与对照组(C)的对比报告为T／C。
C-2.4b在使用间皮素转染的HT29细胞的HT29结肠癌肿瘤模型中的 效力
将100万个HT29细胞(用间皮素稳定转染)皮下地注射进用于接种的NMRI裸鼠的胁腹。在第6天在20-30mm2的肿瘤大小，开始静脉内治疗(第6、10、14天)。治疗以后，跟踪肿瘤生长直到第48天。
C-2.4c在Ovcar3卵巢癌肿瘤模型中的效力
将700万个Ovcar3细胞皮下地注射进用于接种的NMRI裸鼠的胁腹。
在第31天在25-30mm2的肿瘤大小，在5-30mg／lg的剂量范围内开始静脉内治疗(第31、35、39天)。治疗以后，跟踪肿瘤生长直到第94天。在实验结束时，将肿瘤切离并称重。
C-3.1针对C4.4a的ADC的细胞毒性效应分析
在不同的细胞系中，分析了抗-C4.4a ADC的细胞毒性效应：
·A549(CCL-185，ATCC)，用完整C4.4a受体的序列转染，
·A549，假转染
·A549野生型(DSMZ，批次11)
·NCI-H292，内源性地表达C4.4a的肺癌细胞系(CRL-1848，ATCC)
·SCC-4，内源性地表达C4.4a的鳞状上皮细胞癌细胞系(CRL-1624，ATCC)
·SCC-9，内源性地表达C4.4a的鳞状上皮细胞癌细胞系(CRL-1629，ATCC)
·HCT-116，内源性地表达C4.4a的结肠癌细胞系(CCL-247，ATCC)
·HCT-116／VM46，用VM46转染的HCT-116
·A431NS(CRL-2592，ATCC)
根据美国典型组织保藏中心(American Tissue Type Collection，ATCC)关于各个细胞系所指定的标准方法，培养细胞。关于该操作，使用胰蛋白酶(0.05％)和EDTA(0.02％)在PBS中的溶液(Biochrom AG#L2143)使细胞分开，丸粒化，再悬浮于培养基中，计数，并接种进94-孔白底培养板(Costar#3610)(在100μl中的2500个细胞／孔)，然后在培养箱中在37℃和5％二氧化碳下温育。24小时后，以10-7M至10-11M(一式两份值)的浓度，将抗体-药物缀合物施加给100μl培养基中的细胞，并在培养箱中在37℃和5％二氧化碳下温育。72小时后，使用Cell Titer Glow Luminescent CellViability Assay(Promega#G7573和#G7571)，确定细胞生存力。为此目的，每个细胞批次加入100μl底物，随后用铝箔覆盖平板，在平板振荡器中在180rpm振荡2分钟，在实验台上静置8分钟，然后使用Victor X2仪器(Perkin Elmer)测量。底物会检测活细胞的ATP含量，从而产生发光信号，所述信号的高度与细胞的活力直接成比例。使用Graph Pad PrismLaboratory软件，从测量的数据计算IC50。
下面的表7显示了该测定的代表性的示例性实施方案的IC50值1)：
表7
Figure BDA0000432948840006231
Figure BDA0000432948840006241
1)这里列出的效力数据是基于使用指示的药物／mAb比的实验部分中描述的示例性实施方案。所述值可以偏离不同的药物／mAb比。
C-3.3用于确定细胞渗透性的体外试验
使用Caco-2细胞，在流量测定(flux assay)中通过体外试验，可以研究物质的细胞渗透性(M.D.Troutman和D.R.Thakker，Ph arm.Res.20(8)：1210-1224(2003))。为此目的，将所述细胞在24-孔滤板上培养15-16天。为了确定渗透，将在HEPES缓冲液中的各试验物从顶端(A)或基部(B)施加给细胞，并温育2小时。0小时和2小时后，将样品从顺式和反式隔室中取出。使用反相柱通过HPLC(Agilent1200，
Figure BDA0000432948840006242
德国)分离样品。该HPLC系统经由涡轮离子喷射接口连接至三重四极杆质谱仪API4000(Applied Biosystems Applera，Darmstadt，德国)。基于Papp值来评价渗透性，该Papp值借助于Schwab等人公开的公式进行计算(D.Schwab等人，J.Med.Chem.46，1716-1725(2003))。当Papp(B-A)与Papp(A-B)之比>2或<0.5时，将物质分类为具有主动转运。
对于在细胞内释放的毒性基团而言，至关重要的是，从B至A的渗透性[Papp(B-A)]：该渗透性越低，所述物质在细胞内释放以后在细胞中的停留时间越长，并且因此可用于与生化靶标(在该情况下：微管蛋白)相互作用的时间越长。
下表显示了该测定的代表性的示例性实施方案的渗透性数据：
表8
与此相比，单甲基耳他汀E(MMAE)和单甲基耳他汀F(MMAF)在该试验中具有73nm／s的Papp(B-A)值。
C-3.4用于确定P-糖蛋白(P-gp)的底物性质的体外试验
许多肿瘤细胞表达药物的转运蛋白等蛋白，并且这经常伴随对细胞抑制剂的抗性的发展。例如，不是此类转运蛋白等蛋白(诸如P-糖蛋白(P-gp)或BCRP)的底物的物质因此可能表现出提高的活性谱。
使用过表达P-gp的LLC-PK1细胞(L-MDR1细胞)，通过流量测定，确定物质作为P-gp(ABCB1)的底物的性质(A.H.Schinkel等人，J.Clin.Invest.96，1698-1705(1995))。为此目的，将LLC-PK1细胞或L-MDR1细胞在96-孔滤板上培养3-4天。为了确定渗透，在HEPES缓冲液中将各试验物(单独或在有抑制剂(诸如伊维菌素或维拉帕米)存在下)从顶端(A)或基部(B)施加给所述细胞，并温育2小时。0小时和2小时后，将样品从顺式和反式隔室中取出。使用反相柱通过HPLC分离样品。该HPLC系统通过涡轮离子喷射接口连接至三重四极质谱仪API3000(AppliedBiosystems Applera，Darmstadt，德国)。基于Papp值来评价渗透性，该Papp值使用由Schwab等人公开的公式进行计算(D.Schwab等人，J.Med.Chem.46，1716-1725(2003))。如果流出比Papp(B-A)／Papp(A-B)>2，将物质分类为P-gP底物。
在L-MDR1和LLC-PK1细胞中的流出比、或在有或没有抑制剂存在下的流出比可以作为额外标准进行对比，用于评价P-gp底物性质。如果这些值相差超过2倍，将各物质视作P-gp底物。
表9
在该测定中，在这里引用的B至A的实施例的渗透性较低，即，细胞中的毒性基团的停留时间较长。
C-3.5体内效力试验
通过例如异种移植物模型，在体内试验了本发明的缀合物的效力。本领域技术人员熟知用于试验本发明的缀合物的效力的现有技术方法(参见，例如，WO 2005／081711；Polson等人，Cancer Res.2009年3月15日；69(6)：2358-64)。例如，给啮齿类动物(例如小鼠)植入表达结合剂的靶分子的肿瘤细胞系。随后给所述植入物动物施用本发明的缀合物或对照抗体或等渗盐水溶液。施用物质一次或多次。每周使用测径器确定肿瘤生长2次。数天的培养时间后，与用缀合物治疗的动物和与对照组进行对比，确定肿瘤大小。
C-3.5a在小鼠的实验肿瘤中试验ADC
将表达ADC的抗原的人肿瘤细胞皮下地注射进用于接种的免疫抑制小鼠(例如，裸鼠或SCID小鼠)的胁腹中。从细胞培养物中分离出100-1000万个细胞，离心，并用100μL Medium或50％Medium/50％Matrigel再悬浮。然后将细胞混悬液皮下地注射进小鼠。
然后使肿瘤生长几天。在建立肿瘤大小为25mm2的肿瘤以后，开始治疗。
经由向小鼠尾静脉中的静脉内途径，进行ADC治疗。将ADC溶解于PBS中，并以10mL／kg的体积施用。
治疗方案取决于抗体的药代动力学。标准治疗由每个第四天治疗共3次组成。但是，治疗也可以进一步继续，或者可以在更靠后的时间点之后进行第二个3天治疗的循环。
每个治疗组使用8只动物作为标准。如果肿瘤生长存在特别大的波动或者根据预见到的治疗，该数字可以增加。除了接受活性物质的组以外，一个组(作为对照组)根据相同的方案仅用缓冲液治疗。
在该实验的情况下，使用测径器在2个维度(长度／宽度)定期测量肿瘤的面积。通过长度×宽度来确定肿瘤的面积。
在实验结束时，将肿瘤切离并称重。将治疗组(T)与对照组(C)的平均肿瘤重量之商报告为T／C。通过对照组和治疗组在不同的时间点结束，基于所有治疗组和对照组的最后一个连接点处测量的肿瘤面积，计算T／C值。
将100万个SCC-4细胞皮下地注射进用于接种的雌性NMRI裸鼠的胁腹。
当平均肿瘤大小已经达到30-35mm2时，开始ADC的静脉内治疗。当对照组已经达到最大允许尺寸时，结束实验，取出肿瘤，并称重。发现所有试验的靶向C4.4a的ADC以剂量依赖性的方式抑制肿瘤生长。在30mg／kg的剂量，所有试验的ADC达到<0.1的T／C(实施例216、实施例211、实施例215、实施例213)。在低至15mg／kg的剂量，所有试验的ADC实现了与对照相比显著的抗肿瘤作用。
将100万个NCI-H292细胞皮下地注射进用于接种的雌性NMRI裸鼠的胁腹。
在30-35mm2的平均肿瘤大小，开始ADC的静脉内治疗。当达到最大可允许的肿瘤大小时，分别结束对照组和治疗组。以此方式，在治疗结束后肿瘤的进一步生长的差异可以促进ADC的进一步表征。因此，采用在测量时间的最后一个连接点处的肿瘤面积，确定与对照相比的抗肿瘤作用(T／C)。在该实验使用的NCI-H292小鼠模型中，证实了与对照相比所有试验的ADC都能够以剂量依赖性的方式减少肿瘤生长。实施例216在低至1.9mg／kg的剂量，实施例211在低至3.75mg／kg的剂量，实现了显著的抗肿瘤作用。在该模型中得到的最小T／C值包括：实施例216在30mg／kg时的T／C为0.16，实施例211在30mg／kg时的T／C为0.17，实施例215在30mg／kg时的T／C为0.16，和实施例213在15mg／kg时的T／C为0.17。
C-4.使用C4.4a-转染的和非转染的A549细胞的在A549肿瘤模型中 的药代动力学
在静脉内施用7-30mg／kg的不同ADC以后，测量ADC以及可能存在的任何潜在代谢物的血浆浓度和肿瘤浓度，并计算药代动力学参数诸如清除率(CL)、曲线下面积(AUC)和半衰期(t1／2)。
用于定量可能存在的代谢物的分析
在用甲醇沉淀蛋白以后，借助于与串联质谱仪(MS)联用的高压液相色谱法(HPLC)，测量血浆和肿瘤中的化合物。
对于100uL血浆的后处理，将它与400uL甲醇和10uL内部标准品(ISTD，50ng／mL的在甲醇中的溶液)混合，并摇动10秒。在16,000g离心5分钟以后，将250μL上清液转移至自动采样瓶，补加250μL乙酸铵缓冲液(AAC，10mM，pH6.8)，并再次摇动。
对于肿瘤的后处理，将它与4倍量的甲醇混合。在Tissuelyser II(Quiagen)中，以每分钟30次撞击，将样品粉碎6分钟，然后在16,000g离心5分钟；将50μl上清液转移至自动采样瓶，并补加50μL乙酸铵缓冲液(10mM，pH6.8)和5μL ISTD。肿瘤样品准备好用于测量。
最后，在得自SCIEX公司的API4000仪器上，借助于涡轮离子喷射接口(TISP)，在HPLC偶联的大气压电离／串联质谱仪上进行两种基质样品的测量。
在带有Gemini柱(5μm C18110A，50×3mm，Phenomenex)的HP1100泵(Agilent)上，运行HPLC／LC-MSMS(TISP)分析。
对于校准，以0.5-2000μg／L的浓度混合血浆样品。定量限(LOQ)为2μg／L。线性范围为2-1000μg／L。
对于肿瘤样品的校准，以0.5-200μg／L的浓度混合未治疗的肿瘤的上清液。定量限为5μg／L。线性范围为5-200μg／L。
用于有效性试验的质量对照含有5和50μg／L，另外具有在血浆中的500μg／L。在这些样品中发现的浓度从理想值偏离了至多20％(未附数据)。
C-4.1体外细胞增殖试验
通过将内源地或重组地表达结合剂的靶分子的哺乳动物细胞与根据本发明的缀合物一起温育，在体外细胞增殖试验中试验了根据本发明的缀合物的细胞毒性效应。在数小时至数天的培养时间以后，基于相对于没有添加缀合物的对照的细胞计数，确定细胞增殖。可以加入单独的未缀合的毒性基团作为额外对照，和/或可以使用不表达结合剂的靶分子的细胞。通过本领域技术人员熟知的方法，例如，通过计数或通过使用允许基于测量ATP来确定细胞计数的试验试剂盒(例如，ATPliteTM，Perkin Elmer)，确定细胞计数。以此方式确定根据本发明的缀合物的IC50值。通过对比携带结合剂的靶分子的细胞和不携带该分子的细胞上测得的缀合物的IC50值，可以确定缀合物的选择性。
C-4.2对细胞系HT29、DLD-1和SNU-5的体外细胞毒性
为了试验对内源性地CAIX-阳性的或CAIX-阴性的肿瘤细胞的CA9选择性的、细胞毒性效应，使用了人结肠癌细胞系HT29(CA9-阳性的)和DLD-1(CA9-阴性的)以及胃癌细胞系SNU-5(CA9-阳性的)。将确定细胞数目的细胞系HT29(5000个细胞／孔)接种在用于发光的96-孔MTP内的完全培养基(DMEM／HAM′s F12，10％FCS热灭活)中，并在37℃、5％CO2温育过夜。用SNU-5细胞系进行类似的操作，但是这里的培养基为ISCOVE′s+10％FCS(热灭活)。将抗原-阴性的细胞系DLD-1平行地铺板在用于发光的96-孔MTP内的完全培养基(RPMI1640，10％FCS，热灭活)中，并温育过夜(5000个细胞／孔，37℃，5％CO2)。
24小时后，在RPMI／5％FCS中3倍浓缩要试验的物质，并制备。通过将要试验的物质和/或ADC加给细胞，开始治疗。相同地处理HT29、SNU-5和DLD-1细胞。
在3×10-7M至10-12M的浓度范围内，确定要试验的物质的剂量-响应曲线。
选择2-96小时的培养时间。
借助于Cell Titer Glo Luminescent Cell Viability Assay(PROME GA目录号#G7571)，进行增殖检测。已经经历选择的培养时间以后，将CellTiter Glo试剂与细胞一起温育20分钟，然后用发光读数器VICTOR Light(Perkin Elmer)测量发光。
将没有试验物但是在其它方面相同地处理的细胞的增殖定义为100％值。从该试验得到的数据代表一式三份测定，并进行至少2个独立实验。
下表列出了得自该测定的代表性的示例性实施方案的IC50值：
表10
Figure BDA0000432948840006301
Figure BDA0000432948840006311
C-4.3确定抗-CAIX ADC对人胰腺癌细胞系MIAPaCa2和结肠癌 细胞系HT29的抗增殖作用
将确定细胞数目的人胰腺癌细胞系MIAPaCa2(2500个细胞／孔，野生型)接种在96-孔MTP内的完全培养基(DMEM，10％FCS，2.5％马血清)中，并在37℃、5％CO2温育过夜。将稳定表达CAIX的转染的MIAPaCa2细胞(MIAPaCaMSL)铺板在96-孔MTP内的完全培养基中，并温育过夜(2500个细胞／孔，37℃，5％CO2)。
为了试验对内源性地表达CAIX的细胞的细胞毒性效应，使用了结肠癌细胞系HT29。也将所述细胞(2500个细胞／孔，野生型)接种在96-孔MTP中，并在完全培养基(RPMI，10％FCS)中温育过夜。
18小时后，用含血清的新鲜培养基替代接种培养基。通过加入要试验的物质和/或ADC，开始处理。相同地处理转染的细胞和MIAPaCa2细胞以及HT29细胞。
在10-5M至10-14M(1：10稀释系列)的浓度范围内，确定要试验的物质的剂量-响应曲线。
选择48-96小时的培养时间。
借助于MTT测定(ATCC，Manassas，Virginia，USA，目录号30-1010K)，确定增殖。已经经历选择的培养时间以后，将MTT试剂与细胞一起温育4小时，然后通过加入去污剂裂解细胞过夜。
在570nm检测形成的染料。
将没有试验物但是在其它方面相同地处理的细胞的增殖定义为100％值。从该试验得到的数据代表一式三份测定，并在每种情况下进行至少2个独立实验。
下表显示了得自该测定的代表性的示例性实施方案的ICs0值：
表11
C-4.4体内效力试验
借助于例如异种移植物模型，在体内试验了根据本发明的缀合物的效力。本领域技术人员熟知用于试验根据本发明的缀合物的效力的现有技术方法(参见，例如，WO 2005081711；Polson等人，Cancer Res.2009年3月15日，69(6)：2358-64)。例如，将表达结合剂的靶分子的肿瘤细胞系植入啮齿类动物(例如，小鼠)中。然后，将根据本发明的缀合物或对照抗体或等渗盐水溶液施用给植入物动物。施用所述物质一次或多次。在几天的培养时间以后，与用缀合物治疗的动物和与对照组进行对比，确定肿瘤大小。
C-4.4a在小鼠的实验肿瘤中试验抗-CA9ADC的效力
将表达CA9的人肿瘤细胞皮下地注射进免疫抑制的小鼠(例如，裸鼠或SCID小鼠)的胁腹中；从细胞培养物中分离出100-1000万个细胞，离心，并用100uL Medium或Medium／Matrigel再悬浮。然后将细胞混悬液皮下地注射进小鼠。
然后使肿瘤生长几天。在建立肿瘤大小为20mm2的肿瘤以后，开始治疗。为了研究更大肿瘤的影响，可以仅在肿瘤大小达到50-100mm2时才开始治疗。
经由向小鼠尾静脉中的静脉内途径，进行ADC治疗。将ADC溶解于PBS中，并以5mL／kg的体积施用。
治疗方案取决于抗体的药代动力学。标准治疗由每个第四天治疗共3次组成。但是，治疗也可以进一步继续，或者可以在更靠后的时间点之后进行第二个3天治疗的循环。
每个治疗组使用8只动物作为标准。如果肿瘤生长存在特别大的波动或者根据预见到的治疗，该数字可以增加。除了接受活性物质的组以外，一个组(作为对照组)根据相同的方案仅用缓冲液治疗。
在该实验的情况下，使用测径器在2个维度(长度／宽度)定期测量肿瘤的面积。
在实验结束时，将肿瘤切离并称重。将治疗组(T)与对照组(C)的平均肿瘤重量之商给出为T／C。如果对照组和治疗组在不同天终止，使用在所有组仍然处于实验中时的最后一次测量点的肿瘤面积来计算T／C。
C-4.4b在SNU-5胃癌肿瘤模型中的效力
将300万个SNU-5细胞皮下地注射进用于接种的nodSCID小鼠的胁腹。
在第15天30-40mm2的肿瘤大小时，通过静脉内注射在5-30mg/kg范围内的剂量(第15、19、23天)，开始治疗。在治疗以后，跟踪所有组的肿瘤生长。当肿瘤已经达到最大允许的肿瘤大小时，结束对照组。将所有组一起在该时间点终止，将肿瘤切离并称重，并基于肿瘤重量而形成T／C值，或者关于肿瘤的进一步生长来观察治疗组。在后一种情况下，基于在测量时间的最后一个连接点处的肿瘤面积，计算T／C值。用抗-CA9ADC治疗的动物表现出受抑制的肿瘤生长。
C-4.4cHT29模型
使用携带nu／nu基因的雌性无胸腺裸鼠进行小鼠的人异种移植物研究。这些近亲交配的小鼠(NMRI背景)得自丹麦Taconic，体重为18-21g。根据ATCC方案，在含有10％胎牛血清(FCS)的推荐培养基中培养人HT29结肠癌细胞。将细胞收获用于以亚汇合状态(80％汇合)移植。在第0天，通过给小鼠皮下(s.c.)注射在50％Matrigel／50％培养基(不含FCS)中的1×106个HT29细胞，引发肿瘤。移植物体积为100μL，移植部位是左胁腹。通过用测径器测量肿瘤面积(计算：最长直径×与该直径垂直的直径的长度)，确定肿瘤生长。根据对象的状态，使用最大达到20-30或40-50mm2的预定义大小的肿瘤。在该时间点，将动物随机化和分配至各个试验组：对照组和治疗组。每个第四天施用ADC治疗，共3次(每4天1次×3)。治疗形式是向尾静脉中的静脉内(i.v.)注射。每只动物的治疗是基于个体体重，且治疗体积为5-10mL／kg体重。每周确定肿瘤面积和动物重量2次，监测体重作为治疗相关的毒性的量度。当毒性征象出现时，或者当肿瘤达到150mm2的大小时，或者当肿瘤变得坏死时，将动物安乐死。在一组结束时，将动物安乐死，将肿瘤切离，并确定各个肿瘤湿重。基于肿瘤面积或最终的肿瘤重量(在适当时)，将对治疗的应答计算为治疗与对照的比率。
D.药物组合物的示例性实施方案
可以如下将本发明的化合物转化成药物制剂：
静脉内溶液：
在生理学上安全的溶剂(例如，等渗盐水溶液，D-PBS，或加入了聚山梨酯80的甘氨酸和氯化钠在柠檬酸盐缓冲液中的制剂)中，以低于饱和溶解度的浓度，溶解本发明的化合物。对溶液进行无菌过滤，并分配进无菌的且无热原的注射容器中。
静脉内溶液：
可以将本发明的化合物转化成指定的剂型。这可以通过已知的方式如下实现：与惰性的、无毒的、药学上合适的赋形剂(例如，缓冲物质、稳定剂、增溶剂、防腐剂)“混合”或“溶解在”所述赋形剂中。例如，可能包括下述物质：氨基酸(甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和其它氨基酸)，糖类和有关的物质(葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、山梨醇)，甘油，钠盐、钾盐、铵盐和钙盐(例如氯化钠、氯化钾或磷酸氢二钠和许多其它盐)，乙酸盐／乙酸缓冲液系统，磷酸盐缓冲液系统，柠檬酸和柠檬酸盐缓冲液系统，氨丁三醇(TRIS和TRIS盐)，聚山梨酯(例如聚山梨酯80和聚山梨酯20)，泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188和泊洛沙姆171)，聚乙二醇类(PEG衍生物，例如3350)，Triton X-100，EDTA盐，谷胱甘肽，白蛋白(例如人白蛋白)，脲，苯甲醇，苯酚，氯甲酚，间甲酚，苯扎氯铵和许多其它物质。
用于以后转化成静脉内、皮下或肌肉内溶液的冻干粉剂：
可替换地，可以将本发明的化合物转化成稳定的冻干粉剂(可能借助于上述的赋形剂)，并且，在施用之前，用合适的溶剂(例如注射用水、等渗盐水溶液)重构，然后施用。
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Claims (53)

1.通式(Ia)的结合剂-药物成分缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物
其中
n代表1-50的数字，
AK代表结合剂，优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体，
基团§-G-L1-B-L2-§§代表接头，
其中
§表示与基团AK的连接位点，且
§§表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000012
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000021
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000022
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000031
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000032
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
2.根据权利要求1所述的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-50的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合剂(优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体)，其通过所述结合剂的硫原子连接至基团G，
AK2代表结合剂(优选嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，特别优选抗-EGFR抗体)，其通过所述结合剂的氮原子连接至基团G，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000041
其中
#1表示与所述结合剂的硫原子的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基、下式的基团
Figure FDA0000432948830000042
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C10)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000051
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键或(C2-C4)-烷二基，
L6代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000052
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢或(C1-C4)-烷基，
R30代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R29和R30与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R31代表氢或(C1-C4)-烷基，
R32代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R31和R32与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，L1B代表直链(C2-C10)-烷二基，
且
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000061
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000071
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
R36代表氢、(C1-C4)-烷基羰基、叔丁氧羰基或苄氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
或者
R36和R37与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000082
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000091
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000092
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000101
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000102
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
3.根据权利要求1或2所述的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-20的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表抗体或结合抗原的抗体片段，它结合EGFR且经由所述结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表抗体或结合抗原的抗体片段，它结合EGFR且经由所述结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000111
其中
#1表示与所述结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure FDA0000432948830000112
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C6)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000121
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键，
L6代表键或下式的基团
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢，
R30代表氢，
R31代表氢或甲基，
R32代表氢或甲基，
L1B代表直链(C2-C6)-烷二基，
且
其中(C2-C6)-烷二基可以被1-2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000131
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000132
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或甲基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
R27代表氢，
R36代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
或者
R36和R37与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000141
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代。
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000151
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起可以形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000152
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000153
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起可以形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000161
其中
#7表示与连位氮的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起可以形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000171
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
4.根据权利要求1-3所述的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由所述结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由所述结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000172
其中
#1表示与所述结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
Figure FDA0000432948830000181
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000182
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000191
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表哌啶-1，4-二基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢，
R36代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R37代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000192
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000201
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000203
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000202
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000211
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9或-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000212
其中
#9表示与-CHCH2苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK2，
其中
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由所述结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
G代表羰基，
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C3-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000221
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000222
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000231
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000232
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基、4-羟基苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000233
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢，
R9代表氢或苄基，
R35代表甲基。
6.根据权利要求1-4中的任一项所述的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由所述结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
G代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000241
其中
#1表示与所述结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
L1代表键、直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000242
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C3-C5)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000251
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000252
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
L2代表直链(C3-C5)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000261
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000271
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢，
R9代表氢或苄基，
R35代表甲基。
7.式(XXXa)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物
Figure FDA0000432948830000272
其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基、下式的基团
Figure FDA0000432948830000273
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C10)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000281
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键或(C2-C4)-烷二基，
L6代表键，
R29代表氢或(C1-C4)-烷基，
R30代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R29和R30与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R31代表氢或(C1-C4)-烷基，
R32代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R31和R32与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
L1B代表直链(C2-C10)-烷二基，
且
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000291
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000301
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000302
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000311
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000312
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000321
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000322
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
8.根据权利要求7所述的式(XXXa)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C6)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000332
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键，
L6代表键，
R29代表氢，
R30代表氢，
R31代表氢或甲基，
R32代表氢或甲基，
L1B代表直链(C2-C6)-烷二基，
且
其中(C2-C6)-烷二基可以被1-2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000341
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000342
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000351
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000352
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000353
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000361
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000362
其中
#9表示与-CHCH2苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
9.根据权利要求7和8所述的式(XXXa)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，
L1代表键或直链(C2-C6)-烷二基，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000371
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键，
L4代表键，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000372
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000381
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000382
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000383
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R3代表氢，
R4代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000391
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢，
R8代表氢，
R9代表氢，
R35代表甲基。
10.式(XXXI)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物
Figure FDA0000432948830000392
其中
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基、下式的基团
Figure FDA0000432948830000393
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C10)-烷二基，
B1代表下式的基团
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键或(C2-C4)-烷二基，
L6代表键，
R29代表氢或(C1-C4)-烷基，
R30代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R29和R30与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R31代表氢或(C1-C4)-烷基，
R32代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R31和R32与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
L1B代表直链(C2-C10)-烷二基，
且
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000411
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000412
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000421
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000422
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000431
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000432
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000441
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
11.根据权利要求10所述的式(XXXI)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000442
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000451
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R27代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000452
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成苯基环，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000461
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000462
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000471
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000472
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000481
其中
#9表示与-CHCH2苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
12.根据权利要求10和11所述的式(XXXI)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
L1代表键，
B代表键，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000483
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000491
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000501
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7或-C(=O)-NR8R9的基团，
其中
R7代表氢，
R8代表氢，
R9代表氢，
R35代表甲基。
13.选自以下的式(XXXa)和(XXXI)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物：
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-2，5-二氧代吡咯烷-1-基)己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(2S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(1，2-噁嗪烷-2-基)-1-氧代丙烷-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺三氟乙酸盐，
N-(6-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-6-氧代己基)-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R，4S，5S)-1-{(2S)-2-[(1R，2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺。
14.通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物
Figure FDA0000432948830000511
其中
n代表1-50的数字，
AK代表键，
基团§-G-L1-B-L2-§§代表接头，
其中
§表示与基团AK的连接位点，且
§§表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000521
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000522
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000523
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000531
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基。
15.根据权利要求14所述的通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，
其中
n代表1-50的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合剂，其经由所述结合剂的硫原子连接至基团G，
AK2代表结合剂，其经由所述结合剂的氮原子连接至基团G，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
其中
#1表示与所述结合剂的硫原子的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基或代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000542
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
和
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
B代表键或下式的基团
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000552
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
Q1代表4-7元杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D具有在权利要求14中描述的含义。
16.根据权利要求14或15所述的通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，
其中
n代表1-50的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表抗体或结合抗原的抗体片段，且经由硫原子与基团G连接，
AK2代表抗体或结合抗原的抗体片段，且经由氮原子与基团G连接，
n、G、L1、B、L2和D具有在权利要求14或15中给出的含义。
17.根据权利要求14-16中的任一项所述的通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-20的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表抗体或结合抗原的抗体片段，它们结合EGFR且经由所述结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表抗体或结合抗原的抗体片段，它们结合EGFR且经由所述结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000571
其中
#1表示与所述结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基或代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000581
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000583
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
Q2代表环戊基或环己基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或甲基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000591
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000592
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000601
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000602
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000611
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)20H的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基。
18.根据权利要求14-17中的任一项所述的通式(I)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由所述结合剂的半胱氨酸残基的硫原子与基团G连接，
AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗，其经由所述结合剂的赖氨酸残基的NH侧基与基团G连接，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000621
其中
#1表示与所述结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基或代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000622
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000623
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000624
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000631
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000632
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000641
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9或-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢或下式的基团
Figure FDA0000432948830000643
其中
#9表示与-CHC(R26)苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代。
19.用于生产根据权利要求14-18中的任一项所定义的本发明的式(I)化合物的方法，其特征在于，使所述结合剂在缓冲液中的溶液
[A]与合适的还原剂例如二硫苏糖醇或三(2-羧基乙基)膦盐酸盐混合，随后与式(II)的化合物反应
Figure FDA0000432948830000651
其中D、L1、B和L2具有在权利要求14-18中给出的含义，
以形成式(I-A)的化合物
Figure FDA0000432948830000652
其中n、AK1、D、L1、B和L2各自具有在权利要求14-18中给出的含义，
或者
[B]与式(III)的化合物反应
Figure FDA0000432948830000653
Figure FDA0000432948830000661
其中D、L1、B和L2各自具有在权利要求14-18中给出的含义，
以形成式(I-B)的化合物
其中n、AK2、D、L1、B和L2各自具有在权利要求14-18中给出的含义。
20.通过根据权利要求19或51所述的方法生产的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中AK1和AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗。
21.式(XXX)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物
其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，
L1代表键、直链(C1-C10)-烷二基或代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000664
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C1-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
和
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，以形成(C3-C6)-环烷基环或苯基环，包括任选地位于它们之间的碳原子，
B代表键或下式的基团
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
P代表O或NH，
L3代表键或(C2-C4)-烷二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000672
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
Q1代表3-7元碳环或4-7元氮杂杂环，
Q2代表3-7元碳环或4-7元氮杂杂环，
R14代表氢或(C1-C4)-烷基，
R15代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R14和R15与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R16代表氢或(C1-C4)-烷基，
R17代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成5元或6元杂环，
R18代表氢或(C1-C4)-烷基，
R19代表氢或天然的α-氨基酸或它的同系物或异构体的侧基，
R20代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或(C1-C4)-烷基，
R22代表氢或(C1-C4)-烷基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成3-7元碳环，
R23代表(C1-C4)-烷基，
R24代表氢或(C1-C4)-烷基，
R27代表氢或(C1-C4)-烷基，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000681
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个甲基取代基取代，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000692
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000701
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000702
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000711
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基。
22.根据权利要求21所述的式(XXX)的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
Cys代表半胱氨酸残基，其经由侧链的硫原子连接至琥珀酰亚胺的碳原子，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基或代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000712
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
其中
p代表2或3的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000731
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000732
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000741
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢或下式的基团
其中
#9表示与-CHC(R26)苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代。
23.根据权利要求1-6、14-18或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述结合剂结合癌症靶分子。
24.根据权利要求1-6、14-18或23或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述结合剂结合细胞外靶分子。
25.根据权利要求1-6、14-18、23或24或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述结合剂结合细胞外癌症靶分子。
26.根据权利要求1-6、14-18、23、24或25或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述靶分子、细胞外靶分子、癌症靶分子或细胞外癌症靶分子是蛋白。
27.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25或26或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述结合剂在结合所述细胞外靶分子以后被表达所述靶分子的细胞内化。
28.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26或27或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述结合剂是结合蛋白。
29.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26、27或28或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述结合剂是抗体或其结合抗原的抗体片段或抗体模拟物。
30.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26、27、28或29或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
31.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26、27、28、29或30或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
32.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26、27、28、29、30或31或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗体是完整抗体或改性的完整抗体。
33.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗体是IgG类抗体。
34.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述结合剂结合选自以下的细胞外癌症靶分子：EGF受体(NP_005219.2)、间皮素(Q13421-3)、C4.4a(NP_055215.2)、碳酸酐酶IX(CA IX；NP_001207.2))、Her2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、TYRP1、成纤维细胞生长因子受体3、I型单跨膜蛋白ICOSLG和程序性细胞死亡1配体1。
35.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述结合剂特异性地结合选自以下的细胞外癌症靶分子：EGF受体(NP_005219.2)、间皮素(Q13421-3)、C4.4a(NP_055215.2)、碳酸酐酶IX(CAIX；NP_001207.2))、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、TYRP1、成纤维细胞生长因子受体3、I型单跨膜蛋白ICOSLG和程序性细胞死亡1配体1。
36.根据权利要求1-6、14-18、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗体结合EGFR。
37.根据权利要求1-6、14-18或23-36或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗体特异性地结合EGFR。
38.根据权利要求1-6、14-18或23-37或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗-EGFR抗体选自：西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎芦木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
39.根据权利要求1-6、14-18或23-38或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗-EGFR抗体选自包含下述抗体之一的6个CDR序列的抗体：西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎芦木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
40.根据权利要求1-6、14-18或23-39中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗-EGFR抗体选自包含下述抗体之一的可变轻链和可变重链的氨基酸序列的抗体：西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎芦木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
41.根据权利要求1-6、14-18或23-40或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物，其中所述抗-EGFR抗体选自：西妥昔单抗、帕木单抗、尼妥珠单抗、扎芦木单抗、奈昔木单抗和马妥珠单抗。
42.用于治疗和/或预防疾病的根据权利要求1-18或23-41或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物或化合物。
43.用于治疗和／或预防过度增生性疾病和／或血管生成性疾病的方法中的根据权利要求1-18或23-41或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物或化合物。
44.用于生产药物的根据权利要求1-18或23-41或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物或化合物，所述药物用于治疗和／或预防过度增生性疾病和/或血管生成性疾病。
45.药物，其包含与惰性的、无毒的、药学上合适的赋形剂相组合的根据权利要求1-18或23-41或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物或化合物。
46.药物，其包含与一种或多种抗过度增生性的、细胞生长抑制性的或细胞毒性的物质相组合的根据权利要求1-18或23-41或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物或化合物。
47.用于治疗和／或用于预防过度增生性疾病和／或血管生成性疾病的根据权利要求44-46所述的药物。
48.用于治疗和／或预防人类和动物的过度增生性疾病和／或血管生成性疾病的方法，所述方法使用有效量的至少一种根据权利要求1-18或23-41或49-50中的任一项所述的结合剂-药物缀合物或化合物或在权利要求44-46中的任一项中定义的药物。
49.根据权利要求1所述的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-20的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合剂，其经由所述结合剂的硫原子连接至基团G，
AK2代表结合剂，其经由所述结合剂的氮原子连接至基团G，在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000781
其中
#1表示与所述结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
其中
m代表2-6的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
L1A代表直链(C2-C6)-烷二基，
B1代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000783
其中
##5表示与基团L1A的连接位点，
##6表示与基团L1B的连接位点，
L5代表键，
L6代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000791
其中
##7表示与羰基的连接位点，
##8表示与L1B的连接位点，
R33代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
R34代表氢或甲基，
R29代表氢，
R30代表氢，
R31代表氢或甲基，
R32代表氢或甲基，
L1B代表直链(C2-C10)-烷二基，
且
其中(C2-C6)-烷二基可以被1-2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000792
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000801
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表氢或甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表4-7元杂环，
R14代表氢，
R15代表氢，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R18代表氢，
R19代表氢、甲基、丙烷-2-基、2-甲基丙烷-1-基或1-甲基丙烷-1-基，
R20代表氢或甲基，
或者
R19和R20与它们所连接的原子一起形成吡咯烷基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，
R23代表甲基，
R24代表氢或甲基，
R27代表氢，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000811
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000812
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000813
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000821
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表1-羟基乙基、苄基、4-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000822
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000831
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
50.根据权利要求1所述的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-10的数字，
AK代表AK1或AK2
其中
AK1代表结合剂，其经由所述结合剂的硫原子连接至基团G，
AK2代表结合剂，其经由所述结合剂的氮原子连接至基团G，
在AK=AK1时，G代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000841
其中
#1表示与所述结合剂的半胱氨酸残基的连接位点，
#2表示与基团L1的连接位点，
或者
在AK=AK2时，G代表羰基，
L1代表键、直链(C2-C6)-烷二基、下式的基团
其中
m代表2或3的数字，
##1表示与基团G的连接位点，
##2表示与基团B的连接位点，
其中(C2-C6)-烷二基可以被1或2个甲基取代基取代，
B代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000843
其中
＊表示与L1的连接位点，
＊＊表示与L2的连接位点，
L3代表键或乙烷-1，2-二基，
L4代表键或下式的基团
Figure FDA0000432948830000851
其中
＊＊＊表示与羰基的连接位点，
＊＊＊＊表示与L2的连接位点，
R25代表甲基，
R28代表氢、甲基羰基或叔丁基氧基羰基，
Q1代表哌啶-1，4-二基，
R16代表氢或甲基，
R17代表氢或甲基，
或者
R16和R17与它们所连接的原子一起形成哌嗪基环，
R21代表氢或甲基，
R22代表氢或甲基，
或者
R21和R22与它们所连接的原子一起形成环丙基环，R23代表甲基，
R24代表氢，
L2代表直链(C2-C6)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000852
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
D代表下式的基团
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢，
R2代表1-羟基乙基、苄基、1-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000862
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000863
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢，
R4代表苄基、1-羟基苄基、1-苯基乙基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000871
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9或-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000872
其中
#9表示与-CHCH2苯基的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R35代表甲基或羟基。
51.用于生产根据权利要求1-6中的任一项所述的通式(Ia)的本发明化合物的方法，其特征在于，使所述结合剂在缓冲液中的溶液
[A]与合适的还原剂例如二硫苏糖醇或三(2-羧基乙基)膦盐酸盐混合，随后与式(IIa)的化合物反应
Figure FDA0000432948830000881
其中D、L1、B、L2和R35各自具有在权利要求1-6中给出的含义，以形成式(Ia-A)的化合物
Figure FDA0000432948830000882
其中n、AK1、D、L1、B、L2和R35各自具有在权利要求1-6中给出的含义，
或者
[B]与式(IIIa)的化合物反应
Figure FDA0000432948830000883
其中D、L1、B、L2和R35各自具有在权利要求1-6中给出的含义，以形成式(Ia-B)的化合物
其中n、AK2、D、L1、B、L2和R35各自具有在权利要求1-6中给出的含义，
52.通过权利要求51所述的方法生产的化合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中AK1和AK2代表西妥昔单抗、帕木单抗或尼妥珠单抗。
53.根据权利要求1所述的通式(Ia)的结合剂-药物缀合物以及它们的盐、溶剂合物和所述盐的溶剂合物，其中
n代表1-50的数字，
AK代表键，
基团§-G-L1-B-§§代表接头，
其中
§表示与基团AK的连接位点，且
§§表示与氮原子的连接位点，
L2代表直链(C2-C10)-烷二基或下式的基团
Figure FDA0000432948830000892
其中
p代表2-6的数字，
##3表示与基团B的连接位点，
##4表示与氮原子的连接位点，
其中(C2-C10)-烷二基可以被1-4个取代基取代，所述取代基彼此独立地选自甲基、羟基和苄基，
且
其中所述烷二基链的2个碳原子可以以1，2-、1，3-或1，4-关系彼此桥连，包括任选地位于它们之间的碳原子，以形成(C3-C6)环烷基环或苯基环，
D代表下式的基团
Figure FDA0000432948830000901
其中
#3表示与氮原子的连接位点，
R1代表氢或甲基，
R2代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
Figure FDA0000432948830000902
其中
#4表示与连位氮原子的连接位点，
#5表示与羰基的连接位点，
在其中含有N-O基团的环A代表下式的任选地被取代的单环或二环杂环
Figure FDA0000432948830000911
其中
#6表示与羰基的连接位点，
R6代表氢、羟基或苄氧基，
R3代表氢或甲基，
R4代表异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基，
或者
R3和R4与它们所连接的碳原子一起形成下式的(1S，2R)-2-苯基环丙烷-1，1-二基基团
其中
#7表示与连位氮原子的连接位点，
#8表示与基团T1的连接位点，
T1代表式-C(=O)-OR7、-C(=O)-NR8R9、-C(=O)-NH-NH-R10或
-CH2-O-R11的基团，
其中
R7代表氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基，
R8代表氢或甲基，
R9代表氢、甲基、乙基、正丙基或苄基，
或者
R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环，
R10代表苯甲酰基，
R11代表苄基，其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代，
R5代表氢、甲基或下式的基团
其中
#9表示与-CHC(R26)-T2的连接位点，
R12代表苯基，其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代，
R13代表苯基，其可以被甲氧基羰基或羧基取代，
R26代表氢或羟基，
T2代表苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基，
R35代表甲基或羟基。
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