MX2014007121A - Nuevos conjugados de principio activo-ligante (adc) y su uso. - Google Patents

Nuevos conjugados de principio activo-ligante (adc) y su uso.

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Abstract

La presente solicitud se refiere a nuevos conjugados de principio activo-ligante (ADC) de N,N-dialquilauriestatinas dirigidos hacia la diana FGFR2, a metabolitos efectivos de estos ADC, a procedimientos para la preparación de estos ADC, al uso de estos ADC para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades así como el uso de estos ADC para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, especialmente de enfermedades hiperproliferativas y/o angiogénicas como por ejemplo cáncer. Tales tratamientos pueden efectuarse como monoterapias o también en combinación con otros medicamentos u otras medidas terapéuticas.

Description

NUEVOS CONJUGADOS DE PRINCIPIO ACTIVO-LIGANTE (ADC) Y SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se refiere a nuevos conjugados de principio activo-ligante (ADC) de ?,?-dialquilauriestatinas dirigidos hacia la diana receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2), a metabolitos efectivos de estos ADC, a procedimientos para la preparación de estos ADC, al uso de estos ADC para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades así como el uso de estos ADC para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, especialmente de enfermedades hiperproliferativas y/o angiogénicas como por ejemplo cáncer. Tales tratamientos pueden efectuarse como monoterapias o también en combinación con otros medicamentos u otras medidas terapéuticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es la consecuencia del crecimiento celular no controlado de los tejidos más diversos. En muchos casos las nuevas células penetran en tejido ya existente (crecimiento invasivo) o forman metástasis en órganos alejados. Se produce cáncer en los órganos más diversos y con frecuencia presentan evoluciones de la enfermedad específicas del tejido. Por lo tanto la denominación cáncer como concepto general describe un gran grupo de enfermedades definidas de distintos órganos, tejidos y tipos de células.
Los tumores en estadios tempranos dado el caso pueden extirparse mediante medidas quirúrgicas o mediante terapia con rayos. Los tumores con metástasis por lo general solo pueden tratarse en forma paliativa mediante medicamentos quimioterapéuticos. El objetivo aquí es alcanzar la combinación óptima de una mejoría de la calidad de vida y una prolongación del tiempo de vida.
La mayoría de los medicamentos quimioterapéuticos que actualmente se aplican por vía parenteral frecuentemente no están dirigidos al tejido tumoral o las células tumorales, sino que debido a la administración sistémica están distribuidos de manera no específica en el organismo, es decir, también en lugares en la que no se desea una exposición al principio activo, como por ejemplo en células, tejidos y órganos sanos. Esto puede producir efectos secundarios no deseados que incluso pueden llegar a producir efectos graves de toxicidad general los que después frecuentemente limitan mucho el intervalo de dosis de uso terapéutico o requieren discontinuar por completo el medicamento.
La disponibilidad mejorada y selectiva de estos quimioterapéuticos en la célula tumoral o en el tejido directamente circundante y la consiguiente intensificación del efecto, por una parte, y por la otra la minimización de los efectos secundarios tóxicos, por lo tanto desde hace varios años constituyen un tema central en el desarrollo de nuevos quimioterapéuticos. Hasta ahora se realizaron muchos intentos de desarrollar métodos eficientes para la introducción de principio activo en la célula blanco. Pero la optimización de la asociación entre principio activo y diana intracelular y la minimización de la distribución intercelular de principio activo, por ejemplo hacia las células contiguas, continúan siendo una tarea difícil.
Para el direccionamiento dirigido hacia tejido tumoral y células tumorales son adecuados, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales. El significado de tales anticuerpos para el tratamiento clínico de cáncer en general ha aumentado considerablemente en los últimos años, sobre la base de la efectividad de tales agentes como Trastuzumab (Herceptin®), Rituximab (Rituxan®), Cetuximab (Erbi-tux®) y Bevacizumab (Avastin®) que ya están autorizados para el tratamiento de algunas enfermedades tumorales específicas [véase p. ej., G. P. Adams y L. M. Weiner, Nal Biotechnol. 23, 1147-1157 (2005)]. En consecuencia también ha aumentado considerablemente el interés en los así llamados inmunoconjugados, como por ejemplo, los ADC antes mencionados en los que un anticuerpo con efecto internalizador, dirigido contra un antígeno asociado al tumor, está unido de manera covalente por medio de una unidad de enlace ("linker" conectores) con un agente de acción citotóxica. Después de introducir el ADC en la célula tumoral y la posterior escisión del conjugado, luego dentro de la célula tumoral es liberado ya sea el agente citotóxico mismo u otro metabolito con acción citotóxica formado a partir del anterior, y puede desarrollar allí directa y selectivamente su efecto. De esta manera podría mantenerse el daño de tejido normal en valores significativamente menores en comparación con una quimioterapia convencional de cáncer [véase p. ej., J. M. Lam- bert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu y P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1 137-1146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry y B. Stump, Bioconjugate Chem. 21 , 5-13 (2010)].
En lugar de anticuerpos también pueden usarse ligantes del grupo de principios activos de moléculas pequeñas como ligantes que se unen selectivamente a un punto diana especial ("target"), como por ejemplo a un receptor [véase p. ej., E. Ruoslahti et al., Science 279, 377-380 (1998); D. Karkan et al., PLoS ONE 3 (6), e2469 (June 25, 2008)]. También se conocen conjugados compuestos de principio activo citotóxicos y un ligando direccionado que presentan entre el ligando y el principio activo presentan un punto de escisión definido para la liberación del principio activos. Un "punto de escisión nominal" puede consistir por ejemplo en una cadena peptídica que puede ser escindida selectivamente en un punto determinado mediante una enzima especial en el lugar de acción [véase p. ej., R. A. Firestone y L. A. Telano, solicitud de patente estadounidense US 2002/0147138].
La efectividad de anticuerpos monoclonales está comprobada en diferentes tipos de cáncer. Así, Herceptin® y Erbitux® se emplean con éxito en el tratamiento del cáncer de mama HER2-positivo o bien en cáncer colorrectal EGFR-positivo.
El acoplamiento de compuestos citotóxicos a los anticuerpos ofrece una mayor posibilidad de continuar mejorando la terapia anticáncer, dado que estos conjugados permiten una concentración de toxóforos específica tumoral y simultáneamente reducen la toxicidad sistémica. Respecto de la efectividad y la tolerancia se obtuvieron resultados prometedores en estudios clínicos realizados con Brentuximab Vedotin para el linfoma Hodgkin, así como Trastuzumab-DM1 para el cáncer de mama, que apoyan el desarrollo de nuevos anticuerpos y nuevos ADC contra otros antígenos tumorales.
La terapia basada en anticuerpos resulta muy efectiva en el tratamiento de diferentes tipos de carcinomas, entre ellos los tumores sólidos. Así, por ejemplo se usó exitosamente Herceptin® para el tratamiento de cáncer de mama y Rituxan® en tipos de carcinoma relaciones con las células B. En el centro del desarrollo de una terapia exitosa sobre la base de anticuerpos se ubica la aislación de anticuerpos contra proteínas de la superficie celular que preferentemente se expresan en células tumorales.
Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos son receptores de la tirosina quinasa (RTK) de los cuales se conocen cuatro en los mamíferos (FGFR1 , FGFR2, FGFR3, FGFR4). Como ligandos se han identificado 22 factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) humanos (Eswarakumar y Schlessinger, Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16:139-149; Shimada et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 2001 , 98:6500-6505). Los FGFR se componen de tres dominios extracelulares de inmunoglobulina (Ig), a saber D1-D3, donde los dominios 2 y 3 son necesarios para el enlace de ligandos, un dominio transmembranal único y un dominio citoplasmático que contiene el centro catalítico de la proteína tirosina quinasa (en la Figura 1 se muestra una representación esquemática).
Representación esquemática de la estructura de FGFR2. Las variantes de empalme alfa (SEC ID N° 1) y beta (SEC ID N° 2) están contrapuestas mutuamente. La representación muestra los tres dominios similares a Ig (D1 , D2 y D3), el dominio transmembranal (TM) y el dominio de quinasa intracelular. También se han identificado el punto de unión de la heparina (HBS), la caja azida (AB), y el dominio lllb/lllc alternativo. El extremo amino está marcado con una N, el extremo carboxi con una C.
La parte extracelular además incluye la caja azida (AB) y el punto de unión de la heparina (HBS) (véase figura 1). Una importante característica de la familia FGFR de los RTK es que existen diversas variantes de empalmes alternativos. El FGFR de longitud total se denomina FGFR alfa (SEC ID N° 1), mientras que la isoforma que carece de D1 se denomina FGFR beta (SEC ID N° 2) (Figura 1). Un corte y empalme alternativo en el dominio 3 produce dos variantes diferentes, a saber FGFR2 lllb que es codificado por los exones 7 y 8, y FGFR2 lile que es codificado por los exones 7 y 9 (Figura 1). El corte y empalme mencionado por último influye sobre el enlace de los ligandos lo que lleva al patrón de especificidad. FGFR2 lile en primera instancia es expresado por las células mesoenquimales y FGFR2 lllb esencialmente por las células epiteliales. El FGF7 también se conoce como factor de crecimiento de los queratinocitos (KGF) y solo se enlaza con FGFR2 lllb que por lo tanto también se denomina KGFR. Si los FGF se enlazan con sus receptores, a continuación se producen la dimerización y fosforilación de los FGFR y una señalización corriente abajo por medio del complejo de adición de proteínas FRS-GRB2 a la cascada de línea de señal RAS-MAPK y la cascada de línea de señal PI3K-AKT. La cascada de línea de señal mencionada en primer lugar participa del crecimiento celular y en la diferenciación celular, la nombrada por último interviene en la supervivencia de las células y en la determinación del destino de las células (Katoh y Katoh, Int. J. Oncol. 2006, 29:163-168).
Para la organogénesis correcta durante la embriogénesis se requiere una línea de señal orquestada de los cuatro receptores (FGFR1 a FGFR4) y sus variantes de empalma por medio de los diferentes FGF (Ornitz et al., Genome Biol 2001 , 2:3005). En el FGFR2 la carencia de todas las variantes del FGFR2 produce defectos en la formación de la placenta y en el nacimiento de las extremidades y, por lo tanto, produce la muerte en el estadio E10.5. Un knock-out específico de FGFR2 lllb en el ratón también produce letalidad (en P0) en asociación con agenesia de los pulmones, del lóbulo anterior de la hipófisis, de la tiroides, de los dientes y de las extremidades, mientras que un trastorno de la variante FGFR2-lllc tiene capacidad de supervivencia, observándose retraso en la osificación, enanismo proporcional y sinostosis de la base del cráneo (Eswarakumar y Schlessinger, 2005). Las mutaciones activantes del FGFR2 en la línea germinal producen malformaciones graves durante la embiogénesis, como sinosotosis coronaria y sinostosis craneal en el síndrome de Apert o de Pfeiffer en los humanos (Robín et al., en Gene Reviews, NCBI Bookshelf Washington, edic. Pagon et al., 1993). En los adultos la línea de señal del FGFR2 interviene en la curación de heridas, la reparación epitelial y la protección celular de la piel y la mucosa (Braun et al., Philo. Trans. R. Soc. Lond. B 2004, 359:753-757) y en la regeneración en los casos de daños hepáticos (Steiling et al., Oncogene 2003, 22:4380-4388; Bohm, Doktorarbeit, Eidgenóssische Technische Hochschule Zürich, 2009). Se encuentra en discusión una función de la línea de señal del FGFR2 en la migración de las EPDC (epicardial derived cells) hacia el corazón después de producirse un infarto, porque durante la embriogénesis se requiere la línea de señal FGF10-FGFR2 para la migración de las EPDC en el miocardio compacto, un procedimiento que es necesario para el desarrollo del corazón en su totalidad (Vega-Hernández et al., Development 2011 :3331-3340; Winter y De Groot, Cell Mol. Life Sci. 2007, 64:692-703). Todas estas funciones del FGFR2 son de tipo regenerativo y aparentemente solo son de importancia esencial en condiciones no psicológicas debido a un trastorno de la hemostasis tisular. Una línea de señal somática intensificada por medio de FGFR2 interviene en diferentes estados patológicos como ser acné (Katoh, J. of Invest. Dermatol. 2009, 129:1861-1867), psoriasis (Finch et al., Am. J. Pathol. 1997, 151 :1619-1628; Xu et al., J. Invest. Dermatol. 2011 :131 : 1521 -1529) y cáncer (véase abajo).
Se han publicado varios estudios en los que se muestra una fuerte asociación de la expresión del FGFR2 con un desenlace desfavorable en pacientes oncológicos: La sobreexpresión del FGFR2 y/o KGF está aparejada con un crecimiento expansivo de carcinomas de estómago y una menor sobrevida de los pacientes (Matsunobu et al., Int. J. Cáncer 2006, 28:307-314; Toyokawa et al., Oncol. Reports 2009, 21:875-880). La sobreexpresión del FGFR2 se comprobó allí en 31-36,5% de todas las muestras de carcinoma de estómago analizadas (Matsunobu et al., Int. J. Cáncer 2006, 28:307-314; Toyokawa et al., Oncol. Reports 2009, 21 :875-880). El adenocarcinoma (70% de todos los carcinomas de estómago) además se subdivide en dos diferentes tipos patológicos, a saber cáncer de estómago del tipo intestinal y del tipo difuso. Resulta interesante que el primer tipo menos agresivo se correlaciona con una línea de señal ErbB2 activada, mientras que en el último tipo mencionado, más agresivo, se producen aberraciones en la línea de señal FGFR2/PI3K (Yamashita et al., Surg. Today 2011 , 41 :24-38). Una sobreexpresión del FGFR2 se encontró en 53% de todas las muestras de cáncer de estómago del tipo difuso (Yamashita et al., Surg. Today 2011, 41 :24-38). Tomando en cuenta todos los datos, la expresión de HER2 y la expresión del FGFR2 parecen presentarse en dos diferentes poblaciones de pacientes. Posiblemente, la expresión del FGFR2 es en parte el resultado de una amplificación génica, dado que en aproximadamente 7-10% de todos los carcinomas de estómago primarios pueden observarse amplificaciones del FGFR2 (Kunii et al. Cáncer Res. 2008, 68:23-40-2348). Además no solamente se encontró una expresión de FGFR2 en las metástasis, sino que en las metástasis era ¡ncluso más pronunciada que en los tumores primarios (Yamashita et al., Surg. Today 2011 , 41 :24-38).
En el cáncer de mama se encontró una expresión de FGFR2-lllb en 57% de las muestras tumorales, pero apenas en tejidos sanos (Tamaru et al. 2004, 84:1460-1471). KGF (FGF7) se presentó en 45% de las muestras al azar y por lo general junto con FGFR2 II Ib. La co-expresión de FGF7 y su único receptor FGFR2 II Ib estaba asociado con una cantidad significativamente menor de células apoptósicas dentro del tumor primario en comparación con carcinomas primarios de mama en donde se expresó FGF7 n¡ tampoco FGFR2 lllb (Tamaru et al. 2004, 84:1460-1471). Como también en el caso de cáncer de estómago, se encontró una amplificación génica en cáncer de mama, y ello en 4% de los carcinomas de mama triplemente negativos (TNBC) (Turner et al. Oncogene 2010, 29:2013-2023). En el cáncer de mama se identificaron varias modificaciones de nucleótidos individuales (Single Nucleotide Polymorphism = SNP) que conllevan un mayor riesgo de cáncer de mama (Hunter et al. Nature Genetics 2007, 6:870-874). Cuando el SNP está localizado dentro del intrón 2, esto lleva a un aumento de la regulación transcripcional de FGFR2 (Katoh Expert Reviews 2010, 10:1375-1379). Resulta interesante que el FGFR1 preferentemente aumenta en carcinomas de mama que son (ER)-positivos para el receptor de estrógeno, mientras que el FGFR2 aumenta en carcinomas de mama ER-negativos (Katoh, Expert Reviews 2010, 10:1375-1379).
En los casos de carcinoma de páncreas la sobreexpresión de FGFR2 lllb y/o FGF7 es altamente correlativa con la invasión de las venas (Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964-1974), donde se encontró una co-expresión de FGFR2 y FGF7 en células tumorales, aunque esto se produjo aún con mayor frecuencia en células del estroma ubicadas adyacentes a las células tumorales (Ishiwata et al., Am. J. Pathol. 1998, 153:213-222).
En cáncer de ovario epitelial se encontró en 80% de los casos un aumento del FGFR2 en comparación con el tejido normal, y en 70% se encontró FGF7 en el líquido ascítico (Steele et al., Oncogene 20:5878-5887).
La proteína del FGFR2 se encontró en todos los carcinomas cervicales invasivos estudiados, donde se había producido una fuerte expresión en el frente invasivo de los tumores (Kawase et al., Int. J. Oncol. 2010, 36:331-340).
En el adenocarcinoma del pulmón se produjo una co-expresión de FGF7 y FGFR2 en 51 ,6% de los casos y se correlaciona con bajos grados de diferenciación, mayores índices de proliferación, metástasis de nodos linfáticos y menor sobrevida de 5 años (Yamayoshi et al., J. Pathol. 2004, 204:1 0- 18).
En el carcinoma endometrial se presentan mutaciones de FGFR2 activantes en aproximadamente 16% de los casos (Pollock et al., Oncogene 2007, 26:7158-7162).
En el cáncer esofágico (EC) se encontró una co-expresión de FGF7 y FGFR2 en células cancerosas en 26% de los pacientes e implicó una tendencia a un menor tiempo de sobrevida (Yoshino et al., Int. J. Oncol. 2007, 31 :721-728).
En el carcinoma de células hepáticas la expresión de FGFR2 presentó un aumento de 4,7 veces en tumores poco diferenciados. Esta expresión es paralela a la invasión de la vena cava y menores tiempos de sobrevida sin enfermedad (Harimoto et al., Oncology 2010, 78:361-368).
En varias publicaciones con datos de ensayo in-vitro e in-vivo se comprobó una relación causal entre una línea de señal de FGFR2 modificado y el crecimiento tumoral.
Un knock-down o bien una inhibición del FGFR2 en células cancerosas de cáncer de estómago (Takeda et al., Clin. Cáncer Res. 2007; 13:3051-3057; Kunii et al., Cáncer Res. 2008; 68:2340-2348), cáncer de mama (Turner et al. Oncogene 2010, 29:2013-2023), cáncer ovárico (Colé et al., Cáncer Biol. Ther. 2010, 10:495-504) así como carcinoma de epitelio plano de la cabeza y el cuello (Marshall et al., Clin. Cáncer Res. 201 1 , 17:5016-5025) produjeron una menor proliferación o bien una mayor apoptosis de las células tumorales. También en xenotransplantes tumorales se observó en el knock-down de FGFR2 así como en la inhibición de FGFR2 en líneas celulares tumorales que sobreexpresan FGFR2, una inhibición del crecimiento en líneas celulares de cáncer de estómago (Takeda et al., Clin. Cáncer Res. 2007; 13:3051-3057) así como en líneas celulares de cáncer ovárico (Colé et al., Cáncer Biol. Ther. 2010, 10:495-504). Además el FGF7 que solamente activo el FGFR2, aumenta la proliferación de líneas celulares de cáncer de estómago (Shin et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 2002, 128:596-602), líneas celulares de cáncer de mama (Zhang et al., Anticancer Res. 1998, 18:2541-2546) y líneas celulares de cáncer ovárico (Colé et al., Cáncer Biol. Ther. 2010, 10:495-504) in vitro y in vivo. Además un knock-down de FGFR2 en las líneas celulares de cáncer de endometrio que presentan el FGFR2 con mutaciones activadoras, también llevan a la detención del ciclo celular y a la inducción de la muerte celular (Byron et al., Cáncer Res. 2008, 68:6902-6907).
El línea de señal de FGFR2 promueve la migración e invasión de líneas celulares de cáncer de estómago (Shin et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 2002, 128:596-602), líneas celulares de cáncer de mama (Zhang et al., Anticancer Res. 1998, 18:2541-2546) y líneas celulares de cáncer de páncreas in vitro (Nomura et al., Br. J. Cáncer 2008, 99:305-313; Niu et al., J. Biol. Chem. 2007, 282:6601-6011). En el cáncer esofágico el FGFR2 es el gen de mayor actividad en fibroblastos asociados al tumor. Los fibroblastos aislados asociados al tumor liberan un factor soluble que promueve la proliferación de células de cáncer de esófago (Zhang et al., hum. Cáncer Biol. 2009, 15:4017-4022) por lo que se comprueba que también las células de estroma de FGFR2 expresado pueden promover la progresión tumoral. El anticuerpo anti-FGFR2 solamente se menciona en pocos informes. En Fortín et al. (J. Neurosci. 2005, 25: 7470-7479) se ha descrito un anticuerpo anti-FGFR2 bloqueante. Wei et al. (Hybridoma 2006, 25: 115-124) mostraron anticuerpos con especificidad exclusiva para FGFR2 lllb, que inhiben la proliferación celular inducida por KGF. En el documento WO2007/144893 se describen anticuerpos inhibidores que enlazan con FGFR2 y FGFR3. En el documento WO2010/054265 y en Zhao et al. (Clin. Cáncer Res. 2010,16:5750-5758) se describen anticuerpos que inhiben el enlace con FGF, entre otro por ejemplo GAL-FR21 y GAL-FR22. Bai et al. (Cáncer Res. 2010, 70:7630-7639) describen anticuerpos con especificidad para FGFR2 lllb. R&D Systems comercializan anticuerpos anti-FGFR2 que tienen un efecto neutralizante en los ensayos del fabricante. En el documento WO2005/06621 1 se describen anticuerpos que están orientados hacia diferentes FGFR de superficies celulares, entre otros a FGFR2. En el documento WO2009/100105 se describen anticuerpos anti-FGFR2 específicos de isoformas que pueden enlazarse en forma covalente con moléculas efectoras. En el documento WO2007/134210 se describen procedimientos para tratar cáncer colorrectal empleando anticuerpos anti-FGFR2 o inmunoconjugados. En el documento WO2007/144893 se describen anticuerpos de FGFR2 con afinidad de enlace con otros FGFR que bloquean la activación del receptor FGFR2 constitutiva y dependiente de los ligandos.
La auriestatina E (AE) y la monometilauriestatina E (MMAE) son análogos sintéticos de las dolastatinas, un grupo especial de seudopéptidos lineales que fueron aislados originariamente de fuentes marinas y que en parte presentan una actividad citotóxica muy potente frente a células tumorales [para una sinopsis, véase p. ej., G. R. Pettit, Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70, 1-79 (1997); G. R. Pettit et al., Anti-Cancer Drug Design 10, 529-544 (1995); G. R. Pettit et al., Anti-Cancer Drug Design 13, 243-277 (1998)].
Auriestatina E {AE): R = CH.
Monometilauriestatina E (MMAE): R = H Aunque la MMAE presenta la desventaja de una toxicidad sistémica comparativamente elevada. Para mejorar la selectividad tumoral se utiliza la MMAE especialmente en combinación con conectores de valina-citrulina que pueden escindirse enzimáticamente en el contexto ADC para la terapia tumoral más específica [documento WO 2005/081711-A2; S. O. Doronina et al., Bioconjugate Chem. X7_, 114-124 (2006)]. Después de la escisión proteolítica la MMAE es liberada preferentemente en forma intracelular a partir del correspondiente ADC.
La monometilauriestatina F (MMAF) es un derivado de auriestatina con una unidad de fenilalanina C-terminal que solo presenta un moderado efecto anti-proliferativo en comparación con la MMAE. Esto probablemente se deba al grupo carboxilo libre que debido a la polaridad y carga afecta negativamente el pasaje celular de este compuesto. En este contexto se describió al metiléster de MMAF (MMAF-OMe) como un derivado de profármaco con carga neutral que presenta pasaje celular y que muestra en comparación con la MMAF una citotoxicidad in vitro aumentada en varias magnitudes respecto de líneas celulares de carcinomas [S. O. Doronina et al., Bio-conjugate Chem. 17, 1 14-124 (2006)]. Puede suponerse que este efecto es producido por la misma MMAF la que después de la absorción del profármaco en las células es liberada rápidamente debido a la hidrólisis intracelular de ésteres. iMonometilauriestatina F (MMAF): = H Metiléster de monometilauriestatina F (MMAF-OMe): R = Cí¾ Pero los compuestos de principio activo sobre la base de los derivados de ésteres simples por lo general están sometidos al riesgo de una inestabilidad química a causa de una hidrólisis de éster no específica dependiente del lugar de acción previsto, por ejemplo debido a esterasas existentes en el plasma sanguíneo; esto puede limitar claramente la aplicabilidad de tales compuestos en la terapia.
La monometilauriestatina F (MMAF) así como diferentes derivados de ésteres y amida de la misma se revelaron en el documento WO 2005/08171 1-A2. Se han descrito otros análogos de auriestatina con una unidad de fenilalanina C-terminal sustituida con amidas en el documento WO 01/18032-A2. En los documentos WO 02/088172-A2 y WO 2007/008603-A1 se reivindican análogos de MMAF que se refieren a modificaciones de cadenas laterales de la fenilalanina, y en el documento WO 2007/008848-A2 aquellas en las que se encuentra modificado el grupo carboxilo de la fenilalanina. Los conjugados de auriestatina enlazados mediante el extremo C se han descrito poco antes en el documento WO 2009/117531 -A1 [véase también S. O. Doronina et al., Bioconjugate Chem. 19, 1960-1963 (2008)].
Por lo demás, los derivados de auriestatina como M AE y MMAF también son sustratos para proteínas transportadoras que son expresadas por muchas células tumorales, lo que puede generar el desarrollo de resistencia a estos principios activos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Objetivo de la presente invención fue la identificación de nuevos conjugados de principio activo-ligante (ADC) que mediante la combinación de nuevos derivados de ?,?-dialquilauriestatina con enlaces y ligantes adecuados, novedosos presentan un perfilo de acción muy atractivo, como por ejemplo respecto de su acción tumoral específica y/o el menor potencial de los metabolitos formado intracelularmente como sustrato respecto de proteínas transportadoras y, por lo tanto, son adecuados para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades hiperproliferativas y/o angiogénicas, como por ejemplo, el cáncer.
BREVE DESCRIPCÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una una representación esquemática de los FGFR que se componen de tres dominios extracelu lares de inmunoglobulina (Ig), DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Objeto de la presente invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) (la) en la que n representa un número de 1 a 50, AK representa un ligante que se enlaza con el FGFR2, el grupo §-G-L1-B-§§ representa un conector, donde § marca el punto de unión con el grupo AK y §§ marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, L2 representa alcanodiilo (C2-Cio) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, D representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R representa hidrógeno o metilo, R representa isopropilo, isobutilo, sec. -butilo, ferc.-butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1 -/-imidazol-4-ilmetilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, O R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que # marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno o metilo, R4 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere. -butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1H-imidazol-4-ilmetilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1 , representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, ferc.-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno o hidroxi, T2 representa fenilo, bencilo, 1/-/-indol-3-ilo o 1H-indol-3-ilmetilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Compuestos de acuerdo con la invención son los compuestos de las fórmulas (I) y sus sales, solvatos y solvatos de las sales, los compuestos comprendidos por las fórmulas (I), de las fórmulas indicadas a continuación y sus sales, solvatos y solvatos de las sales así como los compuestos comprendidos por las fórmulas (I), indicados a continuación como ejemplos de realización y sus sales, solvatos y solvatos de las sales, en tanto los compuestos comprendidos por las fórmulas (I) indicados a continuación no son ya sales, solvatos y solvatos de las sales.
Los compuestos de acuerdo con la invención dependiendo de su estructura ya pueden presentarse en diferentes formas estereoisoméricas, es decir, en forma de isómeros de configuración o dado el caso también como isómeros de conformación (enantiómeros y/o diaestereómeros, incluyendo aquellos en atropisómeros). La presente invención por lo tanto comprende los enantiómeros y diaestereómeros y sus respectivas mezclas. De tales mezclas de enantiómeros y/o diaestereómeros pueden aislarse de manera conocida los componentes estereoisoméricamente uniformes; preferentemente se emplean para ello procedimientos cromatográficos, especialmente la cromatografía HPLC en fase aquiral o bien quiral.
Dado que los compuestos de acuerdo con la invención pueden presentarse en formas tautómeras, la presente invención comprende todas las formas tautómeras ADC-Charae.
La presente invención también incluye todas las variantes isotópicas adecuadas de los compuestos de acuerdo con la invención. Se entiende por variante isotópica de un compuesto de acuerdo con la invención un compuesto en el que al menos un átomo dentro de un compuesto de acuerdo con la invención se sustituyó por otro átomo del mismo número de orden, pero con otra más atómica que la masa atómica que se presenta de manera usual o preponderante en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden ser incorporados en un compuesto de acuerdo con la invención son aquellos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor, cloro, bromo y yodo, como 2H (deuterio), 3H (tritio), 13C, 14C, 15N, 170, 80, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36CI, 82Br, 123l, 124l, 29l y 1311. Determinadas variantes isotópicas de un compuesto de acuerdo con la invención, como especialmente aquellas en las que están incorporados uno o varios isótopos radioactivos, pueden ser útiles, por ejemplo, para el análisis del mecanismo de acción o de la distribución del principio activo en el organismo; debido a la preparación y detectabilidad comparativamente sencilla, son especialmente adecuados para ello los compuestos marcados con isótopos 3H o 14C. Además la incorporación de isótopos, como por ejemplo de deuterio, puede producir determinadas ventajas terapéuticas como consecuencia de una mayor estabilidad metabólica del compuesto, como por ejemplo una prolongación de la vida media en el organismo o una reducción de la dosis efectiva necesaria; tales modificaciones de los compuestos de acuerdo con la invención por lo tanto dado el caso también pueden constituir una forma de realización preferida de la presente invención. Las variantes isotópicas de los compuestos de acuerdo con la invención pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos por el especialista, así por ejemplo según los procedimientos descritos más adelante y las instrucciones indicadas en los ejemplos de realización, al emplearse correspondientes modificaciones isotópicas de los respectivos reactivos y/o compuestos de partida.
Como sales se prefieren en el marco de la presente invención sales fisiológicamente inofensivas de los compuestos de acuerdo con la invención. También se incluyen las sales que no son adecuadas para los usos farmacéuticos en sí mismos, pero pueden usarse por ejemplo para aislar o purificar los compuestos de acuerdo con la invención.
Las sales fisiológicamente inofensivas de los compuestos de acuerdo con la invención comprenden sales de adición de ácidos de ácidos minerales, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, p. ej., sales del ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido bencensulfónico, ácido toluensulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico y ácido benzoico.
Las sales fisiológicamente inofensivas de los compuestos de acuerdo con la invención también comprenden sales de bases usuales, como a modo de ejemplo y preferentemente sales de metales alcalinos (p. ej., sales de sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (p. ej., sales de calcio y de magnesio) y sales de amonio, derivados de amoníaco u aminas orgánicas con 1 a 16 átomos de carbono, como a modo de ejemplo y preferentemente etilamina, dietilamina, trietilamina, etildiisopropil-amina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclohexilamina, dimetilaminoetanol, procaína, dibencilamina, /V-metilpiperidina, A/-metilmorfolina, arginina, lisina y 1 ,2-etilendiamina.
Como solvatos se denominan en el marco de la invención aquellas formas de compuestos de acuerdo con la invención que en estado sólido o líquido forman un complejo mediante la coordinación con moléculas de disolventes. Los hidratos son una forma especial de solvatos en los que la coordinación se realiza con agua. Como solvatos se prefieren los hidratos en el marco de la presente invención.
Además la presente invención también incluye profármacos de los compuestos de acuerdo con la invención. El concepto "profármacos" denomina compuestos que por sí mismos pueden ser biológicamente activos o inactivos, pero son transformados en compuestos de acuerdo con la invención durante el tiempo de permanencia en el organismo (por ejemplo, en forma metabólica o hidrolítica).
En el marco de la presente invención los sustituyentes, salvo especificación en contrario, presentan el siguiente significado: Alquilo (C1-C4) en el marco de la invención representa un resto alquilo lineal o ramificado con 1 a 4 átomos de carbono. A modo de ejemplo y preferentemente se mencionan: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, 1-metilpropilo y tere-butilo.
Alcanodiilo en el marco de la invención representa un resto alquilo lineal, a, OJdivalente con la cantidad de átomos de carbono dada en cada caso. A modo de ejemplo y preferentemente se mencionan: metilos, etan-1 ,2-diilo (1 ,2-etileno), propan-1,3-diilo (1,3-propileno), butan-1,4-diilo (1 ,4-butileno), pentan-1,5-diilo (1 ,5-pentileno), hexan-1 ,6-diilo (1 ,6-hexileno), heptan-1 ,7-diilo (1 ,7-hexileno), hectan-1 ,8-diilo (1 ,8-octileno), nonan-9,1-diilo (1 ,9-nonileno), decan-1 ,10-diilo (1 ,10-decileno). Cicloalquilo (C3-C7) o bien carbociclo de 3 a 7 miembros en el marco de la invención representa un grupo cicloalquilo monocíclico, saturado con 3 a 7 átomos de carbono. A modo de ejemplo y preferentemente se mencionan: ciclopropilo, ciclobutilo, ciclo-pentilo, ciclohexilo y cicloheptilo.
El grupo lateral de un a-aminoácido en el significado de R19 comprende tanto los grupos laterales de los a-aminoácidos naturales como también los grupos laterales de homólogos e isómeros de estos a-aminoácidos. El a-aminoácido puede presentarse tanto en la configuración L como también en la configuración D o también como mezcla de la forma L y D. Como grupos laterales se indican a modo de ejemplo: metilo (alanina), propan-2-ilo (valina), propan-1-ilo (norvalina), 2-metilpropan-1-ilo (leucina), 1-metilpropan-1-ilo (isoleucina), butan-1-ilo (norleucina), íerc-butilo (2-íerc-butilglicina), fenilo (2-fenilglicina), bencilo (fenilalanina), p-hidroxi-bencilo (tirosina), indol-3-ilmetilo (triptofano), imidazol-4-ilmetilo (histidina), hidroximetilo (serina), 2-hidroxietilo (homoserina), 1-hidroxietilo (treonina), mercaptometilo (cisteina), metiltiometilo (S-metilcisteína), 2-mercaptoetilo (homocisteína), 2-metiltioetilo (metionina), carbamoilmetilo (asparagina), 2-carbamoil- etilo (glutamina), carboximetilo (ácido asparagínico), 2-carboxietilo (ácido glutámico), 4-aminobutan-1-ilo (lisina), 4-amino-3-hidroxibutan-1-ilo (hidroxilisina), 3-amino-propan-1-ilo (ornitina), 2-aminoetilo (ácido 2,4-diaminobutírico), aminometilo (ácido 2,3-diaminopropiónico), 3-guanidinopropan-1-ilo (arginina), 3-ureidopropan-1-ilo (citrulina). Los grupos laterales preferidos de a-aminoácidos en el significado de R19 son metilo (alanina), propan-2-ilo (valina), 2-metilpropan-1-ilo (leucina), bencilo (fenil-alanina), imidazol-4-ilmetilo (histidina), hidroximetilo (serina), 1-hidroxietilo (treonina), 4-aminobutan-1-ilo (lisina), 3-aminopropan-1-ilo (ornitina), 2-aminoetilo (ácido 2,4-diaminobutírico), aminometilo (ácido 2,3-diaminopropiónico), 3-guanidinopropan-1-ilo (arginina). Se prefiere en cada caso la configuración L.
Un heterociclo de 4 a 7 miembros en el marco de la invención representa un heterociclo saturado monocíclico con un total de 4 a 7 átomos anulares que contiene uno o dos heteroátomos anulares de la serie N, O, S, SO y/o SO2 y está enlazada mediante un átomo de carbono anular o dado el caso un átomo de nitrógeno anular. Se prefiere un heterociclo de 5 a 7 miembros con uno o dos heteroátomos anulares de la serie N, O y/o S, especialmente preferido un heterociclo de 5 o 6 miembros con uno o dos heteroátomos anulares de la serie N y/o O. Se mencionan a modo de ejemplo: azetidinilo, oxetanilo, pirrolidinilo, pirazolidinilo, tetrahidrofuranilo, tiolanilo, piperidinilo, piperazinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, morfolinilo, tio-morfolinilo, hexahidroazepinilo y hexahidro-1 ,4-diazepinilo. Son preferidos pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, piperidinilo, piperazinilo, tetrahidropiranilo y morfolinilo.
En la fórmula del grupo que puede representar A, B, B1, D, G, L1, L2, L4, L6, R1, R2, R3, R4 o bien R5, el punto final de la línea que presenta el signo #6, *, **, #3, # #2, ##2, ##3, ##4, ##5, ##6, ##7, ##8, ***, ****, #4, #5, #6, #7, #8 o bien #9, no representa un átomo de carbono o bien un grupo CH2, sino que es parte componente de la unión con el átomo marcado respectivamente al que está unido A, B, B1, D, G, L1, L2, L4, L6, R1, R2, R3, R4 o bien R5 En el marco de la presente invención rige que para todos los restos que se presentan varias veces, su significado es independiente uno de otro. Cuando los restos están sustituidos en los compuestos de acuerdo con la invención, los restos, salvo especificación en contrario, pueden estar mono- o polisustituidos. Se prefiere una sustitución uno o dos sustituyentes ¡guales o diferentes. Especialmente preferida es la sustitución con un sustituyente.
En el marco de la presente invención los términos usados, salvo especificación en contrario, presentan el siguiente significado: El término "conector" se entiende en su sentido más amplio como una unidad química que comprende un enlace covalente o una serie de átomos que enlazan de manera covalente un ligante a un principio activo. Preferentemente el término "conector" se entiende como una serie de átomos en el sentido de la presente invención que enlazan de manera covalente un ligante con un principio activo. Además los conectores pueden representar, por ejemplo, unidades químicas divalentes, como alquildülos, arildiilos, heterooarildiilos, heteroociclildiilos, éster de ácido dicarbonílico, amidas de ácido dicarbonílico.
El término "ligante" se entiende en el sentido más amplio como una molécula que se une a una molécula diana que existe en una población de células blanco a las que se direcciona el conjugado de principio activo-ligante. El término ligante debe entenderse en su acepción más amplia y también comprende, p. ej., lectinas, proteínas que pueden unirse con determinadas cadenas de azúcares o proteínas que enlazan con fosfolípidos. Tales ligantes comprenden por ejemplo, proteínas de elevado peso molecular (proteínas ligantes), polipéptidos o péptidos (péptidos ligantes), moléculas no peptídicas (p. ej., aptámeros (documento US 5.270.163) (artículos sinópticos de Keefe AD., et al., Nat. Rev. Drug discov. 2010; 9:537-550), o vitaminas) y todas las demás moléculas o sustancias que unen células. Las proteínas ligantes son p. ej., anticuerpos y fragmentos de anticuerpos o miméticos de anticuerpos como p. ej., affibodies, adnectinas, anticalinas, DARPins, avímeros, nanocuerpos (artículos sinópticos de Gebauer M. et al., Curr. Opinión in Chem. Bíol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinión in Pharmacology 2008; 8:608-617). Los péptidos ligantes son p. ej., ligandos de un par de receptores ligandos, como p. ej., VEGF del par de receptores ligandos VEGF/KDR, como transferrina del par de receptores ligandos transferrina/receptor transferrina o citoqu i na/receptor citoquina, como TNFalfa del par de receptores ligandos TN Faifa/receptor TNFalfa.
El término "epitopo" como se usa aquí comprende cualquier determinante de una proteína que puede unirse específicamente a una inmunoglobulina o a un receptor de célula T. Tales determinantes por lo general se componente de disposiciones superficiales de moléculas químicamente activas, como por ejemplo, aminoácidos, hidratos de carbono o una combinación de los mismos que por lo general presentan una estructura tridimensional específica y también determinadas propiedades carga. Dos anticuerpos enlazan con el mismo epitopo cuando en un formato de ensayo de enlace puede verse que el primer anticuerpo compite con el segundo anticuerpo. Tales ensayos de enlace son conocidos por el especialista.
Una "molécula diana" se entiende en el sentido más amplio como una molécula presente en la población de células diana y puede ser una proteína (p. ej., un receptor de un factor de crecimiento) o una molécula no peptídica (p. ej., un azúcar o un fosfolípido). Preferentemente es un receptor o un antígeno.
El término molécula diana "extracelular" describe una molécula diana unida con la célula que se encuentra del lado externo de una célula o a aquella parte de una molécula diana que se encuentra del lado externo de una célula, es decir, un ligante puede unirse en una célula intacta a su molécula diana extracelular. Una molécula diana extracelular puede estar anclada en la membrana celular o puede ser parte componente de la membrana celular. El especialista conoce procedimientos para identificar moléculas diana extracelulares. Para proteínas esto puede concretarse mediante una determinación del/de los dominio(s) transmembranales y la orientación de la proteína en la membrana. Estos datos por lo general está guardados en bases de datos de proteínas (p. ej., SwissProt).
El término "molécula diana de una célula cancerosa" describe una molécula diana que existe en mayor número en uno o más tipos de células cancerosas en comparación con células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Preferentemente la molécula diana de una célula cancerosa existe selectivamente en uno varios tipos de células cancerosas en comparación con células no cancerosas del mismo tipo de tejido, describiendo el término selectivo una concentración al menos doble en células cancerosas en comparación con células no cancerosas del mismo tipo de tejido (una "molécula diana selectiva de una célula cancerosa"). El uso de moléculas diana de células cancerosas permite la terapia selectiva de células cancerosas con los conjugados de acuerdo con la invención.
El ligante puede enlazarse mediante un enlace con el conector. El enlace del ligante puede efectuarse mediante un heteroátomo del ligante. Los heteroátomos de acuerdo con la invención del ligante que pueden usarse para el enlace son azufre (en una forma de realización mediante un grupo sulfhidrilo del ligante), oxígeno (según la invención mediante un grupo carboxilo o hidroxilo del ligante) y nitrógeno (en una forma de realización mediante un grupo amino o amida o primario o secundario del ligante). Estos heteroátomos pueden presentarse en el ligante natural o introducirse mediante procedimientos químicos o de biología molecular. Según la invención el enlace del ligante con el toxóforo solamente tiene escasa influencia sobre la actividad de enlace del ligante con la molécula diana. En una forma de realización preferida el enlace no tiene influencia sobre la actividad de unión del ligante con la molécula diana.
El término "anticuerpo" se entiende de acuerdo con la presente invención en su sentido más amplio y comprende moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo anticuerpos monoclonales intactos o modificados, anticuerpos policlonales o anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos). Una molécula de inmunoglobulina comprende preferentemente una molécula con cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (cadenas H) y dos cadenas ligeras (cadenas L) que típicamente están enlazadas mediante puentes de disulfuro. Cada cadena pesada comprende un dominio variable de la cadena pesada (abreviado VH) y un dominio constante de la cadena pesada. El dominio constante de la cadena pesada puede comprender por ejemplo tres dominios CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende un dominio variable (abreviado VL) y un dominio constante. El dominio constante de la cadena ligera comprende un dominio (abreviado CL). Los dominios VH y VL pueden continuar subdividiéndose en regiones con hipervariabilidad, también denominadas regiones que determinan la complementaridad ("complementarity determining región", abreviado CDR) y regiones con menor variabilidad de secuencia ("framework región", abreviado FR). Cada región VH y VL típicamente se compone de tres CDR y hasta cuatro FR. Por ejemplo del extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Puede obtenerse un anticuerpo de cualquiera de las especies adecuadas para ello, p. ej., conejo, llama, camello, ratón o rata. En una forma de realización el anticuerpo es de origen humano o murino. Un anticuerpo p. ej., puede ser humano, humanizado o quimérico.
El término anticuerpo "monoclonal" denomina un anticuerpo que se obtuvo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales de la población son idénticos salvo en las mutaciones que se producen naturalmente que pueden presentarse en pocos cantidades. Los anticuerpos monoclonales reconocen con gran especificidad un solo punto de unión antígeno. El término anticuerpo monoclonal no se refiere a un determinado procedimiento de preparación.
El término anticuerpo "intacto" se refiere a anticuerpos que comprenden tanto un dominio que enlaza antígeno como también los dominios constantes de la cadena ligera y pesada. El dominio constante puede ser un dominio natural o una variante del mismo, en la que se modificaron una o varias posiciones de aminoácidos.
El término anticuerpo "intacto modificado" se refiere a anticuerpos intactos que se fusionaron con otro polipéptido u otra proteína que no provienen de un anticuerpo, por medio de su extremo amino o extremo carboxi mediante un enlace covalente (p. ej., un enlace peptídico). Además se pueden modificar anticuerpos de manera tal que en puntos definidos se introducen cisternas reactivas para facilitar el acoplamiento a un toxóforo (véase Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26(8):925-32).
El término anticuerpo "humano" denomina los anticuerpos que pueden obtenerse un ser humano o los que son anticuerpos humanos sintéticos. Un anticuerpo humano "sintético" es un anticuerpo que puede obtenerse en partes o como un total a partir de secuencias sintéticas in sílice que se basan en el análisis de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humano puede estar codificado, p. ej., mediante un ácido nucleico que se aisló de una biblioteca de secuencias de anticuerpos que son de origen humano. Un ejemplo de tales anticuerpos se indica en Sóderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856.
El término anticuerpo "humanizado" o "quimérico" describe anticuerpos que se componen de una proporción de secuencia no humana y una humana parte humana. En estos anticuerpos se sustituye una parte de las secuencias de la inmunoglobulina humana (receptor) por partes de secuencias de una inmunoglobulina no humana (donante). El donante en muchos casos es inmunoglobulina murina. En anticuerpos humanizados se reemplazan los aminoácidos de la CDR del receptor por aminoácidos del donante. En ocasiones además se sustituyen aminoácidos del marco por aminoácidos correspondientes del donante. En algunos casos el anticuerpo humanizado contiene aminoácidos que no estaban contenidos en el receptor ni tampoco en el donante y los que fueron incorporados durante la optimización del anticuerpo. En anticuerpos quiméricos se fusionan los dominios variables de la inmunoglobulina del donante con las regiones constantes de un anticuerpo humano.
El término región determinante de la complementaridad (CDR) como se lo utiliza aquí se refiere a aquellos aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo que son necesarios para el enlace con el antígeno. Cada región variable presenta típicamente tres regiones CDR que se denominan CDR1 , CDR2 y CDR3. Cada región CDR puede comprender aminoácidos según la definición de Kabat y/o aminoácidos de un bucle hipervariable según la definición de Chotia. La definición según Kabat por ejemplo comprende la región de la posición aproximada de los aminoácidos 24 - 34 (CDR1), 50 - 56 (CDR2) y 89 - 97 (CDR3) de la cadena ligera variable y 31 - 35 (CDR1), 50 - 65 (CDR2) y 95 - 102 (CDR3) de la cadena pesada variable (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). La definición según Chotia comprende por ejemplo la región de la posición aproximada de los aminoácidos 26 -32 (CDR1), 50 - 52 (CDR2) y 91 96 (CDR3) de la cadena ligera variable y 26 - 32 (CDR1), 53- 55 (CDR2) y 96 - 101 (CDR3) de la cadena pesada variable Chotia y Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). En algunos casos una CDR puede incluir aminoácidos de otra región CDR definida según Kabat y Chotia.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada se pueden dividir los anticuerpos en diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, pudiendo varios de ellos estar subdivididos en otras subclases. (Isotipos), p. ej., lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 y lgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases se denominan [alfa/a], [delta/d], [epsilon/e], [gama/?] y [my/µ]. Se conoce tanto la estructura tridimensional como también la estructura de subunidades de anticuerpos.
El término "fragmento funcional" o "fragmento de anticuerpo que enlaza un antígeno" de un anticuerpo/inmunoglobulina se definió como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (p. ej., los dominios variables de un IgG) que aún comprende los dominios de enlace de antígeno del anticuerpo/inmunoglobulina. El "dominio de enlace con antígeno" de un anticuerpo comprende típicamente una o varias regiones hipervariables de un anticuerpo, p. ej., la región CDR1, CDR2 y/o CDR3. De todos modos también la región del "marco" o de "estructura" de un anticuerpo puede ser de importancia para el enlace del anticuerpo al antígeno. La región del marco conforma la estructura para los CDR. Preferentemente el dominio de enlace de antígeno comprende al menos los aminoácidos 4 a 103 de la cadena ligera variable y los aminoácidos 5 a 109 de la cadena pesada variable, más preferentemente los aminoácidos 3 a 107 de la cadena ligera variable y 4 a 111 de la cadena pesada variable, especialmente preferidas son las cadenas pesadas y ligeras variables completas, es decir los aminoácidos 1 - 109 de VL y 1 a 113 de VH (numeración según el documento WO97/08320).
Los "fragmentos funcionales" o "fragmentos de anticuerpo que enlazan antígeno" de la invención comprenden de manera no concluyente fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diabodies, anticuerpos de dominio simple (DAb), anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena simple (single-chain Fv, abreviado scFv); y anticuerpos multiespecíficos, como p. ej., bi- y tri-específicos, anticuerpos formados por fragmentos de anticuerpo C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Otros anticuerpos que los "multi-específicos" o "multi-funcionales" son aquellos con puntos de enlace idénticos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para distintos epitopos de un antígeno o específicos para epitopos de más de un antígeno (véase p. ej., los documentos W093/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60 69; patentes estadounidenses N° 4.474.893; 4.714.681 ; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; o Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Una molécula F(ab')2 o Fab puede construirse de manera tal que la cantidad de interacciones de disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios Ch1 y CL puede reducirse o impedirse por completo.
"Fragmentos funcionales" o "fragmentos de anticuerpo que enlazan antígeno" pueden fusionarse con otro polipéptido o proteína que no provienen de un anticuerpo por medio de su extremo amino o extremo carboxi por medio de un enlace covalente (p. ej., un enlace peptídico). Además se puede modificar los anticuerpos y los fragmentos que enlazan antígenos de manera tal que en puntos definidos se introducen cisteínas reactivas para facilitar el acoplamiento a un toxóforo (véase Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26(8):925-32).
Los anticuerpos policlonales pueden prepararse mediante procedimientos conocidos por el especialista promedio. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante procedimientos conocidos por el especialista promedio (Kóhler y Milsteina, Nature, 256, 495-497, 1975). Los anticuerpos monoclonales humanos o bien humanizados pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos por el especialista promedio (Olsson et al., meth Enzymol. 92, 3-16 o bien Cabilly et al, documento US 4.816.567 o Boss et al, documentos US 4.816.397).
El especialista común conoce múltiples procedimientos para preparar anticuerpos humanos y sus fragmentos, como por ejemplo mediante ratones transgénicos (N Lonberg y D Huszar, Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93) o tecnologías Phage display (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Los anticuerpos de la invención pueden obtenerse de bibliotecas de anticuerpos recombinantes que por ejemplo existe en las secuencias de aminoácidos de una pluralidad de anticuerpos que se obtuvieron de una gran cantidad de voluntarios sanos. Los anticuerpos también pueden prepararse mediante tecnologías DNS recombinantes conocidas. La secuencia de ácido nucleico de un anticuerpo también puede obtenerse mediante una secuenciación de rutina o adquirirse en bases de datos de acceso público.
En un anticuerpo o ligante "aislado" se eliminaron los demás componentes de la célula. Los componentes contaminantes de una célula que podría interferir con un uso terapéutico o diagnóstico son por ejemplo, enzimas, hormonas u otros componentes peptídicos o no peptídicos de una célula. Se prefiere un anticuerpo o ligante que fue purificado más de 95 % en peso respecto del anticuerpo o bien del ligante (determinado p. ej., mediante el procedimiento Lowry, espectroscopia UV-Vis o mediante electroforesis capilar en gel SDS) que fue purificado al punto tal que pueden determinarse al menos 15 aminoácidos del extremo amino o una secuencia interna de aminoácidos, o que purificado hasta la homogeneidad, determinándose la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones de reducción o sin reducción (la detección puede determinarse mediante tinción con azul Coomassie o preferentemente mediante un teñido plateado). Pero un anticuerpo por lo general se prepara por medio de uno o varios pasos de purificación.
El término "enlace específico" o "enlace específicamente" se refiere a un anticuerpo o ligante que se une a un antígeno /molécula diana predeterminados. El enlace específico de un anticuerpo o ligante típicamente describe un anticuerpo o bien un ligante con una afinidad de al menos 10"7 M, siendo que el anticuerpo o bien el ligante presenta una afinidad al menos dos veces mayor respecto del antígeno /molécula diana predeterminados que respecto de un antígeno /molécula diana no específicos (p. ej., albúmina sérica de ovinos o caseína) que no es el antígeno /molécula diana predeterminados o un antígeno /molécula diana muy similares.
Los anticuerpos que son específicos contra un antígeno de célula cancerosa pueden ser preparados por el especialista promedio mediante procedimientos por él conocidos (como p. ej., expresión recombinante) o pueden adquirirse comercialmente (como p. ej., de Merck KGaA, Alemania). Ejemplos de anticuerpos conocidos en la terapia anti cáncer que pueden adquirirse comercialmente son Erbitux® (Cetuximab, Merck KGaA), Avastin® (Bevacizumab, Roche) y Herceptin® (Trastuzumab, Genentech). Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante del tipo IgGlkappa que enlaza con alta afinidad en un ensayo de base celular (Kd = 5 nM) el dominio extracelular del receptor de crecimiento epidérmico humano. El anticuerpo se prepara de manera recombinante en células CHO.
Objeto preferido de la invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que n representa un número de 1 a 50, AK representa AKi o AK2 donde A^ representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 que está unido al grupo G por medio de un átomo de azufre del ligante, AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 que está unido al grupo G por medio de un átomo de nitrógeno del ligante, G para el caso que AK = AKi representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el átomo de azufre del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L1, o para el caso que AK = AKi representa carbonilo, representa una unión, alcanodiilo (C1-C10) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número de 2 a 6, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L1A representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, B representa un grupo de la fórmula .5 -S' en la que ## 5 marca el punto de unión con el grupo L1A, ## 6 marca el punto de unión con el grupo L1B, L5 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L6 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que ## 7 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, ## 8 marca el punto de unión con L1B, R33 representa hidrógeno, alquilcarbonilo (C1-C4), butiloxicarbonilo o benciloxicarbonilo, R34 representa hidrógeno o metilo, representa hidrógeno o alquilo (CrC4), representa hidrógeno o alquilo (CrC4), R29 y R30 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R31 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R32 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R31 y R32 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, L1B representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, y donde el alcanodiilo (C1-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L , ** marca el punto de unión con L2, P representa O o NH, L3 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L4 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa hidrógeno o metilo, R28 representa hidrógeno, alquilcarbonilo (C1-C4), terc- butiloxicarbonilo o benciloxicarbonilo, Q1 representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, Q2 representa un carbociclo de 3 a 7 miembros o un heterociclo de 4 a 7 miembros, R14 representa hidrógeno o alquilo (CrC4), R15 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R14 y R 5 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R16 representa hidrógeno o alquilo (CrC4), R 7 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R 8 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R19 representa hidrógeno o el grupo lateral de un a-aminoácido natural o sus homólogos o isómeros, R20 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R21 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R22 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un carbociclo de 3 a 7 miembros, R23 representa alquilo (C1-C4), R24 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R27 representa hidrógeno o alquilo (C C4), R36 representa hidrógeno, alquilcarbonilo (C1-C4), terc.-butiloxicarbonilo o benciloxi carbonilo, R37 representa hidrógeno o metilo, o R36 y R37 forman junto con los átomos a los que están unidos, un anillo pirrolidino, representa alcanodiilo (C2-C10) lineal o un grupo de la fórmula ##\ /\ donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno o metilo, R2 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, ferc.-butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1/-/-imidazol-4-ilmetilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R representa hidrógeno o metilo, R representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, terc.-butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1/-/-imidazol-4-ilmetilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)- NH-NH-R10 o -Chb-O-R 11 en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R 0 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(O)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno o hidroxi, T2 representa fenilo, bencilo, 1 - -indol-3-ilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Objeto preferido de la invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que representa un número de 1 a 20, representa AK: o AK2 donde AKi representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, para el caso que AK = AK1 representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L1, o para el caso que AK = AK! representa carbonilo, representa una unión, alcanodiilo (C2-C6) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número de 2 a 6, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L1A representa alcanodiilo (C2-C6) lineal, B1 representa un grupo de la fórmula en la que mmaarca el punto de unión con el grupo L i 1 B ## marca el punto de unión con el grupo L L5 representa una unión, L6 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que ## 7 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, ## 8 marca el punto de unión con L1 B, R33 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc- butiloxicarbonilo, R34 representa hidrógeno o metilo, R29 representa hidrógeno, R30 representa hidrógeno, R31 representa hidrógeno o metilo, R32 representa hidrógeno o metilo, 1 B representa alcanodiilo (C2-C6) lineal, y donde el alcanodiilo (C2-C6) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etan-1 ,2-diilo, L4 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa hidrógeno o metilo, R28 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc-butiloxicarbonilo, representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, R14 representa hidrógeno, R15 representa hidrógeno, R16 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo piperazinilo, R18 representa hidrógeno, R 9 representa hidrógeno, metilo, propan-2-ilo, 2-metilpropan-1-ilo o 1- metilpropan-1-ilo, R20 representa hidrógeno o metilo, o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R21 representa hidrógeno o metilo, R22 representa hidrógeno o metilo, o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo ciclopropilo, R23 representa metilo, R24 representa hidrógeno o metilo, R27 representa hidrógeno, R36 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc-butiloxicarbonilo, R37 representa hidrógeno o metilo, o R36 y R37 forman junto con los átomos a los que están unidos, un anillo pirrolidino, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, representa un grupo de la fórmula donde # #33 i marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, rreepprreesseennttaa 11--hhidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo indol-3-ilmetilo, o R )1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno, R4 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, T1 representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)- NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, terc.-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(O)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno o hidroxi, T2 representa fenilo, bencilo, 1H-indol-3-ilo o 1H-indol-3-ilmet¡lo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Objeto preferido de la invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que n representa un número de 1 a 10, representa AKi o AK2 donde AKi representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, para el caso que AK = AKi representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L1, o para el caso que AK = AKi representa carbonilo, representa una unión, alcanodiilo (C2-C6) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, donde el alcanodiilo (C2-C6) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etan-1 ,2-diilo, L4 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa metilo, R28 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc-butiloxicarbonilo, Q1 representa piperidin-1 ,4-diilo, R16 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo piperazinilo, R21 representa hidrógeno o metilo, R22 representa hidrógeno o metilo, o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo ciclopropilo, R23 representa metilo, R24 representa hidrógeno, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno, R4 representa bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en ia que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1 , T1 representa un grupo de la fórmula -C(=O)-OR7, -C(=O)-NR8R9 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, R5 representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHCH2fenilo, R 2 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(O)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Objeto preferido de la invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que n representa un número de 1 a 10, AK representa AK2 donde AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, G representa carbonilo, L1 representa una unión, B representa una unión, L2 representa un alcanodiilo (C3-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, D representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R3 representa hidrógeno, R4 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1 , T representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7 o -C(=0)-NR8R9, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, ferc.-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno, R9 representa hidrógeno o bencilo, R35 representa metilo, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Objeto preferido de la invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que n representa un número de 1 a 10, AK representa AKi donde AKi representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, G representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo l_\ representa una unión, alcanodiilo (C3-C5) lineal o un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, donde el alcanodiilo (C3-C5) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etan-1 ,2-diilo, L4 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa metilo, R28 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc-butiloxicarbonilo, representa hidrógeno o metilo, representa hidrógeno o metilo, o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo piperazinilo, representa alcanodiilo (C3-C5) lineal o un grupo de la fórmula donde representa un número 2 o 3, marca el punto de unión con el grupo B, ## marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, representa un grupo de la fórmula donde # marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R3 representa hidrógeno, R4 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, marca el punto de unión con el grupo T1, T1 representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7 o -C(=0)-NR8R9, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno, R9 representa hidrógeno o bencilo, R 35 representa metilo, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Otro objeto preferido de la presente invención es un conjugado principio activo-ligante tal como se ha descrito precedentemente, donde el ligante comprende la secuencia de aminoácidos de las cadenas variables pesadas y variables ligeras del anticuerpo M048-D01-hlgG1-b, reproducido en la SEC ID N° 14 (VI) y SEC ID N° 13 (Vh), la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1-b reproducido en la SEC ID N° 9 (cadena ligera) y SEC ID N° 10 (cadena pesada).
Otro objeto de la presente invención son compuestos de la fórmula (XXXa) (XXXa), en la que Cis representa un resto cisteína que está unido por medio del átomo de azufre de la cadena lateral a un átomo de carbono de la succinimida, L1 representa una unión, alcanodiilo (C^C-io) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número de 2 a 6, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L1A representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, B1 representa un grupo de la fórmula en la que ## 5 marca el punto de unión con el grupo L1A, ## 6 marca el punto de unión con el grupo L1B, L5 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L6 representa una unión, R29 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R30 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R29 y R30 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R31 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R32 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R31 y R: 32 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, L1B representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, y donde el alcanodiilo (C1-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, P representa O o NH, L3 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L4 representa una unión, Q1 representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, Q2 representa un carbociclo de 3 a 7 miembros o un heterociclo de 4 a 7 miembros, R14 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R15 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R14 y R15 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R16 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R17 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R18 representa hidrógeno o alquilo (d-C4).
R19 representa hidrógeno o el grupo lateral de un a-aminoácido natural o sus homólogos o isómeros, R20 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R21 representa hidrógeno o alquilo (C,-C4), R22 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un carbociclo de 3 a 7 miembros, R representa alquilo (Ci-C4), R24 representa hidrógeno o alquilo (d-C4), R27 representa hidrógeno o alquilo (Ci-C4), representa alcanodiilo (C2-Ci0) lineal o un grupo de V donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R representa hidrógeno o metilo, R2 representa isopropilo, isobutilo, sec. -butilo, íerc.-butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1H-imidazol-4-ilmetilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, R1 y R: junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-O contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, representa hidrógeno o metilo, representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, terc.-butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1 -/-¡midazol-4-ilmetilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1 , representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R 0 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(0)20H, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno o hidroxi, T2 representa fenilo, bencilo, 1H-indol-3-ilo o 1H-indol-3-ilmetilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención además también son preferidos los compuestos de la fórmula (XXXa) en la que Cis representa un resto cisteína que está unido por medio del átomo de azufre de la cadena lateral a un átomo de carbono de la succinimida, L1 representa una unión, alcanodiilo (C2-C6) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L1A representa alcanodiilo (C2-C6) lineal, B1 representa un grupo de la fórmula en la que ## 5 marca el punto de unión con el grupo L ## 6 marca el punto de unión con el grupo L L5 representa una unión, L6 representa una unión, R29 representa hidrógeno, R30 representa hidrógeno, R31 representa hidrógeno o metilo, R32 representa hidrógeno o metilo, L1 B representa alcanodiilo (C2-C6) lineal, y donde el alcanodiilo (C2-C6) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etan-1 ,2-diilo, L4 representa una unión, R14 representa hidrógeno, R15 representa hidrógeno, R16 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo piperazinilo, R23 representa metilo, R24 representa hidrógeno o metilo, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, illo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, epresenta hidrógeno, epresenta 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 H- ndol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 " representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHCH2fenilo, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(0)20H, R 13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo R representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención además también son especialmente preferidos los compuestos de la fórmula (XXXa) en la que Cis representa un resto cisteína que está unido por medio del átomo de azufre de la cadena lateral a un átomo de carbono de la succinimida L1 representa una unión o alcanodiilo (C2-C6) lineal, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión, L4 representa una unión, R16 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, D representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa bencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R3 representa hidrógeno, R4 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-c¡clopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, T1 representa un grupo de la fórmula -C(=O)-OR7 o -C(=O)-NR8R9, en la que R7 representa hidrógeno, R8 representa hidrógeno, R9 representa hidrógeno, R35 representa metilo, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Otro objeto de la presente invención son compuestos de la fórmula (XXXI) (XXXI), en la que representa una unión, alcanodiilo (C1-C10) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número de 2 a 6, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L1A representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, B1 representa un grupo de la fórmula en la que ## 5 marca el punto de unión con el grupo L1A, ## 6 marca el punto de unión con el grupo L1B, L5 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L6 representa una unión, R29 representa hidrógeno o alquilo (d-C*), R30 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R29 y R30 junto con los átomos a los que están unidos, forman heterociclo de 5 o 6 miembros, R31 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R32 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R3 y R32 junto con los átomos a los que están unidos, forman heterociclo de 5 o 6 miembros, L1B representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, donde el alcanodiilo (C1-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, P representa O o NH, Q1 representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, Q2 representa un carbociclo de 3 a 7 miembros o un heterociclo de 4 a 7 miembros, R18 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R19 representa hidrógeno o el grupo lateral de un a-aminoácido natural o sus homólogos o isómeros, R20 representa hidrógeno o alquilo (d-O , o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R 21 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R 22 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o junto con los átomos a los que están unidos, forman carbociclo de 3 a 7 miembros, R representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), representa alcanodiilo (C2-C10) lineal o un grupo de donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R representa hidrógeno o metilo, representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere. -butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1H-imidazol-4-ilmetilo o 1 H- ¡ndol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-dülo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, RJ representa hidrógeno o metilo, R4 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere-butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1/--¡midazol-4-ilmetilo o 1 indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, p-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(0)20H, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno o hidroxi, T2 representa fenilo, bencilo, 1/-/-indol-3-ilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (XXXI) en la que L1 representa una unión, alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, donde el alcanodiilo (C2-C6) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, R18 representa hidrógeno, R19 representa metilo, propan-2-ilo, 2-metilpropan-1-ilo o 1-metilpropan-1- ilo, R20 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R21 representa hidrógeno o metilo, R22 representa hidrógeno o metilo, o R2 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo ciclopropilo, R27 representa hidrógeno o metilo, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno, R4 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo ¡ndol-3-ilmetilo, R y R junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, T1 representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)- NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, /i-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, R5 representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHCh^fenilo, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(0)20H, R 3 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son especialmente preferidos los compuestos de la fórmula (XXXI) en la que L1 representa una unión, B representa una unión, L2 representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula ##\ ^~-L ^\ donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1H-indol-3-ilmetilo, o R y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno, R4 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T , T1 representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7 o -C(=0)-NR8R9, en la que R7 representa hidrógeno, R8 representa hidrógeno, R9 representa hidrógeno, R35 representa metilo, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también se prefieren los compuestos de la fórmula (la) en la que representa ??? donde AKi representa un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que enlaza un antígeno que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L1, y n, L1, B, L2, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también se prefieren los compuestos de la fórmula (la) en la que AK representa AK2 donde AK2 representa un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que enlaza un antígeno que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, G representa carbonilo, y n, L1, B, L2, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también se prefieren los compuestos de la fórmula (la) en la que AK representa AK1 donde AKi representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L1, y n, L1, B, L2, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también se prefieren los compuestos de la fórmula (la) en la que AK representa AK2 donde AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, G representa carbonilo, y n, L1, B, L2, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos compuestos de la fórmula general (la) en la que AK representa AK2 donde AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, G representa carbonilo, L representa una unión, B representa una unión, L2 representa un alcanodiiio (C3-C6) lineal o un grupo de la fórmula ##*· ##4 o P donde P representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, n, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos compuestos de la fórmula general (la) en la que AK representa AK1 donde AKi representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L1, L representa una unión, alcanodiiio (C3-C5) lineal o un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, donde el alcanodiilo (C3-C5) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, representa una unión o etan-1 ,2-diilo, representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa metilo, R28 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc-butiloxicarbonilo, R16 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo piperazinilo, representa alcanodiilo (C3-C5) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, y n, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (la), (XXXa) y (XXXI) en la que L1 representa una unión, B representa una unión, L2 representa un alcanodiilo (C3-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, y n, AK, Cis, G, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (la) en la que L1 representa alcanodiilo (C C10) lineal o un grupo de la fórmula 1 2 O ^lm donde m representa un número de 2 ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ## marca el punto de unión con el grupo B, donde alcanodiilo (C1-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L4 representa un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa hidrógeno o metilo, R28 representa hidrógeno, alquilcarbonilo (C1-C4), terc- butiloxicarbonilo o benciloxicarbonilo, Q1 representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, R16 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R17 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R23 representa alquilo (Ci-C4), R24 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R36 representa hidrógeno, alquilcarbonilo (C1-C4), terc.-butiloxicarbonilo o benciloxi carbonilo, R37 representa hidrógeno o metilo, o R36 y R37 forman junto con los átomos a los que están unidos, un anillo pirrolidino, L2 representa alcanodiilo (C2-C10) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C 0) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, y n, AK, G, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (la) en la que L1 representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con l_\ ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etan-1 ,2-diilo, L4 representa un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa hidrógeno o metilo, R28 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc-butiloxicarbonilo, R10 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo piperazinilo, R36 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc-butiloxicarbonilo, R37 representa hidrógeno o metilo, o R y R forman junto con los átomos a los que están unidos, un anillo pirrolidino, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno y n, AK, G, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también se prefieren los compuestos de la fórmula (la) y (XXXa) en la que G representa un grupo de la fórmula donde # marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, marca el punto de unión con el grupo L1, L representa alcanodiilo (C3-C5) lineal o un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, donde el alcanodiilo (C3-C5) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1 , ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etan-1 ,2-diilo, L4 representa una unión, representa alcanodiilo (C3-C5) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, n, AKL Cis, D, R16 y R17 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (la), (XXXa) y (XXXI) en la que D representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno o metilo, R2 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere. -butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1 - -imidazol-4-ilmetilo o 1 H- indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-c¡clopropan-1 ,1-dülo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R representa hidrógeno o metilo, epresenta isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, íerc.-butilo, fenilo, bencilo, 1- idroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- minobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1 -/-imidazol-4-ilmetilo o 1H- ndol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)- NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, terc.-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R 2 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula -S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno, T2 representa fenilo, bencilo, 1 -/-indol-3-ilo o 1H-indol-3-ilmetilo, y n, AK, Cis, G, L1, B, L2, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (la), (XXXa) y (XXXI) en la que D representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno o metilo, R2 representa isopropilo, isobutilo, sec. -butilo, ferc.-butilo, fenilo, bencilo, 1- hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3- aminobencilo, 1-fen¡letilo, difenilmetilo, 1 -/-imidazol-4-ilmetilo o 1H- indol-3-ilmetilo, R 1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-c¡clopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, n, AK, Cis, G, L1, B, L2 y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (la), (XXXa) y (XXXI) en la que representa un grupo de la fórmula el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R representa hidrógeno, R2 representa bencilo, 4-hídroxibencilo, 1-feniletilo o 1H-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropan-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, eventualmente sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, y n, AK, Cis, G, L1, B, L2 y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (la), (XXXa) y (XXXI) en la que R35 representa hidroxi, y n, AK, Cis, G, L1, B, L2, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
En el marco de la presente invención también son preferidos los compuestos de la fórmula (la), (XXXa) y (XXXI) en la que R35 representa metilo, y n, AK, Cis, G, L1, B, L2, D y R35 presentan los significados antes indicados, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Un objeto preferido de la presente invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que D puede presentar las siguientes estructuras y * representa el punto de unión con el átomo de nitrógeno: así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Un objeto preferido de la presente invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que D presenta una estructura que se revelado por medio de uno de los intermedios de la presente invención; y la unidad conectora §-G-L1-B-L2-§§ así como todas las demás variables se han definido de acuerdo con la presente invención; y sus sales, solvatos y solvatos de las sales. AK preferentemente es un anticuerpo anti-FGFR2 o fragmento del mismo que enlaza un antígeno.
Un objeto preferido de la presente invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que la unidad conector-principio activo presenta una estructura que se ha revelado por medio de uno de los intermedios o ejemplos de la presente invención; y sus sales, solvatos y solvatos de las sales. AK preferentemente es un anticuerpo anti-FGFR2 o un fragmento del mismo que enlaza un antígeno.
Un objeto preferido de la presente invención son conjugados de principio activo-ligante de la fórmula general (la) en la que la unidad conector-principio activo presenta una estructura que se ha revelado por medio de uno de los ejemplos de la presente invención; y sus sales, solvatos y solvatos de las sales. AK preferentemente es un anticuerpo anti-FGFR2 o un fragmento del mismo que enlaza un antígeno.
Objeto especialmente preferido de la presente invención son conjugados principio activo-ligante de la fórmula general (la) (la), en la que n representa un número de 1 a 50, AK representa un ligante que se enlaza con el FGFR2, el grupo §-G-L1-B-§§ representa un conector, donde § marca el punto de unión con el grupo AK y §§ marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, L2 representa alcanodiilo (C2-C10) lineal o un grupo de la fórmula donde P representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, D representa un grupo de la siguiente fórmula donde * representa el punto de unión con el átomo de nitrógeno así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Objeto especialmente preferido de la presente invención son compuestos de la siguiente fórmula donde AK representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y n representa un número de 1 a 10, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. Se prefiere cuando el ligante está unido por un grupo lateral NH de un resto lisina a la unidad conector-toxóforo.
Objeto especialmente preferido de la presente invención son compuestos de la siguiente fórmula donde AK representa un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que se enlaza con el FGFR2 y n representa un número de 1 a 10, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. Se prefiere cuando el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está unido por un grupo lateral NH de un resto lisina a la unidad conector-toxóforo. Objeto especialmente preferido de la presente invención es el compuesto de la siguiente fórmula donde AK2A representa M048-D01-hlgG1 y n representa un número de 1 a 10, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Otro objeto especialmente preferido de la presente invención es el compuesto de la siguiente fórmula donde AK2B representa M048-D01-hlgG1-b y n representa un número de 1 a 10, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales.
Las definiciones de restos indicadas en forma individual en las respectivas combinaciones o bien en las combinaciones preferidas de restos también se sustituyen independientemente de las combinaciones de restos indicadas en cada caso, por definiciones de restos de otras combinaciones.
Muy especialmente preferidas son las combinaciones de dos o más de las áreas preferidas antes mencionadas.
Otro objeto de la invención es un procedimiento para la preparación de los compuestos de acuerdo con la invención de la fórmula (la), caracterizado porque se mezcla una solución del ligante en tampón PBS [A] con un agente de reducción adecuado, como por ejemplo ditiotreitol o clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, y a continuación se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula (lia) (lia) en la que D, L1, L2 y R35 presentan respectivamente los significados antes indicados, dando un compuesto de la fórmula (l-A) (I-A) en la que n, AKi , D, L1, B, L2 y R35 presentan respectivamente los significados antes indicados, o [B] se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula (Illa) (Illa) en la que D, L1, B, L2 y R35 presentan respectivamente los significados antes indicados, dando un compuesto de la fórmula (la-B) (la-B) en la que n, AK2, D, L1, B, L2 y R35 presentan respectivamente los significados antes indicados.
Acoplamiento de cisteína: La reducción parcial del anticuerpo así como el posterior conjugado del anticuerpo reducido (parcialmente) con un compuesto de la fórmula (II) o bien (Ha) se realiza según los métodos conocidos por el especialista, véase p. ej., Ducry et al., Bioconj. Chem. 2010, 21 , 5 y referencias allí mencionadas, Klussman et al., Bioconj. Chem. 2004, 15(4), 765-773. Preferentemente se efectúa la reducción suave del anticuerpo mediante la adición de 2-6 equivalentes TCEP al anticuerpo que se encuentra en una solución tampón adecuada, preferentemente tampón de fosfato, y la agitación durante 30-180 minutos a temperaturas entre 15 y 40 °C, preferentemente a TA. A continuación se realiza el conjugado mediante la adición de una solución de un compuesto de la fórmula (II) o bien (Na) en DMSO, acetonitrilo o DMF a la solución del anticuerpo reducido (parcialmente) en tampón PBS, y posterior transformación a una temperatura de 0 °C a +40 °C, especialmente de +10 °C a +30 °C, durante un período de 30 min a 6 horas, especialmente de 1 a 2 horas.
Acoplamiento de lisina: En primer lugar se preparan los compuestos de la fórmula (III) o bien (Na) o componentes carboxilo activados similares mediante procedimientos clásicos de la síntesis de péptidos. Estos luego se agregan a solventes inertes como p. ej., DMSO o DMF y se adicionan al anticuerpo disponible preferentemente en tampón de fosfato con un valor de pH neutral. La solución se agita 1-16 h a una temperatura entre 15 y 40 °C, preferentemente a TA.
Los procedimientos de preparación antes descritos se explican a modo de ejemplo mediante los esquemas siguientes (Esquema 1 y 2): Esquema 1 [a): 1. AK, TCEP, tampón PBS, a TA; 2. Adición del derivado de maleinimida DMSO, a TA].
Esquema 2 [a): AK, tampón PBS, mezclar a TA con derivado de carboxilo derivado del componente principio activo-conector].
Los compuestos de la fórmula (II) en la que L1 y B representan un enlace, pueden prepararse mediante una aminación reductiva de un compuesto de la fórmula (IV) en la que L2A presenta el significado antes definido de L2, pero está acortado en un átomo de carbono en la longitud de la cadena alquilo, PG1 representa un grupo de protección amino como por ejemplo (9/- -fluoren-9-ilmetoxi)carbonilo, terc-butoxicarbonilo o benciloxicarbonilo, en un compuesto de la fórmula (VI) de este compuesto según procedimientos conocidos por el especialista es escinde el grupo de protección PG1, y el compuesto desprotegido se transforma en un disolvente inerte en presencia de una base adecuada con metil-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-carboxilato en un compuesto de la fórmula (ll-A) en la que D y L2 presentan respectivamente los significados antes indicados.
Los compuestos de la fórmula (II) en la que B representa un grupo de la fórmula (B1) en la que *, **, R14 y R15 presentan respectivamente los significados antes indicados, pueden prepararse al escindir de un compuesto de la fórmula (VI) según procedimientos conocidos por el especialista el grupo de protección PG1 y el compuesto desprotegido se hace reaccionar en un disolvente inerte en presencia de una base adecuada con un compuesto de la fórmula (VII) en la que L1 tiene el significado antes indicado, en un compuesto de la fórmula (ll-B) (ll-B), en la que D, L1 y L2 presentan respectivamente los significados antes indicados. Los compuestos de la fórmula (II) en la que B representa un grupo de la fórmula (B2) en la que *, **, L3, R16 y R 7 presentan respectivamente los significados antes indicados, pueden prepararse mediante la aminación reductiva de un compuesto de la fórmula (IV) en un disolvente inerte con un compuesto de la fórmula (VIII) en la que L2A presenta el significado antes definido de L2 pero está acortado en un átomo de carbono en la longitud de la cadena alquilo, en un compuesto de la fórmula (IX) en la que D y L2 tienen los significados antes indicados, y transformar este compuesto en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con un compuesto de la fórmula (X) en la que L y L3 presentan respectivamente los significados antes indicados, en un compuesto de la fórmula (ll-C) C), en la que D, L1 , L2 y L3 presentan respectivamente los significados antes indicados. Un compuesto de la fórmula (II) en la que B representa un grupo de la fórmula (B3) en la que *, **, L3, R16 y R 7 presentan respectivamente los significados antes indicados y L4A representa un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa hidrógeno o metilo, pueden prepararse al transformar un compuesto de la fórmula (IX) en un disolvente inerte en presencia de una base adecuada y un reactivo de acoplamiento adecuado con un compuesto de la fórmula (Xl-A) o (Xl-B) en las que R25 y PG1 tienen respectivamente los significados antes indicados y PG2 representa un grupo de protección carboxilo adecuado, especialmente bencilo, en un compuesto (Xll-A) o bien (Xll-B) (Xll-B), en los que D, PG1, PG2 y L2 tienen los significados antes indicados, de estos a continuación se escinde según procedimientos conocidos por el especialista el grupo de protección PG2 y se hace reaccionar el compuesto desprotegido en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con un compuesto de la fórmula (X) y de este finalmente se escinde según procedimientos conocidos por el especialista el grupo de protección PG1 en un compuesto de la fórmula (ll-D-A) o bien (ll-D-B) (ll-D-B), en los que D, L1, L2 y L3 tienen los significados antes indicados.
Un compuesto de la fórmula (II) en la que B representa un grupo de la fórmula (B4) en la que *, ** presentan respectivamente los significados antes indicados y Q1A represente un heterociclo de 4 a 7 miembros con enlace de N, pueden prepararse, al transformar un compuesto de la fórmula (IX) en un disolvente inerte en presencia de una base adecuada y un reactivo de acoplamiento adecuado con un compuesto de la fórmula (XXI) en la que PG1 y Q A presentan respectivamente los significados antes indicados, en un compuesto de la fórmula (XXII) (XXII), en la que PG1, Q1A, D y L2 tienen los significados antes indicados, de estos se escinde según procedimientos conocidos por el especialista el grupo de protección PG1 y el compuesto desprotegido a continuación se hace reaccionar en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con un compuesto de la fórmula (XXIII) (XXIII), en la que L tiene el significado antes indicado, en un compuesto de la fórmula (ll-D) (ll-D), 1 . , i 2 en la que Q1A, D, L ' y L¿ tienen los significados antes indicados.
Los compuestos de la fórmula (III) en la que L1 y B representa un enlace, pueden prepararse, al transformar un compuesto de la fórmula (IX) en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con N-hidroxisuccinimida en un compuesto de la fórmula (Ill-A) en la que D y L2 presentan respectivamente los significados antes indicados.
Los compuestos de la fórmula (III) en la que L1 representa un enlace y B representa un grupo de la fórmula (B5*) en la que *, ** y P presentan respectivamente los significados antes indicados y representa un carbociclo de 3 a 7 miembros, pueden prepararse, al transformar un compuesto de la fórmula (IX) en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con un compuesto de la fórmula (XIII) en la que P, Q2A y PG2 presentan respectivamente los significados antes indicados, en un compuesto de la fórmula (XIV) en la que D, P, Q2A, L2 y PG2 presentan respectivamente los significados antes indicados, de estos según procedimientos conocidos por el especialista se escinde el grupo de protección PG2 y el compuesto desprotegido a continuación se hace reaccionar en un disolvente inerte en presencia de una base adecuada con N-hidroxisuccinimida en un compuesto de la fórmula (lll-B) (Ml-B), en la que D, P, Q2A y L2 presentan respectivamente los significados antes indicados. Los compuestos de la fórmula (III) en la que L1 representa un enlace y B representa un grupo de la fórmula (B6) en la que *, **, R18, R19 y R20 presentan respectivamente los significados antes indicados, pueden prepararse, al transformar un compuesto de la fórmula (IX) en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con un compuesto de la fórmula (XV) en la que R18, R19, R20 y PG2 presentan respectivamente los significados antes indicados, en un compuesto de la fórmula (XVI) en la que D, R18, R 9, R20, L2 y PG2 presentan respectivamente los significados antes indicados, de estos se escinde según procedimientos conocidos por el especialista el grupo de protección PG2 y se hace reaccionar el compuesto desprotegido a continuación en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con N-hidroxisuccinimida para dar un compuesto de la fórmula (lll-C) (lll-C), en la que D, R 8, R19, R20 y L2 presentan respectivamente los significados antes indicados.
Los compuestos de la fórmula (III) en la que L1 representa un enlace y B representa un grupo de la fórmula (B7) en la que *, **, R y R presentan respectivamente los significados antes indicados, pueden prepararse, al escindir de un compuesto de la fórmula (VI) según procedimientos conocidos por el especialista el grupo de protección PG1 y transformando el compuesto desprotegido resultante en un disolvente inerte en presencia de una base adecuada con un compuesto de la fórmula (XVII) a que R y R presentan respect iivvaammeennttee llooss ssiiggnniilficados antes indicados, in compuesto de la fórmula (lll-D) indicados.
Los compuestos de la fórmula (III) en la que B representa un grupo de la fórmula (B8) en la que *, **, R y R presentan respectivamente los significados antes indicados, pueden prepararse, al transformar un compuesto de la fórmula (IX) en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con un compuesto de la fórmula (XVIII) en la que R23, R24 y PG1 presentan respectivamente los significados antes indicados, en un compuesto de la fórmula (XIX) indicados, de estos se escinde según procedimientos conocidos por el especialista el grupo de protección PG1 y se hace reaccionar el compuesto desprotegido a continuación en un disolvente inerte en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado y una base adecuada con un compuesto de la fórmula (XX) en la que L A representa alcanodiilo (C1-C10) lineal o representa un grupo de la fórmula en la que m representa un número de 2 a 6, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, pudiendo el alcanodiilo (C1-C10) estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes metilo, y pudiendo dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo formar un puente en una relación de 1 ,2, 1 ,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos conformando un anillo cicloalquilo (03-?ß) o un anillo fenilo, en un compuesto de la fórmula (lll-E) (lll-E), en la que D, R23, R24, L1A y L2 presentan respectivamente los significados antes indicados.
Los compuestos de la fórmula (III) en la que B representa un grupo de la fórmula en la que * y ** presentan respectivamente los significados antes indicados y Q2B representa un heterociclo de 4-7 miembros enlazado con N, pueden prepararse, al transformar un compuesto de la fórmula (IX) en un disolvente inerte en presencia de una base adecuada y un reactivo de acoplamiento adecuado con un compuesto de la fórmula (XXIV) en la que PG1 y Q2B presentan respectivamente los significados antes indicados, en un compuesto de la fórmula (XXV) (XXV), en la que PG1, Q2B, D y L2 tienen los significados antes indicados, de estos se escinde según procedimientos conocidos por el especialista el grupo de protección PG1, y el compuesto desprotegido a continuación se hace reaccionar en un disolvente inerte en presencia de una base adecuada con un compuesto de la fórmula (XX) para dar un compuesto de la fórmula (lll-F) (lll-F), en la que Q2B, D, L1A y L2 tienen los significados antes indicados.
Las transformaciones (IV) + (V)? (VI) y (IV) + (VIII)? (IX) se realizan en los disolventes usuales para una aminación reductiva que son inertes en las condiciones de reacción, dado el caso en presencia de un ácido y/o un agente deshidratante como catalizador. Forman parte de tales disolventes por ejemplo alcoholes como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol o ferc-butanol, éteres como tetra-hidrofurano, 1 ,4-dioxano, 1 ,2-dimetoxietano o bis-(2-metoxietil)-éter, u otros disolventes como diclorometano, 1 ,2-dicloroetano, W,W-dimetilformamida o también agua. También es posible usar mezclas de estos disolventes. Preferentemente se usa como disolvente una mezcla de 1 ,4-dioxano/agua mediante adición de ácido acético o ácido clorhídrico diluido como catalizador.
Como agentes de reducción son adecuados para esta reacción especialmente borohidruros complejos, como por ejemplo borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, acetoxiborohidruro de sodio, borohidruro de sodio de tetra-n-butilamonio o complejo de borano-piridina. Preferentemente se utiliza cianoborohidruro de sodio o complejo de borano-piridina.
Las transformaciones (IV) + (V)? (VI) y (IV) + (VIII)? (IX) se realizan por lo general en un intervalo de temperatura de 0 °C a +120 °C, preferentemente a una temperatura de +50 °C a +100 °C. Las reacciones pueden llevarse a cabo a presión normal, a presión elevada o a presión reducida (p. ej., de 0,5 a 5 bar); por lo general se opera a presión normal.
Las reacciones de acoplamientos (IX) + (X)? (ll-C), (Xll-A) o bien (Xll-B) + (X)? (II-D-A) o bien (ll-D-B), (IX) + (XIII)? (XIV), (IX) + (XV)? (XVI) y (XXII) + (XXIII)? (ll-D) (formación de amida desde el respectivo componente de amina y ácido carboxílico) antes descritas se realizan según los métodos usuales en general de la síntesis de péptido [véase p. ej., M. Bodanszky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín, 1993; M. Bodanszky y A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín, 1984; H.-D. Jakubke y H. Jeschkeit, Aminosáuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie, Weinheim, 1982].
Disolventes inertes para estas reacciones de acoplamiento son por ejemplo éteres como dietiléter, diisopropiléter, ferc-butilmetiléter, tetrahidrofurano, 1 ,4-dioxano, 1 ,2-dimetoxietano o bis-(2-metoxietil)-éter, hidrocarburos como benceno, tolueno, xileno, pentano, hexano, heptano, ciclohexano o fracciones de petróleo, hidrocarburos halogenados como diclorometano, triclorometano, tetraclorometano, 1,2-dicloroetano, tricloroetilen o clorobenceno, o disolventes dipolares-apróticos como acetona, metil-etilcetona, acetonitrilo, etilacetato, piridina, dimetilsulfóxido (DMSO), ?/,/V-dimetilform-amida (DMF), W,A/-dimetilacetamida (DMA), ?/,?/'-dimetilpropilenurea (DMPU) o N-metilpirrolidinona (NMP). También es posible usar mezclas de tales disolventes. Preferentemente se utiliza /S/,A/-dimetilformamida.
Como agentes de activación/de condensación para estos acoplamientos son adecuados por ejemplo carbodiimidas como ?/,?/'-dietil-, ?/,?/'-dipropil-, ?/,?/'-diisopro-pil-, ?/,?/'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o clorhidrato de A/-(3-dimetilaminoisopropil)-?/'-etilcarbodiimida (EDC), derivados de fosgeno como ?/,?/'-carbonildiimidazol (CDI) o isobutilcloroformiato, compuestos de 1 ,2-oxazolio como 2-etil-5-fenil-1 ,2-oxazolio-3-sulfat o 2-ferc-butil-5-metilisoxazolio-perclorato, compuestos de acilamino como 2- etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, compuestos de fósforo como anhídriro de ácido propanofosfónico, dietiléster del ácido cianofosfónico, cloruro de bis-(2-oxo-3-oxazolidinil)-fosforilo, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfo-nio o hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(pirrolidino)fosfonio (PyBOP), o compuestos de uranio como tetrafluoroborato de 0-(Benzotriazol-1-il)-W,/V,A/' /\/'-tetra-metiluronio (TBTU), hexafluorofosfato de 0-(Benzotriazol-1-il)-N,A/,/V',W-tetrametiluro-nio (HBTU), tetrafluoroborato de 2-(2-Oxo-1-(2H)-piridil)-1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio (TPTU), hexafluorofosfato de 0-(7-Azabenzotriazol-1-il)-/v')W,W'A/'-tetramet¡luronio (HATU) o tetrafluoroborato de 0-(1/-/-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1 ,3,3-tetrametiluronio (TCTU), dado el caso en combinación con otros adyuvantes como 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt) o /V-hidroxisuccinimida (HOSu), como también como bases carbonates alcalinos, p. ej., carbonato de sodio o potasio, o bases de amina terciarias como trietilamina, /V-metilmorfolina, /V-metilpiperidina, ?,/V-diisopropiletil-amina, piridina o 4-A/,A/-dimetilaminopiridina.
En el marco de la presente invención se utiliza como agente de activación / condensación para tales reacciones de acoplamiento preferentemente clorhidrato de /S/-(3-dimetilaminoisopropil)-/\/'-etilcarbodiimida (EDC) en combinación con 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt) y A/,A/-diisopropilet¡lamina, o hexafluorofosfato de 0-(7-aza-benzotriazol-l-i -A/^/V./V^A/'-tetrametiluronio (HATU) también en combinación con W,W-diisopropiletilamina.
Las reacciones de acoplamiento (IX) + (X)? (ll-C), (XI l-A) o bien (Xll-B) + (X)? (II-D-A) o bien (ll-D-B), (IX) + (XIII)? (XIV), (IX) + (XV)? (XVI) y (XXII) + (XXIII)? (ll-D) por lo general se llevan a cabo en un intervalo de temperatura de -20 °C a +60 °C, preferentemente de 0 °C a +40 °C. Las transformaciones pueden llevarse a cabo a presión normal, a presión elevada o a presión reducida (p. ej., de 0,5 a 5 bar); por lo general se opera a presión normal.
Las formaciones de ésteres (IX) + (XVIII)? (XII) y (IX) + (Xl-A) o bien (Xl-B)? (XII-A) o bien (Xll-B), (IX) + (XXIV)? (XXV) así como (IX) + (XXI)? (XXII) se realizan en analogía con las antes descritas reacciones de acoplamiento de amidas. Preferentemente estas reacciones se realizan en diclorometano empleando clorhidrato de /V-(3-dimetilaminoisopropil)-A/'-etilcarbodiimida (EDC) y 4-dimetil-aminopiridina a una temperatura de +50 °C a 100 °C a presión normal.
Los grupos funcionales que dado el caso existan en los compuestos -como especialmente grupos amino, hidroxi y carboxilo- también pueden presentarse en los pasos de procedimiento antes descrito, en caso adecuado o reque4rido, en forma protegida temporariamente. La introducción y eliminación de tales grupos de protección se realiza según los procedimientos usuales conocidos en la síntesis de péptidos [véase p. ej., T.W. Greene y P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1999; M. Bodanszky y A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín, 1984]. Cuando existen varios grupos protegidos, su nueva liberación dado el caso puede efectuarse en forma simultánea en una reacción de un solo recipiente o también en pasos de reacción separados. Como grupo de protección amino PG1 preferentemente se usa ferc-butoxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z) o (9/- -fluoren-9-ilmetoxi)carbonilo (Fmoc); para una función hidroxi o carboxilo se emplea preferentemente ferc-butilo o bencilo como grupo de protección PG2. La escisión de un grupo ferc-butilo o ferc-butoxicarbonilo por lo general se lleva a cabo mediante el tratamiento con un ácido fuerte, como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico o ácido trifluoroacético en un disolvente inerte como dietiléter, 1 ,4-dioxano, diclorometano o ácido acético; dado el caso esta reacción también puede realizarse sin adición de un disolvente inerte. En el caso de usar bencilo o benciloxicarbonilo como grupo de protección estos se eliminan preferentemente mediante hidrogenólisis en presencia de un catalizador de paladio adecuado, como por ejemplo paladio sobre carbón activo. El grupo (9/- -fluoren-9-ilmetoxi)carbonilo por lo general es escindido con ayuda a una base amina secundaria como dietilamina o piperidina.
La transformación (VI)? (ll-A) se realiza en un disolvente inerte en esas condiciones de reacción como por ejemplo éteres como tetrahidrofurano, 1 ,4-dioxano, 1 ,2-dimetoxietano o bis-(2-metoxietil)-éter, alcoholes como metanol, etanol, isopropanol, n-butanol o ferc-butanol, o disolventes dipolares-apróticos como acetona, metil-etilcetona, acetonitrilo, etilacetato, piridina, dimetilsulfóxido (DMSO), A/,A/-dimetilform- amida (DMF), /v",A/-dimetilacetamida (DMA), ?/,?/'-dimetilpropilenurea (DMPU) o N-metilpirrolidinona (NMP) o agua. También es posible usar mezclas de tales disolventes. Preferentemente se utiliza una mezcla de 1 ,4-dioxano y agua.
Bases adecuadas para la transformación (VI)? (ll-A) son por ejemplo carbonato alcalino como carbonato de potasio, carbonato de sodio o carbonato de litio, hidrocarbonatos alcalinos como hidrocarbonato de sodio o potasio o alcoholatos alcalinos como metanolato de sodio, etanolato de sodio o terc-butilato de potasio. Preferentemente se utiliza hidrocarbonato de sodio.
La reacción (VI)? (ll-A) se realiza en un intervalo de temperatura de 0 °C a +50 °C, preferentemente de +10 °C a +30 °C. La transformación puede llevarse a cabo a presión normal, a presión elevada o a presión reducida (p. ej., de 0,5 a 5 bar); por lo general se opera a presión normal.
La transformación (VI) + (VII)? (ll-B) se lleva a cabo en un disolvente inerte en las condiciones de reacción, como por ejemplo éteres como tetrahidrofurano, 1 ,4-dioxano, 1 ,2-dimetoxietano o bis-(2-metoxietil)-éter, alcoholes como metanol, etanol, isopropanol, n-butanol o ferc-butanol, o disolventes dipolares-apróticos como acetona, metiletilcetona, acetonitrilo, etilacetato, piridina, dimetilsulfóxido (DMSO), ?/,/V-dimetilformamida (DMF), /V,/V-dimetilacetamida (DMA), ?/,?/'-dimetilpropilenurea (DMPU) o /V-metilpirrolidinona (NMP) o agua. Asimismo es posible utilizar mezclas de tales disolventes. Preferentemente se utiliza DMF.
Bases adecuadas para la transformación (VI) + (VII)? (ll-B) son por ejemplo bases de amina terciarias como trietilamina, /V-metilmorfolina, /V-metilpiperidina, ?/,/V-diiso-propiletilamina, piridina o 4-A/,A -dimetilaminopiridina. Preferentemente se utiliza N,N-diisopropiletilamina.
La reacción (VI) + (VII)? (ll-B) se realiza en un intervalo de temperatura de 0 °C a +50 °C, preferentemente de +10 °C a +30 °C. La transformación puede llevarse a cabo a presión normal, a presión elevada o a presión reducida (p. ej., de 0,5 a 5 bar); por lo general se opera a presión normal.
Las transformaciones (IX)? (Ill-A), (XIV)? (lll-B) y (XVI)? (lll-C) así como (VI) + (XVII)? (lll-D), (XIX) + (XX)? (Ill-E) y (XXV) + (XX)? (lll-F) se realizan en un disolvente que es inerte en las condiciones de reacción. Disolventes adecuados son por ejemplo éteres como dietiléter, diisopropiléter, terc-butilmetiléter, tetrahidrofurano, 1 ,4-dioxano, 1 ,2-dimetoxietano o bis-(2-metoxietil)-éter, hidrocarburos como benceno, tolueno, xileno, pentano, hexano, heptano, ciclohexano o fracciones de petróleo, hidrocarburos halogenados como diclorometano, triclorometano, tetracloro-metano, 1 ,2-dicloroetano, tricloroetileno o clorobenceno, o disolventes dipolares-apróticos como acetona, metiletilcetona, acetonitrilo, etilacetato, piridina, dimetil-sulfóxido (DMSO), A/,/\/-dimetilformamida (DMF), /v",/V-dimet¡lacetam¡da (DMA), ?,?'-dimetilpropilenurea (DMPU) o /V-metilpirrolidinona (NMP). Asimismo es posible utilizar mezclas de tales disolventes. Preferentemente se utiliza /V,/V-dimet¡lform-amida.
Bases adecuadas para estas transformaciones son por ejemplo aminas terciarias como trietilamina, /V-metilmorfolina, /V-metilpiperidina, ?/,/V-diisopropiletilamina, piridina o 4-W,A/-dimetilaminopiridina. Preferentemente se utiliza A/,A/-diisopropilet¡l-amina, dado el caso mediante adición de 4-A/,W-dimetilaminopiridina.
Las transformaciones (IX)? (lll-A), (XIV)? (lll-B) y (XVI)? (lll-C) así como (VI) + (XVII) ? (lll-D) y (XIX) + (XX) ? (lll-E) se llevan a cabo en un intervalo de temperatura de 0 °C a +50 °C, preferentemente de +10 °C a +30 °C. La transformación puede llevarse a cabo a presión normal, a presión elevada o a presión reducida (p. ej., de 0,5 a 5 bar); por lo general se opera a presión normal. Los compuestos de las fórmulas (II) o bien (III) son subcantidades de los compuestos de las fórmulas (lia) o bien (Illa) en la que R35 representa metilo. La preparación de los compuestos (lia) y (Illa) se realiza en analogía con la preparación del compuesto de las fórmulas (II) y (III) como se ha descrito precedentemente.
Los procedimientos antes descritos se explican a modo de ejemplo mediante los esquemas de síntesis indicados a continuación (Esquema 3 a 13, 18): Esquema 4 [a): diisopropiletilamina, DMF, TA].
Esquema 5 [a): agua/dioxano, HCI 1 N, 100°C; b): HATU, diisopropilamina, DMF, TA] Esquema 6 [a): 1. EDCI, DMAP, diclorometano, TA; 2. H2, metanol, TA ; b): 1. EDCI, HOBt, diiso-propilamina, DMF, TA; 2. diclorometano, TA]. [a): 1. EDCI, DMAP, diclorometano, TA; 2. H2, metanol, TA ; b): HATU, diisopropil-amina, DMF, TA].
Esquema 8 [a): EDCI, diclorometano, TA].
Esquema 9 [a): HATU, düsopropiletilamina, DMF, TA; 2. H2, metanol, TA; b): EDCI, DMAP, diclorometano, TA].
Fs uema 10 diclorometano, TA].
Esquema 11 [a): diisopropiletilamina, DMF, TA].
Esquema 12 [a): 1. EDCI, DMAP, diclorometano, TA; 2. diclorometano, TA ; b): diisopropilamina, DMAP, diclorometano, TA].
Esquema 13 [a): DMAP, düsopropilamina, diclorometano, TA].
Esquema 18 [a): 1. agua/dioxano, HCI 1 N, 100°C; 2. H2, Pd/C, metanol, TA; b): HATU, diisopropiletilamina, TA].
Los compuestos de la fórmula (IV) pueden prepararse de componentes de aminoácidos disponibles comercialmente o conocidos en la literatura (véase, por ejemplo, Pettit et al., Synthesis 1996, 719; Shioiri et al., Tetrahedron Lett. 1991 , 32, 931 ; Shioiri et al., Tetrahedron 1993, 49, 1913; Koga er a/., Tetrahedron Lett. 1991 , 32, 2395; Vidal et al., Tetrahedron 2004, 60, 9715; Poncet et al., Tetrahedron 1994, 50, 5345. Pettit et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 1796) en analogía con procedimientos conocidos en la literatura según procedimientos usuales de la química de los péptidos y tal como se ha descrito en la presente parte experimental. Los siguientes esquemas de síntesis (Esquema 14 a 16) explican a modo de ejemplo la preparación.
Esquema 14 [a): clorhidrato de hidroxilamina, KOH, MeOH, 0°C? TA; b): BrCH2(CH2)2CH2Br, K2C03, acetona, reflujo].
Esquema 15 1. diisopropiletilamina, BEP, diclorometano, -10°C? TA; 2. MeOH].
Esquema 16 [ a): 1. düsopropiletilamina, BEP, DMF, TA; 2. diclorometano; b): 1. HATU, diisopropil-etilamina, DMF, TA; 2. diclorometano, TA; c): 1. HATU, düsopropiletilamina, DMF, TA; 2. Piperidina, DMF, TA ].
Los compuestos de las fórmulas (XI), (XIII), (XV), (XVII) y (XXI) inclusive, donde sea pertinente, las formas quirales o diaestereoméricas de los mismos, pueden adquirirse comercialmente o se han descrito como tales en la literatura o pueden prepararse por las vías obvias para el especialista en analogía con los procedimientos publicados en la literatura. Muchas instrucciones detalladas así como citas de literatura para la preparación de los materiales de partida también están incluidas en la parte experimental en la sección para la preparación de compuestos de partida e intermedios.
Los compuestos de las fórmulas (V), (VII), (VIII), (X), (XVIII), (XX) y (XXIII) inclusive, donde sea pertinente, las formas quirales o diaestereoméricas de los mismos, pueden adquirirse comercialmente o se han descrito como tales en la literatura o pueden prepararse por las vías obvias para el especialista en analogía con los procedimientos publicados en la literatura. Muchas instrucciones detalladas así como citas de literatura para la preparación de los materiales de partida también están incluidas en la parte experimental en la sección para la preparación de compuestos de partida e intermedios.
En forma alternativa puede realizarse algunos pasos de la secuencia de preparación en otro orden o con otras combinaciones de grupos de protección. Esta forma de proceder se explican a modo de ejemplo en los esquemas de síntesis enunciados a continuación (Esquemas 17, 19, 20 y 21).
Esquema 17 [ a): Complejo borano-piridina, ácido acético, MeOH; b): 1. HOBt, EDCI, diisopropiletilamina, DMF, TA; 2. TFA, diclorometano, TA; c): HATU, diisopropiletilamina, DMF, TA; d): 1. Pd/C, MeOH, TA; 2. NaHCO3, dioxano, agua].
Esquema 19 1. HATU, diisopropiletilamina, DMF, TA; 2. TFA, diclorometano, TA ; 3. ((H3C)3C(C=0))20, DMF, diisopropiletilamina; b): diisopropiletilamina, BEP, DMF, TA; c): 1. H2, Pd/C (10%). metanol, TA ; 2. HATU, diisopropiletilamina, DMF, TA; 3. TFA, diclorometano, TA ].
Esquema 20 [a): Complejo borano-piridina, ácido acético, MeOH; b): 1. HOBt, EDCI, diisopropiletilamina, DMF, TA; 2. TFA, diclorometano, TA; 3. H2, Pd/C, MeOH, TA c): 1. NaHCO3,dioxano, agua; d): HATU, diisopropiletilamina, DMF, TA].
Esquema 21 [a): 1. HOBt, EDCI, düsopropiletilamina, DMF, TA; b) H2, Pd/C, MeOH, TA Complejo borano-piridina, ácido acético, MeOH; d) TFA, diclorometano, TA, HATU, düsopropiletilamina, DMF, TA; f): HATU, diisopropiletilamina, DMF, TA; g) H2, Pd/C, MeOH, TA].
La molécula diana cancerosa del FGFR2 del ligante de la presente invención es conocida por el especialista. El FGFR2 de longitud completa se denomina FGFR2 alfa (SEC ID N° 1), mientras que la isoforma que carece del dominio D1 , se denomina FGFR2 beta (SEC ID N° 2) (véase Figura 1). Una separación alternativa en el dominio 3 produce dos variantes diferentes, a saber FGFR2 lllb que es codificado por los exones 7 y 8, y FGFR2 lile que es codificado por los exones 7 y 9 (véase Figura 1).
En una realización de la invención el ligante se enlaza, preferentemente en forma específica, con FGFR2. En otro objeto de la invención el ligante se enlaza, preferentemente en forma específica, con el dominio extracelular de la molécula diana FGFR2 (véase Figura 1).
En otra realización de la invención el ligante se enlaza, preferentemente en forma específica, con una o varias formas del polipéptido FGFR2 humano. En otro objeto de la invención el ligante se enlaza, preferentemente en forma específica, con todas las isoformas y variantes de empalmes de FGFR2. En adelante el concepto de diferentes "formas" de FGFR2 incluye diferentes isoformas, diferentes variantes de empalme, diferentes glucoformas o polipéptidos FGFR2 que están sujetos a diferentes modificaciones de traslación y posttraslación, pero sin limitarse a ellos.
En otra realización de la invención el ligante se enlaza, preferentemente en forma específica, con el dominio N-terminal de la molécula diana cancerosa FGFR2. En otro objeto de la invención el ligante se enlaza, preferentemente en forma específica, con el epitopo N-terminal extracelular (1 RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 (SEC ID N° 23).
En otra realización de la invención el ligante también se enlaza, preferentemente en forma específica, con los FGFR2 de otras especies. Esto genera los conjugados de la invención también pueden estudiarse en estas especies de forma farmacológicamente más sencilla. Especies preferidas son roedores, especialmente ratones o ratas, pero también perros, chanchos y primates no humanos.
En una realización preferida, el ligante después del enlace con el FGFR2 en la célula diana es internalizado debido a la unión de la célula diana. Ello provoca que el conjugado de principio activo-ligante que puede ser un inmunoconjugado o un ADC sea incorporado por la célula diana.
En una realización el ligante es una proteína de enlace. En una realización preferida el ligante es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que enlaza un antígeno, un anticuerpo multiespecífico o un mimético de anticuerpo.
Miméticos de anticuerpo preferidos son affibodies, adnectinas, anticalinas, DARPins, avímeros o nanocuerpos. Anticuerpos multiespecíficos preferidos son anticuerpos biespecíficos o triespecíficos.
En una realización preferida el ligante es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que enlaza un antígeno, más preferentes es un anticuerpo aislado o un fragmento de anticuerpo aislado que enlaza un antígeno.
Fragmentos de anticuerpo preferidos que enlazan un antígeno son fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diabodies, DAbs, anticuerpos lineales y scFv. Especialmente preferidos son Fab, diabodies y scFv.
En una realización especialmente preferida el ligante es un anticuerpo. Especialmente preferidos son anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo de los mismos que enlazan antígenos. Además son especialmente preferidos los anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos o fragmentos de anticuerpos de los mismos que enlazan antígenos.
En una realización preferida el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que enlaza antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de las secuencias CDR de la cadena variable ligera y variable pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1.
En otra realización preferida el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que enlaza antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de las secuencias CDR de la cadena variable ligera y variable pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1 reproducido en la SEC ID N° 15 (H-CDR1), SEC ID N° 16 (H-CDR2), SEC ID N° 17 (H-CDR3), SEC ID N° 18 (L-CDR1), SEC ID N° 19 (L-CDR2) y SEC ID N° 20 (L-CDR3).
En otra realización preferida el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que enlaza antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de las cadenas variables pesadas y variables ligeras del anticuerpo M048-D01-hlgG1 o M048-D01-hlgG1-b.
En otra realización preferida el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que enlaza antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de las cadenas variables pesadas y variables ligeras del anticuerpo M048-D01-hlgG1 , reproducido en la SEC ID N° 12 (VI) y SEC ID N° 11 (Vh), o de las cadenas variables pesadas y variables ligeras del anticuerpo M048-D01-hlgG1-b, reproducido en las SEC ID N° 14 (VI) y SEC ID N° 13 (Vh).
En otra realización especialmente preferida el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que enlaza antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena variable ligera y variable pesada del anticuerpo M048-D01- hlgG1-b reproducido en la SEC ID N° 14 (VI) y SEC ID N° 13 (Vh).
En otra realización especialmente preferida el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1-b reproducido en la SEC ID N° 9 (cadena ligera) y SEC ID N° 10 (cadena pesada). En otra realización especialmente preferida el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1 reproducido en la SEC ID N° 7 (cadena ligera) y SEC ID N° 8 (cadena pesada).
Ejemplos de otros anticuerpos FGFR2 son los anticuerpos GAL-FR21-mlgG1 (SEC ID N° 3 y SEC ID N° 4) y GAL-FR22-mlgG2a (SEC ID N° 5 y SEC ID N° 6) descritos en esta invención. Estos dos mencionados por último se construyeron sobre la base del documento WO2010/054265 con las regiones variables allí descritas de las cadenas ligeras (VI) y pesadas (Vh) de los anticuerpos GAL-FR21 (SEC ID N° 1 y SEC ID N° 4 del documento WO2010/054265) y GAL-FR22 (SEC ID N° 7 y SEC ID N° 8 del documento WO2010/054265), donde las regiones variables de GAL-FR21 se reformatearon en un formato mlgG1 , mientras que las regiones variables de GAL-FR22 se reformatearon en un formato mlgG2a.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que enlazan antígenos que se unen con la molécula diana cancerosa pueden prepararse por el especialista promedio con procedimientos conocidos, como por ej., síntesis química o expresión recombinante.
Los ligantes para moléculas diana cancerosas pueden adquirirse comercialmente o pueden ser preparados por el especialista promedio según procedimientos conocidos, como p. ej., síntesis química o expresión recombinante. Otros procedimientos para la preparación de anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo que enlazan un antígeno se describen en el documento WO 2007/070538 (véase página 22 "Antibodies"). El especialista conoce procedimientos como las denominadas bibliotecas de fagos (p. ej., Morphosys HuCAL Gold) que pueden utilizarse para encontrar anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo que enlazan un antígeno (véase el documento WO 2007/070538, página 24 sgs. y Ejemplo 1 en la página 70, Ejemplo 2 en la página 72). Otros procedimientos para la preparación de anticuerpos que utilizan las bibliotecas de ADN de células B, se describieron por ejemplo en la página 26 (WO 2007/070538). Los procedimientos para la humanización de anticuerpos se describen en la página 30-32 del documento WO2007070538 y en detalle en Queen, et al., .Pros. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:10029- 0033,1989 o en el documento WO 90/0786. Además el especialista conoce procedimientos para la expresión recombinante de proteínas en general y especialmente de anticuerpos (véase p. ej., en Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocole, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881, Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); y Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). El especialista conoce los correspondientes vectores, promotores y péptidos señal que son necesarios para la expresión de una proteína/anticuerpo. También en el documento WO 2007/070538 en las páginas 41 - 45 se han descrito procedimientos usuales. Procedimientos para la preparación de un anticuerpo lgG1 se han descrito p. ej., en el documento WO 2007/070538 en el ejemplo 6 en la página 74 sgs. Los procedimientos con los cuales se puede determinar la internalización de un anticuerpo después del enlace con su antígeno, son conocidos por el especialista y se han descrito p. ej., en el documento WO 2007/070538 en la página 80. El especialista puede utilizar los procedimientos descritos en el documento WO 2007/070538 que se emplearon para la preparación de anticuerpos carboanhidrasa IX (Mn), de manera análoga para la preparación de anticuerpos con otra molécula diana específica.
Los compuestos de acuerdo con la invención presentan propiedades farmacológicas valiosas y pueden usarse para la prevención y el tratamiento de afecciones en seres humanos y animales.
Los conjugados de principio activo-ligante (ADC) de la fórmula (la) de acuerdo con la invención presenten una elevada actividad citotóxica específica frente a células tumorales que puede mostrarse mediante los ensayos indicados en la presente parte experimental (Parte C). Esta elevada actividad citotóxica específica de los conjugados de principio activo-ligante (ADC) de la fórmula (la) de acuerdo con la invención se logra debido a la combinación adecuada de nuevos derivados de N,N-dialquilauriestatina y ligantes con conectores que presentan tanto un punto de quiebre nominal que puede escindirse por vía enzimática, hidrolítica o reductiva, para la liberación de los toxóforos, como también ningún punto de quiebre nominal de ese tipo. Especialmente debido al uso de conectores estables que no requieren de un punto de quiebre nominal que puede escindirse por vía enzimática, hidrolítica o reductiva para la liberación de los toxóforos, y los que después de la incorporación del ADC en la célula tumoral y después de una degradación enzimática, intracelular, completa del anticuerpo aún permanecen parcial o totalmente intactos, se logra que el efecto se limite muy específicamente a la célula tumoral. La compatibilidad de los ADC con conectores estables presupone entre otras condiciones que los metabolitos formados intracelularmente se produzcan con suficiente eficiencia, logren su objetivo y allí puedan desarrollar su efecto anti-proliferativo con suficiente potencia, antes de ser expulsados nuevamente de la célula tumoral por las proteínas transportadoras. Una compatibilidad tal de los ADC con una química estable de los conectores y el correspondiente objetivo, ofrece una ventana terapéutica más grande (L. Ducry, Bioconjugate Chem. 2010, 21-5; A.G. Poison, Cáncer Res. 2009, 69, 2358).
Los conjugados de principio activo-ligante (ADC) de la fórmula (la) de acuerdo con la invención presentan especialmente una elevada actividad citotóxica específica frente a células tumorales que expresan el FGFR2. La actividad frente a células tumorales que no expresan el FGFR2 es notoriamente menos marcada.
Los compuestos de acuerdo con la invención debido a este perfil de propiedades son especialmente adecuados para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas en los humanos y en mamíferos en general. Los compuestos por una parte pueden inhibir, bloquear o reducir la proliferación y la división celular y por otra parte aumentar la apoptosis.
En las enfermedades hiperproliferativas, que pueden ser tratadas con los compuestos de acuerdo con la invención se incluyen especialmente el grupo de las afecciones de cáncer y tumorales. En el marco de la presente invención se incluyen especialmente las siguientes afecciones, pero sin que esta enunciación sea limitativa: carcinomas y tumores de mama (formas ductales y lobulares, también in situ), tumores de las vías respiratorias (carcinoma de células pequeñas y de células no pequeñas, carcinoma bronquial), tumores cerebrales (p. ej., del tronco encefálico y del hipotálamo, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma así como tumores neuro-ectodermales y pineales), tumores de los órganos digestivos (esófago, estómago, vesícula biliar, intestino delgado, intestino grueso, recto), tumores hepáticos (e.o. carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma y colangiocarcinoma hepatocelular mixto), tumores de la zona craneal y de garganta (laringe, hipofaringe, nasofaringe, orofaringe, labios y cavidad bucal), tumores de la piel (carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, cáncer de piel de células de Merkel y cáncer de piel no tipo melanoma), tumores de partes blandas (e.o. sarcoma de partes blandas, osteosarcoma, histiocitomas fibrosos malignos, linfosarcoma y rabdomiosarcoma), tumores oftálmicos (e.o. melanoma infraocular y retinoblastoma), tumores de glándulas endocrinas y exócrinas (p. ej., glándulas tiroideas y paratiroideas, páncreas y glándula salival), tumores del tracto urinario (tumores de vejiga, de pene, renales y de vías urinarias) así como tumores de órganos reproductivos (carcinomas de endometrio, cervicales, ováricos, vaginales, de vulva y de útero de la mujer así como carcinomas de próstata y de testículos del hombre). También se incluyen enfermedades proliferativas de la sangre en forma sólida y como células sanguíneas en circulación, como linfomas, leucemias y enfermedades mieloproliferativas, p. ej., leucemia mieloide aguda, linfoblástica aguda, lifocítica-crónica, mielógena-crónica y leucemia de células pilosas, así como linfomas correlativos con SIDA, linfoma Hodgkin, linfoma Non-Hodgkin, linfomas de células T cutáneas, linfomas de Burkitt y linfomas en el sistema nervioso central.
Enfermedades hiperproliferativas preferidas para conjugados de principio activo-ligante anti-FGFR2 Las enfermedades hiperproliferativas, que pueden ser tratadas preferentemente con los compuestos de acuerdo con la invención son tumores que expresan FGFR2, como por ejemplo carcinoma de estómago (tipo intestinal y difuso), carcinoma de mucocelular, especialmente del tipo difuso, cáncer de laringe, cáncer de la unión esofagogástrica (carcinoma of the Esophagogastric Junction = EGJ), cáncer de mama, cáncer del intestino grueso, carcinoma colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de riñon, carcinomas del área de la cabeza y del cuello, cáncer del páncreas, cáncer de hígado, carcinoma cervical, carcinoma de endometrio, especialmente del tipo endometrioide, del tipo seroso-papilar, del subtipo de células claras, cáncer de pulmón, especialmente carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), adenocarcinoma, carcinoma de epitelio plano y carcinoma de páncreas.
Estas enfermedades de los humanos que se encuentran bien descritas también pueden producirse en otros mamíferos con etiología comparable y allí pueden ser tratadas con los compuestos de la presente invención.
El término "tratamiento" o "tratar" se usa en forma convencional en el marco de esta invención y significa la asistencia, el cuidado y la atención de un paciente con el objetivo de combatir, reducir, mejorar o aliviar una enfermedad o una afección de la salud y de mejorar las condiciones de vida que son afectadas por esta enfermedad, como por ejemplo en el caso de padecer de cáncer.
Otro objeto de la presente invención es por lo tanto el uso de los compuestos de acuerdo con la invención para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, especialmente de las enfermedades antes mencionadas.
Otro objeto de la presente invención es el uso de los compuestos de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, especialmente de las enfermedades antes mencionadas.
Otro objeto de la presente invención es el uso de los compuestos de acuerdo con la invención en un procedimiento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, especialmente de las enfermedades antes mencionadas.
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, especialmente de las enfermedades antes mencionadas utilizando una cantidad efectiva de como mínimo uno de los compuestos de acuerdo con la invención.
Los compuestos de acuerdo con la invención pueden usarse solos o según necesidad en combinación con una o varias otras sustancias de acción farmacológica, en tanto esta combinación no produzca efectos secundarios no deseados e inaceptables. Otro objeto de la presente invención por lo tanto son medicamentos que contienen como mínimo uno de los compuestos de acuerdo con la invención y uno o varios otros principios activos, especialmente para el tratamiento y/o la prevención de las afecciones antes mencionadas.
Los compuestos de la presente invención pueden combinarse por ejemplo con sustancias anti-hiperproliferativas, citostáticas o citotóxicas conocidas para el tratamiento de cáncer. Como principios activos combinables adecuados se indican a modo de ejemplo: Aldesleucina, ácido alendrónico, alfaferon, alitretinoina, allopurinol, aloprim, aloxi, altretamina, aminoglutetimida, amifostina, amrubicina, amsacrina, anastrozol, anzmet, aranesp, arglabina, trióxido de arsénico, aromasina, 5-azacitidina, azatioprina, BCG o tice-BCG, bestatina, betametasona-acetato, betametasona-fosfato de sodio, bexaroteno, sulfato de bleomicina, broxuridina, bortezomib, busulfano, calcitonina, campath, capecitabina, carboplatina, casodex, cefesona, celmoleucina, cerubidina, chlorambucilo, cisplatina, cladribina, ácido clodrónico, ciclofosfamida, cytarabina, dacarbazina, dactinomicina, DaunoXome, decadron, decad ron-fosfato, delestrogeno, denileucina diftitox, depomedrol, deslorelina, dexrazoxano, dietilstilbestrol, diflucano, docetaxel, doxifluridina, doxorubicina, dronabinol, DW-166HC, eligard, elitek, ellence, emend, epirubicina, epoetin-alfa, epo-gen, eptaplatina, ergamisol, estrace, estradiol, estramustina fosfato de sodio, etinilestradiol, ethyol, ácido etidrónico, etopofos, etoposida, fadrozol, farston, filgrastim, finasterid, fligrastim, floxuridina, fluconazol, fludarabina, 5-fluordeoxiuridina-monofosfato, 5-fluoruracilo (5-FU), fluoximesterona, flutamida, formestano, fosteabina, fotemustina, fulvestrant, gammagard, gemcitabina, gemtuzumab, gleevec, gliadel, goserelina, clordhidrato de granisetrona, histrelina, hicamtina, hidrocortona, eritro-hidroxinoniladenina, hidroxiurea, ibritumomab tiuxetano, idarubicina, ifosfamida, interferón-alfa, interferón-alfa-2, interferón-alfa-2a, interferón-alfa-2p, interferón-alfa-n1 , interferón-alfa-n3, interferón-beta, interferón-gamma-1a, ¡nterleucina-2, intron A, iressa, ¡rinotecano, Kytrilo, lentinan-sulfato, letrozol, leucovorina, leuprolida, leuprolida-acetato, levamisol, ácido levofoliníco-sal de calcio, levotroide, levoxilo, lomustina, lonidamina, marinol, mecloroetamina, mecobalamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalano, menest, 6-mercaptopurina, mesna, metotrexato, metvix, miltefosina, minociclina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, modrenal, myocet, nedaplatina, neulasta, neumega, neupogen, nilutamida, nolvadex, NSC-631570, OCT-43, octreotido, clorhidrato de ondansetrona, orapred, oxaliplatina, paclitaxel, pediapred, pegaspargasa, pegasys, pentostatina, picibanilo, clorhidrato de pilocarpina, pirarubicina, plicamicina, porfimer-sodio, prednimustina, prednisolona, prednisona, premarina, procarbazina, procrit, raltitrexed, rebif, etidronato de renio-186, rituximab, roferon-A, romurtida, salagen, sandostatina, sargramostim, semustina, sizofirano, sobuzoxano, solu-medrol, estreptozocina, cloruro de estroncio-89, sintroide, tamoxifeno, tamsulosina, tasonermina, tastolactona, taxoter, teceleucina, temozolomida, teniposida, propionato de testosterona, testred, tioguanina, tiotepa, tirotropina, ácido tiludrónico, topotecano, toremifeno, tositumomab, tastuzumab, teosulfano, tretinoina, trexall, trimetilmelamina, trimetrexato, acetato de triptorelina, pamoato de triptorelina, UFT, uridina, valrubicina, vesnarinona, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, virulizina, zinecard, zinostatina-estimalamer, zofran; ABI-007, acolbifen, actimmun, affinitak, aminopterina, arzoxifeno, asoprisnilo, atamestano, atrasentano, avastina, BAY 43- 9006 (Sorafenib), CCI-779, CDC-501 , celebrex, cetuximab, crisnatol, acetato de ciproterona, cecitabina, DN-101 , doxorubicina-MTC, dSLIM, dutasterida, edotecarina, eflornitina, exatecano, fenretinida, diclorhidrato de histamina, implante de histrelina-hidrogel, holmio-166-DOTMP, ácido ibandrónico, interferón-gamma, intron-PEG, ixabepilon, Keyhole Limpet-Hemocianoina, L-651582, lanreotida, lasofoxifeno, libra, lonafarnib, miproxifeno, minodronato, MS-209, MTP-PE liposomal, MX-6, nafarelina, nemorubicina, neovastato, nolatrexed, oblimersen, Onko-TCS, osidem, paclitaxel-poliglutamato, pamidaronato-disódico, PN-401 , QS-21, quazepam, R-1549, raloxifeno, ranpirnas, ácido 13-c/s-retina, satraplatina, seocalcitol, T-138067, tarceva, taxoprexina, timosin-alfa-1 , tiazofurina, tipifarnib, tirapazamina, TLK-286, toremifeno, TransMID-107R, valspodar, vapreotido, vatalanib, verteporfina, vinflunina, Z-100, ácido zoledrónico así como combinaciones de los mismos.
En una forma de realización preferida los compuestos de la presente invención pueden combinarse agentes anti-hiperproliferativos que a modo de ejemplo -sin que esta mención sea definitiva- pueden ser: aminoglutetimida, L-asparaginasa, azatioprina, 5-azacitidina, bleomicina, busulfano, carboplatina, carmustina, clorambucil, cisplatino, colaspasa, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dietilstilbestrol, 2',2'-difluordeoxicitidina, docetaxel, doxorubicina (adriamicina), epirubicina, epotilona y sus derivados, eritro-hidroxinoniladenina, etinilestradiol, etoposida, fludarabin-fosfato, 5-fluorodeoxiuridina, 5-fluorodesoxiuridin-monofosfato, 5-fluoruracilo, fluoximesterona, flutamida, hexametilmelamina, hidroxiurea, caprotato de hidroxiprogesterona, ida-rubicina, ifosfamida, interferón, irinotecano, leucovorina, lomustina, mecloroetamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalan, 6-mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, paclitaxel, pentostatina, L-aspartato de /V-fosfonoacetilo (PALA), plicamicina, prednisolona, prednisona, procarbazina, raloxifeno, semustina, estreptozocina, tamoxifeno, teniposida, propionato de testosterona, tioguanina, tiotepa, topotecano, trimetilmelamina, uridina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina.
De manera muy prometedora los compuestos de acuerdo con la Invención también pueden combinarse con agentes terapéuticos biológicos como anticuerpos (p. ej., avastina, rituxano, erbitux, herceptina). Los compuestos de acuerdo con la invención también pueden lograr efectos positivos en combinación con terapias dirigidas contra la angiogénesis, como por ejemplo con avastina, axitinib, recentína, regorafenib, sorafenib o sunitinib. La combinaciones con inhibidores del proteosoma y de mTOR así como combinaciones con antihormonas e inhibidores enzimáticos metabólicos esteroideos también son especialmente apropiados debido a su ventajoso perfil de efectos secundarios.
En general con la combinación de compuestos de la presente invención con otros agentes de acción citostática o citotóxica se puede apuntar a los siguientes objetivos: • una mejorada efectividad en el retraso de crecimiento tumoral, en la reducción de su tamaño o incluso en su eliminación total en comparación con un tratamiento con un solo principio activo; · la posibilidad de usar los quimioterapéuticos utilizados en dosis menores que en las monoterapias; • la posibilidad de una terapia de mayor tolerancia con menor cantidad de efectos secundarios en comparación con la administración individual; • la posibilidad de tratamiento de un espectro más amplio de enfermedades tumorales; • el logro de un mayor índice de éxito de la terapia; • un mayor tiempo de sobrevida de los pacientes en comparación con la terapia estándar actual.
Los compuestos de acuerdo con la invención por lo demás también pueden usarse en combinación con una terapia de rayos y/o una intervención quirúrgica.
Otro objeto de la presente invención son medicamentos que contienen como mínimo un compuesto de acuerdo con la invención, por lo general junto con uno o varios adyuvantes inertes no tóxicos adecuados para uso farmacéutico, así como su uso para los fines antes mencionados.
Los compuestos de acuerdo con la invención pueden tener efecto sistémico y/o local. A este fin pueden aplicarse de manera adecuada, como por ejemplo por vía oral, parenteral, Los compuestos de acuerdo con la invención pueden tener efecto sistémico y/o local. A este fin pueden aplicarse de manera adecuada, como por ejemplo por vía parenteral, posiblemente inhalativa o como implante o bien stent. Para estas vías de aplicación, los compuestos de acuerdo con la invención pueden administrarse en formas de aplicación adecuadas.
La aplicación parenteral puede efectuarse evitando un paso de resorción (p. ej., por vía intravenosa, intraarterial, intracardial, intraespinal o intralumbar) o previendo una resorción (p. ej., intramuscular, subcutánea, intracutánea, percutánea o intraperitoneal). Para la aplicación parenteral son adecuadas como formas de aplicación, entre otras, preparaciones inyectables o infundibles en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones o liofilizados. Es preferente la aplicación parenteral, especialmente la aplicación intravenosa.
Por lo general resultó ventajoso administrar en la aplicación parenteral cantidades de aproximadamente 0,001 a 1 mg/kg, preferentemente alrededor de 0,01 a 0,5 mg/kg de peso corporal para alcanzar resultados efectivos.
A pesar de ello dado el caso puede ser necesario modificar las cantidades indicadas y ello en relación con el peso corporal, la vía de aplicación, el comportamiento individual frente al principio activo, la forma de preparación y el momento o bien el intervalo en el que se realiza la aplicación. Así, en algunos casos puede ser suficiente administrar menos de la cantidad mínima antes mencionada, mientras que en otros casos se debe exceder el límite superior indicado. En el caso de la administración de cantidades más altas, puede ser recomendable distribuir estas en varias tomas individuales durante el día.
Los ejemplos de realización indicados a continuación explican la invención. La invención no está limitada a los ejemplos.
Los datos porcentuales en los siguientes ensayos y ejemplos se entienden, salvo indicación en contrario, como porcentajes en peso; las partes son partes en peso. Las relaciones de disolventes, de dilución y las indicaciones de concentraciones de soluciones líquidas/líquidas se refieren respectivamente al volumen.
A. Ejemplos Abreviaturas v acrónimos: ABCB1 Cásete de unión de ATP miembro 1 sub-familia B (sinónimo de P-gp y MDR1) abs. absoluto ADC antibody-drug-conjugate = conjugado de anticuerpo-principio activo Ac acetilo ac. acuoso, solución acuosa ATP adenosintrifosfato BCRP proteína de resistencia al cáncer de mama, un transportador de eflujo Boc terc-butoxicarbonilo br. ancho (en RMN) Ej. ejemplo ca. circa, aproximadamente CAIX carboanhidrasa IX Cl ionización química (en EM) d duplete (en RMN) d día(s) DC cromatografía de capa fina DCI ionización química directa (en EM) dd duplete de duplete (en RMN) DMAP 4-N,N-dimetilaminopiridina DME 1 ,2-dimetoxietano DMEM medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco (medio estandarizado para el cultivo celular) DMF A/,A/-dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido DPBS, D-PBS, PBS solución salina de Dulbecco con tampón de fosfato PBS = DPBS = D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No D8537 composición: 0,2 g de KCI 0,2 g de KH2P04 (anhidro) 8,0 g de NaCI 1 ,15 g de Na2HP04 (anhidro) completar hasta 1 I con H20 dt duplete de triplete (en RMN) DTT DL-ditiotreitol d. t. del teórico (en rendimiento químico) EDC clorhidrato de /V'-(3-dimetilaminopropil)-W-etilcarbod¡¡mida EGFR Epidermal growth factor receptor = receptor del factor de crecimiento epidérmico El ionización por choque de electrones (en EM) ELISA ensayo de ¡nmunoabsorción enlazado con enzimas eq. equivalent(e) ESI ionización por electrospray (en EM) ESl-MicroTofq ESI- MicroTofq (nombre del espectrómetro de masa con Tof = Time Of Flight y q = Quadrupol) FCS suero fetal bovino FGFR2 receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 Fmoc (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonilo sat. saturado GTP guanosin-5'-trifosfato h horas(s) HATU hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/V,/S/',A/-tetrametiluronio HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-etansulfónico HOAc ácido acético HOBt 1-hidroxi-1 - -benzotriazol-hidrato HOSu W-hidroxisuccinimida HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento, de alta presión Fmoc (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonilo IC50 concentración de la inhibición media máxima i.m. intramuscular, aplicación en el músculo i.v. intravenoso, aplicación en la vena Katolll línea celular tumoral humana conc. concentrado CL-EM cromatografía líquida acoplada a un espectrómetro de masa Células LLC-PK1 línea celular de riñon de cerdo carcinoma pulmonar de Lewis L-MDR células LLC-PK1 transformadas con MDR1 humano m multiplete (en RMN) MDA-MB-231 línea celular tumoral humana MDR1 proteína 1 de resistencia a múltiples drogas MFM-223 línea celular tumoral humana min minuto(s) EM espectrometría de masas MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio NCI-H716 línea celular tumoral humana NMM A/-met¡lmorfolina NMP A/-metil-2-pirrolidinona RMN espectrometría resonancia magnética NMRI especie de ratones, proveniente del Naval Medical Research Institute (NMRI) Ratones nudos ratones nudos (animales de ensayo) NSCLC non small cell lung cáncer (carcinoma bronquial de células no pequeñas) PBS solución salina con tampón de fosfato Pd/C paladio sobre carbón activado P-gp P-glucoproteína, una proteína transportadora PNGaseF enzima para la escisión de azúcares cuant. cuantitativo (en rendimiento) cuart cuarteto (en RMN) quint quinteto (en RMN) Rf índice de retención (en DC) TA temperatura ambiente Rt tiempo de retención (en HPLC) s singulete (en RMN) s.c. subcutánea, aplicación debajo de la piel Ratones SCID ratones de ensayo con una deficiencia inmune combinada grave (severe combined immunodeficiency) SNU-16 línea celular tumoral humana SUM52-PE línea celular tumoral humana t triplete (en RMN) tere. terciario TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano UV espectrometría ultravioleta v/v relación volumen en volumen (de una solución) Z Benciloxicarbonilo Métodos HPLC- v CL-EM: Procedimiento 1 (CL-EM): Instrumento: sistema Waters Acquity SQD UPLC; columna: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 ,8 µ 50 mm x 1 mm; eluyente A: 1 I de agua + 0,25 mi de ácido fórmico al 99%; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,25 mi de ácido fórmico al 99%; gradiente: 0,0 min 90% A? 1 ,2 min 5% A? 2,0 min 5% A; caudal: 0,40 ml/min; horno: 50 °C; detección UV: 210-400 nm.
Procedimiento 2 (CL-EM): Instrumento: Micromass QuattroPremier con Waters UPLC Acquity; columna: Thermo Hypersil GOLD 1 ,9 µ 50 mm x 1 mm; eluyente A: 1 I de agua + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; gradiente: 0,0 min 90% A - 0,1 min 90% A? 1 ,5 min 10% A? 2,2 min 10% A; caudal: 0,33 ml/min; horno: 50 °C; detección UV: 210 nm.
Procedimiento 3 (CL-EM): Instrumento: Micromass Quattro Micro EM con HPLC Agilent Serie 1100; columna: Thermo Hypersil GOLD 3 µ 20 mm x 4 mm; eluyente A: 1 I de agua + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; gradiente: 0,0 min 100% A? 3,0 min 10% A? 4,0 min 10% A? 4,01 min 100% A (caudal 2,5 ml/min)? 5,00 min 100% A; horno: 50 °C; caudal: 2 ml/min; detección UV: 210 nm.
Procedimiento 4 (CL-EM): Tipo de equipo EM: Micromass ZQ; Tipo de equipo HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; columna: fenomenex Gemini 3 µ 30 mm x 3,00 mm; eluyente A: 1 I de agua + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; gradiente: 0,0 min 90% A? 2,5 min 30% A? 3,0 min 5% A? 4,5 min 5% A; caudal: 0,0 min 1 ml/min ? 2,5 min/3,0 min/4,5 min 2 ml/min; horno: 50 °C; detección UV: 210 nm.
Procedimiento 5 (HPLC): Equipo: HP 1090 Serie II; columna: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50 mm x 4,6 mm; precolumna: Merck Chromolith Guard Cartridge Kit RP-18e, 5 mm x 4,6 mm; volumen de inyección: 5 µ?; eluyente A: 70% HCIO4 en agua (4 ml/litro), eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0,00 min 20% B? 0,50 min 20% B? 3,00 min 90% B? 3,50 min 90% B? 3,51 min 20% B? 4,00 min 20% B; caudal: 5 ml/min; temperatura de columna: 40 °C.
Procedimiento 6 (HPLC): Equipo: Waters 2695 con DAD 996; columna: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50 mm x 4,6 mm; N° de pedido: 1 ,51450,0001. Columna previa: Merck Chromolith Guard Cartridge Kit RP-18e, 5 mm x 4,6 mm; N° de pedido: 1 ,51470,0001. Eluyente A: 70% HCIO4 en agua (4 ml/litro), eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0,00 min 5% B ? 0,50 min 5% B? 3,00 min 95% B? 4,00 min 95% B; caudal: 5 ml/min.
Procedimiento 7 (CL-EM): Tipo de equipo EM: Waters ZQ; Tipo de equipo HPLC: Agilent 1100 Series; UV DAD; columna: Thermo Hypersil GOLD 3 µ 20 mm x 4 mm; eluyente A: 1 I de agua + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; gradiente: 0,0 min 100% A? 3,0 min 10% A? 4,0 min 10% A? 4,1 min 100% A (caudal 2,5 ml/min); horno: 55 °C; caudal: 2 ml/min; detección UV: 210 nm. Procedimiento 8 (CL-EM): Tipo de equipo EM: Waters ZQ; Tipo de equipo HPLC: Agilent 1100 Series; UV DAD; columna: Thermo Hypersil GOLD 3 µ 20 mm x 4 mm; eluyente A: 1 I de agua + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,5 mi de ácido fórmico al 50%; gradiente: 0,0 min 100% A? 2,0 min 60% A? 2,3 min 40% A? 3,0 min 20% A? 4,0 min 10% A? 4,2 min 100% A (caudal 2,5 ml/min); horno: 55 °C; caudal: 2 ml/min; detección UV: 210 nm.
Procedimiento 9 (CL-EM): Instrumento: Waters Acquity SQD UPLC System; columna: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 ,8 µ 50 mm x 1 mm; eluyente A: 1 I de agua + 0,25 mi de ácido fórmico al 99%; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,25 mi de ácido fórmico al 99%; gradiente: 0,0 min 95% A? 6,0 min 5% A? 7,5 min 5% A; horno: 50 °C; caudal: 0,35 ml/min; detección UV: 210-400 nm.
Procedimiento 10 (HPLC): Equipo: Agilent 1200 Series; columna: Agilent Eclipse XDB-C18 5 µ 4,6 mm x 150 mm; precolumna: fenomenex KrudKatcher disposable Pre-Column; volumen de inyección: 5 µ?; eluyente A: 1 I de agua + 0,01% ácido trifluoroacético; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,01% ácido trifluoroacético; gradiente: 0,00 min 10% B? 1 ,00 min 10% B? 1,50 min 90% B? 5,5 min 10% B; caudal: 2 ml/min; temperatura de columna: 30 °C.
Para todos los reactantes o reactivos, cuya preparación no se explica en detalle a continuación, rige que fueron adquiridos comercialmente de fuentes de acceso general. Para todos los reactantes o reactivos, cuya preparación tampoco no se explica en detalle a continuación y que no fueron adquiridos comercialmente o se encuentran accesibles en general, se debe indicar una referencia publicada en la literatura, en la que se ha descrito su preparación.
Procedimiento 11 (CL-EM): Instrumento: sistema Waters ACQUITY SQD UPLC; columna: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 ,8 µ 30 x 2 mm; eluyente A: 1 I de agua + 0,25 mi de ácido fórmico al 99%; eluyente B: 1 I acetonitrilo + 0,25 mi de ácido fórmico al 99%; gradiente: 0,0 min 90% A ? 1 ,2 min 5% A? 2,0 min 5% A horno: 50 °C; caudal: 0,60 ml/min; detección UV: 208 - 400 nm.
Procedimiento 12 (HPLC): Equipo: Agilent 1200 Series con horno en columna y DAD; columna: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50 mm x 4,6 mm; N° de pedido: 1 ,51450,0001.
Columna previa: Merck Chromolith Guard Cartridge Kit RP-18e, 5 mm x 4,6 mm; N° de pedido: 1 ,51470,0001. Eluyente A: 70% HCI04 en agua (4 ml/litro), eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0,00 min 5% B? 0,50 min 5% B? 3,00 min 95% B? 4,00 min 95% B; caudal: 5 ml/min; temperatura de columna: 30 °C.
Compuestos de partida e intermedios: Compuesto de partida 1 Ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-(ferc.-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico (Boc-Dolaproína) El compuesto del título puede prepararse por distintas vías según instrucciones de la literatura, véase p. ej., Pettit et al., Synthesis 1996, 719; Shioiri et al., Tetrahedron Lett. 1991 , 32, 931 ; Shioiri et al., Tetrahedron 1993, 49, 1913; Koga et al., Tetrahedron Lett. 1991, 32, 2395; Vidal et al., Tetrahedron 2004, 60, 9715; Poncet et al., Tetrahedron 1994, 50, 5345. Se preparó ya sea como ácido libre o como sal 1 :1 con diciclohexilamina.
Compuesto de partida 2a Clorhidrato de terc.-butil-(3 ,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-(metilamino)heptanoato o (Dolaisoleucina-OtBu x HCI) El compuesto del título puede prepararse por distintas vías según instrucciones de la literatura, véase p. ej., Pettit et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 1796; Koga et al., Tetrahedron Lett. 1991 , 32, 2395; Shioiri et al., Tetrahedron Lett. 1991 , 32, 931 ; Shioiri etal., Tetrahedron 1993, 49, 1913.
Compuesto de partida 2b tere. -butil-(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-(metilamino)heptanoato (Dolaisoleucina-Oteu) El compuesto se preparó en analogía con el compuesto de partida 2a, pero la hidratación se realizó sin adición de ácido clorhídrico 1N.
Compuesto de partida 3 A/a-(terc.-butoxicarbonil)-A/-hidroxi-L-fenilalaninamida El compuesto del título se preparó según las instrucciones de la literatura (A. Ritter eí al., J. Org. Chem. 1994, 59, 4602).
Rendimiento: 750 mg (75% d. t.) CL-EM (Procedimiento 3): Rt = 1 ,67 min; EM (ESlpos): m/z = 281 (M+H)+.
Compuesto de partida 4 Clorhidrato de 1 ,2-oxazolidina El compuesto del título puede prepararse según las instrucciones de la literatura, véase p. ej., H. King, J. Chem. Soc. 1942, 432; también puede obtenerse en el mercado.
Compuesto de partida 5 Clorhidrato de 1 ,2-oxazinano El compuesto del título puede prepararse según las instrucciones de la literatura, véase p. ej., H. King, J. Chem. Soc. 1942, 432.
Compuesto de partida 6 2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-eno El compuesto del título puede prepararse en forma protegida por Boc según instrucciones de la literatura (véase p. ej., C. Johnson eí al., Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2059); la desprotección se realizó de manera usual mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético y posterior neutralización.
Rendimiento: 149 mg (89% d. t.).
Compuesto de partida 7 tere. -butil-[(1S,2R)-1-(hidroxicarbamoil)-2-fenilciclopropil]carbamato El compuesto del título se preparó según una instrucción de la literatura (A. Ritter et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 4602) a partir de ácido (1 S,2R)-1 -[(ferc. -butoxicarbonil)-amino]-2-fenilciclopropancarboxílico disponible en el mercado (C. Cativiela et al., Chirality W, 11 , 583).
Rendimiento: 339 mg (59% d. t.) CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,82 min; E (ESlpos): m/z = 293 (M+H)+.
Intermedio 1 ferc.-butil-(3R,4S,5S)-4-[{/\/-[(benciloxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metil-heptanoato 10,65 g (41 ,058 mmol) de terc.-butil-(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-(metilamino)-heptanoato (compuesto de partida 2b) se recogieron en 250 mi de diclorometano y la solución se enfrió a -10°C. Después se adicionaron bajo agitamiento 10,317 g (41 ,058 mmol) de N-[(benciloxi)carbonil]-L-valina, 16,866 g (61 ,586 mmol) de 2-bromo-1-etilpiridinio-tetrafluoroborato (BEP) así como 28,6 mi de N,N-diisopropiletilamina y la mezcla a continuación se agitó 20 h a TA. La mezcla de reacción después se diluyó con diclorometano y se extrajo por agitación dos veces con solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con petroléter/acetato de etilo 4:1 como eluyente. Se concentraron las correspondientes fracciones y el residuo se secó durante la noche al alto vacío. Se obtuvieron 10,22 g (51% d. t.) del compuesto del título como aceite amarillento.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,3 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,59 min; EM (ESlpos): m/z = 493 (M+H)+.
Intermedio 2 tere. -butil-(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoato 500 mg (1 mmol) de terc.-butil-(3R,4S,5S)-4-[{A/-[(benc¡loxi)carbonil]-L-valil}(metil)amino]-3-metoxi-5-metilheptanoato (Intermedio 1) se disolvieron en 50 mi de metanol y después de la adición de 100 mg de paladio al 10% sobre carbón activado se hidrogenó durante 1 h a TA bajo hidrógeno a presión normal. El catalizador después se separó por filtración y el disolvente se eliminó al vacío. Se obtuvieron 370 mg (cuant.) del compuesto del título como aceite prácticamente incoloro.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,59 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,74 min; EM (ESlpos): m/z = 359 (M+H)+.
Intermedio 3 /V-[(9/-/-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-/\/-[(3f?,4S,5S)-1-terc.-butox¡-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 4,64 g (13,13 mmol) de /V-[(9H-fluoren-9-¡lmetoxi)carbonil]-/N/-metil-L-valina se disolvieron en 20 mi de DMF y se mezcló sucesivamente se añadieron 4,28 g ( 1 ,94 mmol) de terc.-butil-(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]-heptanoato (Intermedio 2), 2,75 g (14,33 mmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida así como 2,2 g (14,33 mmol) de 1-hidroxi-1H-benzotriazol-hidrato. La mezcla se agitó durante la noche a TA. La mezcla de reacción después se vertió en una mezcla de solución de cloruro de amonio acuosa semi-saturada y acetato de etilo. Se separó la fase orgánica, se lavó sucesivamente con solución saturada de hidrocarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El residuo se usó directamente sin purificación posterior en la próxima etapa.
Rendimiento: 9,1 g (cuant., pureza del 60%) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,7 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,99 min; EM (ESlpos): m/z = 694 (M+H)+.
Intermedio 4 (Fmoc 3) A/-[(9W-fluoren-9-ilmetoxi)carbon¡l]-A/-metil-L-valil-A/-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-A/-metil-L-valinamida 9,1 g del producto en bruto A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbon¡l]-/V-metil-L-val¡l-/\/-[(3R,4S,5S)-1-íerc.-butoxi-3-metox¡-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-metil-L-valinam¡da (Intermedio 3) se recogieron en 56,6 mi de diclorometano, se mezclaron con 56,6 mi de ácido trifluoroacético y se agitó durante 2 h a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y se purificó el residuo restante mediante cromatografía flash, utilizándose como eluyente diclorometano, diclorometano/acetato de etilo 3:1 y diclorometano/acetato de etilo/metanol 15:5:0,5. Después de unificar las correspondientes fracciones y concentrar se obtuvieron 5,8 g (86% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 1 ,3 min; EM (ESlpos): m/z = 638 (M+H)+.
Intermedio 5 tere. -butil-[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-¡l)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]carbamato 500 mg (1 ,9 mmol) de A/-(terc.-butoxicarbonil)-L-fenilalanina se disolvieron en 10 mí de DMF y sucesivamente se añadieron 466 mg (3,8 mmol) de clorhidrato de 1 ,2-oxazinano (compuesto de partida 5), 433 mg (2,3 mmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 382 mg (2,8 mmol) de 1-hidroxi-1H-benzotriazol-hidrato así como 731 mg (5,7 mmol) de A/,A/-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante la noche a TA. La mezcla de reacción después se vertió en una mezcla de solución de cloruro de amonio acuosa semi-saturada y acetato de etilo. Se separó la fase orgánica, se lavó sucesivamente con solución saturada de hidrocarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. Se obtuvieron 620 mg (98% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,62 min; EM (ESlpos): m/z = 235 (M-C4H8-C02+H)+.
Intermedio 6 (2S)-2-amino-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-3-fenilpropan-1-on-trifluoroacetato CFgCOOH x 620 mg (1 ,85 mmol) de terc.-butil-[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]carbamato (Intermedio 5) se recogieron en 5 mi de diclorometano, se mezclaron con 10 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron durante 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo restante se liofilizó a partir de agua/acetonitrilo. De esta manera se obtuvieron 779 mg (91% d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 0,45 min; CL-EM (Procedimiento 3): Rt = 1 ,09 min; EM (ESlpos): m/z = 235 (M+H)+.
Intermedio 7 (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-A/-[(2S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida-trifluoroacetato 360 mg (1 ,25 mmol) de ácido (2f?,3R)-3-[(2S)-1-(íerc.-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico (compuesto de partida 1) se recogieron en 10 mi de DMF y sucesivamente se añadieron 579,2 mg (1 ,25 mmol) de (2S)-2-amino-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-3-fenilpropan-1-on-trifluoroacetato (Intermedio 6), 714,5 mg (1 ,88 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/V,A/',/\/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 655 µ? de A/,A/-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 16 h a TA. La mezcla de reacción después se concentró, el residuo se recogió en acetato de etilo y se extrajo por agitación primero con solución acuosa al 5% de ácido cítrico, después con solución acuosa al 5% de hidrocarbonato de sodio y a continuación se añadieron solución saturada de cloruro de sodio. Se concentró la fase orgánica y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con diclorometano/metanol 16:4 como eluyente. Se unificaron las correspondientes fracciones y el disolvente se eliminó al vacío. Después de secar el residuo al alto vacío se obtuvieron 503,5 mg (74% d. t.) del intermedio protegido con Boc terc.-butil-(2S)-2-[(1 2f?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]-pirrolidin-1 -carboxilato.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,12 min; EM (ESlpos): m/z = 504 (M+H)+. 503 mg (1 mmol) de este intermedio se recogieron en 20 mi de diclorometano, se mezclaron con 10 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y se destiló nuevamente con diclorometano. El residuo restante se extrajo por agitación del acetato de etilo con n-pentano, el disolvente se separó por decantación. El residuo así obtenido se disolvió en agua y se extrajo por agitación con acetato de etilo y a continuación se liofilizó la fase acuosa. De esta manera se obtuvieron 462 mg (89% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,53 min; CL-EM (Procedimiento 1 1): Rt = 0,57 min; EM (ESlpos): m/z = 404 (M+H)+.
Intermedio 8 /S/-(/erc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-A/-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-/V-metil-L-valinamida 51 mg (0,08 mmol) de /N/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/V-metil-L-valil-/\/-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-/\/-met¡l-L-valinamida (Intermedio 4) se disolvieron en 10 mi de DMF y se mezclaron con 0,5 mi de piperidina. Después de agitar 10 min a TA la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se mezcló con dietiléter. Los componentes insolubles se separaron por filtración y se lavaron varias veces con dietiléter. Después se recogió el residuo del filtro en 5 mi de dioxano/agua y la solución se ajustó con soda cáustica 1N a un valor de pH 1 1. Durante el tratamiento por ultrasonido se adicionaron en varias porciones en total 349 mg (1 ,6 mmol) de di-ferc.-butildicarbonato, manteniéndose el valor de pH de la solución en 11. Después de finalizada la reacción se eliminó el dioxano por evaporación y la solución acuosa se ajustó con ácido cítrico a un valor de pH de 2-3. Se extrajo dos veces cada vez con 50 mi de acetato de etilo. Se unificaron las fases orgánicas, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío. El residuo se recogió en dietiléter y el compuesto del título se extrajo por agitación con pentano. Mediante decantación se separó el disolvente. El residuo después se digirió varias veces más con pentano y finalmente se secó al alto vacío. Se obtuvieron así 40 mg (97% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,32 min; EM (ESIpos): m/z = 516 (M+H)+.
Intermedio 9 tere. -butil-(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-carboxilato El compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis de los intermedios 5, 6 y 7 en tres etapas mediante acoplamiento del ácido (1 S,2 )-1-[(ferc.-butoxicarbonil)amino]-2-fenilciclopropancarboxílico disponible en el mercado con clorhidrato de 1 ,2-oxazinano (compuesto de partida 5), la posterior desprotección con ácido trifluoroacético y el acoplamiento con el compuesto de partida 1. El producto final se purificó mediante HPLC preparativa.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,12 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,25 min; EM (ESlpos): m/z = 516 (M+H)+.
Intermedio 10 A/-[(9H-fluoren-9-ilmetox¡)carbonil]^ carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/N/-metil-L-valinamida 315 mg (0,494 mmol) de /V-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/N/-metil-L-valil-//-[(2f?,3S,4S)-1-carboxi-2-metox¡-4-met¡lhexan-3-¡l]-/\/-metil-L-valinamida (Intermedio 4) se disolvieron en 12 mi de DMF, se mezclaron con 104 mg (0,543 mmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida así como 83 mg (0,543 mmol) de 1-hidroxi-1 -/-benzotriazol-hidrato y se agitó 90 min a TA. A continuación se adicionaron 112 µ? de /V,/V-diisopropiletilamina así como 149 mg (0,494 mmol) de trifluoroaceto del ácido (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoico, que se había obtenido antes del compuesto de partida 1 mediante escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético. La mezcla se agitó 2 h a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó al someterlo dos veces a HPLC preparativa. Se obtuvieron 140 mg (35% d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,40 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,38 min; EM (ESlpos): m/z = 807 (M+H)+.
Intermedio 11 A/-[(benciloxi)carbonil]-/S/-metil-L-treonil-/\/-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metil-hexan-3-il]-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se liberó /V-[(benciloxi)carbonil]-/V-metil-L-treonina de 237 mg (0,887 mmol) de su sal diciclohexilamina mediante absorción en acetato de etilo y extracción por agitación con ácido sulfúrico acuoso al 5%. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El residuo se recogió en 16 mi de DMF y se mezcló sucesivamente con 365 mg (1 mmol) de terc.-butil-(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-[metil(L-valil)amino]heptanoato (Intermedio 2), 185 mg (0,967 mmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida así como 148 mg (0,967 mmol) de 1-hidroxi-1/-/-benzotriazol-hidrato. La mezcla se agitó 2 h a TA. La mezcla de reacción después se vertió en una mezcla de solución de cloruro de amonio acuosa semi-saturada y acetato de etilo, se separó la fase orgánica, se lavó sucesivamente con solución saturada de hidrocarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 283 mg (53% d. t.) del intermedio terc.-butiléster W-[(benc¡loxi)carbonil]-A/-metil-L-treonil-/\ -[(3R,4S,5S)-1 -tere. -butoxi-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,17 min. 283 mg (0,466 mmol) de este intermedio se recogieron en 5 mi de diclorometano, se mezclaron con 5 mi de ácido trifluoroacético anhidro y se agitó 2 h a TA. A continuación, la mezcla de reacción se concentró al alto vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 156 mg (61 % d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,50 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,09 min; EM (ESlpos): m/z = 552 (M+H)+.
Intermedio 12 /V-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolid¡n-2-il]propanoil}-L-fenilalaninat-trifluoroacetato de bencilo CFoCOOH x En el primer paso se liberó el compuesto de partida 1 desde 600 mg (1 ,28 mmol) de la correspondiente sal de diciclohexilamonio mediante la disolución de la sal en 100 mi de acetato de etilo y extracción por agitación primero con 50 mi de ácido sulfúrico al 0,5% y después con solución saturada de cloruro de sodio. Después de ello se secó la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtró, se concentró y de inmediato se transformó con L-fenilalaninato de bencilo análogamente a la síntesis del intermedio 7 y a continuación se desprotegió.
Rendimiento: 650 mg (94% en dos etapas) HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,76 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,68 min; EM (ESlpos): m/z = 425 (M+H)+.
Intermedio 13 (pS)-A/-{(2R,3f?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-p-metil-L-fenilalaninat-trifluoroacetato de bencilo En primer lugar se liberó el ácido (2f?,3f?)-3-[(2S)-1 -(tere. -butoxicarbonil)-pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico a partir de 351 mg (0,75 mmol) de la sal de diclicohexilamina (compuesto de partida 1) mediante absorción en acetato de etilo y extracción por agitación con solución acuosa al 5% de hidrosulfato de potasio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El residuo se recogió en 10 mi de DMF y se mezcló sucesivamente con 373 mg (0,75 mmol) de (pS)-p-metil-L-fenilalaninato de bencilo trifluoroacetato [preparado a partir de (pS)-/V-(terc. -butoxicarbonil)-p-metil-L-fenilalanina disponible en el mercado mediante la esterificación mediada con EDC/D AP con alcohol bencílico y posterior escisión del grupo de protección Boc con ácido trifluoroacético], 428 mg (1 ,125 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,A/,/\/',A/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 392 µ? de A/,A/-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó 20 h a TA. La mezcla de reacción después se vertió sobre una mezcla de solución de cloruro de amonio acuosa semi-saturada y acetato de etilo. Se separó la fase orgánica, se lavó sucesivamente con solución saturada de hidrocarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio y a continuación se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 230 mg (57% d. t.) del intermedio protegido con Boc ( S)-A/-{(2f?>3f?)-3-[(2S)-1-(ferc.-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoil}-p-metil-L-fen¡lalaninato de bencilo.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,3 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 1 ,36 min; EM (ESlpos): m/z = 539 (M+H)+. 230 mg (0,42 mmol) de este intermedio se recogieron en 5 mi de diclorometano, se mezclaron con 5 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo restante de la mezcla de reacción se continuó secando al vacío y después se liofilizó de acetonitrilo/agua. De esta manera se obtuvieron 230 mg (cuant.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,6 min.
Intermedio 14 A/-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-3^^ (1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin -1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida-trifluoroacetato x CF3COOH 143 mg (0,223 mmol) de / /-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/\/-met¡l-L-valil-/\/-[(2/?,3S,4S)-1 -carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-/V-metil-L-valinam¡da (Intermedio 4) se recogieron en 15 mi de DMF y se mezcló sucesivamente con 141 mg (0,22 mmol) de (2R,3/?)-3-metoxi-2-metil-/V-[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida-trifluoroacetato (Intermedio 7), 102 mg (0,27 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,/V,A/' A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 128 µ? (0,74 mmol) de A/,/V-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó 3 h a TA. La mezcla de reacción después se vertió en una mezcla de solución de cloruro de amonio acuosa semi-saturada y acetato de etilo. Se separó la fase orgánica, se lavó sucesivamente con solución saturada de hidrocarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. Se obtuvieron así 275 mg (cuant.) del intermedio protegido con Fmoc /S/-[(9/-/-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/ /-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]-pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-met¡l-L-valinamida.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,73 min; CL-EM (Procedimiento 4): Rt = 3,19 min; EM (ESlpos): m/z = 1023 (M+H)+. 46 mg (0,045 mmol) de este intermedio se disolvieron en 4 mi de DMF. Después de la adición de 1 mi de piperidina se agitó la mezcla de reacción 1 h a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (eluyente: acetonitrilo + 0,01% TFA / agua + 0,01% TFA). Se obtuvieron 22 mg (54% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,68 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,03 min; EM (ESlpos): m/z = 801 (M+H)+ 1H-RMN (600 MHz, DMSO-d6): d = 8,8 (m, 2H), 8,7 (m, 1H), 8,42 y 8,15 (2d, 1 H), 7,3-7,1 (m, 5H), 5,12 y 4,95 (2m, 1 H), 4,70 y 4,62 (2m, 1H), 4,62 y 4,50 (2t, 1 H), 4,1-3,9 (m, 3H), 3,85 (m, 1H), 3,75-3,6 (m, 2H), 3,23, 3,18, 3,17, 3,14, 3,02 y 2,96 (6s, 9H), 3,1-2,9 y 2,75 (2m, 2H), 2,46 (m, 3H), 2,4-2,1 (m, 2H), 2,05 (m ancho, 2H), 1 ,85-1 ,55 (m ancho, 6H), 1 ,5-1 ,2 (m ancho, 3H), 1 ,1-0,8 (m, 18H), 0,75 (t, 3H) [otras señales ocultas debajo del pico H2O].
Intermedio 15 W-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metox ^ {[(2S,3S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]-pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\-metil-L-valinamida-trifluoroacetato X CF3COOH 3 126 mg (0,198 mmol) de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/\/-metil-L-valil-A/-[(2R,3S,4S)-1 -carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 4) se recogieron en 10 mi de DMF y se mezcló sucesivamente con 105 mg (0,198 mmol) de (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-A/-[(2S,3S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilbutan-2-il]-3-[(2S)-p¡rrolid¡n-2-il]propanamida-trifluoroacetato (Intermedio 17), 41,6 mg (0,217 mmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 33 mg (0,217 mmol) de 1-hidroxi-1 -/-benzotriazol-hidrato así como 79 µ? (0,454 mmol) de /V,/V-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante la noche a TA. La mezcla de reacción después se vertió en una mezcla de solución de cloruro de amonio acuosa semi-saturada y acetato de etilo. Se separó la fase orgánica, se lavó sucesivamente con solución saturada de hidrocarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. Se obtuvieron así 220 mg (cuant.) del intermedio protegido con Fmoc A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-met¡l-L^^ 2-metil-3-{[(2S,3S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,77 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 1 ,5 min; EM (ESlpos): m/z = 1037 (M+H)+. 220 mg (0,212 mmol) de este intermedio se disolvieron en 5 mi de DMF. Después de la adición de 1 mi de piperidina se agitó la mezcla de reacción 1 h a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (eluyente: acetonitrilo + 0,01% TFA / agua + 0,01% TFA). Se obtuvieron 91 mg (46% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,71 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,9 min; EM (ESlpos): m/z = 815 (M+H)+ 1H-RMN (600 MHz, DMSO-d6): d = 8,87 y 8,80 (2d, 2H), 8,75 (m, 1H), 8,40 y 7,98 (2d, 1H), 7,3-7,1 (m, 5H), 5,45 y 5,2 (2t, 1H), 4,78 y 4,62 (2m, 1 H), 4,73 y 4,58 (2t, 1H), 4,2-4,0 (m, 3H), 3,7-3,6 (m, 1 H), 3,35, 3,20, 3,18, 3,14, 3,12 y 3,00 (6s, 9H), 3,1 y 2,95 (2m, 2H), 2,46 (m, 3H), 2,4-2,0 (m, 4H), 1 ,9-1 ,6 (m, 4H), 1 ,6-1,2 (m, 5H), 1 ,1-0,75 (m, 21 H), 0,80 (t, 3H) [otras señales ocultas debajo del pico H20].
Intermedio 16 /V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 ?,2f?)-1-metoxi-2-metil-3- {[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]-pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 617 mg (1 ,2 mmol) de terc.-butil-(2S)-2-[(1 R,2/?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopro (Intermedio 24) se recogieron en 44 mi de diclorometano, se mezclaron con 4,4 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo restante se liofilizó de dioxano/agua. Se obtuvieron 702 mg (cuant.) del compuesto desprotegido (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-/\/-[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida-trifluoroacetato como producto en bruto, que se usó sin purificación adicional en la siguiente etapa. 470 mg (0,74 mmol) de A/-[(9W-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-/\/-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-/\/-metil-L-valinamida (Intermedio 4) se recogieron en 57 mi de DMF y sucesivamente se añadieron 390 mg (ca. 0,74 mmol) de del antes obtenido (2f?,3R)-3-metoxi-2-metil-A/-[(1 S,2f?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]-3-[(2S)-pirroN 336 mg (0,88 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1 -il)-/N/,/V,A/',/\/-tetrametiluronio-hexafluoro-fosfato (HATU) así como 423 µ? (2,4 mmol) de /V,/V-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó 2 h a TA. La mezcla de reacción después se vertió en una mezcla de solución de cloruro de amonio acuosa semi-saturada y acetato de etilo. Se separó la fase orgánica, se lavó sucesivamente con solución saturada de hidrocarbonato de sodio y solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 453 mg (59% d. t.) del intermedio protegido con Fmoc /N/-[(9H-fluoren-9-il-metoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-A -[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2 )-1-metoxi- 2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino} -3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-W-metil-L-val¡namtí HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,58 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 3,10 min; EM (ESIpos): m/z = 1035 (M+H)+. 453 mg (0,438 mmol) de este intermedio se disolvieron en 24 mi de DMF. Después de la adición de 2,4 mi de piperidina se agitó la mezcla de reacción 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (eluyente: acetonitrilo / 0,1% TFA en agua). Se obtuvieron 260 mg (64% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora. HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,64 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 813 (M+H)+ 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6): d = 8,8 (m, 2H), 8,65 (m, 2H), 7,3-7,1 (m, 5H), 4,8-4,05 (m, 2H), 4,0 y 3,82 (2m, 2H), 3,8-3,5 (m, 8H), 3,32, 3,29, 3,20, 3,19, 3,12 y 3,00 (6s, 9H), 2,65 (t, 1H), 2,5-2,45 (m, 3H), 2,4-1,3 (m, 15H), 1 ,15-0,85 (m, 18H), 0,8 y 0,75 (2d, 3H) [otras señales ocultas debajo del pico H20).
Intermedio 17 W-bencil-A/-metil-L-fenilalaninamida-trifluoroacetato 1000 mg (3,77 mmol) de A/-(íerc.-butoxicarbonil)-L-fenilalanina se disolvieron en 10 mi de DMF y se mezclaron con 457 mg (3,77 mmol) de /V-metilbencilamina, 2150 mg (5,65 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,/\/,/V',A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 657 µ? de ?/,/V-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA y a continuación se concentró al vacío. El residuo se recogió en diclorometano y se extrajo tres veces agitando con agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con petroléter/acetato de etilo 3:1 como eluyente. Las fracciones del producto se concentraron y el residuo se secó al alto vacío. Se obtuvieron así 1110 mg (75% d. t.) del intermedio protegido con Boc A/-bencil-/Va-(íerc.-butoxicarbonil)-//-metil-L-fenilalaninamida.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,14 min; EM (ESlpos): m/z = 369 ( +H)+. 1108 mg (3,007 mmol) de este intermedio se recogieron en 30 mi de diclorometano, se mezclaron con 10 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío, el residuo restante se mezcló con diclorometano y el disolvente se eliminó por filtración. El residuo se mezcló dos veces más con pentano, el disolvente en cada caso se separó nuevamente por decantación y el compuesto del título finalmente se secó al alto vacío. Se obtuvieron así 1075 mg (93% d. t.) del compuesto del título como una resina.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,6 min; EM (ESlpos): m/z = 269 (M+H)+.
Intermedio 18 A/-bencil-A/a-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-A/-metil-L-fenil-alaninamida-trifluoroacetato En primer lugar se liberó el ácido (2R,3/:?)-3-[(2S)-1-(ferc.-butoxicarbonil)-pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico (compuesto de partida 1) de 141 mg (0,491 mmol) de su sal de diclicohexilamina mediante absorción en acetato de etilo y extracción por agitación con ácido sulfúrico acuoso al 5%. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El residuo se recogió en 10 mi de DMF y se mezcló con 187,6 mg (0,49 mmol) de A-bencil-/V-metil-L-fenilalaninamida-trifluoroacetato (Intermedio 9), 190,3 mg (1 ,47 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)- ?/,?/,?/',/V'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 256 µ? de ?,?-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó 1 h a TA. La mezcla de reacción después se concentró, el residuo se recogió en acetato de etilo y la solución se extrajo sucesivamente por agitación con solución saturada de cloruro de amonio, solución saturada de hidrocarbonato de sodio y agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía flash en gel de sílice con acetonítrilo/agua 30:1 como eluyente. Las fracciones del producto se concentraron y el residuo se secó al alto vacío. Se obtuvieron así 168 mg (64% d. t.) del Intermedio protegido con Boc terc.-butil-(2S)-2-[(1 f?,2R)-3-({(2S)-1-[bencil-(metil)amino]-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il}amino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]p¡rrol¡din-1 -carboxilato.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,22 min; EM (ESlpos): m/z = 538 (M+H)+. 168 mg (0,312 mmol) de este intermedio se recogieron en 15 mi de diclorometano, se mezclaron con 3 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo restante se mezcló primero con diclorometano, después se mezcló con dietiléter y el disolvente en cada caso se eliminó nuevamente por filtración. Después de secar al alto vacío se obtuvieron 170 mg (99% d. t.) del compuesto del título como una resina.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,73 min; EM (ESlpos): m/z = 438 (M+H)+.
Intermedio 19 A/-{(2R,3f?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninat-trifluoroacetato de metilo El compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis del Intermedio 18 a partir de ácido (2/?,3f?)-3-[(2S)-1-(ferc.-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico (compuesto de partida 1) que se liberó de la sal de diciclohexilamina, y clorhidrato de metil-L-fenilalaninato.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 0,6 min; CL-EM (Procedimiento 3): Rt = 1 ,17 min; EM (ESlpos): m/z = 349 (M+H)+.
Intermedio 20 A/-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-triptofanat-trifluoroacetato de bencilo El compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 18 a partir de ácido (2f?,3f?)-3-[(2S)-1-(íerc.-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metox¡-2-metilpropanoico (compuesto de partida 1), que se liberó de la sal de diciclohexilamina, y L-triptofanato de bencilo.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,8 min; EM (ESlpos): m/z = 464 (M+H)+.
Intermedio 21 (1S,2R)-1-({(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}amino)-2^ fenilciclopropancarboxilato-trifluoroacetato de bencilo El compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 18 a partir de ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-(íerc.-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico (compuesto de partida 1), que se liberó de la sal de diciclohexilamina, y (1S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropancarboxilato de bencilo, (1 S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropancarboxilato de bencilo o se preparó anteriormente según procedimientos estándar mediante la esterificación de ácido (1S,2f?)-1-[(terc-butoxicarbonil)amino]-2-fenilciclopropancarboxílico disponible en el mercado con alcohol bencílico y posterior escisión de Boc con ácido trifluoroacético.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,5 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 0,93 min; EM (ESlpos): m/z = 437 (M+H)+.
Intermedio 22 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 -/-pirrol-1-il)-N'-metilhexanhidrazid-trifluoroacetato 100 mg (473 pmol) de ácido 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoico se disolvieron en 71 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 139 mg (947 pmol) de terc.-butil-1-metilhidrazincarboxilato, 182 mg (947 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimet¡laminopropil)-3-etilcarbodiimida y 145 mg (947 pmol) de 1-hidroxi-1H-benzotriazol-hidrato. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización a partir de dioxano/agua se obtuvieron 129 mg (80% d. t.) del intermedio protegido en forma de espuma incolora.
A continuación se desbloquearon los 129 mg (380 pmol) de con 2 mi de ácido trifluoroacético en 8 mi de diclorometano. Después de agitar 1 h a TA la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se liofilizó con acetonitrilo/agua y resultaron 125 mg (83% d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora. CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,38 min; EM (ESlpos): m/z = 240 (M+H)+ Intermedio 23 N-(2-aminoetil)-4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-met¡lbutanamida-trifluoroacetato En primer lugar se reunieron 35 mg (164 pmol) de trifluoroacetato clorhidrato de terc -butil-[2-(metilamino)etil]carbamato, 30 mg (164 µ????) de ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 W-pirrol-1-il)butanoico, 75 mg (197 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-?/,?/,?/',?/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 57 µ? de /V-diisopropiletilamina en 5 mi de DMF y se agitó durante la noche a TA. A continuación se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se concentraron las correspondientes fracciones y mediante liofilización a partir de dioxano/agua se obtuvieron 35 mg (63% d.t.) del intermedio protegido.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,71 min; EM (ESlpos): m/z = 340 (M+H)+.
A continuación se desbloqueó la cantidad total del intermedio protegido con 1 mi de ácido trifluoroacético en 5 mi de diclorometano, obteniéndose 28 mg (77% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 3): Rt = 0,75 min; EM (ESlpos): m/z = 240 (M+H)+.
Intermedio 24 4-(2,5dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-[2-(metilamino)etil]butanamida-trifluoroacetato En primer lugar se reunieron 35 mg (164 µ?t???) de trifluoroacetato de clorhidrato de terc.-butil-(2-aminoetil)metilcarbamato, 30 mg (164 pmol) de ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)butanoico, 75 mg (197 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)- ?/,?/,?/',?/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 57 µ? de ?,?-diisopropiletilamina en 5 mi de DMF y se agitaron 30 min a TA. A continuación se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se concentraron las correspondientes fracciones y mediante liofilización a partir de dioxano/agua se obtuvieron 51 mg (91% d.t.) del intermedio protegido.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,6 min; CL-E (Procedimiento 1): Rt = 0,77 min; EM (ESlpos): m/z = 340 (M+H)+.
A continuación se desprotegió la cantidad total con 1 mi de ácido trifluoroacético en 5 mi de diclorometano, obteniéndose 45 mg (69% d.t.) del compuesto del título, CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,19 min; EM (ESlpos): m/z = 240 (M+H)+.
Intermedio 25 (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoato-trifluoroacetato de bencilo En primer lugar se liberó el ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-(ferc.-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico de 1 ,82 g (3,88 mmol) de su sal de diclicohexilamina mediante absorción en 150 mi de acetato de etilo y extracción por agitación con 100 mi de ácido sulfúrico al 0,5%. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El residuo se recogió en 10 mi de dioxano y 10 mi de agua y se mezcló con 1517 mg (4,66 mmol) de carbonato de cesio, se trató 5 min en el baño de ultrasonido y a continuación se concentró al vacío y se destiló una vez más con DMF. El residuo después se recogió en 15 mi de DMF y se mezcló con 1990 mg (11,64 mmol) de bromuro de bencilo. La mezcla se trató 15 min en el baño de ultrasonido y a continuación se concentró al vacío. El residuo se distribuyó entre acetato de etilo y agua, se separó la fase orgánica y se extrajo por agitación con solución saturada de cloruro de sodio y a continuación se concentró. El residuo se purificó después mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 1170 mg (80% d. t.) del intermedio protegido con Boc.
A continuación se desprotegieron estos 1170 mg de inmediato con 5 mi de ácido trifluoroacético en 15 mi de diclorometano. Después de agitar 15 min a TA la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se liofilizó con dioxano. Después del secado al alto vacío resultaron 1333 mg (84% d.t.) del compuesto del título como aceite de color amarillo.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,5 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,59 min; EM (ESlpos): m/z = 278 (M+H)+.
Intermedio 26 A/-(ferc.-butoxicarbon¡l)-/V-^ metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 1200 mg (2,33 mmol) de W-(ferc.-butoxicarbonil)-/\/-metil-L-valil-/v-[(2f?,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 5) se reunieron con 910,8 mg (2,33 mmol) de (2f?,3/?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoato-trifluoroacetato de bencilo (Intermedio 14), 1327 mg (3,49 mmol) de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,A/,/V',A/'-tetramet¡luronio-hexafluorofosfato y 2027 µ? de N,N-diisopropiletilamina en 50 mi de DMF y se agitaron 5 min a TA. Posteriormente se eliminó el disolvente al vacío. El residuo restante se recogió en acetato de etilo y se extrajo sucesivamente por agitación con una solución acuosa al 5% de ácido cítrico y solución saturada de hidrocarbonato de sodio. Se separó la fase orgánica y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se reunieron las fracciones del producto, se concentraron y el residuo se secó al alto vacío. Se obtuvieron así 1000 mg (55% d. t.) del intermediario benciléster W-(ferc.-butox¡-carbonil)-A/-metil-L-valil-^ metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-val^ amida como una resina .
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,56 min; EM (ESIpos): m/z = 775 (M+H)+.
La cantidad total obtenida de este intermedio se recogió en 25 mi de una mezcla de metanol y diclorometano (20:1) y el grupo benciléster se eliminó por hidrogenación bajo hidrógeno a presión normal con 10% paladio sobre carbón activado como catalizador. Después de agitar durante 30 min a TA el catalizador se eliminó por filtración y el filtrado se concentró al vacío. Se obtuvieron 803 mg (91 % d. t.) del compuesto del título como sólido de color blanco.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,24 min; EM (ESlpos): m/z = 685 (M+H)+.
Intermedio 27 (1 S,2R)-1-amino-2-fenil-/N/-propilciclopropancarboxamida-trifluoroacetato El compuesto del título se preparó mediante acoplamiento del ácido (1 S,2f?)-1-[(ferc.-butoxicarbonil)amino]-2-fenilciclopropancarboxílico disponible en el mercado con n-propilamina en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,/ /,/\/' A/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) y posterior escisión de Boc con ácido trifluoroacético (Resultante 85% d. t. en ambas etapas).
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,2 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,52 min; EM (ESlpos): m/z = 219 (M+H)+.
Intermedio 28 (1 S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropancarboxilato-trifluoroacetato de etilo El compuesto del título se preparó según procedimientos estándar mediante la esterificación del ácido (1 S,2R)-1-[(íerc.-butoxicarbonil)amino]-2-fenil-ciclopropancarboxílico disponible en el mercado con etanol y posterior escisión de Boc con ácido trifluoroacético.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,50 min; EM (ESlpos): m/z = 206 (M+H)+.
Intermedio 29 Ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-2,2-dimetilbutanoico A una solución de 1 ,39 g (8,95 mmol) de N-metoxicarbonilmaleinimida en 44 mi de solución saturada de hidrocarbonato de sodio se adicionaron a 0 °C 1 ,5 g (8,95 mmol) de ácido 4-amino-2,2-dimetilbutírico y se continuó agitando 40 min A continuación se eliminó el baño de enfriamiento y la mezcla de reacción se continuó agitando 1 h. Bajo enfriamiento con hielo, se ajustó la mezcla de reacción después mediante la adición de ácido sulfúrico al valor de pH 3 y se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas reunidas se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron. Se obtuvieron 1 ,17 g (al 79%, 49% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,64 min; m/z = 212 (M+H)+.
Intermedio 30 tere. -butil-2-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-2,2-dimetilbutanoil]-hidrazincarboxilato A una solución de 50 mg (237 µ?t???) de ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-2,2-dimetilbutanoico en 2 mi de THF se adicionaron a 0 °C primero 26 µ? (237 µ?p??) de 4-metilmorfolina y a continuación 31 µ? (237 µ????) de isobutilcloroformiato. Después de retirar el baño de enfriamiento y 15 min de agitación posterior a TA se adicionaron 31 ,3 mg (237 µ????) de terc.-butiloxicarbonilhidrazida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y a continuación se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 50,8 mg (66% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,71 min; m/z = 324 (M-H)".
Intermedio 31 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-2,2-dimetilbutanhidrazid-trifluoroacetato 50 mg (154 mmol) de terc.-butil-2-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-p¡rrol-1-¡l)-2,2-dimetil-butanoil]hidrazincarboxilato se disolvieron en 2 mi de diclorometano y se mezclaron con 0,4 mi de ácido trifluoroacético. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA y a continuación se concentró. Se obtuvieron 55,2 mg (93% de pureza, 99% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,36 min; m/z = 226 (M+H)+.
Intermedio 32 Adamantan-1-ilmetil-A/-(terc.-butoxicarbonil)-L-fenilalaninato A una solución de 500 mg (1 ,89 mmol) de /V-Boc-L-fenilalanina en 25 mi de diclorometano se adicionaron a TA 1192 mg (6,2 mmol) de EDC, 578 µ? (4,1 mmol) de trietilamina, 345 mg (2,8 mmol) de DMAP y 345 mg (2,1 mmol) de 1-adamantilmetanol. La mezcla de reacción se agitó durante la noche, después se diluyó con 50 mi de diclorometano y se lavó sucesivamente con solución acuosa al 10% de ácido cítrico, agua y solución saturada de cloruro de sodio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, a continuación se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 769 mg (90% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,84 min; m/z = 414 (M+H)+.
Intermedio 33 Clorhidrato de adamantan-1-ilmetil-L-fenilalaninato 769 mg (1 ,86 mmol) de adamantan-1-ilmetil-N-(ferc.-butoxicarbonil)-L-fenilalaninato (Intermedio 13) se disolvieron en 25 mi de una solución 4 N de cloruro de hidrógeno en dioxano y se agitó 1 h a TA. A continuación se concentró la mezcla de reacción y el residuo se secó al vacío. Se obtuvieron 619 mg (95% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,82 min; m/z = 314 (M+H)+.
Intermedio 34 A/-(ferc.-butoxicarbon^ (adamantan-1 -ilmetoxi)-1 -???-3-fenilpro pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam A una solución de 20 mg (29 µ?t???) de /V-(ierc.-butoxicarbonil)-/S/-metil-L-valil-W-[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 ?,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi^ metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida en 1 mi de DMF se adicionaron a TA 15,3 µ? (88 pmol) de /V,/V-diisoprop¡letilamina, 6,7 mg (44 pmol) de HOBt y 6,7 mg (35 pmol) de EDC y la mezcla se agitó durante 30 min a continuación se adicionaron 10,1 mg (32 pmol) de clorhidrato de adamantan-1 -il-L-fenilalaninato. Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se separó directamente en sus componentes mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 27,5 mg (93% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,70 min; m/z = 980 (M+H)+.
Intermedio 35 /V-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 f?,2R)-3-{[(2S)-1 -(adamantan-1 -ilmetoxi)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/S/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 27,5 mg (28 pmol) de A/-(íerc.-butoxicarbonil)-A-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1 f?,2f?)-3-{[(2S)-1 -(adamantan-1 -ilmetox¡)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida se disolvieron en 1 ,8 mi de diclorometano y se mezclaron con 361 µ? de TFA. La mezcla de reacción se agitó 30 min y después se concentró. El residuo se recogió en agua y se liofilizó. Se obtuvieron 22,7 mg (81% d. t.) del compuesto del título.
CL-E (Procedimiento 1): Rt = 1 ,14 min; m/z = 880 (M+H)+.
Intermedio 36 tere. -butil-[(2S)-1-(benciloxi)-3-fenilpropan-2-il]carbamato Bajo atmósfera de argón se disolvieron 500 mg (1 ,99 mmol) de W-Boc-L-fenilalaninol en 5 mi de DMF y se enfrió 0 °C. A continuación se adicionaron 159 mg (3,98 mmol) de una suspensión al 60% de hidruro de sodio en aceite de parafina. La mezcla de reacción se agitó hasta que no se produjo más gas y a continuación se mezcló con 260 µ? (2,19 mmol) de bromuro de bencilo. Se retiró el baño de enfriamiento y la mezcla de reacción se agitó 2 h a TA. Posteriormente se concentró la mezcla de reacción, el residuo se recogió en agua helada y se extrajo la mezcla con diclorometano. La fase orgánica se lavó con solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 226 mg (33% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,28 min; m/z = 342 (M+H)+.
Intermedio 37 Clorhidrato de (2S)-1-(benciloxi)-3-fenilpropan-2-amina x HCI 220 mg (644 µ?t???) de terc.-butil-[(2S)-1-(benciloxi)-3-fenilpropan-2-il]carbamato se disolvieron en 11 mi de una solución 4 N de cloruro de hidrógeno en dioxano y se agitó 1 h a TA. Después se concentró la mezcla de reacción y el residuo se secó al vacío. Se obtuvieron 138 mg (77% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,65 min; m/z = 242 (M+H)+.
Intermedio 38 A/-(terc.-butoxicarbonil)-/V-m^^ (benciloxi)-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida A una solución de 20 mg (29 pmol) de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A-metil-L-valinamida en 1 mi de DMF se adicionaron a TA 15,3 µ? (88 pmol) de ?/,/V-diisopropiletilamina, 6,7 mg (44 µ????) de HOBt y 6,7 mg (35 pmol) de EDC y la mezcla se agitó durante 30 min A continuación se añadieron 7,8 mg (32 pmol) de clorhidrato de (2S)-1-(benciloxi)-3-fenilpropan-2-amina. Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se separó directamente en sus componentes mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 26 mg (98% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,51 min; m/z = 909 (M+H)+.
Intermedio 39 A/-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(benciloxi)-3-fenilpropan- 2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrol^ 4-il]-/V-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 26 mg (29 µp???) de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-/V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2f?)-3-{[(2S)-1-(benciloxi)-3-fenilpropan-2-il]am oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-^^ se disolvieron en 1 ,8 mi de dicloro-metano y se mezclaron con 370 µ? de TFA. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA y a continuación se concentró. El residuo se recogió en agua y se liofilizó. Se obtuvieron 26,4 mg (cuant.) del compuesto del título. CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,97 min; m/z = 809 (M+H)+.
Intermedio 40 N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 50 mg (70 µp???) de del intermedio 26 y 1 1 mg (70 µ????) de (1S, 2R)-2-amino-1-fenilpropan-1-ol en 10 mi de DMF se mezclaron con 42 mg (0,11 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-l-i -N.N.N'.N'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 25 µ? de N,N- düsopropiletilamina y la mezcla de reacción se agitó 5 min a TA. A continuación se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de unificar las correspondientes fracciones, concentrar y secar al alto vacío se obtuvieron 49 mg (81%) del intermedio protegido. A continuación se separó el grupo Boc según las condiciones conocidas con ácido trifluoroacético en diclorometano. Después de concentrar se realizó la purificación del compuesto del título mediante HPLC preparativa y se obtuvieron 26 mg (52%) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1,65 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,77 min; EM (ESlpos): m/z = 718 (M+H)+.
Intermedio 41 Trifluoroacetato del ácido 3-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}propanoico X CF3COOH 150 mg (541 pmol) de terc.-butil-3-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}propanoato se disolvieron en 3 mi de diclorometano, se mezclaron con 1 ,5 mi de ácido trifluoroacético y se agitó 1 h a TA, a continuación se concentró la mezcla de reacción.
Se obtuvieron 181 mg (100% d.t.) de producto.
EM (El): m/z 222 (M+H)+ Intermedio 42 Ácido 3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etox¡]etox¡}etoxi)propanoico 186 mg (555 µ?t???) de trifluoroacetato de ácido 3-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}propanoico se disolvieron en 2,6 mi de solución saturada de hidrocarbonato de sodio y se mezclaron a 0 °C con 86 mg (555 pmol) de N-metoxicarbonilmaleinimida. La mezcla de reacción se agitó 40 min a 0 °C y 1 h a TA, después se enfrió nuevamente a 0 °C, se ajustó con ácido sulfúrico al valor de pH 3 y se extrajo 3x con 25 mi de acetato de etilo. Las fases orgánicas reunidas se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron.
Se obtuvieron 126 mg (75% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,53 min; m/z = 302 (M+H)+.
Intermedio 43 íerc.-butil-15-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-4-oxo-7,10,13-trioxa-2,3-diazapentadecan-1 -oato 125 mg (417 pmol) de ácido 3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanoico se disolvieron a 0 °C en 2,1 mi de THF y se mezclaron con 46 µ? (417 mmol) de 4-metilmorfolina y 54,5 µ? (417 pmol) de isobutilcloroformiato. Se retiró el baño helado y la mezcla de reacción se agitó 30 min a TA. A continuación se adicionaron a 0 °C 55 mg (417 pmol) de terc- butiloxicarbonilhidrazida. La mezcla de reacción se calentó durante la noche a TA, se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron 60 mg (33% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,66 min; m/z = 416 (M+H)+.
Intermedio 44 3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)propanhidrazid-trifluoroacetato 60 mg (145 pmol) de terc.-but¡l-15-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)-4-oxo-7,10,13-trioxa-2,3-diazapentadecan-1-oato se disolvieron en 1 mi de diclorometano y se mezclaron con 0,2 mi de ácido trifluoroacético. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA y a continuación se concentró.
Se obtuvieron 62 mg (100% d.t.) de producto.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,35 min; m/z = 316 (M+H)+. intermedio 45 (1 S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropancarboxilato-trifluoroacetato de bencilo El compuesto del título se preparó según procedimientos estándar mediante la esterificación del ácido (1 S,2f?)-1 -[(tere. -butoxicarbonil)amino]-2-fenil- ciclopropancarboxílico disponible en el mercado con alcohol bencílico y posterior escisión de Boc con ácido trifluoroacético.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,72 min; EM (ESlpos): m/z = 268 (M+H)+.
Intermedio 46 A/-(ferc.-butoxicarbonil)-W-met^ carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 383 mg (0,743 mmol) de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-/\/-metil-L-valil-/V-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-A-metil-L-valinamida (Intermedio 8) se reunieron con 485 mg (0,743 mmol) de A/-{(2f?,3f?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninato de bencilo trifluoroacetato (Intermedio 12), 424 mg (1 ,114 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,A/,/\/',/\/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 388 µ? de /V,/V-diisopropiletilamina en 15 mi de DMF y se agitó 10 min a TA. A continuación se eliminó el disolvente al vacío. El residuo restante se recogió en acetato de etilo y se extrajo sucesivamente por agitación con solución acuosa al 5% de ácido cítrico y solución saturada de hidrocarbonato de sodio. Se separó la fase orgánica, se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se reunieron las fracciones del producto, se concentró y el residuo se secó al alto vacío. Se obtuvieron 335 mg (48% d. t.) del intermediario benciléster en forma de espuma.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,49 min; EM (ESlpos): m/z = 922 (M+H)+. 100 mg (0,11 mmol) de este intermedio se recogieron en 15 mi de metanol y el grupo benciléster se eliminó por hidrogenación bajo hidrógeno a presión normal con 10% paladio sobre carbón activado como catalizador. Después de agitar 1 h a TA el catalizador se eliminó por filtración y el filtrado se concentró al vacío. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 85 mg (94% d. t.) del compuesto del título en forma de sólido.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,4 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,24 min; EM (ESlpos): m/z = 832 (M+H)+.
Intermedio 47 A/-bencil-L-triptofanamida-trifluoroacetato 202 mg (0,5 mmol) de 2,5-dioxopirrolidin-1-il-/V-(terc.-butoxicarbonil)-L-triptofanato y 45 mg (0,42 mmol) de bencilamina se disolvieron en 10 mi de DMF y se mezclaron con 110 µ? (630 mol) de A/,A/-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó 3 h a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol/17% ac. amoníaco 20:0,5:0,05). Se unificaron las correspondientes fracciones y se concentró. El residuo resultante se digirió con dietiléter y después se secó al alto vacío. A continuación se recogió este residuo en 10 mi de diclorometano y se mezcló con 3 mi de ácido trifluoroacético anhidro. Después de agitar 45 min a TA se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de secar al alto vacío se obtuvieron 117 mg (57% d. t. en ambas etapas) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,66 min; EM (ESlpos): m/z = 294 (M+H)+.
Intermedio 48 (1 S,2/?)-1-amino-2-fenilciclopropancarboxamida-trifluoroacetato 50 mg (180 µ?t???) de ácido (1 S,2R)-1-[(terc.-butoxicarbonil)amino]-2-fenilciclo-propancarboxílico disponible en el mercado se disolvieron en 5 mi de DMF, se mezclaron con 94 µ? (541 pmol) de W./V-diisopropiletilamina, 31 mg (270 µ????) de N-hidroxisuccinimida así como 41 ,5 mg (216 pmol) de EDC y a continuación se agitó durante la noche a TA. La mezcla de reacción después se concentró, el residuo se recogió en dioxano, se mezclaron con 71 mg (901 µ?t???) de hidrocarbonato de amonio y la mezcla de reacción después se dejó 3 días en reposo a TA. La mezcla de reacción después se diluyó con una mezcla 1 :1 de acetato de etilo y agua. Se separó la fase orgánica, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró. El residuo resultante a continuación se recogió en 3 mi de diclorometano y se mezcló con 3 mi de ácido trifluoroacético anhidro. Después de agitar 1 h a TA se concentró. El residuo se mezcló con pentano, se aspiró y se liofilizó con dioxano. De esta manera se obtuvieron 32 mg (62% d. t. en ambas etapas) del compuesto del título. HPLC (Procedimiento 6): Rt = 0,38 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,20 min; EM (ESlpos): m/z = 177 (M+H)+.
Intermedio 49 A/a-{(2/?,3f?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-triptofanamida-trifluoroacetato El compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 13 a partir del compuesto de partida 1 y clorhidrato de L-triptofanamida.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,4 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,92 min; EM (ESlpos): m/z = 473 (M+H)+.
Intermedio 50 4-nitrofenil-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]carbamato 813 mg (3,1 mmol) de trifenilfosfina se disolvieron en 25 mi de THF y bajo argón se enfriaron a -70 °C. Después de la adición gota a gota de 627 mg (3,1 mmol) de diisopropilazodicarboxilato se agitó la mezcla 5 min A continuación se adicionan gota a gota 500 mg (3,1 mmol) de terc.-butil-(2-aminoetil)carbamato disuelto en 5 mi de THF y la mezcla de reacción se agita otros 5 min a -70 °C. Después se adicionaron 136,6 mg (1 ,55 mmol) de 2,2 dimetil-1 -propanol disueltos en 1 mi de THF así como 301 mg (3,1 mmol) de maleinimida, la mezcla de reacción se agitó otros 10 min a -70 °C y a continuación se calentó a TA. Después de agitar otras 16h a TA se eliminó el disolvente al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 463 mg (62%) del intermedio protegido.
Después de eliminar el grupo de protección Boc en condiciones estándar se obtuvieron 652 mg de 1-(2-aminoetil)-1H-pirrol-2,5-diona como trifluoroacetato. 112,9 mg (543 µ?t???) de nitrofeniléster de ácido clorofórmico se disolvieron en 30 mi de THF y después de la adición de 100 mg (271 ,6 pmol) de 1-(2-aminoetil)-1/-/-pirrol-2,5-dion-trifluoroacetato se agitaron 30 min a TA. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró a sequedad y a continuación se suspendió con dietiléter. Después de aspirar y secar se obtuvieron 60 mg (95% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 0,65 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,74 min; EM (ESIpos): m/z = 306 (M+H)+.
Intermedio 51 (íS)-2-fenil-1-(5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-il)etanamin-trifluoroacetato 200 mg (0,75 mmol) de N-(ferc. -butoxicarbonil)-L-fenilalanina se presentaron a 0 °C en 5,5 mi de diclorometano y se mezclaron con 128 mg (0,79 mmol) de 1 ,1'-carbonildiimidazol. Después de 30 min se adicionaron 103 mg (0,75 mmol) de benzoilhidrazida. Después de otros 45 min a 0 °C finalmente se añadieron 500 mg (1 ,5 mmol) de tetrabromuro de carbono y 395 mg (1 ,5 mmol) de trifenilfosfina. La mezcla de reacción se agitó primero 2 h a 0 °C y después durante la noche a TA. La mezcla a continuación se concentró en el evaporador rotativo y el residuo se secó al alto vacío. El producto en bruto así obtenido se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 217 mg (78% d. t.) del intermedio protegido con Boc terc.-butil-[(1S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]carbamato.
CL-EM (Procedimiento 12): Rt = 1 ,15 min; EM (ESlpos): m/z = 366 (M+H) * 217 mg (0,59 mmol) de este intermedio se recogieron en 3 mi de diclorometano, se mezclaron con 0,6 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo restante de la mezcla de reacción se continuó secando al vacío y después se liofilizó con dioxano. De esta manera se obtuvieron 214 mg (90% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,62 min; EM (ESlpos): m/z = 266 (M+H) + Intermedio 52 (7R)-2-fenil-1-(5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-il)etanamin-trifluoroacetato 200 mg (0,75 mmol) de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-D-fenilalanina se presentaron a 0 °C en 5,5 mi de diclorometano y se mezclaron con 128,3 mg (0,79 mmol) de 1 ,1'-carbonildiimidazol. Al cabo de 30 min se adicionaron 103 mg (0,75 mmol) de benzoilhidrazida. Al cabo de otros 45 min a 0 °C finalmente se adicionaron 500 mg (1 ,5 mmol) de tetrabromuro de carbono y 395 mg (1 ,5 mmol) de trifenilfosfina. La mezcla de reacción se agitó primero 2 h a 0 °C y después durante la noche a TA. La mezcla se concentró a continuación en el evaporador rotativo y el residuo se secó al alto vacío. El producto en bruto así obtenido se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 219 mg (80% d. t.) del intermedio protegido con Boc terc.-butil-[(1 R)-2-fenil-1 -(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]carbamato.
CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,36 min; EM (ESlpos): m/z = 366 (M+H) + 219 mg (0,6 mmol) de este intermedio se recogieron en 3 mi de diclorometano, se mezclaron con 0,6 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo restante de la mezcla de reacción se continuó secando al vacío y después se liofilizó con dioxano. De esta manera se obtuvieron 196 mg (86% d. t.) del compuesto del título en forma de sólido.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,41 min Intermedio 53 (2S)-1-(bencilsulfonil)-3-fenilpropan-2-amina 200 mg (1 ,13 mmol) de (4S)-4-bencil-1 ,3-oxazolidin-2-ona se dispusieron en 3 mi de terc.-butanol y se mezclaron con 280 mg (2,26 mmol) de bencilmercaptano. La mezcla a continuación se calentó 2 días bajo reflujo. Después se concentró la mezcla de reacción en el evaporador rotativo y el intermedio obtenido (2S)-1-(bencilsulfanil)- 3-fenilpropan-2-amina se continúa transformando directamente sin procesamiento. HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,63 min CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,67 min; EM (ESlpos): m/z = 258 (M+H) + El intermedio en bruto antes obtenido se disolvió en una solución de 2 mi de peróxido de hidrógeno al 30% y 5 mi de ácido fórmico y se agitó 12 h a TA. Después la mezcla de reacción se vertió sobre una solución saturada de sulfato de sodio y se extrajo tres veces con acetato de etilo. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío. El producto en bruto obtenido se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 343 mg (61% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,40 min; CL-EM (Procedimiento 12): Rt = 0,65 min; EM (ESlpos): m/z = 290 (M+H) + Intermedio 54 {2S,3E)-1 ,4-difenilbut-3-en-2-amina 552,7 mg (9,85 mmol) de hidróxido de potasio se disolvió en metanol, se aplicó sobre 1 ,1 g de óxido de aluminio neutral y después se secó al alto vacío. A una solución de 240 mg (0,82 mmol) de (2S)-1-(bencilsulfonil)-3-fenilpropan-2-amina y 1 ,56 g del hidróxido de potasio así preparado sobre óxido de aluminio en 6,2 mi de n-butanol se adicionaron gota a gota a 5-10'°C 307 µ? (3,3 mmol) de dibromo-difluorometano. La mezcla de reacción se agitó 2 h a TA, después se filtró sobre celite y el residuo se lavó bien con diclorometano. El filtrado se concentró y el residuo resultante se secó al vacío. El producto en bruto así obtenido se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 98 mg (35% d. t.) del compuesto del título con una relación diaestereomérica E/Z de 4:1.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,46 min; CL-EM (Procedimiento 12): Rt = 0,75 min; EM (ESIpos): m/z = 224 (M+H) + La mezcla diaestereomérica E/Z antes obtenida se disolvió en 2 mi de etanol y 0,2 mi de N,A/-diisopropiletilamina y se separó por HPLC en fase quiral [columna: Daicel Chiralpak AD-H, 5 pm, 250 mm x 20 mm; eluyente: hexano/(etanol + 0,2% dietilamina ) 50:50 v/v; detección UV: 220 nm; temperatura: 30 °C]. Las fracciones correspondientes se concentraron en el evaporador rotativo y el residuo se secó al vacío. Se obtuvieron 45 mg del compuesto del título.
H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d [ppm] = 2,62 - 2,83 (m, 2 H) 3,52 - 3,71 (m, 1 H) 6,18 - 6,30 (m, 1 H) 6,34 - 6,46 (m, 1 H) 6,98 - 7,57 (m, 10 H) [otras señales ocultas debajo del pico de disolvente].
Intermedio 55 N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1 S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 20 mg (29 pmol) de Ay-(terc.-butoxicarbonil)-A7-metil-L-valil-/\/-[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1 -metoxipropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida se disolvieron en 1 mi de DIvlF, se mezclaron con 13,3 mg (35 pmol) de HATU y 15,3 µ? (88 pmol) de /V,/V-diisopropiletilamina y se agitó 30 min a TA. A continuación se adicionaron 12,2 mg (32 pmol) de (1S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etanamin-trifluoroacetato. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA y a continuación se separó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 22 mg (81 % d.t.) de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1f?,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4- oxadiazol-2-il)etil]amino}-propil]pirro^ valinamida.
CL-EM (Procedimiento 12): R, = 1 ,45 min; EM (ESIpos): m/z = 933 (M+H)+ Mediante la posterior escisión del grupo de protección Boc con ácido trifluoroacético se obtuvieron después 22,4 mg (98% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,85 min; EM (ESlpos): m/z = 833 (M+H)+ Intermedio 56 /V-metil-L-valil-/ -[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 R)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida-trifluoroacetato A/-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L^ metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 R)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A -metil-L-valinamida se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 55 mediante transformación de 20 mg (29 pmol) de A/-(íerc.-butoxicarbonil)-/V-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-i^ metil-L-valinamida con 12,2 mg (32 µ????) de (1/?)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etanamin-trifluoroacetato.
Rendimiento: 17 mg (64 % d. t.) HPLC (Procedimiento 10): Rt = 3,74 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,45 min; EM (ESlpos): m/z = 933 (M+H) + Mediante la posterior escisión del grupo de protección Boc con ácido trifluoroacético después se obtuvieron 17,1 mg (99 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,55 min; CL-EM (Procedimiento 1 1): Rt = 0,85 min; EM (ESIpos): m/z = 833 (M+H) + Intermedio 57 N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2Sj-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(bencilsulfonil)-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato A/-(terc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L^ (bencilsulfonil)-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin -1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 55 mediante transformación de 20 mg (29 µ????) de N-(terc-butox¡carbonil)-/V-metil-L-val¡l^ propil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida con 9,3 mg (20 µ????) de (2S)-1-(bencilsulfonil)-3-fenilpropan-2-amina.
Rendimiento: 19,2 mg (68 % d. t.) HPLC (Procedimiento 10): Rt = 3,5 min; CL-EM (Procedimiento 12): Rt = 1 ,41 min; EM (ESlpos): m/z = 957 (M+H) + Mediante la posterior escisión del grupo de protección Boc con ácido trifluoroacético después se obtuvieron 19,3 mg (99 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,52 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 857 (M+H) + Intermedio 58 A/-metil-L-valil-N-[(3R,^ il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato N-(terc. -butoxicarbonil)-W-metil-L-valil-A^ 1 ,4-difenilbut-3-en-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-m metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 55 mediante transformación de 20 mg (29 µ????) de N-(terc-butoxicarbon¡l)-A/-metil-L-vaH propil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-;L-valinamida con 7, 1 mg (32 pmol) de (2S,3£)-1 ,4-difenilbut-3-en-2-amina.
Rendimiento: 15,1 mg (58 % d. t.) HPLC (Procedimiento 10): Rt = 4,2 min; CL-EM (Procedimiento 12): Rt = 1 ,51 min; EM (ESlpos): m/z = 891 (M+H) + Mediante la posterior escisión del grupo de protección Boc con ácido trifluoroacético después se obtuvieron 15,7 mg (99 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,62 min; CL-EM (Procedimiento 12): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 791 (M+H) + Intermedio 61 A/-(3-carboxipropil)-N-metil-L^ metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino} -3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 50 mg (0,054 mmol) de W-met¡l-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-¡lcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]p¡rrolid¡n-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato (Intermedio 16) se disolvieron en 8 mi de dioxano/agua y se mezclaron con 70 mi de (0,108 mmol) de una solución al 15% de ácido 4-oxobutanoico en agua. La mezcla de reacción a continuación se agitó 1 h a 100 °C. Después de enfriar a TA se adicionaron 3,7 mg (0,059 mmol) de cianoborohidruro de sodio y la mezcla se ajustó mediante la adición de aproximadamente 300 µ? de ácido clorhídrico 0,1 N a un valor de pH de 3. La mezcla de reacción después se continuó agitando otras 2 h a 100 °C. Después del enfriado se adicionaron nuevamente 70 mi de (0,108 mmol) de la solución al 15% de ácido 4-oxobutanoico y la mezcla de reacción nuevamente se agitó 1 h a 100 °C. Después se adicionaron otros 3,7 mg (0,059 mmol) de cianoborohidruro de sodio y a continuación se ajustó con aproximadamente 300 µ? de ácido clorhídrico 0,1 N el valor de pH otra vez en 3. La mezcla de reacción después se agitó nuevamente 2 h a 100 °C. Con una transformación aún incompleta, se repitió este procedimiento una terera vez. La mezcla de reacción finalmente se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron de esta manera 32 mg (65% d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora. HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,64 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,76 min; EM (ESlpos): m/z = 899 (M+H)+ 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): d = 8,95 y 8,8 (2m, 1H), 8,88 y 8,65 (2s, 1H), 7,4-7,1 (m, 5H), 5,0, 4,78, 4,65 y 4,55 (4m, 2H), 4,1-3,7 (m, 5H), 3,32, 3,29, 3,20, 3,12, 3,1 y 3,0 (6s, 9H), 2,75 (m, 2H), 2,63 (t, 1H), 2,4-2,2 (m, 4H), 2,1-1 ,2 (m, 12H), 1 ,2-0,8 (m, 16H), 0,75 (m, 3H) [otras señales ocultas debajo del pico H2O y el pico de DMSO].
Intermedio 62 A/-(3-carboxipropil)-/\/-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida El compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 61 mediante transformación de 50 mg de /V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2ft)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/S/-metil-L-valinami trifluoroacetato (Intermedio 14) con ácido 4-oxobutanoico.
Rendimiento: 34 mg (70% d. t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,64 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,77 min; EM (ESlpos): m/z = 887 (M+H)+.
Intermedio 63 A/-(4-carboxibencil)-A/-metil-L-valil-/\/-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 2f?)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2/?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbon¡l)-2-fenilciclopropil]amino} -3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida El compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 61 mediante transformación de 15 mg de W-metil-L-val¡l-/V-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 fi,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilc¡clopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolid¡^ valinamida-trifluoroacetato (Intermedio 16) con ácido 4-formilbenzoico.
Rendimiento: 7,5 mg (48% d. t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,75 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 947 (M+H)+.
Intermedio 64 /V-(5-carboxipentil)-Ay-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 2/?)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino} -3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-Ay-metil-L-valinamida 10 mg (0,011 mmol) de /V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroace^ (Intermedio 16) se disolvieron en 2 mi de dioxano/agua y se mezclaron con 2,8 mg (0,022 mmol) de ácido 6-oxohexanoico. La mezcla de reacción a continuación se agitó 1 h a 100 °C. Después de enfriar a TA se adicionaron 0,75 mg (0,012 mmol) de cianoborohidruro de sodio y la mezcla se ajustó mediante la adición de ácido clorhídrico 0,1 N a un valor de pH 3. La mezcla de reacción después se agitó otra hora a 100 °C. Después del enfriado se adicionaron nuevamente 2,8 mg (0,022 mmol) de ácido 6-oxohexanoico y la mezcla de reacción nuevamente se agitó 1 h a 100 °C. Se adicionaron otros 0,75 mg (0,012 mmol) de cianoborohidruro de sodio y a continuación se ajustó con ácido clorhídrico 0,1 N el valor de pH otra vez en 3. La mezcla de reacción después nuevamente se agitó 1 h a 100 °C. Este proceso después se repitió una terera vez. La mezcla de reacción finalmente se concentró y el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 6,4 mg (64% d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,68 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,86 min; EM (ESlpos): m/z = 927 (M+H)+.
Intermedio 65 A/-(2-am¡noetil)-N-metil-L-valil^ metil-3-{[(2S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirro-lidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-Bistrifluoroacetato x 2 CF3COOH El compuesto del título se preparó mediante transformación de 68 mg de W-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S^ oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin -1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinam¡da-tr¡fluoroacetato (Intermedio 14) con terc.-butil-(2- oxoetil)carbamato y posterior escisión del grupo de protección Boc con ácido trifluoroacético.
Rendimiento: 49 mg (62% d. t. en dos etapas) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,58 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,05 min; EM (ESlpos): m/z = 844 (M+H)+ 1H-RMN (600 MHz, DMSO-d6): d = 8,25 (m, 1H), 8,45 y 8,15 (2d, 1H), 7,65-7,55 (m, 3H), 7,23-7,1 (m, 5H), 5,12 y 4,95 (2m, 1 H), 4,72 y 4,62 (2m, 1 H), 4,6 y 4,52 (2t, 1H), 4,2-3,8 (m, 4H), 3,7 (d, 1 H), 3,23, 3,20, 3,19, 3,18, 3,03 y 2,98 (6s, 9H), 3,0-2,7 (m, 6H), 2,4-1 ,2 (m, 15H), 1 ,05, 1 ,0, 0,88 y 0,82 (4d, 6H), 0,92 (m, 6H), 0,73 (m, 6H) [otras señales ocultas debajo del pico H2O].
Intermedio 66 A/-(3-aminopropil)-W-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 ?,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino} -3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida El compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 65 mediante transformación de 25 mg (0,027 mmol) de A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 ?,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]am¡no}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L^ valinamida-trifluoroacetato (Intermedio 16) con (3-oxopropil)carbamato de bencilo y posterior escisión hidrogenolítica del grupo de protección Z (con paladio sobre carbón al 10% como catalizador, en etanol como disolvente).
Rendimiento: 11 mg (41% d. t. en dos etapas) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,53 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,72 min; EM (ESIpos): m/z = 870 (M+H)+.
Intermedio 67 A/-(3-carboxipropil)-N-meti^^ (adamantan-1 -ilmetoxi)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 26 mg (26 pmol) de A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 ,2f?)-3-{[(2S)-1-(adamantan-1 -ilmetoxi)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato y 33,9 µ? de una solución acuosa al 15% de aldehido de ácido succínico (53 pmol) de se disolvieron en 957 µ? de una mezcla 1 :1-dioxano/agua y se calentaron durante 1 h a 100 °C. Después de un breve enfriado se adicionaron 1 ,81 mg (29 pmol) de cianoborohidruro de sodio. La mezcla de reacción se ajustó mediante la adición de ácido clorhídrico 0,1 N al valor de pH 3 y durante otras 2 h se calentó a 100 °C. Después de una nueva adición de las mismas cantidades de solución de aldehido de ácido succínico, cianoborohidruro de sodio y ácido clorhídrico se calentó nuevamente durante 2 h a 100°C. La mezcla de reacción después se separó directamente mediante HPLC preparativa en sus componentes. Se obtuvieron así 18,5 mg (73% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,17 min; m/z = 967 (M+H)+.
Intermedio 68 A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil^ oxi)-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 24 mg (26 µ?t???) de W-met¡l-L-valil-A/-[(3R,4S^^ (benciloxi)-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxoprop¡l]pi^ metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida-trifluoroacetato y 33,7 µ? de una solución acuosa al 15% de aldehido de ácido succínico (52 µ?t???) de se disolvieron en 953 µ? de una mezcla 1 :1-dioxano/agua se calentaron durante 1 h a 100 °C. Después de un breve enfriado se adicionaron 1,80 mg (29 µ?t???) de cianoborohidruro de sodio. La mezcla de reacción se ajustó mediante la adición de ácido clorhídrico 0,1 N al valor de pH 3 y se calentó durante otras 2 h a 100 °C. Después de una nueva adición de las mismas cantidades de solución de aldehido de ácido succínico, cianoborohidruro de sodio y ácido clorhídrico se calentó nuevamente durante 2 h a 100 °C. La mezcla de reacción después se separó directamente mediante HPLC preparativa en sus componentes. Se obtuvieron así 15,2 mg (65% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,01 min; m/z = 895 (M+H)+ Intermedio 69 A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-val¡^^ oxi)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]-pirrolidin-1 -il}-3-metox¡-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-met¡l-L-valinamida mg (84 µ????) de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-/V-[(2R,3S,4S)-1- carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-A/-met¡l-L-valinamida (Intermedio 4) y 45 mg (84 pmol) de /\/-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninato de bencilo trifluoroacetato (Intermedio 12) se recogieron en 2 mi de DMF, se mezclaron con 19 µ? de /S/,/V-diisopropiletilamina, 14 mg (92 pmol) de HOBt así como 17,6 mg (92 µ????) de EDC y después se agitó durante la noche a TA. A continuación se concentró la mezcla de reacción y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 59 mg (68% d. t.) del intermedio protegido con Fmoc /V-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbon¡l]-^ {[(2S)-1 -(benciloxi)-l -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]-pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,55 min; m/z = 1044 (M+H)+. 57 mg (0,055 mmol) de este intermedio para la escisión del grupo de protección Fmoc se trataron con 1 ,2 mi de piperidina en 5 mi de DMF. Después de concentrar y la purificación mediante HPLC preparativa se obtuvieron 39 mg (76% d. t.) del intermedio amina libre /V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-3-{[(2S)-1-(benciloxi)-l -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1,01 min; m/z = 822 (M+H)+. 37 mg (0,045 mmol) de este intermedio se disolvieron en 5 mi de dioxano/agua y análogamente a la preparación del compuesto en el intermedio 66 se transformó con una solución acuosa al 15% de ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio. Se obtuvieron 16 mg (39% d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,01 min; EM (ESlpos): m/z = 908 (M+H)+. intermedio 70 A/-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil^ (benciloxi)-1-oxo-3-fenilbutan-2-¡l]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]p¡rrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 14 a partir de los intermedios 4 y 26 el compuesto amina /V-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S,3S)-1-(benciloxi)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-1-metoxi^ metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida. 30 mg (0,032 mmol) de este compuesto se disolvieron en 6 mi de dioxano/agua y se mezclaron con 41 µ? (0,063 mmol) de una solución acuosa al 15% de ácido 4-oxobutanoico. La mezcla de reacción a continuación se agitó 1 h a 100 °C. Después de enfriar a TA se adicionaron 2,2 mg (0,035 mmol) de cianoborohidruro de sodio y la mezcla se ajustó mediante la adición de aproximadamente 300 µ? de ácido clorhídrico 0,1 N a un valor de pH de 3. La mezcla de reacción después se agitó otras 2 h a 100 °C. Después del enfriado se adicionaron nuevamente 41 µ? (0,063 mmol) de la solución al 15% de ácido 4-oxobutanoico y la mezcla de reacción nuevamente se agitó 1 h a 100 °C. Después se adicionaron otros 2,2 mg (0,035 mmol) de cianoborohidruro de sodio y a continuación se ajustó con aproximadamente 300 µ? de ácido clorhídrico 0,1 N el valor de pH otra vez en 3. La mezcla de reacción después se agitó nuevamente 2 h a 100 °C. Dada una transformación aún incompleta se repitió este proceso una terera vez. La mezcla de reacción finalmente se concentró y el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 24 mg (82% d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,9 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 5,15 min; EM (ESlpos): m/z = 922 (M+H)+.
Intermedio 71 /V-(3-carboxipropil)-/V-metil-L^ metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin 1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 14 a partir de los intermedios 4 y 39 el compuesto amina A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 f?,2R)-1 -metoxi-3-{[(2S)-1 -metoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-Ay-metil-L-valinamida. De 7 mg (0,009 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 2 mg (22% d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,06 min; EM (ESlpos): m/z = 832 (M+H)+.
Intermedio 72 A/-(3-carboxipropil)-N-metil-L-vaW (benciloxi)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-Ay-metil-L-valinamida 212 mg (41 1 µ????) de W-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-A/-[(2 3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-¡l]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 8) y 237 mg (411 mol) de A/-{(2R,3f?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-triptofanato de bencilo trifluoroacetato (Intermedio 20) se recogieron en 30 mi de DMF y se mezclaron con 188 mg (493 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,A/,A/',/V-tetrametiluronio-hexafluorofosfato así como con 215 µ? de /V,/V-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó 20 h a TA, a continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se reunieron las fracciones del producto, se concentró y el residuo se secó al alto vacío. Se obtuvieron así 315 mg (80% d. t.) del intermedio protegido con Boc /N/-(íerc.-butoxicarbonil)-/N/-metil-L-valil-A/-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-(benciloxi)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida en forma de espuma incolora.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,45 min; m/z = 961 (M+H)+. 50 mg (52 µ????) de este intermedio se trataron para escisión del grupo de protección Boc con 1 mi de ácido trifluoroacético en 9 mi de diclorometano. Después de concentrar y la purificación mediante HPLC preparativa se obtuvieron 29 mg (57% d. t.) del intermedio amina libre A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1 -(benciloxi)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida como trifluoroacetato.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,99 min; m/z = 861 (M+H)+. 29 mg (0,03 mmol) de este intermedio se disolvieron en 6 mi de dioxano/agua y se mezclaron con 39 µ? (0,059 mmol) de una solución acuosa al 15% de ácido 4-oxobutanoico. La mezcla de reacción a continuación se agitó 1 h a 100 °C. Después de enfriar a TA se adicionaron 2 mg (0,033 mmol) de cianoborohidruro de sodio y la mezcla se ajustó mediante la adición de aproximadamente 300 µ? de ácido clorhídrico 0,1 N a un valor de pH de 3. La mezcla de reacción después se agitó otras 2 h a 100 °C. Después del enfriado se adicionaron nuevamente 39 µ? (0,059 mmol) de la solución al 15% de ácido 4-oxobutanoico y la mezcla de reacción se agitó nuevamente 1 h a 100 °C. Después se adicionaron otros 2 mg (0,033 mmol) de cianoborohidruro de sodio y a continuación se ajustó con aproximadamente 300 µ? de ácido clorhídrico 0,1 N el valor de pH otra vez en 3. La mezcla se agitó nuevamente 2 h a 100 °C. Posteriormente se vertió la mezcla de reacción sobre una mezcla 1:1 de solución de cloruro de amonio acuosa semi-saturada y acetato de etilo. Se separó la fase orgánica, se lavó con solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El residuo se liofilizó a partir de agua/acetonitrilo. Se obtuvieron así 27 mg (94% d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 5,04 min; EM (ESlpos): m/z = 947 (M+H)+.
Intermedio 73 N-(3-carboxipropil)-W-metil-L^^ (metil)amino]-1-oxo-3-fenilpropan-2-il}amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía a la síntesis descrita para el intermedio 14 a partir de los intermedios 4 y 38 el compuesto amina A/-metil-L-valil-/\/-[(3RI4S)5S)-1-{(2S)-2-[(1 ?,2f?)-3-({(2S)-1 -[bencil(metil)amino]-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il}amino)-1 -metox¡-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida. De 25 mg (0,026 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 13 mg (54% d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 5,01 min; EM (ESlpos): m/z = 921 (M+H)+.
Intermedio 74 A/-(3-carboxipropil)-A/-metil^ [(benciloxi)carbonil]-2-fenilciclopropil}amm^ il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 50 mg (73 µ????) de /V-(terc.-butoxicarbonil)-W-metil-L-valil-/^ [(1 R,2 ?)-2-rarboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoh metil-L-valinamida (Intermedio 26) y 28 mg (73 µ?t???) de (1 S,2R)-1-amino-2-fenilciclo-propancarboxilato de bencilo trifluoroacetato (Intermedio 45) se recogieron en 5 mi de DMF y se mezclaron con 42 mg (110 µ?t???) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-?/,?/,?/',?/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 38 µ? de W.W-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó 5 h a TA, a continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se reunieron las fracciones del producto y se concentró. Después de la liofilización a partir de dioxano/agua se obtuvieron 35 mg (51 % d. t.) del intermedio protegido con Boc N-(terc-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-^ [(benciloxi)carbonil]-2-fenilciclopropil}amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1^ il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida en forma de espuma incolora.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,52 min; m/z = 934 (M+H)+. 35 mg de este intermedio se trataron para la escisión del grupo de protección Boc con 1 mi de ácido trifluoroacético en 5 mi de diclorometano. Después de la concentración y la liofilización a partir de dioxano/agua se obtuvieron 34 mg (97% d. t.) del intermedio amina libre A/-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-({(1 S,2R)-1 -[(benciloxi)carbonil]-2-fenilciclopropil}amino)-1 -metoxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1 como trifluoroacetato.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,91 min; m/z = 834 (M+H)+.
De 11 mg (0,011 mmol) de este intermedio después se obtuvo análogamente para la preparación del intermedio 66 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 2,5 mg (24 % d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 5,1 min; EM (ESlpos): m/z = 920 (M+H)+.
Intermedio 75 A/-(3-carbox¡propil)-/\/-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S,2R)-2-fenil-1-(propilcarbamoil)ciclopropil]-amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 74 mediante el acoplamiento de /V-(ferc.-butoxicarbonil)-/V-metil-L-valil-/V-[(3 ?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2 ?)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y (1S,2R)-1-amino-2-fenil-/v"-propilciclopropancarboxamida-trifluoroacetato (Intermedio 27) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,/N/,A/',/V-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético el compuesto amina A/-metil-L-valil-A/-[(3 ,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S,2/?)-2-fenil-1 -(propilcarbamoil)ciclopropil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 14 mg (0,016 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 11 ,3 mg (83 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,27 min; EM (ESlpos): m/z = 871 (M+H)+.
Intermedio 76 /V-(3-carboxiprop¡l)-/V-metil-^^ (etox¡carbonil)-2-fenilcicloprop¡l]amino}-1-meto metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó mediante el acoplamiento del intermedio 46 (/V-(ferc-butoxicarbonil)-W-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-W-metil-L-valinamida^ con el intermedio 48 (etil-(1S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropancarboxilato-trifluoroacetato) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,AJV',W^etrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión de Boc el compuesto de partida /V-metil-L-valil-/V-[(3 ?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1f?,2R)-3-{[(1S,2R)-1-(etoxicarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato. De 70 mg (0,079 mmol) de este material de partida se preparó después mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 61 46 mg (68 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,28 min; EM (ESlpos): m/z = 858 (M+H)+ Intermedio 77 /V-(3-carboxipropH)-/V-metil-L^ 1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-H metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 75 mediante el acoplamiento de /V-(íerc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R^R^-carboxi-l -metoxipropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y clorhidrato de L-fenilalaninamida en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-¡l)-A/,A/, \/',/V-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético el compuesto amina A/-met¡l-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2fi)-3-{[(2S)-1 -amino-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 47 mg (0,049 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 39 mg (96 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1,7 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,44 min; EM (ESlpos): m/z = 817 (M+H)+ 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): d = 8,95 y 8,8 (2m, 1 H), 8,25 y 8,0 (2d, 1 H), 7,45, 7,35 y 7,0 (3s, ancho, 2H), 7,3-7,1 (m, 5H), 4,8-4,4 (2m, 3H), 3,95 (m, 1 H), 3,82 (m, 1 H), 3,72 (d, 1 H), 3,22, 3,18, 3,15, 3,05 y 3,00 (5s, 9H), 2,85-2,7 (m, 4H), 2,45-1 ,6 (m, 12H), 1 ,5-1 ,2 (m, 3H), 1 ,1-0,7 (m, 21 H) [otras señales ocultas debajo del pico del disolvente].
Intermedio 78 /V-(6-aminohexil)-A/-metil-L^ 2-metil-3-{[(2S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinami^ Este compuesto se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 66 en dos etapas a partir de 20 mg (16 pmol) de del compuesto del intermedio 14 y (6-oxohexil)carbamato de bencilo, realizándose la hidrogenación en metanol como disolvente.
Rendimiento: 7,6 mg (55 % d.t. en dos etapas) HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,7 min; EM (ESlpos): m/z = 901 (M+H)+.
Intermedio 79 N-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-vaN amino)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 36 mg (43 µ????) de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-/\/-[(3R4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2ft)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-fenilet¡l]am il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A-metil-L-valinamida (Intermedio 46) y 4,6 mg (43 pmol) de bencilamina se recogieron en 5 mi de DMF, se mezclaron con 7,5 µ? (88 µ????) de ?/,/V-cí/lsopropiletilamina, 10 mg (65 µ?t???) de HOBt así como 10 mg (52 µ?t???) de EDC y después se agitó durante la noche a TA. A continuación se concentró la mezcla de reacción y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 29 mg (73 % d. t.) del intermedio protegido con Boc N-(terc-butoxicarbonil)-W-metil-L^ amino)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A -metil-L-valinamida.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,43 min; m/z = 921 (M+H)+. 29 mg de este intermedio se trataron para la escisión del grupo de protección Boc con 1 mi de ácido trifluoroacético en 6 mi de diclorometano. Después de la concentración y la liofilización a partir de dioxano/agua se obtuvieron 30 mg (cuant.) del intermedio amina libre A/-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-3-{[(2S)-1-(bencilamino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,95 min; m/z = 821 (M+H)+.
De 17 mg (0,018 mmol) de este intermedio después se obtuvo análogamente para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 13 mg (80 % d. t.) del compuesto del título en forma de una espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,97 min; EM (ESlpos): m/z = 907 (M+H)+.
Intermedio 80 /V-(3-carboxipropil)-/V-metil-L^ amino)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 74 mediante el acoplamiento de /\/-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y /V-bencil-L-triptofanamida-trifluoroacetato (Intermedio 47) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/\/,/V',/V'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético el compuesto amina /V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2f?)-3-{[(2S)-1 -(bencilamino)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-i^ L-valinamida como trifluoroacetato. De 10 mg (0,01 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 2,5 mg (26 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,7 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1,13 min; EM (ESlpos): m/z = 946 (M+H)+.
Intermedio 81 A/-(3-carbox¡propil)-N-met¡l-L^^ carbamoil-2-fenilciclopropil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 74 mediante el acoplamiento de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1f?,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y (1S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropancarboxamida-trifluoroacetato (Intermedio 48) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,A/, \ ',/N/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético el compuesto amina /V-metil-L-valil-/V-[(3R^S,5S)^^ propil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxo-heptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 14 mg (0,0163 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 8 mg (57 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,64 min; EM (ESlpos): m/z = 829 (M+H)+.
Intermedio 82 A/-(3-carboxipropil)-/\/-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2f?)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 /-/-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinam¡da En primer lugar se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 69 mediante el acoplamiento de /V-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/V-metil-L-valil-A/-[(2R,3S,4S)-1 -carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-/\/-metil-L-valinamida (Intermedio 4) y /Va-{(2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-triptofanamida-trifluoroacetato (Intermedio 49) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/S/,/\/',/V-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Fmoc por medio de piperidina el compuesto amina /V-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 78 mg (0,088 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 68 mg (90 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,49 min; EM (ESlpos): m/z = 856 (M+H)+. intermedio 83 /V-(5-carboxipentil)-/V-metil-^^ 3-(1/- -indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con el compuesto en el intermedio 82 a partir de 20 mg (26 µp???) de /V-met¡l-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3- {[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio.
Rendimiento: 5 mg (25 % d. t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1 1 ): Rt = 0,72 min; EM (ESlpos): m/z = 884 (M+H)+.
Intermedio 84 /V-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R2R)-1 -metox¡-2-met¡l-3-{[(2S)-1 -(morfolin-4-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 79 mediante el acoplamiento de A/-(ierc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-/\/-[(3 ,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 f?,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-feniletil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/ /-metil-L-valinamida (Intermedio 46) y morfolina en presencia de EDC y HOBT y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético el compuesto amina N-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2f?)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1 -(morfolin-4-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1^ oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 30 mg (0,033 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 22 mg (76 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,58 min; EM (ESlpos): m/z = 887 (M+H)+.
Intermedio 85 W-(3-carboxipropil)-/V-metil-^^ (bencilamino)-3-hidroxi-1-oxobutan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 79 mediante el acoplamiento de /V-(terc.-butoxicarbonil)-/\/-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2f?)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A -metil-L-valinamida (Intermedio 46) y W-bencil-L-treoninamida-trifluoroacetato en presencia de HATU y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético el compuesto amina /V-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1f?,2f?)-3-{[(2S,3R)-1-(bencilamino)-3-hidroxi-1-oxobutan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 21 mg (0,024 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 20 mg (97 % d. t.) del compuesto del título. HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,54 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,49 min; EM (ESlpos): m/z = 861 (M+H)+.
Intermedio 86 N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -terc-butoxi-1 -oxo-3-fenilpropan-2-¡l]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 74 mediante el acoplamiento de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 ?,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y clorhidrato de terc.-butil-L-fenilalaninato en presencia de O^-azabenzotriazol-l-i -^/V./V^/V'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético mediante la obtención del terc.-butiléster (40 min de agitación con ácido trifluoroacético en diclorometano) el compuesto amina A/-metil-L-valil-/V-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-íerc.-butoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]a 1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-meti L-valinamida como trifluoroacetato. De 22 mg (0,02 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 16 mg (94 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 9): R, = 5,05 min; EM (ESIpos): m/z = 874 (M+H)+.
Intermedio 87 N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butoxi-3-(1 H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida La preparación de este compuesto se efectuó análogamente a la síntesis descrita en el intermedio 86 a partir de 230 mg (336 µ?t???) de /V-(íerc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2/?)-2-carbox¡-1 -metoxipropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y clorhidrato de terc.-butil-L-triptofanato en 3 etapas.
Rendimiento: 95 mg (31 % d.t. en 3 etapas) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 5,05 min; EM (ESlpos): m/z = 913 (M+H)+.
Intermedio 88 /V-(6-aminohexil)-/V-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -amino-3- (1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]-pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 69 mediante acoplamiento de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-A/-[(2f?,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 4) y Ala-{(2R,3f?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-triptofanamida-trifluoroacetato (Intermedio 49) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/N/;/\/,/\/',/V-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Fmoc por medio de piperidina el compuesto amina /V-metil-L-val¡l-/S/-[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1 H-indol-3-il)-1-oxop 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metN^ como trifluoroacetato. De 30 mg (0,03 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del compuesto del intermedio 61 mediante transformación con (6-oxohexil)carbamato de bencilo, que se había obtenido antes mediante oxidación de (6-hidroxihexil)carbamato de bencilo, en presencia de cianoborohidruro de sodio 17 mg (45 % d. t.) del compuesto protegido con Z. A continuación se obtuvo mediante hidrogenólisis en metanol sobre 10 % paladio/carbón activado el compuesto del título.
Rendimiento: 14 mg (95 % d. t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,5 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,73 min; EM (ESlpos): m/z = 869 (M+H)+.
Intermedio 89 /V-(6-aminohexil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2f?)-3-{[(2S)-1 -terc-butoxi-3-(1 -/-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A -metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 86 mediante el acoplamiento de /V-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 f?,2f?)-2-carboxi-1 -metox¡propil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y clorhidrato de terc.-butil-L-triptofanato en presencia de O-ÍZ-azabenzotriazol-l-i -W.^A/^A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético mediante la obtención del terc.-butiléster (30 min de agitación con ácido trifluoroacético/diclorometano 1 :10) el compuesto amina /V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S^ il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 71 mg (0,075 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del compuesto del intermedio 61 mediante transformación con (6-oxohexil)carbamato de bencilo, que se había obtenido antes mediante oxidación de (6-hidroxihexil)carbamato de bencilo, en presencia de cianoborohidruro de sodio 35 mg (44 % d. t.) del compuesto protegido con Z. A continuación se obtuvo mediante hidrogenólisis en metanol sobre 10 % paladio/carbón activado el compuesto del título.
Rendimiento: 30 mg (98 % d. t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,77 min; EM (ESlpos): m/z = 926 (M+H)+.
Intermedio 90 /V-(3-carboxipropil)-A/-met¡l-L^ il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 74 mediante el acoplamiento de /V-(terc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-/\/-[(3 ?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 f?,2f?)-2-carboxi-1-metoxipropil]p¡rrolidin-1-il}-3-metox¡-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y 2-(1H-indol-3-il)etanamina en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/ /,/\/',/N/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético el compuesto amina A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[2-(1 H-indol-3-il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 100 mg (0,119 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 50 mg (49 % d. t.) del compuesto del título. La purificación del compuesto del título se efectuó aquí mediante cromatografía flash en gel de sílice con diclorometano/metanol/amoníaco 17 % como eluyente, modificándose la primera relación de mezcla de 15/2/02 a 15/4/0,5.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 813 (M+H)+.
Intermedio 91 /N/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -[(2S)-2-{(1 f?,2f?)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-A/-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 74 mediante el acoplamiento de /V-(íerc.-butoxicarbonil)-/\/-metil-L-valil-A/-[(3 ?)4SI5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2f?)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y feniletilamina en presencia de O-íy-azabenzotriazol-l-i -ZS/.A/.A/' A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc por medio de ácido trifluoroacético el compuesto amina A/-metil-L-valil-/V-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-{(1 R,2 )-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-fen¡letil)amino]propil}-pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. De 57 mg (0,071 mmol) de este compuesto después análogamente se obtuvieron para la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 44 mg (80 % d. t.) del compuesto del título. La purificación del compuesto del título también aquí puede efectuarse mediante cromatografía flash en gel de sílice con diclorometano/metanol/amoníaco 17 % como eluyente (15/2/02 -> 15/4/0,5).
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,7 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,64 min; EM (ESlpos): m/z = 774 (M+H)+.
Intermedio 92 A/-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-^ hidroxi-1 -fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida De 100 mg (0,139 mmol) de /V-met¡l-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(^R,2R)-3-{[(1 S,2R)-1 -hidrox¡-1 -fenilpropan-2-il]am¡no}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-met¡l-L-val¡nam¡da (Intermedio 40) se preparó en analogía con la preparación del intermedio 61 mediante transformación con ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio 94 mg (84 % d. t.) del compuesto del título. La purificación del compuesto del título se efectuó mediante HPLC preparativa.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,5 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,46 min; EM (ESlpos): m/z = 804 (M+H)+.
Intermedio 93 /V-(3-carboxipropil)-W-metil-L-val^ metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}-propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 22,4 mg (24 prnol) de A/-metil-L-valil-/V-[(3/?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V^ trifluoroacetato se disolvieron en 1 ,4 mi de dioxano/agua y se transformaron análogamente para la preparación del intermedio 61 con solución acuosa al 15 % de ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 8,2 mg (38 % d. t.) del compuesto del título en forma de sólidos de color blanco.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,54 min CL-EM (Procedimiento 12): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 919 (M+H)+ intermedio 94 A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1R)-2-fenil-1-(5-fenil-1,3,4-oxad¡azol-2-il)etil]am¡no}-propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 17,1 mg (18 pmol) de /V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 f?)-2-fenil-1 -(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato se disolvieron en 1 ,1 mi de dioxano/agua y se transformaron análogamente para la preparación del intermedio 61 con solución acuosa al 15 % de ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 14,8 mg (89 % d. t.) del compuesto del título en forma de sólidos de color blanco.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,54 min; CL-EM (Procedimiento 12): Rt = 0,92 min; EM (ESlpos): m/z = 919 (M+H) + Intermedio 95 A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L^ (bencilsulfonil)-3-fenilpropan-2-il]am¡no}-1-meto metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 19,3 mg (20 µp???) de A/-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2«)-3-{[(2S)-1-(benc¡lsulfonil)-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxoprop¡l]-p¡rrol^ metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-met¡l-L-val¡namida-trifluoroacetato se disolvieron en 1 ,2 mi de dioxano/agua y se transformaron análogamente para la preparación del intermedio 61 con solución acuosa al 15 % de ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 8,6 mg (45 % d. t.) del compuesto del título en forma de sólido.
CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,85 min; EM (ESlpos): m/z = 943 (M+H) + Intermedio 96 A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil^ d¡fenilbut-3-en-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 15,5 mg (10 pmol) de A/-metil-L-valil-A/-[(3R4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S,3£)- 1 ,4-difenilbut-3-en-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A-metil-L-valinamida-trifluoroacetato se disolvieron en 1 ,0 mi de dioxano/agua y se transformaron análogamente para la preparación del intermedio 61 con solución acuosa al 15 % de ácido 4-oxobutanoico en presencia de cianoborohidruro de sodio. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 10,3 mg (68 % d. t.) del compuesto del título en forma de sólidos de color blanco.
HPLC (Procedimiento 10): Rt = 2,59 min; CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 877 (M+H) + Intermedio 97 A/-(6-aminohex¡l)-A/-metil-^ 2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida compuesto del título se preparó análogamente a la síntesis del intermedio 66 mediante transformación de 200 mg (0,108 mmol) de A/-metil-L-valil-/\/-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida-trifluoroacetato (Intermedio 16) con (6-oxohexil)carbamato de bencilo y posterior escisión hidrogenolítica del grupo de protección Z (con 5 % de paladio sobre carbón como catalizador, en metanol como disolvente).
Rendimiento: 69 mg (65 % d. t. en dos etapas) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,76 min; EM (ESlpos): m/z = 912 (M+H)+.
Intermedio 98 A/-(5-carboxipentil)-A/-metil-L-val¡^ (bencilamino)-3-(1 /-/-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-va^ La preparación de este compuesto se efectuó análogamente a la síntesis descrita el intermedio 80. La purificación se efectuó mediante HPLC preparativa.
Rendimiento: 40 mg (29 % d.t. en 3 etapas) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,92 min; EM (ESlpos): m/z = 974 (M+H)+.
Intermedio 99 (2S)-2-amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)propan-1 -on-trifluoroacetato 324 mg (0,81 mmol) de 2,5-d¡oxopirrolidin-1-il-A/-(terc.-butoxicarbonil)-L-triptofanato se disolvieron en 20 mi de DMF y se mezclaron con 200 mg (1 ,62 mmol) de clorhidrato de 1 ,2-oxazinano (compuesto de partida 5) y 850 µ? de N,N- diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a 50 °C y a continuación se concentró al vacío. El residuo se recogió en diclorometano y se extrajo con agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con diclorometano/acetato de etilo 4:1 como eluyente. Las fracciones del producto se concentraron y el residuo se secó al alto vacío. Se obtuvieron así 147,5 mg (48 % d. t.) del intermedio protegido con Boc.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,03 min; EM (ESlpos): m/z = 374 (M+H)+.
De 166 mg (444,5 µ?t??G) de este intermedio se escindió en condiciones estándar con 3 mi de ácido trifluoroacético en 20 mi de diclorometano el grupo de protección Boc y después de la purificación mediante HPLC se obtuvieron 155 mg (86 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,43 min; CL-EM (Procedimiento 1 1): Rt = 0,56 min; EM (ESlpos): m/z = 274 (M+H)+.
Intermedio 100 W-(6-{[(bencilox¡)carbon¡l]am¡no}heri [(1 R,2ft)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-H^ metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida 177 mg (260 pmol) de /V-(terc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-valil-/\/-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]- S/-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y 100 mg (260 pmol) de (2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)propan-1-on-trifluoroacetato (Intermedio 99) se recogieron en 15 mi de DMF y se mezclaron con 118 mg (310 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1- il)-A/,/\/,/\/'A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 140 µ? de /V,/V-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA, a continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se reunieron las fracciones del producto y se concentró. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 170 mg (68 % d. t.) del intermedio protegido con Boc.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,36 min; m/z = 940 (M+H)+. 170 mg de este intermedio se trataron para la escisión del grupo de protección Boc 30 min con 3 mi de ácido trifluoroacético en 30 mi de diclorometano. Después la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa, obteniéndose 155 mg (86 % d.t.) del intermedio desprotegido N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,85 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 840 (M+H)+.
De 50 mg (0,052 mmol) de este intermedio después se obtuvo análogamente para la preparación del intermedio 97 con (6-oxohexil)carbamato de bencilo en presencia de cianoborohidruro de sodio y posterior escisión hidrolítica del grupo de protección Z (con 5 % de paladio sobre carbón como catalizador, en metanol como disolvente) el compuesto del título.
Rendimiento: 21 mg (37 % d. t.) HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,02 min; EM (ESlpos): m/z = 1073 (M+H)+.
Intermedio 101 A/-(6-aminohexil)-/V-metil-L^ indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 26,7 mg (24,87 µ????) de del intermedio 100 se disolvieron en 10 mi de metanol y se hidrogenó sobre paladio/carbón activado (5 %) durante 30 min a presión normal de hidrógeno. El catalizador se separó por filtración y el disolvente se evaporó al vacío. Después de secar el residuo al alto vacío se obtuvieron 22,5 mg (96 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,76 min; EM (ESlpos): m/z = 939 (M+H)+.
Intermedio 102 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1^^ L-valil-W-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1^ (morfolin-4-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 157 a partir de A/-(3-carboxipropil)-/N-metil-L-val¡l-A/-[(3 ,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2/?)-1 -metox¡-2-metil-3-{[(2S)-1 -(morfolin-4-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida y la 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado.
Rendimiento: 8 mg (71 % d.t.) HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESIpos): m/z = 1094 (M+H)+.
Intermedio 103 /V-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM L-valil-/V-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-^^ oxobutan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 157 a partir de /V-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S,3f?)-1-(bencilamino)-3-hidroxi-1-oxobutan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-/\/-metil-L-valinamida y la 6- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado.
Rendimiento: 3 mg (22 % d.t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,78 min; EM (ESlpos): m/z = 1069 (M+H)+.
Intermedio 104 /V-{4-[(trans-4-{[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]carbonil}ciclohexil)amino]-4-oxobutil}-A/-metil-L-valil-A/-[(3 4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2F?)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida primer lugar se preparó trans-4-aminociclohexancarboxilato de bencilo trifluoroacetato a partir de ácido frans-4-aminociclohexancarboxílico mediante introducción del grupo de protección Boc, posterior introducción del grupo de protección benciléster y posterior escisión del grupo de protección Boc según métodos usuales en la síntesis de péptidos. 15 mg (18 prnol) de A/-(3-carboxipropil)-/ /-metil-L-valil-/V-[(3R,4SI5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2f?)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida después se disolvieron en 5 mi de dimetilformamida y a continuación se mezclaron con 13 mg (35 µ?t???) de 0-(7-azabenzotriazol-1 -il)-/V,A/,/\/',/V-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 9 µ? de W,/V-diisopropiletilamina así como con 15 mg (44 µ????) de frans-4-aminociclohexancarboxilato de bencilo trifluoroacetato. La mezcla se agitó 1 h a TA y a continuación se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Se unificaron las correspondientes fracciones y el disolvente se evaporó al vacío. Después de secar el residuo al alto vacío se obtuvieron 14,7 mg (78 % d. t.) del intermedio protegido en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 0,95 min; EM (ESlpos): m/z = 1072 (M+H)+.
De este intermedio protegido primero se eliminó en forma hidrogenolítica el benciléster y se obtuvo el componente carboxilo como resultado cuantitativo. Se recogieron 14 mg (14 µ????; 1 equiv.) del compuesto desprotegido en 5 mi de DMF y se mezclaron con 3,3 mg (29 µp???; 2,1 equiv.) de A/-hidroxisuccinimida en presencia de 4,1 mg (21 µ?t???; 1 ,5 equiv.) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 7,5 µ? (44 pmol; 3,1 equiv.) de ?/,/V-d/lsopropiletilamina y 0,9 mg (7 µ????; 0,5 equiv.) de 4-dimetilaminopiridina y se agitó durante la noche a TA. Después se adicionaron nuevamente 10 equiv. /V-hidroxisuccinimida, 5 equiv. de clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 5 equiv. de /V,A/-diisopropiletilamina y 0,5 equiv. de 4-dimetilaminopiridina y la mezcla de reacción se trató 5 h en el baño de ultrasonido. A continuación el disolvente se eliminó por evaporación, el residuo se purificó mediante HPLC preparativa y se unificaron las correspondientes fracciones y se concentró. Después de la liofilización del residuo con dioxano se obtuvieron 9,7 mg (62 % d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,77 min; EM (ESlpos): m/z = 1078 (M+H)+.
Intermedio 105 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutil)-A/-meti L-val^A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R^ 2- metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 157 a partir de ácido 4-{[(2S)-1-{[(2S)-1-{[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-ferc-butoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metilbutan-2-il]amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il](metil)amino}butanoico y 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 -/-pirrol-1 -il)hexanhidrazida disponible en el mercado. El intermedio éster se obtuvo con un rendimiento de 42 %. En un segundo paso se escindió a partir de 6 mg (6 µ????) de este intermedio con ácido trifluoroacético el terc.-butiléster. Al cabo de la purificación mediante HPLC se obtuvieron 3,4 mg (48 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,66 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,04 min; EM (ESlpos): m/z = 1025 (M+H)+.
Intermedio 106 /V-[6-(2 , 5-d ¡oxo-2 , 5-d ¡ hid ro- 1 H-piro^ [(1R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1tf-indol-3-il)-1-o^^ 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-me 14 mg (16 pmol) de W-(6-aminohexil)-/V-metil-L-valil-/S/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valm (Intermedio 88) se recogieron en 750 µ? de dioxano y se mezclaron con 1 ,5 mi de solución saturada de hidrocarbonato de sodio y a continuación con 3,2 mg (21 pmol) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-carboxilato de metilo. La mezcla de reacción se agitó 1 h a TA y después se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 5,5 mg (36 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,84 min; EM (ESlpos): m/z = 949 (M+H)+.
Intermedio 107 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobu^^ L-valil-A/-[(3fi,4S,5S)-1-{(2S)-2-[0^^ metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 38 mg (47 pmol) de /V-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-/V-[(3^ [(1R,2R)-3-{[2-(1H-indol-3-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirroli^ metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida se disolvieron en 37 mi de DMF y a continuación se mezclaron con 71 mg (187 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-?/,?/,?/',?/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 33 µ? de A/,A/-diisopropiletilamina así como con 37 mg (140 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó 1 h a TA. A continuación se concentró al alto vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 12,2 mg (26 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,85 min; EM (ESlpos): m/z = 1020 (M+H)+.
Intermedio 108 A-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobuti L-valil-/V-{(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -[(2S)-2-{(1 2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-[(2-feniletil)amino]propil}pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il}-/ /-metil-L-valinamida El compuesto se preparó en analogía con el intermedio 107.
Rendimiento: 2,5 mg (30 % d.t.) HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,9 min; EM (ESIpos): m/z = 981 (M+H)+.
Intermedio 109 W-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)te^ L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2^ il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida El compuesto se preparó en analogía con el intermedio 107 a partir del compuesto del intermedio 92.
Rendimiento: 35 mg (65 % d.t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,76 min; EM (ESlpos): m/z = 1011 (M+H)+.
Intermedio 110 A/-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-/V-metil-L-valil-A/-[(3R,^ [(1 f?,2f?)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil- 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-met¡l-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 147 a partir del compuesto del intermedio 83.
Rendimiento: 2,4 mg (24 % d.t.) HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESIpos): m/z = 981 (M+H)+.
Intermedio 111 W-(4-{2-[6-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d i h id ro- 1 H-p ^ W-metil-L-valil-A/-[(3R,4S^ oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 140 a partir del intermedio 82 y el intermedio 22.
Rendimiento: 6,5 mg (51 % d.t.) HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 4,71 min; EM (ESlpos): m/z = 1077 (M+H)+.
Intermedio 112 W-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirro^ L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1/?,2f?)-3-{[(1S,2R)-1-carbamoil-2-fenilciclopropil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 157 a partir del compuesto del intermedio 81.
Rendimiento: 5,7 mg (57 % d.t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 1036 (M+H)+.
Intermedio 113 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-(1H-indol-3-il)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 95 mg (104 pmol) de ácido 4-{[(2S)-1-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-ferc.-butoxi-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)amino}-3-metilbutan-2-il]amino}-3-metil-1-oxobutan-2-il](metil)amino}butanoico se disolvieron en DMF y a continuación se mezclaron con 79,5 mg (209 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-?/,?/,?/',?/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 73 µ? de /V,A/-diisopropiletilamina así como con 68 mg (261 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó 2 h a TA. A continuación se concentró al alto vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 104 mg (89 % d.t.) del terc.-butiléster del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,93 min; EM (ESlpos): m/z = 1121 (M+H)+.
El intermedio se recogió en 33,4 mi de diclorometano, se mezcló con 17 mi de ácido trifluoroacético y se agitó 1 h a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa.
Así se obtuvieron 61 mg (62 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,86 min; EM (ESIpos): m/z = 1064 (M+H)+.
Intermedio 114 A/-[6-({[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirro^^ valil-A/-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 5 mg (5 pmol) de /S/-(6-aminohexil)-/V-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2f?)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1 - -indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida se recogieron en 885 µ? de DMF y se mezclaron con 5,3 mg (8 pmol) de 4-nitrofenil-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 - -pirrol-1-il)etil]-carbamato así como con 2,8 µ? de N,N-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a TA y a continuación se concentró a sequedad. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa.
Rendimiento: 0,58 mg (1 1 % d.t.) de una espuma incolora HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,83 min; EM (ESlpos): m/z = 1035 (M+H)+.
Intermedio 115 A/-{4-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-4-oxobutil}-A/-metil-L-valil-/V- {(2S)-2-[(1 f?,2f?)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metiU valinamida Este compuesto se preparó en analogía con el compuesto en el intermedio 147 a partir de 8 mg (9 µ????) de A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 ,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil^ fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]p¡rrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-/\/-met¡l-L-valinamida. Después de la concentración se purificó el éster activado mediante HPLC preparativa y después de eliminar el disolvente al vacío se transformó de inmediato con el anticuerpo.
Rendimiento: 3 mg (27 % d.t.) (sensible a hidrólisis) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 996 (M+H)+.
Intermedio 116 /\/-{4-[(2,5-dioxop¡rrolidin-1-il)ox¡]-4-oxobutil}-/\/-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con el compuesto en el intermedio 147 a partir de 5 mg (6 pmol) de A/-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-/N/-[(3 ?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[( R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan- 2-il]am¡no}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-N-meW Después de la concentración se purificó el éster activado mediante HPLC preparativa y después de eliminar el disolvente al vacío se transformó de inmediato con el anticuerpo.
Rendimiento: 3,2 mg (43 % d.t.) (sensible a hidrólisis) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,92 min; EM (ESlpos): m/z = 984 (M+H)+.
Intermedio 117 /V-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-p¡TO^ L-valil-W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R2R)-3-{[(2S)-1-terc.-butoxi-1-oxo-3-fenilprop il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 157 a partir del compuesto del intermedio 86.
Rendimiento: 7 mg (42 % d.t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 1081 (M+H)+.
Intermedio 118 ?/-(4-{2-[6-(2, 5-d ioxo-2 , 5-d ih id ro- 1 H-pirro^^ L-valil-A/-[(3fi,4S,5S)-1-{(2S)-2^ il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida El compuesto diana se preparó análogamente con el intermedio 157 a partir de 7 mg (7,8 pmol) de del compuesto del intermedio 68. Rendimiento: 6,3 mg (53 % d.t.) CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,00 min; EM (ESlpos): m/z = 1102 (M+H)+.
Intermedio 119 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxo L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-meto^ fenil-1-(5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 7,4 mg (8,1 mmol) de /\/-(3-carboxipropil)-/\/-metil-L-valil-A/-[(3 4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 ,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida y 6,3 mg (24,2 mmol) de clorhidrato de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida se acoplaron y procesaron en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 157. Se obtuvieron 1 ,6 mg (13 %. d. t.) del compuesto del título en forma de sólido.
CL-EM (Procedimiento 11): f¾ = 0,89 min; EM (ESlpos): m/z = 1126 (M+H) + Intermedio 120 /V-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxo L-valil-A/-[(3fi,4S,5S)-3-metoxi^ fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)et¡l]amino}propil]pirrolidin-1-¡l}-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-metil-L-valinamida 12,8 mg (13,9 mmol) de Ay-(3-carboxipropil)-/S/-metil-L-valil-A-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 f?)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolid¡n-1-¡l}-5-m y 10,9 mg (41 ,8 mmol) de clorhidrato de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida se acoplaron y procesaron en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 157. Se obtuvieron 10,8 mg (59 %. d. t.) del compuesto del título en forma de sólido.
CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,90 min; EM (ESlpos): m/z = 1126 (M+H) + Intermedio 121 ?/-(4-{2-[6-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d i h id ro- 1 r7^ L-val¡l-W-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[0^^ ¡l]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A-metil-L-valinamida 7,4 mg (7,9 mmol) de A/-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-/V-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-(bencilsulfonil)-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida y 6,2 mg (23,5 mmol) de clorhidrato de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- ¡l)hexanhidrazida se acoplaron y procesaron en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 157. Se obtuvieron 6,9 mg (7 4 % d. t.) del compuesto del título en forma de sólido.
CL-EM (Procedimiento 1 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 1150 (M+H) + Intermedio 122 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutil) L-valil-/V-[(3/?,4S,5S)-1-{(2S)^ metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida mg (9,1 mmol) de A/-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S,3E)-1 ,4-difenilbut-3-en-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida y 7,2 mg (27,4 mmol) de clorhidrato de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 -/-pirrol-1-il)hexanhidrazida se acoplaron y procesaron en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 157. Se obtuvieron 8,2 mg (82 % d. t.) del compuesto del título como sólido de color blanco.
CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,95 min; EM (ESlpos): m/z = 1083 (M+H) + Intermedio 123 A/-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirro ^ [(1 f?,2ft)-3-{[(2S)-1 -tere. -butoxi-3-(1 tf-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 30 mg (30 µ????) de del intermedio 89 se recogieron en 2 mi de 1 ,4-dioxano y se mezclaron con 4 mi de solución saturada de hidrocarbonato de sodio y a continuación se mezclaron con 7,5 mg (50 µ????) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-carboxilato de metilo. La mezcla de reacción se agitó 1 h a TA y después se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 24 mg (74 % d.t.) del compuesto del título. HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,01 min; E (ESlpos): m/z = 1006 (M+H)+.
Intermedio 124 ?/-[6-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ihid ro-1 H-pirroM ^ [(1R,2f?)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-(1H-indol-3-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan- -il]-/\/-metil-L-valinamida 22 mg (20 pmol) de del intermedio 123 se transformaron con 4 mi de ácido trifluoroacético en 8 mi de diclorometano 1 h a TA. Posteriormente la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 11 mg (54 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,8 min; CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,85 min; EM (ESlpos): m/z = 950 (M+H)+.
Intermedio 125 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- ^ [(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 tf-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]p¡rrolidin-1-il}-3-metox¡-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-metil-L-valinamida 22,5 mg (20 pmol) de del intermedio 101 se recogieron en 2 mi de dioxano/agua 1 :1 y a continuación se mezclaron con 5,6 mg (40 µ?t???) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-carboxilato de metilo así como con 0,25 mi de solución saturada de hidrocarbonato de sodio. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA. Después se adicionaron nuevamente 0,25 mi de la solución saturada de hidrocarbonato de sodio y la mezcla de reacción se agitó otros 15 min a TA y a continuación se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 12,8 mg (50 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,95 min; EM (ESlpos): m/z = 1019 (M+H)+.
Intermedio 126 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-H^ 1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2fi)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 64 mg (70 pmol) de A/-(6-am¡nohexil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2F?)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbon¡l)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin^ valinamida (Intermedio 97) se recogieron en 3 mi de dioxano/agua 1 :1 , después se ajustó con 4 mi de solución saturada de hidrocarbonato de sodio al valor de pH 9 y a continuación se mezcló con 16,3 mg (110 pmol) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-carboxilato de metilo. La mezcla de reacción se agitó 1 h a TA y después se concentró al vacío. Después se adicionaron nuevamente 8 mg (55 pmol) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -carboxilato de metilo, la mezcla de reacción se ajustó nuevamente al valor de pH 9 y se ajustó una hora adicional a TA. A continuación se concentró y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Primero se aislaron 31 mg del intermedio aún no ciclado. Se recogieron 27 mg de este intermedio nuevamente en 2 mi de dioxano/agua 1 :1 y después se mezclaron con 250 µ? de solución saturada de hidrocarbonato de sodio. Al cabo de 2 horas de agitación a TA se concentró la mezcla de reacción y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 20 mg (29 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,96 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 992 (M+H)+.
Intermedio 127 A/-{6-[(2,5-dioxopirrolid¡n-1-il)ox¡]-6^ [(1f?,2f?)-3-{[(2S)-1-(bencilamino)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]am¡no}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 17 mg (18 µp???) de A/-(5-carboxipentil)-/V-metil-L-valil-A/-[(3R4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-3-{[(2S)-1-(benc¡lamino)-3-(1H-indol-3-¡l)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metox¡- 2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida (Intermedio 98) se disolvieron en 2,8 mi de diclorometano y se mezclaron con 20 mg (174 mmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y a continuación con 10 mg (52 µ????) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 0,21 mg (0,17 µ????) de DMAP. Al cabo de 4 h de agitación a TA la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 8,2 mg (43 % d.t.) del compuesto del título. HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): R, = 0,98 min; EM (ESlpos): m/z = 1071 (M+H)+.
Intermedio 128 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-p¡rrol-1^ L-valil-A/-[(3/?,4S,5S)-3-metoxi-1-^ oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin -1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 5 mg (5,6 pmol) de A/-(3-carboxipropil)-/ /-metil-L-valil-/\/-[(3 4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 ?,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2- il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida se disolvieron en 845 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 3,2 mg (17 µ????) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 2,6 mg (17 µ?t???) de 1-hidroxi-1H-benzotr¡azol-hidrato, 1,96 µ? de A/,/V-diisopropiletilamina así como con 5,9 mg (22,5 µ????) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 -/-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 2,2 mg (36 %) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,88 min; EM (ESlpos): m/z = 1094 (M+H)+.
Intermedio 129 A/-(6-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-6-oxohexil)-W-meW L-valil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 4 mg (4,3 pmol) de A/-(5-carboxipentil)-/ /-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil^ valinamida se disolvieron en 646 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 2,5 mg (13 µ????) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 2,0 mg (13 pmol) de 1-hidroxi-1H-benzotriazol-hidrato, 2,25 µ? de /,/V-diisopropiletilamina así como con 4,5 mg (17 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó 3h a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 1,9 mg (39 %) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,9 min; EM (ESIpos): m/z = 1134 (M+H)+.
Intermedio 130 W-(4-{[(2R)-1-({5-[(2,5-dioxopirrolidin-1-^ oxobutil)-A/-metil-L-valil^ 3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino} -3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]- V-metil-L-valinamida 10,5 mg (11,7 µ????) de A/-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-A/-[(3 ?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-meti valinamida se disolvieron en 3,7 mi de diclorometano y a continuación se mezclaron con 6,7 mg (35 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 0,7 mg (5,8 pmol) de 4-dimetilaminopiridina así como con 8,2 mg (47 pmol) de terc-butil-[(2R)-2-hidroxipropil]carbamato disponible en el mercado. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 7,5 mg (61 % d. t.) del intermedio protegido con Boc en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1,03 min; EM (ESlpos): m/z = 1056 (M+H)+.
A continuación se escindió el grupo de protección Boc con ácido trifluoroacético. 4,9 mg (0,005 mmol) de del producto en bruto desprotegido después se recogieron sin purificación adicional en 1,8 mi de diclorometano y se mezclaron con 3,7 mg (0,011 mmol) de 1,1'-[(1 ,5-dioxopentan-1 ,5-diil)bis(oxi)]dipirrolidin-2,5-diona, 2,4 µ? (0,014 mmol) de /V,A/-c//lsopropiletilamina y 0,6 mg (5 pmol) de 4-dimetilaminopiridina. La mezcla se agitó durante 2 h a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 0,77 mg (15 % d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 0,93 min; EM (ESlpos): m/z = 1 167 (M+H)+.
Intermedio 131 A/-{4-[(1 -{5-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-5-oxopentanoil}piperidin-4-il)ox^ /V-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2 ?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 10 mg (1 1 pmol) de /\/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-/\/-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1- {(2S)-2-[(1 R,2f?)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxoprop¡l]pirrolidin-1 ^ valinamida se disolvieron en 2 mi de diclorometano y a continuación se mezclaron con 4,3 mg (22 pmol) de clorhidrato de 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 0,88 mg (6 pmol) de 4-dimetilaminopiridina así como con 5,2 mg (22 µ?t???) de 4-hidroxipiperidin-1-carboxilato de bencilo disponible en el mercado. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 5 mg (40 % d. t.) del intermedio protegido con un grupo Z en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 1 ,04 min; EM (ESlpos): m/z = 1 116 (M+H)+.
A continuación se escindió el grupo de protección Z por vía hidrogenolítica en etanol sobre paladio/carbón activado. 4,6 mg (0,005 mmol) de del producto en bruto desprotegido se recogieron después sin purificación adicional en 1 ,8 mi de diclorometano y se mezclaron con 3,8 mg (0,012 mmol)1 , 1 '-[(1 .5-dioxopentan-1 ,5- diil)b¡s(ox¡)]d¡pirrol¡din-2,5-diona, 0,8 µ? (0,005 mmol) de A/,/V-diisoprop¡letilamina y 0,6 mg (5 pmol) de 4-dimetilaminopiridina. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacio. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 0,96 mg (16 % d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 1193 (M+H)+.
Intermedio 132 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazinil}-4-oxpbuti L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1^ oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 15 mg (16,7 pmol) de A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S,2R)-1-(1,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilcicloprop¡l]amino}-3-oxopropil]pirrolidi valinamida se disolvieron en 2500 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 9,6 mg (50 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 7,6 mg (50 pmol) de 1-h¡droxi-1H-benzotriazol-h¡drato, 5,8 µ? de A,W-diisopropiletilamina así como con 17,4 mg (67 µ????) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 11 ,2 mg (52 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,7 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,09 min; EM (ESlpos): m/z = 1106 (M+H)+.
Intermedio 133 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H^irrol-1-il)hexanoil]hidrazinil}-4-oxobuW L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S,3S)-1-(benciloxi)-1-oxo-3-fen 2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxoprop¡l]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-met¡l-1 -oxoheptan-4-¡l]-/V-metil-L-valinam¡da 5,8 mg (6,3 prnol) de A/-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S,3S)-1-(benc¡lox¡)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-1-metox¡-2-met¡l-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metox¡-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida se disolvieron en 943 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 3,6 mg (19 µ????) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 2,9 mg (19 µ?t???) de 1-hidroxi-1/- -benzotriazol-hidrato, 2,2 µ? de A/,/V-diisopropiletilamina así como con 6,6 mg (25 µ????) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 --pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 4,5 mg (64 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora. HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1,03 min; EM (ESlpos): m/z = 1129 (M+H)+.
Intermedio 134 A/-[3-({[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1W-pirroM^ valil-/V-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 f?,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-oxoheptan-4-il]-A -metil-L-valinamida En primer lugar se preparó 4-n itrofen i l-[2-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d i h id ro- 1 H-p i rrol- 1 -¡l)etil]carbamato en condiciones estándar a partir de 1-(2-aminoetil)-1 - -pirrol-2,5-dion-trifluoroacetato disponible en el mercado y 4-nitrofenilclorocarbonato. 5 mg (6 pmol) de A/-(3-aminopropil)-/S/-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2f?)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metí valinamida se disolvieron en 1000 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 2 µ? de /V;A/-diisopropiletilamina así como con 2,2 mg (9 µ????) de 4-nitrofenil-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)et¡l]carbamato. La mezcla se agitó 1 h a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 1,6 mg (23 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,7 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,09 min; EM (ESlpos): m/z = 1036 (M+H)+.
Intermedio 135 ?/-(4-{2-[6-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ih id ro-1 H-piTO^ L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R2 )-3-{[(2S)-1-(benciloxi)-1-oxo-3-fenilpro il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 10 mg (11 pmol) de /V-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-W^ [(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-(bentiloxi)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]am oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida se disolvieron en 4000 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 6,3 mg (33 pmol) de clorhidrato de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 4,5 mg (33 µ????) de 1-hidroxi-1 H-benzotriazol-hidrato, 5,7 µ? de A/,A/-diisopropiletilamina así como con 1 1 ,5 mg (44 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 2,6 mg (14 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,1 mín; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,01 min; EM (ESlpos): m/z = 1115 (M+H)+.
Intermedio 136 A/-(4-{4-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]piperazin-1-il}-4-oxobuti metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-meto^ 1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida En primer lugar se prepararon 1-[4-oxo-4-(piperazin-1-il)butil]-1H-pirrol-2,5-dion-trifluoroacetato en condiciones estándar a partir de terc.-butilpiperazin-1-carboxilato y ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoico en dos etapas. 5 mg (5,6 prnol) de A/-(3-carboxipropil)-/ /-metil-L-valil-/\/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 ?,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S,2f?)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida se disolvieron en 1000 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 2,1 mg (11 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 1 ,7 mg (11 pmol) de 1-hidroxi-1H-benzotriazol-hidrato, 2 µ? de /V,/V-diisopropiletilamina así como con 3,5 mg (5,6 pmol) de 1-[4-oxo-4-(piperazin-1-il)butil]-1H-pirrol-2,5-dion-trifluoroacetato. La mezcla se agitó durante la noche a TA. Después se adicionaron 2,1 mg (5,6 µ?t???) de O^-azabenzotriazol-l-i -A/.A/.A/^/V'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y la mezcla de reacción se agitó otras 3h a TA. A continuación se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se concentraron las correspondientes fracciones y mediante liofilización a partir de agua se obtuvieron 0,6 mg (10 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,9 min; EM (ESlpos): m/z = 1132 (M+H)+.
Intermedio 137 /V-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-1-metilh¡drazino}-4-oxobuW N-metil-L-valil-A/-[(3K,4S,5S)-3-metox¡-1^^ (1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida En primer lugar se prepararon 6-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ih id ro- 1 H-pirrol- 1 -il)-yV-metilhexanhidrazid-trifluoroacetato en condiciones estándar a partir de disponible en el mercado ácido 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)hexanoico y tera-butil-1-metilhidrazincarboxilato en dos etapas. 6,9 mg (8 pmol) de /V-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinami se disolvieron en 2540 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 3,6 mg (9 pmol) de O-ÍZ-azabenzotriazol-l-i -A/.A jA/'./V'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 3 µ? de N,N-diisopropiletilamina así como con 4,1 mg (12 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)-/V-metilhexanhidrazid-trifluoroacetato. La mezcla se agitó durante la noche a TA. A continuación se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 3,9 mg (45 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,93 min; EM (ESlpos): m/z = 1108 (M+H)+.
Intermedio 138 /V-{4-[(2-{[4-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ihid ro- 1 ^ amino]-4-oxobutil}-A/-metil-L-valil-A^^ metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida A partir de terc.-butil-metil[2-(metilamino)etil]carbamato y ácido 4-(2, 5-d ioxo-2 ,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)butanoico se preparó primero en dos etapas 4-(2, 5-d ioxo-2, 5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-/V-metil-A/-[2-(metilamino)et¡l]butanamida-trifluoroacetato. 6,6 mg (7,3 µ????) de A/-(3-carboxiprop¡l)-/\/-metil-L-val¡l-/\/-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metox¡-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxoprop¡l]p¡rrol¡din-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metH valinamida se disolvieron en 2000 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 5,6 mg (14,7 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,/\/,A/',W-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 2,6 µ? de /V,/V-diisopropiletilamina así como con 4,1 mg (9 pmol) de 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-A/-met¡l-/ -[2-(metilamino)etil]butanamida-trifluoroacetato. Al cabo de 3 h de agitación a TA se adicionaron nuevamente las mismas cantidades de HATU y ?/,/V-diisopropiletilamina y la mezcla de reacción después se agitó durante la noche a TA. A continuación se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 4 mg (44 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,91 min; EM (ESlpos): m/z = 1134 (M+H)+.
Intermedio 139 (2R,3S)-3-amino-4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutan-2-il-(3R,4S,7S, 10S)-4-[(2S)-butan-2-il]-7, 10-diisopropil-3-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,1 1-triazapentadecan-15-oato 13 mg (14,7 pmol) de /V-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida se disolvieron en 10 mi de diclorometano y a continuación se mezclaron con 8,4 mg (44 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 5,4 mg (44 pmol) de 4-dimetilaminopiridina así como con 9 mg (29,3 pmol) de A/-(ferc.-butoxicarbonil)- L-treoninato de bencilo disponible en el mercado. La mezcla se agitó 5 h a TA. A continuación, la mezcla de reacción se extrajo dos veces agitando con agua y la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización a partir de dioxano/agua se obtuvieron 14 mg (81 % d. t.) del intermedio protegido en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,3 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,13 min; EM (ESlpos): m/z = 1178 (M+H)+.
A continuación, el grupo de protección Z se escindió hidrogenolíticamente en metanol sobre 10 % paladio/carbón activado. 9,5 mg (0,0087 mmol) de producto en bruto desprotegido después se recogieron sin purificación adicional en 5 mi de DMF y se mezclaron con 5 mg (26,2 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 4 mg (26,2 µ?t???) de 1-hidroxi-1 - -benzotriazol-hidrato, 54,6 µ? de A,A/-diisopropiletilamina así como con 9,1 mg (34,9 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó 1 h a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 9,5 mg (84 % d.t.) del intermedio protegido con Boc.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 1295 (M+H)+.
A continuación se desprotegieron 9,5 mg (7,3 pmol) de con 0,5 mi de ácido trifluoroacético en 2 mi de diclorometano del intermedio protegido con Boc y después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 9 mg (82 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,84 min; EM (ESlpos): m/z = 1195 (M+H)+.
Intermedio 140 /V-(4-{2-[6-(2, 5-d ¡oxo-2, 5-d ih id ro- 1 H-piro^ A/-metil-L-valil-/V-[(3 4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-val¡namida 4,1 mg (12 µ????) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/- -p¡rrol-1-il)-/\/,-metilhexanhidrazid-trifluoroacetato (Intermedio 22) se disuelven junto con 6,9 mg (8 µ?t???) de del compuesto del intermedio 61 en 2,5 mi de DMF y a continuación se mezclaron con 3,5 mg (9 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,/\/;A/',/N/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 3 µ? de /V,A/-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 2,6 mg (30 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,90 y 0,91 min; EM (ESlpos): m/z = 1 120 (M+H)+.
Intermedio 141 ? -[4-({1 -[4-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ih id ro- 1 H-pirrol-1-il)butanoil]piperidin-4-il}oxi)-4-oxobutil]-A/-metil-L-val¡l-A/-[(3R,4S,5S)-3-meto {[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin 1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/N/-metil-L-valinamida 44 mg (49 µ????) de N-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 f?,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-valinamida se disolvieron en 2 mi de diclorometano y a continuación se mezclaron con 18,8 mg (98 µ?t???) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 3,8 mg (24 pmol) de 4-dimetilaminopiridina así como con 23 mg (98 µ????) de 4-hidroxipiperidin-1-carboxilato de bencilo disponible en el mercado. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 22 mg (40 % d. t.) del intermedio protegido con un grupo Z en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,04 min; EM (ESlpos): m/z = 1116 (M+H)+.
A continuación, el grupo de protección Z se escindió hidrogenolíticamente en etanol sobre paladio/carbón activado. 19 mg (19 pmol) de producto en bruto desprotegido después se recogieron sin purificación adicional en 4 mi de DMF y se mezclaron con 7 mg (39 pmol) de ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)butanoico, 11 mg (29 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/\/,/\/,/\/',A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 5 µ? de N,N-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó 1 h a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 7,5 mg (34 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 1147 (M+H)+.
Intermedio 142 W-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 L-valil-A/-[(3/?,4S,5S)-1-{(2S)-2^ oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 9 mg (9,5 pmol) de /V-(3-carbox¡propil)-/V-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(bencilox¡)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metox¡-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil^^ valinamida (Intermedio 72) se disolvieron en 1000 µ? de DMF y a continuación se mezclaron con 10 mg (38 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado, 7,2 mg (19 µ?t???) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/\/,A/,W,A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 8 µ? de N,N-diisopropiletilamina y la mezcla de reacción se agitó 1 h a TA. A continuación se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se concentraron las correspondientes fracciones y mediante liofilización se obtuvieron 6,4 mg (58 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 0,99 min; EM (ESlpos): m/z = 1154 (M+H)+.
Intermedio 143 A/-(4-{2-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-2,2-dimetilbutanoil]hidrazino}-4^ oxobutil)-/V-metil-L-valil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2 )-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 6 mg (6,7 µp???) de A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-/\/-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)- 2- [(1 ?,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]am¡no}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-/V-m valinamida (Intermedio 61) se transformaron con 3 mg (8,7 pmol) de 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/- -pirrol-1-il)-2,2-dimet¡lbutanhidrazid-tr¡fluoroacetato en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 142 en 2 mg (27 % d.t.) del compuesto del título. HPLC (Procedimiento 12): R, = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 3): Rt = 1 ,92 min; EM (ESlpos): m/z = 1106 (M+H)+.
Intermedio 144 /V-(4-{2-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-2,2-dimetilbutanoil]hidrazino}-4-oxobutil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil- 3- {[(2S)-1-(1,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida A una solución de 5 mg (5,6 µ?t???) de A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-/V-[(3/?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 ,2 ?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazi il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida en 1 mi de DMF se adicionaron 7,65 mg (22,5 pmol) de 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)-2,2-dimetilbutanhidrazid-tr¡fluoroacetato, 3,2 mg (16,9 µ????) de EDC, 1 ,96 µ? (11 ,3 µ????) de diisopropiletilamina así como 2,6 mg (16,9 µ?t???) de ????. La mezcla de reacción se agitó 3 h a TA. A continuación se adicionaron otros 0,95 mg (2,8 pmol) de 4-(2,5-dioxo-2,5-dih¡dro-1 H-pirrol-1-il)-2,2-dimetilbutanhidrazid-trifluoroacetato. Después de agitar durante la noche se concentró la mezcla de reacción y se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 3,5 mg (al 85 %, 48 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 3): Rt = 1 ,86 min; m/z = 1094 (M+H)+.
Intermedio 145 W-[3-(2,5-dioxo-2,5-dih¡dro-1H-p¡rrol-1-il^^ metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilociclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/v"-metil-L-valinamida 12 mg (14 µ?p??) de /V-(3-aminopropil)-W-metil-L-valil-/\/-[(3f?)4S)5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2/?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/ /-meti valinamida (Intermedio 66) se recogieron en 750 µ? de dioxano y se mezclaron con 1 ,5 mi de solución saturada de hidrocarbonato de sodio y a continuación se mezclaron con 3,2 mg (21 µ?t???) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-carboxilato de metilo. La mezcla de reacción se agitó 1 h a TA y después se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 4,2 mg (32 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 950 (M+H)+.
Intermedio 146 /V-(4-{2-[6-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ¡h id ro- 1 ^ L-valil-W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-3-({(2S)-1-[bencil(met¡l)amino]-fenilpropan-2-il}amino)-1 -metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]pirrol¡din-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-met¡l-L-valinamida 9 mg (9,8 pmol) de A/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-({(2S)-1 -[bencil(metil)amino]-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il}amino)-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 73) se transformaron en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 133 con 10 mg (39 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)hexanhidrazida en 1 ,8 mg (15 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 5,11 min; EM (ESlpos): m/z = 1128 (M+H)+.
Intermedio 147 A/-{4-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-4-oxobu^ [(1 2R)-3-{[(2S,3S)-1-(benciloxi)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 16 mg (17 pmol) de /V-(3-carboxipropil)-A/-met¡l-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[( 1 R, 2R)-3-{[(2 S, 3S)- 1 -(benci loxi)- 1 -???-3-fen ilbutan-2-i l]am ino}- 1 -metoxi-2-meti I-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metox¡-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 70) se disolvieron en 2 mi de diclorometano y se mezclaron con 2,6 mg (23 mmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y a continuación se mezclaron con 4 mg (21 µ?t???) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Al cabo de 2 h de agitación a TA se adicionaron nuevamente las mismas cantidades de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Después de agitar durante la noche a TA la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 10 mg (56 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,0 min; Intermedio 148 W-{4-[(2-{[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-¡l)butanoil](metil)amino}-etil)amin oxobutil}-A/-metil-L-valil-A/-[(3fi,4^ 3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/ /-metil-L-valinamida 6 mg (7 pmol) de /N/-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-A/-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2 ?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S,2/?)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 61) se unificaron con 2,8 mg (8 µ????) de A/-(2-aminoetil)-4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/- -pirrol-1-il)-/\/-metilbutanamida-trifluoroacetato, 10,1 mg (27 µ?t???) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/N/,/V',/\/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 5 µ? de A/,A/-diisopropiletilamina en 2 mi de DMF y se agitó durante la noche a TA. Después se adicionaron nuevamente 5 mg (23,5 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)- ?/,?/,?/',?/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 3 µ? de A/,/V-diisopropiletilam¡na. Al cabo de otras 5 h de agitación a TA se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se concentraron las correspondientes fracciones y mediante liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 1 ,3 mg (15 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,21 min; EM (ESlpos): m/z = 1120 (M+H)+.
Intermedio 149 A/-{4-[(2-{[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]amino}etil)(met¡l)amin oxobutil}-A/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 2R)-1-metoxi 3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxaz¡nan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 6 mg (7 µ?t???) de /V-(3-carboxipropil)-/\/-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-/\/-metil-L-valinamida (Intermedio 61) se juntaron con 3,1 mg (9 µ????) de 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)-A/-[2-(metilamino)etil]butanamida-trifluoroacetato, 10,1 mg (27 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/N/,/S/,A/',/S/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y 5 µ? de A,/V-diisopropiletilamina en 2 mi de D F y se agitó 4 h a TA. Después se eliminó el disolvente al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se concentraron las correspondientes fracciones y mediante liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 1 mg (13,4 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,89 min; EM (ESlpos): m/z = 1121 (M+H)+.
Intermedio 150 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-¡l)hexano¡l]hidraz¡no}-4-oxobutí L-valil-A/-[(3/?,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S,2R)-2-fenil-1-(propilcarbamoil)c¡clopropil]amino}propil]pirrolid¡n-1-il}-5-metil-1-oxohepta 4-il]-/V-metil-L-valinamida 7,9 mg (9 pmol) de A/-(3-carboxipropil)-/\/-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)- 2-[(1 R,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S,2 ?)-2-fenil-1-(propilcarbamoil)-ciclopropil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-m se disolvieron en 3 mi de DMF y a continuación se mezclaron con 10,4 mg (54 rnol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, 8,3 mg (54 pmol) de 1-hidroxi-1 /- -benzotriazol-hidrato, 9 µ? de ?/,/V-diisopropiletilamina así como con 9,5 mg (36 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 4,3 mg (22 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora. HPLC (Procedimiento 6): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,93 min; EM (ESlpos): m/z = 1078 (M+H)+.
Intermedio 151 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]h¡drazino}-4-oxobutil)-/V-meW L-valil-/V-[(3 ?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-3-{[(1 S,2f?)-1-carbamoil-2-fenilciclopropil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1^ oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida El compuesto se preparó a partir del compuesto del intermedio 81 análogamente al intermedio 150.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 1036 (M+H)+.
Intermedio 152 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-p¡rrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobuti L-valil-/vH(3R,4S,5S)-1 -{(2S)^ fenilciclopropil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida mg (12 pmol) de /V-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 f?,2«)-3-{[(1 S,2 ?)-1 -(etoxicarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida se disolvieron en 3 mi de DMF y a continuación se mezclaron con 8,9 mg (23 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/V,A/' /\/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 10 µ? de N,N-düsopropiletilamina así como con 12 mg (47 µ?t???) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 - -pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla se agitó 1 h a TA. A continuación se concentró al alto vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 5,8 mg (37 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 9): Rt = 4,99 min; EM (ESIpos): m/z = 1066 (M+H)+.
Intermedio 153 ?/-[1 -(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-12,15-dioxo-3,6,9-trioxa-13,14-diazaoctadecan-18-il]-/V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida una solución de 5 mg (5,6 µ????) de A/-(3-carboxipropil)-W-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida en 1 mi de DMF se adicionaron 9,7 mg (22,5 µ?t???) de 3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 /-/-pirrol-1 -il)etoxi]etoxi}etoxi)-propanhidrazid-trifluoroacetato, 3,2 mg (16,9 µ????) de EDC, 1,96 µ? (11 ,3 µmol) de ?,?-diisopropiletilamina así como 2,6 mg (16,9 µ?t???) de HOBT. La mezcla de reacción se agitó 3 h a TA. A continuación se adicionaron otros 1,2 mg (2,8 µ?t???) de 3-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)-propanhidrazid-trifluoroacetato. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA y a continuación se purificó mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron 3,6 mg (51 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,90 min; m/z = 1185 (M+H)+ Intermedio 154 (2R,3S)-3-amino-4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutan-2-il-(3R,4S,7S,10S)-4-[(2S)-butan-2-il]-7,10-diisopropil-3-(2-{(2S)-2-[(1 R,2f?)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2f?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-oxoetil)-5, 11 -dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8, 11 -triazapentadecan-15-oat 15 mg (17 prnol) de W-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-val¡l-A/-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1-{(2S)-2-[(1 R2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilc¡clopropil]amino}-3-oxopropil]pirrol¡din-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4^ valinamida se disolvieron en 10 mi de diclorometano y a continuación se mezclaron con 12,8 mg (67 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbod¡imida, 10 mg (83 µ????) de 4-dimetilaminopiridina así como con 10,3 mg (33 µ????) de N-(terc. -butoxicarbonil)-L-treoninato de bencilo disponible en el mercado. La mezcla se calentó 4 h bajo reflujo. Después se adicionaron nuevamente las mismas cantidades de reactivo de acoplamiento y 4-dimetilaminopiridina y la mezcla de reacción se calentó durante la noche bajo reflujo. A continuación se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano, se extrajo una vez agitando con agua, se separó la fase orgánica y se concentró al alto vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 7,7 mg (37 % d. t.) del intermedio protegido en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,5 min; CL-EM (Procedimiento 1): R, = 1 ,13 min; EM (ESlpos): m/z = 1190 (M+H)+.
A continuación se eliminó el grupo de protección benciléster por hidrogenacion bajo hidrógeno a presión normal en metanol sobre 10 % paladio/carbón activado y el ácido así obtenido tal como se describió para el intermedio 151 se enlazó con 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 /- -pirrol-1-il)hexanhidrazida. En un último paso se escindió el grupo de protección Boc con ácido trifluoroacético. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 0,22 mg (2,5 % d. t. en 3 etapas) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,81 min; EM (ESlpos): m/z = 1207 (M+H)+.
Intermedio 155 /V-(4-{2-[6-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ih id ro-1 L-valil-A/-[(3RI4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-1-oxo-3-fenilprop^ il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 152 a partir de A/-(3-carbox¡propil)-A/-metil-L-valil-/V-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1f?,2R)-3-{[(2S)-1 -amino-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida y 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,82 min; EM (ESlpos): m/z = 1024 (M+H)+.
Intermedio 156 A/-(3-{[(1-{[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]carbonil}ciclopropil)carbonil]amino}^ro metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-3-metox¡-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía a la última etapa del intermedio 131 a partir de A/-(3-aminopropil)-/V-metil-L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 - metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2 ?)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamid y 1 ,1'-[ciclopropan-1 ,1-d¡ilbis(carboniloxi)]dipirrolidin-2,5-diona, que se había obtenido antes del correspondiente ácido dicarboxílico.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,92 min; EM (ESlpos): m/z = 1080 (M+H)+.
Intermedio 157 A/-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirro ^ L-valil-/V-[(3/?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida 15 mg (18 µ????) de (/V-(3-carboxipropil)-/V-metil-L-valil-A/-[(3 ?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/\/-metil-L-valinamida se disolvieron en 3,8 mi de DMF y a continuación se mezclaron con 27 mg (70 µ?t???) de 0-(7-azabenzotnazol-1-il)-/N/,A/,/V',/V-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 12 µ? de ?,?-diisopropiletilamina así como con 14 mg (53 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 - -pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado. La mezcla de reacción se agitó 1 h a TA. A continuación se concentró al alto vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 6,2 mg (33 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,85 min; EM (ESlpos): m/z = 1063 (M+H)+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6, señales características): d = 10,8 (d, 1 H), 9,8-9,7 (m, 2H), 9,6 y 9,4 (2m, 1 H), 8,9, 8,88, 8,78 y 8,75 (4d, 1 H), 8,08 y 7,85 (2d, 1 H), 7,6-6,9 (m, 9H), 4,7-4,4 (m, 3H), 3,4 (t, 2H), 3,23, 3,2, 3,18, 3,0, y 2,99 (5s, 9H), 2,8 (m, 3H), 2,1 (t, 2H), 1 ,06 y 1 ,01 (2d, 3H), 0,95-0,8 (m, 15H), 0,8-0,75 (dd, 3H).
Intermedio 158 /V-[4-({(2R)-1-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-4-m A/-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(bencilamino)-l -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida 13 mg (14,7 pmol) de /V-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-/V-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2ft)-3-{[(2S)-1-(bencilamino)-1-oxo oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida se disolvieron en 4 mi de dimetilformamida y a continuación se mezclaron con 9,4 mg (25 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/V,/V',/V'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 6 µ? de A/,A/-diisopropiletilamina así como con 7 mg (31 µ????) de clorhidrato de terc-butil-D-leucinato disponible en el mercado. La mezcla se agitó 5 h a TA y a continuación se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización a partir de dioxano/agua se obtuvieron 6,5 mg (49 % d. t.) del intermedio protegido en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,2 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,21 min; EM (ESlpos): m/z = 1076 (M+H)+.
De este intermedio protegido primero se escindió con ácido trifluoroacético en diclorometano el grupo de protección Boc, obteniéndose 6,2 mg (99 % d.t.) del compuesto desprotegido. 5,2 mg (5 pmol) de este intermedio se recogieron en 1 ,5 mi de diclorometano y se transformaron con 0,8 mg (7 µ?t???) de A/-hidroxisuccinimida en presencia de 1 ,2 mg (6 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 0,16 mg (1 µ????) de 4-dimetilaminopiridina. Al cabo de 2 h de agitación a TA se concentró la mezcla de reacción y se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 1 ,3 mg del compuesto del título que en parte se hidrolizó en un educto.
Intermedio 159 W-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobu^ L-valil-W-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-(bencilamino)-1-oxo-3-feni 2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 157 a partir de /V-(3-carboxipropil)-A/-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(2S)-1 -(bencilamino)-l -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida y 6- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/7-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado.
Rendimiento: 6 mg (53 % d.t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 1114 (M+H)+.
Intermedio 160 W-(4-{2-[6-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ih id ro- 1 H-p^^ L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[0^ oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-met¡l-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 157 a partir de 20 mg (21 µ????) de ?/-(3-?3?????G???)-?/^ß???-?-?3???-?/-[(3/?,48,58)-1-{(2S)-2-[(1 2R)-3-{[(2S)-1 -(bencilamino)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-¡l]-/V-metil-L-valinamida y 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 -/-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado.
Rendimiento: 13 mg (52 % d.t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 0,92 min; EM (ESlpos): m/z = 1 153 (M+H)+.
Intermedio 161 /V-(6-{2-[6-(2 , 5-d ¡oxo-2 , 5-d ¡ h id ro- 1 H-pirro^^ L-valil-A/-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 ?,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con la síntesis descrita en el intermedio 157 a partir de /V-(5-carboxipentil)-A/-metil-L-valil-W-[(3 ,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metox¡-5-m y 6- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1/-/-pirrol-1-il)hexanhidrazida disponible en el mercado.
Rendimiento: 0,8 mg (16 % d.t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1,6 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,78 min; EM (ESlpos): m/z = 1092 (M+H)+.
Intermedio 162 ?/-{6-[(2 , 5-d ioxopirrol id ¡ n- 1 -il)oxi]-6-ox^ {(2S)-2-[(1 R,2f?)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]p¡rrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida 18 mg (20 pmol) de A/-(5-carboxipentil)-A/-metil-L-valil-/ /-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 f?,2K)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-m valinamida (Intermedio 64) se disolvieron en 3,2 mi de diclorometano y se añadieron 22 mg (190 mmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y a continuación se mezclaron con 11 mg (60 mol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 0,24 mg (0,17 pmol) de DMAP. Al cabo de 2 h de agitación a TA se adicionaron nuevamente 22 mg (190 mmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona, 11 mg (60 µ?t???) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 0,24 mg (0,17 pmol) de DMAP y la mezcla de reacción se agitó otra hora adicional a TA. A continuación se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 8,2 mg (41 % d.t.) del compuesto del título. HPLC (Procedimiento 5): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 0,9 min; EM (ESlpos): m/z = 1024 (M+H)+.
Intermedio 163 [(1S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropil](1 ,4-dihidro-3H-2,3-benzoxazin-3-il)metanon-trifluoroacetato En primer lugar se preparó de 265 mg (0,82 mmol) de ter-butil-[(1S,2R)-1-(hidroxicarbamoil)-2-fenilciclopropil]carbamato (compuesto de partida 7) mediante reacción con 1,2-Bis(bromometil)benceno análogamente a una instrucción de la literatura (véase H. King, J. Chem. Soc. 1942, 432) el intermedio protegido con Boc ter-butil-[(1 S,2R)-1 -(1 ,4-dihidro-3H-2,3-benzoxazin-3-ilcarbonil)-2-fenilciclopropiljcarbamato.
Rendimiento: 108 mg (34 % d. t.) CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,3 min; EM (ESlpos): m/z = 395 (M+H)+. 108 mg (0,27 mmol) de este intermedio se recogieron en 3,7 mi de diclorometano, se mezclaron con 1 ,8 mi de ácido trifluoroacético y se agitaron 15 min a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo restante se liofilizó con dioxano. Se obtuvieron 112 mg del compuesto del título en resultante cuantitativa en forma de espuma incolora.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,7 min; EM (ESlpos): m/z = 295 (M+H)+.
Intermedio 164 A/-metil-L-valil-A/-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-(1 ,4-dihidro-3H-2,3-benzoxazin-3-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-1-metoxi-2-metil-3- oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-vali trifluoroacetato 166 mg (0, 196 mmol) de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-A/-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1 -m^ metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida (Intermedio 10) se recogieron en 40 mi de DMF y sucesivamente se añadieron 80 mg (0,196 mmol) de [(1 S,2R)-1 -amino-2-fenilciclopropil](1 ,4-dihidro-3/-/-2,3-benzoxazin-3-il)-metanon-trifluoroacetato (Intermedio 163), 1 12 mg (0,294 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/V,/V',/V'-tetra-metiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 682 µ? (3,9 mmol) de ?/,/V-düsopropil-etilamina. La mezcla después se agitó durante la noche a TA. La mezcla de reacción después se concentró al vacío, el residuo se recogió en acetato de etilo y la solución se lavó con solución acuosa saturada de cloruro de sodio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El residuo finalmente se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron de esta manera 19 mg (9 % d. t.) del intermedio protegido con Fmoc W-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/\/-metil-L-valil-/ /-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]am¡no}-1 -meto metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,68 min; CL-EM (Procedimiento 1 ): Rt = 1 ,51 min; EM (ESlpos): m/z = 1083 (M+H)+. 19 mg (0,015 mmol) de este intermedio se disolvieron en 4 mi de D F. Después de la adición de 817 µ? de piperidina ser agitó la mezcla de reacción 5 min a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo primero se digirió con dietiléter y a continuación se purificó mediante HPLC preparativa (eluyente: acetonitrilo + 0,1 % TFA / 0,1 % ac. TFA). Las correspondientes fracciones se juntaron, el disolvente se eliminó al vacío y el residuo después se liofilizó de dioxano/agua. Se obtuvieron 12 mg (92 % d. t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 6): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 861 (M+H)+.
Intermedio 165 N-(6-aminohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-(1 ,4-dihidro-3H-2,3-benzoxazin-3-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 20 mg (0,021 mmol) de del intermedio 164 se preparó en analogía con la preparación del intermedio 97 con (6-oxohexil)carbamato de bencilo en presencia de cianoborohidruro de sodio y posterior escisión hidrolítica del grupo de protección Z (con 5 % de paladio sobre carbón como catalizador, en metanol como disolvente) el compuesto del título.
Rendimiento: 4,5 mg (23 % d. t. en dos etapas) HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,9 min; EM (ESlpos): m/z = 960 (M+H)+.
Intermedio 166 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pi^ [(1 R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-(1 ,4-dihidro-3H-2,3-benzoxazin-3-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida mg (4,5 µ?t???) de del intermedio 165 se recogieron en 1 mi de dioxano/agua 1 :1 y a continuación se mezclaron con 1 mg (6,8 pmol) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-carboxilato de metilo así como con 50 µ? de solución saturada acuosa de hidrocarbonato de sodio. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA. Después se adicionaron nuevamente 50 µ? de la solución saturada acuosa de hidrocarbonato de sodio y la mezcla de reacción se agitó otros 15 min a TA y a continuación se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvo 1 mg (21 % d.t.) del compuesto del título en forma de espuma incolora.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,1 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,08 min; EM (ESlpos): m/z = 1040 (M+H)+.
Intermedio 167 3-{2-[2-(2-oxoetoxi)etoxi]etoxi}propanoato de bencilo El compuesto del título se preparó de 6 g (21 ,55 mmol) de ácido 3-{2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi}propanoico disponible en el mercado en condiciones estándar primero mediante la esterificación con cloruro de bencilo y carbonato de cesio y posterior oxidación con el completo de trióxido de azufre-piridina.
Rendimiento: 611 mg (10 % d.t. en dos etapas) CL-EM (Procedimiento 2): Rt = 1 ,69 min; EM (ESlpos): m/z = 311 (M+H)+.
Intermedio 168 N-(2-{2-[2-(2-carboxietoxi)etoxi]etoxi}etil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1 H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 69 mediante el acoplamiento de A/-[(9/- -fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-/\/-[(2f?,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-/ /-met¡l-L-valinamida (Intermedio 4) y A/ -{(2f?,3/?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-triptofanamida-trifluoroacetato (Intermedio 49) en presencia de O-iZ-azabenzotriazol-l-i -tyty/V^/V-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Fmoc por medio de piperidina el compuesto amina A/-metil-L-valil-A/-[(3 ,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 ?,2 ?)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato. 25 mg (0,028 mmol) de este compuesto y 17,5 mg (0,06 mmol) de del intermedio 167 se reunieron en 2 mi de metanol y se mezclaron con 12,6 mg (0,14 mmol) del complejo de borano-piridina y 2,5 mi de ácido acético. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA. Después se adicionaron nuevamente las mismas cantidades del complejo de borano-piridina y ácido acético y la mezcla de reacción se agitó otras 24h a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones y la liofilización a partir de dioxano/agua 1 :1 se obtuvieron 26,5 mg (88 % d.t.) del compuesto del título protegido con el grupo Z.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,04 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 1064 (M+H)+. 25 mg (0,024 mmol) de este intermedio se recogieron en 10 mi de metanol y se hidrogenaron sobre paladio al 10 % sobre carbón activado durante 45 min a TA bajo hidrógeno a presión normal. El catalizador después se separó por filtración y el disolvente se eliminó al vacío. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 19,7 mg (85 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1,8 min; CL-EM (Procedimiento 1): R, = 0,83 min; EM (ESlpos): m/z = 974 (M+H)+.
Intermedio 169 N-{2-[2-(2-{3-[(2,5-dioxopirrolid¡n-1-il)oxi]-3-oxopropoxi}etoxi)etoxi]etil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 10 mg (10 pmol) de del intermedio 168 se disolvieron en 3 mi de DMF y se añadieron 3,5 mg (30 mmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y se mezclaron a continuación con 2,4 mg (10 µ?t???) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 5 µ? de ?,?-diisopropiletilamina. Al cabo de 20 h de agitación a TA se adicionaron 8 mg (0,02 mmol) de HATU y la mezcla de reacción nuevamente se agitó durante la noche a TA y después se concentró al vacío. El residuo restante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización a partir de dioxano se obtuvieron 8,6 mg (64 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1,9 min; CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,81 min; EM (ESlpos): m/z = 1071 (M+H)+.
Intermedio 170 N-(6-aminohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡- 2-metil-3-{[(2S,3S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 101 en dos etapas a partir de 26 mg (0,028 mmol) de del intermedio 15.
Rendimiento: 16,7 mg (63 % d.t. en dos etapas) HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,81 min; EM (ESlpos): m/z = 914 (M+H)+.
Intermedio 171 N-(6-{[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]amino}hexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S,3S)-1-(1,2- oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirroIidin-1-il}-5-m -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 6,7 mg (7,3 pmol) de del compuesto del intermedio 170 y 3 mg (14,7 pmol) de ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoico disponible en el mercado se recogieron en 2 mi de DMF y se mezclaron con 5,6 mg (14,7 µ????) de 0-(7-azabenzotriazol-l-ilJ-W./S/^^A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como con 2 µ? de A/,A/-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó 30 min a TA. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Las correspondientes fracciones se reunieron, el disolvente se eliminó al vacío y el residuo a continuación se liofilizó con dioxano. Así se obtuvieron 4,5 mg (56 % d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,12 min; EM (ESlpos): m/z = 1079 (M+H)+.
Intermedio 172 (2-{2-[2-(2-oxoetoxi)etoxi]etoxi}etil)carbamato de bencilo El compuesto del título se preparó de 2-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}etanol disponible en el mercado en condiciones estándar primero mediante introducción del grupo de protección Z y posterior oxidación con el complejo de trióxido de azufre-piridina.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,4 min; CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,65 min; EM (ESlpos): m/z = 326 (M+H)+.
Intermedio 173 {2-[2-(2-oxoetoxi)etoxi]etil}carbamato de bencilo El compuesto del título se preparó análogamente al intermedio 172 con 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etanol disponible en el mercado en condiciones estándar primero mediante introducción del grupo de protección Z y posterior oxidación con el completo de trióxido de azufre-piridina.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1,3 min; CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,68 min; EM (ESlpos): m/z = 282 (M+H)+.
Intermedio 174 N-(2-{2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etoxi}etil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilociclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metiU valinamida 47 mg (0,05 mmol) de del intermedio 16 se preparó en analogía con la preparación del intermedio 167 con (2-{2-[2-(2-oxoetoxi)etoxi]etoxi}etil)carbamato de bencilo en presencia del complejo borano-piridina mediante aminación reductiva. A continuación se eliminó el grupo de protección Z por vía hidrogenolítica con 5 % paladio sobre carbón como catalizador y en metanol como disolvente y se obtuvieron 38 mg (66 % d.t. en dos etapas) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,8 min; EM (ESlpos): m/z = 988 (M+H)+.
Intermedio 175 N-[2-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)etil]-N-met^ N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida La preparación se realizó en analogía con las síntesis descritas para el intermedio 166 a partir de 34 mg (0,03 mmol) de del intermedio 174.
Rendimiento: 8,3 mg (23 % d.t.) HPLC (Procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 1068 (M+H)+.
Intermedio 176 N-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etil)-N-metil-L-valil-N [(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1 H-indol-3-il)-1-oxopropan-2- il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida La preparación se realizó en analogía con los intermedios 174 y 175 comenzando la aminación reductiva del intermedio 16 con el intermedio 173, posterior desprotección y conformación de la maleinimida.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (Procedimiento 11): R, = 0,8 min; EM (ESlpos): m/z = 981 (M+H)+.
Intermedio 177 N-[2-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)etil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -amino-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-met¡l-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida La preparación se realizó en analogía con los intermedios 174 y 175 comenzando con la aminación reductiva del intermedio 16 con el intermedio 172, posterior desprotección y conformación de la maleinimida.
HPLC (Procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (Procedimiento 1): R, = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 1025 (M+H)+.
Intermedio 178 N^4-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-4-oxobutil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2 [(1R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metox^ 3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-val^ La preparación se realizó en analogía con el intermedio 162 a partir de 6 mg del intermedio 82.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,82 min; EM (ESlpos): m/z = 953 (M+H)+.
Intermedio 179 4-[(1 E,3S)-3-amino-4-fenilbut-1-en-1-il]bencensulfónico -trifluoroacetato Una mezcla de 13,6 mg (0,06 mmol) de acetato de paladio(ll), 469 mg (1 ,46 mmol) de sulfonato de 4-yodobencensulfonato de potasio, 300 mg (1 ,21 mmol) de (S)-ter-butil-1-fenilbut-3-en-2-il-carbamato, 16,5 mg (0,12 mmol) de fenilurea y 167,6 mg (1 ,21 mmol) de carbonato de potasio en 7,5 mi de DMF se calentaron en un horno de microondas durante 15 min a 160 °C. Das producto en bruto a continuación se purificó directamente mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 312 mg de una mezcla de 31 % del compuesto protegido con BOC y 69 % de la amina libre.
Esta mezcla a continuación se recogió en 30 mi de diclorometano, se mezcló con 1 mi de ácido trifluoroacético y se agitó durante 20 h a TA. Después de concentrar al vacío el residuo se mezcló con dietiléter, el precipitado producido se aspiró y se lavó con dietiléter. Se obtuvieron así 200 mg (62 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 11): Rt = 0,44 min; EM (ESlpos): m/z = 304 (M+H)+.
Intermedio 180 4-[(3R)-3-amino-4-fenilbutil]bencensulfón¡co 100 mg (0,25 mmol) de ácido 4-[(1E,3S)-3-amino-4-fenilbut-1-en-1-il]bencensulfónico-trifluoroacetato se suspendieron en 10 mi de ácido acético así como algunas gotas de DMF y agua, se mezclaron con 70 mg (0,07 mmol) de paladio sobre carbón (al 10 %) y se hidrogenaron 24 h a 2,2 bar presión de hidrógeno. La solución se filtró, el filtrado se purificó mediante HPLC prep.
Se obtuvieron 29 mg (al 76 %, 21 % d.t.) de producto.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,46 min; EM (ESlpos): m/z = 306 (M+H)+.
Intermedio 181 N-(ter-butoxicarbonil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S,3E)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)but-3-en-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida A una solución de 90 mg (0,13 mmol) de N-(ter-butoxicarbonil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida en 4 mi de DMF se adicionaron 60 mg (0,16 mmol) de HATU y 69 µ? (0,39 mmol) de base de Hünig. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA y a continuación se mezclaron con 60 mg (0,15 mmol) de 60,3 mg (0,13 mmol) de ácido 4-[(1E,3S)-3-amino-4-fenilbut-1-en-1-il]bencensulfónico-trifluoroacetato. Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 127 mg de una mezcla 44:56 del compuesto del título y de la amina ya desprotegida.
CL-EM (Procedimiento 1): R, = 1 ,21 min; EM (ESlpos): m/z = 971 (M+H)+; Rt = 0,84 min; EM (ESlpos): m/z = 871 (M+H)+ para el compuesto desprotegido.
Intermedio 182 N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S,3E)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)but-3-en-2-il]am oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 90 mg del intermedio 180 se disolvieron en 4,6 mi de diclorometano y se mezclaron con 0,92 mi de ácido trifluoroacético. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA y a continuación se concentró. El producto en bruto obtenido se purificó mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron 91 mg (98 % d.t.) del compuesto diana.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,85 min; EM (ESlpos): m/z = 871 ( +H)+ Intermedio 183 N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S,3E)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)but-3-en-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Se dispusieron 16,7 µ? (0,03 mmol) de una solución acuosa al 15 % de aldehido succínico en 943 µ? de metanol y se mezclaron con 17 mg (0,02 mmol) de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S,3E)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)but-3-en-2-il]amino}propil]-pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4n N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato (Intermedio 181) así como con 1 ,1 µ? (0,02 mmol) de ácido acético. La mezcla de reacción se agitó 5 min a TA y a continuación se mezclaron con 2,9 µ? (0,02 mmol) del complejo de borano-piridina. Al cabo de 1h se adicionaron respectivamente otros 2 equivalentes de aldehido succínico, ácido acético y complejo de borano-piridina y se agitó 20 h a TA. La mezcla de reacción después se purificó mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron así 20 mg (al 83 %, 80 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 957 (M+H)+ Intermedio 184 N-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S,3 1 -fenil-4-(4-sulfofenil)but-3-en-2-il]amino}propil]p¡rrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida Se agitaron 8 mg (7,5 µ????) de N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S,3E)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)but-3-en-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, 2,8 mg (8,2 pmol) de 6-(2,5-d¡oxo-2,5-dih¡dro-1 H-pirrol-1-il)hexanhidrazid-trifluoroacetato, 3,4 mg (9 pmol) de HATU así como 3,9 µ? de base de Hünig en 0,77 ml de DMF 20h a TA. A continuación la mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron 3 mg (31 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,90 min; EM (ESlpos): m/z = 1164 (M+H)+ Intermedio 185 N-{4-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxH-oxobutil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxh {(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S,3E)-1 -fenil-4-(4-sulfofenil)but-3-en-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida A una solución de 8 mg (7,5 pmol) de N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2S,3E)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)but-3-en-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-meti L-valinamida en 2 mi de DMF se adicionaron 8,6 mg (74,8 pmol) de N-hidroxisuccinimida, 8,5 mg (22,4 pmol) de EDCI y 0,1 mg (0,75 pmol) de DMAP. La mezcla de reacción se agitó 20 h a TA. A continuación se adicionaron 1 ,3 µ? (7,5 pmol) de base de Hünig y se agitó otra hora más. La mezcla de reacción después se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 2,6 mg (72 % pureza; 21 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,89 min; EM (ESlpos): m/z = 1054 (M+H)+ Intermedio 186 N-(ter-butoxicarbonil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2R)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)butan-2-il]amino}propil]pirrolidir^ il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida A una solución de 43 mg (0,06 mmol) de N-(ter-butoxicarbonil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1-metox¡propil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam¡da en 1 ,9 mi de DMF se adicionaron 29 mg (0,07 mmol) de HATU y 33 µ? (0,19 mmol) de base de Hünig. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA y a continuación se mezcló con 29 mg (0,07 mmol) de ácido 4-[(3R)-3-amino-4-fenilbutil]bencensulfónico -trifluoroacetato. Después de agitar durante la noche la mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 58 mg de una mezcla 45:55 del compuesto del título y de la amina ya desprotegida.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 1 ,09 min; EM (ESlpos): m/z = 973 (M+H)+; R, = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 873 (M+H)+ para el compuesto desprotegido.
Intermedio 187 N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-{(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2R)-1 -fenil-4-(4-sulfofenil)butan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 58 mg del intermedio 186 se disolvieron en 4,1 mi de diclorometano, se mezclaron con 0,41 mi de ácido trifluoroacético y se agitó 30 min a TA. Después de concentrar al vacío el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron 50 mg (90 %- de pureza; 85 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,87 min; E (ESlpos): m/z = 873 (M+H)+ Intermedio 188 N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2R)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)butan-2-il]am¡no}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Se dispusieron 171 µ? (0,26 mmol) de una solución acuosa al 15 % de aldehido succínico en 2,5 mi de metanol y se mezclaron con 50 mg (0,05 mmol) de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2R)-1 - fenil-4-(4-sulfofenil)butan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-o metil-L-valinamida-trifluoroacetato así como con 11 ,6 µ? (0,2 mmol) de ácido acético. La mezcla de reacción se agitó 5 min a TA y a continuación se mezcló con 30 µ? (0,24 mmol) del complejo de borano-piridina. Al cabo de 24 h de agitación se adicionó otro equivalente del complejo de borano-piridina y se agitó otras 2 h. La mezcla de reacción después se purificó mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron 40 mg (90 %- de pureza; 66 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,91 min; EM (ESlpos): m/z = 959 (M+H)+ Intermedio 189 N-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2R)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)butan-2-¡l]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il^^ metil-L-valinamida Se agitaron 10 mg (9,3 pmol) de N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2R)-1 -fenil-4-(4-sulfofenil)butan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, 3,5 mg (10,3 pmol) de 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanhidrazid-trifluoroacetato, 4,3 mg (11 ,2 pmol) de HATU así como 4,9 µ? (28 pmol) de base de Hünig en 1 mi de DMF 20h a TA. A continuación se purificó la mezcla de reacción mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron 4,2 mg (92 %- de pureza; 33 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): Rt = 0,91 min; EM (ESlpos): m/z = 1166 (M+H)+ Intermedio 190 N-{4-[(2,5-dioxop¡rrolidin-1-¡l)oxi]-4-oxobutil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metox {(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(2R)-1 -fenil-4-(4-sulfofenil)butan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam A una solución de 10 mg (9,3 pmol) de N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metox¡-2-metil-3-oxo-3-{[(2R)-1-fenil-4-(4-sulfofenil)butan-2-il]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida en 2,5 mi de DMF se adicionaron 10,7 mg (93 µ????) de N-hidroxisuccinimida, 10,6 mg (28 pmol) de EDCI así como 0,12 mg (0,9 pmol) de DMAP. La mezcla de reacción se agitó 20 h a TA y a continuación se purificó mediante HPLC preparativa.
Se obtuvieron 3,8 mg (72 %- de pureza; 25 % d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (Procedimiento 1): R, = 0,90 min; EM (ESlpos): m/z = 1055 (M+H)+ Intermedio 191 Trifluoroacetato de (2R,3R)-A/-[(2S)-3-(1H-lndol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida El compuesto del título se preparó en analogía con la síntesis del Intermedio 7 en dos etapas a partir del compuesto de partida 1 y trifluoroacetato de (2S)-2-amino-3-(1/- -indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)propan-1-ona (Intermedio 99).
Rendimiento en dos etapas: 62 mg (67% d. t.) HPLC (procedimiento 6): Rt = 1 ,65 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,7 min; EM (ESlpos): m/z = 443 (M+H)+.
Intermedio 192 N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 1015 mg (1 ,59 mmol) de /\/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/N/-metil-L-valil-/\/-[(2ft,3S,4S)-1 -carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 4) se recogieron en 50 mi de DMF, se mezclaron con 654 mg (2,39 mmol) de tetrafluoroborato de 2-bromo-1-etilpiridinio (BEP) y 2,8 mi de A/,/S/-diisopropiletilamina y se agitó 10 min a TA. Después se adicionaron 1083 mg (1 ,75 mmol) de trifluoroacetato de (2 3R)-A/-[(2S)-3-(1H-lndol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida (Intermedio 191) y la mezcla a continuación se trató durante 30 min en el baño de ultrasonido a TA. La mezcla de reacción después se concentró al vacío y el residuo se recogió en 300 mi de acetato de etilo. La fase orgánica se lavó sucesivamente con solución acuosa al 5% de ácido cítrico y solución acuosa al 5% de hidrogenocarbonato de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El producto en bruto así obtenido (1684 mg) se recogió sin purificación ulterior en 20 mi de acetonitrilo, se mezcló con 2 mi de piperidina y la mezcla de reacción a continuación se agitó 10 min a TA. Después se concentró al vacío y el residuo se mezcló con éter dietílico. El disolvente se concentró nuevamente por evaporación y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol/solución acuosa de amoníaco al 17% 15:1 :0,1 -> 15:2:0,2). Las correspondientes fracciones se combinaron, se eliminó el disolvente al vacío y el residuo se liofilizó a partir de acetonitrilo/agua. Así se obtuvieron 895 mg (67% en dos etapas) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,84 min; EM (ESlpos): m/z = 840 (M+H)+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): d = 10,8 (d, 1 H), 8,3 y 8,05 (2d, 1 H), 8,0 (d, 1 H), 7,5 (m, 1 H), 7,3 (m, 1H), 7,15 y 7,08 (2s, 1 H) 7,05-6,9 (m, 2H), 5,12 y 4,95 (2m, 1H), 4,65 (m, 1 H), 4,55 (m, 1H), 4,1-3,8 (m, 4H), 3,75 (d, 1H), 3,23, 3,18, 3,17, 3,12, 2,95 y 2,88 (6s, 9H), 3,1-3,0 y 2,85 (2m, 2H), 2,65 (d, 1H), 2,4-2,2 (m, 3H), 2,15 (m, 3H), 1 ,95 (m ancho, 2H), 1 ,85-0,8 (m ancho, 11H), 1,08 y 1 ,04 (2d, 3H), 0,9-0,75 (m, 15H), 0,75-0,65 (dd, 3H) [otras señales ocultas debajo del pico H2O].
Intermedio 193 N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 50 mg (0,052 mmol) de N-metil-L-val¡l-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3- (1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3^ oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-meti (Intermedio 192) y 204 µ? de una solución acuosa al 15% de ácido 4-oxobutanoico se reunieron en 2 mi de metanol y con 23,4 mg (0,252 mmol) del complejo borano-piridina y 6 µ? de ácido acético. La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche. A continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones se obtuvieron 38 mg (78% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (procedimiento 9): Rt = 4,7 min; EM (ESlpos): m/z = 926 (M+H)+.
Intermedio 194 N-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-d¡hidro-1 H-p¡rrol-1-^ L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía a la síntesis descrita para el Intermedio 157 a partir de 10 mg (11 pmol) de N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2- il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxohept^ il]-N-met¡l-L-valinam¡da y la 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-p¡rrol-1-il)hexanh¡draz¡da que puede adquirirse comercialmente.
Rendimiento: 4,4 mg (35% d.t.) HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,90 min; EM (ESlpos): m/z = 1133 (M+H)+.
Intermedio 195 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S,3S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía al Intermedio 166 a partir de 9 mg (0,010 mmol) del Intermedio 170.
Rendimiento: 1 ,1 mg (10% d.t.) HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,99 min; EM (ESlpos): m/z = 994 (M+H)+.
Intermedio 196 Trifluoroacetato de (2S)-2-amino-1 -(2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-3-fenilpropan-1-ona 41 mg (0,37 mmol) de 2,5-dioxopirrol¡din-1-il-/\/-(ferc.-butoxicarbon¡l)-L-fen¡lalan¡nato se recogieron en 10 mi de DMF y se mezclaron con 149 mg (0,41 mmol) de 2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-eno (compuesto de partida 6) así como 72 µ? (0,41 mmol) de A/,A/-düsopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 1 h a TA. El disolvente después se eliminó al vacío, el residuo se recogió en acetato de etilo y se extrajo agitando con solución acuosa al 5% de ácido cítrico y a continuación con solución acuosa al 5% de hidrogenocarbonato de sodio. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con tolueno/etanol 10:1 como eluyente. Las correspondientes fracciones se combinaron y se eliminó el disolvente al vacío. Después de secar el residuo al alto vacío se obtuvieron así 69 mg (47% d. t.) del intermedio protegido con Boc tere. -butil-[(2S)-1-(2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]carbamato como mezcla diaestereomérica.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,1 min; EM (ESlpos): m/z = 359 (M+H)+. 64 mg (0,18 mmol) de este Intermedios se recogieron en 10 mi de diclorometano, se mezcló con 1 mi de ácido trifluoroacético y se agitó 30 min a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo restante se liofilizó con agua/dioxano. De esta manera se obtuvieron 66 mg (cuant.) del compuesto del título en forma de espuma.
HPLC (procedimiento 6): Rt = 1 ,45 min; CL-EM (procedimiento 3): Rt = 1 ,12 min; EM (ESlpos): m/z = 259 (M+H)+.
Intermedio 197 Trifluoroacetato de (2R,3f?)-3-Metoxi-2-metil-/N/-[(2S)-1-(2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida En primer lugar se liberó ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-(terc.-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico (compuesto de partida 1) a partir de 83 mg (0,18 mmol) de su sal de diciclohexilamina mediante absorción en acetato de etilo y extracción con agitación con solución acuosa al 5% de hidrosulfato de potasio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El residuo se recogió en 10 mi de DMF y sucesivamente se añadieron 66 mg (0,18 mmol) de (2S)-2-amino-1-(2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-3-fenilpropan-1-on-trifluoracetato (Intermedio 196), 101 mg (0,266 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/\/,A/' A/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 93 µ? (0,53 mmol) de W./V-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó 30 min a TA. La mezcla de reacción después se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 52 mg (56% d. t.) del intermedio protegido con Boc terc.-butil-(2S)-2-[(1f?,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxo-propil]pirrolidin-1-carboxilato.
HPLC (procedimiento 6): Rt = 2,13 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,13 min; EM (ESlpos): m/z = 528 (M+H)+. 52 mg (0,1 mmol) de este intermedio se recogieron en 10 mi de diclorometano, se añadió 1 mi de ácido trigfluoroacético y se agitó 20 min a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo restante se agitó con 20 mi de éter dietílico. Después de 10 min se filtró y el residuo del filtro se secó al alto vacío. De esta manera se obtuvieron 39 mg (72% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 6): Rt = 1 ,62 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,68 min; EM (ESlpos): m/z = 428 (M+H)+.
Intermedio 198 A/-metil-L-valil-W-[(3^ (2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]-pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida-trifluoroacetato x CF3COOH 3 44,5 mg (0,071 mmol) de A/-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-W-metil-L-valil-/ /-[(2R,3S,4S)-1-carboxi-2-metoxi-4-metilhexan-3-il]-W-metil-L-valinamida (Intermedio 4) se recogieron en 10 mi de DMF y sucesivamente se añadieron 38,6 mg (0,071 mmol) de (2R,3f?)-3-Metoxi-2-metil-/V-[(2S)-1-(2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanamida-trifluoroacetato (Intermedio 197), 32,5 mg (0,086 mmol) de O^-azabenzotriazol-l-i -^^A/'./V'-tetrametiluronio-hexa-fluorofosfato (HATU) así como 41 µ? (0,235 mmol) de ?/,/V-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 1 h a TA. La mezcla de reacción después se concentró al vacío y el residuo se recogió en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó sucesivamente con solución acuosa al 5% de ácido cítrico y solución acuosa al 5% de hidrogenocarbonato de sodio, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. Se obtuvieron así 73 mg (98% d. t.) del Intermedio protegido con Fmoc ?/-[(9/-/-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-A/-metil-L-valil-A/-[(3f?,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-1 -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil^ valinamida.
HPLC (procedimiento 6): Rt = 2,78 min; CL-EM (procedimiento 3): Rt = 2,96 min; EM (ESlpos): m/z = 1047 (M+H)+. 73 mg (0,071 mmol) de este intermedio se disolvieron en 5 mi de DMF. Después de la adición de 0,5 mi de piperidina se agitó la mezcla de reacción durante 10 min a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo se digirió varias veces con éter dietílico. Después de separar por decantación del éter dietílico el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (eluyente: acetonitrilo / 0,1 % TFA ac). Se obtuvieron 16 mg (26% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma.
HPLC (procedimiento 6): Rt = 1 ,94 min; CL-EM (procedimiento 3): Rt = 1 ,71 min; EM (ESlpos): m/z = 825 (M+H)+ 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6): d = 8,9-8,6 (m, 3H), 8,4, 8,3, 8,1 y 8,0 (4d, 1 H), 7,3-7,1 (m, 5H), 6,7-6,5 (m, 2H), 5,2-4,8 (m, 3H), 4,75-4,55 (m, 3H), 4,05-3,95 (m, 1 H), 3,7-3,4 (m, 4H), 3,22, 3,17, 3,15, 3,05, 3,02 y 2,95 (6s, 9H), 3,0 y 2,7 (2 m ancho, 2H), 2,46 (m, 3H), 2,4-1 ,2 (m ancho, 13H), 1 ,1-0,85 (m, 18H), 0,75 (m, 3H) [otras señales ocultas debajo del pico H20].
Intermedio 199 N-(4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(2-oxa 3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida compuesto del título se preparó en analogía con los Intermedios 193 y 194 a partir de 23 mg (24µ????) N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S)-1-(2-oxa-3-azabiciclo[2,2,2]oct-5-en-3-il)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrol¡din-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato (Intermedio 198).
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 2): Rt = 2,1 min; EM (ESlpos): m/z = 1 1 18 (M+H)+.
Intermedio 200 N-[2-(2-{2-[2-(2 , 5-d ioxo-2 , 5-d ih id ro-1 N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida La preparación se realizó en analogía con los Intermedios 174 y 175 comenzando con la alquilación reductiva del Intermedio 192 con el Intermedio 172, posterior desprotección y conformación de la maleinimida.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 1025 (M+H)+.
Intermedio 201 N-{6-[(Bromacetil)amino]hexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 22 mg (0,023 mmol) de N-(6-aminohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (Intermedio 101) se disolvieron en 9,5 mi de THF y a 0°C se añadieron 4,2 µ? de trietilamina. Se adicionó una solución de cloruro de bromoacetilo en THF gota a gota y la mezcla de reacción se agitó 30 min a 0°C. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 6,9 mg (26% d.t.) del compuesto del título en forma de espuma.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 11): Rt = 0,9 min; EM (ESlpos): m/z = 1059 y 1061 (M+H)+.
Intermedio 202 N-{2-[2-(2-{3-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-3-oxopropoxi}etoxi)etoxi]etil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]am¡no}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolid¡n-1 -il}-3-metoxi-5-met¡l-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida preparación se efectuó en primer lugar en analogía con el Intermedio 168 comenzando con la alquilación reductiva del Intermedio 192 con el Intermedio 167 y posterior escisión hidrogenolítica del éster bencílico en N-(2-{2-[2-(2-carboxietoxi)etoxi]etoxi}etil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxaz¡nan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida. 13 mg (10 µ?t???) de este intermedio se disolvieron en 5 mi de DMF y e añadieron 2,1 mg (20 mmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona, 6,5 µ? de /V./V-diisopropiletilamina y 7,1 mg (0,02 mmol) de HATU. La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche y a continuación se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización con acetonitrilo/agua se obtuvieron 9,2 mg (62% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (procedimiento 2): Rt = 2,1 min; EM (ESlpos): m/z = 1141 (M+H)+.
Intermedio 203 tere. -butil-(6-hidrazino-6-oxohexil)carbamato Este compuesto se preparó según procedimientos estándares de la química de péptidos mediante el acoplamiento de ácido 6-[(terc.-butoxicarbon¡l)amino]hexanoico con bencilhidrazincarboxilato en presencia de EDCI y HOBT y posterior escisión hidrogenolítica del grupo de protección benciloxicarbonilo.
CL-EM (procedimiento 1 1): Rt = 0,59 min; EM (ESlpos): m/z = 246 (M+H)+.
Intermedio 204 N-{4-[2-(6-aminohexanoil)hidrazino]-4-oxobutil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1^ 2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1 H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato mg (50 pmol) de (N-(3-carboxipropil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1 H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida se disolvieron en 5 mi de DMF y a continuación se añadieron 30,6 mg (80 µ?t???) de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato, 19 µ? de N,N-diisopropiletilamina así como 22,4 mg (60 pmol) de ferc. -butil-(6-hidrazino-6-oxohexil)carbamato. La mezcla de reacción se agitó 1 ,5 h a TA. A continuación se concentró al alto vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 43 mg (68 % d.t.) del Intermedio protegido que después se recogieron en 10 mi de diclorometano y con 1 mi de ácido trifluoroacético. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se agitó con diclorometano y se eliminó nuevamente el disolvente al vacío. Así se obtuvieron 45 mg (68% d.t. en dos etapas) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (procedimiento 1 1): Rt = 0,66 min; EM (ESlpos): m/z = 983 (M+H)+.
Intermedio 205 N-(4-{2-[6-({[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)etil]carbamoil}amino)-hexanoil]hidrazino}-4-oxobutil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-amino-3-(1 H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía al Intermedio 14 a partir de los Intermedios 50 y 204.
Rendimiento: 4 mg (78% d.t.) HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (procedimiento 1 1 ): Rt = 0,73 min; EM (ESlpos): m/z = 1 149 (M+H)+.
Intermedio 206 N-(6-{[3-({3-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-3-oxopropil}disulfanil)propanoil]-amino}h N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida mg (10 pmol) del Intermedio 101 se disolvieron en 2 mi de DMF y se añadieron 8,6 mg (20 µ????) de 1 , 1 '-{disulfandiilbis[(1-oxopropan-3,1-diil)oxi]}dipirrolidin-2,5-diona y 3,7 µ? de W,A/-diisopropilet¡lamina. La mezcla de reacción se agitó 2 h a TA y a continuación se eliminó el disolvente por evaporación al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 7,2 mg (68% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 11): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 615 [½ (M+2H+] Intermedio 207 Trifluoroacetato de ácido (1S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropancarboxílico CFgCOOH X El compuesto del título se obtuvo por desprotección de 210 mg (0,76 mmol) de ácido (1 S,2R)-1 -[(tere. -butoxicarbonil)amino]-2-fenilciclopropancarboxílico que puede adquirirse comercialmente con ácido trifluoroacético en rendimiento cuantitativo.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,23 min; EM (ESlpos): m/z = 178 (M+H)+.
Intermedio 208 9H-fluoren-9-ilmetil-(6-oxohexil)carbamato El compuesto del título se obtuvo a partir de 1 g (2,95 mmol) de 9H-fluoren-9-ilmetil-(6-hidroxihexil)carbamato que puede adquirirse comercialmente en condiciones estándar mediante oxidación con complejo de trióxido de azufre-piridina. Se obtuvieron 840 mg (85% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,1 min; EM (ESIpos): m/z = 338 (M+H)+.
Intermedio 209 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)hexil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-carboxi-2-fenilciclopropil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el Intermedio 75 mediante el acoplamiento de N-(íerc.-butoxicarbonil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1 -metoxipropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y (1S,2R)-1-amino-2-fenilciclopropancarbonsáure-trifluoroacetato (Intermedio 207) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-l-ilJ-N.N.N'.N'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc mediante ácido trifluoroacético el compuesto amina N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-carboxi-2-fenilciclopropil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida como trifluoroacetato.
Se adicionaron a 22 mg (0,026 mmol) de este compuesto en 10 mi de metanol después 17 mg (0,05 mmol) de 9H-fluoren-9-ilmetil-(6-oxohexil)carbamato (Intermedio 208) y 2,3 mg de ácido acético así como 11 ,4 mg (0,12 mmol) del complejo borano-piridina. La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche. Después se adicionaron nuevamente las mismas cantidades del complejo borano-piridina y ácido acético así como 8 mg de fluoren-9-ilmetil-(6-oxohexil)carbamato y la mezcla de reacción se agitó 24 h a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones el producto se usó de inmediato en la próxima etapa. Se recogieron 33 mg del Intermedio aún sin purificar en 5 mi de DMF y se añadió 1 mi de piperidina. Después de agitar 15 a TA se concentró la mezcla de reacción y el residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa. Así se obtuvieron 11 mg (55% d.t. en dos etapas) del Intermedio ácido aminocarboxílico.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (procedimiento 11): Rt = 0,7 min; EM (ESlpos): m/z = 843 (M+H)+. 6 mg (7,12 µ?t???) de este intermedio se recogieron en 1 mi de dioxano y a continuación se añadieron 6,6 mg (42,7 µ?t???) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-carboxilato de metilo así como con 5 µ? de solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio. La mezcla de reacción se agitó 1 h a TA. Después se añadieron nuevamente 3 porciones de respectivamente 50 µ? de der solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio y la mezcla de reacción se agitó otros 30 min a TA. Después se acidificó la mezcla de reacción con ácido trifluoroacético a un valor de pH 2 y a continuación se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización con acetonitrilo/agua se obtuvieron 4 mg (60% d.t.) del compuesto del título en forma de espuma.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 11): Rt = 0,88 min; EM (ESlpos): m/z = 923 (M+H)+.
Intermedio 210 N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2^ [(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida primer lugar se preparó ácido 6-oxohexanoico según instrucciones de la literatura (J. Org. Chem. 58, 1993, 2196-2200). 80 mg (0,08 mmol) de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam (Intermedio 192) y 65,4 mg (0,5 mmol) de ácido 6-oxohexanoico se combinaron en 9 mi de metanol y se añadieron 10 µ? de ácido acético y 37,4 mg (0,4 mmol) del complejo borano-piridina. La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche. A continuación se concentró al vacío y el residuo se recogió en acetonitrilo/agua 1 :1 y se ajustó con ácido trifluoroacético a un valor de pH 2. La mezcla de reacción se concentró nuevamente y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones se obtuvieron 70 mg (86% d. t.) de N-(5-carboxipentil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-in 3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida como trifluoroacetato.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 955 (M+H)+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6, señales características): d = 12,0 (m ancho, 1H), 10,8 (s, 1H), 9,4 (m, 1 H), 8,9 y 8,8 (2d, 1H), 8,3 y 8,02 (2d, 1H), 7,5 (m, 1 H), 7,3 (m, 1 H), 7,15 y 7,1 (2s, 1 H) 7,05-6,9 (m, 2H), 5,12 y 4,95 (2m, 1 H), 4,7-4,5 (m, 2H), 4,1-3,8 (m, 4H), 3,75 (d, 1H), 3,25, 3,2, 3,18, 3,13, 2,98 y 2,88 (6s, 9H), 2,8 (m, 3H), 1,08 y 1 ,04 (2d, 3H), 0,95-0,8 (m, 15H), 0,8-0,65 (dd, 3H).
Se disolvieron 22 mg (23 pmol) de este intermedio en 1 ,8 mi de diclorometano y se añadieron 13,2 mg (70 pmol) de clorhidrato de 1-(3-dimet¡laminopropil)-3-etilcarbodiimida, 26,5 mg (230 pmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona así como 0,28 mg (2 pmol) de dimetilaminopiridina y la mezcla de reacción se agitó 2 h a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización con acetonitrilo/agua se obtuvieron 21 ,3 mg (88% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,94 min; EM (ESlpos): m/z = 1052 (M+H)+.
Intermedio 211 N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(2S,3S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -???-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida mg (20 pmol) de /\/-metil-L-valil-A-[(3 4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(2S,3S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-¡l}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato (Intermedio 15) en analogía con el Intermedio 210 se sometieron a alquilación reductiva con ácido 6-oxohexanoico.
Rendimiento: 9,2 mg (61% d.t.) HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 929 (M+H)+.
Se disolvieron 9 mg (10 pmol) de este intermedio en 3 mi de DMF y se añadieron 5,6 mg (48 pmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-d¡ona, 5 µ? de A/,/V-diisopropiletilamina y 5,5 mg (0,015 mmol) de HATU y la mezcla de reacción se trató 6 h en el baño ultrasónico. Cada hora se adicionaron 5,5 mg de HATU. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío, el residuo se recogió en acetonitrilo/agua y se ajustó con ácido trifluoroacético a un valor de pH 2. Después de concentrar nuevamente al vacío se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización con acetonitrilo/agua se obtuvieron 5,8 mg (57 % d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,95 min; EM (ESlpos): m/z = 1027 (M+H)+ Intermedio 212 N-{2-[2-(2-{3-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-3-oxopropoxi}etoxi)etoxi]etil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(2S,3S)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida La preparación se efectuó en primer lugar en analogía con el Intermedio 168 comenzando con la alquilación reductiva del Intermedio 15 con el Intermedio 167 y posterior escisión hidrogenolítica del éster bencílico en N-(2-{2-[2-(2-carboxietoxi)etoxi]etoxi}etil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-met¡l-3-{[(2S,3S)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxo-3-fenilbutan-2-il]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida. 8,4 mg (8 pmol) de este intermedio se disolvieron en 3 mi de DMF y se añadieron 9,5 mg (80 µ????) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-dion, 10 µ? de /V./V-diisopropiletilamina y 9,4 mg (25 pmol) de HATU y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al vacío. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío, el residuo se recogió en acetonitrilo/agua y con ácido trifluoroacético se ajustó a un valor de pH 2. Después de concentrar nuevamente al vacío se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización con acetonitrilo/agua se obtuvieron 4 mg (32% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,96 min; EM (ESlpos): m/z = 1117 (M+H)+.
Intermedio 213 N-{6-[(trans-4-{[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]carbonil}ciclohexil)amino]-6-oxoh metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía al Intermedio 104 a partir de N-(5-carboxipenti -N-metil-L-valil-N-KSR^S.SSJ-l-^S^-tílR^RJ-S-t SJ-S-ÍI H-indol-S-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, cuya síntesis se ha descrito para el Intermedio 210. Se obtuvieron 9,3 mg del compuesto del título (37% d.t. en 3 etapas).
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,9 min; EM (ESlpos): m/z = 1177 (M+H)+.
Intermedio 214 N-{4-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-4-oxobutil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S^ [(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía al Intermedio 210 mediante la transformación del Intermedio 92 en el éster activo.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (procedimiento 11): Rt = 0,82 min; EM (ESlpos): m/z = 901 (M+H)+.
Intermedio 215 N-{6-[(2,5-dioxopirrolid¡n-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1 R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida En primer lugar, a partir del Intermedio 40 en analogía con el Intermedio 183 se preparó con el complejo borano-piridina la N-(5-carboxipentil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida. A partir de este compuesto después en analogía con el Intermedio 210 se generó el éster activo. Se obtuvieron 34 mg (36% d.t. en dos etapas) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,85 min; EM (ESlpos): m/z = 930 (M+H)+.
Intermedio 216 N-(4-{[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]carbonil}bencil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida primer lugar en analogía con la preparación del Intermedio 183 se hizo reaccionar el Intermedio 192 con ácido 4-formilbenzoico con complejo borano-piridina dando N-(4-carboxibencil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida. A partir de este compuesto después en analogía con el Intermedio 210 se generaron 11 mg (68% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,13 min; E (ESlpos): m/z = 1072 (M+H)+.
Intermedio 217 N-(5-carboxipentil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-(benciloxi)-l -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 53 mg (84 pmol) de W-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/\/-met¡l-L-valil- \/-[(2R,3S,4S)-1 -carbox¡-2-metox¡-4-metilhexan-3-¡l]-/V-metil-L-val¡namida (Intermedio 4) y 45 mg (84 µ????) de bencil-A/-{(2/?,3f?)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninat-trifluoroacetato (Intermedio 12) se recogieron en 2 mi de DMF, se añadieron 19 µ? de A/,/V-diisopropilet¡lamina, 14 mg (92 µ????) de HOBt así como 17,6 mg (92 µ?t???) de EDC y después se agitó durante la noche a TA. A continuación se concentró la mezcla de reacción y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 59 mg (68% d. t.) del Intermedio protegido con Fmoc ?/-[(9?-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-/V-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(benciloxi)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,55 min; m/z = 1044 (M+H)+.
Se trataron 57 mg (0,055 mmol) de este intermedio para la escisión del grupo de protección Fmoc con 1 ,2 mi de piperidina en 5 mi de DMF. Después de concentrar y purificar mediante HPLC preparativa se obtuvieron 39 mg (76% d. t.) del Intermedio amina libre A/-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(benciloxi)-l -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida como trifluoroacetato.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1 ): Rt = 1 ,01 min; m/z = 822 (M+H)+.
Se transformaron 60 mg (0,06 mmol) de este intermedio en analogía con el Intermedio 210 con ácido 6-oxohexanoico en presencia del complejo borano-piridina. Se obtuvieron 45 mg (75% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1 ): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 9936 (M+H)+.
Intermedio 218 N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2 [(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(benciloxi)-l -oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó mediante la transformación de 42 mg (0,05 mmol) del Intermedio 217 en el éster activo.
Rendimiento: 26 mg (54%) HPLC (procedimiento 5): Rt = 2,1 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,01 min; EM (ESlpos): m/z = 1034 (M+H)+.
Intermedio 219 N-{6-[(2,5-dioxopirrol¡d¡n-1-il)ox¡]-6-oxoh [( R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-m il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida mg (0,02 mol) del compuesto del Intermedio 218 se recogieron en 2,4 mi de metanol y se hidrogenaron sobre paladio al 5% sobre carbón activado durante 30 min a TA bajo hidrógeno a presión normal. Después se separó el catalizador por filtración y se eliminó el disolvente al vacío. El residuo se liofilizó con acetonitrilo/agua 1 :1. Se obtuvieron 14 mg (92% d.t.) del compuesto del título como espuma incolora.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (procedimiento 1): R, = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 944 (M+H)+.
Intermedio 220 N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-lndol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 500 mg de este Intermedio se disolvieron en 20 mi de DMF y se añadieron 466 mg (3,8 mmol) del Intermedio 191, 382 mg (1 ,01 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-?,?,?',?'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 440 µ? (2,5 mmol) de ?,?-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 1 h a TA y después se concentró. El residuo se recogió en diclorometano y primero se extrajo por agitación dos veces con solución acuosa al 5% de ácido cítrico y después con solución saturada acuosa de hidrogenocarbonato de sodio. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con diclorometano/metanol 95:5 como eluyente. Las correspondientes fracciones se combinaron y se eliminó el disolvente al vacío. Después de secar el residuo al alto vacío se obtuvieron 562 mg (65% d. t. en dos etapas) del Intermedio Z-protegido. 562 mg (0,57 mmol) de este Intermedio se recogieron en 50 mi de metanol y se hidrogenaron con 155 mg del paladio al 10% sobre carbón activado durante 20 min a TA bajo hidrógeno a presión normal. Después se separó el catalizador por filtración y se eliminó el disolvente al vacío. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Las correspondientes fracciones se combinaron, se eliminó el disolvente por evaporación al vacío y el residuo se liofilizó con dioxano. Se obtuvieron 361 mg (87% d.t.) del compuesto del título en forma de espuma.
HPLC (procedimiento 5): pico doble con Rt = 1,75 y 1 ,86 min; CL-EM (procedimiento 1): pico doble a Rt = 0,84 min y 0,91 min con la misma masa; EM (ESlpos): m/z = 944 (M+H)+.
Intermedio 221 N-{(2S)-2-[(ierc.-butoxicarbonil)amino]-3-fenilpropil}-N-metil-L-valina 100 mg (0,76 mmol) de N-metil-L-valina y 285 mg (1 ,14 mmol) de ferc. -butil-[(2S)-1-oxo-3-fenilpropan-2-¡l]carbamato que pueden adquirirse comercialmente se combinaron con 22 mi de metanol y se añadieron 340 mg (3,66 mmol) del complejo borano-piridina y 70 µ? de ácido acético. La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche. A continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con diclorometano/metano/solución acuosa de amoníaco al 17% como eluyente. Después de concentrar las correspondientes fracciones y liofilizar con dioxano/agua 1 :1 se obtuvieron 259 mg (93% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (procedimiento 11): Rt = 0,76 min; EM (ESlpos): m/z = 365 (M+H)+.
Intermedio 222 N-[(2S)-2-amino-3-fenilpropil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxl-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 40 mg (0,11 mmol) de N-{(2S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3-fenilpropil}-N-metil-L-valin (Intermedio 221) se disolvieron en 5 mi de DMF y se añadieron 80 mg (0,11 mmol) de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-lndol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (Intermedio 220), 50 mg (0,13 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/V,/\/',/N/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 57 µ? (2,5 mmol) de A/,A/-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó durante 1 h a TA y después se concentró. El residuo se recogió en acetato de etilo y se lavó primero con solución acuosa al 5% de ácido cítrico y después con agua. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Las correspondientes fracciones se combinaron y se eliminó el disolvente al vacío. Después de liofilizar con dioxano se obtuvieron 60 mg (50% d. t.) del Intermedio protegido.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,2 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,17 min; EM (ESlpos): m/z = 1073 (M+H)+.
Se recogieron 60 mg (0,05 mmol) de este intermedio en 10 mi de diclorometano, se añadieron 2 mi de ácido trifluoroacético y la mezcla de reacción 1 ,5 h se agitó a TA.
A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se combinaron las correspondientes fracciones, se eliminó el disolvente al vacío y el residuo se liofilizó con dioxano/agua.
De esta manera se obtuvieron 25 mg (42% d.t.) del compuesto del título en forma de espuma.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,95 min; EM (ESlpos): m/z = 974 (M+H)+.
Intermedio 223 N-[(2S)-2-({[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}amino)-3-fenilpropil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-indol-3-il)-1-(1,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida preparación se efectuó análogamente a la síntesis del Intermedio 134 a partir de 5 mg (4,6 µ????) del Intermedio 222. Se obtuvieron 3,4 mg (65% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,99 min; EM (ESlpos): m/z = 1140 (M+H)+.
Intermedio 224 N-[(2S)-2-({[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)etil]carbamoil}amino)propil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metox¡-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida La preparación se efectuó análogamente a la síntesis del Intermedio 223.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,92 min; EM (ESlpos): m/z = 1064 (M+H)+.
Intermedio 225 N-(2-aminoetil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 100 mg (0,76 mmol) de N-metil-L-valina y 182 mg (1 ,14 mmol) de ferc.-butil-(2-oxoet¡l)carbamato que pueden adquirirse comercialmente se combinaron con 20 mi de metanol y se añadieron 340 mg (3,66 mmol) del complejo borano-piridina y 65 µ? de ácido acético. La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche. A continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con diclorometano/ metano/solución acuosa de amoníaco al 17% (15/4/0,5) como eluyente. Después de concentrar las correspondientes fracciones y liofilizar con dioxano/agua 1 :1 se obtuvieron 190 mg en un pureza de 39 % (35% d.t.) del Intermedio, que se continuó transformando sin otra purificación adicional. 50 mg (0,07 mmol) de este intermedio se disolvieron en 10 mi de DMF y se añadieron 52 mg (0,07 mmol) de N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-lndol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (Intermedio 220), 32 mg (0,09 mmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,/V,/V',/V'-tetra-metiluronio-hexafluorofosfato (HATU) así como 37 µ? (0,2 mmol) de N,N-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó a TA durante la noche y después se concentró. El residuo se recogió en acetato de etilo y primero se extrajo agitando con solución acuosa al 5% de ácido cítrico y después con agua. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Las correspondientes fracciones se combinaron y se eliminó el disolvente al vacío. Después de liofilizar con dioxano se obtuvieron 53 mg (76% d. t.) del Intermedio protegido.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (procedimiento 1 ): Rt = 1 ,02 min; EM (ESlpos): m/z = 984 (M+H)+. 53 mg (0,05 mmol) de este intermedio se recogieron en 10 mi de diclorometano, se añadieron 2 mi de ácido trifluoroacético y la mezcla de reacción se agitó 30 min a TA. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Se combinaron las correspondientes fracciones, se eliminó el disolvente al vacío y el residuo se liofilizó con dioxano/agua. De esta manera se obtuvieron 21 mg (40% d.t.) del compuesto del título en un pureza de 65 %.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 884 (M+H)+.
Intermedio 226 N-[2-({[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H^irrol-1-il)etil]carbamoil}amino)etil]-N-meti N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1- oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 - oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida preparación se efectuó a partir del Intermedio 225 análogamente a la síntesis del Intermedio 134. Se obtuvieron 11,6 mg (59% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,90 min; EM (ESlpos): m/z = 1050 (M+H)+.
Intermedio 227 N-{6-[(2,5-dioxopirrol¡d¡n-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2 [(1R,2R)-3-{[(2S)-1-(benciloxi)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2- metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida Este compuesto se preparó análogamente al Intermedio 218 mediante transformación en el éster activo.
Rendimiento: 18 mg (51 % d. t.) HPLC (procedimiento 5): Rt = 2,1 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,98 min; EM (ESlpos): m/z = 1073 (M+H)+.
Intermedio 228 (2R,3S)-3-[(-erc.-butoxicarbonil)amino]-4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutan-2-il-(3R,4S,7S,10S)-4-[(2S)-butan-2-il]-7,10-diisopropil-3-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-oxoetil)-5, 1 1 -dimetil-6 , 9-d ioxo-2-oxa-5 ,8, 1 1 -triazapentadecan- 15-oato compuesto del título se obtuvo como Intermedio durante la síntesis del Intermedio 154.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2, 1 min; CL-EM (procedimiento 1 ): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 1308 (M+H)+.
Intermedio 229 (2R,3S)-3-acetamida-4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutan-2-il-(3R,4S,7S,10S)-4-[(2S)-butan-2-il]-7, 10-diisopropil-3-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2- fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-oxoetil)-5, 11 -dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8, 11 -triazapentadecan-15-oato compuesto del título se obtuvo a partir de 7,5 mg (2,5 pmol) del Intermedio 154 mediante acetilación con 2,3 µ? de anhídrido acético en 1 mi de DMF en presencia de 0,4 µ? de /V,/V-diisopropiletilamina.
Rendimiento: 1 ,4 mg (40% d. t.) HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 1250 (M+H)+.
Intermedio 230 (2R,3S)-3-[(terc.-butoxicarbonil)amino]-4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dih¡dro-1H-pirrol-1-il)hexanoil] hidrazino}-4-oxobutan-2-il-(3R,4S,7S, 10S)-4-[(2S)-butan-2-il]-3-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-oxoetil)-7, 10-diisopropil-5, 11 -dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11 -triazapentadecan-15-oato Este compuesto se preparó en analogía al Intermedio 229 a partir del Intermedio 193. Se obtuvieron 16 mg (30% d. t. en 3 etapas) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,0 min; CL-EM (procedimiento 1): R, = 1 ,02 min; EM (ESlpos): m/z = 1335 (M+H)+.
Intermedio 231 (2R,3S)-3-acetamida-4-{2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobutan-2-il-(3R,4S,7S, 10S)-4-[(2S)-butan-2-il]-3-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3- (1 H-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-¡l)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-2-oxoetil)-7, 10-düsopropil-5, 11 -dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8, 11-triazapentadecan-15-oato Este compuesto se preparó a partir de 8 mg (6 pmol) del Intermedio 230, en primer lugar mediante desprotección con ácido trifluoroacético y posterior acetilación con anhídrido acético en DMF en presencia de A/,/\/-diisopropilet¡lam¡na. Se obtuvieron 2 mg (37% d. t. en dos etapas) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,88 min; EM (ESlpos): m/z = 1277 (M+H)+.
Intermedio 232 bencil-N-[(4-nitrofenoxi)carbonil]-beta-alaninato 200 mg (0,57 mmol) de bencil-beta-alaninato del ácido 4-metilbencensulfónico que puede adquirirse comercialmente así como 229 mg (1 ,14 mmol) de 4-nitrofenilclorocarbonato se recogieron en 15 mi de tetrahidrofurano y la mezcla de reacción después se calentó 30 min a reflujo. A continuación la mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones y secar el residuo al alto vacío se obtuvieron 86 mg (44% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,07 min; EM (ESlpos): m/z = 345 (M+H)+.
Intermedio 233 N-{2-[({3-[(2,5-dioxop¡rrolidin-1-il)oxi]-3-o^ N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1- oxopropan-2-il]am¡no}-1-metoxi-2-met¡l-3-oxoprop¡l]pirrolidin-1 -il}-3-metox¡-5-^ oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida mg (10 µ?t???) del Intermedio 225 y 6,7 mg (20 µ????) del Intermedio 232 se disolvieron en 3 mi de DMF y a continuación se añadieron 7 µ? de N,N-diisopropiletilamina. La mezcla se agitó a TA durante la noche y a continuación se concentró al alto vacío. El residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa.
Después de concentrar las correspondientes fracciones y secar el residuo al alto vacío se obtuvieron 5,4 mg (38% d.t.) del Intermedio protegido, HPLC (procedimiento 5): Rt = 2,1 min; CL-EM (procedimiento 1 ): Rt = 0. 6in; EM (ESlpos): m/z = 1089 (M+H)+. 5,4 mg (5 µ?t???) de este intermedio se disolvieron en 5 mi de metanol y después de adicionar 2 mg de paladio al 10 % sobre carbón activado se hidrogenó durante 20 min a TA bajo hidrógeno a presión normal. Después se separó el catalizador por filtración y se eliminó el disolvente al vacío. Después de secar el residuo al alto vacío se obtuvieron 5 mg (cuant.) del Intermedio ácido.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1 ): Rt = 0,84 min; EM (ESlpos): m/z = 999 (M+H)+. 5 mg (10 pmol) de este intermedio se disolvieron en 1 mi de DMF y se añadieron 5,8 mg (50 mmol) de 1 -hidroxipirrolidin-2,5-diona y a continuación se añadieron 2,6 µ? de A/,/V-diisopropiletilamina y 3,8 mg (10 µ?t???) de HATU. Después de agitar durante 20 h a TA la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de liofilizar con dioxano/agua 1 :1 se obtuvieron 1 ,1 mg (20% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1 ): Rt = 0,87 min; EM (ESlpos): m/z = 1096 (M+H)+.
Intermedio 234 N-(6-{[(benciloxi)carbonil]amino}hexil)-N-meti^^ 2 (1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-vali mg (30 µ????) de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 ,2f?)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1- il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (Intermedio 55) y 45 mg (180 µ????) de bencil-(6-oxohexil)carbamato se recogieron en 3 mi de metanol y se acidificaron con ácido acético. A temperatura ambiente a continuación se adicionaron 15 µ? (144 µ?t???; 9,4 M) del complejo borano-piridina. A continuación se agitó la preparación durante 24 h a TA, adicionándose después de 8 h nuevamente ácido acético así como 15 µ? (144 µ????; 9,4M) del complejo borano-piridina. La mezcla de reacción a continuación se ajustó con TFA a un valor de pH 2 y se purificó mediante HPLC preparativa. Se combinaron las fracciones del producto, se concentraron y el residuo se secó al alto vacío. Se obtuvieron así 15 mg (46% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,03 min; m/z = 1066 (M+H)+.
Intermedio 235 N-(6-amino exil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi- 2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidi 1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida 15 mg (14 pmol) de N-(6-{[(benciloxi)carbonil]amino}hexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-feni fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (Intermedio 234) se recogieron en 3 mi de metanol y se adicionaron 1 ,8 mg de paladio sobre carbón (5%). La mezcla de reacción a continuación se hidrogenó 2 h a TA bajo hidrógeno a presión normal. Después se separó el catalizador por filtración y se eliminó el disolvente al vacío. El residuo se liofilizó con acetonitrilo/agua 1 :1. Se obtuvieron 11 mg (86% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,81 min; m/z = 932 (M+H)+.
Intermedio 236 N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxh 1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 11 mg (12 pmol) de N-(6-aminohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (Intermedio 235) se recogieron en 500 µ? de dioxano/agua 1 :1 y se añadieron 253 µ? de solución acuosa 1 M de hidrogenocarbonato de sodio y a continuación se añadieron 2,8 mg (18 µ????) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-carboxilato de metilo. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA y después se acidificó con ácido trifluoroacético. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 0,8 mg (7% d.t.) del compuesto del título. CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,01 min; m/z = 1012 (M+H)+.
Intermedio 237 N-(5-carboxipentil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 25 mg (30 pmol) de N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[( 1 S)-2-f en il- 1 -(5-fenil- 1 , 3 ,4-oxad iazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-val¡namida (Intermedio 55) ) y 23 mg (180 pmol) de ácido 6-oxohexanoico se recogieron en 3 mi de metanol y se acidificaron con ácido acético. A temperatura ambiente se adicionaron a continuación 15 µ? (144 pmol; 9,4M) complejo borano-piridina. La mezcla de reacción a continuación se agitó durante 20 h a TA, adicionándose después de 8 h nuevamente ácido acético así como 15 µ? (144 pmol; 9,4M) del complejo borano-piridina. La mezcla de reacción a continuación se ajustó con ácido trifluoroacético a un valor de pH 2 y se purificó mediante HPLC preparativa. Se combinaron las fracciones del producto, se concentraron y el residuo se liofilizó. Se obtuvieron así 21 mg (74% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,91 min; m/z = 947 (M+H)+.
Intermedio 238 N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohex^^ {(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(5-fenil-1.S^-oxadiazol^-i etillaminoJpropillpirrolidin-l-ilJ-S-metil-l-oxoheptan^-ill-N-metil-L- valinamida 21 mg (22 pmol) del Intermedio 237 se disolvieron en 1 mi de DMF y se añadieron 38 mg (333 pmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y a continuación 2,4 mg (10 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N,-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) y 9 µ? de ?,?-diisopropiletilamina. Después de agitar durante 2 h a TA la mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa. Después de liofilizar con dioxano se obtuvieron 22 mg (96% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,95 min; m/z = 1044 (M+H)+.
Intermedio 239 N-metil-L-treonil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1 -il>-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato En primer lugar se liberó N-[(bencNoxi)carbonil]-A/-metil-L-treonina a partir de 237 mg (0,887 mmol) de su sal de diciciohexilamina mediante la absorción en acetato de etilo y extracción mediante agitación con ácido sulfúrico acuoso al 5 %. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. 14,7 mg (0,055 mmol) de A/-[(benciloxi)carbonil]-/V-metil-L-treonina se recogieron en 3 mi de DMF y sucesivamente se añadieron 40 mg (0,055 mmol) del Intermedio 220, 12,7 mg (0,066 mmol) de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 10 mg (0,066 mmol) de 1-hidroxMH-benzotriazol-hidrato. La mezcla a continuación se agitó 2 h a TA. El disolvente después se eliminó al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron así 29 mg (54% d. t.) del Intermedio Z-protegido.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,15 min; EM (ESlpos): m/z = 976 (M+H)+. 29 mg (0,003 mmol) de este intermedio se disolvieron en 5 mi de metanol y se hidrogenaron a TA y presión normal durante 1 h sobre 5 mg de paladio sobre carbón al 5%. Después se separó el catalizador por filtración y se eliminó el disolvente con evaporación. El residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 17 mg (54% d. t.) del compuesto del título.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,77 min; EM (ESlpos): m/z = 842 (M+H)+.
Intermedio 240 N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-treonil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó en analogía al Intermedio 210 a partir de 15,6 mg (0,016 mmol) del Intermedio 239. Se obtuvieron 10,8 mg (67% d. t. en dos etapas) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0. 85 min; EM (ESlpos): m/z = 1053 (M+H)+.
Intermedio 241 N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-hidroxifenil)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato En primer lugar en analogía con el Intermedio 5 se preparó ácido trifluoroacético-(2S)-2-amino-3-(4-hidroxifenil)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)propan-1-ona (1:1). Con este componente en analogía con la síntesis descrita para el Intermedio 75 después se preparó el compuesto del título mediante el acoplamiento con W-(ferc.-butoxicarbonil)-W-metil-L-valil-/V-[(3f?,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 2f?)-2-carboxi-1 -metoxipropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 26) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,A/,A/',A/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc mediante ácido trifluoroacético.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0. 75 min; EM (ESlpos): m/z = 817 (M+H)+.
Intermedio 242 N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-met¡l-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-hidroxifenil)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida mg (0,05 mmol) del Intermedio 241 se hicieron reaccionar en analogía con el Intermedio 210 con ácido 6-oxohexanoico en presencia del complejo borano-piridina. A continuación se transformaron 22,5 mg (0,02 mmol) del ácido obtenido en el éster activado. Se obtuvieron 13,5 mg (36% d. t. en dos etapas) del compuesto del título. HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0. 86 min; EM (ESlpos): m/z = 1028 (M+H)+.
En forma alternativa, el compuesto del título también puede obtenerse mediante hidrogenación catalítica durante 1 hora del Intermedio 250 a temperatura ambiente en metanol sobre paladio sobre carbón activado al 10% con hidrógeno a presión normal.
Intermedio 243 N-(6-aminohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-hidroxifenil)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida La preparación se efectuó en analogía con el Intermedio 78 mediante alquilación reductiva del Intermedio 241 con bencil-(6-oxohexil)carbamato y complejo borano-piridina y posterior hidrogenación en metanol como disolvente.
Rendimiento: 17,5 mg (34% d.t. en dos etapas) HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,7 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,63 min; EM (ESIpos): m/z = 916 (M+H)+.
Intermedio 244 N-[6-(2,5-d¡oxo-2,5-dihidro-1H-p¡^ [(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-hidroxifenil)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida preparación se efectuó en analogía con el Intermedio 166 a partir del Intermedio 243. Rendimiento: 1,3 mg (12% d.t.) HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,89 min; EM (ESlpos): m/z = 996 (M+H)+.
Intermedio 245 2,5-dioxopirrolidin-1-il-O-[(3R)4S,7S,10S)-4-[(2S)-butan-2-il]-3-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-7,10-diisopropil-5,11-dimetil-6,9,15-trioxo-2-oxa-5,8,11-triazapentadecan-15-il]-N-(terc-butoxicarbonil)-L-treonil-beta-alaninato En primer lugar se transformó el Intermedio 193 tal como se ha descrito en el Intermedio 154 con bencil-N-(terc.-butoxicarbonil)-L-treoninato y a continuación se eliminó por hidrogenólisis el benciléster. 30 mg (0,027 mmol) de la N-[4-({(1S,2R)-1- [(terc-butoxicarbonil)amino]-1-carboxipropan-2-il}oxi)-4-oxobutil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-me oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinam¡da así obtenida después se acoplaron con bencil-beta-alaninato de ácido 4-metilbencensulfónico (1:1) en presencia de HATU y se eliminó nuevamente el benciléster mediante hidrogenólisis (Rendimiento: 24 mg (71% d. t. en dos etapas). Finalmente se transformaron 10 mg (0,008 mmol) del ácido obtenido en el éster activado. Después de la purificación por HPLC se obtuvieron 2,7 mg (23% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,9 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,01 min; EM (ESlpos): m/z = 1295 (M+H)+ Intermedio 246a ácido trifluoroacético-(2S)-2-amino-1 -(4-hidroxi-1 ,2-oxazolidin-2-il)-3-(1 H-indol-3-il)propan-1-ona (1 :1) diastereómero 1 diastereómero 1 H 1 ,6 g (3,982 mmol) de 2,5-dioxopirrolidin-1-il-N-(terc.-butoxicarbonil)-L-triptofanato se disolvieron en 15 mi de DMF y se añadieron 500 mg (3,982 mmol) de 1 ,2-oxazolidin-4-ol y 100 µ? de /S/,W-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche. Después se adicionaron nuevamente 100 µ? de N,N-diisopropiletilamina, la preparación en primer lugar se trató durante 5 h en el baño ultrasónico, después se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al vacío. El residuo resultante se recogió en acetato de etilo y primero se extrajo por agitación dos veces con solución de ácido cítrico al 5%, después con solución saturada de hidrogenocarbonato de sodio y finalmente con agua. La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice con diclorometano/metanol 95:5 como eluyente separándose en los diaestereómeros. Las correspondientes fracciones de ambos diaestereómeros se combinaron y se eliminó el disolvente al vacío. Después de secar los residuos al alto vacío se obtuvieron 272 mg (18% d.t.) de Diastereómero 1 (Rf = 0,18 (diclorometano/metanol 95:5) y 236 mg (16% d.t.) de Diastereómero 2 (Rf = 0,13 (diclorometano/metanol 95:5) así como 333 mg (22% d.t.) de una fracción mixta del intermedio protegido con Boc.
A partir de 272 mg (725 pmol) de Diastereómero 1 se escindió de este intermedio en condiciones estándar con 5 mi de ácido trifluoroacético en 20 mi de diclorometano el grupo de protección Boc y después de liofilizar con dioxano/agua se obtuvieron 290 mg (quant) del compuesto del título en una pureza de 75 % y se usó sin purificación adicional en la próxima etapa.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,1 min; CL-EM (procedimiento 13): R, = 1 ,80 min; EM (ESlpos): m/z = 276 (M+H)+ Intermedio 246b ácido trifluoroacético-(2S)-2-amino-1 -(4-hidrox¡-1 ,2-oxazolidin-2-il)-3-(1 H-indol-3-il)propan-1-on(1 :1) Diastereómero 2 CFgCOOH x diastereómero 2 n A partir de 236 mg (630 µ????) del Diastereómero 2 del Intermedio descrito en 246a se escindió en condiciones estándar con 5 mi de ácido trifluoroacético en 20 mi de diclorometano el grupo de protección Boc y después de concentrar, agitar con éter dietílico y secar el residuo al alto vacío se obtuvieron 214 mg (76%) del compuesto del título.
CL-EM (procedimiento 13): Rt = 1 ,84 min; EM (ESlpos): m/z = 276 (M+H)+ Intermedio 247a N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(4-hidroxi-1 ,2-oxazolidin-2-il)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-met¡l-3-oxopropil]piro^ N-metil-L-valinamida Para la síntesis de este compuesto se realizó en primer lugar el acoplamiento como se ha descrito para el Intermedio 74 de los Intermedios 26 y 246a con una posterior escisión del grupo de protección Boc. A continuación se produjo la alquilación, tal como se ha descrito para el Intermedio 210, con ácido 6-oxohexanoico en presencia del complejo borano-piridina y una posterior transformación del ácido en el éster activo. El compuesto del título se purificó mediante HPLC preparativa.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 1053 (M+H)+ Intermedio 247b N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1 -(4-hidrox¡-1 ,2-oxazolidin-2-il)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Diastereomer 2 Para la síntesis de este compuesto se realizó en primer lugar, como se ha descrito para el Intermedio 74, el acoplamiento de los Intermedios 26 y 246a con una posterior escisión del grupo de protección Boc. A continuación se produjo la alquilación, tal como se ha descrito para el Intermedio 210, con ácido 6-oxohexanoico en presencia del complejo borano-piridina y una posterior transformación del ácido en el éster activo. El compuesto del título se purificó mediante HPLC preparativa.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1): R, = 0,86 min; EM (ESlpos): m/z = 1053 (M+H)+ Intermedio 248 N-(5-carboxipentil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-1-terc-butoxi-3-(4-hidroxifenil)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida En primer lugar se preparó en analogía con la síntesis descrita en el Intermedio 86 mediante el acoplamiento de A/-(ferc.-butoxicarbonil)-/\/-metil-L-valil-/\/-[(3 4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 26) y terc.-butil-L-tirosinato en presencia de O-Í -azabenzotriazol-l-i -^A/.A/'./V'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc mediante ácido trifluoroacético, obteniendo el terc.-butiléster (40 min de agitación con ácido trifluoroacético en diclorometano) el compuesto amina terc-butil-N-[(2R,3R)-3-metoxi-3-{(2S)-1-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-(metil{(2S)-3-metil-2-[(N-metil-L-valil)amino]butil}amino)heptanoil]pirrolid¡n-2-il}-2-metilpropanoil]-L-tirosinato como trifluoroacetato. A partir de 38 mg (0,04 mmol) de este compuesto después en analogía con la preparación del Intermedio 210 mediante la reacción con ácido 4-oxohexanoico en presencia del complejo borano-piridina se obtuvieron 31 mg (99% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,8 min; CL-EM (procedimiento 1): R, = 0,88 min; EM (ESlpos): m/z = 918 (M+H)+.
Intermedio 249 ácido trifluoroacético-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-[4-(benciloxi)fenil]-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]piirolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida(1 :1) En primer lugar y en analogía con los Intermedios 5 y 6 se preparó a partir de O-bencil-N-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosina ácido trifluoroacético-(2S)-2-amino-3-[4-(benciloxi)fenil]-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)propan-1-on(1:1). A partir de este componente después se preparó el compuesto del título en analogía con la síntesis descrita en el Intermedio 75 mediante el acoplamiento con A/-(ferc.-butoxicarbonil)-A/-metil-L-val¡l-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2 )-2-carboxi-1-metoxipropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi^ metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida (Intermedio 26) en presencia de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,A/,/\/',/V'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato y posterior escisión del grupo de protección Boc mediante ácido trifluoroacético.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,15 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0. 99 min; EM (ESlpos): m/z = 908 (M+H)+.
Intermedio 250 N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1^ [(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-[4-(benciloxi)fenil]-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 100 mg (0,088 mmol) del Intermedio 249 se transformaron en analogía con el Intermedio 210 con ácido 6-oxohexanoico en presencia del complejo borano-piridina. A continuación se transformaron 30 mg (0,029 mmol) del ácido obtenido en el éster activado. Se obtuvieron 15 mg (40% d. t. en dos etapas) del compuesto del título. HPLC (procedimiento 12): Rt = 2,26 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,05 min; EM (ESlpos): m/z = 1 119 (M+H)+.
Intermedio 251 N-[4-(2-{5-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-5-oxopentanoil}-2-metilhidrazino)-4-oxobutil]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida En primer lugar se transformaron 30 mg (0,032 mmol) del Intermedio 193 en el N-hidroxisuccinimidéster activado. 10,3 mg (0,009mmol) de este éster activo se disolvieron en 2 mi de DMF y se añadieron 2,7 mg (0,018 mmol) de 1-metilhidrazincarboxilato de tere-butilo y 8 µ? de ?/,/V-diisopropiletilamina y se agitó 16 h a TA. Se repitió este proceso, después se concentró la preparación y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones y secar al alto vacío se obtuvieron 5,4 mg (43%) del Intermedio.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0. 99 min; EM (ESlpos): m/z = 1054 (M+H)+.
A partir de 3,5 mg (0,002 mmol) de este Intermedio se escindió con ácido trifluoroacético en diclorometano el grupo de protección Boc. Después de Concentrar y secar al alto vacío, se recogió el residuo en 4 mi de diclorometano y se añadieron 1 ,1 '-[(1 ,5-dioxopentan-1 ,5-diil)bis(oxi)]dipirrolidin-2,5-diona y 2 µ? de N,N-diisopropiletilamina. Después de agitar 1 h a TA se concentró la preparación y se purificó el residuo restante mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones y secar al alto vacío se obtuvieron 1 ,4 mg (44%) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,88 min; EM (ESlpos): m/z = 1166 (M+H)+.
Intermedio 252 N-(2^2-[2-(2-carooxietoxi)etoxi]etoxi}etil)-N-metil-L-valil-N-[(3RI4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-hidroxifenil)-1-(1,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 100 mg (0,088 mmol) del Intermedio 249 y 109 mg (0,350 mmol) del Intermedio 167 se combinaron en 10 mi de metanol y se añadieron 39 mg (0,42 mmol) del complejo borano-piridina y 15 µ? de ácido acético. La preparación se agitó a TA durante la noche. Después se adicionaron nuevamente las mismas cantidades del complejo borano-piridina y ácido acético y la preparación se agitó 24 h a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones y liofilizar con dioxano/agua 1:1 se obtuvieron 98 mg (93%d.t.) del intermedio bis-bencilo. Este se recogió en 18,5 mi de metanol y se sometió durante 1 h a temperatura ambiente a una hidrogenación bajo hidrógeno a presión normal sobre paladio al 5% carbón activado. Después de filtrar, concentrar y liofilizar el residuo a partir de dioxano se obtuvieron 73 mg (87% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,85 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,84 min; EM (ESlpos): m/z = 1021 (M+H)+.
Intermedio 253 N-{2-[2-(2-{3-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-3-oxopropoxi}etoxi)etoxi]etil}-N-metil-L-vali [(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-hidrox¡fenil)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-¡l}-3-meto^^ oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 22 mg (22 pmol) del Intermedio 252 se disolvieron en 8,5 mi de DMF y se añadieron 25 mg (215 mol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y a continuación 12,3 mg (32 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-/V,A/,/\/',/\/-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) y 37 µ? de ?,?-diisopropiletilamina. Después de agitar 2 h a TA la mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa. Después de liofilizar con dioxano se obtuvieron 16 mg (62% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,57 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,8 min; EM (ESlpos): m/z = 1118 (M+H)+.
Intermedio 254 N-(2-{2-[2-(2-carboxietoxi)etoxi]etoxi}etil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1 -(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 10 mg (0,012 mmol) del Intermedio 55 y 11 mg (0,036 mmol) del Intermedio 167 se combinaron en 1 mi de metanol y se añadieron 5,4 mg (0,058 mmol) del complejo borano-piridina y 1 µ? de ácido acético. La preparación se agitó a TA durante la noche. Después se adicionaron nuevamente las mismas cantidades complejo borano-piridina y ácido acético y la preparación se agitó otras 20 h a TA. A continuación se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de concentrar las correspondientes fracciones y liofilizar con dioxano/agua 1 :1 se obtuvieron 8 mg (58% d.t.) del Intermedio bis-bencilo. Este se recogió en 2 mi de metanol y se sometió durante 1 h a temperatura ambiente a una hidrogenación bajo hidrógeno a presión normal sobre paladio al 5% carbón activado. Después de filtrar, concentrar y liofilizar el residuo a partir de dioxano se obtuvieron 7 mg (95% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,99 min; EM (ESlpos): m/z = 1036 (M+H)+.
Intermedio 255 N-{2-[2-(2-{3-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-3-oxopropoxi}etoxi)etoxi]etil}-N-metil-L-val^ [(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-meti L-valinamida 7,3 mg (7 pmol) del Intermedio 254 se disolvieron en 0,3 mi de DMF y se añadieron 12 mg (106 µ?t???) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y a continuación 13,5 mg (35 pmol) de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-A/,/V,/\/'A/'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) y 6 µ? de ?,?-diisopropiletilamina. Después de agitar 2 h a TA, la mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa. Después de liofilizar con dioxano se obtuvieron 7,7 mg (79% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,97 min; EM (ESlpos): m/z = 1134 (M+H)+.
Intermedio 256 N-(2-{2-[2-(2-am¡noetoxi)etoxi]etoxi}etil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-3-m {(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(5-fenil-1 ,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-v^ 20 mg (0,02 mmol) del Intermedio 55, en analogía con la preparación del Intermedio 254 se realizó una aminación reductiva con bencil-(2-{2-[2-(2-oxoetoxi)etoxi]etoxi}etil)carbamato (Intermedio 172) en presencia del complejo borano-piridina. A continuación se eliminó mediante hidrogenólisis el grupo de protección Z con 5% de paladio sobre carbón como catalizador y en metanol como disolvente y se obtuvieron 21 mg (85% d.t. en dos etapas) del compuesto del título.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,85 min; EM (ESlpos): m/z = 1008 (M+H)+.
Intermedio 257 N-[2-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi]etoxi}etoxi)etil]-N-metil-L-vali [(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-feni fenil-1,3,4-oxadiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 21 mg (20,8 pmol) del Intermedio 256 se recogieron en 1 mi de dioxano/agua 1 :1 y a continuación se añadieron 4,9 mg (31 ,2 pmol) de 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-carboxilato de metilo así como 42 µ? de una solución acuosa 1 M de hldrogenocarbonato de sodio. La mezcla de reacción se agitó 30 min a TA. Después se adicionaron nuevamente 374 µ? de la una solución acuosa 1 de hidrogenocarbonato de sodio y la mezcla de reacción se agitó otros 30 min a TA y a continuación se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó mediante HPLC preparativa. Después de la liofilización se obtuvieron 4,5 mg (20% d.t.) del compuesto del título como espuma incolora.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,04 min; EM (ESlpos): m/z = 1088 (M+H)+.
Intermedio 258 N-{2-[2-(2-{3-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-3-oxopropoxi}etoxi)etoxi]etil}-N-met¡l-L-vali N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-[4-(benciloxi)fenil]-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida Este compuesto se preparó a partir del Intermedio 249 mediante alquilación reductiva con terc-butil-3-{2-[2-(2-oxoetoxi)etoxi]etoxi}propanoato, posterior escisión del t-butiléster y transformación en el N-hidroxisuccinimidéster.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,96 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,1 1 min; EM (ESlpos): m/z = 1208 (M+H)+.
Intermedio 259 N-(5-carboxipentil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S,3E)-1 ,4-difenilbut-3-en-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-meti 1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 9,6 mg (8,4 µ????) de A/-metil-L-valil-/V-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S,3£)-1 ,4-d¡fenilbut-3-en-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]p¡rrol¡din-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida-trifluoroacetato (Intermedio 58) y 6,5 mg (51 µ????) de ácido 6-oxohexanoico se recogieron en 769 µ? de metanol y se acidificaron con ácido acético. A temperatura ambiente se adicionaron a continuación 4 µ? (40 µ????) del complejo borano-piridina. La mezcla de reacción después se agitó otras 20 h a TA. La mezcla de reacción a continuación se ajustó con ácido trifluoroacético a un valor de pH 2 y se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones del producto se combinaron, se concentraron y se liofilizó el residuo. Se obtuvieron así 8 mg (93% d. t.) del compuesto del título en forma de espuma.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,06 min; m/z = 1019 (M+H)+.
Intermedio 260 N-{6-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-6-oxohexil}-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S,3E)-1 ,4-difenilbut-3-en-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 7,5 mg (7,4 µ????) del Intermedio 259 se disolvieron en 332 µ? de DMF y se añadieron 12,7 mg (110 pmol) de 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona y a continuación 14 mg (37 µ?t???) de O-íy-azabenzotriazol-l-iIJ-N.N.N'.N'-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HATU) y 6 µ? de N,N-diisopropilet¡lam¡na. Después de agitar 2 h a TA la mezcla de reacción se purificó mediante HPLC preparativa. Después de liofilizar con dioxano se obtuvieron 4 mg (55% d.t.) del compuesto del título.
CL-EM (procedimiento 1): Rt = 1 ,19 min; m/z = 1002 (M+H)+.
Intermedio 261 N-{2-[2-(2-{3-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)ox¡]-3-oxo N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-{[(1 S,2R)-1-(1 ,2-oxazinan-2-ilcarbonil)-2-fenilciclopropil]amino}-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-met¡l-L-valinamida Este compuesto se preparó a partir del Intermedio 16 mediante alquilación reductiva con bencil-3-{2-[2-(2-oxoetoxi)etoxi]etoxi}propanoato, posterior escisión hidrogenolítica del benciléster y transformación en el éster de N-hidroxisuccinima. HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,83 min; CL-EM (procedimiento 1): Rt = 0,93 min; EM (ESlpos): m/z = 1 114 (M+H)+.
B. Preparación de conjugados principio activo-anticuerpo (ADC) B-1. Generación de anticuerpos anti-FGFR2 La aislación del anticuerpo anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 y M048-D01-hlgG1-b humano de la presente invención se realizó mediante la tecnología Phage display usando la biblioteca de anticuerpos Fab naif n-CoDeR de Bioinvent International AB (Lund, Suecia; descrito en Sóderling et al., Nat. Biotech. 2000, 18:853-856). El fragmento Fab M048-D01 parenteral fue un suceso en la inspección. La región variable de la cadena pesada Vh de este fragmento Fab está dada por la SEC ID N° 21 , la región variable de la cadena liviana VI está dada por la SEC ID N° 22. Después de identificar el fragmento Fab M048-D01 este se expresó con la denominación M048-D01-hlgG1-b (SEC ID N° 10 para la cadena pesada, y SEC ID N° 9 para la cadena ligera) como IgG humano. Para una clonación eficiente se expresaron los primeros tres aminoácidos del exteremo N-terminal de la cadena pesada de M048-D01-hlgG1-b [EVQ] alternativamente también como QVE. Esa variación produjo el anticuerpo M048-D01-hlgG1 (SEC ID N° 8 para la cadena pesada y SEC ID N° 7 para la cadena ligera). Las regiones variables Vh y VI de M048-D01-hlgG1 están dadas por las SEC ID N° 1 1 y SEC ID N° 12, las regiones variables Vh y VI de M048-D01-hlgG1-b por las SEC ID N° 13 y SEC ID N° 14. Los dos anticuerpos presentan las mismas secuencias CDR que están dadas por las SEC ID N° 15 (H-CDR1),16 (HiCDR2),17 (H-CDR3),18 (L-CDR1),19 (L-CDR2) y 20 (L-CDR3).
Los anticuerpos GAL-FR21-mlgG1 y GAL-FR22-mlgG2a se han descrito en el documento WO2010/054265 como mlgG1 (GAL-FR21) y mlgG2b (GAL-FR22). GAL-FR21 se ha definido allí por medio de Vh (SEC ID N° 4 en el documento WO2010/054265) y mediante VI (SEC ID N° 1 en el documento WO2010/054265), así como también está definido GAL-22 mediante Vh (SEC ID N° 8 en el documento WO2010/054265) y mediante VI (SEC ID N° 7 en el documento WO2010/054265). Para los estudios que se han descrito en la presente solicitud, se reformatearon VI y Vh de GAL-FR21 al formato lgG1 murino, resultando en el anticuerpo GAL-FR21-mlgG1 (SEC ID N° 3 y SEC ID N° 4 de la presente solicitud). VI y Vh de GAL-FR22 se reformatearon al formato lgG2a murino, resultando en el anticuerpo GAL-FR22-mlgG2a (SEC ID N° 5 y SEC ID N° 6 de la presente solicitud).
B-2. Expresión de anticuerpos anti-FGFR2 Los anticuerpos M048-D01-hlgG1 , M048-D01-hlgG1-b, GAL-FR21-mlgG1 y GAL-FR22-mlgG2a se produjeron en forma transitoria en un cultivo de células de mamíferos.
La preparación de los constructos de expresión se realizó como se describió a continuación: Para poder transferir las regiones Vh y VI del Fabs M048-D01 proveniente del phage display al formato IgG y para cambiar el sistema de expresión de E. coli a células de mamíferos, se amplificaron las secuencias Vh y VI del clon de E. coli del phage display usando los cebadores PCR. Las interfases flanqueantes de la enzima de restricción se introdujeron en los extremos 5' y 3' tanto de Vh como también de VI. Estas interfases de las enzimas de restricción se usaron para la clonación de Vh y VI en un vector de expresión que contenía la estructura IgG.
Las células de E. coli se incubaron en un tubo de ensayo con 100 µ? agua a 95°C durante 10 min y después se colocó durante 5 min sobre hielo. Después de vortexear brevemente, se aclaró la solución mediante centrifugación. El sobrenadante separado se usó para la amplificación de ADN. Las reacciones PCR se realizaron por separado para Vh y VI. Se usaron pares de cebadores específicos con interfases BamHI y Notl para VI y Mfel e interfases Blpl para Vh. Las reacciones PCR se llevaron a cabo usando la polimerasa AccuPrime Pfx Polymerase (Invitrogen, # 12344-024) según las instrucciones del fabricante. Los productos PCR se analizaron sobre geles de agarosa al 1%. A los efectos de obtener extremos compatibles, se realizó la digestión de los vectores de expresión y los productos PCR según las instrucciones del fabricante durante 2 h a 37°C con las correspondientes endonucleasa de restricción (véase, Tabla 1). La digestión se detuvo por medio de incubación a 70°C durante 15 min. Los fragmentos resultantes se ligaron en el vector de expresión y se transformaron células E. coli o células de mamíferos según métodos estándar con los constructos.
Las secuencias de ADN de los dominios Vh y VI o de cadenas ligeras completas de algunos anticuerpos (GAL-FR21-mlgG1 , GAL-FR22-mlgG2a y M048-D01-hlgG1-b) se sintetizaron por medio de la tecnología Geneart Gensynthese y GeneOptimizer para la expresión génica de mamíferos (life technologies, Grand Island, NY, EE.UU.). Durante la síntesis de genes se fusionaron los dominios V con secuencias que codifican un péptido señal de mamífero con una secuencia Kozaki previa. Las interfases de restricción flanqueantes se insertaron en los extremos 5' y 3' de los constructos de ADN sintetizados. Estas interfases de restricción se usaron para la clonación de Vh y de VI o de las cadenas liviana en un vector de expresión que contenía las regiones codificadores constantes del IgG.
Los vectores de expresión y los constructos del tipo de genes se digirieron según las instrucciones del fabricante durante 2h a 37 °C con las respectivas endonucleasas de restricción, para obtener extremos compatibles (véase, Tabla 1). La digestión se detuvo por medio de incubación a 70°C durante 15 min. Los fragmentos resultantes se ligaron y se transformaron células E. coli con los ligados. Los plásmidos que se obtuvieron de estos productos transformados, se usaron para transformar células de mamíferos según procedimientos estándar.
Tabla 1 : Interfases de restricción para la clonación de Vh y VI o de la cadena liviana en vectores de expresión IgG * Clonación de la cadena ligera completa # clonación del producto PCR en vectores de expresión digeridos con EcoRI-BIpI y BamHI-Notl.
La expresión del anticuerpo se efectuó transitoriamente en un cultivo de células de mamíferos como está descrito en Tom et. al (Tom et al, Capítulo 12 en Methods Express: Expression Systems, editor Michael R. Dyson y Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007): Para la expresión anticuerpo anti-FGFR2, por ejemplo, M048- D01-hlgG1 , GAL-FR21-mlgG1 y GAL-FR22-mlgG2a, se transformaron células HEK293 6E en forma transitoria con un plásmido de expresión basado en un promotor CMV adecuado. La medida del cultivo celular fue de 1 ,5 I en el matraz agitador o 10 I en el "Wave-Bag". La expresión se realizó a 37°C durante 5-6 días en un medio F17 (Invitrogen) completado con Tryptone TN1 (Organotechnie) con 1 % "FCS ultra low IgG" (Invitrogen) y ácido valproico 0,5 mM.
Alternativamente se expresó el anticuerpo anti-FGFR2, por ejemplo M048-D01- hlgG1-b, en una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) transformado en forma estable. Para ello se usó un sistema monovector. La fermentación se realizó en biorreactores en diferente escala con el procedimiento fed-batch.
El fragmento Fab M048-D01 parental (Vh: SEC ID N° 21 , VI: SEC ID N° 22) proveniente del anticuerpo basado en M048-D01 del phage display se expresó de la siguiente manera: 20-50 mi de medio LB (mezclado con 0,1 mg/ml de ampicilina y 0,1% de glucosa) se inocularon con un precultivo de un correspondiente clon E.coli que contenía el vector pBif inicial que carecía de la secuencia Genelll, pero en el que estaba clonada la secuencia Fab M048-D01. La producción del sFabs se inició por la adición IPTG 0,5 mM (concentración final). La incubación se realizó durante la noche a 30 °C y 250 rpm.
B-3. Purificación del anticuerpo FGFR-2 Los anticuerpos, por ejemplo M048-D01-hlgG1 , M048-D01-hlgG1-b, GAL-FR21-mlgG1 y GAL-FR22-mlgG2a, se obtuvieron de los sobrenadantes de los cultivos de células. Los sobrenadantes se aclararon mediante centrifugación de las células. A continuación se purificó el sobrenadante celular mediante cromatografía de afinidad en una columna cromatográfica MabSelect Sure (GE Healthcare). Para ello se equilibró la columna en DPBS pH 7,4 (Sigma/Aldrich), se rellenó el sobrenadante celular y se lavó la columna con aprox. 10 volúmenes de columna de DPBS pH 7,4 + 500 NaCI mM. Los anticuerpos se eluyeron en acetato de sodio 50 mM pH 3,5 + 500 NaCI mM y después se continuó purificando mediante cromatografía por filtración con gel en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en DPBS pH 7,4.
La purificación del fragmento Fab M048-D01 parenteral expresado en E.coli se realizó de la siguiente manera: las células E. coli se cosecharon por centrifugación y se lisaron mediante incubación a 4°C durante 1 h en tampón de lisis (20% sacarosa (w/v), TRIS 30 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, 1 mg/ml de lisozima (Sigma L-6876) y 2,5 U/ml de benzonasa (Sigma E1014)). Posteriormente se adicionó el mismo volumen de PBS. A continuación se vertió el sobrenadante aclarado sobre perlas Dynabeads para la aislación His-Tag (Invitrogen, 101-03D) y la mezcla se agitó durante 2 h a 4°C. Posteriormente se lavó la matriz tres veces con tampón 1 (tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, 300 NaCI mM, imidazol 5 mM, 0,01% Tween-20). A continuación se realizó un solo paso de lavado en el tampón 2 (PBS mezclado con 0,005% Tween-20). Al final se eluyeron los Fab con tampón E (tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4, NaCI 300 mM, imidazol 300 mM) y se concentraron usando el tampón PBS en dispositivos de concentración Vivaspin 500 (cut-off 10000, de GE, 28-9322-25).
B-4. Relevamiento del perfil de reactividad cruzada del anticuerpo basado en M048-D01 La reactividad cruzada de los anticuerpos M048-D01-hlgG1 y M048-D01-hlgG1-b humanos de la presente solicitud se determinó usando el fragmento Fab M048-D01 parental (que comprende Vh: SEC ID N° 21 y VI: SEC ID N° 22).
El fragmento Fab M048-D01 se analizó en un ensayo ELISA respecto del enlace a las diferentes variantes de receptores FGF indicadas en la Tabla 2.
Tabla 2: Lista de proteínas recombinantes que se usaron para determinar el perfil de reactividad cruzada de los ligantes FGFR2.
Todas las variantes están disponibles como proteínas de fusión Fe en preparaciones sin vehículo. Las proteínas se sometieron a biotinilación según las instrucciones del fabricante usando un sobrenadante 2 veces molar de biotina-LC-NHS (Pierce; Cat. N° 21347) y se desalinizaron mediante columnas de desalinización Zeba (Pierce; Cat N° 89889).
Para el ensayo ELISA se cargaron con estreptavidina (Pierce, 15500) placas de 96 cavidades tratadas durante la noche a 4°C con 1 g/ml proteína biotinilizada. Se usaron como referencia las cavidades cargadas con TRAIL-Fc biotinilizada. Al día se lavaron tres veces con PBST (1 x PBS mezclado con 0,05% Tween20 (Sigma, P7949)) las placas, se trataron con tampón de bloqueo (PBST mezclado con 3% BSA (Sigma A4503)), y se lavaron nuevamente tres veces con PBST. Se añadieron 100 µ? del Fab purificado (1 pg/ml) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBST, se añadió un anti-hlgG (específico de Fab) acoplado con HRP (dilución 1 :2500, Sigma, A0293) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La reacción cromática se activó mediante la adición de 50 µ? de TMB (Invitrogen, 2023) y se después de 5-15 min con la adición de 50 µ? de H2S04 (Merck, 1 120801000). Se controló la reacción cromática en un dispositivo lector de placa a 450 nm (Tecan). Las intensidades de señal de las cavidades que contenían TRAIL-Fc se usaron como valores de fondo y las relaciones señal-fondo se calcularon como se resumió en la Tabla 3.
Tabla 3: Resumen de los datos de ELISA respecto de la reactividad cruzada de M048-D01 Relaciones señal-fondo: 0: <2; +: 2-3; ++: 3-5; +++ Como puede verse en la Tabla 2, los anticuerpos M048-D01-hlgG1 y M048-D01- hlgG1-b basados en M048-D01 se enlazan con FGFR2 humano y murino y ello independientemente de si se trata de isoformas alfa o beta o de formas de empalme lllb y lile. Como también resulta de la Tabla, los anticuerpos de la invención que se basan en M048-D01 no se enlazan con FGFR1 , FGFR3 y FGFR4.
B-5. Mapeo de epitopo mediante tecnología CLIPS A los efectos de analizar las características de enlace de los anticuerpos basados en M048-D01 , se realizó un intensivo mapeo de epitopos sobre la base de la tecnología de Pepscan "Chemically Linked peptides on Scaffolds" (CLIPS) (Timmerman et al., J. Mol. Recognit. 2007, 20:283-99). En total se diseñaron 8653 diferentes péptidos CLIPS de 15 aminoácidos a 30 aminoácidos de longitud que cubren los epitopos lineales, conformacionales y discontinuos en el FGFR2 humano. Los péptidos se sintetizaron en arreglos de péptidos. El anticuerpo M048-D01-hlgG1 humano se analizó en los arreglos de péptidos en un procedimiento basado en ELISA. Los péptidos que arrojaron los valores más altos en ELISA, se analizaron para aislar secuencias de aminoácidos similares compartidas.
A los efectos de reconstruir epitopos discontinuos de la molécula diana, se sintetizó una biblioteca de péptidos estructurados. Mediante la tecnología CLIPS es posible estructurar los péptidos en bucles individuales, bucles dobles, bucles triples, bucles similares a hojas plegadas, bucles tipo hélice y combinaciones de estos elementos estructurales: para ello se acoplan las denominadas plantillas CLIPS a restos de cisteína de los arreglos de péptidos. Por ejemplo se disolvió una solución 0,5 mM de la plantilla T2 CLIPS 1 ,3-bis (bromometil) benceno en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9) / acetonitrilo (1 :1 (v/v)). Esta solución se adicionó a los arreglos de péptidos. La plantilla CLIPS se enlazó en ese caso con las cadenas laterales de 2 cisteínas de los péptidos disponibles en los arreglos de péptidos (placa de 455 cavidades con cavidades de 3 µ?). Los arreglos de péptidos se bascularon cuidadosamente en la solución durante 30 a 60 min, estando completamente cubiertos por la solución. Finalmente se lavaron los arreglos exhaustivamente con exceso de agua y se trataron en tampón de desactivación (1% SDS, 0,1% beta-mercapto-etanol en PBS (pH 7,2)) a 70°C durante 30 min en el baño de ultrasonido. Después se repitió el tratamiento en el baño de ultrasonido en agua durante otros 45 min. Los péptidos CLIPS que portan T3 se prepararon de manera similar.
El enlace del anticuerpo a cada péptido se analizó en un ELISA basado en un PEPSCAN (Sloostra et al, Molecular diversity 1996, 1 : 87-96). Los arreglos de péptidos se preincubaron con 5% a 100% de tampón de enlace (1 h, 20 °C). El tampón de enlace consistió de 1% Tween-80, 4 % de suero equino y 5 % de ovoalbúmina (w/v) disuelta en PBS. Después de un paso de lavado se incubaron los arreglos de péptidos con solución primaria de anticuerpo (1 a 5 pg/ml) en 1% Tween- 80 en PBS durante la noche a 4°C. Después de otro paso de lavado se incubaron los arreglos de péptidos en una dilución 1/1000 de un conjugado de anticuerpo-peroxidasa (anti-human-lgG) en buffer de enlace 100% durante una hora a 25°C. Después de otro paso de lavado se adicionó el sustrato de peroxidasa 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonato (ABTS) y 2 µ?/ml de H2O2 al 3%. Después de una hora se midió el desarrollo cromático y se cuantificó con una cámara CCD y un sistema de procesamiento de imágenes.
Como datos en bruto de este procedimiento se obtienen valores ópticos que llegan hasta 0-3000 mAU (milli-absorption-units).
El resultado fue que todos los anticuerpos basados en M048-D01 se enlazan con un epitopo que se compone de los 15 restos N terminales de FGFR2 (1 RPSFSLVEDTTLEPE15). El análisis de 1257 CLIPS y péptidos lineales mostró de manera consistente valores ELISA elevados para péptidos N-terminales.
Los restos N-terminales ( RPSFSLVEDTTLEPE15) existen en todas las variantes de corte y empalme de FGFR2 humano y ello independientemente del corte y empalme alternativo en el dominio D3 que resulta en las isoformas II Ib y lile. También existe el epitopo cuando se eliminó mediante corte y empalme el dominio D1 del FGFR2 de longitud total (FGFR2 alfa, SEC ID N° 1) de lo que resulta la forma beta más corta de FGFR2 (SEC ID N° 2). En este caso el epitopo se ubica directamente delante del dominio D2.
De especial interés es que la secuencia N-terminal está conservada en el hombre, el ratón, la rata y el mono Rhesus. Esto permite la amplia reactividad cruzada inter-especies del anticuerpo M048-D01. El epitopo de enlace de M048-D01-hlgG1 y M048-D01-hlgG1-b, de dos ejemplos de anticuerpos de la presente invención, está marcado como campo rayado en la figura 1.
B-6. Procedimiento general para el acoplamiento a cadenas laterales de cisteína En las reacciones de acoplamientos se usaron los siguientes anticuerpos: M048-D01-hlgG1 M048-D01-hlgG1-b A una solución del correspondiente anticuerpo anti-EGFR que por ejemplo puede presentarse en tampón PBS en el intervalo de concentración entre 1 mg/ml y 10 mg/ml se añadieron 3 equivalentes de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), disueltos en tampón PBS, y se agitó durante 1 h a TA. A continuación se adicionaron según la carga deseada, entre 2 y 10 equivalentes del compuesto precursor de maleinimida o del compuesto precursor de halogenuro de los intermedios 102, 103, 105-109, 111-114, 117-126, 128, 129, 132-146, 148-155, 157, 159-161 , 166, 171 , 175-177, 184, 189, 194-195, 199-201 , 205, 209, 223-224, 226, 228-231 , 236, 244 y 257 en forma de solución en DMSO. En ese caso la cantidad de DMSO no debería exceder 10% del volumen total. La preparación se agitó durante 60-120 min a TA y a continuación se vertió sobre columnas PD 10 equilibradas en PBS (Sephadex® G-25) y se eluyó con tampón PBS. Dado el caso se realizó además una concentración mediante ultracentrifugación. En caso necesario para una mejor separación de componentes de bajo peso celular, se repitió la concentración mediante ultrafiltración después de una nueva dilución con tampón de PBS.
Por lo general y salvo indicación en contrario, se utilizaron 5 mg de del correspondiente anticuerpo en tampón de PBS para la reducción y el posterior acoplamiento. Después de la purificación en la columna PD10 se obtuvieron así respectivamente soluciones del correspondiente ADC en 3,5 mi de tampón PBS. En estas soluciones se determinó entonces la concentración de proteínas indicada en cada caso. Además se determinó la carga del anticuerpo (Relación Drug/mAb) según los procedimientos descritos a continuación.
De acuerdo con este procedimiento se prepararon los ¡nmunoconjugados representados en los ejemplos 1 , 3, 5-6, 8, 10-12, 14,15, 27 y 32.
En las fórmulas estructurales representadas, AK A y AK1 B tienen el siguiente significado AKIA = anticuerpo anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 (parcialmente reducido)- S§1 AK1 B = anticuerpo anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1-b (parcialmente reducido)- S§1 donde §1 significa el enlace con el grupo maleinimida, y S representa el átomo de azufre de un resto cisteína del anticuerpo parcialmente reducido.
B-7. Procedimiento general para el acoplamiento a cadenas laterales de lisina: En las reacciones de acoplamientos se usaron los siguientes anticuerpos: M048-D01-hlgG1 M048-D01-hlgG1-b GAL-FR21-mlgG1 GAL-FR22-mlgG2a A una solución del correspondiente anticuerpo en tampón PBS en el intervalo de concentración entre 1 mg/ml y 15 mg/ml se añadieron, según la carga deseada, 2 y 5 equivalentes del compuesto precursor a acoplar de los intermedios 104, 110, 1 15, 1 16, 127, 130, 131 , 147, 156, 158, 162, 169, 178, 185, 190, 202, 206, 210-216, 218, 219, 227, 233, 238, 240,242, 245, 247a, 247b, 250, 251 , 253, 255, 258 y 260-261 en forma de solución en DMSO. Después de agitar durante 30 min a TA se añadió nuevamente la misma cantidad del compuesto precursor en DMSO. La cantidad de DMSO no debería exceder 10% del volumen total. Después de agitar otros 30 min a TA la preparación se vertió sobre columnas PD 10 equilibradas en PBS (Sephadex® G-25) y se eluyó con tampón PBS. Dado el caso se realizó además una concentración mediante ultracentrifugación. En caso necesario para una mejor separación de componentes de bajo peso celular, se repitió la concentración mediante ultrafiltración después de una nueva dilución con tampón de PBS.
Por lo general y salvo indicación en contrario, se utilizaron 5 mg de del correspondiente anticuerpo en tampón de PBS para el acoplamiento. Después de la purificación en la columna PD10 se obtuvieron así respectivamente soluciones del correspondiente ADC en 3,5 mi de tampón PBS. En estas soluciones se determinó entonces la concentración de proteínas indicada en cada caso. Además se determinó la carga del anticuerpo (Relación Drug/mAb) según los procedimientos descritos a continuación.
De acuerdo con este procedimiento se prepararon los inmunoconjugados representados en los ejemplos 2, 4, 7, 9, 13, 16-17, 25, 26, 28-31 y 33-35.
En las fórmulas estructurales representadas, AK2A, AK2B, AK2D y AK2E tienen el siguiente significado AK2A = anticuerpo anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 - NH§2 AK2B = anticuerpo anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1-b - NH§2 AK2D = anticuerpo anti-FGFR2 GAL-FR21-mlgG1 - NH§2 AK2E = anticuerpo anti-FGFR2 GAL-FR22-mlgG2a - NH§2 * donde §2 significa el enlace con el grupo carbonilo, y NH representa el grupo amino de la cadena lateral de un resto lisina del anticuerpo.
B-8. Procedimiento general para la preparación de aductos de cisteína: 10 µ?t??? de los compuestos precursores de maleinimida antes descritos se agregaron a 3 mi de DMF y se mezclaron con 2,1 mg (20 µ????) de L-cisteína. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a TA, a continuación se concentró al vacío y después se purificó mediante HPLC preparativa.
En las fórmulas estructurales representadas Cis significa en la que §3 significa el enlace con la unidad conectora de toxóforo.
B-9. Procedimiento general para la preparación de aductos de lisina: Se recogieron 10 pmol del precursor del éster activo antes descrito en 5 mi de DMF y en presencia de 30 pmol de A/,A/-diisopropiletilamina se mezcló con L-lisina protegida con a-amino. La mezcla de reacción se agitó 2 h a TA, a continuación se concentró al vacío y después se purificó mediante HPLC preparativa. A continuación se eliminó el grupo de protección según procedimientos conocidos.
Posterior purificación y caracterización de conjugados de acuerdo con la invención Después de realizada la transformación en algunos casos la mezcla de reacción por ejemplo se concentró mediante ultrafiltración y a continuación se desalinizó y purificó mediante cromatografía, por ejemplo mediante una columna Sephadex® G-25. La elución se efectuó por ejemplo con solución salina con tampón de fosfato (PBS). A continuación la solución se esterilizó a esterilidad y se congelaron. En forma alternativa se puede liofilizar el conjugado.
B-10. Determinación de la carga de toxóforo De las soluciones en tampón de PBS obtenidas de los conjugados descritos en los ejemplos de realización se determinó la carga de toxóforo de la siguiente manera: La determinación de la carga de toxóforo de los ADC enlazados con lisina se efectuó según la determinación por espectrometría de masa de los pesos moleculares de las distintas especies de conjugados. Para ello, primero se realizó la desglusilación de los conjugados de anticuerpos mediante PNGaseF, se acidificó la muestra y después de la separación por HPLC se analizó por espectrometría de masa mediante ESI-MicroTofQ (Bruker Daltonik). Se sumaron todos los espectros por medio de la señal en el TIC (Total Ion Chromatogramm) y se calculó el peso molecular de las distintas especies de conjugados sobre la base de MaxEnt Deconvolution. Después de la integración de señal de las distintas especies se calculó entonces la DAR (= Drug/Antibody Ratio).
Para la identificación de las proteínas, además de la determinación del peso molecular después de la desglucosilación y/o desnaturalización, se efectuó una digestión tríptico, la que al cabo de la desnaturalización, reducción y derivatización confirmó la identidad de la proteína mediante los péptidos trípticos comprobados. La determinación de la carga de toxóforo de los conjugados enlazados con cisteína se realizó mediante la cromatografía de fase inversa del ADC reducido y desnaturalizado. A la solución de ADC se adicionó (1mg/ml, 50 µ?) clorhidrato de guanidinio (GuHCI) (28,6 mg) y una solución de DL-ditiotreitol (DTT) (500 mM, 3 µ?). La mezcla se incubó durante una hora a 55°C y se analizó mediante HPLC.
El análisis por HPLC se realizó en un sistema Agilent 1260 HPLC con detección a 220 nm. Se empleó una columna polimérica de fase inversa de Polymer Laboratories PLRP-S (número de catálogo PL1912-3802) (2,1 x150 mm, tamaño de partícula de 8 pm, 1000 Á) con una velocidad de caudal de 1 ml/min con los siguientes gradientes: 0 min, 25 % B; 3 min, 25 % B; 28 min, 50 % B. El eluyente A consistió en 0,05 % de ácido trifluoroacético (TFA) en agua, el eluyente B de 0,05 % de ácido trifluoroacético en acetonitrilo.
Los picos detectados se asignaron mediante la comparación del tiempo de retención de la cadena ligera (LO) y de la cadena pesada (HO) con el anticuerpo no conjugado. Los picos que se detectaron exclusivamente en la muestra conjugada, se asignaron a la cadena ligera con un toxóforo (L1) y a las cadenas pesadas con uno, dos y tres toxóforos (H1 , H2, H3).
La carga promedio del anticuerpo con toxóforos se calculó del siguiente modo: en primer lugar se calculó la carga de cadena ligera a partir de las superficies de pico determinadas como la suma de los resultados de integración de todos los picos dividida por la suma de los resultados de integración ponderados una sola vez.
La carga de cadena pesada se calculó como la suma de los resultados de integración ponderados con el número de toxóforos de los picos de la cadena pesada dividida por la suma de los resultados de integración ponderados una sola vez de los picos que pertenecen a la cadena pesada. La carga promedio de "drug" resulta como el doble de la suma de la carga de la cadena ligera y la carga de la cadena pesada. En casos aislados puede suceder que no es posible determinar exactamente la carga de toxóforo debido a la co-elución de algunos picos.
B-11. Verificación de un enlace del ADC con el antígeno Después de realizado el acoplamiento se verificó la capacidad de enlace del ligante con la molécula diana. Para ello, el especialista conoce diversos procedimientos, por ejemplo, se puede verificar la afinidad del conjugado mediante un ensayo con tecnología ELISA o análisis de resonancia de plasmones de superficie (mediciones BIAcore™). La concentración del conjugado puede ser medida por el especialista por procedimientos usuales, por ejemplo para conjugados de anticuerpos mediante determinación de proteínas (véase también Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21 :778-784 y Polson et al., Blood 2007; 1102:616-623).
Ejemplos de realización de inmunoconiugados Ejemplo 1 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 30 mg de M048-D01-hlgG1 en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación, se diluyó nuevamente con PBS y se concentró de nuevo.
Concentración de proteína: 15,5 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,7 Ejemplo 2 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 32 mg de M048-D01-hlgG1 en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación, se diluyó nuevamente con PBS y se concentró de nuevo.
Concentración de proteína: 11 ,7 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,9 Ejemplo 3 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 30 mg de M048-D01-hlgG1 en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación, se diluyó nuevamente con PBS y se concentró de nuevo.
Concentración de proteína: 12,5 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,7 Ejemplo 4 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 2 mg de M048-D01-hlgG1 en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente con PBS.
Concentración de proteína: 1 ,92 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,7 Ejemplo 5 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 3 mg de M048-D01-hlgG1 en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 2,54 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,1 Ejemplo 6 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 4 mg de M048-D01-hlgG1 en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,53 mg/ml Relación Drug/mAb: 2,7 Ejemplo 7 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,28 mg/ml Relación Drug/mAb: 6,1 Ejemplo 8 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente, Concentración de proteína: 1 ,26 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,5 Ejemplo 9 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,28 mg/ml Relación Drug/mAb: 6,1 Ejemplo 10 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,36 mg/ml Relación Drug/mAb: 4,4 Ejemplo 11 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,27 mg/ml Relación Drug/mAb: 4,8 Ejemplo 12 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración proteica: 1 ,48 mg/ml Drug/mAb-Ratio: 4,0 Ejemplo 13 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración proteica: 1 ,21 mg/ml Relación Drug/mAb: 1 ,5 Ejemplo 14 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración proteica: 1 ,27 mg/ml Relación Drug/mAb: 2,7 Ejemplo 15 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente con PBS.
Concentración proteica: 1 ,37 mg/ml Drug/mAb-Ratio: 3,9 Ejemplo 16 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 4 mg de GAL-FR21-mlgG1 en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente con PBS.
Concentración de proteína: 1 ,63 mg/ml Relación Drug/mAb: 8,7 Ejemplo 17 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 4 mg de GAL-FR22-mlgG2a en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente con PBS.
Concentración de proteína: 1 ,60 mg/ml Relación Drug/mAb: 8,1 Ejemplo 18 N-(6-{[(5S)-5-amino-5-carboxipentil]am¡no}-6-oxohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)- 1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1 -(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2- il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4- il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato Se recogieron 15,5 mg (15 pmol) del intermedio 210 en 5 mi de DMF y se mezclaron con 4,4 mg (18 pmol) N2-(terc-butoxicarbonilo)-L-lisina así como 7,7 µ? (44 µ????) de A/,A/-diisopropiletilamina. La mezcla de la reacción se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al vacío. El resto se purificó luego mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 14 mg (81 % d.t.) del intermedio protegido del compuesto del título que a continuación se recogieron en 1 mi de diclorometano y se desprotegieron con 1 mi de ácido trifluoroacético. La mezcla de la reacción se concentró y, luego de la liofilización del resto de acetonitrilo/agua 1 :1 , se obtuvieron 15 mg (97% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Ri=1 ,8 min; LC-MS (Procedimiento 1 ): Ri=0,79 min; MS (ESlpos): m/z=1083(M+H)+.
Ejemplo 19 N-(6-{[(5S)-5-amino-5-carboxipentil]amino}-6-oxohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)- 1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-(1 H-indol-3-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]p¡rrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida 40 mg (40 µ????) del intermedio 227 se recogieron en 5 mi de DMF y se mezclaron con 11 ,5 mg (40 prnol) N2-[(benciloxi)carbonil]-L-lisina así como 13 µ? (80 µ?t???) ?,?-diisopropiletilamina. La mezcla de la reacción se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al vacío. El resto se purificó luego mediante HPLC preparativo. Se obtuvieron 32,5 mg (70% d.t.) del intermedio protegido del compuesto del título.
Estos 32,5 mg del intermedio fueron disueltos en 10 mi de metanol e hidrogenados luego del agregado de 2 mg del 10% de paladio en carbón activo durante 30 minutos a TA bajo hidrógeno a presión normal. Se filtró luego el catalizador y el solvente fue retirado. Luego de la liofilización del resto de dioxano/agua 1 :1 se obtuvieron 26 mg (99% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Ri=1 ,7 min; LC-MS (Procedimiento 1 ): R^O.76 min; MS (ESlpos): m/z=1014(M+H)+.
Ejemplo 20 N-[(18S)-18-amino-18-carboxi-12-oxo-3,6,9-trioxa-13-azaoctadec-1 -il]-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(1 H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-i oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrol¡din-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-¡l]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato 3,5 mg (3 µ????) del intermedio 202 se recogieron en 2 mi de DMF y se mezclaron con 0,8 mg (3 µ?t???) N2-(terc-butoxicarbonilo)-L-lisina así como 1 ,6 µ? (10 µ?t???) de A/,A/-diisopropiletilamina. La mezcla de la reacción se agitó durante la noche a TA y a continuación se concentró al vacío. El resto se recogió en acetonitrilo/agua 1 :1 , llevado a pH 2 con ácido trifluoroacético y luego purificado mediante HPLC preparativo. Se obtuvieron 1 mg (25% d.t.) del intermedio protegido del compuesto del título que a continuación se recogieron en 500 µ? de diclorometano y se desprotegieron con 500 µ? de ácido trifluoroacético. La mezcla de la reacción se concentró y, luego de la liofilización del resto de acetonitrilo/agua 1 :1 , se obtuvo 1 mg (89% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (Procedimiento 12): Ri=1 ,9 min; LC-MS (Procedimiento 1): ^=0,82 min; MS (ESlpos): m/z=1173(M+H)+.
Ejemplo 21 A/-(4-{2-[6-(3-{[(2f?)-2-amino-2-carboxietil]sulfanil}-2,5-dioxopirrolidin-1-il)hexanoil]hidrazino}-4-oxobut¡l)-W-met¡l-L^ {[(2S)-1 -amino-3-(1 /-/-indol-3-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida Se recogieron 10 mg (? ?µ?t???) del Intermedio 157 en 5,2 mi de DMF y se añadió 2,28 mg (20 µ?t???) de L-cisteína. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a TA, a continuación se concentró al vacío y después se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 5,8 mg (48% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,45 min; LC-MS (procedimiento 1): Rt = 0,74 min; MS (ESlpos): m/z = 1 184 (M+H)+.
Ejemplo 22 A/-(4-{2-[6-(3-{[(2 )-2-amino-2-carbox¡ il)hexanoil]hidraz¡no}-4-oxobutil)-N-m^^ {[(1S)-1-carboxi-2-(1 H-indol-3-il)etil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-i 3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-A/-metil-L-valinamida Se recogieron 10 mg (10pmol) del Intermedio 113 en 5,2 mi de DMF y se añadieron 2,28 mg (20 µ?t???) de L-cisteína. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a TA, a continuación se concentró al vacío y después se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 6 mg (54% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,5 min; LC-MS (procedimiento 1): Rt = 0,77 min; MS (ESlpos): m/z = 1 185 (M+H)+.
Ejemplo 23 A/-[6-(3-{[(2R)-2-amino-2-carboxietil]sulfanil}-2,5-dioxopirrolidin-1-il)hexil]-A/-meW valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 ,2R)-3-{[(1 S)-1-carboxi-2-(1H-indol-3-il)etil]amino^ 1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/N/-metil- L-valinamida Se recogieron 10 mg (10 µ????) del Intermedio 124 en 4 mi DMF y se añadieron 2,5 mg (20 pmol) de L-cisteína. La mezcla de reacción se agitó 2 h a TA, a continuación se concentró al vacío y después se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 7,2 mg (64% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,6 min; LC-MS (procedimiento 1): Rt = 0,8 min; MS (ESlpos): m/z = 1071 (M+H)+.
Ejemplo 24 A/-[6-(3-{[(2 )-2-amino-2-carboxietil]sulfanil}-2,5-dioxopirrolidin-1-il)hexil]^ valil-A/-[(3f?)4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1f?,2/?)-3-{[(2S)-3-(1H-indol-3-il)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1 -oxopropan-2-il]amino}-1 -metox¡-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-/V-metil-L-valinamida Se recogieron 10 mg (10 pmol) del Intermedio 125 en 4 mi de DMF y se añadieron 2,4 mg (20 pmol) de L-cisteína. La mezcla de reacción se agitó 2 h a TA, a continuación se concentró al vacío y después se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 7,7 mg (69% d.t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 5): Rt = 1 ,7 min; LC-MS (procedimiento 2): Rt = 1 ,91 min; MS (ESlpos): m/z = 1 140 (M+H)+.
Ejemplo 25 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,27 mg/ml Relación Drug/mAb: 1 ,0 Ejemplo 26 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 35 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación, se diluyó nuevamente con PBS y se concentró de nuevo.
Concentración de proteína: 11 ,60 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,7 Ejemplo 27 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 35 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación, se diluyó nuevamente con PBS y se concentró de nuevo.
Concentración de proteína: 11 ,7 mg/ml Relación Drug/mAb: 4,2 Ejemplo 28 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS después de la purificación por medio de Sephadex la mezcla de reacción : concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente con PBS.
Concentración de proteína: 1 ,31 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,7 Ejemplo 29 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la mezcla de reacción se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente con PBS.
Concentración de proteína: 1 ,53 mg/ml Relación Drug/mAb: 1 ,3 Ejemplo 30 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la preparación se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,61 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,9 Eiemplo 31 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la mezcla de reacción se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,32 mg/ml Relación Drug/mAb: 1 ,7 Ejemplo 32 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS después de la purificación por medio de Sephadex la mezcla de reacción concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,12 mg/ml Relación Drug/mAb: 0,2 Ejemplo 33 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la mezcla de reacción se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,29 mg/ml Relación Drug/mAb: 5,5 Ejemplo 34 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS después de la purificación por medio de Sephadex la mezcla de reacción : concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,04 mg/ml Relación Drug/mAb: 0,5 Eiemplo 35 Para el acoplamiento se utilizaron aquí 5 mg de M048-D01-hlgG1-b en PBS y después de la purificación por medio de Sephadex la mezcla de reacción se concentró mediante ultracentrifugación y se diluyó nuevamente.
Concentración de proteína: 1 ,66 mg/ml Relación Drug/mAb: 3,4 Ejemplo 36 N-(6-{[(5S)-5-amino-5-carboxipentil]amino}-6-oxohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(2S)-3-(4-h¡droxifenil)-1-(1 ,2-oxazinan-2-il)-1-oxopropan-2-il]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1 -il}-3-metoxi-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato Se recogieron 8 mg (8 pmol) del Intermedio 242 en 3 mi de DMF y se añadieron 2,9 mg (12 µ?t???) de N2-(terc.-butoxicarbonil)-L-lisina así como 2,7 µ? (16 pmol) de N,N-diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA, después se añadieron nuevamente las mismas cantidades de N2-(terc.-butoxicarbonil)-L-lisina y A/,A/-d¡isopropiletilamina y después se agitó otras 4 h a TA. A continuación se concentró la preparación al vacío. El residuo después se purificó mediante HPLC preparativa. Después de liofilizar con acetonitrilo/agua, se obtuvieron 6,5 mg (72% d.t.) del Intermedio protegido del compuesto del título que a continuación se recogió en 5 mi de diclorometano y se desprotegió con 0,75 mi de ácido trifluoroacético. La preparación se concentró y después de liofilizar el residuo con dioxano/agua, se obtuvieron 5 mg (76% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,7 min; LC-MS (procedimiento 1): Rt = 0,69 min; MS (ESlpos): m/z = 1059 (M+H)+.
Ejemplo 37 N-(6-{[(5S)-5-amino-5-carboxipentil]amino}-6-oxohexil)-N-metil-L-valil-N-[(3R,4S,5S)-1 -{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1 S)-1 -carboxi-2-(4-hidroxifenil)etil]amino}-1 -metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida-trifluoroacetato primer lugar se transformaron 38 mg (41 pmol) del Intermedio 248 en el N-hidroxisuccinimid-éster. Se recogieron 72 mg del producto en bruto obtenido en 5 mi de DMF y se añadieron 24 mg (100 pmol) de N2-(terc.-butoxicarbonil)-L-lisina así como 23 µ? de A/,/V-di¡sopropiletilamina. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a TA, después se añadió nuevamente 16 mg de N2-(terc.-butoxicarbonil)-L-lisina y 12 µ? de A/,A/-diisopropiletilamina y a continuación se trató otras 2 h en el baño ultrasónico. Después se concentró la preparación al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Después de liofilizar con acetonitrilo/agua se obtuvieron 20 mg (50% d.t.) del Intermedio protegido del compuesto del título.
A continuación se recogieron 15 mg (12 µ?t???) de este Intermedio en 3 mi de diclorometano y se añadió 1 mi de ácido trifluoroacético. Después de agitar durante 40 min a TA se adicionaron otros 1 ,5 mi de ácido trifluoroacético y la preparación se trató durante 1 h en el baño ultrasónico. Después se concentró la preparación y después de liofilizar el residuo con dioxano/agua se obtuvieron 13 mg (90% d. t.) del compuesto del título.
HPLC (procedimiento 12): Rt = 1 ,5 min; LC-MS (procedimiento 1): Rt = 0,68 min; MS (ESIpos): m/z = 990 (M+H)+.
C. Evaluación de la efectividad biológica La actividad biológica de los compuestos de acuerdo con la invención se demostró mediante los ensayos descritos a continuación: C-1. Identificación de células tumorales con diferentes niveles de FGFR2 en la superficie celular Para determinar las cantidades viables de FGFR2 para el anticuerpo en la superficie celular se analizó la unión celular del anticuerpo FGFR2 en diferentes líneas celulares tumorales en la citometría de flujo. Se usaron las siguientes líneas celulares para los ensayos. Los datos respecto de las mutaciones y cantidades de copias del FGFR2 provienen del proyecto genómico del Sanger Center: - SNU-16 células de carcinoma gástrico humano, amplificación del gen FGFR2 (cantidad de copias 14; ATCC-CRL-5974, RPMI 1640 (Biochrom FG1215) + 10% FCS - Katolll células de carcinoma gástrico humano, amplificación del gen FGFR2 (cantidad de copias 14 ATCC-TCP-1008; Iscove's (Biochrom FG0465) + 20% FCS - SUM52-PE células de cáncer de mama humano, amplificación del gen FGFR2 (cantidad de copias 14; Asterand Lot-Nr: 28062A1-6004; Ham's F12 (Biochrom FG0815) + 5% FCS + tampón Hepes 10 mM + 1 pg/ml de hidrocortisona + 5 pg/ml de insulina - MFM-223 células de cáncer de mama humano, amplificación del gen FGFR2 (cantidad de copias 14; ECACC-98050130, MEM Earle (Biochrom F0315) + 10% FCS + glutamina 2mM - NCI-H716 células de carcinoma colorrectal humano, amplificación del gen FGFR2 (cantidad de copias: 8; ATCC-CCL-251 ; RPMI 1640 (Biochrom FG1215) + 10% FCS) - MDA-MB-231 células de cáncer de mama humano (sin amplificación del gen FGFR2, cantidad de copias 3; ATCC-HTB-26, DMEM / HAM's F12 (Biochrom FG4815) + 10% FCS Para los ensayos se lavaron dos veces células adherentes con PBS (sin iones de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) y se desprendieron con tampón de disociación celular sobre la base de PBS, libre de enzimas (Invitrogen). Se suspendieron aproximadamente 1 x 105 células por cavidad en tampón FACS (PBS sin Ca2+ y Mg2+ con 3% FCS (Biochrom)), a continuación se centrifugaron (250 g, 5 min, 4°C) y se desecho el sobrenadante. Las células se resuspendieron en diluciones de anticuerpo (5 Mg/ml en 80 µ?) en tampón FACS y se incubaron durante 1 h sobre hielo. En el paso siguiente, las células se lavaron una vez con 100 µ? de tampón FACS frío y se adicionaron 80 µ? de anticuerpo secundario diluido 1 :150 (IgG anti-ratón de cabra acoplado con PE, Jackson Immuno Research #115-115-164 para GAL-FR21-mlgG1 o bien GAL-FR22-mlgG2a e IgG anti-humano de cabra acoplado con PE, dianova #109-115-098 para M048-D01-hlgG1).
Después de la incubación durante 1 h sobre hielo, las células se lavaron nuevamente con tampón FACS frío, se resuspendieron en 100 µ? de tampón FACS y se analizaron en el citómetro de flujo FACS-Array (BD Biosciences). Los resultados se calcularon como valor medio geométrico de la población celular detectada con anticuerpo FGFR2 menos la fluorescencia de fondo que se midió mediante la incubación de la población celular solo con el anticuerpo secundario. Los valores se evaluaron según el siguiente sistema: valor medio geométrico anticuerpo FGFR2 menos valor medio geométrico solo de anticuerpos secundarios >10 +, >100 ++, >1000 +++, > 10000 ++++, -: sin señal. Los valores próximos a los límites de categoría se identifican con ().
El enlace de los anticuerpos FGFR2 a las células tumorales se indicó en Tabla 4: Tabla 4 ' nd: no determinado Los anticuerpos FGFR2 detectan FGFR2 en la superficie celular de células cancerosas MFM-223 y SNU-16.
C-2. Determinación del efecto citotóxico de los ADC dirigidos contra FGFR2 El efecto citotóxico de los ADC FGFR2 se determinó en diferentes líneas celulares con distintas cantidades de expresión de FGFR2: El cultivo de las células se efectuó según métodos estándar con los medios de crecimiento indicados en el párrafo C-1. Para la realización, se desprendieron las células con una solución de tripsina (0,05%) y EDTA (0,02%) en PBS (Biochrom AG #L2143), se peletizaron, se resuspendieron en medio de cultivo, se contaron y se sembraron en una placa de cultivo de 96-cavidades con fondo blanco (Costar #3610) (en 75 µ?/cavidad, las siguientes cantidades de células por cavidad: SNU-16: 3000; MFM-223: 7000; MDA-MB-231 : 4000; SUM52-PE: 3000; NCI-H716: 3000; Katolll: 3000) y se incubaron en la incubadora a 37°C y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 h se agregaron los conjugados de principio activo-anticuerpo en 25 µ? de medio de cultivo (concentración cuádruple) sobre las células, de modo que se alcanzó una concentración final de los conjugados de principio activo-anticuerpo de 3 x 10"7 M a 3 x 10"11 M en las células (triplicados). A continuación se incubaron las células en la incubadora a 37°C y 5% de dióxido de carbono. En una placa paralela se determinó la vitalidad celular al comenzar el tratamiento con el principio activo (día 0) con el ensayo de viabilidad celular "Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay" (Promega #G7573 y #G7571). Para ello se adicionaron en cada preparado celular 100 µ? del sustrato, después se cubrieron las placas con lámina de aluminio, se agitaron durante 2 minutos con el agitador de placa a 180 rpm, se dejó reposar durante 8 minutos en el banco del laboratorio y después se midió con un luminómetro (Víctor X2, Perkin Elmer). El sustrato detecta el contenido de ATP en las células vivas, produciéndose una señal de luminiscencia, cuya altura es directamente proporcional a la vitalidad de las células. Después de incubar durante 72 h con los conjugados de principio activo-anticuerpo se midió también en estas células la vitalidad con el ensayo "Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay" como se ha descrito arriba. De los datos medidos se calcularon los valores IC50 de la inhibición del crecimiento en comparación con el día 0 con el software del laboratorio MTS (desarrollado por Schering AG y Bayer Business Services 1999-2009) por medio de una adecuación de 4 parámetros.
En la siguiente Tabla 5 se indicaron los valores IC501) de ejemplos de realización representativos de este ensayo: Tabla 5 ' Los datos de la efectividad indicados se refieren a los ejemplos de realización descritos en la parte experimental con las relaciones Drug/mAB indicadas. Los valores eventualmente pueden variar en caso de otras relaciones Drug/mAB.
El ejemplo de realización 1 inhibió la proliferación de las líneas celulares cancerosas SNU-16 y MFM-223 que expresan FGFR2 en la superficie celular con un valor IC50 en el intervalo de concentración subnanomolar. El ejemplo de realización 1 inhibió la proliferación de la línea celular cancerosa MDA-MB-231 que no expresa FGFR2 en la superficie celular con un valor IC5o de 300 nM. Como resulta de los datos, todos los conjugados de principio activo-anticuerpo analizados (ejemplos de realización 1-31 , 33-35) inhiben selectivamente la proliferación de líneas celulares cancerosas que expresan FGFR2 (SNU-16, MFM-223, SUM52-PE, Katolll o NCI-H716).
C-3. Determinación de la influencia sobre la polimerización de tubulina Las células cancerosas son células desnaturalizadas que frecuentemente también pueden llevar a la formación tumoral debido a una aumentada división celular. Los microtúbulos forman las fibras del aparato de huso acromático y constituyen un componente esencial del ciclo celular. La construcción y degradación regulada de los microtúbulos permite la distribución exacta de los cromosomas en las células hijas y representa un proceso dinámico continuo. Una interferencia en esta dinámica produce una división celular deficiente y finalmente la muerte celular. Pero la mayor división celular de células cancerosas también las convierte en especialmente receptivas a los tóxicos de las fibras del huso acromático que constituyen un componente fijo de la quimioterapia. Las sustancias tóxicas de las fibras del huso como paclitaxel o epotilona producen una velocidad de polimerización muy aumentada de los microtúbulos, mientras que los vinca-alcaloides o también la monometilauriestatina E (MMAE) generan una velocidad de polimerización mucho más reducida de los microtúbulos. En ambos casos está interferida sensiblemente la dinámica necesaria del ciclo celular. Los compuestos estudiados en el marco de la presente invención generan una velocidad de polimerización reducida de los microtúbulos.
Para estudiar la polimerización de la tubulina se utilizó el equipo de ensayo "Fluorescence-based Microtubule Polymerisation Assay Kit" de la empresa Cytoskeleton (Denver, Colorado, EE.UU.; número de pedido: BK011). En este ensayo se adiciona GTP a tubulina no polimerizada, con lo que la polimerización puede producirse en forma espontánea. El ensayo se basa en la unión del fluoróforo 4',6-diamidaino-2-fenilindol (DAPI) con la tubulina. Debido a espectros de emisión diferentes es posible diferenciar DAPI libre y enlazado. Dado que DAPI presenta una afinidad notoriamente mayor frente a la tubulina polimerizada en comparación con la tubulina no polimerizada, puede controlarse la polimerización de tubulina mediante el aumento de la fluorescencia de flurofóros DAPI enlazados.
Para la realización de este ensayo, los compuestos de acuerdo con la invención disueltos en DMSO se diluyeron de su concentración inicial de 10 mM a 1 µ? en agua. Además del control del tampón también se incluyó como control del ensayo paclitaxel para aumentar la polimerización y por otra parte vinblastina para inhibir la polimerización. Para la medición se usaron placas perforadas de 96 cavidades con media superficie de piso. La cinética de la polimerización de la tubulina se controló durante 1 h a 37 °C en un fluorímetro. La longitud de onda de excitación fue 355 nm, se realizó el seguimiento de la emisión a 460 nm. Para el intervalo del incremento lineal dentro de los primeros 10 minutos se calculó la modificación de la fluorescencia por minuto (AF/min) que constituye la velocidad de polimerización de los microtúbulos. La potencia de las sustancias de ensayo se cuantificó mediante la respectiva reducción de la velocidad de polimerización. En la siguiente Tabla 6 se indican datos de la influencia de ejemplos de realización representativos sobre la polimnerización de la tubulina: Tabla 6: Bloqueo de la polimerización de tubulina mediante ejemplos seleccionados de las variantes de toxóforos.
El toxóforo MMAF y los ejemplos de realización inhiben la polimeración de la tubulina en relación con la concentración. Con 100 µ? MMAF se encuentra totalmente inhibida la polimerización de la tubulina. Los compuestos estudiados en el marco de la presente invención generan una reducción de la velocidad de polimerización de los microtúbulos. En los ejemplos de realización 18 - 21 se inhibe la polimerización de la tubulina con 1 µ? a 45-88 % del valor que se mide con 1 µ? MMAF.
C-4. Ensayos in vitro para la determinación de la permeabilidad celular La permeabilidad celular de una sustancia puede analizarse mediante ensayos in vitro en un ensayo de flujo empleando células Caco-2 [M.D. Troutman y D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Para ello se cultivaron las células en placas filtrantes de 24 orificios durante 15-16 días. Para la determinación de la permeación se aplicó el respectivo ejemplo de realización en un tampón HEPES ya sea en forma apical (A) o basal (B) sobre las células y se incubó durante 2 h. Después de 0 h y al cabo de 2 h se extrajeron muestras de los compartimientos cis- y trans. Las muestras se escindieron mediante HPLC (Agilent 1200, Bóblingen, Alemania) empleando columnas de fase inversa. El sistema HPLC-System estaba acoplado por medio de una interfase Turbo Ion Spray a un espectrómetro de masa triple Quadropol API 4000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Alemania). La permeabilidad se evaluó mediante un valor Papp que se calculó mediante la fórmula publicada por Schwab er a/. [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. De importancia decisiva para los toxóforos que son liberados intracelularmente, es la permeabilidad de B hacia A [Papp (B-A)]: Cuando menor es esa permeabilidad, tanto mayor es el tiempo de permanencia del ejemplo de realización en la célula después de la liberación intracelular y con ello también el tiempo que se encuentra disponible para una interacción con el blanco bioquímico (en este caso la tubulina).
En la siguiente Tabla 7 se indican datos de permeabilidad de ejemplos de realización representativos de este ensayo: Tabla 7 Los ejemplos de realización presentan una menor permeabilidad de B hacia A [Papp (B-A) y por lo tanto un mayor tiempo de permanencia en las células CaCo-2. En comparación con ello, la monometilauriestatina E (MMAE) y la monometilauriestatina F (MMAF) en este ensayo presentan un valor Papp (B-A) de 73 nm/s y tienen así una tiempo de permanencia notoriamente más corto en las células Caco-2.
C-5. Ensayos in vitro para la determinación de las propiedades del sustrato para la glicoproteína P (P-gp) Muchas células tumorales expresan proteínas transportadoras para principios activos, lo que frecuentemente conlleva que se desarrolle resistencia a los citostáticos. Las sustancias que no son sustratos de tales proteínas transportadoras como por ejemplo glicoproteína P (P-gp) o BCRP, por lo tanto pueden presentar un perfilo de acción mejorado.
Las propiedades del sustrato de una sustancia para P-gp (ABCB1) se determinación mediante un ensayo de flujo utilizando células LLC-PK1 que sobreexpresan la P-gp (células L-MDR1) [A.H. Schinkel et al., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. Para ello se cultivaron las células LLC-PK1- o L-MDR1 en placas filtrantes de 96-orificios durante 3-4 días. Para la determinación de la permeación se aplicó la respectiva sustancia de ensayo ya sea sola o en presencia de un inhibidor (como p. ej., ivermectina o verapamilo) en un tampón HEPES ya se en forma apical (A) o basal (B) sobre las células y se incubó durante 2 h. Después de 0 h y al cabo de 2 h se extrajeron muestras de los compartimientos cis y trans. Las muestras se escindieron mediante HPLC empleando columnas de fase inversa. El sistema HPLC-System estaba acoplado por medio de una interfase Turbo Ion Spray a un espectrómetro de masa triple Quadropol API 4000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Alemania). La permeabilidad se evaluó mediante un valor Papp que se calculó mediante la fórmula publicada por Schwab et al. [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)].
De importancia decisiva para los toxóforos que se liberan intracelularmente, es la permeabilidad de B hacia A [Papp (B-A)]: cuanto más baja es dicha permeabilidad, tanto mayor es el tiempo de permanencia del ejemplo de realización en la célula después de la liberación intracelular y con ello también el tiempo disponible para una interacción con el blanco bioquímico (en este caso: tubulina).
En la siguiente Tabla 8 se indican datos de permeabilidad de ejemplos de realización representativos de este ensayo que se realizó en células L-MDR1 : Tabla 8 Los ejemplos de realización presentan una baja permeabilidad de B hacia A [Papp (B-A)] y por lo tanto presentan un tiempo de permanencia prolongado en las células L-MDR1.
C-6. Farmacocinética en el modelo tumoral SNU-16 Después de la aplicación i.v. de diferentes ADC se miden las concentraciones de ADC en el plasma y en el tumor, así como los metabolitos que pueden presentarse potencialmente y se calculan los parámetros farmacocinéticos como Clearance (CL), superfice debajo de la curva (AUC) y vida media (t-1/2).
Análisis para cuantificar los potenciales metabolitos La medición de los compuestos en el plasmo y el tumor se efectúa después de la precipitación de las proteínas con metanol por medio de una cromatografía líquida de alta presión (HPLC) acoplada a un espectrómetro de masa acoplado en tándem (EM).
Para el procesamiento de 100 µ? de plasma estos se mezclan con 400 µ? de metanol y 10 µ? de estándar interno (ISTD, 50 ng/ml en metanol) y se agitó durante 10 segundos. Después de centrifugar 5 minutos a 16000 g se transfieren 250 µ? del sobrenadante a un Autosampler-Vial, se completa con 250 µ? de tampón de acetato de amonio (AAC, 10 nriM, pH 6,8) y se agita nuevamente.
Para el procesamiento de un tumor, este se mezcla con la cantidad cuádruple de metanol. En el Tissuelyser II (Qiagen) se tritura la muestra durante 6 minutos con 30 impactos por minuto y a continuación se separa por centrifugación durante 5 minutos a 16000 g. Se transfieren 50 µ? del sobrenadante a un Autosampler-Vial, se completa con 50 µ? de tampón de acetato de amonio (10 mM, pH 6,8), así como 5 µ? de ISTD. Después de una nueva agitación la muestra del tumor esta lista para la medición. La medición de ambas muestras de matriz se efectúa finalmente por medio de un espectrómetro de masa atmospheric pressure ionization/acoplado en tándem a una HPLC mediante una interfase Turbolonspray (TISP) en un dispositivo API4000-Gerát de la empresa SCIEX.
El análisis HPLC/LC-EMEM (TISP) se efectúa con una bomba HP1100 (Agilent) con la columna Gemini (5 µ?t? C18 110 A, 50 x 3 mm, fenomenex).
C-7. Ensayo de efectividad in vivo La efectividad de los conjugados de acuerdo con la invención se analiza in vivo por ejemplo mediante modelos de xenoinjerto. El especialista conoce procedimiento en el estado de la técnica de cómo puede analizarse la efectividad de un conjugado de la invención (véase por ejemplo el documento WO 2005081711 ; Polson et al, Cáncer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358-64). Por ejemplo, para ello se le implanta a roedores (por ejemplo, a ratones) una línea celular tumoral que expresa la molécula diana del ligante. A continuación se les aplica a los animales implantados ya sea un conjugado de la invención o anticuerpo de control o solución salina isotónica. La aplicación se realiza una sola vez o varias veces. Después de un tiempo de incubació de varios días se determina el tamaño del tumor en comparación con animales tratados con conjugado y el grupo de control.
C-7a. Prueba de los ADC en tumores experimentales en el ratón Las células tumorales humanas que expresan FGFR2 se inoculan en forma subcutánea en la paleta de ratones inmunosuprimidos, por ejemplo ratones nudos o SCID. Se desprenden 1-10 millones de células del cultivo celular, se centrifugan y se resuspenden con 100 µ? de medio o 50% de medio / 50% de matrigel. La suspensión celular se inyecta debajo de la piel del ratón.
En el plazo de algunos días se produce el crecimiento de un tumor. El tratamiento comienza recién con un tamaño tumoral de 20-25 mm2.
El esquema de tratamiento se rige según la farmacocinética del anticuerpo. El tratamiento estándar es tres veces cada cuarto día consecutivo. Pero el tratamiento también puede continuar o se puede realizar en otro momento posterior un segundo ciclo con tres días de tratamiento.
En forma estándar se utilizan 8 animales por grupo de tratamiento. Puede aumentar esta cantidad, cuando se esperan variaciones demasiado fuertes en el crecimiento tumoral o después del tratamiento. Paralelo a los grupos que reciben las sustancias con acción terapéutica, un grupo de control es tratado solamente con el tampón según el mismo esquema.
En el transcurso del ensayo se mide la superficie tumoral regularmente con un calibre en dos dimensiones (longitud / ancho). La superficie del tumor se calculó mediante la fórmula longitud x ancho.
Al final del ensayo se extirpan los tumores y se pesan. El cociente de los pesos medios de los tumores del grupo bajo tratamiento (T) con el grupo de control (C) se indica como T/C. Si se finalizó el ensayo de los grupos de control y de tratamiento en diferentes momentos, se calculó el valor T/C por medio de las superficies tumorales de la última medición conjunta de todos los grupos de tratamiento y de control.
C-7b. Ensayo de FGFR2-ADC en el modelo de xenoinjerto SNU-16 en el ratón Se inocularon 2 millones de células de carcinoma gástrico SNU-16 en forma subucutánea en la paleta de ratones NODscid hembras.
El tratamiento intravenoso con los conjugados comenzó con un tamaño medio de tumor de 20-30 mm2. Cuando los grupos de control habían alcanzado el tamaño máximo permitido, se finalizó el ensayo en estos grupos. Los grupos de ensayo que habían sido tratados con conjugados FGFR2, se finalizaron cuando los tumores comenzaron a crecer nuevamente. La efectividad de los conjugados se determinó el día 31 , el último día de ensayo del control vehicular. Los conjugados FGFR2 analizados inhibieron el crecimiento tumoral dependiendo de la dosis. En la dosis de 5 mg/kg el Ejemplo 1 alcanzó un T/C de 0,08, el Ejemplo 3 un T/C de 0,06 y el Ejemplo 26 un T/C de 0,10. En todos los animales tratados el tumor en ese momento fue menor que al comienzo del tratamiento (regresión parcial del tumor). Con una dosificación de 2,5 mg/kg en el Ejemplo 26 se alcanzó un T/C de 0,14. Con esta dosis en el Ejemplo 26 se produjo una regresión parcial en 40% de los animales. Con la dosificación de 1 mg/kg el Ejemplo 1 alcanzó un T/C de 0,15 y el Ejemplo 3 un valor de 0,36. En el Ejemplo 1 esta dosis también produjo una regresión parcial en todos los animales tratados, mientras que en el Ejemplo 3 no se lograron regresiones parciales. Para todos los conjugados analizados se pudo alcanzar con una dosis de hasta 1 mg/kg un efecto antitumoral significativo en comparación con el control. Los correspondientes conjugados de anticuerpos de control no evidenciaron ninguna efectividad en este modelo con las mismas dosis.
C7c. Ensayo de FGFR2-ADC en el modelo de xenoinierto MFM-223 en el ratón Se incoluraon 10 millones de células de carcinoma de mama MFM-223 en forma subucutánea en la paleta de ratones NMRI nu/nu hembras. Estos ratones previamente recibieron un suplemento de pellets de estradiol.
El tratamiento intravenoso con los conjugados se inició con un tamaño medio de tumores de 30-35 mm2. Cuando los grupos de control el día 40 habían alcanzado el tamaño máximo permitido, se finalizó el ensayo en todos los grupos y se determinó el peso de los tumores. En el Ejemplo 26 se alcanzó con una dosis de 10 mg/kg un valor T/C de 0,09, con una dosis de 5 mg/kg un valor T/C de 0,13 y con una dosis de 1 mg/kg un T/C de 0,26. Para las tres dosificaciones analizadas se pudo lograr un efecto antitumoral significativo. El correspondiente conjugado de anticuerpo de control solamente evidenció en una dosis de 10 mg/kg una efectividad no específica significativa en este modelo.
C7d. Ensayo de FGFR2-2 ADC en el modelo de xenoinierto NCI-H716 en el ratón Se inocularon 1 ,5 millones de células de carcinoma de intestino NCI-H716 en forma subucutánea en la paleta de ratones NMRI nu/nu hembras.
El tratamiento intravenoso con los conjugados se inició con un tamaño medio de tumores de 25-30 mm2. Cuando los grupos de control el día 36 habían alcanzado el tamaño máximo permitido, se finalizó el ensayo en todos los grupos y se determinó el peso de los tumores. El tratamiento en el Ejemplo 26 resultó en una reducción significativa del peso tumoral y alcanzó un valor T/C de 0,24 con 5 mg/kg. El correspondiente conjugado de anticuerpo de control con esta dosis no mostró ninguna efectividad en este modelo.
D. Ejemplos de realización para composiciones farmacéuticas Los compuestos de acuerdo con la invención pueden transformarse de la siguiente manera en preparaciones farmacéuticas: Solución i.v.: El compuesto de acuerdo con la invención se disuelve en una concentración inferior a la solubilidad de saturación en un disolvente de tolerancia fisiológica (p. ej., solución salina isotónica, D-PBS o una formulación con glicina y cloruro de sodio en tampón de citrato mediante adición de Polysorbat 80). La solución se filtra a esterilidad y se envasa en viales para inyección estériles y libres de pirógenos.
Solución i.v.: Los compuestos de acuerdo con la invención pueden transformarse en las formas farmacéuticas indicadas. Esto puede realizarse de un modo en sí conocido al "mezclar con" o bien "disolver en" adyuvantes inertes, no tóxicos, adecuados para uso farmacéutico (p. ej., sustancias tampón, estabilizadores, agentes de disolución, conservantes). Pueden estar contenidos, por ejemplo: aminoácidos (glicina, histidina, metionina, arginina, lisina, leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, fenilalanina y otros), azúcar y sustancias similares (glucosa, sacarosa, manitol, trehalosa, sucrosa, mañosa, lactosa, sorbitol), sales de glicerina, de sodio, de potasio, de amonio y de calcio (p. ej., cloruro de sodio, cloruro de potasio o triohidrofosfato disódico y muchos otros), sistemas tampón de acetato/ácido acético, sistemas tampón de fosfato, ácido cítrico o sistemas tampón de citrato, Trometamol (TRIS y sales TRIS), polisorbatos (p. ej., Polysorbat 80 y Polysorbat 20), poloxámeros (p. ej., Poloxamer 188 y Poloxamer 171), Macrogoles (derivados PEG, p. ej., 3350), tritón X-100, sales de EDTA, glutatión, albúminas (p. ej., humana), urea, alcohol bencílico, fenol, clorocresol, metacresol, cloruro de benzalconio y muchos otros más.
Liofilizado para la posterior transformación en una solución i.v., s.c. o i.m.: En forma alternativa los compuestos de acuerdo con la invención pueden ser transformados en un liofilizado estable (dado el caso con la ayuda adicional de los ayudantes antes indicados) y antes de la aplicación reconstituirse con un disolvente adecuado (p. ej., agua para inyectables, solución salina isotónica) y después aplicarse.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Conjugados principio activo-ligante de la fórmula general (la) (la), caracterizados porque n representa un número de 1 a 50, AK representa un ligante que se enlaza con el FGFR2, el grupo §-G-L1-B-§§ representa un conector, donde § marca el punto de unión con el grupo AK y §§ marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, L2 representa alcanodiilo (C2-C10) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo de metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre sí de 1 ,2, 1 ,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno o metilo, R2 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, ferc.-butilo, fenilo, bencilo, 1-hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3-aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1H-imidazol-4- ilmetilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, representa hidrógeno o metilo, R representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, ferc.-butilo, fenilo, bencilo, 1-hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3-aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1H-imidazol-4- ilmetilo o 1 - -indol-3-ilmetilo, R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2 )-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-dülo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, - C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula - S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno o hidroxi, representa fenilo, bencilo, 1H-indol-3-ilo o 1 -/-indol-3- i I metí lo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 2. Conjugados principio activo-ligante de la fórmula general (la) de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizados porque n representa un número de 1 a 50, AK representa AKi o AK2 donde AKi representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y que está unido al grupo G por medio de un átomo de azufre del ligante, AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y que está unido al grupo G por medio de un átomo de nitrógeno del ligante, G para el caso de que AK = AKi representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el átomo de azufre del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L , o para el caso de que AK = AK2 represente carbonilo, L1 representa una unión, alcanodiilo (C1-C10) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número de 2 a 6, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L1A representa alcanodiilo (C2-Ci0) lineal, B representa un grupo de la fórmula en la que ## 5 marca el punto de unión con el grupo L A, ## 6 marca el punto de unión con el grupo L1B, L5 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L6 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que ## 7 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, ## 8 marca el punto de unión con L1B, R33 representa hidrógeno, alquilcarbonilo (C1-C4), terc- butiloxicarbonilo o benciloxicarbonilo, R34 representa hidrógeno o metilo, R29 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R30 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R29 y R30 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R31 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R32 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R31 y R32 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, L1B representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, y donde el alcanodiilo (C Cio) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo de metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre sí de 1 ,2, 1 ,3 o 1,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, P representa O o NH, L3 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L4 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa hidrógeno o metilo, R28 representa hidrógeno, alquilcarbonilo (C1-C4), butiloxicarbonilo o benciloxicarbonilo, representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, Q2 representa un carbociclo de 3 a 7 miembros o un heterociclo de 4 a 7 miembros, R14 representa hidrógeno o alquilo (C C4), R15 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R14 y R 5 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R16 representa hidrógeno o alquilo (d-C4), R17 representa hidrógeno o alquilo (C-i-C4), o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R18 representa hidrógeno o alquilo (Ci-C4), R 9 representa hidrógeno o el grupo lateral de un a-aminoácido natural o sus homólogos o isómeros, R20 representa hidrógeno o alquilo (Ci-C4), o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R21 representa hidrógeno o alquilo (Ci-C4), R22 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un carbociclo de 3 a 7 miembros, R23 representa alquilo (CrC4), R24 representa hidrógeno o alquilo (CrC4), R27 representa hidrógeno o alquilo (d-C4), R36 representa hidrógeno, alquilcarbonilo (Ci-C4), terc- butiloxicarbonilo o benciloxicarbonilo, R37 representa hidrógeno o metilo, R y R forman junto con los átomos a los que están unidos, un anillo pirrolidino, representa alcanodiilo (C2-C10) lineal o un grupo de la fórmula ##4 O P donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-Ci0) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo de metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre si de 1 ,2, 1 ,3 o 1,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno o metilo, R2 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, ferc.-butilo, fenilo, bencilo, 1-hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3-aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1 /-/-imidazol-4- ilmetilo o 1/-/-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-O contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno o metilo, R4 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere. -butilo, fenilo, bencilo, 1-hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3-aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1H-imidazol-4- ilmetilo o 1/-/-indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2R)-2-fenil-c¡clopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, terc.-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula - S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno o hidroxi, T2 representa fenilo, bencilo, 1 /-/-indol-3-ilo o 1 /-/-indol-3- ilmetilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 3. Conjugados principio activo-ligante de la fórmula general (la) de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizados porque: n representa un número de 1 a 20, AK representa AKi o AK2 donde K-i representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, G para el caso de que AK = AKi represente un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L1, o para el caso de que AK = AK2 represente carbonilo, representa una unión, alcanodiilo (C2-C6) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número de 2 a 6, ## marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L 1A representa alcanodiilo (C2-C6) lineal B representa un grupo de la fórmula en la que ## 5 marca el punto de unión con el grupo L1 ## 6 marca el punto de unión con el grupo L1B, L5 representa una unión, L6 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que ## 7 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, ## 8 marca el punto de unión con L1B, R33 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc- butiloxicarbonilo, R34 representa hidrógeno o metilo, R29 representa hidrógeno, R30 representa hidrógeno, R31 representa hidrógeno o metilo, R32 representa hidrógeno o metilo, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal, donde el alcanodiilo (C2-C6) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etano-1 ,2-diilo, L4 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa hidrógeno o metilo, R28 representa hidrógeno, metilcarbonilo o butiloxicarbonilo, Q1 representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, R14 representa hidrógeno, R 5 representa hidrógeno, R 6 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R16 y R 7 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo piperazinilo, R18 representa hidrógeno, R 9 representa hidrógeno, metilo, propano-2-ilo , 2-metilpropano-1-ilo o 1-metilpropano-1-ilo, R20 representa hidrógeno o metilo, o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R21 representa hidrógeno o metilo, R22 representa hidrógeno o metilo, o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo ciclopropilo, R23 representa metilo, R24 representa hidrógeno o metilo, R27 representa hidrógeno, R36 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc- butiloxicarbonilo, R37 representa hidrógeno o metilo, o R36 y R37 forman junto con los átomos a los que están unidos, un anillo pirrolidino, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula ##¦> •##4 O P donde P representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, D representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1/-/-indol-3-ilmetilo, o R y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, epresenta hidrógeno, epresenta 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o H-indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2/?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula ca el punto de unión con el átomo de nitrógeno cente, ca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, - C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, r?-prop¡lo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R28)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula - S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno o hidroxi, representa fenilo, bencilo, 1 -/-indol-3-ilo o 1/-/-indol-3- ilmetilo, R35 representa metilo o hidroxi, asi como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 4. Conjugados principio activo-ligante de la fórmula general (la) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizados porque n representa un número de 1 a 10, AK representa AKi o AK2 donde AKi representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, G para el caso de que AK = AKi represente un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, #2 marca el punto de unión con el grupo L1, o para el caso de que AK = AK2 represente carbonilo, representa una unión, alcanodiilo (C2-C6) lineal, un grupo de la fórmula representa un número 2 o 3, marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, donde el alcanodiilo (C2-C6) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etano-1 ,2-diilo, L4 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, **** marca el punto de unión con L2, R25 representa metilo, R28 representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc- butiloxicarbonilo, Q1 representa piperidín-1 ,4-diilo, R 6 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman anillo piperazinilo, R21 representa hidrógeno o metilo, R22 representa hidrógeno o metilo, o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman anillo ciclopropilo, R23 representa metilo, R24 representa hidrógeno, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 1-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 -/-indol-3-ilmetilo, R1 y R junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, representa hidrógeno, representa bencilo, 1-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 /-/-indol-3- ilmetilo, R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, T1 representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R representa hidrógeno o metilo, R! representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, 11 R representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, R representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que # marca el punto de unión con -CHCH2fenilo, R 12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula - S(0)2OH, R 13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R 35 representa metilo o hidroxi, o sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 5. Conjugados principio activo-ligante de la fórmula general (la) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque n representa un número de 1 a 10, AK representa AK2 donde AK2 representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del grupo lateral NH de un resto lisina del ligante, G representa carbonilo, L1 representa una unión, B representa una unión, L2 representa un alcanodiilo (C3-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, representa un grupo de la fórmula donde # *3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R representa hidrógeno, R2 representa bencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-O contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R3 representa hidrógeno, R4 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1H-indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, T representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7 o -C(=0)-NR8R9, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, p-propilo, ferc.-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno, R9 representa hidrógeno o bencilo, R35 representa metilo, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 6. Conjugados principio activo-ligante de la fórmula general (la) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados porque n representa un número de 1 a 10, AK representa AKi donde AKi representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y está unido al grupo G por medio del átomo de azufre de un resto cisteína del ligante, G representa un grupo de la fórmula donde #1 marca el punto de unión con el resto cisteína del ligante, ^ marca el punto de unión con el grupo L , L1 representa una unión, alcanodiilo (C3-C5) lineal o un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, donde el alcanodiilo (C3-C5) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1 , ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etano-1 ,2-diilo, L4 representa una unión o un grupo de la fórmula en la que *** marca el punto de unión con el grupo carbonilo, marca el punto de unión con L2, R25 representa metilo, R representa hidrógeno, metilcarbonilo o terc- butiloxicarbonilo, R16 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R16 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo piperazinilo, representa alcanodiilo (C3-C5) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitróg representa un grupo de la fórmula on el átomo de nitrógeno R representa hidrógeno, representa bencilo o 1 -/-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2R)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, illo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, epresenta hidrógeno, epresenta bencilo, 4-hidroxibencilo o 1H-¡ndol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2R)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T , T1 representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7 o -C(=0)-NR8R9, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, ferc.-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno, R9 representa hidrógeno o bencilo, R35 representa metilo, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. (la), caracterizados porque n representa un número de 1 a 50, AK representa un ligante que se enlaza con el FGFR2, el grupo §-G-L1-B-§§ representa un conector, donde § marca el punto de unión con el grupo AK y §§ marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, L2 representa alcanodiilo (C2-C10) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo de metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre sí de 1 ,2, 1 ,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa un grupo de la siguiente fórmula donde punto de unión con el átomo de nitrógeno o sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 8. Compuestos de la siguiente fórmula caracterizados porque AK representa un ligante que se enlaza con el FGFR2 y n representa un número de 1 a 10, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 9. Compuestos de la siguiente fórmula caracterizados porque AK representa un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que se enlaza con el FGFR2 y n representa un número de 1 a 10, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 10. Compuesto de la siguiente fórmula caracterizados porque AK2A representa M048-D01-hlgG1 y n representa un número de 1 a 10, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 11. Compuesto de la siguiente fórmula caracterizados porque AK2B representa M048-D01-hlgG1-b y n representa un número de 1 a 10, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 12. Compuestos de la fórmula (XXXa) (XXXa), caracterizados porque Cys representa un resto cisteína que está unido por medio del átomo de azufre de la cadena lateral a un átomo de carbono de la succinimida, L representa una unión, alcanodiilo (C1-C10) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número de 2 a 6, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L A representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, B1 representa un grupo de la fórmula marca el punto de unión con el grupo L 1A ## 6 marca el punto de unión con el grupo L1B, L5 representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), L6 representa una unión, R29 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), representa hidrógeno o alquilo (Ci-C4), junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, 31 R representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), 32 R representa hidrógeno o alquilo (C^C4), o 32 RJ1 y R junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros L1 B representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, y donde el alcanodiilo (C1-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo de metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre sí de 1 ,2, 1 ,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde marca el punto de unión con L1 , ** marca el punto de unión con L2, P representa O o NH, L3 representa una unión o alcanodiiio (C2-C4), L4 representa una unión, Q representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, Q2 representa un carbociclo de 3 a 7 miembros o un heterociclo de 4 a 7 miembros, R14 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R15 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R14 y R15 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R16 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R17 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R 6 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R 8 representa hidrógeno o alquilo (Ci-C4), R19 representa hidrógeno o el grupo lateral de un a-aminoácido natural o sus homólogos o isómeros, R20 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R 9 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R21 representa hidrógeno o alquilo (d-C4), R22 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R2 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un carbociclo de 3 a 7 miembros, R23 representa alquilo (C1-C4), R24 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R27 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), representa alcanodiiio (C2-C10) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo de metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre sí de 1 ,2, 1,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R representa hidrógeno o metilo, R2 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere. -butilo, fenilo, bencilo, 1-hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3-aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1 - -imidazol-4- ¡Imetilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, A con el grupo N-O contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno o metilo, R4 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere-butilo, fenilo, bencilo, 1-hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3-aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1H-imidazol-4- ilmetilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, o junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2R)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, -C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, ferc.-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula - S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno o hidroxi, T2 representa fenilo, bencilo, 1H-indol-3-ilo o 1/- -indol-3-ilmetilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 13. Compuestos de la fórmula (XXXa) de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizados porque Cys representa un resto cisteína que está unido por medio del átomo de azufre de la cadena lateral a un átomo de carbono de la succínimida L representa una unión, alcanodiilo (C2-C6) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, L1A representa alcanodiilo (C2-C6) lineal, representa un grupo de la fórmula en la que ## 5 marca el punto de unión con el grupo L A, ## 6 marca el punto de unión con el grupo L B, L5 representa una unión, L6 representa una unión, R29 representa hidrógeno, R30 representa hidrógeno, R31 representa hidrógeno o metilo, R32 representa hidrógeno o metilo, L B representa alcanodiilo (C2-C6) lineal, y donde el alcanodiilo (C2-C6) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión o etano-1 ,2-diilo, L4 representa una unión, R 4 representa hidrógeno, R15 representa hidrógeno, R16 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, o R 6 y R17 junto con los átomos a los que están unidos, forman anillo piperazinilo, R representa metilo, R24 representa hidrógeno o metilo, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R representa hidrógeno, R2 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo 1H-indol-3-ilmetilo, R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-dülo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-O contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno, R4 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 -/-indol-3-ilmetilo, R y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, - C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, rj-propilo, tere-butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R1 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula - S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 14. Compuestos de la fórmula (XXXa) de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizados porque Cys representa un resto cisteína que está unido por medio del átomo de azufre de la cadena lateral a un átomo de carbono de la succinimida L1 representa una unión o alcanodiilo (C2-C6) lineal, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, L3 representa una unión, L4 representa una unión, R16 representa hidrógeno o metilo, R17 representa hidrógeno o metilo, L2 representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa bencilo o 1H-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-O contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R3 representa hidrógeno, R4 representa bencilo, 4-hidroxibencilo o 1A7-indol-3-ilmetilo, o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2R)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T , T1 representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7 o -C(=0)-NR8R9, en la que R7 representa hidrógeno, R8 representa hidrógeno, R9 representa hidrógeno, R35 representa metilo, asi como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. Compuestos de la fórmula (XXXI) (XXXI), caracterizados porque L representa una unión, alcanodiilo (C1-C10) lineal, un grupo de la fórmula donde m representa un número de 2 a 6, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, marca el punto de unión con el grupo B, 1A representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, B representa un grupo de la fórmula en la que ## marca el punto de unión con el grupo L ## marca el punto de unión con el grupo L1 B, representa una unión o alcanodiilo (C2-C4), representa una unión, .29 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R 30 representa hidrógeno o alquilo (Ci-C^), R29 y R30 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, R31 representa hidrógeno o alquilo (Ci-C4), R32 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R3 y R32 junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclo de 5 o 6 miembros, L B representa alcanodiilo (C2-C10) lineal, y donde el alcanodiilo (C1-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo de metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre sí de 1 ,2, 1,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa una unión o un grupo de la fórmula donde marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, P representa O o NH, Q1 representa un heterociclo de 4 a 7 miembros, Q2 representa un carbociclo de 3 a 7 miembros o un heterociclo de 4 a 7 miembros, R18 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), R19 representa hidrógeno o el grupo lateral de un a-aminoácido natural o sus homólogos o isómeros, R20 representa hidrógeno o alquilo (C C4), o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo pirrolidinilo, R21 representa hidrógeno o alquilo (CrC4), R22 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un carbociclo de 3 a 7 miembros, R27 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), representa alcanodiilo (C2-C10) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número de 2 a 6, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre sí del grupo de metilo, hidroxi y bencilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre sí de 1 ,2, 1,3 o 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo cicloalquilo (C3-C6) o un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno o metilo, R2 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere. -butilo, fenilo, bencilo, 1-hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3-aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1A7-imidazol-4- ilmetilo o 1/-/-indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2R)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno o metilo, R4 representa isopropilo, isobutilo, sec.-butilo, tere-butilo, fenilo, bencilo, 1-hidroxietilo, 4-hidroxibencilo, 4-hidroxi-3-nitrobencilo, 4-hidroxi-3-aminobencilo, 1-feniletilo, difenilmetilo, 1 /-/-imidazol-4- ilmetilo o 1/-/-indol-3-ilmetilo, o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (I S.Z/^-Z-fenil-ciclopropano-l .l-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, T representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, - C(=O)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11, en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R 0 representa benzoílo, R11 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHC(R26)-T2, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula - S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R26 representa hidrógeno o hidroxi, T2 representa fenilo, bencilo, 1 -/-indol-3-ilo o 1H-indol-3- ¡Imetilo, R35 representa metilo o hidroxi, o sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 16. Compuestos de la fórmula (XXXI) de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizados porque L1 representa una unión, alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde m representa un número 2 o 3, ## 1 marca el punto de unión con el grupo G, ##2 marca el punto de unión con el grupo B, donde el alcanodiilo (C2-C6) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, B representa una unión o un grupo de la fórmula donde * marca el punto de unión con L1, ** marca el punto de unión con L2, R18 representa hidrógeno, R19 representa metilo, propano-2-ilo, 2-metilpropano-1-ilo o metilpropano-1-ilo, R20 representa hidrógeno o alquilo (C1-C4), o R19 y R20 junto con los átomos a los que están unidos, forman anillo pirrolidinilo, R2 representa hidrógeno o metilo, R22 representa hidrógeno o metilo, o R21 y R22 junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo ciclopropilo, R27 representa hidrógeno o metilo, representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula ti donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, ##4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, donde el alcanodiilo (C2-C10) puede estar sustituido con 1 o 2 sustituyentes metilo, y donde dos átomos de carbono de la cadena alcanodiilo pueden formar un puente en una relación entre sí de 1 ,4 incluyendo los átomos de carbono que dado el caso se encuentren entre ellos, conformando un anillo fenilo, representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1 - -indol-3-ilmetilo, o R1 y R2 junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula en la que #6 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, R6 representa hidrógeno, hidroxi o benciloxi, R3 representa hidrógeno, R4 representa 1-hidroxietilo, bencilo, 4-hidroxibencilo, 1-feniletilo o 1H-indol-3-ilmetilo, O junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en ia que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1, representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7, -C(=0)-NR8R9, - C(=0)-NH-NH-R10 o -CH2-O-R11 , en la que R7 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, tere. -butilo, bencilo o adamantilmetilo, R8 representa hidrógeno o metilo, R9 representa hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo o bencilo, o R8 y R9 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, un heterociclo de 4 a 7 miembros, R10 representa benzoílo, R1 representa bencilo que puede estar sustituido en el grupo fenilo con metoxicarbonilo o carboxilo, representa hidrógeno, metilo o un grupo de la fórmula en la que #9 marca el punto de unión con -CHChfefenilo, R12 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo, carboxilo o un grupo de la fórmula - S(0)2OH, R13 representa fenilo que puede estar sustituido con metoxicarbonilo o carboxilo, R35 representa metilo o hidroxi, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 17. Compuestos de la fórmula (XXXI) de acuerdo con una reivindicaciones 15 o 16 caracterizados porque L1 representa una unión, B representa una unión, L2 representa alcanodiilo (C2-C6) lineal o un grupo de la fórmula donde p representa un número 2 o 3, ## 3 marca el punto de unión con el grupo B, marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, D representa un grupo de la fórmula donde #3 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno, R1 representa hidrógeno, R2 representa bencilo o 1 H-indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2f?)-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #4 marca el punto de unión con el átomo de nitrógeno adyacente, #5 marca el punto de unión con el grupo carbonilo, el anillo A con el grupo N-0 contenido en el mismo representa un heterociclo mono o bicíclico, dado el caso sustituido, de la fórmula e arca el punto de unión con el grupo carbonilo, presenta hidrógeno, hidroxi o benciloxi, ógeno, epresenta bencilo, 4-hidroxibencilo o 1H-indol-3-ilmetilo, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un grupo (1 S,2 )-2-fenil-ciclopropano-1 ,1-diilo de la fórmula en la que #7 marca el punto de unión con el átomo de nitrógen adyacente, #8 marca el punto de unión con el grupo T1 , T1 representa un grupo de la fórmula -C(=0)-OR7 o -C(=0)-NR8R9, en la que R7 representa hidrógeno, R8 representa hidrógeno, R9 representa hidrógeno, R35 representa metilo, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 18. Procedimiento para la preparación de los compuestos, tal como se reclaman en una de las reivindicaciones 1 a 11 , de la fórmula general (la), caracterizado porque se mezcla una solución del ligante en un tampón [A] con un agente de reducción adecuado, como por ejemplo seleccionado del grupo que consiste en ditiotreitol o clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, y a continuación se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula (II) (II) en la que D, L1, L2 y R35 presentan respectivamente los significados indicados en las reivindicaciones 1 a 11 dando un compuesto de la fórmula (l-A) (l-A) en la que n, AK^ D, L1, B, L2 y R35 presentan respectivamente los significados indicados en las reivindicaciones 1 a 1 1 [B] se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula (III) (III) en la que D, L1 , B, L2 y R35 presentan respectivamente los significados indicados en las reivindicaciones 1 a 11 dando un compuesto de la fórmula (l-B) (l-B) en la que n, AK2, D, L1, B, L2 y R35 presentan respectivamente los significados indicados en las reivindicaciones 1 a 1 1. 19. Compuestos preparados según el procedimiento en la reivindicación 18, caracterizados porque AKi y AK2 representan un anticuerpo que comprende las seis secuencias CDR del anticuerpo M048-D01-hlgG1 o M048-D01-hlgG1-b, la cadena variable ligera y la cadena variable pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1 o M048-D01-hlgG1-b, o la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1 o M048-D01-hlgG1-b, así como sus sales, solvatos y solvatos de las sales. 20. Un conjugado principio activo-ligante de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque el ligante se enlaza específicamente con el FGFR2. 21. Un conjugado principio activo-ligante de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque el ligante se enlaza con el epitopo N-terminal extracelular (1 RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2. 22. Un conjugado principio activo-ligante de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque el ligante después del enlace con el FGFR2 en la célula diana es internalizado mediante el enlace de la célula diana. 23. Un conjugado principio activo-ligante de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque el ligante es una proteína de enlace, un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. 24. Un conjugado principio activo-ligante de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque el ligante en el enlace con la molécula diana cancerosa FGFR2 compite con el anticuerpo GAL-FR21 , GAL-FR22 o M048-D01-hlgG1. 25. Un conjugado principio activo-ligante de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque el ligante comprende la secuencia de aminoácidos de las secuencias CDR de las cadenas variable ligera y variable pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1 reproducido en la SEC ID N° 15 (H-CDR1), SEC ID N° 16 (H-CDR2), SEC ID N° 17 (H-CDR3), SEC ID N° 18 (L-CDR1), SEC ID N° 19 (L-CDR2) y SEC ID N° 20 (L-CDR3), la secuencia de aminoácidos de las cadenas variable pesada y variable ligera del anticuerpo M048-D01-hlgG1 , reproducido en la SEC ID N° 12 (VI) y SEC ID N° 11 (Vh), la secuencia de aminoácidos de las cadenas variable pesada y variable ligera del anticuerpo M048-D01-hlgG1-b, reproducido en la SEC ID N° 14 (VI) y SEC ID N° 13 (Vh), la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1-b reproducido en la SEC ID N° 9 (cadena ligera) y SEC ID N° 10 (cadena pesada), la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo M048-D01-hlgG1 reproducido en la SEC ID N° 7 (cadena ligera) y SEC ID N° 8 (cadena pesada), o la secuencia de aminoácidos de las cadenas variables pesada y ligera del anticuerpo GAL-FR21 o GAL-FR22. 26 Un conjugado principio activo-ligante o compuestos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 25 para uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades. 27. Un conjugado principio activo-ligante o un compuesto de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 25, para uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades hiperproliferativas y/o angiogénicas. 28. Un conjugado principio activo-ligante tal como se define en una de las reivindicaciones 1 a 25 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades hiperproliferativas y/o angiogénicas. 29. Medicamento caracterizado porque contiene un conjugado principio activo-ligante o un compuesto tal como se define en una de las reivindicaciones 1 a 25, en combinación con un adyuvante inerte, no tóxico, adecuado farmacéuticamente. 30. Medicamento caracterizado porque contiene un conjugado principio activo-ligante o un compuesto tal como se define en una de las reivindicaciones 1 a 25 en combinación con una o varias sustancias anti-hiperproliferativas, citostáticas o citotóxicas. 31. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 29 o 30 para uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades hiperproliferativas y/o angiogénicas. 32. Procedimiento para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades hiperproliferativas y/o angiogénicas en seres humanos y animales usando una cantidad efectiva de al menos un conjugado de principio activo-ligante o un compuesto tal como se define en una de las reivindicaciones 1 a 25, o un medicamento tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 30 y 31.
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