KR101699432B1 - 섬유아세포성장인자수용체 ２에 대한 모노클로날 항체 - Google Patents

섬유아세포성장인자수용체 ２에 대한 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 섬유아세포성장인자수용체 2에 대한 모노클로날 항체, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 그러한 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법과 관련이 있다.

Description

섬유아세포성장인자수용체 ２에 대한 모노클로날 항체{MONOCLONAL ANTIBODIES TO FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR 2}
관련 출원들에 대한 상호-참조
본원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라, 2008년 11월 7일에 출원된 US 특허 출원 제 61/112,686호 및 2009년 3월 30일에 출원된 US 특허 출원 제 61/164,870호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허 출원의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본원에 통합된다.
정부 이익에 관한 진술
본원에 기재된 발명은 일부분 미국국립보건원이 제공한 Grant 5R44 CA101283-03 기금으로 개발되었다. 미국 정부는 본원 발명에 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본원 발명은 일반적으로 신규한 생물학제제(biologics)를 개발하기 위한 모노클로날 항체(mAb) 및 재조합 DNA 기술의 조합, 더 특별하게는, 예를 들어, 섬유아세포성장인자수용체 2에 결합하고 이를 중화하는 모노클로날 항체의 생산과 관련이 있다.
발명의 배경
크기 범위가 17 내지 34 kDa이고, 유사한 내부 코어 영역을 공유하는, 섬유아세포 성장인자(FGF) 패밀리의 22개의 공지된 일원이 존재하는데, 활성 및 서열에서의 이들의 유사성에 기초하여 7개의 서브패밀리로 그룹화될 수 있다(Ornitz et al., Genome Biol. 2:3005.1, 2001). 예를 들어, FGF1 서브그룹은 원형(prototypical) FGFs, FGF1(산성 FGF) 및 FGF2(염기성 FGF)으로 구성되고; FGF4 서브그룹은 FGF4, FGF5 및 FGF6로 구성되며; FGF7 서브패밀리는 FGF3, FGF7, FGF10 및 FGF22로 구성된다(Zhang et al., J. Biol. Chem. 281:15694, 2006).
FGF2의 한 형태는 155개 아미노산(aa)으로 구성된 전구체에서 유래된 146개의 아미노산으로 구성된 18 kDa의 비-당화된 폴리펩티드이다(Ornitz et al., Genome Biol. 2:3005.1, 2001; Okada-Ban et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32:263, 2000). 146개 아미노산의 인간 FGF2에 관한 대표적인 서열은 US20020115603호에 SEQ ID NO:4로 제공되어 있다. 대부분의 다른 FGFs와는 달리, FGF2는 분비에 관한 신호 서열을 엔코딩하지 아니하나, 18 kDa 형태는 ER-Golgi 복합체와는 관계없이 비통상적 에너지-의존성 경로에 의해 분비될 수 있다. 다른 FGF1 서브패밀리 일원인, FGF1은 그 자체로는, FGF2와 유사한 크기 및 구조를 지니고, 또한 신호 서열이 결여되어 있으나, 분비될 수 있다. 본원에서 관심있는 또 다른 FGF는 FGF7인데, 이것은 각질세포성장인자(KGF)로도 불리우며, 중간엽(mesenchymal) 기원의 세포에 의해 생산되며 내피 세포 증식을 자극한다(Finch et al., Adv. Cancer Res. 91 :69, 2004; Finch et al., J. Natl. Cancer Inst. 98:812, 2006). KGF는 폐, 전립선, 유방, 소화관 및 피부를 포함하는 다수의 기관에서 발현되며 기관 발달과 피부 상처의 복구와 연루되어 있다(Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964, 2007).
FGF 패밀리 일원은 4개의 공지된 티로신 키나아제 수용체, 섬유아세포성장인자수용체 1-4(FGFR1-4)와 이들의 이소형에만 결합하는데, 다양한 FGFs는 상이한 규모로 상이한 FGFRs에 결합한다(Zhang et al., J. Biol. Chem. 281 :15694, 2006). 인간 FGFR2의 단백질 서열은, 예를 들어, GenBank Locus AF487553에 제공되어 있다. 각각의 FGFR은 도 1에 도시된 것과 같이 3개의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인(D1, D2 및 D3)을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain, ECD), 1개의 막관통 헬릭스(transmembrane helix), 및 세포내 촉매 키나아제 도메인으로 구성되어 있다(Mohammadi et al., Cytokine Growth Factor Revs, 16:107, 2005). D1과 "산성 박스(acid box, AB)"로 지칭되는 D2 사이에 링커내의 산성 아미노산의 연속된 스트레치가 존재한다. D1과 AB를 포함하는 영역은, 리간드에 대한 결합에 의해 완화되는, 수용체의 자가억제(autoinhibition)에 관여하는 것으로 여겨진다. FGFRs는 이들의 mRNAs의 다수의 다른 스플라이싱에 의해 특징지워지는데, 이러한 스플라이싱은 다양한 이소형을 야기시킨다(Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271 :15292, 1996; 또한 FGFR2 및 이의 이소형의 서열에 관하여 Swiss-Prot P21802 및 이송형 P21802-1 내지 -20 참조바람). 특히, 모두 3개의 Ig 도메인을 포함하는 형태(α 이소형) 또는 D1 없이 단지 2개의 Ig 도메인(D2 및 D3 도메인)을 포함하는 형태(β 이소형)가 존재한다. 모든 형태가 IIIa로 명명된 D3의 첫 번째 절반을 함유하지만, FGFR1-FGFR3에서 특히 중요한 것은, 2개의 다른 엑손이 D3의 두번째 절반에 관하여 이용될 수 있고, 이는 IIIb 및 IIIc 형태를 야기시킨다는 것이다. FGFR2의 경우, 이들은 각각 FGFR2IIIb와 FGFR2IIIc(또는 단지 FGFR2b와 FGFR2c)로 명명되고; 상응하는 베타 형태는 FGFR2(beta)IIIb와 FGFR2(beta)IIIc로 명명된다. FGFR2의 FGFR2IIIb 형태(K-sam-II{Swiss-Prot는 이것을 K-sam-IIC1?으로 지칭하고 있음}로도 명명되어 있음)(Swiss-Prot P21802-18 참조)는 FGF1과 KGF 둘 모두에 대한 고 친화력 수용체이고, 한편 FGFR2IIIc(K-sam-1으로도 명명됨)(Swiss-Prot P21820-5 참조)는 FGF1 및 FGF2 둘 모두에 결합하나 KGF에 결합하지 않는다(Miki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246, 1992). 실제로, FGFR2IIIb는 KGF에 대한 유일한 수용체(Ornitz et al., 1996, op. cit.)이고 그에 따라 KGFR로도 지칭된다.
FGFRs 및 이들의 이소형은 다양한 조직내에서 차별되게 발현된다. 특히, FGFR2IIIb(및 FGFR1과 FGFR3의 IIIb 형태)는 내피 조직에서 발현되고, 한편 FGFRIIIc는 중간엽 조직에서 발현된다(Duan et al., J. Biol. Chem. 267:16076, 1992; Ornitz et al., 1996, 전게서). 이러한 수용체의 특정 FGF 리간드는 상반되는 발현 패턴을 나타낸다. 따라서, FGF7(KGF)을 포함하는 FGF3 서브패밀리 일원은 FGFRIIIb에만 결합하고(Zhang et al., 전게서), 중간엽 조직에서 발현되며, 그에 따라 내피 세포의 파라크린(paracrine) 이펙터일 수 있다(Ornitz et al., 1996, 전게서). 반대로, FGF4 서브패밀리 일원인, FGF4-6는 FGFR2IIIc에 결합하고, 내피 계통 및 중간엽 계통 둘 모두에서 발현되고, 그에 따라 오토크린(autocrine) 또는 파라크린 기능을 지닐 수 있다. FGFR2의 이소형 및 이들의 리간드의 발현 패턴 때문에, FGFR2는 내피-중간엽 상호작용에 있어 소정 역할을 하며(Finch et al., Dev. Dyn. 203:223, 1995), 그리하여 마우스에서 FGFR2IIIb의 녹-아웃이 심각한 배아(embryonic) 결함 및 치사율을 야기시킨다는 것은 놀랍지 않다(De Moerlooze et al., Development 127:483, 2000).
고 친화력으로 FGFR1-4에 결합하는 것 이외에, FGFs는 더 낮은 친화력으로 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(heparin sulfate proteoglycans, HSPG)에 결합한다. 사실상, 세포 표면 상에서 헤파린/헤파린 설페이트(HS)에 대한 FGF의 결합은 FGFRs를 통한 신호전달을 필요로 한다. FGF, 특히 FGF2와 FGFR 및 헤파린의 상호작용은 X-선 결정학 및 돌연변이 분석으로 심도깊게 연구되었고, 이제 헤파린/HS는 수용체 활성화, 자가인산화 및 신호전달(signal transduction)을 야기시키는, 대칭되는(symmetric) 2:2 FGF-FGFR 이합체의 형성에 참여하는 것으로 여겨지고 있다(Mohammadi et al., 2005). FGFs는 증식, 이동 및 분화, 특히, 배아 발달 동안의 증식, 이동 및 분화를 포함하는 다양한 세포 유형에서의 다양한 반응을 매개하고(Ornitz et al., op. cit.), 성인에서 조직 항상성유지 및 복구에 관여한다. 예를 들어, FGF2는 섬유아세포와 내피 세포를 포함하는 특정 세포의 증식을 자극(즉, 유사분열성임)하며 특정 세포, 예컨대, 뇌세포에 대한 항-아폽토시스 생존 인자이다(Okada-Ban, 전게서). 또한 FGF2는 내피 세포의 분화(형태형성) 및 이동(운동성)을 자극한다(Dow et al., Urology 55:800, 2000). 몇몇 FGFs, 특히 FGF1 및 FGF2는 강력한 혈관신생 인자이다(Presta et al., Cytokine and Growth Factor Rev. 16:159, 2005).
개발에 있어서 FGF 시스템의 중요성은 두개융합증 증후군(craniosynostosis syndromes)(두개 봉합의 조기 융합)을 포함하는 인간 인지 골격 장애(congenital skeletal disorders)와 연관된 FGFR1-3에서의 다수의 돌연변이의 발견에 의해 주목받아왔다(Wilkie et al., Cytokine Growth Factor Revs 16:187, 2005). 이러한 유전 질환은 일반적으로 우성인데, 그 이유는 연관된 돌연변이들이, 종종 수용체 이합체화를 촉진함으로써, 기능획득(gain-of-function)을 야기시키기 때문이다. 특히, 극심한 두개융합증 장애인, 에이퍼트 증후군(Apert syndrome, AS)은 리간드 결합 친화력을 증가시키는 FGFR2의 보존된 D2-D3 링커 영역 내의 2개의 돌연변이들 주 어느 하나(Ser-252 -> Trp 또는 Pro-253 -> Arg)와 연관되어 있다(Ibrahimi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:7182, 2001).
FGF2와 다른 FGFs는 직접적으로 혈관신생 및 종양 세포를 자극시킴으로써 암에서 소정 역할을 하는 것으로 보고되었다(Grose et al., Cytokine Growth Factor Revs. 16:179, 2005; Presta et al., 전게서). FGFR2IIIb RNA는 많은 유형의 종양에서 발현되는데(Finch et al., J. Natl, Cancer Inst. 98:812, 2006), 이는 종종 상응하는 정상 조직내에서의 이의 발현의 결과이다(Orr-Urtreger et al., Dev. Biol. 158:475, 1993). KGF(FGF7)와 KGFR(FGFR2IIIb)은 많은 췌장암에서 과발현되어 있으며(Ishiwata et al., Am. J. Pathol. 153: 213, 1998), 이들의 동시발현은 나쁜 예후와 상관관계가 있다(Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964, 2007). FGFR2 유전자의 체세포 돌연변이가 자궁 내막(uterine) 암종의 거대 조사군(panel)의 12%에서 발견되었으며, 몇몇 시험된 케이스에서 종양 세포 생존을 위해 필요하였다(Dutt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:8713, 2008). 2가지 종양에서, FGFR2 돌연변이가 에이퍼트 증후군과 연관된 동일한 S252W 치환인 것으로 확인되었다. FGFR2의 증폭 및 과발현은 미분화되고, 확산된 유형의 위암과 강하게 연관되어 있는데, 상기 위암은 특히 나쁜 예후를 나타내고, 작은 분자 화합물에 의한 FGFR2 활성의 억제는 그러한 암 세포의 증식을 강하게 억제시킨다(Kunii et al., Cancer Res. 68:2340, 2008; Nakamura et al., Gastroenterol. 131 :1530, 2006). FGFR2IIIb RNA는 16/20 상피 난소 암(epithelial ovarian cancers, EOCs)에서 발현되나 정상 난소 표면 상피에서는 발현되지 않고(Steele et al., Oncogene 20:5878, 2001); FGFR2IIIb 리간드 FGF1, FGF7 및 FGF10는 EOC 세포주에서 증식, 이동 및 세포 사멸로부터의 보호를 유도하는데(Steele et al., Growth Factors 24:45, 2006), 이는 FGFR2IIIb가 난소암에서 악성 표현형에 기여할 수 있음을 시사한다.
FGFR2에 대한 제한된 수의 모노클로날 항체만이 보고되었다. 포틴 등(Fortin et al., J. Neurosci. 25:7470, 2005)은 FGFR2에 대한 블록킹 항체를 보고하였고, 웨이 등(Wei et al., Hybhdoma 25: 115, 2006)은 KGF-유도 세포 증식을 억제시키는 FGFR2의 IIIb 형(즉, KGFR)에 특이적인 2개의 mAbs를 개발하였다. 야욘 등(Yayon et al., WO2007/144893, 2006)은 FGFR2와 FGFR3 둘 모두에 결합하는 억제성(inhibitory) mAb를 개시하였다. R&D Systems은 2005년 이후로 IIIb 형태에 관한 선호도를 가지며, 이들의 검정에서 활성을 중화시키는 항-FGFR2 mAb를 판매하여 왔다. 그러나, 생체내에서(in vivo) FGFR2에 대한 항체의 항-종양 활성에 대한 보고는 없었다.
발명의 요약
한 구체예에서, 본원 발명은 마우스에서 인간 종양 이종이식체(xenograft)의 성장을 억제하는 인간 섬유아세포성장인자수용체 2(FGFR2)에 대한 모노클로날 항체(mAb)를 제공한다. mAb는 FGF2에 의한 수용체에 대한 결합을 포함하는, 수용체의 생물학적 활성의 적어도 하나, 바람직하게는 몇 가지 또는 전부를 억제할 수 있다. mAb는 수용체의 FGFR2IIIb 및 FGFRIIIc 형태 중 어느 하나 또는 둘 모두에 결합할 수 있는데, 예를 들어, FGFR2IIIb에는 결합하지만 FGFR2IIIc에는 결합하지 않는다. 바람직하게는, 본원 발명의 mAb는 유전공학적으로 조작된, 예를 들어, 키메라(chimeric), 인간화된 또는 인간 mAb이다. 예시적인 항체는 GAL-FR21, GAL-FR22, 및 GAL-FR23 및 이들의 키메라 및 인간화된 형태이며, 이러한 mAbs 중 어느 하나와 동일한 에피토프를 가지거나 결합에 관하여 이러한 mAbs 중 어느 하나와 경쟁하는 mAbs이다. 또 다른 구체예에서, 유전공학적으로 조작된 항-FGFR2 항체, 예를 들어, 키메라 또는 인간화된 GAL-FR21, GAL-FR22, 및 GAL-FR23를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 제 3의 구체예에서, 약학 조성물은 암 또는 기타 질환, 예를 들어, 위암을 치료하기 위해 환자에게 투여된다.
예시된 인간화된 항체는 도 13A(GAL-FR21)의 서열로부터의 CDRs을 포함하는 인간화된 경쇄 및 도 13B(GAL-FR21)의 서열로부터의 CDRs을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함하거나, 도 16A(GAL-FR22)의 서열로부터의 CDRs을 포함하는 인간화된 경쇄 및 도 16B(GAL-FR22)의 서열로부터의 CDRs을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함한다. 몇몇 인간화된 항체는 도 13A(GAL-FR21)에 제시된 3개의 경쇄 CDRs 및 도 13B(GAL-FR21)에 제시된 3개의 중쇄 CDRs을 포함하거나, 도 16A(GAL-FR22)에 제시된 3개의 경쇄 CDRs 및 도 16B(GAL-FR22)에 제시된 3개의 중쇄 CDRs을 포함한다. 임의로, 경쇄 가변 영역은 도 13A(HuGAL-FR21)에 제시된 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 가지고 중쇄 가변 영역은 도 13B(HuGAL-FR21)에 제시된 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 가진다. 그러한 몇몇 항체에서, 케이벳 번호매김에 의한 잔기 H27, H28, H30, H48, 및 H67은 도 13B(GAL-FR21)에 제시된 중쇄의 상응하는 위치를 점유하는 잔기에 의해 점유된다. 바람직한 인간화된 항체는 도 13A(HuGAL-FR21)에 제시된 서열을 지니는 경쇄 가변 영역 및 도 13B(HuGAL-FR21)에 제시된 서열을 지니는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 3개의 Ig-유사 도메인(D1, D2 및 D3), 막관통(transmembrane) 도메인(검은색 박스), 및 세포내 키나아제 도메인을 제시하는, FGFR2의 구조에 대한 개략도. 헤파린 결합 부위(HBS), 산성 박스(AB) 및 다른 IIIb/IIIc 부분 도메인이 제시되어 있다. N = 아미노 말단, C = 카르복시 말단.
도 2. 아래 실시예들에 기재된 항-FGFR2 mAbs GAL-FR21, GAL-FG22, GAL-FR23의 특징들의 요약.
도 3. FGFR2IIIb에 대한 mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23 및 음성 대조군 mIgG의 ELISA 결합.
도 4. 4가지 형태의 FGFR2-FGFR2IIIb, FGFR2(beta)IIIb, FGFR2(IIIc) 및 FGFR2(beta)IIIc 각각 - Fc와의 융합 단백질로서 - 에 대한 mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23 및 음성 대조군 마우스 mAb 5G8의 결합 ELISA. 고정된 농도의 각각의 mAb를 본 검정에 사용하였다.
도 5. 각각의 mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23 및 비오티닐화된 형태의 상기 mAbs에 대한 음성 대조군 마우스 mAb 5G8의 FGFR2IIIb에 대한 경쟁적 결합 ELISA. 100:1 비율의 비표지된 mAb 대 비오티닐화된 mAb를 사용하였다.
도 6. SNU-16 및 KATO III 세포 상의 FGFR2IIIb에 대한 mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23 및 음성 대조군 mAb의 결합에 대한 유세포분석.
도 7. FGFR2IIIC 또는 FGFR2IIIb(S252W)로 트랜스펙션된 293F 세포에 결합하는 mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23 및 음성 대조군 mAb에 대한 유세포분석.
도 8. (a) mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23에 의한 FGFR2IIIb에 대한 FGF1(상단 패널) 및 FGF2(하단 패널)의 결합의 억제를 측정하는 ELISA 검정. (b) mAbs GAL-FR21 및 GAL-FR22에 의한 FGFR2IIIb에 대한 FGF7(상단 패널) 및 FGF10(하단 패널)의 결합의 억제를 측정하는 ELISA 검정.
도 9. PBS 단독, GAL-FR21, GAL-FR23 또는 FR2bC 54.8.11(상단 패널)로 처리하거나 PBS, GAL-FR22 또는 FR2bC 54.8.11(하단 패널)로 처리한 마우스에서 SNU-16 인간 위 종양 이종이식체의 성장. mAbs를 그룹 당 약 5마리의 마우스에, 주(week) 당 2회 20 μg씩 투여하였다.
도 10. PBS 단독, GAL-FR21 또는 GAL-FR22로 처리한 마우스에서 SNU-16 (A, 상단 패널) 또는 OCUM-2M(B, 하단 패널) 인간 위 종양 이종이식체의 성장.
도 11. 인간과 마우스 FGFR2IIIb에 대한 GAL-FR21(상단 패널) 또는 GAL-FR22(하단 패널)의 결합 ELISA.
도 12. 인간 및 치노몰구스 원숭이 FGFR2IIIb에 대한 GAL-FR21(상단 패널) 또는 GAL-FR22(하단 패널)의 결합 ELISA.
도 13. HuGAL-FR21 경쇄(A) 및 중쇄(B) 성숙 가변 영역의 아미노산 서열이 마우스 GAL-FR21과 인간 억셉터 V 영역과 정렬되어 제시되어 있다. CDRs은 GAL-FR21 서열에서 밑줄 그어져 있고, 마우스 아미노산으로 치환된 아미노산은 HuGAL-FR21 서열에서 이중으로 밑줄 그어져 있다. 1-문자 아미노산 코드 및 케이벳 번호매김 체계는 경쇄 및 중쇄 둘 모두에 사용된다.
도 14. 성숙 HuGAL-FR21 항체 경쇄(A) 및 중쇄(B) 전체의 아미노산 서열. 각 라인의 첫 번째 아미노산은 번호매겨져 있다; 번호매김은 순차적이다. 경쇄에서, CK 영역의 첫 번째 아미노산은 밑줄 그어져 있고, 중쇄에서, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 첫 번째 아미노산은 밑줄 그어져 있다.
도 15. 본 명세서에 기재된 대로 실행된, 인간화된 HuGAL-FR21 및 마우스 GAL-FR21 mAbs 및 대조 인간 항체 hIgG의 경쟁적 결합.
도 16. 밑줄 그어져 있는 CDRs을 지니는, HuGAL-FR22 경쇄(A) 및 중쇄(B) 성숙 가변 영역의 아미노산 서열. 1-문자 아미노산 코드 및 케이벳 번호매김 시스템은 경쇄 및 중쇄 둘 모두에 사용된다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본원 발명은 FGFR2의 생물학적 활성을 억제하고/하거나 마우스에서 FGFR2-발현 종양 이종이식체의 성장을 억제하는 항-FGFR2 모노클로날 항체(mAbs), 상기 mAbs를 포함하는 약학 조성물, 및 질환의 치료를 위하여 상기 항체 및 약학 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
1. 항체
항체는 복잡한 내부 구조를 지니는 매우 크고, 복잡한 분자이다(~150,000의 분자량 또는 약 1320개 아미노산). 천연 항체 분자는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄를 함유하며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 지닌다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 차례로 2개의 영역으로 구성되어 있다: 표적 항원 결합에 관여하는 가변 ("V") 영역 및 면역계의 다른 구성요소들과 상호작용하는 불변("C") 영역. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3-차원 공간에서 함께 항원(예를 들어, 세포의 표면 상의 수용체)에 결합하는 가변 영역을 형성한다. 각각의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내부에, 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, "CDRs")으로 불리는, 3개의 짧은 세그먼트(평균 10개의 아미노산 길이)가 존재한다. 항체 가변 도메인내의 6개의 CDRs(경쇄로부터 3개 및 중쇄로부터 3개)은 3-D 공간에서 함께 폴딩되어 표적 항원 상에 로킹(locking)되는 실제 항체 결합 부위를 형성한다. CDRs의 위치 및 길이는 케이벳 등의 문헌[Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987]에 정확하게 정의되어 있다. CDRs에 포함되지 않은 가변 영역의 일부분은 프레임워크(framework)로 지칭되는데, 이것은 CDRs을 위한 환경을 형성한다.
인간화된 항체는 마우스 항체("도너(donor) 항체", 이 항체는 또한 래트, 햄스터 또는 기타 비-인간 종일 수 있음)로부터의 CDRs이 인간 항체("억셉터 항체") 상에 이식된 유전공학적으로 조작된 항체이다. 억셉터 항체의 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 인간 항체 서열의 공통(consensus) 서열, 또는 생식선(germline) 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화된 항체는 도너 항체로부터의 CDRs 및 가변 영역 프레임워크 및 인간 항체로부터의 불변 영역을 지니는 항체이다. 또한, 높은 결합 친화력을 보유하도록 하기 위해, 2개의 추가 구조 엘리먼트들 중 적어도 하나를 사용할 수 있다. 참고문헌으로서 본원에 통합되는, 하기 문헌을 참조바람: US 특허 제5,530,101호 및 5,585,089호, 상기 특허문헌은 인간화된 항체의 작제에 관한 상세한 설명을 제공한다. 인간화된 항체가 종종 마우스 항체로부터의 CDRs 6개 모두(바람직하게는, 케이벳에 의해 정의되나, 달리 초시아(Chothia)의 정의와 같은, 다른 정의에 의해 정의됨)를 포함하나, 이들은 또한 마우스 항체로부터의 완전한 CDRs보다 더 작은 CDRs을 지니도록 제조될 수 있다[예를 들어, 하기 문헌 참조: Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002); Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428 (2002); Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, (1999); Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441 (2000)].
마찬가지로, SDRs로 명명된, CDRs의 일부, 결합에 필요한 CDR 잔기의 서브세트만을 인간화된 항체내로 통합시키는 것이 필요할 수 있다. 항원과 접촉하지 않고 SDRs내에 존재하지 않는 CDR 잔기가 종래 연구들에 기초하여, 초씨아 초가변 루프 밖에 존재하는 케이벳 CDRs의 영역으로부터(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901 , 1987), 분자 모델링에 의해 및/또는 경험적으로, 또는 곤잘레스 등의 문헌[Gonzales et al., Mol. Immunol. 41 : 863, 2004]에 기재된 대로, 확인될 수 있다(예를 들어, CDRH2 중의 잔기 H60-H65은 종종 필요하지 아니함). 그러한 인간화된 항체에서, 하나 이상의 도너 CDR 잔기가 존재하지 않는 위치에서, 상기 위치를 점유하는 아미노산은 억셉터 항체 서열내의 상응하는 위치(케이벳 번호매김에 의함)를 점유하는 아미노산일 수 있다. 포함되는 그러한 치환의 개수는 경쟁하는 고려사항의 균형을 반영한다. 그러한 치환은 인간화된 항체에서 마우스 아미노산의 개수를 감소시키고 결과적으로 잠재적인 면역원성을 감소시키는데 잠재적으로 유익하다. 그러나, 치환은 또한 친화력의 변화를 초래할 수 있고, 친화력에서의 유의한 감소는 회피되는 것이 바람직하다. 또한 CDRs 내의 치환을 위한 위치와 치환되는 아미노산은 경험적으로 선택될 수 있다.
따라서, 전형적으로, 인간화된 항체는 (i) 마우스 항체, 예를 들어, GAL-FR21로부터의 CDRs(종종 3개의 CDRs), 인간 가변 영역 프레임워크, 및 인간 불변 영역을 포함하는 경쇄; 및 (ii) 마우스 항체, 예를 들어, GAL-FR21로부터의 CDRs(종종 3개의 CDRs), 인간 가변 영역 프레임워크, 및 인간 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역 프레임워크는 각각 성숙한 인간 항체 서열, 인간 항체 서열의 공통 서열, 또는 생식선 영역 서열일 수 있다.
첫 번째 구조 엘리먼트에서, 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크는 다수의 공지된 인간 항체 중에서 억셉터 항체를 적당하게 선택함으로써, 도너 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크와 최대의 서열 동일성(65% 내지 95%)을 갖도록 선택된다. 두 번째 구조 엘리먼트에서, 인간화된 항체를 작제시, 인간 억셉터 항체의 프레임워크내의 선택된 아미노산(CDRs 밖)은 특정 규칙에 따라 도너 항체로부터의 상응하는 아미노산으로 대체된다. 구체적으로, 프레임워크에서 대체되는 아미노산은 CDRs과 상호작용하는 이들의 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 대체된 아미노산은 도너 항체 서열 중의 CDR에 인접하거나 3-차원 공간에서 측정시 인간화된 항체내의 CDR의 4 내지 6 옹스트롱(angstroms) 이내에 존재할 수 있다.
키메라 항체는 마우스 (또는 다른 설치류) 항체의 가변 영역이 인간 항체의 불변 영역과 결합된 항체이다; 유전공학적 조작을 통한 이들의 작제는 잘 알려져 있다. 그러한 항체는 약 2/3의 인간 항체이면서, 마우스 항체의 결합 특이성을 보유한다. 마우스, 키메라 및 인간화된 항체내에 존재하는 비인간 서열의 비율은 키메라 항체의 면역원성이 마우스와 인간화된 항체의 중간임을 제시한다. 마우스 항체와 대비하여 감소된 면역원성을 지닐 수 있는 다른 유형의 유전공학적으로 조작된 항체는 파지 디스플레이 방법(Dower et al., WO91/17271 ; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, WO92/20791; 및 Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998, 각각의 문헌은 참고문헌으로써 본원에 포함됨) 또는 트랜스제닉 동물(Lonberg et al., WO93/12227; Kucherlapati WO91/10741, 각각의 문헌은 참고문헌으로써 본원에 포함됨)을 사용하여 제조한 인간 항체를 포함한다.
본원에서 사용한, 용어 "인간-유사" 항체는 상당한 비율(예를 들어, 약 50% 이상)의 하나 또는 둘 모두의 쇄의 아미노산이 인간 면역글로불린 유전자에서 유래된 mAb를 지칭한다. 따라서, 인간-유사 항체는 키메라, 인간화된 및 인간 항체를 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다. 본원에서 사용한, "감소된-면역원성"을 지니는 mAb는 인간 환자에게 투여되는 경우 마우스 항체보다 상당히 더 적은 면역원성을 나타낼 것으로 예상되는 mAb이다. 그러한 항체는 키메라, 인간화된 및 인간 mAbs를 비롯한, B- 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 마우스 항체내의 특정 아미노산을, 예를 들어, 노출된 잔기로 대체함으로써 제조된 mAbs를 포함한다(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991). 본원에 사용된, "유전공학적으로 조작된" mAb는 재조합 DNA 기술의 도움으로 유전자들이 비천연 환경에서 작제되었거나 포함된(예를 들어, 마우스 또는 박테리오파지 내의 인간 유전자들) mAb이고, 그러므로, 예를 들어, 통상적인 하이브리도마 기술로 제조된 마우스 mAb를 포함하지 아니할 것이다.
인간화된 항체를 설계하기 위한 다른 접근법은 또한 상기한 US 특허 제 5,530,101호 및 5,585,089호의 방법, 예를 들어, "초인간화(superhumanization)"(Tan et al. J. Immunol. 169: 1119, 2002, 및 US 특허 제 6,881,557호 참조) 또는 스튜드니칵 등의 문헌[Studnicak et al., Protein Eng. 7:805, 1994]의 방법과 동일한 결과를 달성시키기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 유전공학적으로 조작된, 감소된-면역원성 mAbs를 생산하기 위한 다른 접근법은 예를 들어, 문헌[Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105, 1998; Roguska et al. Protein Eng. 9:895, 1996; 및 US 특허 제 6,072,035호 및 5,639,641호]에 기재된, "재형상화(reshaping)", "초키메라화(hyperchimerization)" 및 버니어링(veneering)/리서페이싱(resurfacing)을 포함한다.
mAb의 에피토프는 당해 mAb가 결합하는 이의 항원의 부분이다. 각각의 항체가 항원에 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우, 2개의 항체는 동일 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 1x, 5x, 10x, 2Ox 또는 100x 과량의 한 항체는 경쟁적 결합 검정에서 측정시 50% 이상 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 다른 항체의 결합을 억제한다(예를 들어, 다음 문헌 참조바람: Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). 달리, 한 항체의 결합을 감소 또는 제거시키는 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이들이 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거시키는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 지닌다. 한 항체의 결합을 감소 또는 제거시키는 몇몇 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거시키는 경우, 2개의 항체는 중첩되는 에피토프를 지닌다.
2. 항-FGFR2 항체
만일 결합이 부분적으로 또는 완전하게 FGFR2의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제시킨다면, FGFR2(즉, 항-FGFR2 mAb)에 결합하는 모노클로날 항체(mAb)는 FGFR2를 중화시키거나, 중화(또는 억제 또는 길항)하는 것으로 지칭된다. 중화 항체가 억제 또는 차단할 수 있는 FGFR2의 생물학적 활성중에는 FGFR2의 FGF 리간드, 예를 들어, FGF1 및/또는 FGF2 중 하나 이상 또는 전부에 결합하는 FGFR2의 활성이 있다. FGFRIIIb의 경우, 이러한 리간드는 FGF1, FGF7(KGF) 및 FGF7 서브패밀리의 다른 일원들, FGF3, FGF10 및 FGF22를 포함한다. FGFRIIIc의 경우, 이러한 리간드는 FGF1과 FGF2; FGF4과 FGF4 서브패밀리의 다른 일원들, FGF5와 FGF6; FGF8과 FGF8 서브패밀리의 다른 일원들, FGF17과 FGF18; 및 FGF9와 FGF9 서브패밀리의 다른 일원들, FGF16과 FGF20을 포함한다. 중화 항-FGFR2 mAb에 의해 억제될 수 있는 FGFR2의 또 다른 중요한 활성은, 세포, 예를 들어, 상피 또는 내피 세포, 섬유아세포, FGFR2가 트랜스펙션된 Ba/F3 세포와 같은 세포, 다양한 인간 종양 세포의 증식의 자극이다. 중화 항-FGFR2 mAb에 의해 억제가능한 다른 활성은 내피 세포와 같은 세포의 분화 및 이동의 자극 및, 예를 들어, 인간 혈관 내피 세포(human vascular endothelial cell, HUVEC) 증식 또는 튜브 형성의 자극에 의해 또는 닭 배아 장뇨막(chick embryo chorioallantoic membrane, CAM)에 적용한 경우 혈관의 유도에 의해 측정한 경우, 혈관신생의 유도이다. 일반적으로, 중화 mAb는 위에서 나열한 하나 이상의 FGFs에 의해 유도된 경우, 이러한 활성을 억제시킨다. 마찬가지로, mAb는 바람직하게는 FGFR2에 대한 FGF 리간드의 결합, 예를 들어, FGFR2 및 다운스트림 MAP 키나아제의 인산화에 의해 자극되는 신호 전달 경로의 전부 또는 일부를 억제한다(Dailey et al., Cytokine Growth Factor Revs 16:233, 2005).
본원 발명의 중화 mAb는, 예를 들어, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 또는 50 g/ml의 농도에서, 하기 실시예에 기재되어 있거나 종래 기술 분야에 공지된 방법들로 검정할 때, 약 50% 이상, 그러나 바람직하게는 75%까지, 더 바람직하게는, 90% 또는 95% 또는 심지어 99%까지, 가장 바람직하게는 대략 100%(본질적으로 완전하게 또는 FGFR2가 결여된 음성 대조군과 구별불가능하게)까지, FGFR2의 생물학적 활성을 억제한다. 전형적으로, 사용된 FGF 리간드의 양이 생물학적 활성을 완전히 자극시키는데 충분한 경우, 측정된 억제의 정도는 1, 2, 또는 5 ng/ml 또는 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3 또는 10 g/ml이다. 바람직하게는, mAb는 단일 제제로서 사용한 경우, 생물학적 활성을 중화, 즉, 억제하나, 임의로 2가지 mAbs를 함께 사용하여 억제를 제공할 수 있다. 가장 바람직하게는, mAb는 상기 나열된 생물학적 활성 중 단지 하나를 중화하는 것이 아니고, 2가지, 3가지 또는 수가지를 중화한다; 본원의 목적을 위해, 단일 제제로 사용된 항-FGFR2 mAb는 FGFR2의 모든 생물학적 활성을 중화하며, 이는 "완전 중화(fully neutralizing)"로 지칭되고, 그러한 mAbs는 가장 바람직하다.
본원 발명은 FGFR2IIIb에 결합하나 FGFRIIIc에 별로 잘 결합하지 않거나 검출가능하게 결합하지 않거나, 달리 FGFR2IIIc에 결합하나 FGFRIIIb에 별로 잘 결합하지 않거나 검출가능하게 결합하지 않거나, 제 3의 대안으로 FGFR2IIIb와 FGFR2IIIc 둘 모두에 결합하는 중화 mAbs 및 약학 조성물로 이러한 유형의 항체들 중 임의의 항체의 용도, 특히 암 또는 기타 질환의 치료를 위한 용도를 제공한다. 또한 본원 발명은 하나 이상의 형태로 FGFR2에 결합하고, FGFR2를 발현하는 종양 이종이식체, 예를 들어, SNU-16 또는 OCUM-2M 이종이식체의 성장을 억제, 바람직하게는 완전히 억제하는, 중화 또는 비중화 mAbs를 제공한다. 그러한 mAb는, 예를 들어, FGFR2를 통하여 음의 성장 신호 또는 향-아폽토시스(pro-apoptotic) 신호를 전달함으로써, 종양 성장을 억제할 수 있다. 본원 발명의 MAbs는 바람직하게는 FGFR2에 특이적이거나 우선적으로 이에 결합하는데, 즉, 이들은 FGFR2와 관련된 단백질, 예컨대, 다른 FGF 수용체, FGFR1, FGFR3 및 FGFR4를 비롯한 다른 막 수용체 티로신 키나아제에 결합하지 않거나, 단지 훨씬 더 적은 정도로(예를 들어, 10배 이상 더 적게) 결합한다. 반면, 몇몇 경우에서, FGFR2 이외의 하나 이상의 다른 FGF 수용체에 결합하는 mAbs가 바람직하다. 본원 발명의 mAbs는 전형적으로 FGFR2에 대하여 107 M-1 이상 그러나 바람직하게는 108 M-1 이상, 가장 바람직하게는 109 M-1 이상 또는 심지어 1010 M-1 이상의 결합 친화력(결합 상수 Ka)를 지닌다. 또 다른 형태의 것보다 FGFR 또는 FGFR2의 한 형태에 차별적 또는 우선적 결합을 나타내는 mAbs는, 바람직하게는, 예를 들어, Ka로 측정시, 형태들 간에 5배, 10배 또는 백배 이상의 선호도를 나타낸다. 항체와 항원 사이의 결합의 결여(즉, 항체가 항원에 결합하지 않음)는 항체와 항원 사이의 시도된 결합 반응으로부터의 임의의 신호가, 예를 들어, 항체 또는 항원이 비존재하거나 비활성제로 대체된, 음성 대조군과 구별불가능하다는 것을 의미한다.
본원 발명의 몇몇 mAbs는 인간 FGFR2와 마우스 FGFR2 둘 모두에 결합하거나, 인간 FGFR2와 마우스, 래트, 래빗, 닭, 개 및/또는 원숭이(예를 들어, 치노몰구스 원숭이) FGFR2 중 하나, 둘 이상 또는 전부에 결합한다. 몇몇 경우에, mAb는 인간 FGFR2에 대한 결합력의 2, 10 또는 100-배 이내의 결합력(즉, Ka)으로 마우스 FGFR2(예를 들어, 마우스 FGFR2IIIb)에 결합한다; 마찬가지로, mAb는 인간 FGFR2에 대한 결합력의 2 또는 10-배 이내의 결합력으로 또는 심지어 대체로 동일하게 또는 인간 FGFR2에 대한 결합과 구별불가능하게(즉, 실험 오차 이내로) 치노몰구스 원숭이 및/또는 침팬지 FGFR2(예를 들어, FGFR2IIIb)에 결합할 수 있다. 다른 mAbs는 오직 인간 FGFR2에만 특이적이다.
본원 발명의 MAbs는 이들의 천연 4량체 형태(2개의 경쇄 및 2개의 중쇄)로 항-FGFR2 항체를 포함하고 임의의 공지의 이소형 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 및 이들의 아형(subtypes), 즉, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3일 수 있다. 또한 본원 발명의 mAbs는 항체의 단편, 예컨대, Fv, Fab 및 F(ab')2; 이기능성(bifunctional) 하이브리드 항체(예를 들어, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987), 단일-쇄 항체(Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); 싱글-암(single-arm) 항체(Nguyen et al., Cancer Gene Ther. 10:840, 2003); 및 변형된 불변 영역을 지니는 항체(예를 들어, U.S. 특허 제 5,624,821호)를 포함한다. mAbs는 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 또는 닭) 기원일 수 있거나, 이들은 유전공학적으로 조작될 수 있다. 설치류 mAbs는 적절한 애주번트 중의 FGFR2로 복강내(i.p.), 정맥내(i.v.), 또는 발바닥(footpad)내로 다수회의 면역접종, 후속하여 지라 또는 림프절 세포의 적출과 적합한 불멸화된 세포주와의 융합, 및 이후 FGFR2에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 선별을 포함하는 표준 방법으로 제조되는데, 예를 들어, 하기 실시예들을 참조하라. 앞에서 언급한 종래 기술 분야에 공지된 방법들로 제조한, 키메라 및 인간화된 mAbs는 본원 발명의 바람직한 구체예이다. 예를 들어, 파지 디스플레이 또는 트랜스제닉 마우스 방법에 의해, 제조한 인간 항체가 또한 바람직하다(예를 들어, 하기 문헌 참조바람: Dower et al., McCafferty et al., Winter, Lonberg et al., Kucherlapati, supra).
아래에 기재한 항-FGFR2 mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23은 본원 발명의 일예이다. 일단, FGFR2를 중화하는 본원에 기재된 요망되는 특성을 지니는, 단일의, 아치형(archtypal) 항-FGFR2 mAb, 예를 들어, GAL-FR21이 분리되면, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 동일한 에피토프를 지니는, 유사한 특성을 갖는 다른 mAbs를 생성시키는 것은 간단하다. 예를 들어, 마우스를 상기한 대로 FGFR2로 면역접종시키고, 하이브리도마를 생성시키고, 결과적으로 얻은 mAbs를 FGFR2에 대한 결합에 대하여 아치형 mAb와 경쟁하는 능력에 관해 스크리닝할 수 있다. 또한 아치형 mAb가 결합하는 에피토프를 함유하는 FGFR2의 더 작은 단편으로 마우스를 면역접종할 수 있다. 에피토프는, 예를 들어, FGFR2와 걸쳐있는(spanning) 일련의 중첩 펩티드에 대한 결합에 관하여 스크리닝함으로써 위치파악(localization)될 수 있다. 대안적으로, 제스퍼스 등의 문헌[Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994]의 방법을 이용하여 동일한 에피토프를 지니고 그에 따라 아치형 mAb, 예를 들어, GAL-FR21과 유사한 특성을 지니는 mAbs의 선별을 인도할 수 있다. 파지 디스플레이를 이용하여, 제일 먼저 아치형 항체의 중쇄를 (바람직하게는 인간) 경쇄의 소정 레퍼토리와 페어링시켜 FGFR2-결합 mAb를 선별하고, 그후 신규한 경쇄를 (바람직하게는 인간) 중쇄의 소정 레퍼토리와 짝지워 아치형 mAb와 동일한 에피토프를 지니는 (바람직하게는 인간) FGFR2-결합 mAb를 선별한다. 대안적으로, 예를 들어, GAL-FR21의 변이체를 GAL-FR21의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 cDNA의 돌연변이유발로 획득가능하다.
예를 들어, 각각의 mAb와 FGFR2에 대한 결합에 관해 경쟁하는, GAL-FR21, GAL-FG22 또는 GAL-FR23와 동일하거나 중첩되는 에피토프를 지니는 mAbs는 본원 발명의 다른 일예를 제공한다. 키메라 또는 인간화된 형태의 GAL-FR21, GAL-FG22 또는 GAL-FR23은 특히 바람직한 구체예이다. 또한 (신호 서열을 포함하지 않는) 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에서 GAL-FR21, GAL-FG22 또는 GAL-FR23와 90%, 95% 또는 99% 동일하고 이의 기능적 특성이 유지되고/되거나, 소수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산의 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실, 또는 삽입에 의해 각각의 mAb와 구별되는 mAbs가 본원 발명에 포함된다. 또한 GAL-FR21, GAL-FG22 또는 GAL-FR23의 상응하는 CDRs과 90%, 95% 또는 99% 또는 100% 동일한 적어도 하나의 바람직하게는 6개 CDR(s) 모두를 지니는 mAbs가 포함된다. 본 명세서의 여러 곳에 기재된, 서열 동일성 백분율은 케이벳 번호매김 규칙에 의해 최대로 정렬된 항체 서열로 결정된다. 정렬후, 대상 항체 영역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)과 참조 항체의 동일 영역이 비교되면, 대상 항체 영역과 참조 항체 영역 간의 서열 동일성 백분율은 두 대상 항체 영역 및 참조 항체 영역에서 동일한 아미노산에 의해 점유된 위치의 개수를 상기 2개의 영역의 정렬된 위치의 총 개수로 나누고(갭을 계수하지 않음), 백분율로 전환하기 위해 100을 곱함으로써 구해진다.
보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 분류하기 위한 목적으로, 아미노산은 다음과 같이 그룹화될 수 있다: 그룹 I(소수성 측쇄); met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성의 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(쇄 형태에 영향을 주는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 그룹내의 아미노산들 간의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 이러한 그룹들 중 한 그룹의 일원을 또 다른 그룹의 일원으로 변경하는 것으로 이루어진다.
본원 발명의 네이티브 mAbs를 이들의 하이브리도마에서 생산할 수 있다. 유전공학적으로 조작된 mAbs, 예를 들어, 키메라 또는 인간화된 mAbs를 다양한 당업계에 공지된 방법으로 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 이들의 경쇄 및 중쇄 V 영역을 엔코딩하는 유전자를 중첩되는 올리고뉴클레오티드로부터 합성하고 가용한 C 영역과 함께 필요한 조절 영역, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리 A 부위 등을 제공하는 발현 벡터(예를 들어, Invitrogen으로부터 구매가능한 발현 벡터)내로 삽입할 수 있다. CMV 프로모터-인핸서의 사용이 바람직하다. 이후 발현 벡터를 다양한 잘 알려진 방법, 예컨대, 리포펙틴 또는 일렉트로포레이션을 이용하여 다양한 포유동물 세포주, 예컨대, CHO 또는 Sp2/0 및 NSO를 포함하는 비증식(non-producing) 골수종내로 트랜스펙션시키고, 항체를 발현하는 세포를 적절한 항체 선별로 선별할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,530,101호를 참조하라. 더 많은 양의 항체를 시중에서 구입가능한 생물반응기에서 세포를 성장시켜 생산할 수 있다.
일단 발현되면, 본원 발명의 mAbs 또는 다른 항체는 당업계의 표준 절차, 예컨대, 미세여과, 한외여과, 단백질 A 또는 G 친화력 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 유기 염료에 기반한 다른 형태의 친화력 크로마토그래피 등에 따라 정제할 수 있다. 약제학적 용도를 위해, 약 적어도 90 또는 95% w/w의 균질성의 실질적으로 순수한 항체가 바람직하며, 98% 또는 99% w/w 또는 이를 초과하는 균질성이 가장 바람직하다.
3. 치료 방법
본원 발명은 본원 발명의 mAb(즉, 항-FGFR2 mAb)를 질환을 지니거나(치료적 치료) 질환의 발생 또는 재발의 위험을 지니는(예방적 치료) 환자에게 투여하는 치료 방법을 제공한다. 용어 "환자"는 인간 환자; 수의학적 환자, 예컨대, 고양이, 개 및 말; 농장 동물, 예컨대, 소, 양, 및 돼지; 및 시험 목적으로 사용되는 실험 동물, 예컨대, 마우스 및 래트를 포함한다. 본원 발명의 방법은 인간 환자의 치료에 특히 잘 받아들여 질 수 있다. 인간 환자를 치료하는 방법에 사용되는 mAb는 인간 FGFR2 단백질에 결합하며, 상기 단백질의 서열은 GenBank Locus AF487553로 제공되어 있다. 본 명세서에서 인용된 다른 FGFRs 또는 FGFs에 대한 인용문헌은 배경 부분에 제공되어 있다. 인간 단백질에 대한 mAb가 또한 다른 종에서 사용될 수 있는데, 상기 종 상동체는 인간 단백질과 항원성 교차반응성을 지닌다. 그러한 교차반응성이 결여된 종에서, 그러한 종에 존재하는 종 상동체에 대한 적절한 특이성을 지니는 항체가 사용된다. 그러나, 실험 동물에서 이종이식 실험에서, 상기 이종이식에 의해 발현되는 인간 단백질에 대한 특이성을 지니는 mAb가 일반적으로 사용된다.
바람직한 구체예에서, 본원 발명은 본원에 기재된 항체를 포함하는 약제 제형을 제공한다. 약제 제형은 동결건조된 또는 수성 용액의 형태로, 임의로 부형제 또는 안정화제와 함께, 생리학적으로 허용되는 담체 중의 mAb를 함유한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 채용된 투여량 및 농도에서 수령체에 무독성이며 전형적으로 5.0 내지 8.0의 pH, 가장 흔하게 6.0 내지 7.0의 pH로, 완충액, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 또는 아세테이트; 등장성으로 만들기 위한, 염, 예컨대, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드 등; 항산화제, 보존제, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 친수성 중합체, 예컨대, 폴리소르베이트 80, 아미노산, 예컨대, 글리신, 탄수화물, 킬레이트제, 당, 및 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 기타 표준 성분(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. 1980)을 포함한다. mAb는 전형적으로 0.1 내지 100 mg/ml, 예를 들어, 1 내지 10 mg/ml 또는 10 내지 50 mg/ml, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 mg/ml의 농도로 존재한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본원 발명은 약제 제형으로 항-FGFR2 mAb를 사용하여 질환을 지니는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 약제 제형으로 제조된 mAb는 임의의 적합한 경로에 의해, 특히 정맥 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구적으로, 근내로 또는 피하로 환자에게 투여될 수 있다. 정맥내 주입은 15분 미만, 그러나 더 흔하게는 30분, 또는, 1, 2 또는 심지어 3시간에 걸쳐 주입될 수 있다. 또한 mAb는 질병(예를 들어, 종양)의 부위로 직접적으로 주입되거나, 리포좀과 같은 전달 작용제로 캡슐화되어 주입될 수 있다. 주입되는 용량은 치료될 병태를 적어도 부분적으로 경감시킬 정도로 충분하며("치료학적으로 유효한 용량"), 임의로 0.1 내지 5 mg/kg 체중, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 mg/kg일 수 있으나, 0.1 또는 1 내지 10 mg/kg 초과 또는 심지어 1 내지 15, 20 또는 30 mg/kg일 수 있다. 또한 고정된 단위 용량은, 예를 들어, 100, 200, 500, 1000 또는 2000 mg으로 주어질 수 있거나, 용량은 환자의 표면 영역, 예를 들어, 1000 mg/㎡에 기반할 수 있다. 일반적으로, 1 내지 8 용량(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이 암 치료를 위해 투여되나, 10, 20 이상의 용량이 주어질 수 있다. mAb는, 예를 들어, 1주, 2주, 4주, 8주, 3 내지 6개월 또는 이 보다 더 긴 기간 동안 mAb의 반감기에 의존하여, 매일, 1주에 2회(biweekly), 매주, 격주, 매월 또는 몇몇 다른 간격으로 투여될 수 있다. 또한 반복된 치료 과정, 즉, 만성 투여가 가능하다.
치료 대상 환자에 존재하는 질환을 적어도 부분적으로 경감시키는데 효과적인 용량, 투여 빈도 및 투여 경로의 조합은 치료학적 유효 섭생으로 지칭된다. 환자에서 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는데 효과적인 용량, 투여 빈도 및 투여 경로의 조합은 예방학적 유효 섭생으로 지칭된다.
본원 발명의 항-FGFR2 mAbs로의 치료에 특히 민감한 질환은 혈관신생을 필요로 하거나 FGFR2 및/또는 FGF의 검출가능한 또는 바람직하게는 상승된 수준과 연관이 있는 것으로 믿어지는 고형 종양, 예를 들어, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 폐암(소세포 또는 비소세포 폐암), 결장암, 전립선암, 자궁경부암, 췌장암, 위암, 식도암, 간암(hepatocellular carcinoma)(liver cancer), 신장암(renal cell carcinoma)(kidney cancer), 두경부 종양, 중피종, 악성 흑색종(melanoma), 육종, 및 뇌 종양(예를 들어, 신경교종, 예컨대, 교아세포종)을 포함한다. 상승된 수준은, 바람직하게는, 동일한 환자로부터의, 정상 조직, 예컨대, 조직-매치된 비암성 조직내의 각각의 비교가능한 FGFR2 또는 FGF의 수준에 대하여 암성 조직내의 비교가능한 FGFR2(예를 들어, FGFR2IIIb) 또는 FGF(예를 들어, FGF2, FGF7 또는 FGF10)의 수준을 단백질 또는 mRNA 수준으로 측정될 수 있다. 마찬가지로 검출가능한 수준은 암성 조직내의 단백질 또는 mRNA 수준으로 측정가능하고, 분석대상물(예를 들어, FGFR2 또는 FGF)이 비존재하는 것으로 공지된 대조군 샘플 중의 백그라운드 수준과 비교되거나 분석대상물 또는 분석대상물을 엔코딩하는 핵산에 결합하지 않는 것으로 공지된 항체 또는 프라이머 또는 프로브를 사용하여 검출이 실행되는 음성 대조군과 비교된다. 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 및 기타 혈액암(hematologic malignancies), 특히, 이러한 암들 중 FGFR2 및/또는 FGF의 증강된 발현을 동반하는 암이 또한 항-FGFR2 mAbs로의 치료에 민감할 수 있다. 본원 발명의 항-FGFR2 mAbs으로의 치료에 적합한 혈관신생과 연관된 기타 질환은, 상기한 것과 같이, 연령관련황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 당뇨망막병증 (diabetic retinopathy), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma) 및 눈의 기타 질환; 건선 및 피부의 기타 질환; 류머티즘성 관절염; 및 FGFR2에서의 돌연변이와 연관된 유전적 골격 장애, 예를 들어, 에이퍼트 증후군(Apert syndrome)을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 항-FGFR2 mAb는, 예를 들어, 암을 치료하기 위해, 다른 요법(therapy)과 병합하여(즉, 함께, 즉, 상기 요법 이전, 도중 또는 이후에) 투여된다. 예를 들어, 암 치료를 위해, 항-FGFR2 mAb는 하나 이상의 임의의 공지 화학요법 약물, 예를 들어, 알킬화제, 예컨대, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 프로카바진, 및 시클로포스파미드; 항대사제(antimetabolites), 예컨대, 플루오로우라실, 플록수히딘(floxuhdine), 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트 및 히드록시우레아; 식물 알칼로이드를 포함하는 천연 제품 및 항생제, 예컨대, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 에토포시드(etoposide), 마이토마이신, 미토산트론(mitoxantrone), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 탁솔(파클리탁셀) 또는 관련 화합물, 예컨대, Taxotere®; 토포이소머라아제 1 억제제 이리노테칸; 테모졸로미드 및 카무스틴을 함유하는 Gliadel® wafer를 포함하는 뇌 종양에 관해 특별히 승인된 작용제; 및 티로신 키나아제의 억제제, 예컨대, Gleevec®, Sutent®(수니티닙 말레이트), Nexavar®(소라페닙) 및 Tarceva®(에를로티닙) 또는 Iressa®(제피티닙); 혈관신생의 억제제; 및 WO 2005/017107 A2(본원에서 참고문헌으로 본 명세서에 통합됨)에 나열된 모든 승인된 항암제 및 실험 항암제와 함께 투여될 수 있다. 항-FGFR2 mAb는 표준 화학요법 섭생에서 사용되는 1, 2, 3가지 이상의 이러한 기타 작용제와 병용하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 기타 작용제는 치료되는 특정 유형의 암에 대해 효과적인 것으로 이미 공지된 작용제들이다. 항-FGFR2 mAb는 화학요법 약물에 대한 내성을 극복하고, 그로 인해 이들의 유효성을 증가시키는데 특히 유용하다.
항-FGFR2 mAb와 함께 암을 치료하기 위해 투여될 수 있는 기타 작용제는 생물학제제(biologies), 예컨대, HER2 항원에 대한 Herceptin™; VEGF에 대한 Avastin®; 또는 내피 성장인자(EGF) 수용체에 대한 항체, 예컨대, Erbitux®(세툭시맙) 및 Vectibix®(파니투무맙)을 포함하는, 모노클로날 항체를 포함한다. 간세포 성장인자(HGF)에 대한 항체가 mAb L2G7 (Kim et al., Clin Cancer Res 12:1292, 2006 및 미국 특허 제 7,220,410호) 및 특히 이의 키메라 및 인간화된 형태, 예컨대, HuL2G7(WO 07115049 A2); WO 2005/017107 A2호에 기재된 인간 항-HGF mAbs, 특히 2.12.1; 및 WO 07143090 A2 또는 WO 07143098 A2호에 기재된 HGF 결합 단백질; 및 상기한 mAbs 중 임의의 것과 결합에 대하여 경합하는 기타 중화 항-HGF mAbs를 포함하는, 항-FGFR2 mAb와 함께 사용하기에 특히 바람직하다. HGF의 cMet 수용체에 결합하는 mAb, 예를 들어, 단지 1개의 "암(arm)", 즉, 결합 도메인을 지니도록 유전공학적으로 조작된 항-cMet mAb OA-5D5(Martens et al., Clin. Cancer Res. 12:6144, 2006)가 또한 바람직하다. 또한 기타 FGFR 수용체 FGFR1, 3, 4 또는 다양한 FGFs, 예컨대, FGF1, FGF2 및 FGF7에 대한 항체가 항-FGFR2 mAb와 병용하여 사용하기에 바람직하다. 더욱이, 항-FGFR2 mAb는 임의 유형의 수술 및/또는 외부 빔 방사, 강도 조절 방사 요법(intensity modulated radiation therapy, IMRT) 및 임의 유형의 방사선외과술, 예를 들어, 감마 나이프를 포함하는, 방사선 요법과 함께 사용될 수 있다.
항-FGFR2 mAb 항체를 포함하는 치료(예를 들어, 표준 화학요법)는, 동일한 치료(예를 들어, 화학요법)이나, 항-FGFR2 mAb를 포함하지 않는 동일한 치료(예를 들어, 화학요법)와 비교하여, 암을 지니는 환자의 평균 무전이 생존(median progression-free survival) 또는 전반적인 생존 시간을 30% 이상 또는 40%, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 또는 이를 초과하여 증가시킴으로써 질환을 완화시킬 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항-FGFR2 mAb 항체를 포함하는 치료(예를 들어, 표준 화학요법)는 항-FGFR2 mAb를 포함하지 않는 치료와 비교하여, 이러한 종양(예를 들어, 난소, 자궁내막, 췌장, 유방, 폐, 대장 및 교아세포종, 특히, 재발되거나 불응성인 경우)을 지니는 환자의 완전한 반응 속도, 부분적 반응 속도, 또는 객관적 반응 속도(완전 + 부분)를 30% 이상 또는 40%, 그러나, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100%까지 증가시킬 수 있다.
전형적으로, 임상 시험에서(예를 들어, II상, II/III상 또는 III상 시험), 화학요법만을 시술받은 환자의 대조군과 비교하여 화학요법 + 항-FGFR2 mAb로 치료된 환자의 평균 무전이 생존 및/또는 반응 속도에서의 앞서 언급한 것과 같은 증가는, p = 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서, 통계적으로 유의하다. 완전 및 부분 반응 속도는, 예를 들어, 국립암연구소 및/또는 미국 식품의약국에 의해 나열 또는 허용된, 암에 대한 임상 시험에 공통적으로 사용되는 객관적 기준에 의해 결정된다.
4. 다른 방법
본원 발명의 항-FGFR2 mAbs는 또한 진단적, 예후적 및 실험실적 방법에서의 용도가 있음이 확인된다. 이들은 종양 또는 종양을 지니는 환자의 순환에서 FGFR2의 수준을 측정하여, 종양을 추적 및 종양 치료의 지침을 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 높은 수준의 FGFR2(예를 들어, 동일한 환자로부터의 조직-매치된 비암성 샘플에 비해 증가된 수준)와 연관된 종양은 항-FGFR2 mAb로의 치료에 특히 민감할 수 있다. 특정 구체예에서, mAbs는 ELISA에서 또는 FGFR2의 수준, 예를 들어, 혈청내 FGFR2의 수준을 측정하기 위한 방사능면역검정에서, 또는 FGFR2 발현 위치를 확인하기 위한 면역조직화학, 예를 들어, 종양 생검 표본에서, 사용될 수 있다. 상이한 에피토프에 결합하는 (즉, 결합에 관해 비경쟁하는) 2가지 항-FGFR2 mAbs의 사용은 FGFR2를 검출하기 위한 민감한 "샌드위치" ELISA를 개발하는데 있어서 특히 유용하다. 다양한 검정에서, mAb는 형광 분자, 스핀-표지된 분자(spin-labeled molecules), 효소 또는 방사능동위원소로 표지될 수 있고, mAb는 FGFR2에 관한 검정을 실시하기 위해 필요한 모든 시약들과 함께 키트 형태로 제공될 수 있다. 다른 용도에서, 항-FGFR2 mAbs는, FGFR2를 정제하는데, 예를 들어, 친화력 크로마토그래피에 의해 정제하는데 사용된다.
실시예
실시예 1: 시약 및 검정
Flag - FGF1 , FLAG - FGF2 , 및 FLAG - FGF7 의 제조. 인간 FGF1(155개 아미노산을 지니는 형태; Chiu et al., Oncogene 5:755-1990) 및 인간 FGF2(155개 아미노산을 지니는 형태; Sommer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 144:543, 1987)에 대한 DNA 서열을 합성하고(GenSchpt, Inc), 그런 다음 PCR로 N-말단 Flag 펩티드 태그(tag)를 지니도록 증폭시키고 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 pET 벡터의 유도체(Invitrogen)로 클로닝시켰다. 이러한 플라스미드로 E.coli BL21(DE3) 세포를 형질변환시키고, 1 mM IPTG를 사용하여 FGF1 또는 FGF2 발현을 유도하였다. FGF 발현 수준을 FGF1 또는 FGF2 특이적 ELISA 키트(R&D Systems)를 사용하여 측정하였다. FGF를 기재된 대로(Wiedlocha et al., Mol. Cell. Biol., 16:270, 1996) 헤파린-세파로스 CL-6B 비드(Amersham Biosciences)를 사용하여 정제하였다. 유사하게, 인간 FGF7(194개의 아미노산을 지니는 전구체 형태; Finch, P.W. et al., Science 245:752, 1989)에 대한 유전자를 합성하고 PCR로 pCMV 벡터(pDrive의 유도체, Invitrogen)내에 N-말단 Flag 태그를 지니도록 증폭시키고, Flag-FGF10을 유사한 방식으로 만들었다. 플라스미드 DNAs를 인간 293F 세포를 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 293F 세포의 배양 상청액을 리간드-수용체 결합 검정에 관해 사용하였다.
FGFR2 융합 단백질의 제조. 인간 FGFR2IIIb 및 인간 FGFR2IIIc의 세포외 도메인(ECD)을 면역부착소 분자로서 발현시켰다. 알파 형태의 경우, FGFR2IIIb(아미노산 1-378) 또는 FGFR2IIIc(아미노산 1-377)의 전체 ECD를 엔코딩하는 DNA 단편을 폴리펩티드 링커를 통해 인간 Fc(잔기 216 내지 446)에 융합시키고; (D1이 없는) 베타 형태의 경우, 대신 FGFR2(beta)lllb의 경우 아미노산 152-378 및 FGFR2(beta)lllc의 경우 아미노산 152-377을 사용하였다. 이러한 FGFR2-Fc 분자를 293F 세포를 트랜스펙션시키고, 293 발현 배지(Invitrogen) 중의 G418 (1 mg/ml)의 존재하에 안정한 형질전환체(transfectants)를 선별함으로써 발현시켰다. 293F로 트랜스펙션된 세포로부터 분비된 FGFR2-Fc를 단백질 A/G 컬럼을 사용하여 정제하였다. 유사하게, 치노몰구스(cyno) 원숭이 FGFR2 ECD의 cDNA를 cyno 간 mRNA로부터 표준 기법에 의해 클로닝하고, 아미노산 1-378을 인간 Fc에 융합시켜 발현을 위한 cyno FGFR2IIIb-Fc를 생성시켰다. 침팬지 FGFR2IIIb-Fc를 시험관내 돌연변이유발을 이용하여 작제하여 chimp FGFR2IIIb와 다른 인간 FGFR2IIIb ECD내 한 아미노산을 chimp 아미노산(GenBank에 공지된 서열에 기초하여, 잔기 186 메티오닌을 트레오닌)으로 전환시켰다. 마우스 FGFR2(beta)lllb-Fc 단백질을 R&D Systems (Catalog # 708-MF)에서 구입하였다.
FGFR2 융합 단백질에 결합하는 mAb에 관한 ELISA 검정. ELISA 플레이트를 밤새 4℃에서 염소 항-인간 IgG-Fc(2 μg/ml)로 코팅시켰다. 그런 다음, 비특이적 결합 부위를 RT에서 1시간 동안 2% BSA로 차단시켰다. 플레이트를 상기한 바와 같이 1시간 동안 FGFR2 융합 단백질 중 어느 하나(1 μg/ml)와 함께 인큐베이션시킨 다음, 후속하여 다양한 농도의 mAbs 또는 하이브리도마 배양 유체와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 결합된 mAb를 HRP-염소 항-마우스 항체로 검출하고 후속하여 세척하고, TMB 기질(Sigma)을 첨가하고, 450 nm에서 판독하였다. 모든 ELISA 검정에서, 플레이트를 각 단계 사이에 3회 세척하였다.
유세포분석. 세포 분류 완충액(CSB: PBS/1 % FBS/0.02% NaN3)으로 2회 세척한 후, 2 x 1O5개 세포를 마이크로티터 웰에서 50 μl의 CSB 중에 재현탁시키고, 1시간 동안 얼음에서 시험할 50 μl의 항-FGFR2 mAb(1 μg/50 μl)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 CSB에서 세척하고, 결합된 항체를 얼음에서 1시간 동안 FITC-염소 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)와 함께 인큐베이션하여 검출하였다. CSB로 2회 세척후, 세포를 FACScan(Becton Dickinson)으로 분석하였다.
실시예 2: FGFR2 에 대한 모노클로날 항체의 생성
MPL/TDM(Sigma-Aldrich)에 현탁시킨 항원과 함께, FGFR2(beta)IIIb-Fc(초기 용량 10 μg/발바닥, 그런 다음 5 μg/발바닥), 또는 17회 용량의 FGFR2IIIc-Fc(초기 용량 10 μg/발바닥, 그런 다음, 2 μg, 이후 5 μg으로 5회 용량) 후속하여 5회 용량의 FGFR2(beta)IIIc-Fc(5 μg/발바닥)를 1주 간격으로 20회 또는 22회 Balb/c 마우스(5-6주령, 암컷)의 뒷 발바닥에 주입함으로써 마우스들을 면역접종시켰다. 최종 주입후 3일째에, 오금림프구(popliteal lymphoid cells)를 추출하고, Hybhmune Electrofusion System(Cyto Pulse Sciences)을 사용하여 1:1 비율로 P3/X63-Ag8U1 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 하이브리도마를 24시간 후에 2x HAT(Sigma)의 첨가로 선별하였다. 융합후 10일째에, 하이브리도마 배양 상청액을 ELISA를 사용하여 FGFR2IIIb-Fc에 결합하나 인간 IgG에 결합하지 않는 이들의 활성에 관해 스크리닝하였다. 그런 다음 선별된 mAbs를 인간 위 종양 세포주 SNU-16(Shin et al, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126:519, 2000) 상의 FGFR2IIIb를 인식하는 이들의 활성에 관해 스크리닝하였다. 그런 다음 선별된 하이브리도마를 제한 희석 기법을 이용하여 2회 클로닝하였다. 이 방식으로 선별된 3개의 mAbs는 첫 번째 면역접종 섭생으로부터 GAL-FR21 및 GAL-FR22, 및 두 번째 면역접종 섭생으로부터 GAL-FR23이었다. 이러한 mAbs의 특성은 하기에 추가로 기재된 바와 같이 도 2에 제시되어 있다.
또한, 다수의 다른 항-FGFR2 mAbs를, FR2bB 100.12.9, FR2bC 54.8.11, FR2bC 100.7.9, FR2bC 101.8.2, FR2bC 115.1.5, FR2bC 149.8.8, FR2bB 11.5.3, 및 FR2bB 18.1.6을 포함하는, 융합체로부터 획득하였다.
실시예 3: 항- FGFR2 mAbs 의 특성
도 3에 제시된 바와 같이, 선별된 mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23 3개 모두가 실시예 1에 기재된 ELISA 검정에서 FGFR2IIIb에 잘 결합한다. ELISA에서 4개의 상이한 형태의 FGFR2-Fc를 사용함으로써, 이들 mAbs 각각이 상이한 결합 패턴을 지니며 그에 따라 상이한 에피토프(도 4)를 지닌다는 것을 결정하였다. GAL-FR21은 알파 및 베타 두 가지 형태의 FGFR2IIIb(즉 D1을 동반 또는 비동반)에 결합하나, FGFRIIIc에 결합하지 않는다. 따라서, 에피토프는 D1과 연루될 수 없고 D3IIIb와 관련되어야 하며, 그래서 D3IIIb 또는 D3 내부에 에워싸여 있을 가능성이 있다. 또한 GAL-FR22는 알파 및 베타 두 가지 유형에 결합하며, 그리하여, 두 IIIb 및 IIIc와 관련하여, 에피토프는 D2-D3IIIa 또는 특히 D2-D3내에 에워싸여 있을 것으로 추정된다. 마지막으로, GAL-FR23은 베타 형태들 중 어느 하나에 결합하지 아니하여, 이의 에피토프는 완전히 또는 부분적으로 D1내에 존재함이 틀림없다. 그러므로, D1 또는 D2-D3 또는 D3 중 어느 하나 안에 에피토프를 갖는 mAbs는 본원 발명에 속한다.
mAbs GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23가 상이한 에피토프에 결합하는지 여부를 확정하기 위해, 경쟁 실험을 실시하였는데, 이 실험에서 각 mAb를 비오티닐화시켰고, 그런 다음 0.4 μg의 비오티닐화된 mAb를 상기한 ELISA 검정(다만, 검출 시약으로써 HRP-스트렙트아비딘을 사용함)에서 FGFR2IIIb-Fc에 대한 결합에 관해 100:1 과량의 각각의 다른 비표지된 mAbs(또는 대조 뮤린 mAb 5G8)과 경쟁시켰다. 도 5에 제시된 것과 같이, 각각의 mAb는 그 자체로 결합에 관해 경쟁하나, 다른 mAbs와 결합에 대해 경쟁하지 않는데, 이는 이들이 상이한 에피토프를 지닌다는 것을 제시한다. 또한, 이 검정에서 비오티닐화된 GAL-FR21과 결합에 관해 경쟁하는 다른 mAbs FR2bB 100.12.9, FR2bC 54.8.11, FR2bC 100.7.9, FR2bC 101.8.2, Fr2bC 115.1.5, FR2bC 149.8.8는 그에 따라 GAL-FR21와 동일하거나 중첩되는 에피토프를 지니며, 한편 비오티닐화된 GAL-FR22와 결합에 관해 경쟁하는 mAbs FR2bB 11.5.3, 및 FR2bB 18.1.6는 그에 따라 GAL-FR22와 동일하거나 중첩되는 에피토프를 지닌다.
선별된 mAbs가 세포막 상의 적절한 형태의 FGFR2에 결합하는지 여부를 확정하기 위해, 유세포분석을 실행하였다. FGFR2IIIb를 과발현하는, KATO-III(ATCC HTB-103) 및 SNU-16(ATCC CRL-5974) 세포를 사용하여 해당 유형의 수용체에 대한 결합을 시험하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23 mAbs 3개 모두가, 상기한 이들의 에피토프로부터 예상한 바와 같이, 두 세포주 모두에 결합한다. mAbs 중 어느 것도 그들 자체로 숙주 293F 세포에 결합하지 않음을 입증한 후, FGFRIIIc에 관한 유전자로 트랜스펙션된 인간 293F 세포를 사용하여 해당 형태에 대한 결합을 시험하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 이들의 에피토프에서 예상한 바와 같이, GAL-FR22 및 GALFR23는 FGFRIIIb-트랜스펙션된 세포에 결합하나, GALFR21는 상기 세포에 결합하지 않는다. 마지막으로, FGFR2의 S252W 돌연변이는 일부 암 세포에서 발견되기 때문에, 그러한 돌연변이를 포함하도록 작제된 FGFR2IIIb 유전자(FGFR2IIIb(S252W))로 트랜스펙션된 293F 세포에 대한 mAbs의 결합을 시험하였다. 도 7에서 제시된 바와 같이, mAbs 모두가 FGFR2IIIb(S252W)-트랜스펙션된 세포에 결합하였다. FGFR2IIIb(S252W)에 결합하는 활성은 본원 발명의 mAbs의 바람직한 특성이다.
FGFR2에 대한 FGF 리간드의 결합을 억제하는 mAbs의 활성을 측정하기 위해, ELISA 검정을 사용하였다. ELISA 웰을 밤새 4℃에서 2 μg/ml의 염소 항-인간 IgG-Fc로 코팅시켰다. RT에서 1시간 동안 2% BSA로 블록킹시킨 후, 웰을 1시간 동안 0.5 μg/ml의 FGFR2IIIb-Fc와 함께 인큐베이션하고, 후속하여 1시간 동안 다양한 농도의 mAbs의 존재하에 Flag-FGF1 또는 FLAG-FGF2(0.2 μg/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 Flag-FGF1을 HRP-항-Flag M2 항체(Sigma)의 첨가 및 이후 TMB 기질의 첨가로 검출하였다. 도 8a로부터 알 수 있는 바와 같이, mAb GAL-FR21은 본 검정에서 FGFR2IIIb에 대한 FGF1의 결합을 약하게 블록킹시켰으나, GAL-FR22과 GAL-FR23은 FGF1 결합을 블록킹시키지 않았다. 대조적으로, GAL-FR21은 FGFR2IIIb에 대한 FGF2의 결합을 강하게 블록킹시키고, GAL-FR22는 FGF2 결합을 적당하게 블록킹시키며, GAL-FR23은 결합을 블록킹시키지 못하였다. Flag-FGF7과 Flag-FGF10을 사용하는 것을 제외하고는 유사한 검정에서, GAL-FR21과 GAL-FR22가 FGFR2IIIb에 대한 FGF7과 FGF10의 결합을 블록킹시킨다는 것이 또한 드러났다(도 8b). 실제로, GAL-FR21과 GAL-FR22와 같이, 본원 발명의 유익한 mAbs는 FGFR2IIIb에 대한 FGF2, FGF7과 FGF10의 결합을, 바람직하게는 80% 또는 90% 또는 95%까지 또는 완전하게 또는 실질적으로 완전하게 블로킹시킨다. 그러므로, GAL-FR23을 제외한 GAL-FR21과 GAL-FR22는 FGFR2의 적어도 하나의 생물학적 활성을 중화시키는 것으로 드러났다.
실시예 4: 이종이식 모델
삭제
이종이식 실험을 종래 개시된 바와 같이 실행하였다(Kim et al., Nature 362:841 ,1993). 완전 DMEM 배지에서 전형적으로 성장시킨 인간 종양 세포를 HBSS에 수확하였다. 암컷 무흉선 누드 마우스 또는 NIH-III Xid/Beige/누드 마우스(4-6주령)의 투여 부위에 0.1 ml의 HBSS 중의 2-10 x 106 개 세포를 피하로 주사하였다. 종양 크기가 50 내지 100 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 무작위로 그룹화하고 5 mg/kg(총 100 μg) 또는 몇몇 다른 투여량의 mAbs를 0.1 ml의 부피로 주당 2회 복강내(i.p.)로 투여하였다. 종양 크기를 2차원[길이(a) 및 너비(b)]으로 측정함으로써 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 V = ab2/2에 따라 계산하고 평균 종양 부피 ± SEM으로 표현하였다. 각각의 처치군의 마우스 수는 일반적으로 5 내지 7마리였다. 통계 분석을, 예를 들어, 스튜던트(Student) t-시험을 이용하여, 실시할 수 있다.
도 9와 10A는 다양한 실험에서 주당 2회 20 μg(1 mg/kg)의 용량 수준으로 투여된 GAL-FR21, GAL-FR22 및 GAL-FR23이 SNU-16 위 종양 이종이식체의 성장을 강하게 억제시키며, 한편 GAL-FR21이 상기 이종이식체의 성장을 가장 강력하고 완전하게 억제시킨다는 것을 보여준다. GAL-FR21와 결합에 관해 경쟁하는 위에서 언급한 mAb FR2bC 54.8.11이 또한 이종이식체 성장을 억제시켰다. 도 10B는 주당 2회 50 μg(2.5 mg/kg)의 용량 수준으로 투여된 GAL-FR21과 GAL-FR22가 또한 OCUM-2M 인간 위 종양 세포주(문헌[Yashiro et al., Jpn J Cancer Res 85:883, 1994]에 기재됨)의 이종이식체의 성장을 강하게 억제시켰음을 보여준다. KATO III 또는 기타 FGFR2-발현 세포주의 이종이식체를 억제시키는 mAbs의 활성은 유사한 것으로 드러났다. 상기한 것과 같은 기타 항-종양 물질과 함께 부가적으로 또는 시너지적으로 종양 성장을 억제시키는 mAbs의 활성은 이종이식된 마우스 그룹을 mAb 단독, 기타 작용제 단독, 및 mAb와 기타 작용제를 함께 처리함으로써 입증되었고, 두 작용제로의 처치가 어느 한 작용제 단독 처리에 비해 월등한 억제 효과를 나타낸다는 것이 주목되었다.
실시예 5: 다른 종으로부터의 FGFR2 에 대한 mAbs 의 결합
인간 이외의 종들로부터의 FGFR2에 결합하는 mAbs의 활성을 결정하기 위해, ELISA 검정을 사용하였다. ELISA 웰을 밤새 4℃에서 2 μg/ml의 염소 항-인간 IgG-Fc로 코팅시켰다. RT에서 1시간 동안 2% BSA로 블록킹시킨 후, 웰을 1시간 동안 0.2 μg/ml의 FGFR2IIIb-Fc와 함께 인큐베이션시켰으며, 여기서 융합 단백질내의 FGFRIIIb는 인간, 마우스, 치노몰구스 원숭이 또는 침팬지 FGFRIIIb이었다. 그런 다음 웰을 다양한 농도의 GAL-FR21 또는 GAL-FR22 mAb와 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 mAbs를 HRP-컨주게이션된 염소 항-마우스 IgG-Fc의 첨가 및 이후 TMB 기질의 첨가로 검출하였다. 도 11은 GAL-FR21이 거의 마우스 FGFR2에 결합(10배 이내)할 뿐만 아니라 인간 FGFR2에 결합하며, 한편 GAL-FR22는 마우스 FGFR2에 적절하게 잘(인간 FGFR2의 약 100배 이내) 결합한다는 것을 보여준다. 도 12는 GAL-FR21이 치노몰구스 원숭이 FGFR2를 비롯한 인간 FGFR2에 (별차이 없이) 결합하며, 한편 GAL-FR22가 치노몰구스 원숭이 FGFR2(인간 FGFR2의 약 100배 이내)에 적당하게 잘 결합한다는 것을 보여준다. 침팬지 FGFR2로의 유사한 실험은 치노몰구스 원숭이 FGFR2와 동일한 결과를 나타내었다: GAL-FR21는 침팬지 FGFR2를 비롯한 인간 FGFR2에 (별차이 없이) 결합하였고, 한편 GAL-FR22는 침팬지 FGFR2에 적당하게 잘 (인간 FGFR2의 약 100배 이내) 결합하였다. GAL-FR21과 GAL-FR22와 같이, 본원 발명의 바람직한 mAbs는 마우스, 원숭이, 침팬지 및 인간 FGFR2 모두에 결합하고, 가장 바람직하게는 마우스 FGFR2에 인간 FGFR2에 대한 결합의 2, 10, 100 또는 1000배 이내로 결합하고/하거나 원숭이 및/또는 침팬지 FGFR2에 (예를 들어, Ka로 측정할 때) 인간 FGFR2에 대한 결합의 2, 10 또는 100-배 이내로 또는 (실험적 오차 범위 이내에서) 별차이 없이 결합한다. 다른 종들의 FGFR2에 대한 결합은 그러한 동물 종들에서 mAbs의 시험이 더 용이하게 실행되도록 만든다.
실시예 6: GAL - FR21 과 GAL - FR22 의 인간화
GAL-FR21 mAb의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 클로닝, 키메라 mAb의 작제 및 발현, 및 인간화된 GAL-FR21 mAb의 설계, 작제, 발현 및 정제를, 예를 들어, 모든 목적을 위해 참고문헌으로서 본 명세서에 통합되는, L2G7 mAb에 관한 US 2008019974호에 기재된 것과 같은, 분자 생물학의 표준적 방법을 사용하여 모두 실행하였다. GAL-FR21의 (성숙) 경쇄 및 중쇄 가변(V) 영역의 아미노산 서열은 도 13A 및 도 13B에 각각 제시되어 있고, 상단 선은 표지된 GAL-FR21이다. 더 구체적으로, 인간화된 GAL-FR21 mAb를 설계하기 위해, 퀸 등[Queen et al.]의 문헌, US 특허 제 5,530,101호 및 제 5,585,089호의 방법들을 일반적으로 따랐다. 도 13A와 13B에 각각 제시된 것과 같은, 인간 VK 서열 CAG27369 및 VH 서열 AAB00780를 각각 GAL-FR21 VL 및 VH 서열에 관한 억셉터 서열로서 역할하도록 선택하였는데, 그 이유는 이들이 이들에 대한 특히 높은 프레임워크 상동성(즉, 서열 동일성)을 지니기 때문이다. GAL-FR21 가변 도메인의 컴퓨터-생성 분자 모델을 사용하여 CDRs에 충분히 가까워 이들과 잠재적으로 상호작용하는 GAL-FR21 프레임워크 내의 아미노산의 위치를 결정하였다. 인간화된 GAL-FR21 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 설계하기 위해, 마우스 GAL-FR21 mAb로부터의 CDRs을 제일 먼저 억셉터 프레임워크 영역내로 개념적으로 이식시켰다. CDR 형태를 유지하기 위해 필요할 수 있는, 컴퓨터 모델이 CDRs과의 유의한 접촉을 제시한 프레임워크 위치들에서, 마우스 항체로부터의 아미노산들을 인간 프레임워크 아미노산으로 대체하였다. HuGAL-FR21로 명명된 인간화된 GAL-FR21 mAb의 경우, 이러한 대체를, 케이벳 번호매김을 사용하여, 중쇄의 잔기 27, 28, 30(초씨아 초과변 루프 H1 내) 및 48 및 67에서 실행하였고, 경쇄내의 어떠한 잔기도 대체되지 않았다. HuGAL-FR21 경쇄 및 중쇄 V 영역 서열은 각각 도 13A와 13B에 제시되어 있고, 가운데 선은 HuGAL-FR21을 나타내며, 여기서 이들은 각각의 GAL-FR21 도너 및 인간 억셉터 V 영역에 대해 정렬되어 있다 - (케이벳에 의해 규정된 것과 같은) CDRs은 밑줄그어져 있고, 위에서 나열한 대체된 아미노산들은 이중으로 밑줄그어져 있다.
본원 발명은, 도 13에 제시된 경쇄 및 중쇄 V 영역을 포함하는, 인간화된 GAL-FR21 mAb, HuGAL-FR21 뿐만 아니라, 일반적으로 프레임워크 내에서 가능하게는 CDRs 내에서, 소수(예를 들어, 전형적으로 1, 2, 3, 5 또는 10개 이하)의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 HuGAL-FR21의 서열과 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 다른 인간화된 mAbs 변이체를 제공한다. 특히, 상기한 대체의 서브셋트만이 억셉터 프레임워크에서 이루지거나, 추가의 대체(들)이 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 마우스 GAL-FR21 VH 아미노산 69L이 억셉터 아미노산 69I로 치환될 수 있고/거나 마우스 아미노산이, CDRs에 약간 근접해 있는, 케이벳-번호매김 위치 1, 3 및 60 및 63 중 임의의 위치에서 인간화된 경쇄내의 각각의 아미노산들로 치환될 수 있다. 실제로, 인간화된 mAb내의 CDRs과 접촉하지 않는 다수의 프레임워크 잔기들이 도너 마우스 mAb 또는 기타 마우스 또는 인간 항체의 상응하는 위치들로부터의 아미노산들의 치환을 수용할 수 있고, 심지어 다수의 유력한 CDR-접촉 잔기들이 또한 치환을 잘 수용할 수 있거나, 심지어 CDRs 내의 아미노산들이 변형될 수 있다. CDR 치환의 일예는 CDR내 잔기를 가변 영역 프레임워크를 공급하기 위해 사용된 인간 억셉터 서열의 상응하는 위치를 점유하는 잔기로 치환하는 것이다.
가장 흔하게는 변이체 인간화된 GAL-FR21 서열에서 이루어진 치환은 치환된 HuGAL-FR21 아미노산들과 관련하여 보존적이다. 아미노산은 하기와 같이 보존적 치환, 즉, 한 그룹 내의 치환을 결정하기 위하여 그룹화될 수 있다: 그룹 I(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; Group IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe.
바람직하게는, HuGAL-FR21 내의 (보존적 또는 비보존적) 치환은 인간화된 mAb의 결합 친화력 또는 활성(potency), 즉, FGFR2의 생물학적 활성을 중화시키는 이의 활성(예를 들어, 변이체 인간화된 GAL-FR21 mAb의 본원에 기재된 일부 또는 모든 검정에서의 능력은 HuGAL-FR21의 능력과 본질적으로 동일, 즉, 실험 오차 이내임)에 대하여 실질적인 영향을 미치지 않는다. 바람직하게는, 성숙 변이체 경쇄 및 중쇄 V 영역 서열은 각각의 HuGAL-FR21 성숙 경쇄 및 중쇄 V 영역과 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는, 98% 이상 동일하다. 달리, GAL-FR21의 가변 영역과 높은 서열 동일성을 지니는 다른 인간 항체 가변 영역이 또한 인간화된 항체 프레임워크, 특히 인간 서브그룹 I로부터의 카파 V 영역 및 인간 서브그룹 I로부터의 중쇄 V 영역, 또는 이들 서브그룹의 공통(consensus) 서열을 제공하는데 적합하다.
다른 인간화된 항체에서, 예시된 항체와 연계하여 언급된 도너 치환을 위한 억셉터의 적어도 1, 2, 3, 4 또는 모두 5개의 위치들(즉, H27, H28, H30, H48, H67)이 바람직하게는 마우스 도너 항체 중쇄의 상응하는 위치를 점유하는 잔기에 의해 점유된다. 중쇄 억셉터 서열이 AAB00780 이외의 것이면, 도너 치환을 위한 억셉터는 특화된 위치를 점유하는 잔기가 억셉터와 도너 사이에서 이미 동일한지 여부에 따라서 특정 가변 프레임워크 영역 위치의 특화된 점유를 필요로 하거나 필요로 하지 않을 수 있다.
본원에서 논의된 예시적인 mAb HuGAL-FR21는, 예를 들어, US 2008019974호에 제시된 바와 같이, 인간 κ 및 γ1 불변 영역을 지니며, 그에 따라 IgG1이다. HuGAL-FR21의 (성숙) 경쇄 및 중쇄의 완전한 서열은 도 14에 제시되어 있다. 이러한 서열이 각각 Km(3)과 G1m(3) 동종이형(allotypes)의 서열인 경우, 임의의 (IgG1, κ) 동종이형의 IgG1 mAbs가 명명된 HuGAL-FR21에 의해 에워싸여 있는 것으로 이해된다. 또한 HuGAL-FR21이 관용적인 절차에 의해 제조되는 경우, 경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에서 1 내지 수개의 아미노산들, 예컨대, 중쇄의 C-말단 리신이 소실되거나 당해 분자의 일부 또는 전부에서 유도체화될 수 있고, 그러한 조성물은 여전히 명명된 HuGAL-FR2에 의해 에워싸여 있을 것이며 인간화된 GAL-FR21 mAb인 것으로 간주됨이 이해될 것이다. 다른 이소형의 인간화된 mAbs(예를 들어, IgG2, IgG3 및 IgG4)는 HuGAL-FR21 가변 영역과 적절한 인간 불변 영역을 조합함으로써 제조될 수 있다. 치환은 보체-매개 세포독성 또는 ADCC와 같은 이펙터 기능을 감소 또는 증가시키기 위해(예를 들어, 하기 문헌 참조: Winter et al., 미국 특허 제 5,624,821호; Tso et al., 미국 특허 제 5,834,597호; 및 Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해(예를 들어, 하기 문헌 참조: Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004) HuGAL-FR21 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 이로만 국한되는 것은 아니지만, 구체적으로, IgG 불변 영역내 위치 250에서 Gln 및/또는 위치 428에서 Leu으로의 돌연변이를 지니는 HuGAL-FR21이 본원 발명의 구체예에 속한다.
HuGAL-FR21의 결합 친화력을 마우스 mAb GAL-FR21의 결합 친화력과 비교하기 위해, 경쟁적 결합 실험을 표준 ELISA 기술을 사용하여 실시하였다. 구체적으로, ELISA 웰을 밤새 4℃에서 2 μg/ml의 염소 항-인간 IgG-Fc로 코팅시켰다. RT에서 1시간 동안 2% BSA로 블록킹시킨 후, 웰을 0.5 μg/ml의 FGFR2IIIb-Fc와 함께 인큐베이션시켰다. 농도가 증가된, 비표지된 GAL-FR21, HuGAL-FR21 또는 대조 인간 항체 hIgG 존재하에 비오티닐화된 GAL-FR21 mAb(0.05 μg/ml)와 함께 웰을 인큐베이션시켰다. 결합된 비오티닐화된 GAL-FR21의 수준을 HRP-스트렙트아비딘 및 기질의 첨가로 측정하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, HuGAL-FR21 및 GAL-FR21은 대략 동일하게 잘 경쟁하였는데, HuGAL-FR21이 조금 더 나은 것으로 추정되었으며, 이것은 HuGAL-FR21의 FGFR2에 대한 결합 친화력이 (마우스) GAL-FR21 mAb 보다 적어도 더 높다는 것을 시사한다. 표지된 mAb의 결합을 50%까지 억제시키는데 필요한 HuGAL-FR21의 농도로부터, 당업자는 FGFR2에 대한 HuGAL-FR21의 결합 친화력(Ka)가 대략 109 M-1 이상임을 평가할 수 있다. HuGAL-FR21은 또한 본원에 기재된 FGFR2 활성(예를 들어, FGFR2에 대한 FGF2 또는 FGF7의 결합의 억제)에 관한 생물학적 검정들 중 임의의 검정에서 시험될 수 있고, GAL-FR21과 동등하게 FGFR2 활성을 억제시킬 것이다.
인간화된 GAL-FR22 mAb는 HuGAL-FR22와 동일 또는 유사한 방식으로 설계, 작제, 생산 및 검정될 수 있다. GAL-FR22의 (성숙) 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 도 16A와 16B에 제시되어 있고, 선들은 표지된 GAL - FR22 이다. 인간화된 GAL-FR22 mAb는 도 16A의 서열로부터의 CDRs을 포함하는 인간화된 경쇄 및 도 16B의 서열로부터의 CDRs을 포함하는 인간화된 중쇄를 지닌다. 몇몇 경우, 인간화된 GAL-FR22 mAb는 도 16A에 제시된 3개의 경쇄 CDRs 및 도 16B에 제시된 3개의 중쇄 CDRs을 포함한다. 바람직하게는, 인간화된 GAL-FR22 mAb는 마우스 GAL-FR22 mAb의 친화력의 2 또는 3배 이내의 FGFR2에 대한 결합 친화력을 지니며, 가장 바람직하게는, 예를 들어, HuGAL-FR21과 GAL-FR21에 관해 기재한 것과 같이 경쟁 ELISA로 측정할 때, GAL-FR22 mAb의 친화력과 거의 차이가 없거나 이를 초과하는 결합 친화력을 지닌다.
본원 발명이 제시된 바람직한 구체예들을 참조하여 기술되었으나, 다양한 변형이 본원 발명에서 벗어나지 않은체 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 별도로 달리 명시하지 않는 한, 본원 발명의 임의의 단계, 원소, 구체예, 특징 또는 양상은 임의의 다른 것들과 함께 사용될 수 있다. 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 접근 번호 등은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 접속 번호가 모든 목적을 위해 이의 전체로 참고문헌으로 통합되도록 구체적으로 또한 개별적으로 지적된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 이들의 전체로 참고문헌으로써 본 명세서에 통합된다. 접근 번호와 관련된 핵산 또는 단백질 서열이 변경되면, 2008년 11월 7일에 제출된 것과 동일한 접속 번호와 관련된 서열 버전이 변경되도록 의도된다.
모노클로날 항체 GAL-FR21, GAL-FR22, 및 GAL-FR23을 생산하는 하이브리도마는, 부다페스트 조약에 따라, American Type Culture Collection(주소: P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108)에, 각각, 2008년 11월 6일자로 ATCC 수탁 번호 PTA-9586 및 2008년 8월 12일자로 수탁 번호 PTA-9408로 수탁되었다. 이러한 수탁체는 승인된 보관소에서 유지될 것이고, 당해 보관소가 샘플의 반출에 관한 요청을 승인한 가장 최근의 승인일 후 적어도 5년의 기간 동안, 기탁일 이후 적어도 30년의 기간 동안, 또는, 가장 긴 기간에 해당하는, 관련 특허의 존속기간 동안, 돌연변이, 생존력상실(nonviability) 또는 파괴가 발생한 경우 교체될 것이다. 이러한 세포주에 대한 공중의 이용가능성에 관한 모든 제한은 본 출원으로부터 특허 등록시 완전히 해소될 것이다.
ATCC PTA09586 20081106 ATCC PTA09587 20081106 ATCC PTA09408 20080812
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Claims (20)

  1. 섬유아세포성장인자수용체 2(fibroblast growth factor receptor 2, FGFR2)에 결합하고 마우스에서 인간 종양 이종이식체(xenograft)의 성장을 억제하는 모노클로날 항체(mAb)로서, 상기 mAb는 각각 KASQGVSNDVA (CDR-L1), SASYRYT (CDR-L2) 및 QQHSTTPYT (CDR-L3)의 아미노산 서열을 갖는 세 개의 경쇄 CDR; 및 각각 TYNVH (CDR-H1), SIYPDNGDTSYNQNFKG (CDR-H2) 및 GDFAY (CDR-H3)의 아미노산 서열을 갖는 세 개의 중쇄 CDR을 포함하는, mAb.
  2. 제 1항에 있어서, Fab 또는 F(ab')2 단편 또는 단일-쇄 항체인, mAb.
  3. 제 1항에 있어서, 키메라 또는 인간화된 mAb인, mAb.
  4. 제 1항에 있어서, 인간화된 mAb인, mAb.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:2와 95% 이상의 서열 동일성을 지니고, 상기 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:5와 95% 이상의 서열 동일성을 지니는, mAb.
  6. 제 5항에 있어서, 케이벳(Kabat) 번호매김에 의한 잔기 H27, H28, H30, H48, 및 H67이 SEQ ID NO:5에 제시된 중쇄의 상응하는 위치를 점유하는 잔기에 의해 점유된, mAb.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:2에 제시된 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:5에 제시된 서열을 갖는, mAb.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 mAb를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 암은 위암인, 약학 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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  16. 삭제
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