ES2646168T3 - Anticuerpos monoclonales para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal (mAb) humanizado, humano o genéticamente modificado que se une a FGFR2IIIb pero no a FGFR2IIIc e inhibe el crecimiento de un tumor humano xenoinjertado en un ratón, en donde el mAb (i) compite por la unión a FGFR2 con el anticuerpo monoclonal GAL-FR21 depositado bajo número ATTC PTA-9586, y (ii) inhibe la unión de FGF2, FGF7 y FGF10 a FGFR2IIIb.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos monoclonales para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 Declaracion de interes del gobierno

La invencion descrita en esta solicitud se realizo en parte con fondos proporcionados por Grant 5R44 CA101283-03 de los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invencion.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a la combinacion de las tecnologfas de anticuerpos monoclonales (mAb) y de ADN recombinante para el desarrollo de nuevos agentes biologicos, y mas concretamente, por ejemplo, a la produccion de anticuerpos monoclonales que se unen a, y neutralizan el Receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos 2.

Antecedentes de la invencion

Existen 22 miembros conocidos de la familia del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF), con un tamano que oscila de 17 a 34 kDa y que comparten una region nucleo interna de similitud, que se pueden agrupar en 7 subfamilias basandose en su similitud de actividad y de secuencia (Ornitz et al., Genome Biol. 2:3005.1, 2001). Por ejemplo, el subgrupo FGF1 consiste en los FGF prototfpicos, FGF1 (FGF acido) y FGF2 (FGF basico); el subgrupo FGF4 consiste en FGF4, FGF5 y FGF6; y la subfamilia FGF7 consiste en FGf3, FGF7, FGF10 y FgF22 (Zhang et al., J. Biol. Chem. 281:15694, 2006).

Una forma de FGF2 es un polipeptido no glicosilado de 18 kDa que consiste en 146 aminoacidos derivados de un precursor de 155 aa (Ornitz et al., Genome Biol. 2:3005.1,2001; Okada-Ban et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32:263, 2000). Una secuencia ilustrativa para un FGF2 de 46 aminoacidos humano se proporciona en el SEQ ID NO: 4 del documento US20020115603. A diferencia de la mayona de los otros FGF, el FGF2 no codifica una secuencia senal para la secrecion, sino que la forma de 18 kDa puede ser secretada mediante una ruta dependiente de la energfa no convencional independiente del complejo RE-Golgi. El otro miembro de la subfamilia FGF1, el propio FGF1, tiene un tamano y una estructura similares a los de FGF2 y tambien carece de secuencia senal pero puede ser secretado. Otro FGF de interes aqu es FGF7, tambien denominado factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), que es producido por las celulas de origen mesenquimal y estimula la proliferacion de celulas epiteliales (Finch et al., Adv. Cancer Res. 91:69, 2004; Finch et al., J. Natl. Cancer Inst. 98:812, 2006). El KGF es expresado en numerosos organos incluyendo pulmon, prostata, mama, tracto digestivo y piel y esta implicado en el desarrollo de los organos y en la reparacion de las heridas cutaneas (Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964, 2007).

Los miembros de la familia de FGF se unen solamente a cuatro receptores de tirosina quinasa conocidos, los Receptores del Factor de Crecimiento de Fibroblastos 1-4 (FGFR1-4) y sus isoformas, uniendose los diversos FGF a diferentes FGFR en grados variables (Zhang et al., J. Biol. Chem. 281:15694, 2006). Se proporciona una secuencia de protema de FGFR2 humano, p. ej., en GenBank Locus AF487553. Cada FGFR consiste en un dominio extracelular (ECD) que comprende tres dominios de tipo inmunoglobulina (Ig) (D1, D2 y D3), una unica helice transmembrana, y un dominio quinasa catalttico intracelular (Mohammadi et al., Cytokine Growth Factor Revs, 16:107, 2005) como se ilustra en la Fig. 1. Existe un tramo continuo de aminoacidos acidos en el conector entre D1 y D2 denominado "caja acida" (AB). Se cree que la region que contiene D1 y AB esta implicada en la autoinhibicion del receptor, que se libera mediante la union al ligando. Los FGFR se caracterizan por multiples empalmes alternativos de sus ARNm, que conducen a una variedad de isoformas (Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271:15292, 1996; Vease tambien Swiss-Prot P21802 y las isoformas P21802-1 a -20 para las secuencias de FGFR2 y sus isoformas). De manera notable, existen formas que contienen los tres dominios Ig (isoforma a) o solamente los dos dominios Ig, dominios D2 y D3 sin D1 (isoforma p). De particular importancia en FGFR1 - FGFR3, mientras todas las formas contienen la primera mitad de D3 designada IIIa, se pueden utilizar dos exones alternativos para la segunda mitad de D3, conduciendo a las formas IIIb y IIIc. Para FGFR2, estos se denominan respectivamente FGFR2IIIb y FGFR2IIIc (o solamente FGFR2b y FGFR2c); las correspondientes formas beta se denominan FGFR2(beta)IIIb y FGFR2(beta)IIIc. La forma FGFR2IIIb de FGFR2 (tambien denominada K-sam-II {Swiss-Prot se refiere a este como K-sam-IIC1?}) (vease Swiss-Prot P21802-18) es un receptor de alta afinidad tanto para FGF1 como para KGF mientras FGFR2IIIc (tambien denominado K-sam-I) (vease Swiss-Prot P21820-5) se une tanto a FGF1 como a FGF2 bien pero no se une a KGF (Miki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246, 1992). Por supuesto, FGFR2IIIb es el unico receptor para KGF (Ornitz et al., 1996, op. cit.) y por lo tanto tambien se denomina KGFR.

Los FGFR y sus isoformas se expresan diferencialmente en diferentes tejidos. Notablemente, FGFR2IIIb (y las formas IIIb de FGFR1 y FGFR3) se expresan en tejidos epiteliales, mientras FGFRIIIc se expresa en tejidos mesenquimales (Duan et al., J. Biol. Chem. 267:16076, 1992; Ornitz et al., 1996, op. cit.). Ciertos ligandos de FGF de estos receptores tienen un patron de expresion opuesto. De este modo, los miembros de la subfamilia de FGF3 incluyendo FGF7 (KGF) solamente se unen a FGFRIIIb (Zhang et al., op. cit.) y se expresan en tejidos mesenquimales de manera que pueden ser efectores paracrinos de las celulas epiteliales (Ornitz et al., 1996, op. cit). En contraste, los miembros de la subfamilia de FGF4 FGF4-6 se unen a FGFR2IIIc y se expresan en linajes

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tanto epiteliales como mesenquimales de manera que pueden tener funciones autocrinas o paracrinas. Debido a los patrones de expresion de las isoformas de FGFR2 y sus ligandos, FGFR2 juega un papel en las interacciones epiteliales-mesenquimales (Finch et al., Dev. Dyn. 203:223, 1995), de manera que no es sorprendente que la inactivacion de FGFR2IIIb en ratones conduzca a graves defectos embrionarios y letalidad (De Moerlooze et al., Development 127:483, 2000).

Ademas de unirse a FGFR1-4 con una elevada afinidad, los FGF se unen a proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG) con una baja afinidad. De hecho, la union de FGF a heparina/sulfato de heparina (HS) sobre la superficie celular es necesaria para la senalizacion a traves de los FGFR. La interaccion de FGF, especialmente FGF2, con FGFR y heparina ha sido ampliamente estudiada mediante cristalograffa de rayos X y analisis mutacional, y ahora se cree que la heparina/HS participa en la formacion de un dfmero FGF-FGFR 2:2 simetrico (Mohammadi et al., 2005), que conduce a la activacion del receptor, la autofosforilacion y la transduccion de la senal.

Los FGF median una variedad de respuestas en diferentes tipos de celulas incluyendo la proliferacion, migracion y diferenciacion, especialmente durante el desarrollo embrionario (Ornitz et al., op. cit.), y en el adulto estan implicadas en la homeostasis y la reparacion de tejidos. Por ejemplo, FGF2 estimula la proliferacion de (esto es, es mitogenico para) ciertas celulas incluyendo fibroblastos y celulas endoteliales y es un factor de supervivencia anti-apoptotico para ciertas celulas tales como celulas neurales (Okada-Ban, op. cit.). El FGF2 tambien estimula la diferenciacion (morfogenesis) y la migracion (motilidad) de celulas endoteliales (Dow et al., Urology 55:800, 2000). Varios FGF, especialmente FGF1 y FGF2, son potentes factores angiogenicos (Presta et al., Cytokine and Growth Factor Rev. 16:159, 2005).

La importancia del sistema FGF en el desarrollo ha sido destacada por el descubrimiento de numerosas mutaciones en los FGFR1-3 asociados con trastornos esqueleticos congenitos humanos incluyendo el smdrome de craniosinostosis (fusion prematura de las suturas craneales) (Wilkie et al., Cytokine GroWth Factor Revs 16:187,

2005) . Estas enfermedades geneticas son normalmente dominantes debido a que las mutaciones asociadas conducen a una ganancia de funcion, a menudo facilitando la dimerizacion del receptor. Notablemente, el trastorno de craniosinostosis grave con smdrome de Apert (AS) esta asociado con una de dos mutaciones (Ser-252 -> Trp o Pro-253 -> Arg) en la region conectora D2-D3 conservada de FGFR2 que incrementan la afinidad de union al ligando (Ibrahimi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:7182, 2001).

Se ha informado de que FGF2 y otros FGF juegan un papel en el cancer, tanto estimulando la angiogenesis como las celulas tumorales directamente (Grose et al., Cytokine Growth Factor Revs. 16:179, 2005; Presta et al., op cit.). El ARN de FGFR2IIIb es expresado en muchos tipos de tumores (Finch et al., J. Natl, Cancer Inst. 98:812, 2006), a menudo como consecuencia de su expresion en los correspondientes tejidos normales (Orr-Urtreger et al., Dev. Biol. 158:475, 1993). El KGF (FGF7) y el KGFR (FGFR2IIIb) son expresados en exceso en muchos canceres pancreaticos (Ishiwata et al., Am. J. Pathol. 153: 213, 1998), y su expresion simultanea se corresponde con una mala prognosis (Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964, 2007). Las mutaciones somaticas del gen FGFR2 se encontraron en 12% de un gran panel de carcinomas endometriales (uterinos), y en varios casos sometidos a ensayo eran requeridas para la supervivencia de las celulas tumorales (Dutt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:8713, 2008). En dos tumores se encontro que la mutacion de FGFR2 era la misma sustitucion S252W asociada con el smdrome de Apert. La amplificacion y la expresion en exceso de FGFR2 estan fuertemente asociadas con el tipo de cancer gastrico difuso, indiferenciado, que tiene una prognosis particularmente mala, y la inhibicion de la actividad de FGFR2 por compuestos de molecula pequena inhibfan potentemente la proliferacion de tales celulas cancerosas (Kunii et al., Cancer Res. 68:2340, 2008; Nakamura et al., Gastroenterol. 131:1530, 2006). El ARN de FGFR2IIIb se expresaba en 16/20 canceres epiteliales de ovario (EOC) pero no en epitelio de la superficie ovarica normal (Steele et al., Oncogene 20:5878, 2001); y los ligandos de FGFR2IIIb FGF1, FGF7 y FGF10 indujeron la proliferacion, motilidad y proteccion frente a la muerte celular en lmeas celulares de EOC (Steele et al., Growth Factors 24:45, 2006), sugiriendo que FGFR2IIIb puede contribuir al fenotipo maligno en el cancer de ovario.

Solamente se ha informado de un numero limitado de anticuerpos monoclonales para FGFR2. Fortin et al. (J. Neurosci. 25:7470, 2005) informaron sobre un anticuerpo de bloqueo para FGFR2, y Wei et al. (Hybridoma 25: 115,

2006) desarrollaron dos mAb espedficos para la forma IIIb de fGfr2 (esto es, KGFR) que inhibfan la proliferacion celular inducida por KGF. Hestir et al. (US2007/248605, 2007 comenta anticuerpos que se unen al dominio Ig3 de FGFR2. Yayon et al. (Documento WO2007/144893, 2006) describen un mAb inhibidor que se une tanto a FGFR2 como a FGFR3. R&D Systems ha comercializado desde 2005 un mAb anti-FGFR2 que neutraliza la actividad en su analisis, con preferencia para la forma IIIb. Sin embargo, no ha habido informes sobre la actividad anti-tumoral de anticuerpos contra FGFR2 in vivo.

Compendio de la invencion

En una realizacion, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal (mAb) para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2) que inhibe el crecimiento de un xenoinjerto de tumor humano en un raton. El mAb puede inhibir al menos una, y preferiblemente varias o todas las actividades biologicas del receptor, incluyendo la union al receptor por FGF2. El mAb se puede unir a cualquiera o a ambas formas FGFR2IIIb y FGFRIIIc del receptor, p. ej., a FGFR2IIIb pero no a FGFR2IIIc. Preferiblemente, el mAb de la invencion esta manipulado geneticamente, por ejemplo, quimerico, humanizado o humano. Los anticuerpos ilustrativos son GAL-FR21, GAL-

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FR22, y GAL-FR23 y sus formas quimericas y humanizadas, y los mAb que tienen el mismo epttopo o compiten por la union con uno de estos mAb. En otra realizacion se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo anti-FGFR2 manipulado geneticamente, p. ej., GAL-FR21, GAL-FR22, y GAL-FR23 quimericos o humanizados. En una tercera realizacion la composicion farmaceutica se administra a un paciente para tratar el cancer u otra enfermedad, por ejemplo cancer gastrico.

Los anticuerpos humanizados ilustrados comprenden una cadena ligera humanizada que comprende CDR de la secuencia de la Fig. 13A (GAL-FR21) y una cadena pesada humanizada que comprende CDR de la secuencia de la Fig. 13B (GAL-FR21), o comprende una cadena ligera humanizada que comprende CDR de la secuencia de la Fig. 16A (GAL-FR22) y una cadena pesada humanizada que comprende CDR de la secuencia de la Fig. 16B (GAL- FR22). Algunos anticuerpos humanizados comprenden las tres CDR de la cadena ligera mostrada en la Fig. 13A (GAL-FR21) y las tres cDr de la cadena pesada mostrada en la Fig. 13B (GAL-FR21), o comprenden las tres CDR de la cadena ligera mostradas en la Fig. 16A (GAL-FR22) y las tres CDR de la cadena pesada mostradas en la Fig. 16B (GAL-FR22). Opcionalmente, la region variable de la cadena ligera tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la secuencia mostrada en la Fig. 13A (HuGAL-FR21) y la region variable de la cadena pesada tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la secuencia mostrada en la Fig. 13B (HuGAL-FR21). En algunos de tales anticuerpos, los residuos H27, H28, H30, H48, y H67 por la numeracion de Kabat estan ocupados por el residuo que ocupa la correspondiente posicion de la cadena pesada mostrada en la Fig. 13B (GAL-FR21). Un anticuerpo humanizado preferido comprende una region variable de la cadena ligera que tiene la secuencia mostrada en la Fig. 13A (HuGAL-FR21) y una region variable de la cadena pesada que tiene la secuencia mostrada en la Fig. 13B (HuGAL-FR21).

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Diagrama esquematico de la estructura de FGFR2, que muestra los tres dominios de tipo Ig (D1, D2 y D3), el dominio transmembrana (caja negra), y el dominio quinasa intracelular. Se indican el sitio de union a heparina (HBS), la caja acida (AB) y los dominios parciales MIb/MIc alternativos. N = extremo amino, C = extremo carboxi.

Figura 2. Compendio de las propiedades de los mAb anti-FGFR2 GAL-FR21, GAL-FG22, GAL-FR23 descritos en Ejemplos.

Figura 3. ELISA de union de los mAb GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 y mIgG de control negativo para FGFR2IIIb.

Figura 4. ELISA de union de los mAb GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 y mAb de raton de control negativo 5G8 para cada una de las cuatro formas de FGFR2-FGFR2IIIb, FGFR2(beta)Iub, FGFR2(IIIc) y FGFR2(beta)IIIc - como protemas de fusion con Fc. Se utilizo una concentracion fija de cada mAb en el analisis.

Figura 5. ELISA de union competitiva para FGFR2IIIb de cada uno de los mAb GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 y mAb de raton de control negativo 5G8 contra los mAb en forma biotinilada. Se utilizo una razon 100:1 de mAb no marcado con respecto a biotinilado.

Figura 6. Citometna de flujo de la union de los mAb GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 y mAb de control negativo para FGFR2IIIb sobre celulas SNU-16 y KATO III.

Figura 7. Citometna de flujo de la union de los mAb GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 y el mAb de control negativo a celulas 293F transfectadas con FGFR2IIIc o FGFR2IIIb(S252W).

Figura 8. (A) Analisis ELISA que mide la inhibicion de la union de FGF1 (panel superior) y FGF2 (panel inferior) a FGFR2IIIb por los mAb GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23. (B) Analisis ELISA que mide la inhibicion de la union de FGF7 (panel superior) y FGF10 (panel inferior) a FGFR2IIIb por los mAb GAL-FR21 y GAL-FR22.

Figura 9. Crecimiento de xenoinjertos de tumor gastrico humano SNU-16 en ratones tratados con PBS solo, GAL- FR21, GAL-FR23 o FR2bC 54.8.11 (panel superior) o con PBS, GAL-FR22 o FR2bC 54.8.11 (panel inferior). Los mAb se administraron a 20 |jg dos veces por semana, aproximadamente 5 ratones por grupo.

Figura 10. Crecimiento de xenoinjertos de tumor gastrico humano SNU-16 (A, panel superior) u OCUM-2M (B, panel inferior) en ratones tratados con pBS solo, GAL-FR21 o GAL-FR22.

Figura 11. Elisa de union de GAL-FR21 (panel superior) o GAL-FR22 (panel inferior) a FGFR2IIIb humano y de raton.

Figura 12. ELISA de union de GAL-FR21 (panel superior) o GAL-FR22 (panel inferior) a FGFR2IIIb humano y de mono cinomolgo.

Figura 13. Las secuencias de aminoacidos de las regiones variables maduras de la cadena ligera (A) y la cadena pesada (B) de HuGAL-FR21 se muestran alineadas con regiones V aceptoras de GAL-FR21 de raton y humanas. Las CDR estan subrayadas en las secuencias de GAL-FR21, y los aminoacidos sustituidos por aminoacidos de

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raton estan doblemente subrayados en las secuencias de HuGAL-FR21. Se utilizan el codigo de aminoacidos de 1 letra y el sistema de numeracion de Kabat para la cadena tanto ligera como pesada.

Figura 14. Secuencias de aminoacidos de la cadena ligera (A) y la cadena pesada (B) del anticuerpo HuGAL-FR21 maduro completo. El primer aminoacido de cada lmea esta numerado; la numeracion es secuencial. En la cadena ligera, el primer aminoacido de la region Ck esta subrayado, y en la cadena pesada, los primeros aminoacidos de las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3 estan subrayados.

Figura 15. Union competitiva de mAb HuGAL-FR21 humanizado y GAL-FR21 de raton y anticuerpo hIgG humano de control, llevada a cabo como se describe en la memoria.

Figura 16. Secuencias de aminoacidos de las regiones variables maduras de la cadena ligera (A) y la cadena pesada (B) de HuGAL-FR22, con las CDR subrayadas. Se utilizan el codigo de aminoacidos de 1 letra y el sistema de numeracion de Kabat para la cadena tanto ligera como pesada.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

La invencion proporciona anticuerpos monoclonales (mAb) anti-FGFR2 que inhiben las actividades biologicas de FGFR2 y/o inhiben el crecimiento de un xenoinjerto de tumor que expresa FGFR2 en un raton, composiciones farmaceuticas que comprenden los mAb, y metodos de utilizacion de las mismas para el tratamiento de enfermedades.

1. Anticuerpos

Los anticuerpos son moleculas complejas, muy grandes (peso molecular de ~150.000 o aproximadamente 1320 aminoacidos) con una estructura interna intrincada. Una molecula de anticuerpo natural contiene dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, teniendo cada par una cadena ligera y una cadena pesada. Cada cadena ligera y cadena pesada consiste a su vez en dos regiones: una region variable ("V") implicada en la union del antfgeno diana, y una region constante ("C") que interacciona con otros componentes del sistema inmunitario. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada estan juntas en el espacio tridimensional para formar una region variable que se une al antfgeno (por ejemplo, un receptor sobre la superficie de una celula). Dentro de cada region variable de la cadena ligera o pesada, existen tres segmentos cortos (con un promedio de 10 aminoacidos de longitud) denominados regiones determinantes de la complementariedad ("CDR"). Las seis CDR de un dominio variable de anticuerpo (tres de la cadena ligera y tres de la cadena pesada) se pliegan juntas en el espacio tridimensional para formar el sitio de union del anticuerpo real que se cierra sobre el antfgeno diana. La posicion y la longitud de las CDR han sido definidas con precision por Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987. La parte de una region variable no contenida en las CDR se denomina marco, que forma el entorno para las CDR.

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo manipulado geneticamente en el que las CDR de un anticuerpo de raton ("anticuerpo donador", que tambien puede ser de rata, hamster u otra especie no humana) son injertadas sobre un anticuerpo humano ("anticuerpo aceptor"). La secuencia del anticuerpo aceptor puede ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpo humano maduro, una secuencia consenso de secuencias de anticuerpos humanos, o una secuencia de la region de la lmea germinal. De este modo, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene CDR de un anticuerpo donador y un marco de la region variable y regiones constantes de un anticuerpo humano. Ademas, con el fin de conservar la elevada afinidad de union, se puede emplear al menos uno de dos elementos estructurales adicionales. Veanse, las Patentes de los Estados Unidos Nums. 5.530.101 y 5.585.089, que proporcionan instrucciones detalladas para la construccion de anticuerpos humanizados. Aunque los anticuerpos humanizados a menudo incorporan las seis CDR (preferiblemente como define Kabat, pero alternativamente por otras definiciones, tales como la de Chothia) de un anticuerpo de raton, tambien se pueden elaborar con menos que las CDR completas de un anticuerpo de raton (p. ej., Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002); Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, (2002); Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, (2000).

De un modo similar, puede ser necesario incorporar solamente parte de las CDR, a saber el subgrupo de residuos de las CDR requerido para la union, denominados SDR, al anticuerpo humanizado. Los residuos de la CDR que no contactan con el antfgeno y que no estan en los SDR se pueden identificar basandose en estudios previos (por ejemplo los residuos H60-H65 de CDRH2 a menudo no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de los bucles hipervariables de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), mediante modelado molecular y/o empmcamente, o como describen Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. En tales anticuerpos humanizados en las posiciones en las que uno o mas residuos de la CDR del donando estan ausentes, el aminoacido que ocupa la posicion puede ser un aminoacido que ocupa la correspondiente posicion (por la numeracion de Kabat) en la secuencia del anticuerpo aceptor. El numero de tales sustituciones que se van a incluir refleja un equilibrio de consideraciones contradictorias. Tales sustituciones son potencialmente ventajosas al disminuir el numero de aminoacidos de raton en un anticuerpo humanizado y, por consiguiente, al disminuir la inmunogenicidad potencial. No obstante, las sustituciones tambien pueden ocasionar cambios de afinidad, y

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preferiblemente se evitan las reducciones significativas en la afinidad. Las posiciones para la sustitucion en las CDR y los aminoacidos a sustituir tambien se pueden seleccionar empfticamente.

De este modo, tipicamente un anticuerpo humanizado comprende (i) una cadena ligera que comprende CDR (a menudo tres CDR) de un anticuerpo de raton, p. ej., GAL-FR21, un marco de la region variable humana, y una region constante humana; y (ii) una cadena pesada que comprende CDR (a menudo tres CDR) del anticuerpo de raton, p. ej., GAL-FR21, un marco de la region variable humana, y una region constante humana. Los marcos de la region variable de la cadena ligera y pesada pueden ser cada uno una secuencia de anticuerpo humano maduro, una secuencia consenso de secuencias de anticuerpos humanos, o una secuencia de una region de la lrnea germinal.

En el primer elemento estructural, el marco de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado se selecciona para que tenga una identidad de secuencia maxima (entre 65% y 95%) con el marco de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo donador, mediante la seleccion adecuada del anticuerpo aceptor entre los muchos anticuerpos humanos conocidos. En el segundo elemento estructural, al construir el anticuerpo humanizado, los aminoacidos seleccionados del marco del anticuerpo aceptor humano (fuera de las CDR) se remplazan por los correspondientes aminoacidos del anticuerpo donador, de acuerdo con reglas especificadas. Espedficamente, los aminoacidos que se van a remplazar en el marco se seleccionan basandose en su capacidad para interaccionar con las CDR. Por ejemplo, los aminoacidos remplazados pueden ser adyacentes a una CDR de la secuencia del anticuerpo donador o estar a 4-6 angstroms de una CDR del anticuerpo humanizado segun se mide en el espacio tridimensional.

Un anticuerpo quimerico es un anticuerpo en el que la region variable de un anticuerpo de raton (u otro roedor) se combina con la region constante de un anticuerpo humano; su construccion por medio de manipulacion genetica es bien conocida. Tales anticuerpos conservan la especificidad de union del anticuerpo de raton, a la vez que es aproximadamente dos tercios humano. La proporcion de secuencia no humana presente en los anticuerpos de raton, quimericos y humanizados sugiere que la inmunogenicidad de los anticuerpos quimericos es intermedia entre la de los anticuerpos de raton y humanizados. Otros tipos de anticuerpos manipulados geneticamente que pueden tener una inmunogenicidad reducida con respecto a los anticuerpos de raton incluyen anticuerpos humanos elaborados utilizando metodos de presentacion en fagos (Dower et al., documento WO91/17271; McCafferty et al., documento WO92/001047; Winter, documento WO92/20791; y Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998) o utilizando animales transgenicos (Lonberg et al., documento WO93/12227; Kucherlapati documento WO91/1074l).

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino anticuerpo "de tipo humano" hace referencia a un mAb en el que una porcion sustancial de la secuencia de aminoacidos de una o ambas cadenas (p. ej., aproximadamente 50% o mas) se origina a partir de genes de inmunoglobulina humana. Por lo tanto, los anticuerpos de tipo humano abarcan, pero no se limitan a, anticuerpos quimericos, humanizados y humanos. Segun se utiliza en la presente memoria, un mAb con "inmunogenicidad reducida" es aquel que se espera que tenga significativamente menos inmunogenicidad que un anticuerpo de raton cuando se administra a pacientes humanos. Tales anticuerpos incluyen mAb quimericos, humanizados y humanos asf como mAb elaborados remplazando aminoacidos espedficos en los anticuerpos de raton que pueden contribuir a epftopos de las celulas B o T, por ejemplo residuos expuestos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991). Segun se utiliza en la presente memoria, un mAb "manipulado geneticamente" es aquel para el cual se han construido los genes o se ha colocado en un entorno no natural (p. ej., genes humanos en un raton o un bacteriofago) con la ayuda de tecnicas de ADN recombinante, y por lo tanto no incluina, p. ej., un mAb de raton elaborado con tecnologfa de hibridoma convencional.

Tambien se podnan utilizar otros enfoques para disenar anticuerpos humanizados para lograr el mismo resultado que los metodos de la Patente de los Estados Unidos Num. 5.530.101 y 5.585.089 descritas anteriormente, por ejemplo, "superhumanizacion" (veanse Tan et al. J. Immunol. 169: 1119, 2002, y Patente de los Estados Unidos Num. 6.881.557) o el metodo de Studnicak et al., Protein Eng. 7:805, 1994. Por otra parte, otros enfoques para producir mAb con inmunogenicidad reducida, manipulados geneticamente incluyen "remodelacion", "hiperquimerizacion" y acondicionamiento de la superficie ("veneering/resurfacing"), como se describe, p. ej., en Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105, 1998; Roguska et al. Protein Eng. 9:895, 1996; y en las Patentes de los Estados Unidos Nums. 6.072.035 y 5.639.641.

El epftopo de un mAb es la region de su antfgeno a la cual se une el mAb. Dos anticuerpos se unen al mismo epftopo o a un epftopo solapante si cada uno inhibe competitivamente (bloquea) la union del otro al antfgeno. Esto es, un exceso de 1x, 5x, 10x, 20x o 100x de un anticuerpo inhibe la union del otro al menos en 50%, pero preferiblemente 75%, 90% o incluso 99% segun se mide en un analisis de union competitiva (vease, p. ej., Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epftopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoacidos en el antfgeno que reducen o eliminan la union de un anticuerpo, reducen o eliminan la union del otro. Dos anticuerpos tienen epftopos solapantes si algunas mutaciones de aminoacidos que reducen o eliminan la union de un anticuerpo, reducen o eliminan la union del otro.

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2. Anticuerpos anti-FGFR2

Se dice que un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une a FGFR2 (esto es, un mAb anti-FGFR2) neutraliza FGFR2, o es neutralizador (o inhibidor o antagonista), si la union inhibe parcialmente o completamente una o mas actividades biologicas de FGFR2. Entre las actividades biologicas de FGFR2 que puede inhibir o bloquear un anticuerpo neutralizador se encuentra la capacidad de FGFR2 para unirse a uno o mas o todos sus ligandos FGF, p. ej. FGF1 y/o FGF2. Para FGFRIIIb estos ligandos incluyen FGFl, FGF7 (KGF) y los otros miembros de la subfamilia de FGF7, FGF3, FGF10 y FGF22. Para FGFRIIIc estos ligandos incluyen FGF1 y FGF2; FGF4 y los otros miembros de la subfamilia de FGf4, FGF5 y FGF6; FGF8 y los otros miembros de la subfamilia de FGF8, FGF17 y FGF18; y FGF9 y los otros miembros de la subfamilia de FGF9, FGF16 y FGF20. Otra actividad importante de FGFR2 que puede ser inhibida por un mAb anti-FGFR2 neutralizador es la estimulacion de la proliferacion de celulas, p. ej., celulas epiteliales o endoteliales, fibroblastos, celulas tales como celulas Ba/F3 en las cuales se ha transfectado FGFR2, y diversas celulas tumorales humanas. Otras actividades inhibibles por un mAb anti-FGFR2 neutralizador son la estimulacion de la diferenciacion y migracion de celulas tales como celulas endoteliales, y la induccion de angiogenesis, por ejemplo como se mide mediante estimulacion de la proliferacion de celulas endoteliales vasculares humanas (HUVEC) o la formacion de tubo o mediante la induccion de vasos sangumeos cuando se aplica a membrana corioalantoica (CAM) de embrion de pollo. Normalmente, el mAb neutralizador inhibe estas actividades cuando es inducido por uno o mas de los FGF enumerados anteriormente. De un modo similar, el mAb inhibe preferiblemente toda o parte de la ruta de transduccion de la senal estimulada por la union de un ligando FGF a FGFR2 (Dailey et al., Cytokine Growth Factor Revs 16:233, 2005), p. ej., fosforilacion de FGFR2 y MAP quinasas aguas abajo.

Un mAb neutralizador de la invencion a una concentracion, p. ej., de 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 o 50 g/ml inhibe una funcion biologica de FGFR2 aproximadamente al menos 50% pero preferiblemente 75%, mas preferiblemente 90% o 95% o incluso 99%, y muy preferiblemente aproximadamente 100% (esencialmente completamente o sin distincion de un control negativo que carece de FGFR2) analizada mediante metodos descritos en el apartado Ejemplos o conocidos en la tecnica. Tfpicamente, el grado de inhibicion se mide cuando la cantidad de ligando FGF utilizada es suficiente para estimular completamente la actividad biologica, o es 1, 2, o 5 ng/ml o 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 3 o 10 g/ml. Preferiblemente, el mAb es neutralizador, esto es, inhibe la actividad biologica, cuando se utiliza como un unico agente, pero opcionalmente se pueden utilizar 2 mAbs juntos para proporcionar la inhibicion. Muy preferiblemente, el mAb neutraliza no solo una sino dos, tres o varias de las actividades biologicas enumeradas mas arriba; para los fines de la presente memoria, un mAb anti-FGFR2 que utiliza un unico agente que neutraliza todas las actividades biologicas de FGFR2 se denomina "completamente neutralizador", y tales mAb son los mas preferibles.

La descripcion proporciona mAb neutralizadores que se unen a FGFR2IIIb pero se unen peor o de manera no detectable a FGFRIIIc, o alternativamente se unen a FGFR2IIIc pero peor o de manera no detectable a FGFRIIIb, o una tercera alternativa se une tanto a FGFR2IIIb como a FGFR2IIIc, y el uso de cualquiera de estos tipos de anticuerpos en una composicion farmaceutica, especialmente para el tratamiento del cancer u otras enfermedades. La descripcion tambien proporciona mAb, neutralizadores o no neutralizadores, que se unen a FGFR2 en una o mas de sus formas e inhiben, preferiblemente por completo, el crecimiento de un xenoinjerto de tumor que expresa FGFR2, p. ej., un xenoinjerto SNU-16 u OCUM-2M. Semejante mAb puede inhibir el crecimiento tumoral, p. ej., transmitiendo una senal de crecimiento negativa o una senal pro-apoptotica a traves de FGFR2. Los mAb descritos en la presente memoria son preferiblemente espedficos para FGFR2 o se unen a el preferentemente, esto es, no se unen, o solamente se unen en un grado mucho menor (p. ej., al menos 10 veces menos), a protemas relacionadas con FGFR2 tales como otros receptores de FGF, FGFR1, FGFR3 y FGFR4 asf como a otras tirosina quinasas receptoras de membrana. Por otra parte, en algunos casos, se prefieren los mAb que se unen a uno o mas de los otros receptores de FGF ademas de a FGFR2. Los mAb descritos en la presente memoria tienen tfpicamente una afinidad de union (constante de asociacion Ka) para FGFR2 de al menos 107 M"1 pero preferiblemente 108 M"1 o superior, y muy preferiblemente 109 M"1 o superior o incluso 1010 M"1 o superior. Los mAb que muestran una union diferencial o preferencial a una forma de FGFR o FGFR2 sobre otra, muestran preferiblemente una preferencia de al menos cinco, diez o cien veces entre las formas, p. ej., medida por medio de Ka. La carencia de union entre un anticuerpo y un antfgeno (esto es, el anticuerpo no se une al antfgeno) significa que cualquier senal de una reaccion de union intentada entre los dos es indistinguible de un control negativo, p. ej., en el que el anticuerpo o el antfgeno estan ausentes o han sido remplazados por un agente inactivo.

Algunos mAb descritos en la presente memoria se unen tanto a FGFR2 humano como a FGFR2 de raton, o se unen a FGFR2 humano y a uno, dos o mas de todos los FGFR2 de raton, rata, conejo, pollo, perro y/o mono (p. ej., mono cinomolgo). En algunos casos, el mAb se une a FGFR2 de raton (p. ej., FGFR2IIIb de raton) con una afinidad (esto es, Ka) de 2, 10 o 100 veces la afinidad por el FGFR2 humano; de un modo similar el mAb se puede unir a FGFR2 de mono cinomolgo y/o chimpance (p. ej., FGFR2IIIb) con una afinidad de 2 o 10 veces la afinidad por el FGFR2 humano o incluso sustancialmente la misma o sin distincion de la union a FGFR2 humano (esto es, dentro del error experimental). Otros mAb son espedficos solo para FGFR2 humano.

Los mAb de la invencion incluyen anticuerpos anti-FGFR2 en su forma tetramerica natural (2 cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas) y pueden ser de cualquiera de los isotipos conocidos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE y sus subtipos, esto es, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas e IgG1, IgG2a, IgG2b, e IgG3 de raton. Los mAb de la invencion tambien

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incluyen fragmentos de anticuerpos tales como Fv, Fab y F(ab')2; anticuerpos tubridos bifuncionales (p. ej., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987), anticuerpos de cadena sencilla (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); anticuerpos de un solo brazo (Nguyen et al., Cancer Gene Ther. 10:840, 2003); y anticuerpos con regiones constantes alteradas (p. ej., Patente de los Estados Unidos Num. 5.624.821). Los mAb pueden ser de origen animal (p. ej., raton, rata, hamster o pollo), o pueden estar manipulados geneticamente. Los mAb de roedor se elaboran mediante metodos convencionales, que comprenden inmunizacion multiple con FGFR2 en un coadyuvante apropiado i.p., i.v., o en la almohadilla plantar, seguido de extraccion de celulas del bazo o de ganglio linfatico y fusion con una lrnea celular inmortalizada adecuada, y a continuacion seleccion para determinar los hibridomas que producen anticuerpo que se une a FGFR2, p. ej., vease en los Ejemplos mas abajo. Los mAb quimericos y humanizados, elaborados mediante metodos conocidos en la tecnica mencionados mas arriba, son realizaciones preferidas de la invencion. Tambien se prefieren los anticuerpos humanos elaborados, p. ej., mediante presentacion en fagos o metodos con ratones transgenicos (veanse, p. ej., Dower et al., McCafferty et al., Winter, Lonberg et al., Kucherlapati, mas arriba).

Los mAb anti-FGFR2 GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 se describen a continuacion. Una vez que se ha aislado un mAb anti-FGFR2 arquetipico, individual, por ejemplo GAL-FR21, que tiene las propiedades deseadas descritas en la presente memoria de neutralizacion de FGFR2, es sencillo generar otros mAb con propiedades similares, p. ej., que tengan el mismo epftopo, utilizando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones con FGFR2 como se ha descrito anteriormente, producir hibridomas, y escrutar los mAb resultantes para determinar la capacidad para competir con el mAb arquetfpico por la union a FGFR2. Los ratones tambien pueden ser inmunizados con un fragmento mas pequeno de FGFR2 que contiene el epftopo al cual se une el mAb arquetipico. El epftopo puede ser localizado, p. ej., escrutando para determinar la union a una serie de peptidos solapantes que abarcan FGFR2. Alternativamente, se puede utilizar el metodo de Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994 para guiar la seleccion de mAb que tienen el mismo epftopo y por lo tanto propiedades similares a las del mAb arquetfpico, p. ej., GAL-FR21. Utilizando la presentacion en fagos, primero la cadena pesada del anticuerpo arquetfpico se empareja con un repertorio de cadenas ligeras (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb que se una a FGFR2, y a continuacion la nueva cadena ligera se empareja con un repertorio de cadenas pesadas (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb que se una a FGFR2 que tenga el mismo epftopo que el mAb arquetfpico. Alternativamente se pueden obtener variantes, p. ej., de GAL-FR21 mediante mutagenesis de ADNc que codifica las cadenas pesada y ligera de GAL-FR21.

Los mAbs con el mismo epftopo o un epftopo solapante con GAL-FR21, GAL-FG22 o GAL-FR23, p. ej., que compiten por la union a FGFR2 con el respectivo mAb, proporcionan otro ejemplo. Una forma quimerica o humanizada de GAL-FR21, GAL-FG22 o GAL-FR23 es un ejemplo especialmente preferido. Tambien se describen en la presente memoria mAb que son identicos en 90%, 95% o 99% a GAL-FR21, GAL-FG22 o GAL-FR23 en una secuencia de aminoacidos de las regiones variables de la cadena pesada y/o ligera (sin incluir la secuencia senal) y mantienen sus propiedades funcionales, y/o difieren del respectivo mAb en un pequeno numero de sustituciones de aminoacidos funcionalmente irrelevantes (p. ej., sustituciones conservativas), deleciones, o inserciones. Tambien se describen mAb que tienen al menos una y preferiblemente las seis CDR que son identicas en 90%, 95% o 99% o 100% a las correspondientes CDR de gAl-FR21, GAL-FG22 o GAL-FR23. Aqrn, como en otros lugares de esta solicitud, todos los porcentajes de identidad se determinan con secuencias de anticuerpos maximamente alineadas por medio de la convencion de la numeracion de Kabat. Despues del alineamiento, si una region del anticuerpo sujeto (p. ej., la region variable madura completa de una cadena pesada o ligera) se esta comparando con la misma region de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones de los anticuerpos sujeto y de referencia es el numero de posiciones ocupadas por el mismo aminoacido en la region del anticuerpo tanto sujeto como de referencia dividido por el numero total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contar los huecos, multiplicado por 100 para convertirlo en porcentaje.

Con el fin de clasificar las sustituciones de aminoacidos como conservativas o no conservativas, los aminoacidos se pueden agrupar como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrofobas); met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales alcalinas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la conformacion de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromaticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativas implican sustituciones entre aminoacidos del mismo grupo. Las sustituciones no conservativas constituyen el intercambio de un miembro de uno de estos Grupos por un miembro de otro.

Los mAb nativos de la invencion se pueden producir a partir de sus hibridomas. Los mAb manipulados geneticamente, p. ej., mAb quimericos o humanizados, pueden ser expresados por una variedad de metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los genes que codifican las regiones V de sus cadenas ligera y pesada se pueden sintetizar a partir de oligonucleotidos solapantes e insertar junto con regiones C disponibles en vectores de expresion (p. ej., asequibles comercialmente de Invitrogen) que proporcionan las regiones reguladoras necesarias, p. ej., promotores, intensificadores, sitios poli A, etc. Se prefiere el uso del promotor-intensificador de CMV. Los vectores de expresion se pueden transfectar a continuacion utilizando diversos metodos bien conocidos tales como lipofeccion o electroporacion en una variedad de lrneas celulares de mamfero tales como CHO o mielomas no productores incluyendo Sp2/0 y NSO, y celulas que expresan los anticuerpos seleccionados mediante seleccion con antibioticos apropiada. Vease, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Num. 5.530.101. Se pueden producir cantidades mas grandes de anticuerpo haciendo crecer las celulas en biorreactores disponibles en el mercado.

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Una vez expresados, los mAb u otros anticuerpos de la invencion se pueden purificar de acuerdo con procedimientos convencionales de la tecnica tales como microfiltracion, ultrafiltracion, cromatograffa de afinidad con protema A o G, cromatograffa de exclusion por tamanos, cromatograffa de intercambio anionico, cromatograffa de intercambio cationico y/u otras formas de cromatograffa de afinidad basadas en colorantes organicos o similares. Se prefieren anticuerpos sustancialmente puros con una homogeneidad de al menos aproximadamente 90 o 95% p/p, y los mas preferidos con una homogeneidad de 98% o 99% p/p o mas, para usos farmaceuticos.

3.- Metodos de Tratamiento

La invencion proporciona metodos de tratamiento en los que el mAb de la invencion (esto es, un mAb anti-FGFR2) se administra a pacientes que tienen una enfermedad (tratamiento terapeutico) o con riesgo de aparicion o recurrencia de una enfermedad (tratamiento profilactico). El termino "paciente" incluye pacientes humanos; pacientes veterinarios, tales como gatos, perros y caballos; animales de granja, tales como ganado vacuno, ovejas, y cerdos; y animales de laboratorio utilizados con fines de ensayo, tales como ratones y ratas. Los metodos son particularmente aptos para el tratamiento de pacientes humanos. El mAb utilizado en los metodos de tratamiento de pacientes humanos se une a la protema FGFR2 humana, cuya secuencia es proporcionada por GenBank Locus AF487553. Las citas de otros FGFR o FGF referidos en esta descripcion se proporcionan en la seccion Antecedentes. Tambien se puede utilizar un mAb para una protema humana en otras especies en las que el homologo de especie tiene reactividad cruzada antigenica con la protema humana. En especies que carecen de semejante reactividad cruzada, se utiliza un anticuerpo con especificidad apropiada por el homologo de especie presente en esa especie. No obstante, en experimentos de xenoinjerto en animales de laboratorio, se utiliza generalmente un mAb con especificidad por la protema humana expresada por el xenoinjerto.

En una realizacion preferida, la presente invencion proporciona una formulacion farmaceutica que comprende los anticuerpos descritos en la presente memoria. Las formulaciones farmaceuticas contienen el mAb en un portador fisiologicamente aceptable, opcionalmente con excipientes o estabilizadores, en forma de soluciones liofilizadas o acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores adecuados no son toxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, o acetato a un pH ffpicamente de 5,0 a 8,0, muy a menudo de 6,0 a 7,0; sales tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, etc. para alcanzar la isotonicidad; antioxidantes, conservantes, polipeptidos de bajo peso molecular, protemas, polfmeros hidrofilos tales como polisorbato 80, aminoacidos tales como glicina, carbohidratos, agentes quelantes, azucares, y otros ingredientes convencionales conocidos por los expertos en la tecnica (Remington's Pharmaceutical Science 16a edicion, Osol, A. Ed. 1980). El mAb esta ffpicamente presente a una concentracion de 0,1 - 100 mg/ml, p. ej., 1 - 10 mg/ml o 10 - 50 mg/ml, por ejemplo 5, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 mg/ml.

En otra realizacion preferida, la invencion proporciona un metodo de tratamiento de un paciente con una enfermedad utilizando un mAb anti-FGFR2 en una formulacion farmaceutica. El mAb preparado en una formulacion farmaceutica se puede administrar a un paciente mediante cualquier ruta adecuada, especialmente parenteralmente mediante infusion intravenosa o inyeccion en embolada, intramuscularmente o subcutaneamente. La infusion intravenosa se puede administrar a lo largo de tan poco como 15 minutos, pero mas a menudo durante 30 minutos, o a lo largo de 1, 2 o incluso 3 horas. El mAb tambien se puede inyectar directamente en el sitio de la enfermedad (p. ej., un tumor), o encapsular en agentes portadores tales como liposomas. La dosis administrada es suficiente para aliviar al menos parcialmente la afeccion que esta siendo tratada (dosis "terapeuticamente eficaz") y opcionalmente de 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 mg/kg, pero puede ser tan alta como 0,1 o 1 a 10 mg/kg o incluso de 1 a cualquiera de 15, 20 o 30 mg/kg. Tambien se puede administrar una dosis unitaria fija, por ejemplo, 100, 200, 500, 1000 o 2000 mg, o la dosis se puede basar en el area de superficie del paciente, p. ej., 1000 mg/m2. Normalmente se administran entre 1 y 8 dosis, (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) para tratar el cancer, pero se pueden suministrar 10, 20 o mas dosis. El mAb se puede administrar diariamente, bisemanalmente, semanalmente, en semanas alternas, mensualmente o a algun otro intervalo, dependiendo, p. ej. de la vida media del mAb, durante 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3-6 meses o mas. Tambien son posibles cursos repetidos de tratamiento, como es la administracion cronica.

Una combinacion de una dosis, una frecuencia de administracion y una ruta de administracion eficaces para aliviar al menos parcialmente una enfermedad presente en un paciente que esta siendo tratado es referida como regimen terapeuticamente eficaz. Una combinacion de una dosis, una frecuencia de administracion y una ruta de administracion eficaces para inhibir o retrasar el comienzo de una enfermedad en un paciente es referida como regimen profilacticamente eficaz.

Las enfermedades especialmente susceptibles de tratamiento con los mAb anti-FGFR2 de la invencion incluyen tumores solidos que se cree que requieren angiogenesis o estan asociados con niveles detectables o preferiblemente elevados de FGFR2 y/o un FGF, por ejemplo cancer de ovario, cancer de endometrio, cancer de mama, cancer de pulmon (de celulas pequenas o de celulas no pequenas), cancer de colon, cancer de prostata, cancer de cuello de utero, cancer de pancreas, cancer gastrico, cancer de esofago, carcinoma hepatocelular (cancer de hffgado), carcinoma de celulas renales (cancer de rinon), tumores de cabeza y cuello, mesotelioma, melanoma, sarcomas, y tumores cerebrales (p. ej., gliomas, tales como glioblastomas). Se pueden medir niveles elevados a nivel de protema o ARNm en tejido canceroso en relacion con niveles comparables de FGFR2 (p. ej., FGFR2IIIb) o FGF (p. ej., FGF2, FGF7 o FGF10) en relacion con niveles comparables del respectivo FGFR2 o FGF en tejido

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normal tal como tejido no canceroso del mismo tejido, preferiblemente del mismo paciente. De un modo similar se pueden medir niveles detectables a nivel de protema o ARNm en tejido canceroso y compararlos con niveles de fondo en muestras de control en las cuales se sabe que el analito (p. ej., FGFR2 o FGF) esta ausente o en relacion con controles negativos en los cuales la deteccion se realiza utilizando un anticuerpo o cebador o sonda que se sabe que no se une al analito o al acido nucleico que codifica el analito. Leucemias, linfomas, mieloma multiple y otras malignidades hematologicas, especialmente cualquiera de estos canceres que tenga un aumento de expresion de FGFR2 y/o FGF, tambien pueden ser susceptibles de tratamiento con los mAb anti-FGFR2. Otras enfermedades asociadas con la angiogenesis para las cuales el tratamiento con los mAb anti-FGFR2 de la invencion son adecuados incluyen degeneracion macular asociada con la edad (DMAE), retinopatfa diabetica, glaucoma neovascular y otras enfermedades del ojo; psoriasis y otras enfermedades de la piel; artritis reumatoide; y trastornos esqueleticos geneticos asociados con mutaciones en el FGFR2, p. ej., smdrome de Apert, como se ha descrito anteriormente.

En una realizacion preferida, el mAb anti-FGFR2 se administra combinado con (esto es, junto con, esto es, antes, durante o despues de) otra terapia. Por ejemplo, para tratar el cancer, se puede administrar el mAb anti-FGFR2 junto con uno cualquiera o mas de los farmacos quimioterapeuticos conocidos, por ejemplo agentes alquilantes tales como carmustina, clorambucilo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, procarbazina, y ciclofosfamida; antimetabolitos tales como fluorouracilo, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, metotrexato e hidroxiurea; productos naturales incluyendo alcaloides y antibioticos de plantas tales como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, etoposido, mitomicina, mitoxantrona, vinblastina, vincristina, y Taxol (paclitaxel) o compuestos relacionados tales como Taxotere®; el inhibidor de topoisomerasa 1 irinotecan; agentes espedficamente aprobados para tumores cerebrales incluyendo obleas de temozolomida y Gliadel® que contienen carmustina; e inhibidores de tirosina quinasas tales como Gleevec®, Sutent® (sunitinib malato), Nexavar® (sorafenib) y Tarceva® (erlotinib) o Iressa® (gefitinib); inhibidores de la angiogenesis; y todos los agentes anti-cancerosos aprobados y experimentales enumerados en el documento WO 2005/017107 A2. El mAb anti-FGFR2 se puede utilizar combinado con 1, 2, 3 o mas de estos otros agentes utilizados en un regimen quimioterapeutico convencional. Normalmente, los otros agentes son aquellos ya conocidos por ser eficaces para el tipo concreto de cancer que se este tratando. El mAb anti-FGFR2 es especialmente util para superar la resistencia a farmacos quimioterapeuticos y aumentar de ese modo su eficacia.

Otros agentes con los cuales se puede administrar el mAb anti-FGFR2 para tratar el cancer incluyen agentes biologicos tales como anticuerpos monoclonales, incluyendo Herceptin™ contra el antfgeno HER2; Avastin® contra VEGF; o anticuerpos para el receptor del Factor de Crecimiento Epidermico (EGF) tales como Erbitux® (cetuximab) y Vectibix® (panitumumab). Los anticuerpos contra el Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) son especialmente preferidos para su uso con el mAb anti-FGFR2, incluyendo el mAb L2G7 (Kim et al., Clin Cancer Res 12:1292, 2006 y la Patente de los Estados Unidos Num. 7.220.410) y concretamente sus formas quimericas y humanizadas tales como HuL2G7 (documento WO 07115049 A2); los mAb anti-HGF humano descritos en el documento WO 2005/017107 A2, concretamente 2.12.1; y las protemas de union a HGF descritas en el documento WO 07143090 A2 o el documento WO 07143098 A2; y otros mAb anti-HGF neutralizadores que compiten por la union con cualquiera de los mAbs anteriormente mencionados. Tambien se prefiere un mAb que se une al receptor cMet de HGF, por ejemplo el mAb anti-cMet OA-5D5 (Martens et al., Clin. Cancer Res. 12:6144, 2006) que ha sido manipulado geneticamente para que tenga solamente un "brazo", esto es el dominio de union. Los anticuerpos contra los otros receptores FGFR FGFR1, 3, 4 o contra varios FGF tales como FGF1, FGF2 y FGF7 tambien se prefieren para su uso combinado con el mAb anti-FGFR2. Por otra parte, se puede utilizar el mAb anti-FGFR2 junto con cualquier forma de cirugfa y/o terapia de radiacion incluyendo radiacion externa, terapia con radiacion de intensidad modulada (IMRT) y cualquier forma de radiocirugfa tal como, p. ej., Gamma Knife.

El tratamiento (p. ej., quimioterapia convencional) que incluye el anticuerpo mAb anti-FGFR2 puede aliviar una enfermedad incrementando el tiempo de supervivencia libre de progreso medio o de supervivencia global de pacientes con cancer al menos 30% o 40% pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o incluso 100% o mas, en comparacion con el mismo tratamiento (p. ej., quimioterapia) pero sin el mAb anti-FGFR2. Ademas o alternativamente, el tratamiento (p. ej., quimioterapia convencional) que incluye el mAb anti-FGFR2 puede incrementar la tasa de respuesta completa, la tasa de respuesta parcial, o la tasa de respuesta objetivo (completa + parcial) de pacientes con estos tumores (p. ej., de ovario, de endometrio, de pancreas, de mama, de pulmon, de colon y glioblastomas especialmente cuando es reincidente o refractario) al menos 30% o 40% pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o incluso 100% en comparacion con el mismo tratamiento (p. ej., quimioterapia) pero sin el mAb anti-FGFR2.

Tfpicamente, en una prueba clmica (p. ej., una prueba en fase II, fase II/III o fase III), los incrementos anteriormente mencionados en la supervivencia libre de progreso media y/o la tasa de respuesta de los pacientes tratados con quimioterapia mas el mAb anti-FGFR2, con respecto al Grupo de control de pacientes que reciben quimioterapia solamente (o mas placebo), son estadfsticamente diferentes, por ejemplo a un nivel de p = 0,05 o 0,01 o incluso 0,001. Las tasas de respuesta completa y parcial se determinan por medio de criterios objetivos comunmente utilizados en pruebas clmicas para el cancer, p. ej., como los enumerados o aceptados por el Instituto Nacional del Cancer y/o la Administracion de Alimentos y Farmacos.

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4. Otros metodos

Los mAb anti-FGFR2 de la invencion tambien encuentran uso en metodos de diagnostico, pronostico y de laboratorio. Se pueden utilizar para medir el nivel de FGFR2 en un tumor o en la circulacion de un paciente con un tumor, y por lo tanto para seguir y guiar el tratamiento del tumor. Por ejemplo, un tumor asociado con niveles elevados de FGFR2 (p. ej., incrementado con respecto a una muestra no cancerosa del mismo tejido del mismo paciente) es especialmente susceptible de tratamiento con un mAb anti-FGFR2. En realizaciones particulares, se pueden utilizar los mAb en un ELlSA o un radioinmunoanalisis para medir el nivel de FGFR2, p. ej., en suero, o en inmunohistoqmmica para localizar la expresion de FGFR2, p. ej., en un especimen de biopsia de tumor. El uso de dos mAb anti-FGFR2 que se unen a diferentes epttopos (esto es, que no compiten por la union) es especialmente util en el desarrollo de un ELISA "sandwich" sensible para detectar el FGFR2. Para diversos analisis, el mAb puede estar marcado con moleculas fluorescentes, moleculas con marca de espm, enzimas o radioisotopos, y puede ser proporcionado en forma de kit con todos los reactivos necesarios para realizar el analisis para FGFR2. En otros usos, se utilizan los mAb anti-FGFR2 para purificar FGFR2, p. ej., mediante cromatograffa de afinidad.

Ejemplos

Ejemplo 1: Reactivos y analisis

Preparacion de Flag-FGF1, FLAG-FGF2, y FLAG-FGF7. Las secuencias de ADN para el FGF1 humano (la forma con 155 aminoacidos; Chiu et al., Oncogene 5:755-1990) y el FGF2 humano (la forma con 155 aminoacidos; Sommer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 144:543, 1987) se sintetizaron (GenScript, Inc), a continuacion se amplificaron mediante PCR para tener un peptido Flag N-terminal y se clonaron en un derivado del vector pET (Invitrogen) utilizando tecnicas de biologfa molecular convencionales. Estos plasmidos se transformaron en celulas de E.coli BL21 (DE3) y se indujo la expresion de FGF1 o FGF2 utilizando IpTg 1 mM. El nivel de expresion de FGF se determino utilizando un kit de ELISA espedfico para FGF1 o FGF2 (R&D Systems). El FGF se puriifico utilizando cuentas de heparina-Sefarosa CL-6B (Amersham Biosciences) como se describe (Wiedlocha et al., Mol. Cell. Biol. 16:270, 1996). De un modo similar, se sintetizo un gen para FGF7 humano (la forma precursora con 194 aminoacidos; Finch, P.W. et al., Science 245:752, 1989) y se amplifico mediante PCR para tener una etiqueta Flag N-terminal en un vector pCMV (un derivado de pDrive, Invitrogen), y se elaboro Flag-FGF10 de un modo analogo. Los ADN plasmfdicos se transfectaron en celulas 293F humanas. El sobrenadante de cultivo de las celulas 293F transfectadas se utilizo para el analisis de union ligando-receptor.

Preparacion de protemas de fusion de FGFR2. Se expresaron el dominio extracelular (ECD) de FGFR2IIIb humano y de FGFR2IIIc humano como moleculas de inmunoadhesina. Para las formas alfa, se fusionaron los fragmentos de ADN que codificaban el ECD completo de FGFR2IIIb (aminoacidos 1-378) o FGFR2IIIc (aminoacidos 1-377) a Fc humano (residuos 216 a 446) a traves de un conector polipeptfdico; para las formas beta (sin D1) se utilizaron en su lugar los aminoacidos 152-378 para FGFR2(beta)IIIb y los aminoacidos 152-377 para FGFR2(beta)IIIc. Estas moleculas de FGFR2-Fc se expresaron transfectando las celulas 293F y seleccionando los transfectantes estables en presencia de G418 (1 mg/ml) en medio de expresion de 293 (Invitrogen). El FGFR2-Fc secretado desde las celulas 293F transfectadas se purifico utilizando una columna de protema A/G. De un modo similar, se clono ADNc de ECD de FGFR2 de mono cinomolgo (cyno) mediante tecnicas convencionales a partir de ARNm de hngado de cyno, y se fusionaron los aminoacidos 1-378 a Fc humano para crear FGFR2IIIb-Fc de cyno para su expresion. Se construyo FGFR2IIIb-Fc de chimpance utilizando la mutagenesis in vitro para convertir el aminoacido del ECD de FGFR2IIIb humano que difiere de FGFR2IIIb de chimp en el aminoacido de chimp (residuo metionina 186 a treonina, basandose en las secuencias conocidas de GenBank). Se adquirio protema FGFR2(beta)IIIb-Fc de raton de R&D Systems (Num. de Catalogo 708-MF).

Analisis ELISA para el mAb que se une a la protema de fusion de FGFR2. Las placas de ELISA se recubrieron con anti-IgG-Fc humana de cabra (2 pg/ml) durante la noche a 4°C. Los sitios de union no espedfica se bloquearon con BSA al 2% durante 1 hr a RT. Las placas se incubaron con una de las protemas de fusion de FGFR2 descritas anteriormente (1 pg/ml) durante 1 hr, seguido de incubacion con diferentes concentraciones de mAb o fluidos de cultivo de hibridoma durante 1 hr. El mAb unido se detecto con anti-anticuerpo de raton de Cabra conjugado con HRP seguido de lavado, adicion de sustrato TMB (Sigma) y lectura a 450 nm. En todos los analisis ELISA, las placas se lavaron 3 veces entre cada etapa.

Citometna de flujo. Despues de lavar dos veces en tampon de clasificacion celular (CSB: PBS/FBS al 1%/NaN3 al 0,02%), 2 x 105 las celulas se resuspendieron en 50 pl de CSB en un pocillo de microtitulacion y se incubaron con 50 pl del mAb anti-FGFR2 que se iba a someter a ensayo (1 pg/50 pl) durante 1 hr sobre hielo. Las celulas se lavaron a continuacion dos veces en CSB y los anticuerpos unidos se detectaron mediante incubacion con anti-IgG de raton de cabra conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante 1 hr sobre hielo. Despues de lavar dos veces en CSB, las celulas se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson).

Ejemplo 2: Generacion de anticuerpos monoclonales para FGFR2

Se inmunizaron ratones Balb/c (hembras de 5-6 semanas de edad) mediante inyeccion en las almohadillas de sus patas traseras a intervalos de 1 semana 20 o 22 veces con FGFR2(beta)IIIb-Fc (dosis inicial 10 pg/almohadilla,

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despues 5 jg/almohadilla), o con 17 dosis de FGFR2IIIc-Fc (dosis inicial 10 |jg/almohadilla, despues 5 dosis a 2 jg, despues a 5 jg) seguido de 5 dosis de FGFR2(beta)IIIc-Fc (a 5 jg/almohadilla), con el antigeno suspendido en MPL/TDM (Sigma-Aldrich). Tres dfas despues de la inyeccion final, se extrajeron las celulas linfoides popliteales y se fusionaron con celulas de mieloma de raton P3/X63-Ag8U1 a una razon 1:1 utilizando un Hybrimune Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences). Los hibridomas se seleccionaron mediante la adicion de 2x HAT (Sigma) 24 hr mas tarde. Diez dfas despues de la fusion, los sobrenadantes de cultivo de hibridoma se escrutaron para determinar su capacidad para unirse a FGFR2IIIb-Fc pero no a IgG humana utilizando ELISA. A continuacion se escrutaron los mAb seleccionados para determinar su capacidad para reconocer FGFR2IIIb sobre la lrnea de celulas tumorales gastricas humana SNU-16 (Shin et al, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126:519, 2000). Los hibridomas seleccionados se clonaron a continuacion dos veces utilizando la tecnica de dilucion limitante. Tres mAb seleccionados de este modo fueron GAL-FR21 y GAL-FR22 del primer regimen de inmunizacion, y GAL-FR23 del segundo regimen de inmunizacion. Las propiedades de estos mAb se muestran en la Fig. 2 como se describe a continuacion.

Ademas, se obtuvieron otros numerosos mAb anti-FGFR2 a partir de las fusiones, incluyendo FR2bB 100.12.9, FR2bC 54.8.11, FR2bC 100.7.9, FR2bC 101.8.2, FR2bC 115.1.5, FR2bC 149.8.8, FR2bB 11.5.3, y FR2bB 18.1.6.

Ejemplo 3: Propiedades de los mAb anti-FGFR2

Como se observa en la Fig. 3, los tres mAb seleccionados GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 se unen bien a FGFR2IIIb en el analisis ELISA descrito en el Ejemplo 1. Utilizando las cuatro formas diferentes de FGFR2-Fc en el ELISA, se determino que cada uno de estos mAb tiene un patron de union diferente y por lo tanto epftopo (Fig. 4). GAL-FR21 se une a las formas tanto alfa como beta de FGFR2III (esto es, con y sin D1), pero no a FGFRIIIc. El epftopo por lo tanto no puede implicar D1 y debe implicar D3IIIb, por lo que esta probablemente incluido en D3IIIb o D3. GAL-FR22 tambien se une a las formas tanto alfa como beta, pero tanto en el contexto de IIIb como de IIIc, de manera que el epftopo esta presumiblemente incluido en D2-D3IIIa o desde luego D2-D3. Finalmente, GAL-FR23 no se une a ninguna de las formas beta, de manera que su epftopo debe estar totalmente o parcialmente en D1. Por consiguiente, los mAb que tienen un epftopo en D1 o D2-D3 o D3 estan incluidos en la presente invencion.

Para confirmar que los mAb GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 se unen a diferentes epftopos, se llevo a cabo un experimento de competicion en el que cada mAb fue biotinilado, y a continuacion se hicieron competir 0,4 jg del mAb biotinilado con un exceso 100:1 de cada uno de los otros mAb no marcados (o mAb murino de control 5G8) por la union a FGFR2IIIb-Fc en el analisis ELISA descrito anteriormente (pero con HRP-estreptavidina como reactivo de deteccion). Como se observa en la Fig. 5, cada mAb competfa consigo mismo por la union pero no con los otros mAb, demostrando que tienen diferentes epftopos. Ademas, los otros mAbs FR2bB 100.12.9, FR2bC 54.8.11, FR2bC 100.7.9, FR2bC 101.8.2, Fr2bC 115.1.5, FR2bC 149.8.8 competfan por la union con GAL-FR21 biotinilado en este analisis de modo que tienen el mismo epftopo que GAL-FR21o un epftopo solapante, mientras los mAb FR2bB 11.5.3, y FR2bB 18.1.6 competfan por la union con GAL-FR22 biotinilado de modo que tienen el mismo epftopo que GAL-FR22 o un epftopo solapante.

Para confirmar que los mAb seleccionados se unen a las formas apropiadas de FGFR2 sobre la membrana, se empleo la citometna de flujo. Se utilizaron celulas KATO-III (ATCC HTB-103) y SNU-16 (ATCC CRL-5974), que expresan en exceso FGFR2IIIb, para someter a ensayo la union a esa forma del receptor. Como se observa en la Fig. 6, los tres mAb GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 se unen a ambas lrneas celulares, como se esperaba a partir de sus epftopos descritos anteriormente. Se utilizaron celulas 293F humanas transfectadas con un gen para FGFRIIIc para someter a ensayo la union a esa forma, despues de verificar que ninguno de los mAb se une a las celulas 293F anfitrionas por sf mismas. Como se observa en la Fig. 7, GAL-FR22 y GALFR23 pero no GALFR21 se unen a celulas transfectadas con FGFRIIIb, como se esperaba a partir de sus epftopos. Finalmente, puesto que la mutacion S252W de FGFR2 se encuentra en algunas celulas cancerosas, se sometio a ensayo la union de los mAb a celulas 293F transfectadas con un gen FGFR2IIIb construido para que contuviera esa mutacion (FGFR2IIIb(S252W)). Como tambien se observa en la Fig. 7, todos los mAb se unieron a las celulas transfectadas con FGFR2IIIb(S252w). La capacidad para unirse a FGFR2IIIb(S252W) es una propiedad preferida de los mAb de la invencion.

Para determinar la capacidad de los mAb para inhibir la union de los ligandos FGF a FGFR2, se utilizo un analisis ELISA. Los pocillos de ELISA se recubrieron con 2 jg/ml de anti-IgG-Fc humana de cabra durante la noche a 4°C. Despues de bloquear con BSA al 2% durante 1 hr a RT, los pocillos se incubaron con 0,5 jg/ml de FGFR2IIIb-Fc durante 1 hr, seguido de incubacion con Flag-FGF1 o Flag-FGF2 (0,2 jg/ml) en presencia de diferentes concentraciones de mAb durante 1 h. El Flag-FGF1 unido se detecto mediante la adicion de anticuerpo anti-Flag M2 conjugado con HRP (Sigma) y posterior adicion de sustrato TMB. Como se puede observar a partir de la Fig. 8A, el mAb GAL-FR21 bloqueo debilmente la union de FGF1 a FGFR2IIIb en este analisis, pero GAL-FR22 y GAL-FR23 no bloquearon la union de FGF1. En contraste GAL-FR21 bloqueo fuertemente la union de FGF2 a FGFR2IIIb, GAL- FR22 bloqueo moderadamente la union de FGF2, y GAL-FR23 no bloqueo la union. En analisis similares, pero utilizando Flag-FGF7 y Flag-FGF10, tambien se demostro (Fig. 8B) que GAL-FR21 y GAL-FR22 bloquean la union de FGF7 y FGF10 a FGFR2IIIb. En efecto, mAb ventajosos de la invencion, como GAL-FR21 y GAL-FR22, bloquean la union de FGF2, FGF7 y FGF10 a FGFR2IIIb, preferiblemente en 80% o 90% o 95% o completamente o esencialmente completamente. Por consiguiente se ha demostrado que GAL-FR21 y GAL-FR22 pero no GAL-FR23 neutralizan al menos una actividad biologica de FGFR2.

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Ejemplo 4: Modelos de xenoinjerto

Se llevan a cabo experimented de xenoinjerto como se ha descrito previamente (Kim et al., Nature 362:841,1993). Se cosechan en HBSS celulas tumorales humanas tipicamente desarrolladas en medio DMEM complete. Se inyectan subcutaneamente en ratones carentes de sistema inmunitario hembra o ratones NIH-III Xid/Beige/nud (4-6 semanas de edad) 2-10 x 106 celulas en 0,1 ml de HBSS en las areas dorsales. Cuando el tamano del tumor alcanza 50-100 mm3, los ratones se agrupan al azar y se les administran 5 mg/kg (100 |jg total) o alguna otra dosificacion de mAb i.p. dos veces por semana en un volumen de 0,1 ml. Los tamanos de los tumores se determinan dos veces por semana midiendo en dos dimensiones [longitud (a) y anchura (b)]. El volumen tumoral se calcula de acuerdo con V = ab2/2 y se expresa como el volumen tumoral medio ± ETM. El numero de ratones en cada Grupo de tratamiento es tipicamente de 5-7 ratones. Se puede realizar un analisis estadfstico, p. ej., utilizando la prueba T de Student.

Las Figuras 9 y 10A demuestran que en diversos experimentos GAL-FR21, GAL-FR22 y GAL-FR23 administrados a un nivel de dosificacion de 20 jg (1 mg/kg) dos veces por semana inhibieron todos fuertemente el crecimiento de xenoinjertos de tumor gastrico SNU-16, siendo GAL-FR21 el mas potente e inhibiendo completamente el crecimiento del xenoinjerto. El mAb FR2bC 54.8.11 mencionado anteriormente que compite por la union con GAL-FR21 tambien inhibio el crecimiento del xenoinjerto. La Fig. 10B demuestra que GAL-FR21 y GAL-FR22 administrados a un nivel de dosificacion de 50 jg (2,5 mg/kg) dos veces por semana tambien inhibio fuertemente el crecimiento de xenoinjertos de la lmea celular de tumor gastrico humano OCUM-2M (que se describe en Yashiro et al., Jpn J Cancer Res 85:883, 1994). De un modo similar se muestra la capacidad de los mAb para inhibir los xenoinjertos de KATO III u otras lmeas celulares que expresan FGFR2. La capacidad de los mAb para inhibir el crecimiento tumoral aditivamente o sinergicamente con otros agentes anti-tumorales descritos anteriormente se demuestra tratando Grupos de ratones xenoinjertados con el mAb solo, el otro agente solo, y el mAb junto con el otro agente, y observando que el tratamiento con ambos agentes tiene un efecto inhibidor mayor que cualquiera de los agentes solo.

Ejemplo 5: Union de los mAb a FGFR2 de otra especie

Para determinar la capacidad de los mAb para unirse a FGFR2 de especies distintas de la humana, se utilizaron analisis ELISA. Los pocillos de ELISA se recubrieron con 2 jg/ml de anti-IgG-Fc humana de cabra durante la noche a 4°C. Despues de bloquear con BSA al 2% durante 1 hr a RT, los pocillos se incubaron con 0,2 jg/ml de FGFR2IIIb-Fc durante 1 hr, donde el FGFRIIIb de la protema de fusion fue FGFRIIIb humano, de raton, de mono cinomolgo o de chimpance. Los pocillos se incubaron a continuacion con diferentes concentraciones de mAb GAL- FR21 o GAL-FR22. Los mAb unidos se detectaron mediante la adicion de anti-IgG-Fc de raton de cabra conjugado con HRP y a continuacion sustrato TMB. La Fig. 11 demuestra que GAL-FR21 se une a FGFR2 de raton casi tan bien (10 veces) como a FGFR2 humano, mientras GAL-FR22 se une a FGFR2 de raton moderadamente bien (aproximadamente 100 veces el de FGFR2 humano). La Fig. 12 demuestra que GAL-FR21 se une a FGFR2 de mono cinomolgo tan bien (sin distincion) como a FGFR2 humano, mientras GAL-FR22 se une a FGFR2 de mono cinomolgo moderadamente bien (aproximadamente 100 veces el de FGFR2 humano). Un experimento similar con FGFR2 de chimpance dio los mismos resultados que con FGFR2 de mono cinomolgo: GAL-FR21 se unio a FGFR2 de chimpance tan bien (sin distincion) como a FGFR2 humano, mientras GAL-FR22 se unio a FGFR2 de chimpance moderadamente bien (aproximadamente 100 veces el de FGFR2 humano). Los mAb preferidos, como GAL-FR21 y GAL-FR22, se unen a los FGFR2 de raton, mono, chimpance y ser humano, y muy preferiblemente se unen a FGFR2 de raton tan bien como 2, 10, 100 o 1000 veces el de FGFR2 humano, y/o se unen a FGFR2 de mono y/o chimpance 2, 10 o 100 veces o sin distincion de (en una variacion experimental) FGFR2 humano (medido, p. ej., por medio de Ka). La union a FGFR2 de otras especies hace que el ensayo de los mAb en esas especies animales sea mas facil de realizar.

Ejemplo 6: Humanizacion de GAL-FR21 y GAL-FR22

La clonacion de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada del mAb GAL-FR21, la construccion y la expresion de un mAb quimerico, y el diseno, la construccion, la expresion y la purificacion de un mAb GAL-FR21 humanizado se llevaron a cabo utilizando metodos convencionales de la biologfa molecular, p. ej., como se describe en el documento US 2008019974 para el mAb L2G7. Las secuencias de aminoacidos de las regiones variables (V) de las cadenas ligera y pesada (maduras) de GAL-FR21 se muestran respectivamente en las Figs. 13A y 13B, lmeas superiores indicadas con GAL-FR21. Mas espedficamente, para disenar un mAb GAL-FR21 humanizado, se siguieron en general los metodos de Queen et al., Patentes de los Estados Unidos Nums. 5.530.101 y 5.585.089. La secuencia de Vk humana CAG27369 y la secuencia de VH AAB00780, mostradas respectivamente en las Figs. 13A y 13B, lmeas inferiores, se seleccionaron respectivamente para que sirvieran como secuencias aceptoras para las secuencias de VL y VH de GAL-FR21 debido a que tienen una homologfa del marco particularmente elevada (esto es, identidad de secuencia) con las mismas. Se utilizo un modelo molecular generado por ordenador del dominio variable de GAL-FR21 para localizar los aminoacidos en el marco de GAL-FR21 que estan suficientemente proximos a las CDR como para interaccionar potencialmente con ellas. Para disenar las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de GAL-FR21 humanizado, se injertaron primero conceptualmente las CDR del mAb GAL-FR21 de raton en las regiones marco aceptoras. En las posiciones del marco en las que el modelo por ordenador sugirio un contacto significativo con las CDR, que puede ser necesario para mantener la conformacion de las CDR, los aminoacidos del anticuerpo de raton se sustituyeron por los aminoacidos del marco humano. Para el mAb GAL-

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FR21 humanizado disenado HuGAL-FR21, esto se realizo en los residuos 27, 28, 30 (en el bucle hipervariable de Chothia H1) y 48 y 67 de la cadena pesada y en ningun residuo de la cadena ligera, utilizando la numeracion de Kabat. Las secuencias de la region V de las cadenas ligera y pesada de HuGAL-FR21 se muestran en las Figs. 13A y 13B respectivamente, lmeas medias indicadas por HuGAL-FR21, donde se alinean frente a las respectivas regiones V donadora y aceptora humana de GAL-FR21 - las CDR (segun define Kabat) estan subrayadas y los aminoacidos sustituidos enumerados mas arriba estan doblemente subrayados.

La invencion proporciona no solamente un mAb GAL-FR21 humanizado, HuGAL-FR21, que incluye las regiones V de las cadenas ligera y pesada mostradas en la Fig. 13, sino tambien mAb humanizados variantes cuyas regiones variables de las cadenas ligera y pesada difieren de las secuencias de HuGAL-FR21 en un pequeno numero (p. ej., tipicamente no mas de 1, 2, 3, 5 o 10) de remplazos, deleciones o inserciones, normalmente en el marco pero posiblemente en las CDR. En particular, solamente se puede realizar un subgrupo de las sustituciones descritas anteriormente en los marcos aceptores, o se pueden realizar una o varias sustituciones adicionales, p. ej., el aminoacido 69L de la VH de GAL-FR21 de raton puede remplazar al aminoacido 691 aceptor, y/o los aminoacidos de raton pueden remplazar los respectivos aminoacidos de la cadena ligera humanizada en cualquiera de las posiciones numeradas por Kabat 1, 3 y 60 y 63, que tienen cierta proximidad a las CDR. En efecto, muchos de los residuos del marco que no estan en contacto con las CDR en el mAb humanizado pueden acomodar sustituciones de aminoacidos de las correspondientes posiciones del mAb de raton donador u otros anticuerpos de raton o humanos, e incluso muchos residuos con contacto con CDR potenciales tambien son susceptibles de sustitucion o incluso se pueden alterar aminoacidos dentro de las CDR. Un ejemplo de una sustitucion en la CDR consiste en sustituir un residuo en una CDR por un residuo que ocupa la correspondiente posicion de la secuencia aceptora humana utilizada para suministrar marcos de regiones variables.

La mayor parte de los remplazos realizados en las secuencias de GAL-FR21 humanizado variante son conservativas con respecto a los aminoacidos de HuGAL-FR21 remplazados. Los aminoacidos se pueden agrupar como sigue para determinar las sustituciones conservativas, esto es, sustituciones dentro de un grupo: Grupo I (cadenas laterales hidrofobas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales alcalinas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientacion de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromaticas): trp, tyr, phe.

Preferiblemente, los remplazos en HuGAL-FR21 (sean o no conservativos) no tienen un efecto sustancial sobre la afinidad de union o la potencia del mAb humanizado, esto es, su capacidad para neutralizar las actividades biologicas de FGFR2 (p. ej., la potencia en algunos o todos los analisis descritos en la presente memoria del mAb GAL-FR21 humanizado variante es esencialmente la misma, esto es, dentro del error experimental, que la de HuGAL-FR21). Preferiblemente las secuencias de la region V de las cadenas ligera y pesada variantes maduras son identicas al menos en 90%, mas preferiblemente al menos en 95%, y lo mas preferiblemente al menos en 98% a las respectivas regiones V de las cadenas ligera y pesada maduras de HuGAL-FR21. Alternativamente, tambien son adecuadas otras regiones variables de anticuerpos humanos con una elevada identidad de secuencia con las de GAL-FR21 para proporcionar el marco de anticuerpo humanizado, especialmente regiones V kappa del subgrupo I humano y regiones V de la cadena pesada del subgrupo I humano, o secuencias consenso de estos subgrupos.

En otros anticuerpos humanizados, al menos 1, 2, 3, 4, o las 5 posiciones de las sustituciones de aceptor por donador mencionadas en conexion con el anticuerpo ilustrado (esto es, H27, H28, H30, H48, H67) estan preferiblemente ocupadas por el residuo que ocupa la correspondiente posicion de la cadena pesada del anticuerpo donador de raton. Si la secuencia aceptora de la cadena pesada es distinta de AAB00780, se puede requerir o no una sustitucion de aceptor por donador para la ocupacion especificada de una posicion de la region marco variable concreta dependiendo de si el residuo que ocupa la posicion especificada ya es el mismo entre el aceptor y el donador.

El mAb ilustrativo HuGAL-FR21 comentado aqu tiene regiones constantes k e y1 humanas, p. ej., como se presenta en el documento US 2008019974, y es por lo tanto una IgG1. Las secuencias completas de las cadenas ligera y pesada (maduras) de HuGAL-FR21 se muestran en la Fig. 14. Si bien estas secuencias son respectivamente de los alotipos Km(3) y G1m(3), se entiende que los mAb IgG1 de cualquier alotipo (IgG1, k) estan incluidos en la denominacion HuGAL-FR21. Tambien se entendera que cuando HuGAL-FR21 es fabricado mediante procedimientos convencionales, de uno a varios aminoacidos del extremo amino o carboxi de la cadena ligera y/o pesada, tales como la lisina C-terminal de la cadena pesada, pueden estar ausentes o ser derivatizados en una proporcion o todas las moleculas, y semejante composicion todavfa estara incluida en la denominacion HuGAL-FR2 y se considerara un mAb GAL-FR21 humanizado. Los mAbs humanizados de otros isotipos (p. ej., IgG2, IgG3 e IgG4) se pueden elaborar combinando las regiones variables de HuGAL-FR21 con las regiones constantes humanas apropiadas. Se pueden realizar remplazos en las regiones constantes de HuGAL-FR21 para reducir o aumentar la funcion efectora tal como la citotoxicidad mediada por el complemento o ADCC (veanse, p. ej., Winter et al., Patente de los Estados Unidos Num. 5.624.821; Tso et al., Patente de los Estados Unidos Num. 5.834.597; y Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), o para prolongar la vida media en los seres humanos (vease, p. ej., Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Espedficamente pero sin limitacion, los HuGAL-FR21 que tienen mutaciones en la region constante de IgG a Gln en la posicion 250 y/o Leu en la posicion 428 son realizaciones de la presente invencion.

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Para comparar la afinidad de union de HuGAL-FR21 con la del mAb GAL-FR21 de raton, se llevo a cabo un experimento de union competitiva utilizando la tecnolog^a ELISA convencional. Espedficamente, los pocillos de ELISA se recubrieron con 2 pg/ml de anti-IgG-Fc humana de cabra durante la noche a 4°C. Despues del bloqueo con BSA al 2% durante 1 hr a RT, los pocillos se incubaron con 0,5 pg/ml de FGFR2IIIb-Fc. Los pocillos se incubaron con mAb GAL-FR21 biotinilado (0,05 pg/ml) en presencia de concentraciones crecientes de GAL-FR21 no marcado, HuGAL-FR21 o anticuerpo hIgG humano de control. El nivel de GAL-FR21 biotinilado unido se determino mediante la adicion de HRP-estreptavidina y sustrato. Como se muestra en la Fig. 15, HuGAL-FR21 y GAL-FR21 compitieron aproximadamente igual de bien, siendo HuGAL-FR21 posiblemente ligeramente mejor, indicando que la afinidad de union a FGFR2 de HuGAL-FR21 es al menos tan elevada como la del mAb GAL-FR21 (raton). A partir de la concentracion de HuGAL-FR21 requerida para inhibir la union del mAb marcado en 50%, se puede estimar que la afinidad de union Ka de HuGAL-FR21 a FGFR2 es de al menos aproximadamente 109 M-1. HuGAL-FR21 tambien se puede someter a ensayo en cualquiera de los analisis biologicos para determinar la actividad de FGFR2 descrito en la presente memoria, p. ej., inhibicion de la union de FGF2 o FGF7 a FGFR2, e inhibira la actividad de FGFR2 de manera comparable a GAL-FR21.

Se puede disenar, construir, producir y analizar un mAb GAL-FR22 humanizado de la misma manera o de una manera similar a la del HuGAL-FR22. Las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada (madura) de GAL-FR22 se muestran respectivamente en las Figs. 16A y 16B, lmeas indicadas por GAL-FR22. Un mAb GAL-FR22 humanizado tiene una cadena ligera humanizada que comprende CDR de la secuencia de la Fig. 16A y una cadena pesada humanizada que comprende CDR de la secuencia de la Fig. 16B. En algunos casos, el mAb GAL-FR22 humanizado comprende las tres CDR de la cadena ligera mostradas en la Fig. 16A y las tres CDR de la cadena pesada mostradas en la Fig. 16B. Preferiblemente, el mAb GAL-FR22 humanizado tiene una afinidad de union para FGFR2 2 o 3 veces la afinidad del mAb GAL-FR22 de raton, y lo mas preferiblemente tiene una afinidad de union indistinguible o mayor que la del mAb GAL-FR22, medida, p. ej., por medio de un ELISA de competicion como se describe para HuGAL-FR21 y GAL-FR21.

Aunque la invencion ha sido descrita con referencia a las realizaciones preferidas actualmente, se debe entender que se pueden realizar diversas modificaciones sin salirse de la invencion. A menos que resulte evidente de otro modo a partir del contexto, cualquier etapa, elemento, realizacion, rasgo o aspecto de la descripcion puede ser utilizado con cualquier otro. Si una secuencia de acido nucleico o protema asociada con un numero de acceso se cambia, prevalece la version de la secuencia asociada con este numero de acceso de 7 de Noviembre de 2008.

Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales GAL-FR21, GAL-FR22, y GAL-FR23 han sido depositados en la Coleccion de Cultivos Tipo Americana, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, respectivamente con los Numeros ATCC PTA-9586 de 6 de Noviembre, 2008, PTA-9587 de 6 de Noviembre, 2008 y pTa-9408 de 12 de Agosto, 2008, bajo el Tratado de Budapest. Estos depositos se mantendran en un deposito autorizado y se sustituiran en caso de mutacion, no viabilidad o destruccion durante un penodo de al menos cinco anos despues de que el deposito haya recibido la solicitud mas reciente para la salida de una muestra, durante un penodo de al menos treinta anos despues de la fecha del deposito, o durante la vida aplicable de la patente relacionada, el que sea mas largo. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al publico de estas lmeas celulares seran retiradas de manera irrevocable tras la expedicion de una patente a partir de la solicitud.

Parrafos relevantes

1. Un anticuerpo monoclonal (mAb) humano o humanizado que se une al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2), e inhibe el crecimiento de un tumor humano xenoinjertado en un raton.

2. El mAb del parrafo 1 que inhibe la union de FGF2 a FGFR2.

3. El mAb del parrafo 1 que se une a FGFR2IIIb pero no a FGFR2IIIc.

4. El mAb del parrafo 1 que esta humanizado.

5. El mAb del parrafo 1 que es un fragmento de Fab o F(ab')2 o un anticuerpo de cadena sencilla.

6. Una composicion farmaceutica que comprende un mAb del parrafo 1.

7. Un metodo para tratar el cancer en un paciente que comprenden administrar al paciente una composicion farmaceutica que comprende el mAb del parrafo 1.

8. Un anticuerpo monoclonal (mAb) que compite por la union a FGFR2 con un anticuerpo seleccionado del grupo de GAL-FR21, gAl-FR22 y GAL-FR23, en donde el mAb esta modificado geneticamente.

9. El mAb del parrafo 8 que inhibe el crecimiento de un tumor humano SNU-16 xenoinjertado en un raton.

10. El mAb del parrafo 8 que es quimerico o humanizado.

11. El mAb del parrafo 8 que es un mAb GAL-FR21 o GAL-FR22 humanizado.

12. El mAb del parrafo 8 que es humano.

13. Una composicion farmaceutica que comprende un mAb del parrafo 8.

14. Un metodo de tratamiento del cancer en un paciente que comprende administrar al paciente una composicion farmaceutica que comprende el mAb del parrafo 8.

5 15. El metodo del parrafo 14 en donde dicho cancer es cancer gastrico.

16. Un anticuerpo humanizado que comprende una cadena ligera humanizada que comprende CDRs de la secuencia en la Fig. 13A (GAL-FR21) y una cadena pesada humanizada que comprende CDRs de la secuencia de la Fig. 13B (GAL-FR21), o que comprende una cadena ligera humanizada que comprende CDRs de la secuencia en la Fig. 16A (GAL-FR22) y una cadena pesada humanizada que comprende CDRs de la secuencia de la Fig. 16B 10 (GAL-FR22).

17 Un anticuerpo humanizado del parrafo 16, que comprende las tres cadenas ligeras CDRs mostradas en la Fig. 13A (GAL-FR21) y las tres cadenas pesadas CDRs mostradas en la Fig. 13B (GAL-FR21), o que comprende las tres cadenas ligeras CDRs mostradas en la Fig. 16A (GAL- FR22) y las tres cadenas pesadas CDRs mostradas en la Fig. 16B (GAL-FR22).

15 18. un anticuerpo humanizado del parrafo 17, en donde la region variable de la cadena ligera tiene al menos 95% de

identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la Fig. 13A (HuGAL-FR21) y la region variable de la cadena pesada tiene al menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la Fig. 13B (HuGAL-FR21).

19. El anticuerpo humanizado de la figura 18, en donde los residuos H27, H28, H30, H48, y H67 por la numeracion de Kabat estan ocupados por el residuo que ocupa la correspondiente posicion de la cadena pesada mostrada en la

20 Fig. 13B (GAL-FR21).

20. El anticuerpo humanizado del parrafo 19, en donde la region variable de la cadena ligera tiene la secuencia mostrada en la Fig. 13A (HuGAL-FR21) y la region variable de la cadena pesada tiene la secuencia mostrada en la Fig. 13B (HuGAL-FR21).

Claims (9)

1. 10

   15

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal (mAb) humanizado, humano o geneticamente modificado que se une a FGFR2IIIb pero no a FGFR2IIIc e inhibe el crecimiento de un tumor humano xenoinjertado en un raton, en donde el mAb

   (i) compite por la union a FGFR2 con el anticuerpo monoclonal GAL-FR21 depositado bajo numero ATTC PTA-9586,

   y

   (ii) inhibe la union de FGF2, FGF7 y FGF10 a FGFR2IIIb.
2. 2. El mAb de la reivindicacion 1 que es un fragmento de Fab o F(ab')2 o un anticuerpo de cadena sencilla.
3. 3. El mAb de las reivindicaciones 1 o 2 que compite por la union a FGFR2 con el anticuerpo monoclonal GAL-

   FR21 depositado bajo en numero de ATCC PTA-9586, en donde el mAb esta modificado geneticamente.
4. 4. El mAb de la reivindicacion 3 que inhibe el crecimiento de un tumor humano SNU-16 xenoinjertado en un raton.
5. 5. El mAb de la reivindicacion 3 que es quimerico o humanizado.
6. 6. El mAb de la reivindicacion 3 que es humano.
7. 7. Una composicion farmaceutica que comprende el mAb de la reivindicacion 1.
8. 8. El mAb de la reivindicacion 1, para uso en el tratamiento del cancer.
9. 9. El mAb de la reivindicacion 8 para uso segun la reivindicacion 8, en donde el cancer es cancer gastrico.