JP2010525301A - 子宮内膜癌および前癌の診断、分類および治療の方法 - Google Patents

Abstract

子宮内膜癌に関する診断および治療への適用について記載する。診断および治療への適用は、ＦＧＦＲ２遺伝子およびその発現産生物における、ある種の活性化変異に基づく。本発明は、ＦＧＦＲ２活性化変異に関連するヌクレオチド配列、アミノ酸配列、プローブ、およびプライマー、そして被験者の子宮内膜癌を診断および分類するためにこれらの変異体を包含するキットを対象とする。
【選択図】図１

Description

（関連する特許出願に対する相互参照）
本特許出願は、２００７年３月２３日に提出された米国仮特許出願第６０/８９６，８８４号、および２００７年１０月２３日に提出された米国仮特許出願第６０/９８２，０９３号の継続出願であり、それらの内容をそれら全体において本明細書にて、それらに対して参照として援用する。

（電子的に提出した素材の参照としての組み込み(incorporation-by-reference)）
本明細書と共に同時に提示し、以下：２００８年３月２４日に作成された”Seq_list”と命名されたOne 27,110 byte ASCII（テキスト）、のように同定されたコンピュータ可読の核酸/アミノ酸配列リストを、その全体において本明細書にて参照として組み入れる。

（発明の技術分野）
本発明は、子宮内膜癌の診断、分類、および治療のための方法およびキットの方向づけを行う。

子宮内膜癌は、米国において女性の生殖器系の最も一般的に診断される悪性腫瘍である。２００７年に米国において子宮体癌の新規３９，０８０例が診断され、７，４００名の女性がこの疾患で死亡したと見積もられた（Jemal A. Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, Thun MJ. CA Cancer J Clin 2007 Jan-Feb; 57(1): 43-66）子宮内膜癌のある女性の大多数は、子宮摘出術で外科的に治癒する；しかし約１５％の女性は、現行の化学療法に不応性の持続的または再発性の腫瘍を示す。進行したステージ、進行性または再発性の疾患を持つこれらの女性に関して、有効性が証明されたアジュバント療法がないため、生存は難しい。再発後生存期間の中央値は１０か月であり（Jereczek-Fossa B, Badzio A, Jassen J., Int J Gynecol Cancer 1999 Jul; 9(4): 285-94）、再発した患者の５年生存はわずか１３％に過ぎない（Creutzberg CL, van Putten WL, Koper PC, et al., Lancet 2000 Apr 22; 355 (9213): 1404-11）。

悪性癌はしばしば多数の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における変異を表し、非常に多くの遺伝子の発現に変化を呈し、様々な染色体異常を含有する。この遺伝子の複雑さにもかかわらず、特定の分子の異常を標的とすることで、例えば選択的チロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブ（グリベック）およびゲフィニチブ（イレッサ）を用いて見られるように、ヒト腫瘍の急速な退縮を生じさせることが示された。この現象を説明するため、Bernard Weinstein は“癌遺伝子依存性”という用語を導入した。彼は、腫瘍細胞が細胞の生存と成長に関するその癌遺伝子の活性に依存するように、癌遺伝子の活性の存在下で腫瘍細胞のシグナル伝達回路網が再プログラム化されると提唱した（Weinstein IB. Science 2002 Jul 5; 297 (5578): 63-4）。事実、実験データおよび臨床データは癌遺伝子依存性というこの概念を支持しており、さらに変異、再配列、および過剰発現を含む癌遺伝子の活性化の多重のメカニズムが、癌遺伝子依存性に関与し得ることを示唆している（Weinstein IB, Joe AK., Nat Clin Pract Oncol 2006 Aug; 3(8): 448-57）。

多様な染色体遺伝子の欠損が、子宮内膜癌において報告されている。十分にまたは中程度に分化した類内膜性の子宮内膜癌は、子宮癌のおよそ８０％に及ぶ。それらは、高頻度のＰＴＥＮにおける不活性化変異（２６−８０％）、ＫＲＡＳ２の活性化変異（１３−２６％）、およびβカテニンの機能獲得型変異（２５−３８％）を特徴とする（Hecht JL. Mutter GL., J Clin Oncol 2006 Oct 10; 24 (29):4783-91, Shiozawa T, Konishi I., Int J Clin Oncol 2006 Feb; 11(1): 13-21）。ＦＧＦＲ１、２および３における生殖系列の機能獲得型変異は、多様な頭蓋骨癒合症症候群および軟骨異形成症症候群において報告されている。これらの障害における遺伝子型/表現型の相関は複雑であり、３つの受容体の１つにおける変異に関連する１４を越える別個の臨床的症候群、およびいくつかの臨床的症候群、例えば異なる受容体の変異に関連するパイフェル症候群およびクルーゾン症候群を伴う（Passos-Bueno MR, Wilcox WR, Jabs EW, Sertie AL, Alonso LG and Kitoh H. (1999), Hum Mutat 14: 115-125, Wikie AO, Patey SJ, Kan SH, van den Ouweland AM, and Hamel BC. (2002), Am J Med Genet 112: 266-278）。

癌の生物学的基盤、ならびに癌の診断および治療を理解することでは大いに進展が得られたが、癌は未だ米国における主要な死亡原因の１つである。癌の診断および治療における固有の困難さとして、なによりも多くの異なる癌のサブグループの存在、および検査で陽性な患者の結果の可能性を最大にするための適当な治療戦略における併用薬の多様性が挙げられる。さらに、広範な子宮内膜癌のサブグループ、および疾患の進行の多様性がある。子宮内膜癌を適当に治療するため、そして治療成功のチャンスを最大にするために、子宮内膜癌タイプまたはサブタイプをできるだけ早期に同定することが重要である。

このように、適当なそして最適な治療計画を選択するために、子宮内膜癌を検出し分類する方法が現在必要とされている。一度検出され分類されたら、さらに被験者の疾患をうまく治療する、または疾患の再発を阻止するチャンスを最大とするための、子宮内膜癌のタイプに基づいて子宮内膜癌を治療する改善された方法が必要となる。

Jemal A. Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, Thun MJ. CA Cancer J Clin 2007 Jan-Feb; 57(1): 43-66 Jereczek-Fossa B, Badzio A, Jassen J., Int J Gynecol Cancer 1999 Jul; 9(4): 285-94 Creutzberg CL, van Putten WL, Koper PC, et al., Lancet 2000 Apr 22; 355 (9213): 1404-11 Weinstein IB. Science 2002 Jul 5; 297 (5578): 63-4 Weinstein IB, Joe AK., Nat Clin Pract Oncol 2006 Aug; 3(8): 448-57 Hecht JL. Mutter GL., J Clin Oncol 2006 Oct 10; 24 (29):4783-91 Shiozawa T, Konishi I., Int J Clin Oncol 2006 Feb; 11(1): 13-21 Passos-Bueno MR, Wilcox WR, Jabs EW, Sertie AL, Alonso LG and Kitoh H. (1999), Hum Mutat 14: 115-125 Wikie AO, Patey SJ, Kan SH, van den Ouweland AM, and Hamel BC. (2002), Am J Med Genet 112: 266-278

本発明は、子宮内膜癌を診断、分類、および治療する方法を提供する。線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）の活性化変異を同定し、子宮内膜癌と相関させることにより、本明細書において、被験者における子宮内膜癌を診断、分類、および治療するための有用なツールを提供する。

１つの態様において本発明は、被験者、好ましくはヒト被験者の子宮内膜癌または前癌を検出し、診断する方法である。本方法は、好ましくは子宮内膜細胞を含有する生体サンプルにおけるＦＧＦＲ２の受容体の変異を検出することを包含し、その場合変異は、ＦＧＦＲ２受容体の活性化に関連する。ＦＧＦＲ２の１つまたはそれより多くの活性化変異の存在が、被験者における子宮内膜癌または前癌の診断指標である。活性化変異は、ミスセンス変異、すなわち欠失、挿入、および欠失と挿入の双方であることができ、しばしば高めれたリガンドの結合、乱交雑のリガンドの結合（例えば正常には野生型受容体に結合できないリガンドに受容体が結合し、それにより活性化されることを可能にする）、構成的な受容体の二量体化、シグナル伝達の増加を導く障害された受容体再利用、遅延された分解、過剰発現、またはキナーゼの活性化を結果的にもたらす。好ましい態様においてＦＧＦＲ２は、最適なシグナル伝達のためにリガンドの刺激をまだなお必要とすると思われる構成的に活性な変異体である。

好ましくは検出のステップは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの少なくとも１つの核酸における、少なくとも１つのヌクレオチドＦＧＦＲ２の変異について、生体サンプルをスクリーニングすることを包含する。ある種の態様において活性化変異は、ＦＧＦＲ２における少なくとも１つのアミノ酸の置換を結果的にもたらす。

好ましい態様においてＦＧＦＲ２活性化変異は、以下から成る群より選択される少なくとも１つの変異を含む：免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインＩＩおよびＩＩＩ間の接合部における変異（例えば配列番号２もしくは３のすべてにおける、２５２位のＳからＷ、Ｆ、もしくはＬへの変異；２５３位のＰからＲへの変異；２６３位のＰからＬへの変異；２６７位のＳからＰへの変異）；ＩｇＩＩＩドメインにおける変異（例えば配列番号２もしくは３のすべてにおける、２７６位のＦからＶへの変異；２７８位のＣからＹもしくはＦへの変異；２８１位のＹからＣへの変異；２８８位のＩからＳへの変異；２８９位のＱからＰへの変異；２９０位のＹからＣ、ＧもしくはＲへの変異；２９２位のＫからＥへの変異；３１０位のＫからＲへの変異；３１５位のＡからＴへの変異；３２１位のＤからＡへの変異；３２８位のＹからＣへの変異）；ＩｇＩＩＩドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン間の接合部における変異（例えば配列番号２もしくは３の各々すべてにおける、３５４位もしくは３５３位のＳからＣもしくはＴへの変異；３５９位もしくは３５８位のＶからＦへの変異；３６２位もしくは３６１位のＡからＳへの変異；３７２位もしくは３７１位のＳからＣへの変異；３７５位もしくは３７４位のＹからＣへの変異；３７３位もしくは３７２位のＳからＣへの変異；３７６位もしくは３７５位のＹからＣへの変異）；ＴＭドメインの変異（例えば各々配列番号２もしくは３の各々すべてにおける、３８０位もしくは３７９位のＧからＲへの変異；３８３位もしくは３８２位のＣからＲへの変異、３８４位もしくは３８３位のＧからＲへの変異；３９２位もしくは３９１位のＭからＲへの変異）；ＴＭドメインおよびチロシンキナーゼドメインＩ間の接合部における変異（例えばＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃのスプライシング変異）；チロシンキナーゼドメインＩにおける変異（例えば各々配列番号２もしくは３の各々すべてにおける、５３８位もしくは５３７位のＩからＶへの変異；５４０位のＮからＫへの変異；５４８位もしくは５４７位のＩからＶへの変異；５４９位もしくは５４８位のＮからＨへの変異；５５０位もしくは５４９位のＮからＫへの変異；５６５位もしくは５６４位のＥからＧへの変異）；またはチロシンキナーゼドメインＩＩにおける変異（例えば、各々配列番号２もしくは３の各々すべてにおける、６４１位もしくは６４０位のＫからＲへの変異；６５０位もしくは６４９位のＫからＥへの変異；６５９位もしくは６５８位のＫからＮへの変異；６６０位もしくは６５９位のＫからＥへの変異；６６３位もしくは６６２位のＧからＥへの変異；６７８位もしくは６７７位のＲからＧへの変異；配列番号１の２２９０−９１位のヌクレオチドＣおよびＴの欠失に起因するフレームシフト変異）。

ＩｇＩＩＩドメインの好ましい活性化の変異のその他の例として、例えば配列番号２のすべてにおける、３３１位のＮからＩへの変異；３３７位のＡからＰへの変異；３３８位のＧからＰまたはＲへの変異；３４０位のＹからＣまたはＨへの変異；３４１位のＴからＰへの変異；３４２位のＣからＦ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、ＷまたはＹへの変異；３４４位のＡからＧまたはＰへの変異；３４７位のＳからＣへの変異；３５１位のＳからＣへの変異、そして配列番号３の均等な変異を含む。

１つより多くのＦＧＦＲ２活性化変異が生体サンプルにおいて検出されてよく、例えば少なくとも２つのＦＧＦＲ２受容体の活性化変異がある種の態様において検出されることに注目することは重要である。

検出する子宮内膜癌は、あらゆるサブタイプ、例えば漿液性、粘液性、および類内膜性の組織学的サブタイプであることができる。しかし好ましい態様において、検出する癌は類内膜性の組織学的サブタイプである。

加えて本発明は、検査被験者におけるＦＧＦＲ２シグナル伝達経路の活性のレベルを評価し、それをコントロール被験者の活性のレベルと比較することを包含する、被験者における子宮内膜癌を診断または分類する方法を提供し、その場合コントロール被験者と比較しての検査被験者のＦＧＦＲ２経路の増加した活性が、子宮内膜癌を示す。経路の活性のレベルは、例えばＦＧＦＲ２タンパク質の発現または活性のレベルの増加を評価することにより、評価することができる。あるいは発現または活性のレベルは、例えばＦＧＦＲ２、好ましくは受容体の活性化を結果的にもたらす変異したＦＧＦＲ２をコードするｍＲＮＡの量を決定することにより評価してよい。例えば１つの態様において、子宮内膜癌はゲノムの増幅によるＦＧＦＲ２の過剰発現に関連し、本アッセイはＦＧＦＲ２の過剰発現を特異的に検出するようにデザインする。

本発明はまた、子宮内膜癌を診断または分類するためのキットであって、ＦＧＦＲ２遺伝子によりコードされるＦＧＦＲ２タンパク質の増加した活性を結果的にもたらす同遺伝子の変異部位に、特異的にハイブリッド形成する、または隣接するオリゴヌクレオチド、および子宮内膜癌の診断で使用するための説明書を包含する、前記キットへの方向づけを行う。変異部位は、例えば配列番号１のヌクレオチド７５５、９２９、９４３、１１１８，１１４７，１６４２、１６５０、１９７８、および２２９０−９１、ならびに配列番号７の均等なヌクレオチド、から成る群より選択されるヌクレオチドを包含してよい。好ましい態様においてキットは、変異部位を包含する少なくとも１つのプローブを包含する。

本発明はさらに、ＦＧＦＲ２タンパク質の変異を特異的に認識する抗体、および使用のための説明書を包含する、子宮内膜癌を診断または分類するためのキットへの方向づけを行う。所望により変異は、変異のないＦＧＦＲ２タンパク質、例えば配列番号２および３のタンパク質と比較した時に、増加した活性を結果的にもたらす。好ましくは抗体は、以下から成る群：免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインＩＩおよびＩＩＩ間の接合部における変異；ＩｇＩＩＩドメインにおける変異；ＩｇＩＩＩドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン間の接合物における変異；ＴＭドメインにおける変異；ＴＭドメインおよびチロシンキナーゼドメインＩ間の接合部における変異；チロシンキナーゼドメインＩにおける変異、またはチロシンキナーゼドメインＩＩにおける変異、より選択される特定のＦＧＦＲ２タンパク質の変異に対して作成する。より好ましくは抗体は、以下から成る群：（ａ）配列番号２（ＮＰ＿０７５２５９．２）もしくは配列番号３（ＮＰ＿０００１３２．１）の２５２位のＳからＷへの変異；（ｂ）配列番号２もしくは３の３１０位のＫからＲへの変異；（ｃ）配列番号２もしくは３の３１５位のＡからＴへの変異；（ｄ）配列番号２の３７３位もしくは配列番号３の３７２位のＳからＣへの変異；（ｅ）配列番号２の３７６位もしくは配列番号３の３７５位のＹからＣへの変異；（ｆ）配列番号３の３８３位もしくは配列番号３の３８２位のＣからＲへの変異；（ｇ）配列番号２の３９２位もしくは配列番号３の３９１位のＭからＲへの変異；（ｈ）配列番号２の５４８位もしくは配列番号３の５４７位のＩからＶへの変異；（ｉ）配列番号２の５５０位もしくは配列番号３の５４９位のＮからＫへの変異；または（ｊ）配列番号２の６６０位もしくは配列番号３の６５９位のＫからＥへの変異、より選択される変異に対して作成する。

本発明はさらに、被験者における子宮内膜癌または前癌を治療する方法を提供する。好ましくは被験者は子宮内膜癌（例えば漿液性、粘液性、および類内膜性の組織学的サブタイプ）を患っているヒトである。当該方法は好ましくは、ＦＧＦＲ２の活性化、例えばリガンド非依存的またはリガンド依存的な様式のいずれかで構成的に活性であるＦＧＦＲ２変異型を特徴とする、子宮内膜癌または前癌を有する被験者に、医薬的に受容可能な担体と共に有効量のＦＧＦＲ２阻害剤を投与することを包含する。この場合、ＦＧＦＲ２阻害剤はＦＧＦＲ２の発現または活性を阻害し、それにより被験者の子宮内膜癌の成長または増殖を効果的に阻害する。ＦＧＦＲ２阻害剤は、好ましくは子宮内膜癌細胞の細胞周期の停止および/またはアポトーシスを誘発する。１つの態様においてＦＧＦＲ２阻害剤は、子宮内膜癌に関する外科的処置後に、術後の子宮内膜癌の再発を阻害するために、被験者に投与する。もう１つの態様において阻害剤は、外科的摘出を受けられない、持続性または再発性の子宮内膜癌を有する患者に投与する。

使用するＦＧＦＲ２阻害剤は、ＦＧＦＲ２遺伝子の発現またはＦＧＦＲ２発現産生物を阻害してよい。１つの態様において薬剤は、ＦＧＦＲ２アンチセンス核酸、好ましくは配列番号１の、９２９位のＡからＧへの置換；１６５０位のＴからＧへの置換；９４３位のＧからＡへの置換；７５５位のＣからＧへの置換；１６５０位のＴからＡもしくはＧへの置換；１１２７位のＡからＧへの置換；１１７５位のＣからＧへの置換；１６４２位のＡからＧへの置換；１９７８位のＡからＧへの置換；イントロン１０ Ａ＞Ｃ+２；または２２９０−９１位のＣＴの欠失、および配列番号７の均等な置換、より選択される少なくとも１つのヌクレオチドの置換、を包含するセグメントとハイブリッド形成する、アンチセンス核酸である。

もう１つの態様においてＦＧＦＲ２阻害剤は、ＦＧＦＲ２ドメインを遮断することによりＦＧＦＲ２活性を阻害する。例えばＦＧＦＲ２阻害剤は、ＦＧＦＲ２の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインＩＩおよびＩＩＩ間のリンカー領域；ＦＧＦＲ２のＩｇＩＩＩドメイン；ＦＧＦＲ２のＩｇＩＩＩドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン間の接合部；（ＦＧＦＲ２の）ＴＭドメイン；ＦＧＦＲ２のＴＭドメインおよびチロシンキナーゼドメインＩ間の接合部；ＦＧＦＲ２のチロシンキナーゼドメインＩ、またはＦＧＦＲ２のチロシンキナーゼドメインＩＩ、に対して作成された抗ＦＧＦＲ２阻害抗体である。例えば１つの態様において、ＦＧＦＲ２阻害剤は、ＦＧＦＲ２のフォールディング、ＦＧＦＲ２の三次元構造、リガンドの結合、または基質、例えばＡＴＰとの結合を妨害する。

好ましい例として、以下：（ａ）配列番号２（ＮＰ＿０７５２５９．２）もしくは配列番号３（ＮＰ＿０００１３２．１）の２５２位のＳからＷへの変異；（ｂ）配列番号２もしくは３の３１０位のＫからＲへの変異；（ｃ）配列番号２もしくは３の３１５位のＡからＴへの変異；（ｄ）配列番号２の３７３位もしくは配列番号３の３７２位のＳからＣへの変異；（ｅ）配列番号２の３７６位もしくは配列番号３の３７５位のＹからＣへの変異；（ｆ）配列番号２の３８３位もしくは配列番号３の３８２位のＣからＲへの変異；（ｇ）配列番号２の３９２位もしくは配列番号３の３９１位のＭからＲへの変異；（ｈ）配列番号２の５４８位もしくは配列番号３の５４７位のＩからＶへの変異；（ｉ）配列番号２の５５０位もしくは配列番号３の５４９位のＮからＫへの変異；または（ｊ）配列番号２の６６０位もしくは配列番号３の６５９位のＫからＥへの変異、より選択される変異を包含するＦＧＦＲ２アミノ酸配列を、特異的に認識する抗体を含む。

好ましい態様において抗体は、配列番号２または３の２５２位のＳからＷへの変異に対して作成する。もう１つの好ましい態様において、抗体はヒト化抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。

代わりの態様においてＦＧＦＲ２阻害剤は、阻害的短鎖ＲＮＡ（small inhibitory RNA,ｓｉＲＮＡ）、ヘアピン型短鎖ＲＮＡ（small hairpin RNA, ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)、またはリボザイムである。好ましい態様においてＦＧＦＲ２阻害剤はｓｈＲＮＡであり、好ましくはＦＧＦＲ２のエクソン２（配列番号４）、および/またはＦＧＦＲ２のエクソン１５（配列番号５）を標的とするｓｈＲＮＡである。もう１つの特定の非限定的態様において、ＦＧＦＲ２阻害剤はＰＤ１７３０７４である。

本発明はさらに子宮内膜癌を分類する方法を提供する。当該方法はユーザーが子宮内膜癌のタイプを適当に分類することを可能にし、その結果被験者の有する子宮内膜癌のタイプに基づいて、特定のかつ適当な治療を使用することができる。当該方法は、以下：子宮内膜癌細胞内のＦＧＦＲ２変異に関してスクリーニングする；そして子宮内膜癌細胞内のＦＧＦＲ２活性化変異の発見をもとに、ＦＧＦＲ２活性化に誘発される子宮内膜癌として子宮内膜癌のタイプを分類する、ことを包含する。好ましくはＦＧＦＲ２活性化変異は、１つまたはそれより多くの上に同定したＦＧＦＲ２の変異である。ある種の態様において当該方法はさらに、ＦＧＦＲ２変異がＦＧＦＲ２活性化を誘発するかどうかを決定することを包含する。

図１のＡ−Ｅは、子宮内膜細胞の細胞死を結果的にもたらす、ＡＮＣ３Ａ細胞およびＭＦＥ２９６細胞におけるＦＧＦＲ２のｓｈＲＮＡを介したノックダウンの結果を示す。図１Ａおよび図１Ｂは、子宮内膜癌細胞の細胞増殖におけるＦＧＦＲ２ ｓｈＲＮＡの効果を示す。ＡＮＣ３Ａ細胞（図１Ａ）またはＭＦＥ２９６細胞（図１Ｂ）は、空ベクター、非サイレンシング、またはＦＧＦＲ２の２つの異なるエクソン（Ｘ２またはＸ１５）を標的とする２つの独立したＦＧＦＲ２ ｓｈＲＮＡコンストラクトを形質導入し、細胞増殖における効果をＳＲＢアッセイを使用して評価した。ＦＧＦＲ２ ｓｈＲＮＡによる処置は、双方の細胞株の増殖を抑制した。非サイレンシングのコントロールｓｈＲＮＡは、細胞増殖への効果は認められなかった。図１Ｃ。ＥＲＫ１/２およびＡＫＴの活性化におけるＦＧＦＲ２ノックダウンの効果。ｓｈＲＮＡの形質導入に続いて、ＡＮ３ＣＡ細胞は、０．２％ＦＢＳ中で１８時間、血清を欠乏させるか、または１０％ＦＢＳを含有する完全成長培地中に維持した。溶菌液を集め、ＦＧＦＲ２発現、ならびにＥＲＫ１/２およびＡＫＴの活性化についてウェスタンブロットにより分析した。ＦＧＦＲ２のノックダウンは、０．２％および１０％のＦＢＳにおいて低減されたＥＲＫ１/２の活性化を、１０％ＦＢＳにおいてＡＫＴリン酸化の中程度の低減をもたらし、０．２％ＦＢＳにおいてはＡＫＴ活性化への効果は認められなかった。図１Ｄ。ＦＧＦＲ２のノックダウンに続いての細胞死。ＡＮ３ＣＡ細胞に、リポフェクトアミン２０００形質導入試薬を使用して、非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳ）コントロールまたはＦＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ Ｘ２を形質導入した。形質導入後４８時間で細胞を集め、５００ｎｇ/ｍＬ アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよび１μｇ/ｍＬ ヨウ化プロピジウムにて染色し、フローサイトメトリーによりアネキシン−ＦＩＴＣ陽性の細胞について分析した。ＦＧＦＲ２のノックダウンは、アポトーシスの指標であるアネキシンＶ陽性細胞の増加を結果的にもたらした。総タンパク質溶菌液のうち３０μｇを、ウェスタンブロット解析により分析して、ＦＧＦＲ２のノックダウンを確認した。ｓｈＲＮＡコンストラクトは、ＦＩＴＣと重複する発光スペクトルを有するＧＦＰもまた発現するため、このノックダウンはｓｈＲＮＡコンストラクトではなく、ｓｉＲＮＡコンストラクトを用いて行った。図１Ｅは、子宮内膜癌細胞株におけるＰＴＥＮ発現を示す。子宮内膜癌細胞の溶菌液を集め、ＰＴＥＮ発現についてウェスタンブロット解析により評価した。 図２のＡ−Ｂ： 活性化されたＦＧＦＲ２を発現する子宮内膜癌細胞は、汎用的ＦＧＦＲ（ｐａｎ−ＦＧＦＲ）阻害剤であるＰＤ１７３０７４に対して感受性がある。６つの子宮内膜癌細胞株に関する用量応答曲線。細胞生存率は、ＰＤ１７３０７４添加後７２時間にＳＲＢアッセイにて測定した。ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞は、Ｎ５５０Ｋ ＦＧＦＲ２変異を保有する。ＨＥＣＩＡ、Ishikawa、ＫＬＥ、およびＲＬ９５２は、ＦＧＦＲ２の野生型である。ＰＤ１７３０７４は、野生型ＦＧＦＲ２を発現する細胞株と比較して、変異ＦＧＦＲ２を発現する細胞株の細胞生存率において、顕著な負の効果を有した。ＰＤ１７３０７４のＩＣ５０値：ＡＮ３ＣＡ＝６１．７ｎＭ；ＭＦＥ２９６＝２８４．３ｎＭ；ＨＥＣＩＡ＞３０００ｎＭ；Ishikawa＝２９２０．７ｎＭ；ＫＬＥ＞１０００ｎＭ；ＲＬ９５２＞１０００ｎＭ。図２Ｂは、ＰＤ１７３０７４処置後のＰＬＣｇの活性化状態を示す。 細胞は０．２％ ＦＢＳ中で１８時間、血清を欠乏させた後、段階的に増加する濃度のＰＤ１７３０７４で３時間処置した。溶菌液を集め、ウェスタンブロット解析によりＰＬＣgの活性化について評価した。図２Ｃは、ＦＧＦ２不在下およびＦＧＦ２への応答下での細胞増殖を示す。構成的に活性なＦＧＦＲ２キナーゼドメイン変異Ｎ５５０Ｋは、外来のＦＧＦ２リガンドの不在下（−ＦＧＦ２）および存在下（＋ＦＧＦ２）の双方において、野生型受容体（ＷＴ）により誘発された値を上回る、増殖の増加を結果的にもたらす。これらのデータは、Ｎ５５０Ｋ変異は構成的に活性ではあるが、一方この変異はまた完全な活性のためにリガンドを必要とすることを示唆する。 図３のＡ−Ｂ： ＰＤ１７３０７４を介してのＦＧＦＲ２の阻害は、活性化されたＦＧＦＲ２を有する子宮内膜癌細胞における細胞死および細胞周期の停止を誘発する。（図３Ａ）アネキシン染色は、汎用的ＦＧＦＲ阻害剤であるＰＤ１７３０７４による処置に続いてのＡＮ３ＣＡ細胞の細胞死を明らかにする。２．５×１０^５細胞/ウェルの密度で播いたＡＮ３ＣＡ細胞を、ＤＭＳＯ（ビヒクルコントロール）、または１μＭ ＰＤ１７３０７４で処置した。４８、７２、または９６時間後、細胞を集め、５００ｎｇ/ｍＬ アネキシン−ＦＩＴＣおよび１μｇ/ｍＬ ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによりアネキシン陽性の細胞についてトリプルで分析した。ＰＤ１７３０７４処置した細胞は、ＤＭＳＯ単独で処置した細胞と比較して、アポトーシスの指標であるアネキシンＶ染色の増加を示した。（図３Ｂ）ＰＤ１７３０７４は、ＡＮ３ＣＡ細胞においてＧ１細胞周期の停止を導く。細胞はトリプルで６ウェルプレートに播き、１μＭ ＰＤ１７３０７４で処置した。ＰＤ１７３０７４添加後７２時間に、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーにより、細胞周期を測定した。 ＰＤ１７３０７４の段階的に増加する濃度での処置に続いての、鍵となるシグナル伝達分子の活性化状態。細胞は、１０％ ＦＢＳ中で３時間、段階的に増加する濃度のＰＤ１７３０７４で処置した。溶菌液を集め、ウェスタンブロット解析によりＥＲＫ１/２、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３、およびｐ３８の活性化について評価した。ＰＤ１７３０７４処置は、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞において、ＥＲＫ１/２の活性化の抑制、ＡＫＴリン酸化の中程度の抑制を結果的にもたらしたが、ＳＴＡＴ３またはｐ３８の活性化への効果は認められなかった。ＰＤ１７３０７４処置はＨＥＣＩＡ細胞においては、ＥＲＫ１/２、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３、およびｐ３８の活性化には奏功しなかった。 図５のＡ−Ｂ： ＰＤ１７３０７４処置後の時間にわたる鍵となるシグナル伝達分子の活性化の状態。（図５Ａ）細胞は、０から７２時間の示した時間の間、１０％ ＦＢＳ中の１μＭ ＰＤ１７３０７４で処置した。溶菌液を集め、ウェスタンブロット解析によりＥＲＫ１/２、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３、およびｐ３８の活性化について分析した。ＰＤ１７３０７４処置は、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞において、ＥＲＫ１/２の活性化の抑制、およびＡＫＴリン酸化の部分的抑制をもたらしたが、ＳＴＡＴ３またはｐ３８の活性化には奏功しなかった。ＰＤ１７３０７４処置はＨＥＣＩＡ細胞においては、ＥＲＫ１/２、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３、およびｐ３８の活性化には奏功しなかった。（図５Ｂ）細胞は、０．２％ ＦＢＳ中で一晩飢餓状態とした後、０から７２時間の示した時間の間、０．２％ ＦＢＳ中の１μＭ ＰＤ１７３０７４にて処置した。溶菌液を集め、ウェスタンブロット解析によりＥＲＫ１/２、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３、およびｐ３８の活性化について評価した。ＰＤ１７３０７４処置は、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞において、ＥＲＫ１/２の活性化の抑制、およびＡＫＴリン酸化の中程度の抑制を結果的にもたらした。ＰＤ１７３０７４はＨＥＣＩＡ細胞においては、ＥＲＫ１/２、またはＡＫＴの活性化には奏功しなかった。 図６は、ＦＧＦＲ２の変異を図で表す。ＦＧＦＲ２の変異を機能的ドメインにマップする。原発性子宮内膜癌および細胞株において同定された体細胞変異を、タンパク質を表した図の上に表示し、ＦＧＦＲ２ｂ（配列番号２；ＮＰ＿０７５２５９．２）に関連して番号付けする。生殖系列の変異は、多様な頭蓋骨癒合症症候群に関連付けられており、ＦＧＦＲ２ｃ（配列番号３ ＮＰ＿０００１３２．１）に関連して番号付けする。４つの体細胞ＦＧＦＲ２の子宮内膜の変異（一方生殖系列ではこれまで報告されていない）は、骨格の軟骨異形成症においてＦＧＦＲ３ｃのパラロガスな位置で報告されたものと同一のミスセンス変化を有する（^＊＊で示す）。新規の変異を下線で示す。^ａＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃ変異は、＋ＶＴのスプライス型に比例して相対的増加を結果的にもたらすようである。^ｂＦＳは、フレームシフトおよび未成熟な切断を結果的にもたらす２２９０−９１の２ｂｐ欠失をいう。

本発明を今度は、説明の目的のみのため本発明の好ましい態様に関して記載することにする。本発明の精神および範囲から離れることなく、説明した態様の中で、そして態様への多数の修飾または変更を加えてもよいことは、当業者に理解されるであろう。

本発明は部分的には、ＦＧＦＲ２受容体における変異であって、受容体の活性化を誘発するものを使用して、被験者の子宮内膜癌または前癌を効果的に検出および分類することができる、という発見に基づく。本発明はさらに、ＦＧＦＲ２遺伝子またはその発現産生物を阻害することが、子宮内膜癌を治療する上で有効であるという発見に基づく。

本明細書で使用する場合“子宮内膜癌”という用語は、例えば漿液性、粘液性、および類内膜性の組織学的サブタイプを含む、当該疾患のすべての形およびサブタイプを包括的に含む。子宮内膜癌は、子宮の内張りである子宮内膜に発症する癌である。

本発明の文脈においてＦＧＦＲ２遺伝子は、好ましくはヒト由来の遺伝子であって、配列番号１、７、または対立遺伝子のバリアントおよびオルソログを含む相同体に記された翻訳領域のヌクレオチド配列を包括的に含む。ＦＧＦＲ２タンパク質は、これもまた好ましくはヒト由来のタンパク質であって、配列番号２もしくは３、またはそのオルソログを含む相同体に記されたアミノ酸配列を有するタンパク質、を包括的に含む。図６は、ＦＧＦＲ２タンパク質のＦＧＦＲ２ドメインの機能的ドメイン、および機能的ドメインと関連づけてマップしたＦＧＦＲ２の変異を示す。

ＦＧＦＲ２は、４つの異なる遺伝子によりコードされる構造的に関連するチロシンキナーゼ受容体（ＦＧＦＲ １−４）のファミリーである。ＦＧＦＲ２は、３つの細胞外免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン、膜貫通ドメイン、および分断されたチロシンキナーゼドメインから構成される糖タンパク質である。ＩｇＩＩＩドメインにおける選択的スプライシングが、ＦＧＦ/ＦＧＦＲの結合およびシグナル伝達における冗長性および特異性の双方の双方のパターンの一次決定要因である。このスプライシング事象は組織特異的であり、別個のリガンド特異性を保有するＦＧＦＲ１−ＦＧＦＲ３のＩＩＩｂよびＩＩＩｃの受容体のアイソフォームを生じる（Mohammadi M, Olsen SK and Ibrahimi OA (2005), Cytokine Growth Factor Rev 16: 107-137, Ornitz DM and Itoh N. (2001), Genome Biol 2: REVIEWS3005）。ＦＧＦＲ２に関しては、上皮系列の細胞のみが、エクソン８にコードされた“ＩＩＩｂ”アイソフォーム（ＦＧＦＲ２ｂ；配列番号２；ＮＰ＿０７５２９．２）を発現し、一方間葉系由来細胞のみが、エクソン９を利用する “ＩＩＩｃ”アイソフォーム（ＦＧＦＲ２ｃ；配列番号３；ＮＰ＿０００１３２．１）を発現する（Scotet E and Houssaint E. (1995). Biochim Biophys Acta 1264:238-242）。ＦＧＦＲ２ｂアイソフォームは優先的にＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ１０と結合し、一方ＦＧＦＲ２ｃは、ＦＧＦ７および、ＦＧＦ１０とは結合しないが、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、およびＦＧＦ８とは高いアフィニティーでしっかり結合する（Ibrahimi OA, Zhang F, Eliseenkova AV, Itoh N, Linhardt RJ and Mohammadi M. (2004), Hum Mol Genet 13:2313-2324）。

検査被験者または生体サンプルにおけるＦＧＦＲ２の“増加した活性”または“活性化変異”は、コントロール、例えば健常な被験者または標準サンプルと比較しての、検査被験者または生体サンプルにおけるより高い総ＦＧＦＲ２活性をいう。好ましくは、必ずしもそうでなくてもよいが、活性はコントロールに比して、検査被験者または検査サンプルにおいて少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも１００％、そしてさらにより好ましくは少なくとも１５０％高い。増加した活性は、例えば高められたリガンドの結合、乱交雑または不適当なリガンドの結合、構成的な受容体の二量体化、シグナル伝達の増加をもたらす障害された再利用、遅延された分解、またはキナーゼの活性化による、例えば増加した基底状態のＦＧＦＲ２活性、延長された刺激、遅延された分解、または過剰発現に起因してよい。

ＦＧＦＲ２のより高い発現レベルは、例えばＦＧＦＲ２遺伝子の非翻訳領域の変異、またはＦＧＦＲ２の転写もしくは翻訳に関与する翻訳領域もしくは非翻訳領域の遺伝子の変異に起因してよい。ＦＧＦＲ２の発現レベルは、例えばコントロールと比較した時の検査被験者のＦＧＦＲ２ｍＲＮＡもしくはＦＧＦＲ２タンパク質のレベルを比較することにより、例えば正常な子宮内膜（例えば正常な隣接する子宮内膜サンプル）に対して腫瘍を比較することにより、決定することができる。

“機能保存的バリアント”は、アミノ酸の、類似の特性（例えば極性、水素結合電位、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性、など）を有するものとの置き換えを含むがこれに限定されない、ポリペプチドの全体の立体構造および機能を変更することなく、タンパク質または酵素中の所定のアミノ酸残基が変化したものである。類似の特性を持つアミノ酸は当該技術において周知されている。例えばアルギニン、ヒスチジンおよびリジンは、親水性−塩基性のアミノ酸であり、互換可能であってよい。同様に疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、またはバリンと置き換えてよい。そのような変化は、タンパク質またはポリペプチドの見かけ上の分子量または等電点に、ほとんどまたは全く影響を及ぼさないと期待される。

保存されているとして示されたもの以外のアミノ酸が、タンパク質または酵素中で異なっていてもよく、その結果類似の機能をもついずれか２つのタンパク質間の、一定比率のタンパク質またはアミノ酸の類似性は変動してよく、例えばクラスタ法による整列化スキーム（この場合類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく）に従って決定した場合、７０％から９９％であってよい。 “バリアント”もまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定した場合、少なくとも６０％のアミノ酸の同一性、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、そしてなおより好ましくは少なくとも９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、そして比較するネイティブまたは親のタンパク質または酵素と、同じ、または実質的に類似する特性または機能を有する、ポリペプチドまたは酵素を含む。特定のバリアントは“機能獲得型”バリアントであり、タンパク質または酵素中の少なくとも１つの所定のアミノ酸残基の変化が、タンパク質の活性を含むがこれに限定されないポリペプチドの特定の機能を改善する、ポリペプチドバリアントを意味する。アミノ酸残基の変化は、あるアミノ酸を、類似の特性を有するものとの置き換えであることができる。

本明細書で使用する場合、“相同の”および“類似の”という用語は、スーパーファミリー（例えば免疫グロブリンスーパーファミリー）および異なる種由来の相同タンパク質を含む“共通の進化起源”を保有するタンパク質間の関係をいう。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする遺伝子）は、類似性のパーセント、または保存された位置としての特定の残基もしくはモチーフの存在という用語で表すかどうかは別として、それらの配列の類似性により反映されるように、配列の相同性を有する。

具体的な態様において、２つのＤＮＡ配列は、配列比較アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Strides等により決定された場合、少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％、または少なくとも９５％のヌクレオチドが、定義された長さのＤＮＡ配列にわたりマッチする時、“実質的に相同または類似”である。

“変異体”および“変異”という用語は、遺伝子材料、例えばＤＮＡにおけるあらゆる検出可能な変化、またはそのような変化のあらゆる過程のメカニズム、もしくは結果を意味する。コントロール材料と比較した時、そのような変化は“異常”といってよい。これには、構造（例えば遺伝子のＤＮＡ配列）が変更された遺伝子の変異、あらゆる遺伝子またはＤＮＡから生じるあらゆる変異の過程、および修飾された遺伝子またはＤＮＡの配列により発現されるあらゆる発現産生物（例えばタンパク質）を含む。“バリアント”という用語もまた、修飾されたまたは変更された遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞など、すなわちあらゆる種類の変異を示すために使用してよい。

本明細書で使用する場合、“配列特異的オリゴヌクレオチド”は、ＦＧＦＲ２遺伝子、好ましくはＦＧＦＲ２活性化変異における、特定のバリエーションまたは変異を検出するために使用することができるオリゴヌクレオチドの関連するセットをいう。

“プローブ”は、プローブ中の少なくとも１つの配列と、被験者の標的タンパク質中における配列との相補性により、標的領域中の配列とハイブリッド構造を形成する、核酸またはオリゴヌクレオチドをいう。

本発明は、ＦＧＦＲ２の発現を阻害するために使用してよい、アンチセンス核酸（リボザイムを含む）を提供する。“アンチセンス核酸”は好ましくは、細胞質条件下でＲＮＡまたはＤＮＡ分子中の相補的塩基とハイブリッド形成することで、ＤＮＡ分子の役割を阻害する、一本鎖核酸分子である。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写物である場合、アンチセンス核酸は逆転写物またはｍＲＮＡを干渉する相補的な核酸である。現在使用する場合“アンチセンス”は、広くＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、リボザイム、ＲＮＡに誘発されるサイレンシング複合体、およびＲＮアーゼ−Ｈを介した抑制を含む。アンチセンス核酸分子は、細胞内の発現に関するリコンビナント遺伝子によりコード化することができる（例えば米国特許第５，８１４，５００号；米国特許第５，８１１，２３４号）、あるいは合成により調製することができる（例えば米国特許第５，７８０，６０７号）。合成オリゴヌクレオチドはアンチセンスとしての使用として適切である。

診断法
本発明に従って、過剰発現および遅延された分解を含む、受容体の活性化を誘発するＦＧＦＲ２受容体の変異を検出して、被験者の子宮内膜癌または前癌を診断または分類することができる。

本明細書で使用する場合“被験者”は、子宮内膜癌を発症する可能性のある、ヒトまたはヒト以外の哺乳類、例えば霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類、である。すべての態様において、ヒトの被験者が好ましい。好ましくは被験者は、子宮内膜癌を有していると疑われる、子宮内膜癌と診断された、または子宮内膜癌の家族歴がある、そのいずれかのヒトである。子宮内膜癌を有すると疑われる被験者を同定するための方法は、物理的検査、被験者の家族の病歴、被験者の病歴、子宮内膜の生検、またはいくつかの画像技術、例えば超音波検査、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、または陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を含んでよい。子宮内膜癌に関する診断法、および子宮内膜癌診断の臨床的判断基準は、医学分野の当業者に周知されている。

したがって診断法は、例えばＦＧＦＲ２遺伝子の変異を包括的に含んでよく、その場合その変異が結果的に増加したＦＧＦＲ２の受容体活性をもたらす。ＦＧＦＲ２の変異は、殊にＦＧＦＲ２遺伝子のコード領域、例えばＦＧＦＲ２遺伝子のＩｇＩＩドメインまたはＩｇＩＩＩドメインにおける変異に影響を及ぼしてよい。変異は、ミスセンス変異、好ましくは核酸の置換、または欠失、または双方の組み合わせを結果的にもたらすミスセンス変異であってよい。好ましくは変異は、１つ、そして時にはそれより多くのアミノ酸の置換または欠失を結果的にもたらす。例えば以下の表２を参照のこと。

本発明の診断法はまた、ＦＧＦＲ２タンパク質における変異、特にＦＧＦＲ２タンパク質の増加した活性を結果的にもたらす変異を検出することを包括的に含む。好ましくは変異は、以下から成る群：免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインＩＩおよびＩＩＩ間の接合部における変異；ＩｇＩＩＩドメインにおける変異；ＩｇＩＩＩドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン間の接合物における変異；ＴＭドメインにおける変異；ＴＭドメインおよびチロシンキナーゼドメインＩ間の接合部における変異；チロシンキナーゼドメインＩにおける変異、またはチロシンキナーゼドメインＩＩにおける変異、より選択されるＦＧＦＲ２における少なくとも１つの変異である。最も好ましくは変異は、ＦＧＦＲ２におけるアミノ酸の置換、例えば配列番号２もしくは配列番号３の２５２位のＳからＷへの変異、または配列番号２の５５０位もしくは配列番号３の５４９位のＮからＫへの変異、を誘発する。もう１つの態様においてＦＧＦＲ２におけるアミノ酸の置換は、配列番号２もしくは３の３１０位のＫからＲへの変異；または配列番号２の３９２位もしくは配列番号３の３９１位のＭからＲへの変異である。１つの非限定的態様において変異は、配列番号１（ＮＭ−０２２９７．２）；２２９０−９１位のヌクレオチドＣおよびＴの欠失；配列番号７；またはＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃのスプライシング変異から成る。

典型的には検出されるＦＧＦＲ２受容体の活性化変異は、例えば、それによりＦＧＦＲ２受容体が活性化されるリガンドの結合の増加、変更された（乱交雑の）リガンドのアフィニティー、構成的な受容体の二量体化、遅延された分解、障害された細胞膜からの再利用、過剰発現、またはキナーゼの活性化により、受容体の活性化を増加する。

本明細書で使用する場合、“診断”という用語は、疾患の進展のあらゆるステージでの疾患の同定をいい、そしてまた疾患を発症または再発する被験者の素因の決定を含む。本発明はさらに、子宮内膜癌のタイプを確立および分類する手段を提供する。

“生体（biological）サンプル”という用語は、ＤＮＡを入手しよいあらゆる細胞原料をいう。好ましくは“生体サンプル”は、子宮を裏打ちする子宮内膜細胞が生体サンプル中に存在することが保証される、子宮領域またはその近傍より入手する。１つの態様において生体サンプルは、血液の形、例えば月経血または閉経後の少量出血である。

さらなる態様において被験者の子宮内膜癌の診断は、検査被験者の子宮内膜細胞中のＦＧＦＲ２タンパク質の発現、遅延された分解、または活性のレベルを評価し、コントロール被験者の子宮内膜細胞中の発現または活性のレベルと比較することを包含し、その場合コントロール被験者と比較しての検査被験者のＦＧＦＲ２タンパク質の増加した発現および/または活性が、子宮内膜癌または前癌を示す。

ＦＧＦＲ２の発現または遅延された分解のレベルは、生体サンプル中のＦＧＦＲ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を決定することにより、または生体サンプル中のＦＧＦＲ２タンパク質の濃度を決定することにより評価してよい。ＦＧＦＲ２活性のレベルは、ＦＧＦＲ２シグナル伝達経路のシグナル伝達の流束における活性のレベルを決定することにより、例えば本明細書に記載するように、サンプルまたは被験者におけるＦＧＦＲ２活性を測定することにより評価してよい。

核酸を基本とするアッセイ
本発明に従って、すなわちＦＧＦＲ２ ＤＮＡまたはその転写物におけるＦＧＦＲ２核酸の変異型、ならびにＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２経路の他の成分の制御されていない発現、例えば過剰発現を、多様な適切な方法により検出することができる。

生体サンプルに含有される核酸を分析し配列決定するための、そして遺伝子の障害を診断するための標準的な方法を利用することができ、遺伝子型の分析に関する多くの戦略は当業者に公知である。

好ましい態様においてＦＧＦＲ２遺伝子における変異の決定は、生体サンプル中のＦＧＦＲ２のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおける変異を検出するための、核酸配列、例えば特定のオリゴヌクレオチドの使用を包括的に含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ２核酸に存在する変異部位に、またはこの変異部位に隣接する領域に特異的にハイブリッド形成してよい。また、ＦＧＦＲ２のすべてまたは一部の増幅を可能にするプライマーを利用してもよい。あるいはそのような技術と組み合わせて、本明細書に記載したまたは当業者に公知のオリゴヌクレオチドの配列決定を適用して、ＦＧＦＲ２の変異を検出することができる。

当業者は溶液中で、そして固相手段を利用する態様において、ハイブリダイゼーションのプローブを使用してよい。固相手段を伴う態様において、検査核酸は選択されたマトリクスまたは表面に吸着させる、またはそうでなければ付着させる。次に固定された一本鎖核酸を、選択されたプローブと特異的にハイブリダイゼーションさせる。

もう１つの態様において当業者は、増幅技術、例えばＰＣＲまたはリバースＰＣＲ(reverse-PCR)（“リバースポリメラーゼ連鎖反応法”）で、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、生体サンプル中に潜在的に存在する標的のＤＮＡまたはｍＲＮＡを各々特異的に増幅してもよい。

有用なオリゴヌクレオチドとして、ＦＧＦＲ２エクソンの増幅を可能にするプライマーを含む。
本発明は、より具体的には、以下のステップを包含する、子宮内膜癌または前癌のin vitroの診断方法を対象とする：
ａ）ＤＮＡを含有する生体サンプルを、ＦＧＦＲ２遺伝子のすべてまたは一部の増幅を可能にする特定のオリゴヌクレオチドと接触させる、すなわちサンプル中に含有されるＤＮＡを、この場合ハイブリダイゼーションに適当な、そして生体サンプル中に含有されるＤＮＡとプライマーとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、接近させ；
ｂ）前記ＤＮＡを増幅し；
ｃ）増幅生成物を検出し；
ｄ）得られた増幅された生成物を、正常なコントロールの生体サンプルを用いて得られた増幅された産生物と比較し、それによりＦＧＦＲ２遺伝子における可能性ある異常を検出すること。

ある種の態様において、生体サンプルのＤＮＡは、増福を必要とせずに直接配列決定する。これらの態様において、配列決定されたＤＮＡを、ＦＧＦＲ２遺伝子中の可能性ある異常を検出するためのコントロール配列と比較する。

本発明の方法はまた、例えば生体サンプルに含有されるｍＲＮＡを、例えばＲＴ−ＰＣＲにより増幅することにより、ＦＧＦＲ２遺伝子の転写物における異常の検出に適用することができる。

本発明のもう１つの主題は、先に定義したように、以下のステップを包含する、子宮内膜癌のin vitroの診断方法である：
ａ）生体サンプル中に含有されるｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成し；
ｂ）前記ｃＤＮＡを、前記ｃＤＮＡとプライマーとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ＦＧＦＲ２遺伝子の転写物のすべてまたは一部の増幅を可能にする特定のオリゴヌクレオチドと接触し；
ｃ）前記ｃＤＮＡを増幅し；
ｄ）増幅生成物を検出し；
ｅ）得られた増幅された産生物を、正常なコントロールの生体サンプルを用いて得られた増幅された生成物と比較し、それによりＦＧＦＲ２遺伝子の転写物における可能性ある異常を検出すること。

コントロールは、当業者に公知のあらゆる正常な子宮内膜コントロールサンプル、例えば正常な隣接する子宮内膜サンプル、または血液または頬スワブより得られた正常なＤＮＡであることができる。

ＲＮＡ分析に関して、生体サンプルは上に記載したようにあらゆる細胞原料、例えば生検組織であってよく、その原料から当業者に周知されている標準的な方法、例えばグアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出（Chomocyznski et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156）を使用してＲＮＡを単離する。次に単離されたＲＮＡを、選択された部位に特異的である特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により逆転写および増福をカップルさせる。プライマーのアニーリングに関する条件は、特定の逆転写および増福を確実にするように選ぶ；したがって増幅生成物の出現が、特定の遺伝子のバリエーションの存在の診断基準となる。もう１つの態様において、ＲＮＡを逆転写および増福し、その後増幅された配列を、例えば直接的な配列決定により同定する。なおもう１つの態様において、そのＲＮＡより得たｃＤＮＡをクローン化し、配列決定して変異を同定することができる。

本発明のＦＧＦＲ２核酸はまた、例えば治療および診断のアッセイにおいてプローブとして使用することができる。例えば本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを包含するプローブを提供する。そのオリゴヌクレオチドは、野生型遺伝子（配列番号１および７）の配列とは異なるＦＧＦＲ２遺伝子の領域、例えば変異領域または多形領域、と特異的にハイブリッド形成する能力があるヌクレオチド配列を有する領域を包含する。次にそのようなプローブを使用して、被験者から採取したサンプル中にＦＧＦＲ２遺伝子の変異が存在することを、特異的に検出することができる。変異領域または多形領域は、ＦＧＦＲ２遺伝子のプロモーター、エクソン、またはイントロンの配列に位置することができる。

本発明の特に好ましいプローブは、標的ヌクレオチド配列との特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分ないくつかのヌクレオチドを有する。したがって配列番号１−３に基づいた、そして本明細書に提供した変異配列に相補的な適切な長さのプローブを、意図した適用に依存して適当なレベルの特異性に関して、当業者が構成し、検査することができる。標的ヌクレオチド配列が、ＤＮＡの大きなフラグメント、例えば数十または数百キロバイトのゲノムＤＮＡフラグメント中に存在する場合には、プローブのサイズは、ＤＮＡのより短いフラグメント中に存在する標的配列を検出するために使用するプローブと比較した場合、十分に特異的なハイブリダイゼーションを提供するため、より長くなければならないと思われる。例えばいくつかの診断法において、ＦＧＦＲ２遺伝子の一部分を最初に増幅し、したがって染色体ＤＮＡの残り部分から単離した後、プローブにハイブリッド形成させる。そのような状況下では、より短いプローブでハイブリダイゼーションの十分な特異性を提供するようである。例えば約１５ヌクレオチド、なおより好ましくは２０ヌクレオチドが好ましいが、約１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプローブでも十分であると思われる。

好ましい態様において、プローブまたはプライマーはさらに、好ましくは検出される能力のあるものに結合させた標識を包含する。例えば標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素の補助因子より選択することができる。

本発明のもう１つの好ましい態様において、例えばプローブまたはプライマーとして使用する単離された核酸は、例えばより安定化するように修飾する。修飾された核酸分子の例として、ＤＮＡのホスホロアミデート、ホスホチオエート、およびメチルホスホネートの類似体を含む（米国特許第５，１７６，９９６号；５，２６４，５６４号；および５，２５６，７７５号もまた参照のこと）。

なおもう１つの態様において、ＨＰＬＣまたは変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）の技術を使用して、ＦＧＦＲ２核酸を分析してよい。ＤＨＰＬＣは、部分的変性温度、すなわち塩基対のミスマッチ部位でのヘテロ二本鎖を変性させるのに十分な温度でＨＰＬＣ分析を行うことで、ホモ二本鎖を、同じ塩基対の長さを有するヘテロ二本鎖から分離することができることを観察する場合に開発された（Hayward-Lester, et al., Genome Research, 1995, 5: 494; Underhill, er al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 193; Doris, et al., DHPLC Workshop, 1997, Stanford University）。したがってＤＨＰＬＣの使用は、変異の検出に適用される（Underhill, et al., Genome Research, 1997, 7: 996; Liu, et al., Nucleic Acid Res., 1998, 26; 1396）。ＤＨＰＬＣは、１塩基対程度とわずかしか違っていないヘテロ二本鎖を分離することができる。米国特許第６，２８７，８２２号または６，０２４，８７８号に記載されているような”Matched Ion Polynucleotide Chromatography”（ＭＩＰＣ）またはDnaturing ”Matched Ion Polynucleotide Chromatography”（ＤＭＩＰＣ）も、本発明と組み合わせてもまた有用となり得る分離法である。

あるいは、ＦＧＦＲ２遺伝子における異常を検出するための、ＤＧＧＥ法（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）、またはＳＳＣＰ法（Single-Strand Conformation Polymorphism、一本鎖コンフォメーション多形分析）を使用することができる。ＤＧＧＥは、変動する濃度の変性剤を含有するゲルを通しての電気泳動を使用して、１塩基対の変化程度の小さな配列差異に基づいて、同一の長さの２つのＤＮＡフラグメントを分離するための方法である（Guldberg et al., Nuc. Acids Res. 1994, 22: 880）。ＳＳＣＰは、２つの種のハイブリダイゼーションと、その後のゲル電気泳動による配列ミスマッチの検出を包含する、２つのＤＮＡ間の配列の差異を検出するための方法である（Ravnik-Glavac et al., Hum. Mol. Genet. 1994, 3: 801）。”HOT cleavage”、すなわち２つの種のハイブリダイゼーションと、その後の化学的開裂による配列ミスマッチの検出を包含する、２つのＤＮＡ間の配列の差異を検出するための方法（Cotton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 4397）もまた使用することができる。好ましくはそのような方法に続いて直接的な配列決定を行う。有利なことにＲＴ−ＰＣＲ法は、スプライシングによる変異の結果、例えば隠れた(cryptic)部位の活性化によるエクソンのスキッピング、または異常なスプライシングの可視化を可能にするため、ＦＧＦＲ２転写物中の異常を検出するために使用してよい。好ましくはこの方法に続いて、同様に直接的な配列決定を行う。

マイクロアレイを使用する技術、好ましくはハイスループットスクリーニングを可能にするマイクロアレイ技術もまた、ＦＧＦＲ２遺伝子における異常を検出するため、または本明細書に記載したように増加したシグナル伝達をもたらすＦＧＦＲ２遺伝子の発現もしくはＦＧＦＲ２経路の別の成分をアッセイするために、有利に実施することができる。マイクロアレイは、同一のオリゴヌクレオチドの同じセットをアレイの少なくとも２つの選択された別個の領域に付着させ、前記の選択された１つの領域と接触させた正常なサンプルを、前記の選択された別の領域と接触させた検査サンプルに対して容易に比較できるように、デザインしてよい。これらのアレイは、微量の液体の導管(microfluidic conduit)を使用して、正常なサンプルと検査サンプルの混合を避ける。有用なマイクロアレイ技術として、Nanogen, Inc (San Diego, Calif.)により開発されたもの、およびAffymetrixにより開発されたものを含む。しかし“遺伝子チップ”または“ＤＮＡチップ”とも呼ばれる、すべてのタイプのマイクロアレイを変異の同定に適用してよい。そのようなマイクロアレイは、当該技術において周知されている。

オリゴヌクレオチドを付着させる固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック（例えばポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、またはその他の材料から作製されてよい。核酸を表面に付着させるための１つの方法は、Schena et al., Science 1995, 270: 467-470により一般的に記載されているように、ガラスプレート上にプリンティングすることによる。この方法はｃＤＮＡのマイクロアレイを調製するために殊に有用である。DeRisi et al., Nature Genetics 1996, 14: 457-460; Shalon et al., Genome Res. 1996, 6: 639-645; およびSchena et al.,Pric, Natl. Acad. Sci. USA 1995, 93: 10539-11286もまた参照のこと。

マイクロアレイを作製するためのその他の方法、例えばマスキングによる方法(Maskos and Southern, Nuc. Acids Res. 1992, 20: 1679-1684)もまた使用してよい。原則として、いかなるタイプのアレイでも、例えばナイロンのハイブリダイゼーションメンブレン上のドットブロット（Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual (第２版), 1-3巻, Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）を使用することができるが、当業者に認識されているように、ハイブリダイゼーション容積がますます少量となるため、非常に小さなアレイが好ましい。これらのアッセイに関して、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、付着させたオリゴヌクレオチドが、検査するサンプル中に存在するＦＧＦＲ２遺伝子の少なくとも一部に、“特異的に結合する”または“特異的にハイブリッド形成する”ように、すなわちプローブがＦＧＦＲ２遺伝子座に相補的な核酸配列とハイブリッド形成する、二本鎖を形成する、または結合するが、非相補的な核酸配列とはその部位にハイブリッド形成することがないように、選択する。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドの短さが２５塩基より短いもしくは等しければ、標準的な塩基対形成のルールを使用してミスマッチが起こらない、またはポリヌクレオチドの短さが２５塩基より長くても、わずか５％のミスマッチにとどまる場合、あるポリヌクレオチド配列は、もう１つの配列と相補的であると考える。好ましくはポリヌクレオチドは完璧に相補的である（ミスマッチがない）。ネガティブコントロールを含むハイブリダイゼーションアッセイを行うことにより、特定のハイブリダイゼーション条件が結果的に特定のハイブリダイゼーションをもたらすことは、容易に示すことができる（例えば、Shalon de al., 上記、およびChee et al., Science 1996, 274: 610-614を参照のこと）。

多様な方法を、ハイブリダイゼーション事象の検出および分析のために利用できる。ＤＮＡプローブの標識に使用するレポーター基（フルオロフォア、酵素、放射性同位体、など）に依存して、検出および分析は、蛍光定量的、比色測定、またはオートラジオグラフィーにより行う。放射される放射線、例えば蛍光放射線または粒子の放出を観察および測定することによって、ハイブリダイゼーション事象についての情報を得てよい。

蛍光標識したプローブを使用する場合、転写物のアレイの各部位での蛍光発光は、好ましくは走査型共焦点レーザー顕微鏡により検出することができる。１つの態様において、適当な励起光を使用する分離スキャン(separate scan)は、使用する２つのフルオロフォア各々について行う。あるいは、２つのフルオロフォアに特異的な波長で同時検体照明を可能にするレーザーを使用して、２つのフルオロフォアからの発光を同時に分析することができる（Shalon et al. Genome Res. 1996, 6: 639-695を参照のこと）。

タンパク質を基本とするアッセイ
ＦＧＦＲ２核酸を分析する代わりとして、タンパク質における変異、またはタンパク質の非制御産生物、例えば過剰発現に基づいて、ＦＧＦＲ２を評価することができる。

好ましい態様においてＦＧＦＲ２は、イムノアッセイにより検出する。例えばウェスタンブロット法は、特定のバリアント、またはＦＧＦＲ２の存在もしくは不在の検出を可能にする。特にイムノアッセイは、ＦＧＦＲ２タンパク質中の特定の（野生型または変異の）アミノ酸配列を検出することができる。抗体の精製については以下に記載するが、その他のイムノアッセイの型式もまた、ウェスタンブロット法の代わりに使用することができる。これらの方法の１つはＥＬＩＳＡ法である。

ＥＬＩＳＡ法において、ＦＧＦＲ２に対する抗体、すなわちＦＧＦＲ２のエピトープフラグメントを、選択された表面、例えばタンパク質を結合することのできる表面、例えばポリスチレンミクロ滴定プレートのウェル上に固定化する。不完全に吸着されたポリペプチドを除去するため洗浄した後、非特異的タンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を、選択された表面に結合させてよい。このことで、固定化表面上の非特異的な吸着部位のブロッキングを可能とし、したがって表面上の抗血清の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを低下させる。次に固定化表面をサンプルと接触させ、免疫複合体（抗原/抗体）形成を伝達する様式で検査する。これには、サンプルを希釈液、例えばＢＳＡ溶液、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、および/またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）/Tweenで希釈することを含む。次にサンプルを２から４時間、約２５から３７℃の間の温度でインキュベーションしたまま放置する。インキュベーションに続いて、サンプルと接触させた表面を洗浄して、免疫複合体以外の材料を除去する。洗浄方法は、溶液、例えばＰＢＳ/Tweenまたはホウ酸緩衝液で洗浄することを含んでよい。検査サンプルおよび結合した抗体間の特定の免疫複合体の形成、およびその後の洗浄に続いて、免疫複合体形成の発生、およびその量さえも、免疫複合体をタンパク質上の変異したエピトープを認識する、ＦＧＦＲ２変異体に対する二次抗体を作用させることにより決定してよい。検出手段を提供するため、二次抗体は関連する活性、例えば適当な発色基質と共にインキュベーションすることで発色を起こす酵素活性を有してよい。次に、例えば可視分光器を使用して発色の程度を測定することにより、定量を達成してよい。

典型的には検出抗体は、酵素、例えばペルオキシダーゼと複合体を形成させ、そして可溶性発色団のペルオキシダーゼ基質、例えばテトラメチルベンジジンの添加に続いて、１Ｍ 硫酸を添加することにより、タンパク質を検出する。検査タンパク質の濃度は、標準曲線との比較により決定する。

これらのプロトコルは、Molecular Biology、第２巻、第１１章のCurrent ProtocolsおよびAntibodies, a Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) pp579-593 に詳述されている。

あるいは、生化学的アッセイを使用して、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したサンプルにおけるバンドの存否を検出することにより；逆相、イオン交換、およびゲル浸透を含む、高速液体クロマトグラフィーの様々な方法のいずれかにより分析したサンプルにおけるクロマトグラフィーのピークの存否により；分析的キャピラリー電気泳動クロマトグラフィー、または当該技術に公知のあらゆるその他の定量的または定性的な生化学的技術におけるＦＧＦＲ２の存否により、ＦＧＦＲ２の発現、または蓄積を検出することができる。

上で考察したイムノアッセイは、ＦＧＦＲ２タンパク質またはそのフラグメントに対して作成した抗体の使用を伴う。そのような抗体の生成を以下に記載する。
抗ＦＧＦＲ２抗体
そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｇ発現ライブラリ、および例えばヒト化抗体を含むが、これに限定されない。

当該技術で公知の様々な方法を、ＦＧＦＲ２ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体に対する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の生成のために使用してよい。抗体の生成のため、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、等を含むがこれに限定されない様々なホスト動物を、抗原のポリペプチドを注射して免疫することができる。

ＦＧＦＲ２ポリペプチドに対して作成されるモノクローナル抗体の調製のため、培養液における連続細胞株による抗体分子の生成のために提供されるあらゆる技術を使用してよい。これらには、Kohler and Milstein (Nature 256:495-497, 1975)により独自に開発されたハイブリドーマ技術、同様にトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 2026-2030, 1983)、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96, 1985)などを含むが、これらに限定されない。本発明の付加的な態様において、モノクローナル抗体は無菌動物において生成することができる（１９８９年１２月２８日に公開された国際特許公開第ＷＯ ８９/１２６９０号）。

本発明に従って、一本鎖抗体の生成に関して記載された技術（Hustonに対する米国特許第５，４７６，７８６号および第５，１３２，４０５号；米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、ＦＧＦＲ２ポリペプチド特異的な一本鎖抗体を生成することができる。事実これらの遺伝子を、in vivoでの発現のために送達することができる。本発明の付加的な態様は、Ｆａｂ発現ライブラリの構成に関して記載された技術（Huse et al., Scinece 246: 1275-1281, 1989）を利用して、ＦＧＦＲ２ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体に関する、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。

抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、公知の技術により作成することができる。例えばそのようなフラグメントは：抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作成することのできるＦａｂ’フラグメント、およびパパインおよび還元剤による抗体分子の処理により作成することのできるＦａｂフラグメント、を含むがこれに限定されない。

抗体の生成において、所望の抗体に関するスクリーニングは、当該技術における公知の技術、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、“サンドウィッチ”イムノアッセイ、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、in situ イムノアッセイ（例えばコロイド状の金、酵素、または放射性同位体標識を使用して）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光法、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイ等、により達成することができる。１つの態様において抗体の結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出する。もう１つの態様において、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出する。さらなる態様において、二次抗体を標識する。イムノアッセイにおいて結合を検出することに関しては、多くの手段が当該技術において知られており、それらは本発明の範囲内である。

診断キット
本発明はさらに、子宮内膜癌を診断または分類するための、被験者のＦＧＦＲ２遺伝子内の配列の決定のためのキットを提供する。キットは、バリアントの位置の配列を決定するための手段を包含し、そして所望により変異の分析のためのデータを含んでよい。配列決定のための手段は、適切な核酸を基本とする試薬および免疫学的な試薬を包含してよい。好ましくはキットはまた、バリアントの位置の配列を決定するため、そして被験者の子宮内膜癌を診断または分類するための、適切なバッファー、適当であればコントロール試薬、および指示書を包含する。

核酸を基本とする診断キット
本発明は、生体サンプル中のＦＧＦＲ２の遺伝子の多様性を検出するための、核酸を基本とする方法を提供する。ＦＧＦＲ２遺伝子の特定の位置の配列は、ＰＣＲ増幅用の特定のプローブを使用してのハイブリダイゼーション、制限酵素による断片化、直接的な配列決定、ＳＳＣＰ、および当該技術に公知のその他の技術の、１つまたはそれより多くを非限定的に含む、当該技術に公知のあらゆる適切な手段を使用して決定する。

１つの態様において診断キットは以下の構成内容を含む。
ａ）プローブＤＮＡ：プローブＤＮＡは予め標識されていてよい；あるいはプローブＤＮＡは未標識でもよく、標識用の成分はキット内に別の容器に含まれていてもよい；そして
ｂ）ハイブリダイゼーション試薬：キットはまた、適用可能であれば固相マトリクス、およびスタンダードを含む、特定のハイブリダイゼーションプロトコルに必要な、適切に包装されたその他の試薬および材料を含有してよい。

もう１つの態様において、診断キットは以下を含む：
ａ）配列決定プライマー：配列決定プライマーは、予め標識されていてもよいし、またはアフィニティー精製部分もしくは付着部分を含有してもよい；そして
ｂ）配列決定試薬：キットはまた、特定の配列決定のプロトコルに必要な、適切に包装されたその他の試薬および材料を含有してもよい。

１つの好ましい態様において、キットは配列決定プライマーのパネルを包含し、その配列はバリアントの位置に隣接する配列に対応する。
抗体を基本とする診断キット
本発明はまた、生体サンプル中の変異（または野生型）ＦＧＦＲ２タンパク質を検出するための、抗体を基本とする方法を提供する。この方法は以下の：（ｉ）サンプルを１つまたはそれより多くの抗体調製物と接触させる。その場合抗体および生体サンプル中のＦＧＦＲ２間で安定な抗原−抗体複合体を形成することができる条件下で、各抗体調製物は変異（または野生型）ＦＧＦＲ２に対して特異的である；そして（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成されたあらゆる抗原−抗体複合体を、当該技術で公知のあらゆる適切な手段を使用して検出する。その場合複合体の検出が、変異（または野生型）ＦＧＦＲ２の存在を示す、
というステップを包含する。

典型的にはイムノアッセイは、標識化抗体または標識化抗原成分（例えば抗体への結合に関してサンプル中の抗原と競合するもの）のいずれかを使用する。適切な標識は、非限定的に、酵素を基本とする、蛍光性、化学発光、放射性、または色素の分子を含む。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた知られており、例えばビオチンおよびアビジンを使用するもの、ならびに酵素で標識したイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイがある。

診断キットは典型的には以下の構成内容の１つまたはそれより多くを含む：
（ｉ）ＦＧＦＲ２特異的抗体：抗体は予め標識されていてよい；あるいは抗体は未標識でよく、標識用の成分がキット内に別の容器に含まれていてもよい、または標識された二次抗体を提供する；そして
（ｉｉ）反応成分：キットはまた、適用可能であれば固相マトリクス、およびスタンダードを含む、特定のイムノアッセイプロトコルに必要な適切に包装されたその他の試薬および材料を含有してもよい。

上述のキットは好ましくは、子宮内膜癌を診断または分類するための検査を実行し、読むための説明書を含む。さらに好ましい態様において、当該診断キットはハイスループットおよび/または自動操作に適用できる。

子宮内膜癌を治療する方法
本発明はさらに、ＦＧＦＲ２活性化を特徴とする子宮内膜癌を治療する方法を提供する。治療法は好ましくは、被験者におけるＦＧＦＲ２活性の阻害を包含する。一般にこの方法は、そのような治療を必要とする患者に、ＦＧＦＲ２の発現または活性を調節する有効量の薬剤を、医薬的に受容可能な担体と共に投与することを包含する。例えば治療薬剤は、ＦＧＦＲ２アンチセンス核酸、抗ＦＧＦＲ２細胞内阻害抗体、または低分子阻害剤であってよい。

治療組成物は、原則的な活性な薬剤としてＦＧＦＲ２阻害剤を包含する。適切な阻害剤の例として、ＦＧＦＲ２ＤＮＡの合成およびその発現産生物を阻害する阻害剤（例えばＦＧＦＲ２ ＲＮＡまたはタンパク質）を含む。一例としての態様において、阻害剤は低分子のＦＧＦＲ２阻害剤、例えばＰＤ１７３０７４である。もう１例の態様において、ＲＮＡ干渉を使用し、その場合阻害剤はＲＮＡの合成および/または翻訳を阻害する試薬、例えば阻害的短鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピン型短鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)、またはリボザイムである。

なおもう１つの態様において阻害剤は、ＦＧＦＲ２に対して、好ましくは変異ＦＧＦＲ２に対して、そして特にＦＧＦＲ２の少なくとも１つのＩｇドメインに対して作成された抗体を包含する。好ましくは抗体は、ＦＧＦＲ２のＩｇＩＩおよびＩｇＩＩＩドメイン間の変異したリンカー領域に関して、例えばＳ２５２Ｗ変異に対して特異的である。一般に好ましい抗体は、モノクローナル抗体、そして特に、それらがヒト被験者の体内で免疫原性反応を誘発しないように修飾された抗体（例えばヒト化抗体）である。ＦＧＦＲ２の活性を遮断する抗体は、当業者に周知されているあらゆる標準的な方法、例えば診断への適用の文脈において上に記載した方法に従って生成し、選択してよい。

細胞内の抗体（時に“細胞内抗体”と呼ぶ）は、いくつかのシステム、例えばウイルス感染（Marasco et al., Hum. Gene Ther. 1998, 9: 1627）およびその他の感染疾患（Rondon et al., Annu. Rev. Microbiol. 1997, 51: 257）、ならびに癌遺伝子、例えばｐ２１（Cardinal et al., FEBS Lett. 1998, 439: 197-202; Cochet et al., Cancer Res. 1998, 58: 1170-6）、ｍｙｂ（Kasono et al., Biochem Biophys Res Commun, 1998, 251: 124-30）、ｅｒｂＢ−２（Graus-Porta et al., Mol Cell Biol. 1995, 15:1182-91）、等において、細胞内タンパク質の活性を制御するために使用されてきた（Marasco, Gene Ther. 1997, 4: 11; Chen et al., Hum. Gene Ther. 1994, 5:595を参照のこと）。この技術を適用して、抗ＦＧＦＲ２細胞内抗体の発現によりＦＧＦＲ２活性を阻害することができる。

適すると思われるその他の阻害剤として、ＦＧＦＲ２に対して作成されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは変異ＦＧＦＲ２アイソフォームを含む。本発明に従ってのアンチセンス核酸をコードする配列を包含するベクターは、あらゆる公知の方法、例えば当該技術で利用可能な遺伝子療法に関する方法により、投与してよい。遺伝子療法の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32: 573-596; Mulligan, Science 1993, 260: 926-932; およびMorgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993, 62: 191-217; May, TIBTECH 1993, 11: 155-215を参照のこと。使用することのできるリコンビナントＤＮＡの当該技術で一般に知られている方法は、Ausubel et al., 編、1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; およびDracopoli et al.,編、1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NYの第１２章および１３章を参照のこと。

本明細書で使用する場合“治療”という用語は、被験者の子宮内膜癌の発生または進行における治療的介入である。“治療”という用語はまた、公知のＦＧＦＲ２活性化変異を有すると診断された被験者における子宮内膜癌の発生または再発の予防も、包括的に含む。

“治療有効量”という用語は本明細書において、ＦＧＦＲ２活性のレベルを調節する、例えば約１０パーセントまで、好ましくは約５０パーセントまで、そしてより好ましくは約９０パーセントまで減少させるのに十分な量または用量を意味するために使用する。好ましくは治療有効量は、被験者の活性、機能および応答における臨床的に意味のある欠損を寛解する、または補うことができる。あるいは治療有効量は、被験者の臨床的に意味のある状態における改善を引き起こすための十分量である。

ＦＧＦＲ２阻害剤は、ＦＧＦＲ２の活性または発現を阻害することから、医薬組成物中に医薬的に受容可能な担体と共に有利なように製剤化される。その時この物質を、子宮内膜癌に対する活性成分または治療薬と呼んでよい。

活性成分の濃度または量は、以下に考察するように所望の投与量および投与計画に依存する。適切な用量範囲は、使用するＦＧＦＲ２阻害剤に大きくは依存するが、例示のみの目的として、１日当たり約０．０１ｍｇ/ｋｇ体重から約１００ｍｇ/ｋｇ体重を含んでよい。

医薬組成物はまた、他の生物学的に活性な化合物を含んでよい。“医薬的に受容可能な”という語句は、ヒトに投与した時に生理学的に耐えられる、そして典型的にはアレルギー反応および類似の有害反応、例えば胃の不快感、めまい等を起こさない、分子実態および組成物をいう。好ましくは本明細書で使用する場合、“医薬的に受容可能な”という用語は、動物、そしてより特定すればヒトにおける使用に関する、国家もしくは州政府の規制当局により承認されている、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められている薬局方でリストされていることを意味する。“担体”という用語は、それと共に化合物を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。そのような医薬的担体は、無菌液、例えば水および油（石油、動物、野菜もしくは合成を原料とするもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油、等を含む）であることができる。水または水溶液、例えば生理食塩水溶液およびブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液が、特に注射溶液用の担体として好ましく利用される。適切な医薬的担体は、E. W. Martinによる“Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。

本発明に従って本発明の医薬組成物は、非経口、経粘膜、例えば経口(per os)、経鼻、経膣もしくは経直腸、または経皮により導入することができる。非経口経路として、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮膚内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内の投与を含む。子宮を直接標的とすること、例えば子宮または子宮の内張りへの直接投与による方法も、有利であると思われる。

一つの態様において治療化合物は、コントロールされた放出システムで送達することができる。例えばポリペプチドは、持続的なポンプを用いての静脈内注入、ポリマーマトリックス、例えばポリ乳酸/ポリグルタミン酸（ＰＬＧＡ）にて、コレステロールと活性成分の混合物を含有する皮下植込み型のペレット（Silastic R. TM.; Dow Coming, Midland, Mich.; 米国特許第５，５５４，６０１号を参照のこと）、植え込み可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、またはその他の投与方式を使用して投与してよい。

本発明の実施例を提供するが、例示のみに過ぎず、本発明または付記した請求項の範囲を限定するものではないことと理解されたい。当業者は、請求項および本明細書の開示に従って本発明をいかなる形で実践することもできることは認識していよう。

〔実施例１〕
子宮内膜癌における活性化ＦＧＦＲ２変異の検出
著者らの発見は、ＦＧＦＲ２の活性化および過剰発現が子宮内膜の腫瘍形成に一役を担うことを示す。エクソン８はエクソン９より３ヌクレオチド長く、したがってＦＧＦＲ２ｂアイソフォームは、ＦＧＦＲ２ｃアイソフォームより１コドン長い。シグナル伝達の特異性はまた、受容体、リガンドおよびヘパリン(heparin)硫酸プロテオグリカンの組織特異的な発現（Allen et al., 2001; Fiore, 2001）によっても提供される。ＦＧＦＲ２の“ｂ”および“ｃ”のアイソフォームの長さの差異により、上皮系で発現されるＦＧＦＲ２ｂアイソフォーム（配列番号２；ＮＰ＿０７５２５９．２）に関連して、すべての変異に番号付けするものとする。エクソン８の下流で起こる変異に関しは、本明細書において、括弧でおよび表２で、ＦＧＦＲ２ｃアイソフォーム（配列番号３；ＮＰ＿０００１３２．１）に関連して番号付けした均等な変異を提供する。２つの子宮内膜細胞株で同定されたＮ５５０Ｋ（Ｎ５４９Ｋ）バリアントは、受容体の活性化をもたらす可能性があった、というのは、同一または類似の生殖系列のミスセンス変化が、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３においてクルーゾン症候群（Kan et al., 2002）および軟骨低形成症（Bellus et al., 1995）の患者で報告されているからである（図１）。

次に、原発性子宮癌においてＦＧＦＲ２活性化変異の範囲および頻度を決定することを模索した。これまでにＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の活性化変異が生殖系列において同定されているエクソン（エクソン７、８、１０、１３および１５）の直接的な配列決定を、１８７例の原発性子宮癌において行い、腫瘍のすべてのグレードおよびステージ、ならびに子宮内膜癌の主要な組織学的サブタイプを表した（表１）。

間葉系に発現されるアイソフォーム（ＦＧＦＲ２ｃ）において発症する子宮内膜間質性肉腫、およびすべての癌肉腫（悪性の上皮系および間葉系の要素双方を伴う腫瘍）由来のＥＳＳ−１において報告されたＡ３１５Ｔについてもまた、エクソン９（ＮＭ＿０００１４１）における変異に関してスクリーニングしたことは注目すべきである。腫瘍（３２例の子宮内膜癌、プラス１７例の癌肉腫）のサブセットについて、第２および第３の免疫グロブリンドメイン（以後Ｄ２およびＤ３という）、膜貫通ドメイン、ならびにキナーゼドメイン全体を包括的に含むエクソン５−１８を配列決定して、新規の体細胞系変異に関連する発症を決定した。エクソン７、１０、１３および１５に発見された変異に加えて、１つの付加的な変異、すなわちエクソン１８の２ｂｐの欠失が、このより広範な変異スクリーニングにおいて同定された。変異は１９例（１０％）で同定された。１１５例の子宮内膜癌のうち１８例（１６％）が変異を有しており、１例の漿液性癌（４５例中１例、２％）が変異を持っていた。癌肉腫および明細胞癌においては変異は認められなかった。

すべての変異についてconstitutionalＤＮＡの配列決定を行い、変異が体細胞により生じることを確認した。類内膜性の症例のうち、正常なミスマッチの修復を有する症例（６１例中６例、１０％）と比較して、ミスマッチの修復の欠損を有する症例において多くのＦＧＦＲ２変異が認められた（４９例中１１例、２２％）が、統計学的有意性には達しなかった（ｐ＝０．１０）。５例の腫瘍に関して、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の状態が決定されなかったことは、注目すべきである。ＭＳＩ陽性の症例における２ｂｐの欠失が活性化されている可能性は低く、したがってバイスタンダー(bystander)変異を表していると思われるため、著者らはこれを含めなかった。マイクロサテライト不安定性を示す腫瘍において多くの変異が認められるが、同じ変異がＭＳＩ陽性およびマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）の原発性腫瘍の双方において観察されること、そして変異の大半は生殖系列で同定される活性化変異と同一であり、それらがマイクロサテライト不安定性に関連したバイスタンダー変異であるとすれば、偶然の一致は期待できない、という事実により、著者らはＦＧＦＲ２におけるこれらの変異は病原性であると主張することとした。

１１の異なる変異のうち、７つは、頭蓋骨癒合症または骨系統疾患の症候群に関連することが依然に報告されており、１つ（Ａ３１５Ｔ）は、類似のミスセンス変異が報告されている（Ａ３１５Ｓ）ＦＧＦＲ２残基で起こり、そして４つの変異は新規であった（図１）。腫瘍の組織型に従っての変異の分布を、ＦＧＦＲ２変異を持つ腫瘍のグレードおよびステージと共に表２にまとめる。Ｓ２５２Ｗ変異は同定された最も一般的な変異であり、８例の独立した腫瘍に認められた。この変異は、ＦＧＦリガンドとの鍵となる接触を提供する、Ｄ２およびＤ３間のリンカー領域に起こる。Ｓ２５２Ｗおよび隣接するＰ２５３Ｒの変異は、アパート症候群、すなわち頭蓋骨癒合症ならびに手足の重篤な合指症を特徴とする、最も重篤な頭蓋骨癒合症症候群を引き起こす（Park et al., 1995）。

生化学、構造、生物学のアッセイを駆使した研究を組み合わせて、Ｓ２５２Ｗ変異が、増加したリガンドの結合およびリガンドの乱交雑を示すことが示された（Ibrahimi et al., 2001; Ibrahimi et al., 2004; Yu et al., 2000）。Ｓ２５２Ｗ ＦＧＦＲ２ｃ変異体およびＳ２５２Ｗ ＦＧＦＲ２ｂ変異体の双方の受容体を用いて、広範なin vitroのアフィニティーの研究が行われ、この変異が、選択的スプライシングによるアイソフォームに起因するリガンドの結合特異性を妨害することに加えて、多数のＦＧＦ群に関する受容体の結合アフィニティーを２から８倍に増加することが示された（Ibrahimi et al., 2004）。

このパネルの腫瘍におけるＳ２５２Ｗ変異の有病率は、類内膜性子宮内膜癌ではこの変異に関して陽性の選択であることを示唆する。すべてのＦＧＦリガンドの発現について、正常な周期的な子宮内膜および子宮内膜癌では調べられていないが、菅腔上皮および腺上皮の基底部では主にＦＧＦ２が発現されているという、いくつかの研究報告がある（Moller et al., 2001; Sangha et al., 1997）。いくつかの研究はまた、複合型過形成および腺癌に関連した腺上皮におけるＦＧＦ２発現の増加を示した（Gold et al., 1994）。子宮内膜上皮細胞は正常には、ＦＧＦ２と結合することのできないＦＧＦＲ２アイソフォームのみしか発現しない。しかしこれら細胞におけるＳ２５２Ｗ変異の獲得が、結果的にＳ２５２Ｗ ＦＧＦＲ２ｂ受容体のオートクリンの活性化をもたらすと予測されている。Ｓ２５２Ｗ変異はまた、変異受容体が、子宮内膜間質に高度に発現されるＦＧＦ９と結合することを可能にする（Tsai et al., 2002）。Ｓ２５２Ｗ変異の有病率は、異なるＦＧＦＲ２アイソフォームが、子宮内膜において方向性のある上皮系から間葉系のシグナル伝達を仲介する上で、重要な役割を担うことを示唆する。

４つの付加的な細胞外ドメインの変異、すなわち細胞系列におけるＫ３１０ＲおよびＡ３１５Ｔ、ならびに原発性腫瘍におけるＳ３７３Ｃ（Ｓ３７２Ｃ）およびＹ３７６Ｃ（Ｙ３７５Ｃ）が同定され、後者の変異は２つの独立した腫瘍において認められた（図１、表２）。付加的なシステイン残基の喪失または獲得のいずれかをもたらす、ＦＧＦＲ２（またはパラロガスなＦＧＦＲ３）におけるこれらの細胞外変異について行われた機能の研究は、これらのミスセンスによる変化が、分子内よりむしろ分子間のジスルフィド結合形成による、構成的な受容体の二量体化を結果的にもたらすことを示した（Naski et al., 1996）。生殖系列において、細胞外の膜近傍のＦＧＦＲ２ｃ変異のＳ３７２ＣおよびＹ３７５Ｃは、広範囲の付加的な臨床的特徴を伴う頭蓋骨癒合症症候群であるBeare-Stevenson cutis gyrata症候群の数名の個体において報告された（Przylepa et al., 1996）。ＦＧＦＲ３ｃにおけるパラロガスな変異（Ｇ３７０ＣおよびＹ３７３Ｃ）もまた、重篤な軟骨過形成症であるＩ型致死性骨異形成症に関連する（Rousseau et al., 1996）。Ａ３１５Ｓ変異に類似するＡ３１５Ｔ変異は、ＦＧＦ１０と非正統的に結合する能力をＦＧＦＲ２ｃに与えるようである（Ibrahimi et al., 2004）。

著者らは、膜貫通ドメイン内の２つの変異；Ｃ３８３Ｒ（Ｃ３８２Ｃ）およびＭ３９２Ｒ（Ｍ３９１Ｅ）を同定した。著者らの同定したＣ３８３Ｒ変異は、軟骨異形成症の患者の９５％以上に及ぶ、ＦＧＦＲ３におけるパラロガスな位置での非保存的ミスセンス変異（Ｇ３８０Ｒ）（Shiang de al., 1994）に類似する。ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ変異は、受容体の半減期を増加し、リガンドに誘発される内部移行への抵抗性を受容体に与えることが報告されている（Monsonego-Ornan et al., 2000）。より最近の研究は、野生型の受容体はリガンドの刺激に続いてリソソームの分解を行うのに対して、変異Ｇ３８０Ｒの変異受容体は、リソソームから細胞膜に戻って再利用され、したがってＦＧＦシグナル伝達を増加させることを示した（Cho et al., 2004）。新規Ｍ３９２Ｒ変異は、黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群に関連する、よく研究されているＦＧＦＲ３ Ａ３９１Ｅ変異の近位の２残基である。Ａ３９１Ｅ変異の生物物理学的分析は、ＦＧＦＲ３膜貫通ドメインの二量体化自由エネルギーの変化が、二量体の安定化に一致することを示した（Li et al., 2006）。ＦＧＦＲ２ｃにおけるＣ３８２Ｒ変異は、構成的な受容体のリン酸化およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換をもたらすことが以前に示されている（Li et al., 1997）が、これらの膜貫通ＦＧＦＲ２ｂ変異による受容体の活性の正確なメカニズムの解明は、依然として追及されている。

細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの変異に加えて、ＦＧＦＲ２キナーゼドメインにおける４つの異なる変異が同定された。これらの２つ、すなわちＮ５５０Ｋ（Ｎ５４９Ｋ）およびＫ６６０Ｅ（Ｋ６５９Ｅ）は、いかなる頭蓋骨癒合症症候群においても生殖系列の変異として同定されていないが、ＦＧＦＲ２ｃにおける類似のＮ５４９Ｈ変異はクルーゾン症候群に関連付けられ(Kan et al., 2002)、そしてパラロガスな位置での同じ変異が、軟骨低形成症（Ｎ５４０Ｋ）および致死性骨異形成症ＩＩ（Ｋ６５０Ｅ）に関連して、ＦＧＦＲ３において認められた(Naski et al., 1996)。Ｎ５４９ＨおよびＫ６５０Ｎの変異のＦＧＦＲ２ｃキナーゼの結晶構造は、これらの変異が、キナーゼのヒンジ領域での新規の自己抑制的な分子のブレーキを緩めることにより、キナーゼを活性化させることを示す(M. Mohammadi, 未発表の結果)。

新規ＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃのスプライシング変異の病理学的結果は判明していないが、しかしこの変異が受容体の増加したシグナル伝達を結果的にもたらすと推測したいところである。エクソン１０の下流の２つのアミノ酸、バリンおよびスレオニン（ＶＴ）が含まれるか除外されるかを導く、ＦＧＦＲ１−３の細胞内膜近傍領域の選択的スプライシングがある。ＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃ変異は、ＧＣＡＡＧＴの基準外のスプライシング供与部位を結果的にもたらし、そして基準外のＧＣ−ＡＧ供与体/受容体ペアが、ＧＡ−ＡＧ供与体/受容体ペアに比して、ゲノムにおいて１５−３０倍のより高い頻度で観察される（Burest et al., 2000; Chong et al., 2004）ことを考慮すれば、ＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃ変異は、＋ＶＴアイソフォームの相対的比率の増加を結果的にもたらすものと思われる。ＦＧＦＲ群をＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路に連結するＦＲＳ２アダプターシグナル伝達タンパク質は、選択的スプライシングＶＴを含むマウスＦＧＦＲ１の膜近傍ドメインの配列に結合する（Burgar et al., 2002）。このように、ＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃ変異は、＋ＶＴ転写物のレベルを増加させる、より効率的なスプライシング供与部位をもたらす可能性があり、このことが今度はＦＲＳ２ａを介した増加したシグナル伝達を結果的にもたらすことになるのであろう。

１例の子宮内膜腫瘍は、２２８７−８８ＣＴの新規の２ｂｐの欠失を保有することが示された。この欠失はエクソン１８の最後のコドンであるコドン７６６での未成熟な切断による、ＬＴＩＮＥからＬＴＨＮＱＳｔｏｐへのフレームシフトおよび変化を導く。この２ｂｐの欠失は、ＦＧＦＲ２の同様に切断されたＣ３転写物と同様の様式で構成的に活性化される、切断されたＦＧＦＲ２受容体を結果的にもたらすか、あるいは単純にバイスタンダー変異を表すものと思われる。

２つの子宮内膜サンプルは２つの変異を保有することが示された。すなわちＡＮ３ ＣＡ ＭＳＩ陽性細胞株は、Ｎ５５０Ｋ（Ｎ５４９Ｋ）およびＫ３１０Ｋを保有し、ＭＳＩ陰性腫瘍１４９２は、Ｓ２５２ＷおよびＹ３７６Ｃ（Ｙ３７５Ｃ）を保有する。同一腫瘍における２つのおそらく優位な活性化変異の発見は、予想外であった。各例において、リガンド依存的なＳ２５２Ｗまたは特徴づけられていないＫ３１０Ｒのいずれかと共に、構成的なリガンド非依存的な受容体活性化を結果的にもたらすことが知られている変異が存在することに注目することは興味深く、子宮内膜上皮における増加したＦＧＦＲ２活性化に関して、付加的な選択圧力が存在すると思われることを示唆する。

〔実施例２〕
ＦＧＦＲ２の阻害による子宮内膜癌の治療
材料および方法
「配列解析」
変異の分析は以前に記載されている（８）ように行った。ＰＣＲプライマー配列は、Ｍ１３ tailedとし、２方向で配列決定を行った。プライマー配列は、要望に応じて著者より入手可能である。

「細胞培養および試薬」
ヒト子宮内膜ＭＦＥ２９６細胞株は、European Collection of Cell Cultures (Salisbury, Wiltshire, UK)より購入した。ヒト子宮内膜細胞株、ＡＮ３ＣＡ、ＨＥＣＩＡ、Ishikawa、ＲＬ９５２、およびＫＬＥは、Dr. Paul Goodfellow (Washington University, St. Louis, MO)の提供を受けた。ＭＦＥ２９６細胞は、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ中で成長させた。ＡＮ３ＣＡ細胞は、１０％ ＦＢＳ、非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ＨＥＣＩＡ細胞は、１０％ ＦＢＳ、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した、５０％ ＤＭＥＭ および５０％ ＲＰＭＩ １６４０中で培養した。Ishikawa細胞およびＲＬ９５２細胞は、１０％ ＦＢＳ、非必須アミノ酸、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で成長させた。ＫＬＥ細胞は、１０％ ＦＢＳ、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した、５０％ ＤＭＥＭ および５０％ Ｆ−１２培地中で成長させた。すべての培地、ＦＢＳ、および補充物質は、Invitrogen (Carlsbad, CA)より購入した。すべての細胞は、５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気下で３７℃で成長させた。ＰＤ１７３０７４はSigma-Aldrich (St. Louis, MO)より購入し、ＤＭＳＯ中で１ｍＭのストック濃度に再構成し、−２０℃で保存した。ＫＨ１−ＬＶレンチウイルスベクタープラスミドは、Dr. Maria S. Soengas (University of Michigan, Ann Arbor, MI)のご好意により提供を受け、そしてｐＮＨＰ、ｐＶＳＶ−Ｇ、およびｐＴＡＴレンチウイルスパッキングプラスミドは、Dr. Matthew Houentelman (Translatioal Genomics Research Institute, Phoenix, AZ) のご好意により提供を受けた。

「ｓｈＲＮＡデザイン」
ＦＧＦＲ２の２つの異なるエクソン（エクソン２およびエクソン１５）を標的とする、２つの独立したｓｈＲＮＡを、以下の配列に対してデザインした。エクソン２を標的とするｓｈＲＮＡ：ＴＴＡＧＴＴＧＡＧＧＡＴＡＣＣＡＣＡＴＴＡ（配列番号４；ヌクレオチド７９−９９、ＮＭ＿０２２９７０）；エクソン１５を標的とするｓｈＲＮＡ：ＡＴＧＴＡＴＴＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡ（配列番号５；ヌクレオチド１８６６−１８８４、ＮＭ＿０２２９７０）。非サイレンシングｓｈＲＮＡコンストラクトもまた、Qiagenからの非サイレンシングｓｉＲＮＡ配列（配列番号６；ＡＡＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ）に基づいてデザインし、ネガティブコントロールとして使用した。対応するオリゴヌクレオチドをアニールさせ、ＫＨ１−ＬＶレンチウイルスベクター内にクローン化した。ＫＨ１−ＬＶ自己不活性型(self-inactivating)レンチウイルスベクターは、Ｈ１プロモーターのコントロール下では短いヘアピン配列の発現を、そしてヒトユビキチン−Ｃプロモーターのコントロール下ではＧＦＰ発現を可能にし、形質導入効率を容易にモニタリングすることができる。クローン化戦略は、要望に応じて著者より入手可能である。

「レンチウイルスの作成」
７５ｃｍ^２の培養フラスコを５０ｍｇ/ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（Sigma-Aldrich、 St. Louis, MO）でコーティングし、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）を１フラスコ当たり８×１０^６細胞の密度で播いた。翌日細胞を、SuperFectトランスフェクション試薬（Quiagen, Valencia, CA）を使用して、７．１μｇ ｐＮＨＰ、２．８μｇ ｐＶＳＶ−Ｇ、０．５μｇ ｐＴＡＴ、および３．５μｇ ＫＨ１−ＬＶで、SuperFect（μｌ）対ＤＮＡ（μｇ）比４：１で、製造元のプロトコルに従ってトランスフェクションした。ウイルスを含有する培地を２４時間後および４０時間後に集め、両者を合わせ、０．４５ｍｍ低分子タンパク質結合Duraporeフィルター（Millipore Corporation, Billerica, MA）を通して濾過し、細胞の残骸を除去し、そしてウイルス調製物を分注し、使用まで−８０℃で保存した。

「レンチウイルスの形質導入」
細胞は、６ウェルプレートで１ウェル当たり４×１０^５細胞の密度で播いた。翌日細胞は、６μｇ/ｍｌ ポリブレン（Sigma-Aldrich、 St. Louis, MO）存在下、レンチウイルスストックで感染させた。空ベクターおよび非サイレンシングｓｈＲＮＡ感染を、各実験のコントロールとして使用した。ｅＧＦＰ可視化により決定した（データは示していない）ところ、各ｓｈＲＮＡ実験において９０％より高い形質導入効率を達成した。

「成長阻害アッセイ」
感染後２４時間で細胞をトリプシン処理し、完全成長培地中で９６ウェルプレートに１ウェル当たり５，０００細胞の密度でトリプルで播き、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ（Sigma-Aldrich、 St. Louis, MO）を使用して増殖を評価した。指定した時間ポイントにウェルを１０％（wt/vol）トリクロロ酢酸で固定し、ＳＲＢで３０分間染色し、１％（vol/vol）酢酸で洗浄した。タンパク質と結合した色素を１０ｍＭ Trisベースの溶液に溶解させ、５１０ｎｍで吸光度を測定した。ＰＤ１７３０７４薬の研究用として、細胞を完全成長培地中で９６ウェルプレートに１ウェル当たり５，０００細胞の密度で播いた。翌日、段階的に増加する濃度のＰＤ１７３０７４を加え、７２時間後にＳＲＢを使用して増殖を評価した。

「アポトーシス細胞のアネキシンＶ−ＦＩＴＴＣ標識」
アネキシンＶ−ＦＩＴＴＣ染色を使用して、製造元の指示書に従ってアポトーシスを起こした細胞上のホスファチジルセリンの暴露を測定した（BioVision, Inc. Mountain View, CA）。ｓｈＲＮＡは、ＦＩＴＣと重複する発光スペクトルを有するＧＦＰもまた発現するため、ノックダウンはｓｈＲＮＡコンストラクトよりむしろｓｉＲＮＡコンストラクトを用いて達成した。６ウェルプレートで、１ウェル当たり２．５×１０^５細胞を播いた。２４時間後に細胞を、２５ｎＭ 非サイレンシング（ＮＳ）ｓｉＲＮＡ、またはＦＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ Ｘ２で、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、室温で２０分間放置してリポフェクタミン２０００との複合体を形成させ、トランスフェクションを３７℃で２４時間行った。トランスフェクション後４８時間で、浮遊しているおよび付着した細胞を集め、冷却ＰＢＳで洗浄し、アネキシン結合バッファー（１０ｍＭ Hepes（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）中に再懸濁し、５００ｎｇ/ｍＬ アネキシンＶ−ＦＩＴＣ、および１μｇ/ｍＬ ヨウ化プロピジウム（Sigma-Aldrich、 St. Louis, MO）で染色し、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター、およびSummitソフトウェア、バージョン４．３（Dako Cytomation, Carpinteria, CA）を使用して、アネキシン陽性の細胞について分析した。ＰＤ１７３０７４の研究用に、細胞を６ウェルプレートで、１ウェル当たり１×１０^５細胞の密度で播いた。２４時間後、細胞を１μＭ ＰＤ１７３０７４またはＤＭＳＯ（ビヒクルコントロール）で処理し、指定した時間ポイントにアネキシンＶ−ＦＩＴＴＣで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。

「細胞周期の分析」
細胞は、６ウェルプレートで１ウェル当たり１×１０^５細胞の密度で播いた。翌日、細胞は１μＭ ＰＤ１７３０７４またはＤＭＳＯ（ビヒクルコントロール）で処理した。７２時間後細胞を、記載されている{Krishan, 1975 #28}ようにヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。細胞周期の分析は、ModFit ソフトウェア（Verity Software House, Inc. Topsham, ME）を使用して行った。

「ウェスタンブロット解析」
細胞は６０ｍｍ^２のディッシュに、１ディッシュ当たり２×１０^６細胞の密度で播いた。翌日細胞を、０．２％ ＦＢＳ中で１８時間一晩飢餓状態にするか、または完全成長培地中に維持した後、段階的に増加する濃度のＰＤ１７３０７４と共に３時間インキュベーションした。細胞は氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、キナーゼバッファー[２０ｍＭ Hepes ｐＨ７．４、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Triton Ｘ１００、１０％ グリセロール、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＮａＦ、１００μＭ ＡＥＢＳＦ、および１錠/１０ｍＬのMini Complete Protease Inhibitor(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)]中ですすぎ、ウシガンマグロブリンスタンダード（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を用いてQuick Start Bradford Reagentを使用して、タンパク質濃度を推定した。等量のタンパク質を，４−１２％濃度勾配ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリビニリデンジフロリドメンブレン(Invitrogen, Carlsbad, CA)に転写した。メンブレンは、リン酸化されたおよび総合のＡＫＴ、ＥＲＫ１/２、ｐ３８、ＳＴＡＴ−３およびＳＴＡＴ−５、ＰＬＣγ、ならびに総ＲＴＥＮに対する抗体を用いてイムノブロットした（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）。ＦＧＦＲ２の発現は、ＢｅｋＣ１７抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）を用いて検出した。ホースラディッシュペルオキシダーゼと複合体化したヤギ抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（Biomeda, Foster City, CA）を使用し、続いて化学発光染色を行った。ｓｈＲＮＡの研究用に、ｓｈＲＮＡ形質導入後４８時間に溶菌液を集め、上に記載したように処理した。

「統計分析」
統計分析は、MacintoshのGraphPad Prism バージョン４．０（GraphPad Software, San Diego, CA）を使用して行った。ＩＣ５０値は、勾配の変動を伴うシグモイド型用量応答の非線形回帰を使用する用量−応答分析により算出した。アポトーシスデータは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）により分析した。治療群間の有意差は、Student検定を使用して決定した。すべてのＰ値は、Ｐ＜０．０５である場合に有意とみなした。データは平均±ＳＥとして表した。

結果
「原発性子宮内膜癌におけるＦＧＦＲ２、ＰＴＥＮ、およびＫＲＡＳ２の変異のパターン：同時に起こるＦＧＦＲ２およびＰＴＥＮの変異、ならびに相互排他的なＦＧＦＲ２およびＫＲＡＳ２の変異。」
類内膜性子宮内膜癌において、ＰＴＥＮおよびＫＲＡＳ２の変異が一般的であることを考慮して、ＰＴＥＮにおける機能喪失型の変異、および/またはＫＲＡＳにおける機能獲得型の変異を持つ腫瘍において、ＦＧＦＲ２活性化が起こっているかどうかを決定することを、最初に模索した。ＦＧＦＲ２変異の状態が分かっている１１６例の子宮内膜腫瘍において、ＰＴＥＮの９つすべてのエクソン、およびＫＲＡＳのエクソン１の配列決定を行った。類内膜性子宮内膜癌においてはエクソン１の変異がＫＲＡＳ変異の９６％より多くを占めることから、入手可能なＤＮＡの量が限定されるため、ＫＲＡＳのエクソン１の配列決定のみを行った（The Catalog of Somatic Mutation in Cancer, http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic）。変異の分析は、腫瘍の７０％（８２/１１６）にＰＴＥＮ変異を明らかにした。ＦＧＦＲ２変異を有するこれら腫瘍のうち、７７％（１４/１８）はＰＴＥＮ変異もまた保有しており、類内膜性子宮内膜腫瘍において、ＦＧＦＲ２の変異はしばしばＰＴＥＮ変異と並行して起こることを示した。ＫＲＡＳ変異は腫瘍の１２％（１５/１１６）に同定された。ＧＦＲ２およびＫＲＡＳにおける活性化変異は、相互排他的であった。注目すべきことに、１例の腫瘍は、ＦＧＦＲ２におけるフレームシフト変異（２２９０−９１ ｄｅｌＣＴ）を保有し、かつＫＲＡＳ変異を含有していた。しかし、このＦＧＦＲ２変異の病理学的本質が不明であるため、著者らはＦＧＦＲ２における活性化変異は、ＫＲＡＳにおける活性化変異とは相互排他的であると結論した。ＰＴＥＮ不活性化変異は、ＫＲＡＳ変異およびＦＧＦＲ２変異の双方と並行して起こっていた（表３）。

「ＦＧＦＲ２のｓｈＲＮＡによるノックダウンは、ＰＴＥＮの不活性化にもかかわらず、子宮内膜癌細胞の細胞死を誘発する」
子宮内膜癌においてＰＴＥＮ不活性化という状況でＦＧＦＲ２活性化変異が起こること、そして細胞の生存を促進するＰ１３Ｋ/ＡＫＴ経路の公知の役割を考慮して、次にＦＧＦＲ２の阻害が、ＰＴＥＮ不活性化の存在下で細胞死を誘発できるかどうかを決定することを模索した。細胞増殖におけるＦＧＦＲ２発現のｓｈＲＮＡによるノックダウンの効果は、双方ともＦＧＦＲ２活性化変異を保有する、ＡＮ３ＣＡおよびＭＦＥ２９６の子宮内膜癌細胞において評価した。加えてＡＮ３ＣＡは、ＰＴＥＮの対立遺伝子双方に変異を有しており、ＰＴＥＮを発現しない（図１Ｅ）。加えてＡＮ３ＣＡは、ＰＴＥＮの双方の対立遺伝子に変異を有し、ＰＴＥＮを発現しない。他方ＭＦＥ２９６は、ＰＴＥＮおよびＰＩＫ３ＣＡに関して野生型である（The Catalog of Somatic Mutation in Cancer、http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic）。ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞に、ＦＧＦＲ２を標的とする２つの独立したｓｈＲＮＡをレンチウイルスにより形質導入した。細胞の増殖および生存率は、複数の時間ポイントで測定した。ＦＧＦＲ２のノックダウンは、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞の双方における細胞増殖を阻害し（図１Ａ、Ｂ）、ＰＴＥＮ不活性化の存在下でさえも活性化されたＦＧＦＲ２を標的とする有効性を示した。ｓｈＲＮＡの形質導入後４８時間のウェスタンブロットにより、ＦＧＦＲ２発現のノックダウンを確認し、ＥＲＫ１/２およびＡＫＴのリン酸化を調べた。図１ｃに示したように、ＦＧＦＲ２ ｓｈＲＮＡコンストラクトは双方とも、ＦＧＦＲ２タンパク質の９０％より高いノックダウンを結果的にもたらした。リン酸化ＥＲＫ１/２のレベルの低下は、ＦＧＦＲ２のノックダウンに続いてＡＮ３ＣＡにおいて認められた。この効果は、細胞を０．２％ ＦＢＳで中成長させた時にはより顕著であった。しかしセリン４７３でのＡＫＴリン酸化の変化は観察されておらず（図１Ｃ）、この細胞株のＰＴＥＮ変異の状態と一致する。

ＦＧＦＲ２ノックダウンに続いて観察された細胞死が、アポトーシスの誘発によるものであることを確認するため、ＡＮ３ＣＡ細胞に、ＦＧＦＲ２を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで標識して、暴露されたホスファチジルセリンをフローサイトメトリーにより検出した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性の染色の増加は、非サイレンシングｓｉＲＮＡコントロールと比較して、ＦＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後４８時間には明らかであり、これらの細胞がアポトーシスを起こしていることを示した（図１Ｄ）。ＦＧＦＲ２のノックダウンに続いて観察された細胞生存能の劇的な阻害は、これらの細胞が癌遺伝子依存性を示すと思われることを示唆する。それ故、活性化されたＦＧＦＲ２は子宮内膜癌において潜在的治療標的である。

「活性化されたＦＧＦＲ２を発現する子宮内膜癌細胞は、汎用的ＦＧＦＲ阻害剤であるＰＤ１７３０７４に対して感受性がある」
６つの子宮内膜癌細胞株（２つの変異株Ｎ５５０Ｋ ＦＧＦＲ２、および４つの野生型ＦＧＦＲ２）を、汎用的ＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＰＤ１７３０７４の、段階的に増加する濃度で処置した。この阻害剤は、ＦＧＦＲ群（ＦＧＦＲ１、ＩＣ５０＝〜２５ｎＭ）およびＶＥＧＦ群（ＶＥＧＦ２、ＩＣ５０＝〜１００ｎＭ）に対する高い選択性を示し、ＦＧＦＲ３の活性化ｔ（４；１４）転位置および活性化変異を有する骨髄腫細胞において、アポトーシスを導入することが示されている（１０）。図２Ａに示したように、変異ＦＧＦＲ２を有する２つの子宮内膜癌細胞株は、野生型ＦＧＦＲ２を有する細胞株に比して、ＰＤ１７３０７４による阻害に対して１０−４０倍高い感受性があった。ＰＴＥＮの双方の対立遺伝子における機能喪失型変異を有するＡＮ３ＣＡ株は、最も感受性の高い細胞株であった。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識は、〜７０％のＡＮ３ＣＡ細胞が、薬剤の処置後９６時間でアポトーシスを起こしていることを示した（図３Ａ）。加えて細胞周期の分析は、ＰＤ１７３０７４処置がＡＮ３ＣＡ細胞のＧ１期での停止を誘発することを明らかにした（図３Ｂ）。図２Ｃに示したように、構成的に活性なＦＧＦＲ２キナーゼドメイン変異Ｎ５５０Ｋは、外来のＦＧＦ２リガンドの不在下（−ＦＧＦ２）および存在下（＋ＦＧＦ２）の双方において、野生型受容体（ＷＴ）により誘発されるレベルを上回る、増殖の増加を結果的にもたらす。これらのデータは、Ｎ５５０Ｋ変異が構成的に活性である一方で、Ｎ５５０Ｋ変異はまた完全な活性のためにはリガンドを必要とすることを示唆する。マウスインターロイキン依存性プロＢ ＢａＦ３細胞株は、受容体型チロシンキナーゼ機能の評価のためのモデルシステムとして、ルーチンに使用されている。ＢａＦ３細胞の増殖および生存は正常にはＩＬ−３に依存するが、活性化された受容体型チロシンキナーゼのシグナル伝達が、細胞の生存能および増殖を維持するＩＬ−３に置き換わることができる。増殖アッセイは、ＩＬ−３不在下、そして１ｎＭ ＦＧＦ２および１０μｇ/ｍｌ ヘパリンの存在下で行い、５日後、ViaLight Plus Cell Proliferation/Cytotoxicity キット(Lonza rockland Inc)を製造元の指示書に従って使用して、増殖をアッセイした。

「汎用的ＦＧＦＲ阻害に続く細胞死は、ＥＲＫの阻害、ＡＫＴの部分的阻害に関連するが、ＳＴＡＴ３の阻害またはｐ３８の活性化には関連しない」
ｐ３８の遅延された活性化とカップルしたＥＲＫ１/２、ＡＫＴ、およびＳＴＡＴ３/５のリン酸化の阻害は、癌遺伝子依存性を示す細胞における細胞死の誘発に関連する一般的な特色であることが、報告されている（１７）。ＰＤ１７３０７４処置がこれらの経路、すなわちＥＲＫ１/２、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３/５、およびｐ３８の類似の阻害を結果的にもたらすかどうかを決定するため、リン酸化レベルを、３つの細胞株（ＰＤ１７３０７４に対して感受性の２つ、および抵抗性の１つ）においてウェスタンブロットにより評価した。ＳＴＡＴ５発現は、これら３つの細胞株におけるウェスタンブロットでは検出できなかった（データは示していない）。図４に示したように、３時間のＰＤ１７３０７４による処置は、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞におけるＥＲＫ１/２のリン酸化の、濃度依存的な減少をもたらした。野生型ＦＧＦＲ２を発現し、そしてＰＤ１７３０７４抵抗性であるＨＥＣＩＡ細胞は、ＥＲＫ１/２リン酸化の減少を示さなかった。このことは、ＫＲＡＳ２ Ｇ１２Ｄ変異による、この細胞株のＭＡＰＫ経路の下流の活性化と一致する（The Catalog of Somatic Mutation in Cancer、http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic）。

ＰＤ１７３０７４処置はまた、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞において、スレオニン３０８およびセリン４７３でのＡＫＴのリン酸化の中程度の低減をもたらす。ＨＥＣＩＡ細胞では、ＡＫＴの活性化の低下は明らかではなかった。特に、ＰＤ１７３０７４処置は検査したいずれの細胞株においても、ＳＴＡＴ３またはｐ３８のリン酸化には奏功しなかった（図４）。ＦＧＦＲ群はこの経路を通してのシグナル伝達することが示されている（１８）ため、著者らはまたＰＬＣγの活性化についても調べた；ＰＬＣγ活性化における変化は、ＰＤ１７３０７４処置後には観察されなかった（データは示していない）。

ＰＤ１７３０７４処置後３時間では、ＳＴＡＴ３またはｐ３８の活性化における変化は明らかではなかったが、癌遺伝子依存性のこれまでのモデルは、ｐ３８の活性化は遅延され、癌遺伝子阻害後８−２４時間にピークに達することを示している{Sharma, 2006 #17}。それ故著者らは、ＰＤ１７３０７４処置後０から７２時間の範囲の様々な時間ポイントで、ＥＲＫ１/２、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３/５、およびｐ３８の活性化を評価した。図４に提示したデータと一致して、ＰＤ１７３０７４処理は、ＭＦＥ２９６細胞およびＡＮ３ＣＡ細胞においてＥＲＫ１／２活性化の急速な低下をもたらしたが、ＨＥＣＩＡ細胞では認められなかった（図５Ａ）。リン酸化されたＥＲＫ１／２は、ＰＤ１７３０７４処置後２４−４８時間で戻り始めたが、７２時間までにベースラインの活性化には達しなかった。リン酸化されたＡＫＴの低減もまた、ＭＦＥ２９６細胞およびＡＮ３ＣＡ細胞において検出されたが、セリン４７３位よりスレオニン３０８位の方がより顕著であった（図５Ａ）。ＡＫＴ活性化の減少は、ＭＡＰＫのリン酸化の急速な阻害と比較して遅れ、ＰＤ１７３０７４処置後８時間および２４時間にＡＫＴリン酸化の最大の減少が検出された。

特に、ＳＴＡＴ３/５またはｐ３８の活性化の変化は、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞においては、時間コースを通して検出されなかった（図５Ａ）。細胞を０．２％ＦＢＳ培地中で成長させた場合、ＰＤ１７３０７４による処置は、完全成長培地で観察されたのと同様に、ＡＮ３ＣＡおよびＭＦＥ２９６双方においてＭＡＰＫ活性化の低下をもたらした（図５Ｂ）。興味深いことに０．２％ＦＢＳ培地中でのＰＤ１７３０７４処置は、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞において、スレオニン３０８でのリン酸化ＡＫＴの中程度の低減、およびセリン４７３のわずかな低減を結果的にもたらした。０．２％ＦＢＳ中のＡＮ３ＣＡ細胞株におけるＡＫＴの構成的活性化は、ＰＴＥＮの双方の対立遺伝子の不活性化による可能性が高い；構成的ＡＫＴ活性化のメカニズムは、ＭＦＥ２９６細胞においては、この細胞が野生型ＰＴＥＮおよびＰＩＫ３ＣＡを発現するため分かっていない。

考察
腫瘍の進行の分子的基盤を理解することで、多様な癌のタイプにおける標的療法の開発および成功を導いてきた{Pickering, 2008 #27}。様々なシグナル伝達経路に関与する遺伝子内の活性化変異が、結果的にこれら経路に対する腫瘍細胞の“依存性”をもたらし得る、という証拠がますます挙げられてきている{Sharma, 2007 #31}。さらにこれら活性化変異は、潜在的な治療標的を同定するために貢献するだけでなく、それらの存在はまた経路の阻害に対する臨床応答を予測することが可能になる{Lynch, 2004 #30}。しかし、標的の阻害に対する応答は、これらの変異が起こる分子の状況により影響されることが、ますます明らかになってきている。以前に著者らが、類内膜性子宮内膜腫瘍の〜１６％にＦＧＦＲ２の活性化変異を同定したように、本明細書においても、ＦＧＦＲ２変異が子宮内膜癌内で起こる遺伝子の状況を調べることを模索した。著者らはまた、ＦＧＦＲ２に活性化変異を保有する子宮内膜癌細胞においてＦＧＦＲ２を阻害することの生物学的結果を調べることにより、活性化されたＦＧＦＲ２を標的とする治療の可能性を評価することを模索した。

本研究において著者らは、公知のＦＧＦＲ２変異状態を有する、類内膜性子宮内膜腫瘍のＫＲＡＳ変異およびＰＴＥＮ変異の状態を評価した。ＫＲＡＳおよびＦＧＦＲ２の活性化変異は同一腫瘍内で一緒に起こってはおらず、ＦＧＦＲ２がＭＡＰＫ経路を通して腫瘍形成を行うことと一致する。ＦＧＦＲ２活性化はＰＴＥＮ不活性化と並行して起こっており、少なくとも子宮内膜細胞においてＦＧＦＲ２は、その生物学的効果をＰＩ３Ｋ/ＡＫＴを通しては仲介しないことを示唆する。このことは、子宮内膜細胞のＦＧＦ７またはＦＧＦ１０の刺激が結果的にＥＲＫ１／２の活性化をもたらすが、ＡＫＴは活性化しない、という以前のある報告（１９）により支持される。ＰＴＥＮおよびＫＲＡＳの変異は、同一腫瘍内で起こっており、以前の報告（２０）と一致する。

著者らはまた、ＦＧＦＲ２シグナル伝達がＡＮ３ＣＡおよびＭＦＥ２９６の子宮内膜癌細胞株の生存および増殖に必須であることを示したが、このことは癌遺伝子依存性をおおいに示唆するものである。この結果は、活性化されたＦＧＦＲ２を有する２つの細胞株が、汎用的ＦＧＦＲ阻害剤であるＰＤ１７３０７４に対して選択的感受性があることを著者らが示した、ＰＤ１７３０７４ ＩＣ_５０の研究により支持される。ＡＮ３ＣＡ細胞がＰＤ１７３０７４に対して最も感受性が高く、かつＰＴＥＮの変異株であることは注目に値する。このことは、類内膜性子宮内膜癌におけるＰＴＥＮ変異の高い発生率を考慮すると、特に重要である。ＰＴＥＮ不活性化は、細胞の“癌遺伝子依存性”を活性化された受容体の経路から構成的に活性化されたＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達へと移し、そうして受容体の阻害に対する抵抗性を導くと思われることが示唆された（２１）。事実、低減されたまたは不在のＰＴＥＮを有するＥｒｂＢ２を過剰発現する乳腫瘍は、トラスツツマブを含有する化学療法の投与計画に対して、相対的に抵抗性である（２２，２３）。注目すべきことに、ＰＴＥＮの喪失にもかかわらず、汎用的阻害剤によるＦＧＦＲ２の阻害は、ＡＮ３ＣＡ細胞における細胞死および細胞周期の停止を誘発した。このようにＡＮ３ＣＡ細胞はなお、ＦＧＦＲ２の癌遺伝子シグナルに依存性である。興味深いことにＰＤ１７３０７４処置は細胞周期の停止を誘発したが、ＭＦＥ２９６細胞においては高められたアネキシンＶ染色という結果を得られなかった（データは示していない）。細胞周期の停止だけが、ＭＦＥ２９６細胞におけるＰＤ１７３０７４の有効性の原因であるのかどうか、または未知のメカニズムを通してのアネキシンＶ陰性の細胞死の誘発がまた関与するのかどうか、依然として決定されていない。

癌遺伝子の不活性化が、リン酸化されたＥＲＫ、ＡＫＴ、およびＳＴＡＴ３/５の急速な喪失、および遅延されたｐ３８の活性化に関連することから、Ｓｒｃ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、およびＥＧＦＲの活性化に起因する癌遺伝子依存性は、共通のシグナル伝達カスケードを共有することが示唆された（１７）。著者らは本明細書において、完全成長培地中のＦＧＦＲ２の阻害は、リン酸化されたＥＲＫの喪失、およびＡＫＴの部分的阻害に関連するが、ＳＴＡＴ３またはｐ３８のリン酸化状態には奏功しないことを報告する。それ故、ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞における、活性化されたＦＧＦＲ２への依存性の根底にあるメカニズムは、癌遺伝子依存性のその他のモデルとは別個のものである。

ＰＤ１７３０７４を用いての汎用的ＦＧＦＲ阻害により誘発される細胞死は、１０％ＦＢＳ、および０．２％ＦＢＳを補充した双方の培地において、ＥＲＫ１／２活性化の完全な阻害に相関していた。ＡＮ３ＣＡ細胞における変異ＰＴＥＮの状態を考慮すると、予想外なことに、ＰＤ１７３０７４処置は、１０％ＦＢＳ含有培地においてＡＫＴリン酸化の部分的喪失をもたらした。それ故ＦＧＦＲ２は、ＰＴＥＮの下流のＡＫＴリン酸化を仲介する可能性がある。事実マウスのケラチノサイトにおいて、インスリン様成長因子Ｉは、プロテインキナーゼＣを介したプロテインホスファターゼの制御に関与するＰＩ３Ｋの独立したメカニズムを通して、ＡＫＴリン酸化を変化させることが示されている（２４）。ＡＮ３ＣＡ細胞およびＭＦＥ２９６細胞のＰＤ１７３０７４処置に続いて観察された減少したＡＫＴリン酸化の原因となるメカニズムは、依然として決定されていない。しかしＡＮ３ＣＡ細胞で観察されたＰＤ１７３０７４に誘発された細胞死は、ＡＫＴのこの脱リン酸化とは独立している可能性が高い。０．２％ＦＢＳで行った濃度応答曲線は、１０％ＦＢＳで得られたものと、ＡＮ３ＣＡに関して類似のＩＣ_５０を得た（データは示していない）。０．２％ＦＢＳ中で成長させたＡＮ３ＣＡ細胞は、ＡＫＴの著明な脱リン酸化は示さなかったことから、これらのデータを合わせると、この細胞株においてＡＫＴの脱リン酸化は、ＰＤ１７３０７４誘発による細胞死に必要ではないことを示唆する。

まとめると著者らは、原発性類内膜性子宮内膜癌において、ＦＧＦＲ２変異はＰＴＥＮ不活性化と同時に発生するが、ＫＲＡＳ２変異とは相互排他的であることを示した。
ｓｈＲＮＡのノックダウンによるＦＧＦＲ２シグナル伝達の遮断、または汎用的ＦＧＦＲ阻害剤であるＰＤ１７３０７４による治療は、活性化されたＦＧＦＲ２を発現する子宮内膜癌細胞株の細胞周期の停止および細胞死を結果的にもたらした。しかし、ＦＧＦＲ２の阻害の後に変化した細胞の経路は、癌遺伝子依存性が示された他の癌遺伝子の阻害の後に観察されたものとは別個のものであった。子宮内膜癌におけるＦＧＦＲ２活性化に関連する癌遺伝子依存性の新たな経路が、おそらく出現するだろう。これらのデータを合わせると、構成的に活性な変異ＦＧＦＲ２の阻害は、この癌のタイプにおける高頻度のＰＴＥＮの不活性化にもかかわらず、子宮内膜癌患者にとって治療上有益であることを示す。

本発明は、本明細書に記載した特定の態様により範囲が限定されるものではない。本明細書に記載したものに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。その様な修飾は、請求項の範囲内に含まれることを意図する。すべての数値は概算であり、説明の目的としてのみ提供することもまた、理解されるものとする。

本出願を通して引用した、すべての特許、特許出願、公開広報、製品の説明、およびプロトコルを、その全内容においてすべての目的に関し本明細書にて参照として援用する。

Claims (36)

1. 被験者における子宮内膜癌または前癌を検出する方法であって、子宮内膜細胞を含有する生体サンプルにおける線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）の受容体の変異を検出することを包含し、その場合変異はＦＧＦＲ２受容体の活性化に関連し、子宮内膜細胞におけるＦＧＦＲ２の前記変異の存在が、被験者の子宮内膜癌または前癌の診断指標である、前記方法。
2. 前記検出が、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡから成る群より選択される、少なくとも１つの核酸における少なくとも１つのヌクレオチドＦＧＦＲ２の変異に関するスクリーニングを包含する、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＦＧＦＲ２受容体活性化変異の検出が、以下から成る群：免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインＩＩおよびＩＩＩ間の接合部における変異；ＩｇＩＩＩドメインにおける変異；ＩｇＩＩＩドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン間の接合部における変異；ＴＭドメインにおける変異；ＴＭドメインおよびチロシンキナーゼドメインＩ間の接合部における変異；チロシンキナーゼドメインＩにおける変異、またはチロシンキナーゼドメインＩＩにおける変異、より選択される、ＦＧＦＲ２における少なくとも１つの変異である、請求項１に記載の方法。
4. 変異が、ＦＧＦＲ２における少なくとも１つのアミノ酸の置換を結果的にもたらす、請求項１に記載の方法。
5. ＦＧＦＲ２におけるアミノ酸の置換が、以下から成る群：（ａ）配列番号２（ＮＰ＿０７５２５９．２）もしくは配列番号３（ＮＰ＿０００１３２．１）の２５２位のＳからＷへの変異；（ｂ）配列番号２もしくは３の３１０位のＫからＲへの変異；（ｃ）配列番号２もしくは３の３１５位のＡからＴへの変異；（ｄ）配列番号２の３７３位もしくは配列番号３の３７２位のＳからＣへの変異；（ｅ）配列番号２の３７６位もしくは配列番号３の３７５位のＹからＣへの変異；（ｆ）配列番号２の３８３位もしくは配列番号３の３８２位のＣからＲへの変異；（ｇ）配列番号２の３９２位もしくは配列番号３の３９１位のＭからＲへの変異；（ｈ）配列番号２の５４８位もしくは配列番号３の５４７位のＩからＶへの変異；（ｉ）配列番号２の５５０位もしくは配列番号３の５４９位のＮからＫへの変異；または（ｊ）配列番号２の６６０位もしくは配列番号３の６５９位のＫからＥへの変異、より選択される、請求項４に記載の方法。
6. 変異が、配列番号２および３の２５２位のＳからＷへの変異である、請求項５に記載の方法。
7. 少なくとも２つのＦＧＦＲ２受容体活性化変異が検出される、請求項１に記載の方法。
8. 変異が、高められたリガンドの結合、乱交雑のリガンドのアフィニティー、構成的な受容体の二量体化、障害された再利用、遅延された分解、またはキナーゼの活性化を結果的にもたらし、それによりＦＧＦＲ２受容体を活性化する、請求項１に記載の方法。
9. 変異が、以下から成る群：配列番号１の２２９０−９１位のヌクレオチドＣおよびＴの欠失；またはＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃのスプライシング変異、より選択される、請求項２に記載の方法。
10. ＰＴＥＮ不活性化変異もまた検出される、請求項１に記載の方法。
11. 癌が、類内膜性の組織学的サブタイプである、請求項１に記載の方法。
12. 被験者がヒトであり、ＦＧＦＲ２が構成的に活性な変異である、請求項１に記載の方法。
13. この状態を患っている被験者における子宮内膜癌または前癌を治療する方法であって、ＦＧＦＲ２の活性化を特徴とする子宮内膜癌または前癌を有する被験者に、医薬的に受容可能な担体と共に有効量のＦＧＦＲ２阻害剤を投与することを包含し、その場合ＦＧＦＲ２阻害剤がＦＧＦＲ２の発現または活性を阻害し、それにより被験者の子宮内膜癌の成長または増殖を効果的に阻害する、前記方法。
14. ＦＧＦＲ２阻害剤が、ＦＧＦＲ２遺伝子の発現またはＦＧＦＲ２発現産生物を阻害する、請求項１３に記載の方法。
15. ＦＧＦＲ２阻害剤がＰＤ１７３０７４である、請求項１４に記載の方法。
16. ＦＧＦＲ２阻害剤が、阻害的短鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピン型短鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)、またはリボザイムである、請求項１４に記載の方法。
17. 阻害剤がｓｈＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
18. ｓｈＲＮＡが、ＦＧＦＲ２のエクソン２（配列番号４）、および/またはＦＧＦＲ２のエクソン１５（配列番号５）を標的とする、請求項１７に記載の方法。
19. 阻害剤が、ＦＧＦＲ２に対して作成された抗体を包含する、請求項１４に記載の方法。
20. 抗体が、ＦＧＦＲ２の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインＩＩおよびＩＩＩのリンカー領域；ＦＧＦＲ２のＩｇＩＩＩドメイン；ＦＧＦＲ２のＩｇＩＩＩドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン間の接合部；ＦＧＦＲ２のＴＭドメイン中の変異；ＦＧＦＲ２のＴＭドメインおよびチロシンキナーゼドメインＩ間の接合部；ＦＧＦＲ２のチロシンキナーゼドメインＩ、またはＦＧＦＲ２のチロシンキナーゼドメインＩＩ、に対して作成される、請求項１９に記載の方法。
21. 抗体が、配列番号２または３の２５２位のＳからＷへの変異に対して作成される、請求項１９に記載の方法。
22. 抗体がヒト化抗体である、請求項１９に記載の方法。
23. 阻害剤が、子宮内膜癌細胞の細胞周期の停止またはアポトーシスを誘発する、請求項１３に記載の方法。
24. ＦＧＦＲ２が構成的に活性な変異である、請求項１３に記載の方法。
25. ＦＧＦＲ２阻害剤を、子宮内膜癌に関する外科的処置後に、術後の被験者の子宮内膜癌の再発を阻害するために被験者に投与する、請求項１３に記載の方法。
26. 子宮内膜癌を分類する方法であって、以下：
    子宮内膜癌細胞内のＦＧＦＲ２変異に関してスクリーニングする、そして
    子宮内膜癌細胞内のＦＧＦＲ２活性化変異が発見されると、子宮内膜癌のタイプをＦＧＦＲ２活性化に誘発される子宮内膜癌として分類する、
    ことを包含する前記方法。
27. 請求項２６に記載の方法であって、前記分類が子宮内膜癌を有する被験者のための治療を開発するために使用され、前記方法においてＦＧＦＲ２変異がＦＧＦＲ２活性化を誘発するかどうかを決定するステップをさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
28. ＦＧＦＲ２における変異が、免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインＩＩおよびＩＩＩ間の接合部における変異；ＩｇＩＩＩドメインにおける変異；ＩｇＩＩＩドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン間の接合物における変異；ＴＭドメインにおける変異；ＴＭドメインおよびチロシンキナーゼドメインＩ間の接合部における変異；チロシンキナーゼドメインＩにおける変異、またはチロシンキナーゼドメインＩＩにおける変異である、請求項２６に記載の方法。
29. 変異が、ＦＧＦＲ２における少なくとも１つのアミノ酸の置換を結果的にもたらす、請求項２８に記載の方法。
30. ＦＧＦＲ２におけるアミノ酸の置換が、以下から成る群：（ａ）配列番号２（ＮＰ＿０７５２５９．２）もしくは配列番号３（ＮＰ＿０００１３２．１）の２５２位のＳからＷへの変異；（ｂ）配列番号２もしくは３の３１０位のＫからＲへの変異；（ｃ）配列番号２もしくは３の３１５位のＡからＴへの変異；（ｄ）配列番号２の３７３位もしくは配列番号３の３７２位のＳからＣへの変異；（ｅ）配列番号２の３７６位もしくは配列番号３の３７５位のＹからＣへの変異；（ｆ）配列番号２の３８３位もしくは配列番号３の３８２位のＣからＲへの変異；（ｇ）配列番号２の３９２位もしくは配列番号３の３９１位のＭからＲへの変異；（ｈ）配列番号２の５４８位もしくは配列番号３の５４７位のＩからＶへの変異；（ｉ）配列番号２の５５０位もしくは配列番号３の５４９位のＮからＫへの変異；または（ｊ）配列番号２の６６０位もしくは配列番号３の６５９位のＫからＥへの変異、より選択される請求項２９に記載の方法。
31. 変異が、高められたリガンドの結合、乱交雑のリガンドのアフィニティー、構成的な受容体の二量体化、遅延された分解、障害された再利用、またはキナーゼの活性化を結果的にもたらし、それによりＦＧＦＲ２受容体を活性化する、請求項２６に記載の方法。
32. 変異が、配列番号１の２２９０−９１位のヌクレオチドＣおよびＴの欠失；またはＩＶＳ１０＋２Ａ＞Ｃのスプライシング変異である、請求項２６に記載の方法。
33. 癌が、類内膜性の組織的サブタイプである、請求項２６に記載の方法。
34. 被験者がヒトであり、ＦＧＦＲ２が構成的に活性な変異である、請求項２６に記載の方法。
35. 子宮内膜癌を診断または分類するためのキットであって、ＦＧＦＲ２遺伝子の変異部位に特異的にハイブリッド形成する、もしくは隣接するオリゴヌクレオチド、またはＦＧＦＲ２タンパク質における変異を特異的に認識する抗体；および子宮内膜癌の診断で使用するための説明書を包含し、その場合変異が、子宮内膜細胞におけるＦＧＦＲ２タンパク質の増加した活性もしくは発現を結果的にもたらす、前記キット。
36. 抗体が、配列番号２または３の２５２位のＳからＷへの変異を標的とする、請求項３５に記載のキット。