JP3771218B2 - 細胞老化関連核酸配列及びタンパク質 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は老化に関連された核酸配列及びタンパク質に関するものであって、より詳細には細胞老化に関連された核酸配列及びタンパク質そしてそれらの用途に関するものである。
【０００２】
従来の技術
老化の機構に対しての活発な研究があり、多様な仮説が提示された。前記仮説は(a)老化のフリーラジカル理論(Harman D, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7124-7128(1981))、 (b)交互結合理論(Bjorksten J., J. Am. Geriatr Soc., 16, 408-423(1968))、(c)ミトコンドリア理論(Lee CM et al., Free Radic. Biol. Med., 22, 1259-1269(1997); 及びWallace DC et al., Biofactors, 7, 187-190(1998))、そして (d)遺伝的プログラム理論(Harley CB et al., Curr. Opin. Genet. Dev., 5, 249-255(1995))などを含む。
【０００３】
また、老化は細胞レベル(即ち、細胞老化)で研究が進行された。研究によると、老化細胞は(a)細胞サイクルのG1段階で止まっていて、(b)低下された生理学的機能を示し(Goldstein, Science, 249:1129-1133(1990); Campisi J., Cell, 84:497-500(1996))、そして (c)アポトーシス−プログラム−細胞死滅に対しての耐性を示す(Wang E., Cancer Res., 55:2284-2292(1995))特徴を有する。
【０００４】
細胞が個体水準での老化現象を反映するということが解明(Campisi J., Cell, 84:497-500(1996))された以後、細胞老化に対しての多様な研究が行われてきた。
【０００５】
一方、老化過程に関与する核酸及びタンパク質に関する特許出願はWO 99/52929及びWO 01/23615に開示されている。
【０００６】
前述したように、多様な理論が提示されているが、細胞老化に対してのより明白な解明、老化細胞を同定することのできる特定バイオマーカー及び細胞老化を調節することのできる生体分子に対しての要求がある。
【０００７】
特に、老化関連疾病、例えば、Wernerシンドローム及びHutchinson-Gilfordシンドロームの疾病を治療するために、老化現象を逆転して正常的な生理的機能を回復させることのできる方法に対しての重要性が台頭される。
【０００８】
本明細書の全体に掛けて多数の特許文献及び論文が参照されてその引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容はその全体として本明細書に参照に挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【０００９】
発明の構成
本発明の一態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１０】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１１】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１２】
本発明の他の態様によると、本発明はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の他の態様によると、本発明はドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質の有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の態様によると、本発明はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤の有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の態様によると、本発明は(a)試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；(b)前記細胞からタンパク質を分離する段階；(c)アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質に対して特異性を有する抗体と前記分離されたタンパク質とを接触させる段階；及び(d)前記抗体に結合された前記分離されたタンパク質の量を決定する段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様によると、本発明は(a)試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；(b)前記細胞からRNAを分離する段階；(c)アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドから誘導されたプローブと前記分離されたRNAとを接触させる段階；及び(d)細胞老化関連タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記分離されたRNAの量を決定する段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のプローブを含む老化細胞検出用キットを提供する。
【００２１】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシン及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質を含む細胞老化同定用バイオマーカー(biomarker)を提供する。
【００２２】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞老化同定用バイオマーカーを提供する。
【００２３】
従って、本発明の目的は老化細胞の検出方法を提供することにある。
【００２４】
本発明の他の目的は細胞老化調節用組成物を提供することにある。
【００２５】
本発明のまた他の目的は細胞老化調節を必要とする患者の細胞老化を調節する方法を提供することにある。
【００２６】
本発明の他の目的は細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供することにある。
【００２７】
本発明の他の目的は老化細胞検出用キットを提供することにある。
【００２８】
本発明の他の目的は細胞老化同定用バイオマーカーを提供することにある。
【００２９】
本発明の他の目的及び利点は発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によりさらに明確になる。
【００３０】
本発明は、基本的に、細胞老化を調節する核酸及びタンパク質に関するものである。本発明者らはアンフィファイシン及びカベオリンが各々異なる方式で細胞老化に関与されていることを発見し、これは実施例に例示されている。
【００３１】
クラスリン−コーティングされた小胞を通する収容体−媒介エンドサイトシスの過程は多段階からなっていて、これはクラスリンコートの募集(recruitment)及びコーティングされたバッド(bud)の分裂を含む(Schmid SL, Annu. Re. Biochem., 66:511-548(1997))。表皮成長因子(以下、EGFと称する)が収容体に結合した後、収容体チロシンキナーゼはクラスリンをリン酸化して、これはアンフィファイシンのSrc−ホモロジー(homology)−3(SH3)ドメインに対する結合位置を提供する(Slepnev, V.I. et al., Science, 281:821-824(1998); Wang, L.H. et al., J.Biol.Chem., 270:10079-10083(1995);及びRamjaun, A.R. et al., J.Neurochem., 70:2369-2376(1998))。アンフィファイシン−1の正確な作用機構は解明されていないが、前記タンパク質はエンドサイトシスバッド(bud)の首部位で募集及びオリゴマー化に関与すると考えられる(Schmid, S.L. Annu. Rev. Biochem., 66:511-548(1997); 及びTakei, K. et al., Nat. Cell Biol., 133-139(1999))。アンフィファイシン−1はAP2/クラスリンコート及びダイナミン−1を連結してエンドソーム(endosome)小胞を作る(Slepnev, V.I. et al., Science, 281:821-824(1998); Shupliakov, O., et al., Science, 276:259-263(1997); McMahon, H.T. et al., FEBS Lett., 413:319-322(1997); David, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:331-335(1996); 及びUrrutia, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:377-384(1997))。アンフィファイシンのカルボキシル−末端ドメインはGTPaseダイナミンを利用してコーティングされたバッド(bud)を落とす (David, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:331-335(1996);及びUrrutia, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:377-384(1997))。アンフィファイシンとダイナミンまたはクラスリンとの相互作用の破壊及びAP-2はクラスリン−媒介エンドサイトシスを抑制する(Slepnev, V.I. et al., Science, 281:821-824(1998); Shupliakov, O., et al., Science, 276:259-263(1997); 及びWigge, P. et al., Curr. Biol., 7:554-560(1997))。前述の発見はエンドサイトシス小胞のクラスリン−媒介バッディング(budding)をダイナミン−媒介小胞分裂に連結するにアンフィファイシンが関与することを示す。また、アンフィファイシンは多数のサブタイプを有していて、アンフィファイシン−2はSH3ドメインを有していてアンフィファイシン−1のようにダイナミンに対しての結合−親化性を有していることも知られている。
【００３２】
カベオレは直径50-100nmの細胞膜小胞含入体であり、トランスサイトシスとピノサイトシス(pinocytosis)のようなエンドサイトシス及び信号伝達体系に関与する(Engelman, J.A. et al., FEBS Lett., 428:205(1998))。21-24 kDaの膜タンパク質、カベオリンはin vivoでカベオレ膜の重要な構造成分である。カベオリンのない哺乳動物細胞でカベオリン−1または−3遺伝子を安定に発現させる場合にはカベオレ構造の形成を誘導することができるということが知られている(Lipardi, C. et al., J. Cell Biol., 140:617(1998))。カベオリンはin vivoで多数のサブタイプを有するものとして知られている。カベオリン−2は大部分の細胞種で発現されて、カベオレの後部側面でヘテロ−オリゴマーを形成すると知られている(Scheiffele, P. et al., J. Cell Biol., 140:795(1998))。カベオリン−3の発現は横紋筋細胞でのみ起こるものとして報告されている(Tang, Z. et al., J. Biol. Chem., 271:2255(1996))。
【００３３】
Ｉ．老化細胞の同定方法及び細胞老化に影響を与える物質の同定方法
本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質のようなエンドサイトシスに関与するタンパク質を利用する。
【００３４】
本発明の方法において、細胞老化を示す信号は細胞内のアンフィファイシンタンパク質の減少された量またはカベオリンの増加された量を測定することにより測定される。
【００３５】
本明細書で用語“老化(senescence)”は“老化(aging)”と同一な意味を有する。用語“老化細胞(old cell)”は“老化細胞(senescent cell)”と同一な意味を有する。特に特定されなかったら、本明細書内のすべての技術的及び科学的用語は本発明の属する技術分野の当業者が共通的に理解するものと同一な意味を有する。例えば、本明細書内の用語はBenjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press(2000); and Kendrew et al., The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd.(1994)に開示されている。
【００３６】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。
【００３７】
本発明で利用されるアンフィファイシンは前述のアンフィファイシンサブタイプから選択されることができる。望ましくは、前記アンフィファイシンタンパク質はアンフィファイシン−1であり、これは前述したように主サブタイプとして知られたものである。また、本発明に利用されるカベオリンタンパク質はカベオリン−1、カベオリン−2及びカベオリン−3から選択されることができる。望ましくは、前記カベオリンタンパク質はカベオリン−1タンパク質であり、これは前述したように主サブタイプとして知られたものである。
【００３８】
アンフィファイシンまたはカベオリンに対しての抗体を利用する本発明の方法において、前記抗体は当業者に公知された方法により収得できる(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。前記抗体はポリクローンまたはモノクローン抗体である。モノクローン抗体は例えば、米国特許第4,196,265号に例示された方法のように公知された技術により容易に収得することができる。抗体に結合された分離タンパク質の量を決定する段階は放射能免疫分析及び酵素−結合免疫吸着分析のような当業者に公知された方法により実施されることができる。前記方法は放射能、蛍光、生物学的または酵素的標識などのような標識またはマーカーの検出に一般的に基づく。
【００３９】
本発明の望ましい具現例によると、前記方法はウェスタンブロッティング方法により実施される。ウェスタンブロッティング方法の一般的な過程はPeter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC Pressに開示されている。本発明においてのウェスタンブロッティングは、望ましくは、(a)測定対象の細胞試料を破壊する段階；(b)破壊された細胞からタンパク質を収得する段階；(c)SDS及び2−メルカプトエタノールを含む溶液内で前記収得したタンパク質を変性させる段階；(d)SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施する段階；(e)ゲル状の前記タンパク質をニトロセルロース(以下、“NC”と称する)膜に転移させる段階；(f)NC膜上のタンパク質をアンフィファイシンまたはカベオリン、望ましくはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1に対する1次抗体と反応させる段階；(g)発色反応を触媒する酵素に結合された2次抗体と前記1次抗体を反応させる段階；(h)前記段階(g)の酵素の基質を添加して発色反応を誘導する段階；そして(i)前記段階(g)の酵素により展開された色相の程度を測定する段階を含む。
【００４０】
発色反応のための酵素の望ましい例は、アルカリンフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼを含むが、これに限定されるものではない。アルカリンフォスファターゼを利用する場合、ブロモクロロインドリールフォスフェート(BCIP)、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)及びECFが脂質として利用され；ホースラディッシュペルオキシダーゼを利用する場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン及びルミノールが基質として利用される。
【００４１】
実施例に記載されたように、本発明者らは老化段階で細胞内アンフィファイシンの量が大いに減少し、反対にカベオリンの量は大いに増加することを確認した。従って、本発明は定性的な方法で実施することができる。例えば、アンフィファイシン検出のためのウェスタンブロッティングバンドの強さ及び厚さは視覚的に検出することができるほど大いに減少し；カベオリンを検出するためのウェスタンブロッティングの場合にはバンドの強さ及び厚さは大いに増加する。結論的に、老化細胞及び若い細胞から得られたウェスタンブロッティングバンドを比較して、老化を容易に検出することができる。
【００４２】
さらに、本発明は定量的にも実施することができる。例えば、ウェスタンブロッティングから得られたバンドをデンシトメーターで定量的データに変換させることができる。40μgタンパク質を分析する特定実施例で、試験対象の細胞内にあるアンフィファイシン−1の発現程度が若い細胞より45倍くらい低い場合、前記試験対象の細胞は老化されたものとして決定することができる。
【００４３】
本発明のアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質のようなエンドサイトシスに関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【００４４】
本発明の方法において、細胞老化を示す信号は細胞内のアンフィファイシンをコードするヌクレオチドの減少された量またはカベオリンをコードするポリヌクレオチドの増加された量を測定することにより検出される。
【００４５】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。望ましくは、前記ポリヌクレオチドはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1タンパク質をコードするものである。本発明で利用される前記ポリヌクレオチドはgDNA(ゲノムDNA)、cDNAまたはmRNAである。
【００４６】
本発明の望ましい具現例によると、前記方法はノーザンブロッティング方法により実施されることができる。ノーザンブロッティングの一般的な過程はPeter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC Pressに開示されている。本発明のノーザンブロッティングは(a)試験対象の細胞からRNAを収得する段階；(b)収得したRNAで電気泳動を実施する段階；(c)ナイロンまたはNC膜に前記RNAを転移させる段階；(f)アンフィファイシンまたはカベオリン、望ましくはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1 mRNAに相補的な放射能−標識オリゴヌクレオチドプローブと前記転移されたRNAをハイブリダイズさせる段階；(g)最終バンドの強さを測定する段階を含む。
【００４７】
実施例に記載されたように、本発明者らは老化段階で細胞内アンフィファイシンRNAの量が大いに減少し、反対にカベオリンRNAの量は大いに増加することを確認した。従って、本発明は定性的な方法で実施することができる。例えば、アンフィファイシンRNA検出のためのノーザンブロッティングバンドの強さ及び厚さは視覚的に検出することができるほど大いに減少し；カベオリンRNAを検出するためのノーザンブロッティングの場合にはバンドの強さ及び厚さは大いに増加する。結論的に、老化細胞及び若い細胞から得られたノーザンブロッティングバンドを比較して、老化を容易に検出することができる。
【００４８】
さらに、本発明は定量的にも実施することができる。例えば、ノーザンブロッティングから得られたバンドをデンシトメーターで定量的データに変換させることができる。アンフィファイシン−1 RNA 50μgを分析する特定実施例で、試験対象の細胞に対するバンドの強さが若い細胞より15倍くらい低い場合、前記試験対象の細胞は老化されたものとして決定することができる。
【００４９】
ＩＩ．細胞老化調節用組成物
本発明の細胞老化調節用組成物は細胞老化を調節することのできる生体分子を含む。前記生体分子は(a)アンフィファイシン及びカベオリンタンパク質のようなタンパク質；(b)アンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。また、前記生体分子はアンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズすることのできるアンチセンスヌクレオチドを含む。一方、本発明の組成物はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤を含む。
【００５０】
前述のように、前記タンパク質を直接的に送達することもできるが、望ましくは、アンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５１】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。望ましくは、前記エンドサイトシスに関与するタンパク質はアンフィファイシン−1またはカベオリン−1タンパク質である。
【００５２】
ポリヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドはgDNAまたはcDNAが望ましく、これは真核細胞用発現ベクターにより運搬される。アンフィファイシン−1をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは、配列2として示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、より望ましくは、配列1として示すヌクレオチド配列のヌクレオチド111−2195に該当するヌクレオチドを含む。カベオリン−1をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは、配列4として示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、より望ましくは、配列3として示すヌクレオチド配列のヌクレオチド26−559に該当するヌクレオチドを含む。
【００５３】
本発明に利用される発現ベクターは真核細胞宿主、望ましくは哺乳動物細胞、より望ましくはヒト細胞から外来遺伝子を発現する。発現ベクターのプロモーターは哺乳動物細胞のゲノムから由来のもの(例えば、メタロチオネインプロモーター)、または哺乳動物ウイルスから由来のもの(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター)である。万一、調節遺伝子が宿主細胞システムと両立することができる場合には、所望の遺伝子配列に連結されているプロモーターまたは調節配列を利用することも望ましい。ウイルスを利用する多くの発現システムが利用でき、例えば、一般的に利用されるプロモーターはポリオマ及びアデノウイルス2から由来のものであり、最も多く利用されるものはシミアンウイルス40(SV 40)から由来のプロモーターである。適合なポリアデニル化部位を転写単位に挿入することが望ましい。本発明に利用できる商業的に購入可能なベクターの例はpcDNA 3(Invitrogen;サイトメガロウイルスプロモーター及びポリアデニル化信号包含)、pSI(Promega; SV 40プロモーター及びポリアデニル化信号包含)、pCI(Promega;サイトメガロウイルスプロモーター及びポリアデニル化信号包含)、及びpREP7(Invitrogen;RSVプロモーター及びSV 40ポリアデニル化信号包含)を含む。
【００５４】
また、アンフィファイシンまたはカベオリンをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは遺伝子治療のためのウイルスベクターを利用して運搬されることができる。例えば、前記運搬システムは(a)アデノウイルスベクター(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, In: Human Gene Transfer, Eds., Cohen-Haguenauer and Boiron, Editions John Libbey Eurotest, France, 51-61(1991); and Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther., 1:241-256(1991)); (b) アデノ−関連ウイルスベクター(LaFace et al., Virology, 162:483-486(1998); Zhou et al., Exp. Hematol., 21:928-933(1993); and Walsh et al., J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994)); 及び(c) モロニーマウス白血病ウイルスの遺伝子操作された変異体のようなレトロウイルスベクター(Kasahara et al., Science, 266:1373-1376(1994))を含む。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内条件下で、DNAまたはRNAに結合するようになる。二重鎖DNAにアンチセンスオリゴヌクレオチドが結合するようになると、三重−ヘリックスを形成するようになり、RNAに結合するようになると二重−へリックスを形成するようになる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはプロモーター及び他の調節部位、目的遺伝子のエキソン及びイントロンに結合するように製作することができる。本発明に利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のポリヌクレオチドに実質的に相補的である。即ち、アンチセンスコンストラクトは目的遺伝子に幾つかの不一致塩基を有することができる。より望ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリンタンパク質、さらに望ましくはカベオリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。最も望ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリン−1 mRNAの翻訳開始部位にハイブリダイズする。
【００５６】
メチル化剤または脱メチル化剤を含む本発明の組成物で、前記製剤はカベオリン遺伝子の塩基のメチル化程度を調節する。実施例に記載されたように、メチル化されきれなかったカベオリン遺伝子はより増加された発現程度を示す。望ましい具現例で、メチル化または脱メチル化されるカベオリン遺伝子はカベオリン−1遺伝子である。より望ましくは、前記変形される部位はカベオリン−1遺伝子のプロモーターであり、最も望ましくは、カベオリン−1遺伝子のプロモーターにあるCpGアイランドである。本発明に利用されるメチル化剤の例はメチルアゾキシメタノールアセテート、テモゾロミド(temozolomide)及びN-メチル-N-ニトロソウレアを含むが、これに限定されるものではない。脱メチル化剤の非−制限的な例は5−アザ−デオキシシチジン、5−アザシチジン、6−アザシチジン及び8−アザグアニンを含む。
【００５７】
細胞老化を調節する組成物として、本発明はドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子の有効量を含む組成部を提供する。前記ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子はアンフィファイシン−1の機能を抑制するものとして知られている(Shupliakov, O. et al., Science, 276:259(1997); and Wigge P., Curr. Biol., 7:554(1997))。ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子による処置は細胞老化を誘導し、これは実施例で確認することができる。本発明の望ましい具現例によると、前記ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子は配列2として示すアミノ酸配列250乃至588を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５８】
ＩＩＩ．細胞老化調節方法
本発明の方法において、アンフィファイシンまたはカベオリンに関連された生体分子の有効量は典型的に細胞に投与される。特に、アンフィファイシンまたはカベオリンをコードするポリヌクレオチドまたはこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは次の方法によりin vivoまたはex vivoで投与されることができる：(a) 微細注入(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)); (b) カルシウムフォスフェート共沈澱(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)); (c) 電気穿孔(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)); (d) リポソーム−媒介形質感染(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)); (e) DEAE-デキストラン処理(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)); 及び(f) 粒子ボンバード(bombardment) (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))。
【００５９】
本発明の望ましい具現例によると、利用される細胞は哺乳動物、より望ましくはヒト細胞から由来のものである。望ましくは、投与されるタンパク質、ポリヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1に対するものである。望ましくは、投与されるポリヌクレオチドはgDNAまたはcDNAである。より望ましくは、投与されるポリヌクレオチドは真核細胞用発現ベクターで運搬される。アンチセンスコンストラクトを利用する本発明の望ましい具現例で、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリン、より望ましくはカベオリン−1をコードする遺伝子に実質的に相補的なものである。最も望ましい具現例はカベオリン−1 mRNAの翻訳開始部位にハイブリダイズするものである。
【００６０】
メチル化剤または脱メチル化剤を利用する本発明の方法で、前記製剤はカベオリン遺伝子の塩基のメチル化程度を調節する。望ましい具現例で、メチル化または脱メチル化されるカベオリン遺伝子はカベオリン−1遺伝子である。より望ましくは、前記変形される部位はカベオリン−1遺伝子のプロモーターであり、最も望ましくは、カベオリン−1遺伝子のプロモーターにあるCpGアイランドである。本発明に利用されるメチル化剤の例はメチルアゾキシメタノールアセテート、テモゾロミド(temozolomide)及びN-メチル-N-ニトロソウレアを含むが、これに限定されるものではない。脱メチル化剤の非−制限的な例は5−アザ−デオキシシチジン、5−アザシチジン、6−アザシチジン及び8−アザグアニンを含む。
【００６１】
前記I、II及びIIIの共通的な事項は過度な重複を招来する本明細書の複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００６２】
ＩＶ．キット及びバイオマーカー
前述のように、本発明は老化細胞検出用キットを提供する。老化細胞を検出するに必要なすべての必須的な物質及び試薬は一つのキット内に包含させることができる。試験対象の細胞から分離されるDNAまたはRNAにハイブリダイズするに有用なプローブが利用される。また、前記プローブはPCR及びRT−PCRのように当業者に公知された分子生物学分析方法に利用されるプライマーであることができる。また、本発明のキットは核酸増幅に適合な酵素、例えば、Taq重合酵素、増幅反応に必要な反応混合物を提供することのできるdNTP混合物及び緩衝液を含むことができる。
【００６３】
本発明の望ましい具現例で、前記プローブはアンフィファイシン−1タンパク質またはカベオリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のものである。望ましくは、前記プローブは固体支持体上に固定化されたものである。本発明のキットに利用される固体支持体は当業者に公知されたものであって、ガラス、プラスチック、重合体、金属、準金属、セラミックまたは有機物を含む。本発明のより望ましい具現例によると、本発明はアンフィファイシン−1タンパク質またはカベオリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のプローブのアレイを含むキットを提供する。個体支持体を含むマイクロアレイに対しての一般的な技術はWO 89/10977、米国特許第5,202,231号、 第5,002,867号及び第5,143,854号に開示されている。
【００６４】
本発明の望ましい具現例によると、本発明のキットはプローブの存在を検出するに利用される標識(label)を追加的に含む。前記標識はプローブと試料から分離されたヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを検出できるようにする。最も一般的な標識は3H、14C及び32Pのような放射線物質である。
【００６５】
本発明は細胞老化同定用バイオマーカーを提供する。望ましい具現例で、本発明に適合なタンパク質またはポリヌクレオチドはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1から由来のものである。
【００６６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【００６７】
実施例
実施例 I ：細胞培養
実施例 I-1 ：表皮繊維芽細胞の培養
表皮繊維芽細胞の分離及び培養はBoyceとHamの方法(Boyce ST. and Ham RG., J. Invest. Dermato., 81:33-40(1983)) により次のように実施した：先ず、７歳の男児から表皮を収得し、これを薄く剥がして切片にした後、表皮切片を0.25%のコラゲナーゼが含まれたハンクス塩溶液(Hank’s salt solution: Gibco BRL社)10mlに入れて、90分間5%CO2、37℃の恒温培養機で培養させた後、上皮と真皮とを相互分離した。次いで、分離した真皮に0.25%のトリプシン溶液1mlを添加して、抗生剤であるストレプトマイシン100μg/mlとペニシリン(Gibco BRL社)100ユニット/mlを含むDMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium: Sigma社)10mlに入れた後、37℃の恒温培養機で10分間培養した。前記過程により得られた表皮繊維芽細胞を10mlのPBSで洗浄した後、前記のDMEM(10%FBS及び抗生剤包含)で継代培養を次のように続けて実施した：恒温培養機は5%のCO2濃度及び37℃を維持するようにし、DMEMは三日毎に交換して、サブコンフルエンシ(subconfluency)が維持されるようにし、継代培養(subculture)は1：4で実施した。25群落ダブリング(population doublings)以下の細胞は増殖が非常に活発で、これは前老化細胞(または若い細胞)として見做し、反面、60群落ダブリング以上の細胞は老化細胞として見做し、この細胞は延長された群落ダブリング期間(3週以上)を示した。
【００６８】
I-2 ：肺繊維芽細胞 (fetal lung fibroblast) の培養
肺繊維芽細胞であるIMR-90細胞はATCC(CCL-186)から購入して使用した。IMR-90の培養は前記の皮膚繊維芽細胞と同様に実施した。
【００６９】
実施例 II ：細胞老化誘導
II-1 ： H 2 O 2 による細胞老化誘導
先ず、前記実施例I-1で継代培養されたPDL 16の皮膚繊維芽細胞を細胞培養皿に敷いて細胞培養恒温機(37℃, 5% CO2, humidified)で一週間維持して細胞がGl細胞基に停止されるようにした。一方、Gl細胞基に停止されたかのことは次のように確認した：細胞を70%氷冷エタノールで固定した後、PI染色溶液(PBSに50μg/mlのRNase Aと50μg/mlのプロピニウムヨージド(propinium iodide)が包含)を用いて室温で細胞を染色した。これをFACS(Fluorescence-activated cell sorter)を用いてDNAが各々2nと4nの中でどのような形態を示すかを確認することにより細胞基を確認した。Gl細胞基の細胞の場合、大部分のDNA染色状態が2n状態を示した。
【００７０】
Gl細胞基に停止された皮膚繊維芽細胞に400μM H2O2を処理して3時間培養した後、PBS 10mlで2回洗浄した。次いで、細胞を1：4で継代培養した後正常的な細胞培養条件(37℃, 5% CO2, humidified)で培養を持続した。H2O2を処理して７日以後から細胞老化の指標として使用されている老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色をして細胞が老化状態に入ったことを確認して実験に使用した。β−ガラクトシダーゼ活性染色は下記実施例IIIのように実施した。
【００７１】
II-2 ：ヒドロキシウレア (Hydroxyurea) による細胞老化誘導
先ず、前記実施例I-1で継代培養されたPDL 16の皮膚繊維芽細胞をDMEMが含まれた細胞培養皿に敷いて、14時間細胞培養機(37℃, 5% CO2, humidified)で培養した。次いで、400μMのヒドロキシウレアを処理して培養を持続した。培養培地は三日毎に交換し、培地を交換するたびに400μMのヒドロキシウレアを新しく添加した。ヒドロキシウレアを処理して14日後から老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色を下記実施例IIIのように実施し老化状態への進入を確認して実験に使用した。
【００７２】
実施例 III ：老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色
老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色(以下、“SA β−gal活性染色"と称する)はDimriらの方法(Dimri GP. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:9363-9367(1995))により次のように行った：先ず、セミコンフルエント(semiconfluent)繊維芽細胞をPBS 10mlで2回洗浄した後、2%のパラホルムアルデヒドで室温で5分間固定した。固定された細胞をPBSで再び洗浄し、β−ガラクトシダーゼ活性染色溶液(1mg/mlのX-Gal, 40 mMクエン酸/ソジウムフォスフェート(pH 6.0), 5mMポタシウムフェロシアニド(potassium ferrocyanide), 150mM NaCl及び2mM MgCl2)5mlを添加して、37℃の恒温培養機で12〜16時間反応させた。反応が進行される間、光が入らないようにアルミホイルで培養皿を包んで培養した。最終的に、位相差顕微鏡で発色程度を確認した。ヒト表皮繊維芽細胞の場合はPDL 50、IMR 90の場合にはPDL 65からβ−ガラクトシダーゼ活性が現れて、H2O2で処理した場合は処理して10日以後から、ヒドロキシウレアで処理した場合は処理して14〜20日以後からβ−ガラクトシダーゼ活性が現れ細胞が老化に進入したことを確認することができた。
【００７３】
実施例 IV ：エンドサイトシス (endocytosis) の変化確認
IV-1 ：老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下観察
老化細胞で収容体−媒介エンドサイトシスの機能に変化があるかを確認するためにトランスフェリン(transferrin)の運搬程度を次のように観察した：先ず、細胞をカバーグラスの上に敷いた後、細胞培養機(37℃, 5% CO2, humidified)で培養した後、25μg/mlテトラメチルロダミン−接合トランスフェリン(Molecular Probe社)を5分間処理した。次いで、PBS 10mlで洗浄した後、PBS内4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定して、細胞の核をDAPI(Sigma-Aldrich)で染色した。トランスフェリンの運搬程度は共焦点顕微鏡(Biorad社、#MRC 1024)を用いて観察し、その結果は図１に示した。
【００７４】
図１で、パネルAは若い繊維芽細胞(PDL 20)及び老化繊維芽細胞(PDL 54)を示し、パネルBはIMR細胞(PDL 32及び68)を示す。図１で分かるように、若い繊維芽細胞及び若いIMR細胞の場合は蛍光性トランスフェリンが細胞内に運搬されて核の周囲に集まっている様子を示すが、これは細胞内運搬時に現れる典型的な様子として報告されたことがある。これとは反対に、老化細胞は前老化細胞のようにトランスフェリンを効率的に細胞内に運搬することはできなかった。
【００７５】
IV-2 ：処理時間によるトランスフェリン運搬の観察
表皮繊維芽細胞を25μg/mlテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンで10、20、40及び60分間処理して、その実験結果は図２に示した。図２でパネルY、M及びOは各々若い細胞(PDL 24)、中間細胞(PDL 38)及び老化細胞(PDL 54)を示す。図２から確認できるように、PDL 24及び38の若い細胞ではトランスフェリン運搬が効果的に発生し10分から細胞内の核の周辺にその蛍光像が現れ、時間が経過するにつれて持続的に運搬されたトランスフェリンが蓄積されてさらに多い蛍光が観察された。これに反して老化細胞では60分間培養した後にも細胞内に運搬された蛍光が現れなかった。
【００７６】
IV-3 ：トランスフェリン運搬のパルス−チェーシング (pulse-chasing)
IMR 90に5分間25μg/mlロダミン(rhodamine)−接合トランスフェリンを処理した後、0分、5分及び10分間チェーシングした。その後、前記のように固定して、トランスフェリンの運搬程度を共焦点顕微鏡で観察した(参照：図３)。図３で、パネルY、M及びOは若い細胞(PDL 26)、中間細胞(PDL 48)及び老化細胞(PDL 72)を示す。図３から分かるように、若い細胞の場合はただ5分でトランスフェリンを細胞内の骨脂細網系部位に位置させ、5分間のパルスの後固定させた時には既にその蛍光が核周辺で観察されて、10分後には細胞内で処理されその蛍光像が拡散されて現れた。これに反しPDL 48の細胞の場合は、トランスフェリンの運搬が遅延され、10分後細胞内の骨脂細網系部位に蛍光像が淡く現れていることを確認することができた。 一方、PDL 72細胞では時間が経過してもトランスフェリンの運搬自体が行われなかった。
【００７７】
IV-4 ：人為的に誘導された老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下確認
前記実施例IIで人為的に老化が誘導された細胞に前記のように25μg/mlテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンを処理して、蛍光性トランスフェリンの運搬程度を共焦点顕微鏡で観察した(参照：図４)。図４から分かるように、継代培養による自然的老化でだけではなくH2O2やヒドロキシウレアを処理して得られた人為的老化細胞でも収容体−媒介エンドサイトシス機能が低下されていることを確認することができた。
【００７８】
本実施例を通じてヒト繊維芽細胞が老化されるとエンドサイトシス機能が低下されトランスフェリンのようなリガンドを細胞内に流入することができないということを確認した。
【００７９】
実施例 V ：収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質発現分析
老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下を分子的次元から解明するために、収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質の発現をウェスタンブロッティング(Western blotting)実験を通じて次のように確認した。
【００８０】
サブコンフルエント(subconfluent)の初期、中期及び末期−継代細胞を細胞溶解緩衝液(1%トリトンX-100, 0.5% NP-40, 50 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5μg/mlアプロチニン, 5μg/mlロイペプチン, 1 mM NaVO4及び1 mM NaF)を利用し溶解して、音波破砕した後、破砕物を14000×gで10分間遠心分離した後、その上層液を取った。このようにして得られた上層液に対して、ブラッドフォード法(Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976))を利用してタンパク質を定量した後、同量(40μg)のタンパク質を取って5X SDS試料緩衝液(60 mM Tris-Cl(pH 6.8), 25%グリセロール, 2% SDS, 14.4 mM 2-メルカプトエタノール, 0.1%ブロモフェノールブルー)を添加して5分間煮って変性させた。細胞破砕液(10-15μgタンパク質を包含)を電気泳動キット(Biorad社)を利用して8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をして分離させて、分離されたタンパク質をトランスファーキット(Biorad社)を利用してNCメンブレンに転移させた。このブロットを5%脱脂粉乳(Difco社)を含むTTBS(Tris buffered saline with Tween 20)で1時間ブロッキングさせた。前記ブロットを5%脱脂粉乳を含むTTBS内の各々の1次抗体で1時間室温で免疫ブロットして、TTBSで3回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合抗−マウス2次抗体(Jackson Immuno Research Laboratory)を処理した。前記1次抗体として使用された抗体の中で、抗−ダイナミン抗体、抗−α−アダプチン抗体、抗−β−アダプチン抗体及び抗−クラスリン重鎖抗体はTransduction Laboratory社から購入したものであり、マウス単一クローン抗−アンフィファイシン−1抗体は大韓民国の忠北大学校医科大学、キムスンリョル博士から得たものであり(Jin, Y., Kim et al.(in press), Production and characterization of monoclonal antibodies against amphiphysin, Exp. Mol. Med.)、抗−ホスホチロシン抗体と抗−トランスフェリン収容体抗体はSanta Cruz Biotechnologyから購入したものである。シグナルは改善された化学発光システム(ECLキット, Amersham Pharmacia Biotech)を利用して可視化して、その結果は図５に示した。
【００８１】
図５から確認できるように、ただアンフィファイシン−1だけが老化細胞で大幅減少されて、他のエンドサイトシスタンパク質はほとんど変化がなかった。アンフィファイシン−1タンパク質の発現減少は繊維芽細胞及びIMR 90細胞各々の老化細胞で観察された。さらに、H2O2またはヒドロキシウレアから誘導された老化細胞(“＋”で表示)も図５と同一な実験結果を示した(参照：図６)。
【００８２】
前記実験結果から細胞老化過程はアンフィファイシン−1の発現減少と連関されていることが分かる。
【００８３】
実施例 VI ：収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質をコードする mRNA のノーザンブロット分析
前記実施例Vから確認した細胞老化時アンフィファイシン−1タンパク質の発現減少の正確な機構を解明するために、ノーザンブロッティングを次のように実施した。
【００８４】
酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルムを利用して前記実施例Iのヒト表皮繊維芽細胞からRNAを分離して、ホルムアルデヒド試料緩衝液(5X MOPS, 17.5%ホルムアルデヒド及び50%ホルムアミド)と混合した後、電気泳動キット(Hoefer社)を利用して1%アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動が終了された後、NCメンブレンにRNAを転移させて、自動UV交互結合剤(Stratagen社)を利用してRNAをメンブレンに交互結合させた。その後、32P−標識されたプローブ(アンフィファイシン−1 cDNAのヌクレオチド111−1116を包含)とハイブリダイゼーション反応をさせた後、最終的に自動放射線写真を得た(参照：図７)。図７で、パネルYはPDLが27、MはPDLが36そしてOはPDLが60である表皮繊維芽細胞である。図７から分かるように、老化が進行されるにつれてアンフィファイシンmRNA量が減少されることを確認することができた。
【００８５】
前記の実験結果から細胞老化進行は転写段階でのアンフィファイシン−１の減少と連関されていることが分かる。
【００８６】
実施例 VII ：アンフィファイシン−１遺伝子のクローニング
ヒトアンフィファイシン−１遺伝子の全長cDNAは添付の配列１として示すヌクレオチド配列を有し、前記cDNAを運搬するベクターは大韓民国の忠北大学校から入手した。前記ベクターはpGEX-2Tベクター(Pharmacia社)のBamHIとEcoRI制限位置に前記cDNAを挿入してアンフィファイシン−１とグルタチオン−S−トランスフェラーゼが融合された形態に発現されるように製作された。図８はヒトアンフィファイシン−１をコードするcDNAを運搬するベクターの遺伝子地図である。全長cDNAは次のプライマーを利用してPCR増幅した：5_-AACTGTCCACCATGGCCGACATCAAGACGGGC-3_ 及び 5_-GGATCCCTAATCTAAGCGTCGGGT-3_。PCR増幅はPyrobest Taq重合酵素(Takara社)を使用して次の温度で30サイクルを行った：55℃で30秒(アニーリング)、72℃で1.5分(伸長反応)及び92℃で30秒(変性)。増幅されたcDNAをpT7 blueベクター(Novagen社)にクローニングして塩基配列を確認した。次いで、Hind IIIと Bam HIで処理した後、繊維芽細胞にアンフィファイシン−1 cDNAを微細注入するためにpcDNA3ベクター(サイトメガロウイルスのプロモーター及びポリアデニル化シグナル包含)にサブクローニングした。アンフィファイシン−1のcDNAを含むpcDNA 3の遺伝子地図は図９に示されている。
【００８７】
実施例 VIII ：アンフィファイシン− 1 遺伝子による老化細胞の細胞膜収容体性エンドサイトシスの回復
VIII − 1 ：アンフィファイシン− 1 遺伝子の微細注入
実施例Iの老化されたヒト表皮繊維芽細胞(PDL 58)をカバーグラス上に敷いてFBSが入っていないDMEM培地を用いて細胞培養機(37℃, 5% CO2, humidified)で24時間培養した。次いで、前記実施例VIIでpcDNA 3ベクターにクローニングされたアンフィファイシン−1遺伝子(10ng/ml) 10-14l及びラビットIgG(Sigma社, 5mg/ml)10-14l を老化細胞の核に微細注入した。ベクターは微細注入バッファー(50mM HEPES, pH 7.2, 100mM KCl, 50mM NaPO4)で10ng/mlに希釈した。希釈したベクターをトランスゼクター5246 (transjector5246；Eppendorf社)及びマイクロマニピュレーター(micromanipulator；Eppendorf社)を使用して細胞核に微細注入した。
【００８８】
VIII − 2 ：微細注入された細胞でのアンフィファイシン− 1 の発現分析
微細注入された細胞でアンフィファイシン−1の発現を次のように重複免疫蛍光染色を実施して確認した：微細注入後、24時間FBSのないDMEM培地で成長させた細胞を3.7%パラホルムアルデヒド溶液(in PBS)で10分間固定させて、PBS内0.3% Triton X-100で室温で10分間透過化した。次いで、抗−アンフィファイシン−1抗体及びFITC−接合抗−ラットIgG抗体(Jackson Laboratory社)で細胞を連続的に37℃で1時間処理した後、ロダミン−接合抗−ラビットIgG抗体(Jackson Laboratory社：1：100に希釈)で37℃で1時間処理した。像は蛍光顕微鏡(Zeiss社, Axiovert 25, CFL451210)で観察した(参照：図１０)。図１０から分かるように、抗−ラビットIgGはロダミンにより赤色蛍光で確認でき、アンフィファイシン−1は2次抗体のFITCにより緑色蛍光で確認することができた。アンフィファイシン−1の存在を示す緑色蛍光は細胞質で観察された。
【００８９】
従って、アンフィファイシン−1タンパク質は実施例VIII−1の微細注入された細胞で発現されることが分かる。
【００９０】
VIII − 3 ：老化細胞でのエンドサイトシス機能回復の分析
微細注入された細胞をFBSが入っていないDMEMで恒温機(37℃, 5% CO2, humidified)で24時間培養した。次いで、125ng/mlテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンで細胞を30分間処理し、10mlPBSで洗浄した後、PBS内4%パラホルムアルデヒド10mlで10分間固定した。その後、免疫蛍光染色を前記実施例VIII−2と同様に実施した。蛍光顕微鏡(Zeiss社、Axiovert 100)を利用して、微細注入された細胞の確認及びトランスフェリンの運搬程度を観察した。実験結果は表１に示した。
【００９１】
【表１】
【００９２】
前記表１から確認できるように、pcDNA 3ベクターがモック(mock)で微細注入した細胞に比べて、アンフィファイシン−1遺伝子が含まれたpcDNA 3ベクターを微細注入した細胞でトランスフェリンの細胞内運搬が大いに増加されることが分かる。即ち、老化細胞のエンドサイトシス活性はアンフィファイシン−1 cDNAの注入により急激に増加する。このような実験結果はアンフィファイシン−1が老化細胞のエンドサイトシスの機能回復に必須的であり、細胞老化を調節する重要な要素であることを証明する。
【００９３】
実施例 IX ：ドミナントネガティブアンフィファイシン− 1 遺伝子のクローニング
アンフィファイシン−1の機能を遮断するものとして知られているドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子(Shupliakov, O. et al., Science, 276:259(1997);及びWigge P., Curr. Biol., 7:554(1997))を、アンフィファイシン−1 cDNAを鋳型にして特定プライマーを利用しPCRを実施することにより増幅して、これによりアンフィファイシン−1タンパク質の中間部分(アミノ酸250乃至588)をコードする部分的なヌクレオチド配列を増幅した。利用された前方向プライマー及び逆方向プライマーは次の配列を有する； 5’-AACTGTCCACCATGAGTGATTCGGGTCCTCTCCGC-3’ 及び5’-GGATCCCTACTGCTCCGTAGCCAGCTCCGG-3’。PCR増幅産物を実施例VIIの方法と同様にpcDNA(Invitrogen)にサブクローニングした。最終ベクターの遺伝子地図は図１１に示されている。
【００９４】
実施例 X ：ドミナントネガティブアンフィファイシン− 1 遺伝子による若い細胞のエンドサイトシス機能の抑制
前記実施例IXで製作されたベクターを利用して、若い繊維芽細胞(PDL 16)を次のように形質転換させた：前記実施例９で製造したベクター2μg及びpEGFP-N1ベクター(Clontech社)0.5μgをDMEMとプラス試薬8μlと混合した後、室温で15分間放置した。その後、リポフェクタミン(Gibco-BRL社)とDMEMの混合物を前記混合物とよく混合した後、室温で15分間放置した。その後、DMEM 2mlを追加的に添加して、前記最終混合物を若い繊維芽細胞に添加した後37℃で3時間培養した。3時間経過した後、20%FBSを含有するDMEM 2.5mlを加えて、40時間培養した。次いで、細胞に25μg/mlロダミン−接合トランスフェリンを10分間処理した後、共焦点顕微鏡(Biorad社, #MRC1024)で像を観察し、形質転換された細胞(EGFP−由来緑色蛍光発散)または非−形質転換された細胞でのトランスフェリンの運搬程度を解明した(参照：図１２)。図１２から確認できるように、ドミナントネガティブアンフィファイシン−1 cDNAが挿入されたベクターとpEGFP-N1ベクターで同時形質転換された細胞(左側パネル)ではロダミン−接合トランスフェリンの赤色蛍光が観察されなく、即ち、ロダミン−接合トランスフェリンの細胞内運搬が発生されなくて、形質転換されていない細胞(右側パネル)では赤色蛍光が観察された。
【００９５】
前記実験結果はアンフィファイシン−1の機能的不能は収容体−媒介エンドサイトシスを抑制して、これは結局細胞老化を誘導することを示す。
【００９６】
実施例 XI ：ウェスタンブロッティングを利用した Erk − 1/2 の活性分析
ヒト繊維芽細胞またはIMR−90の若い細胞(PDL 30以下)、中間細胞(PDL 35-45)及び老化細胞(PDL 60以上)の各々にEGF(Gibco-BRL社, #13247-051, human, recombinant)100ng/mlを処理して刺激させた。次いで、前記実施例Vに記載された方法に従ってウェスタンブロッティングを実施した。モノクローン抗−ホスホ−Erk-1/2抗体、ポリクローン抗−Erk-1/2抗体及びポリクローン抗−EGFR抗体はSanta Cruz Biotechnology社から購入したものである。図１３（ａ）から確認できるように、若い細胞及び中間細胞はEGF刺激後５分以内にErk-1/2キナーゼがリン酸化(活性化)されて、15分間持続された。しかし、老化細胞の場合はErk-1/2キナーゼのリン酸化が15分経過するまで検出されなかった。一方、群落ダブリングが増加する場合、EGFからErkキナーゼへの信号伝達が減少するにも関わらず、Erkキナーゼ及びEGFRの発現度は変化がないことをウェスタンブロッティングを通じて確認した(参照：図１３（ｂ）)。
【００９７】
従って、老化細胞で現れる成長刺激因子に対しての反応の減少はErk−1/2キナーゼの活性化、即ちリン酸化の減少によるものであることが分かる。
【００９８】
実施例 XII ：ウェスタンブロッティングを利用したカベオリン (caveolin) 発現の分析
カベオリン発現分析のために、ヒト繊維芽細胞またはIMR−90の若い細胞(PDL 30以下)、中間細胞(PDL 35-45)及び老化細胞(PDL 60以上)の各々に対して前記実施例Vと同様にウェスタンブロッティングを実施した。単一クローン抗−カベオリン−1抗体、単一クローン抗−カベオリン−2抗体及び単一クローン抗−カベオリン−3抗体はTransduction Laboratories社から購入したものである。図１４から分かるように、老化が進行されるにつれてヒト繊維芽細胞またはIMR-90でカベオリン−1、カベオリン−2及びカベオリン−3の全てがその発現が増加される。
【００９９】
実施例 XIII ：免疫沈澱による EGFR 及びカベオリン -1 の相互作用の分析
ヒト繊維芽細胞の若い細胞(PDL 30以下)及び老化細胞(PDL 60以上)の各々の細胞試料をIP溶解緩衝溶液(10mMフォスフェート緩衝溶液, pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, 2mM EDTA, 1mM PMSF, 2μg/mlアプロチニン, 2μg/mlロイペプチン, 50mM NaF及び0.2mM Na3VO4)で溶出して、短く音波破砕した後9000rpmで5分間遠心分離しその上層液を取った。次いで、上層液を正常マウス血清、抗−EGFR抗体または抗−カベオリン−1抗体と反応させた後タンパク質A-セファロースビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)で免疫複合体を沈澱させて、SDS-PAGEを実施した後、前記実施例Vと同様にウェスタンブロッティングを実施した(参照：図１５)。
【０１００】
図１５から分かるように、ヒト繊維芽細胞の老化細胞でEGFR免疫複合体はカベオリン−1タンパク質を含んでいると分析されたが、若い繊維芽細胞はそうではなかった。
【０１０１】
従って、老化が進行されるにつれて、カベオリン−1タンパク質の発現が増加されて、増加されたカベオリン−1はEGFRと相互作用してEGFRによるErk-1/2キナーゼの活性化作用を抑制することが分かる。
【０１０２】
実施例 XIV ：カベオリン− 1 に対しての電子顕微鏡分析
ヒト繊維芽細胞の若い細胞(PDL 20)と老化細胞(PDL 65)を1000rpmで遠心分離して細胞を沈澱させて、3%グルタルアルデヒド/PBS(pH 7.4)で固定させた後、0.2Mソジウムカコジレート緩衝溶液(pH 7.4)で洗浄した。次いで、細胞沈殿物をカコジレート緩衝溶液内の1%オスミウムテトロキシドで1時間処理した後、プロピレンオキシドを通した等級のエタノール処理により脱水させて、Embed812(Electron Microscope Sciences社)内に細胞試料を埋めた。その後、埋められたマイクロトーム(microtomb；Leichert-JUNG社)を利用して200nmに切断して、切断片をメチレンブルー及びアジュレII(azureII)を利用して染色させた後、光学顕微鏡で観察し、電子顕微鏡で観察する部位を選択した。その後、選択された部位を再びマイクロトームを利用して60nmの厚さで超薄切断して、ウラニルアセテート及びリードシトレートで染色した後、透過電子顕微鏡(H-600, Hitachi)で観察した。図１６から分かるように、老化細胞の場合カベオレ(caveolae)−類似構造の数が若い細胞より多い。
【０１０３】
実施例 XV ：カベオリン -1 cDNA 運搬用プラスミド DNA の製作
ヒト繊維芽細胞の老化細胞からTRIzol(Gibco-BRL社, #15596-026)を利用して総RNAを分離し、これを鋳型にしてRT-PCRを実施して、カベオリン−1のcDNAを得た。この際使用したプライマーは次のようである：前方向プライマー、 5’-atccaagcttccaccatgtctgggggcaaatacgt-3’及び逆方向プライマー、 5’-gcaggatccctatatttctttctgcaagttgat-3’。逆転写酵素はPromega社のAMT RTaseを使用し、TaqポリマラーゼはTakara社のEx Taqを使用した。温度条件は次のようである：60℃で30秒(アニーリング)、72℃で50秒(伸長反応)及び92℃で30秒(変性)。次いで、カベオリン−1のcDNAを確認するために増幅されたcDNAを鎖終結方法(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463(1977))で配列付け(sequencing)した。 カベオリン−1 cDNAのヌクレオチド配列は添付の配列３のようである。増幅されたcDNAをpcDNA 3ベクター(Invitrogen)にHind IIIとBam HI制限位置を利用してサブクローニングした。最終的に製作されたベクターの遺伝子地図は図１７のようである。
【０１０４】
実施例 XVI ：カベオリン -1 cDNA によるヒト繊維芽細胞の形質転換
前記実施例XVで製作されたベクターを利用してヒト繊維芽細胞の若い細胞(PDL 25)を次のように形質転換させた：細胞を皿に敷いて18時間培養し70-80%の融合度(confluency)になるようにした。前記実施例XVで製造したベクター2μgとプラス試薬8μlを混合した後、リポフェクタミン(Gibco-BRL社)12μlとDMEM 238μl混合液とよく混合した後、室温で15分間放置した。次いで、再びDMEM 2mlを加えた後、最終混合物を若い繊維芽細胞に処理して37℃で3時間培養した。3時間後、20%のFBSを含むDMEM 2.5mlを加えて、24時間培養した。30時間が経過した後、100μg/mlのEGFで形質転換された細胞を刺激した。最終的に、前記実施例Vと同様にウェスタンブロッティングを実施してErk-1/2の活性化を調査した。図１８で、Aパネルの1番レーンはpcDNA 3のみで形質転換したものであり、2番レーンはカベオリン−1 cDNAが挿入されたpcDNA 3で形質転換したものである。図１８から確認できるように、カベオリン−1 cDNAが挿入されたpcDNA 3で形質転換された細胞はカベオリンが発現されていることが分かる。図１８でBパネルの1〜3番レーンはpcDNA 3で形質転換された細胞にEGFを各々0分、5分及び20分間処理したものであり、4〜6番レーンはカベオリン-1 cDNAが挿入されたpcDNA 3で形質転換された細胞にEGFを各々0分、5分及び20分間処理したものである。
【０１０５】
図１８から分かるように、カベオリン-1が過発現される細胞ではErk-1/2キナーゼの細胞内発現は変化がないが、モック(mock)で形質転換された細胞に比べてそのリン酸化が大いに抑制されたことが分かる。
【０１０６】
従って、カベオリン-1のDNAで細胞を形質転換させる場合には、EGFによるErk-1/2キナーゼの活性化が遮断されて、外部刺激に対しての反応性が減少され細胞が老化状態に誘導されることが分かる。このような結果は、老化細胞でEGFによるErk-1/2キナーゼの活性化が低下されることはカベオリン-1タンパク質の発現増加によるものであることを示す。
【０１０７】
実施例 XVII ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染 XVII-1 ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
カベオリン-1タンパク質の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相互作用するカベオリン-1 ｍRNAの適合な部位を選択した。次いで、カベオリン-1 ｍRNAの翻訳開始部位に結合して翻訳開始を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。合成されたオリゴヌクレオチドはその5’-末端にフルオレセイン(Genotech)が接合されていて、安定性を増加させるためにホスホロチオエート(phosphorothioate)で変形されたものである。例えば、合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは次のヌクレオチド配列を有する：5’-tttgcccccaga-3’。前記部位に結合するセンスオリゴヌクレオチドも合成した： 5’-atgtctgggggc-3’。
【０１０８】
XVII-2 ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染
老化されたヒト繊維芽細胞(PDL 64)をFBSのないDMEMを含む24ウェル−プレートまたは皿に敷いて、細胞培養機(37℃, 5% CO2)で12時間培養した。次いで、100 uM合成アンチセンスオリゴヌクレオチド1〜5μl及びプラス試薬(Gibco-BRL)を500μl DMEMと混合して室温で15分間反応させた後、結果混合物を12μl Lipofectamin(Gibco-BRL)とDMEMの混合液500μlによく混合して、室温で15分間定置させてリポソーム複合体を形成させた。その後、細胞をDMEM(血清なし)で2回洗浄した後、前記リポソーム複合体1mlを処理して、37℃で3時間反応させた。形質感染された細胞に、10% FBSを含有するDMEM 1〜5mlを添加して、24時間培養した後、培地を10% FBSを含有するDMEMに交替した。次いで、一定時間培養した後、免疫染色及びウェスタンブロッティングを次のように実施した。
【０１０９】
XVII-3 ：免疫染色
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞を4%パラホルムアルデヒド0.5mlで20分間室温で固定させた後、PBS内0.5%トリトンX−100 0.5mlで10分間処理し透過化させて、2% BSA(in PBS)でブロッキングした。次いで、細胞に抗−カベオリン−1抗体(Transduction Laboratory)を4℃で一晩中処理した後、ロダミン−接合2次抗体(Santa Gruz)で室温で1時間処理した。核を可視化するために、DAPI(Molecular Probe)を添加した。観察は共焦点顕微鏡(Biorad, #MRC1024)を利用して実施した。図１９から分かるように、細胞内でのカベオリン−1の発現はアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞で処理時間が経過するにつれて大いに減少したが、センスオリゴヌクレオチドで処理された細胞では変化がなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は変形された細胞形態を示した：拡大されて広がる形状から小さなスピンドル形状に。反対に、センスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は前記した細胞形態変化を示さなかった。
【０１１０】
XVII-4 ：ウェスタンブロッティング
オリゴヌクレオチドを処理した細胞に対して実施例XIIと同様にウェスタンブロッティングを実施した。アンチセンスオリゴヌクレオチドが処理された細胞はカベオリン−1に該当する弱いバンドを示し、これはアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞でカベオリン−1の発現が減少されることを示すものである。
【０１１１】
前記の免疫染色及びウェスタンブロッティングの結果から、カベオリン−1が細胞老化に直接的な関連があり、カベオリン−1の発現を減少させる場合には細胞老化を防止することができるだけではなく老化細胞を若い細胞に転換させることもできるということが分かる。
【０１１２】
実施例 XVIII ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染による Erk-1/2 活性の分析
前記実施例XVIIと同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドを老化繊維芽細胞及び若い繊維芽細胞に処理した。EGF刺激及びウェスタンブロッティングを実施例XIと同様に実施した。図２０は本実施例の結果を示す。図２０から分かるように、若い細胞でErk-1/2キナーゼは強くリン酸化(活性化)された。しかし、非処理された老化細胞及びセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は若い細胞に比べてさらに高い基本的Erk-1/2活性を示し、EGFで刺激した場合、Erk-1/2活性は変化がなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞で、EGFによるErk-1/2活性化は若い細胞と同様に大いに増加した。
【０１１３】
前記実験結果から老化細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを処理してカベオリン-1の発現を抑制するとErkにより仲裁される信号伝達を若い細胞と類似に正常的に回復させることができるということが分かる。
【０１１４】
実施例 XIX ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染による p-Erk-1/2 の核への転位観察
前記実施例XVIIIで活性化されたErk-1/2が核内に転位されて他の遺伝子の発現を調節するのかどうかを確認するために、次のように免疫染色を実施した：実施例XIIIと同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドで若い繊維芽細胞及び老化繊維芽細胞を処理した。処理された細胞を抗-p-Erk(リン酸化されたErk)抗体(New England Biotech)で4℃で一晩中処理した後、FITC-接合2次抗体(Santa Cruz)で室温で1時間処理した。核を可視化するために、DAPI(Molecular Probe)を添加した。p-Erk-1/2局部化像は共焦点顕微鏡(Biorad, #MRC1024)を利用して可視化し、これは図２１及び図２２に示した。図２１及び図２２で、矢印はp-Erk-1/2キナーゼが核へ転位されたことを示す。
【０１１５】
図２１から分かるように、若い細胞で、p-Erk-1/2は処理後5分辺りに細胞質で強く観察されて、核内に転位されたp-Erk-1/2は処理後30分辺りに観察されて、処理後60分辺りにp-Erk-1/2はただ細胞質でのみ弱く観察された。 前記実験結果から、処理後5分内にErk-1/2が活性化(リン酸化)されて、30分辺りにp-Erk-1/2は核内に転位され幾遺伝子の転写を調節し、60分辺りに非活性化されることが分かる。若い細胞とは違って、老化細胞ではEGF処理とは無関係にp-Erk-1/2が細胞質で強く観察されて、これはウェスタンブロッティング分析で確認された。老化細胞では核内に転位されたp-Erk-1/2が観察されなかった。
【０１１６】
また、図２２から分かるように、センスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は核内でp-Erk-1/2が観察されなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞では観察された。
【０１１７】
前記実験結果は、Erk-仲介シグナル伝達の回復がアンチセンスオリゴヌクレオチドによるカベオリン-1の発現抑制により達成できることを示す。また、前記実験結果は、老化細胞で一般的に抑制されている核内への転位を回復するにカベオリン-1が関与できることを示す。
【０１１８】
実施例 XX ：カベオリン -1 遺伝子の CpG アイランドのメチル化
老化が進行されるにつれて、p16/Ink4aのプロモーターに位置したCpGアイランドのメチル化が減少され、これはp16/Ink4aの発現を増加させるということは公知されている(Jarrard DF., Cancer Res., 15;59(12):2957-2964(1999))。また、癌細胞でカベオリン-1も類似なメチル化傾向を有するということも解明されている(Cui J., Prostate, 15;46(3):249-256(2001))。従って、本発明者らはカベオリン-1の減少された発現が前記のメチル化によるものであるかを分析した。
【０１１９】
若いヒト繊維芽細胞(PDL 20)にDMSO内1uM脱メチル化剤5−アザ(aza)−デオキシシチジン(Sigma)を処理して、一定時間毎に培地を交替しながら同時に脱メチル化剤を添加して2〜3週間処理した。細胞老化の誘導は実施例IIIのようにSA β-gal染色で確認した。関連タンパク質の発現を調べるために、処理された細胞を日付別に収穫して前記実施例と同様にウェスタンブロッティングを実施した。ウェスタンブロッティングで、抗−p53抗体、抗−p16抗体、抗−カベオリン−1抗体及び抗−アクチン抗体はSanta Cruz Biotechnology社から入手したものである。
【０１２０】
SA β-gal染色の結果を示した図２３（ａ）から確認できるように、約２週間処理された若い細胞は老化細胞−類似形質を示した。ウェスタンブロッティングの結果を示した図２３（ｂ）から確認できるように、脱メチル化によりp16及びカベオリン−1の発現は増加してp53の発現は変化がなかった。p16の増加は細胞老化の初期段階で検出された反面、カベオリン−1の増加はp16より早い段階で検出された。前記実験結果は、老化細胞でのカベオリン−1の増加は細胞老化またはp16の増加により直接的に招来されるものではなくカベオリン−1遺伝子のプロモーター内CpGアイランドの脱メチル化により直接的に招来されるということを示す。
【０１２１】
結論的に、細胞老化はカベオリン−1遺伝子、特にCpGアイランドのメチル化により調節できることが分かる。
【０１２２】
以上、本発明の望ましい具現例を記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されると言える。
【０１２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】老化細胞での低下されたエンドサイトシスを示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２】若い細胞及び老化細胞での時間によるトランスフェリンの細胞内運搬を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図３】若い細胞及び老化細胞でのトランスフェリンに対してのパルス-チェーシング結果を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図４】H2O2またはヒドロキシウレアにより人為的に老化が誘導された細胞でのトランスフェリンの細胞内運搬程度を確認した共焦点顕微鏡写真である。
【図５】細胞老化に関連されたタンパク質の分析のためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図６】H2O2またはヒドロキシウレアにより人為的に老化が誘導された細胞で細胞老化に関連されたタンパク質の分析のためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図７】細胞老化に関連されたタンパク質をコードするmRNAを分析するためのノーザンブロッティング結果を示す写真である。
【図８】実施例VIIで利用されたヒトアンフィファイシン−1をコードするcDNAを含むベクターの遺伝子地図である。
【図９】実施例VIIで製作されたヒトアンフィファイシン−1をコードするcDNAを含む発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１０】微細注入された細胞でアンフィファイシン−1の発現を分析するための蛍光顕微鏡で観察された像を示す写真である。
【図１１】ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子を含む発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１２】ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子で処理された若い細胞の低下されたエンドサイトシス機能を確認する共焦点顕微鏡写真である。
【図１３】（ａ）若い細胞及び中間細胞でErk-1/2キナーゼの活性(リン酸化)を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
（ｂ）老化細胞でErk-1/2キナーゼの活性(リン酸化)を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１４】若い細胞、中間細胞及び老化細胞でカベオリンのサブタイプ、即ち、カベオリン−1、カベオリン−2及びカベオリン−3の発現を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１５】若い細胞及び老化細胞で表皮成長因子収容体(EGFR)及びカベオリン−1の相互作用を確認するための免疫沈澱の結果を示す写真である。
【図１６】若い細胞及び老化細胞でカベオレ構造を示す電子顕微鏡写真である。
【図１７】実施例XVで製作されたカベオリン−1 cDNAが挿入された発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１８】カベオリン−1 cDNAで形質転換された若い細胞に対してのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１９】カベオリン−1発現がアンチセンスオリゴヌクレオチドにより大いに減少されるということを証明する共焦点顕微鏡写真である。
【図２０】図２０はカベオリン−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染によるErk-1/2の活性を分析するためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図２１】若い細胞及び老化細胞で表皮成長因子(EGF)刺激によるErk-1/2の活性化及び局部化を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２２】カベオリン−1の下向調節、即ち、カベオリン−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染後、若い細胞及び老化細胞でEGF刺激によるErk-1/2の活性化及び局部化を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２３】（ａ）脱メチル化剤、5−アザ−デオキシシチジンで処理された若い細胞に対しての老化−関連β−ガラクトシダーゼ活性染色の結果を示す写真である。
（ｂ）脱メチル化剤、5−アザ−デオキシシチジンで処理された若い細胞に対してのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
発明の属する技術分野
本発明は老化に関連された核酸配列及びタンパク質に関するものであって、より詳細には細胞老化に関連された核酸配列及びタンパク質そしてそれらの用途に関するものである。
【０００２】
従来の技術
老化の機構に対しての活発な研究があり、多様な仮説が提示された。前記仮説は(a)老化のフリーラジカル理論(Harman D, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7124-7128(1981))、 (b)交互結合理論(Bjorksten J., J. Am. Geriatr Soc., 16, 408-423(1968))、(c)ミトコンドリア理論(Lee CM et al., Free Radic. Biol. Med., 22, 1259-1269(1997); 及びWallace DC et al., Biofactors, 7, 187-190(1998))、そして (d)遺伝的プログラム理論(Harley CB et al., Curr. Opin. Genet. Dev., 5, 249-255(1995))などを含む。
【０００３】
また、老化は細胞レベル(即ち、細胞老化)で研究が進行された。研究によると、老化細胞は(a)細胞サイクルのG1段階で止まっていて、(b)低下された生理学的機能を示し(Goldstein, Science, 249:1129-1133(1990); Campisi J., Cell, 84:497-500(1996))、そして (c)アポトーシス−プログラム−細胞死滅に対しての耐性を示す(Wang E., Cancer Res., 55:2284-2292(1995))特徴を有する。
【０００４】
細胞が個体水準での老化現象を反映するということが解明(Campisi J., Cell, 84:497-500(1996))された以後、細胞老化に対しての多様な研究が行われてきた。
【０００５】
一方、老化過程に関与する核酸及びタンパク質に関する特許出願はWO 99/52929及びWO 01/23615に開示されている。
【０００６】
前述したように、多様な理論が提示されているが、細胞老化に対してのより明白な解明、老化細胞を同定することのできる特定バイオマーカー及び細胞老化を調節することのできる生体分子に対しての要求がある。
【０００７】
特に、老化関連疾病、例えば、Wernerシンドローム及びHutchinson-Gilfordシンドロームの疾病を治療するために、老化現象を逆転して正常的な生理的機能を回復させることのできる方法に対しての重要性が台頭される。
【０００８】
本明細書の全体に掛けて多数の特許文献及び論文が参照されてその引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容はその全体として本明細書に参照に挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【０００９】
発明の構成
本発明の一態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１０】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１１】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１２】
本発明の他の態様によると、本発明はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の他の態様によると、本発明はドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質の有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の態様によると、本発明はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤の有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の態様によると、本発明は(a)試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；(b)前記細胞からタンパク質を分離する段階；(c)アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質に対して特異性を有する抗体と前記分離されたタンパク質とを接触させる段階；及び(d)前記抗体に結合された前記分離されたタンパク質の量を決定する段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様によると、本発明は(a)試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；(b)前記細胞からRNAを分離する段階；(c)アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドから誘導されたプローブと前記分離されたRNAとを接触させる段階；及び(d)細胞老化関連タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記分離されたRNAの量を決定する段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のプローブを含む老化細胞検出用キットを提供する。
【００２１】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシン及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質を含む細胞老化同定用バイオマーカー(biomarker)を提供する。
【００２２】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞老化同定用バイオマーカーを提供する。
【００２３】
従って、本発明の目的は老化細胞の検出方法を提供することにある。
【００２４】
本発明の他の目的は細胞老化調節用組成物を提供することにある。
【００２５】
本発明のまた他の目的は細胞老化調節を必要とする患者の細胞老化を調節する方法を提供することにある。
【００２６】
本発明の他の目的は細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供することにある。
【００２７】
本発明の他の目的は老化細胞検出用キットを提供することにある。
【００２８】
本発明の他の目的は細胞老化同定用バイオマーカーを提供することにある。
【００２９】
本発明の他の目的及び利点は発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によりさらに明確になる。
【００３０】
本発明は、基本的に、細胞老化を調節する核酸及びタンパク質に関するものである。本発明者らはアンフィファイシン及びカベオリンが各々異なる方式で細胞老化に関与されていることを発見し、これは実施例に例示されている。
【００３１】
クラスリン−コーティングされた小胞を通する収容体−媒介エンドサイトシスの過程は多段階からなっていて、これはクラスリンコートの募集(recruitment)及びコーティングされたバッド(bud)の分裂を含む(Schmid SL, Annu. Re. Biochem., 66:511-548(1997))。表皮成長因子(以下、EGFと称する)が収容体に結合した後、収容体チロシンキナーゼはクラスリンをリン酸化して、これはアンフィファイシンのSrc−ホモロジー(homology)−3(SH3)ドメインに対する結合位置を提供する(Slepnev, V.I. et al., Science, 281:821-824(1998); Wang, L.H. et al., J.Biol.Chem., 270:10079-10083(1995);及びRamjaun, A.R. et al., J.Neurochem., 70:2369-2376(1998))。アンフィファイシン−1の正確な作用機構は解明されていないが、前記タンパク質はエンドサイトシスバッド(bud)の首部位で募集及びオリゴマー化に関与すると考えられる(Schmid, S.L. Annu. Rev. Biochem., 66:511-548(1997); 及びTakei, K. et al., Nat. Cell Biol., 133-139(1999))。アンフィファイシン−1はAP2/クラスリンコート及びダイナミン−1を連結してエンドソーム(endosome)小胞を作る(Slepnev, V.I. et al., Science, 281:821-824(1998); Shupliakov, O., et al., Science, 276:259-263(1997); McMahon, H.T. et al., FEBS Lett., 413:319-322(1997); David, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:331-335(1996); 及びUrrutia, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:377-384(1997))。アンフィファイシンのカルボキシル−末端ドメインはGTPaseダイナミンを利用してコーティングされたバッド(bud)を落とす (David, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:331-335(1996);及びUrrutia, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:377-384(1997))。アンフィファイシンとダイナミンまたはクラスリンとの相互作用の破壊及びAP-2はクラスリン−媒介エンドサイトシスを抑制する(Slepnev, V.I. et al., Science, 281:821-824(1998); Shupliakov, O., et al., Science, 276:259-263(1997); 及びWigge, P. et al., Curr. Biol., 7:554-560(1997))。前述の発見はエンドサイトシス小胞のクラスリン−媒介バッディング(budding)をダイナミン−媒介小胞分裂に連結するにアンフィファイシンが関与することを示す。また、アンフィファイシンは多数のサブタイプを有していて、アンフィファイシン−2はSH3ドメインを有していてアンフィファイシン−1のようにダイナミンに対しての結合−親化性を有していることも知られている。
【００３２】
カベオレは直径50-100nmの細胞膜小胞含入体であり、トランスサイトシスとピノサイトシス(pinocytosis)のようなエンドサイトシス及び信号伝達体系に関与する(Engelman, J.A. et al., FEBS Lett., 428:205(1998))。21-24 kDaの膜タンパク質、カベオリンはin vivoでカベオレ膜の重要な構造成分である。カベオリンのない哺乳動物細胞でカベオリン−1または−3遺伝子を安定に発現させる場合にはカベオレ構造の形成を誘導することができるということが知られている(Lipardi, C. et al., J. Cell Biol., 140:617(1998))。カベオリンはin vivoで多数のサブタイプを有するものとして知られている。カベオリン−2は大部分の細胞種で発現されて、カベオレの後部側面でヘテロ−オリゴマーを形成すると知られている(Scheiffele, P. et al., J. Cell Biol., 140:795(1998))。カベオリン−3の発現は横紋筋細胞でのみ起こるものとして報告されている(Tang, Z. et al., J. Biol. Chem., 271:2255(1996))。
【００３３】
Ｉ．老化細胞の同定方法及び細胞老化に影響を与える物質の同定方法
本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質のようなエンドサイトシスに関与するタンパク質を利用する。
【００３４】
本発明の方法において、細胞老化を示す信号は細胞内のアンフィファイシンタンパク質の減少された量またはカベオリンの増加された量を測定することにより測定される。
【００３５】
本明細書で用語“老化(senescence)”は“老化(aging)”と同一な意味を有する。用語“老化細胞(old cell)”は“老化細胞(senescent cell)”と同一な意味を有する。特に特定されなかったら、本明細書内のすべての技術的及び科学的用語は本発明の属する技術分野の当業者が共通的に理解するものと同一な意味を有する。例えば、本明細書内の用語はBenjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press(2000); and Kendrew et al., The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd.(1994)に開示されている。
【００３６】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。
【００３７】
本発明で利用されるアンフィファイシンは前述のアンフィファイシンサブタイプから選択されることができる。望ましくは、前記アンフィファイシンタンパク質はアンフィファイシン−1であり、これは前述したように主サブタイプとして知られたものである。また、本発明に利用されるカベオリンタンパク質はカベオリン−1、カベオリン−2及びカベオリン−3から選択されることができる。望ましくは、前記カベオリンタンパク質はカベオリン−1タンパク質であり、これは前述したように主サブタイプとして知られたものである。
【００３８】
アンフィファイシンまたはカベオリンに対しての抗体を利用する本発明の方法において、前記抗体は当業者に公知された方法により収得できる(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。前記抗体はポリクローンまたはモノクローン抗体である。モノクローン抗体は例えば、米国特許第4,196,265号に例示された方法のように公知された技術により容易に収得することができる。抗体に結合された分離タンパク質の量を決定する段階は放射能免疫分析及び酵素−結合免疫吸着分析のような当業者に公知された方法により実施されることができる。前記方法は放射能、蛍光、生物学的または酵素的標識などのような標識またはマーカーの検出に一般的に基づく。
【００３９】
本発明の望ましい具現例によると、前記方法はウェスタンブロッティング方法により実施される。ウェスタンブロッティング方法の一般的な過程はPeter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC Pressに開示されている。本発明においてのウェスタンブロッティングは、望ましくは、(a)測定対象の細胞試料を破壊する段階；(b)破壊された細胞からタンパク質を収得する段階；(c)SDS及び2−メルカプトエタノールを含む溶液内で前記収得したタンパク質を変性させる段階；(d)SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施する段階；(e)ゲル状の前記タンパク質をニトロセルロース(以下、“NC”と称する)膜に転移させる段階；(f)NC膜上のタンパク質をアンフィファイシンまたはカベオリン、望ましくはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1に対する1次抗体と反応させる段階；(g)発色反応を触媒する酵素に結合された2次抗体と前記1次抗体を反応させる段階；(h)前記段階(g)の酵素の基質を添加して発色反応を誘導する段階；そして(i)前記段階(g)の酵素により展開された色相の程度を測定する段階を含む。
【００４０】
発色反応のための酵素の望ましい例は、アルカリンフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼを含むが、これに限定されるものではない。アルカリンフォスファターゼを利用する場合、ブロモクロロインドリールフォスフェート(BCIP)、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)及びECFが脂質として利用され；ホースラディッシュペルオキシダーゼを利用する場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン及びルミノールが基質として利用される。
【００４１】
実施例に記載されたように、本発明者らは老化段階で細胞内アンフィファイシンの量が大いに減少し、反対にカベオリンの量は大いに増加することを確認した。従って、本発明は定性的な方法で実施することができる。例えば、アンフィファイシン検出のためのウェスタンブロッティングバンドの強さ及び厚さは視覚的に検出することができるほど大いに減少し；カベオリンを検出するためのウェスタンブロッティングの場合にはバンドの強さ及び厚さは大いに増加する。結論的に、老化細胞及び若い細胞から得られたウェスタンブロッティングバンドを比較して、老化を容易に検出することができる。
【００４２】
さらに、本発明は定量的にも実施することができる。例えば、ウェスタンブロッティングから得られたバンドをデンシトメーターで定量的データに変換させることができる。40μgタンパク質を分析する特定実施例で、試験対象の細胞内にあるアンフィファイシン−1の発現程度が若い細胞より45倍くらい低い場合、前記試験対象の細胞は老化されたものとして決定することができる。
【００４３】
本発明のアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質のようなエンドサイトシスに関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【００４４】
本発明の方法において、細胞老化を示す信号は細胞内のアンフィファイシンをコードするヌクレオチドの減少された量またはカベオリンをコードするポリヌクレオチドの増加された量を測定することにより検出される。
【００４５】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。望ましくは、前記ポリヌクレオチドはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1タンパク質をコードするものである。本発明で利用される前記ポリヌクレオチドはgDNA(ゲノムDNA)、cDNAまたはmRNAである。
【００４６】
本発明の望ましい具現例によると、前記方法はノーザンブロッティング方法により実施されることができる。ノーザンブロッティングの一般的な過程はPeter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC Pressに開示されている。本発明のノーザンブロッティングは(a)試験対象の細胞からRNAを収得する段階；(b)収得したRNAで電気泳動を実施する段階；(c)ナイロンまたはNC膜に前記RNAを転移させる段階；(f)アンフィファイシンまたはカベオリン、望ましくはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1 mRNAに相補的な放射能−標識オリゴヌクレオチドプローブと前記転移されたRNAをハイブリダイズさせる段階；(g)最終バンドの強さを測定する段階を含む。
【００４７】
実施例に記載されたように、本発明者らは老化段階で細胞内アンフィファイシンRNAの量が大いに減少し、反対にカベオリンRNAの量は大いに増加することを確認した。従って、本発明は定性的な方法で実施することができる。例えば、アンフィファイシンRNA検出のためのノーザンブロッティングバンドの強さ及び厚さは視覚的に検出することができるほど大いに減少し；カベオリンRNAを検出するためのノーザンブロッティングの場合にはバンドの強さ及び厚さは大いに増加する。結論的に、老化細胞及び若い細胞から得られたノーザンブロッティングバンドを比較して、老化を容易に検出することができる。
【００４８】
さらに、本発明は定量的にも実施することができる。例えば、ノーザンブロッティングから得られたバンドをデンシトメーターで定量的データに変換させることができる。アンフィファイシン−1 RNA 50μgを分析する特定実施例で、試験対象の細胞に対するバンドの強さが若い細胞より15倍くらい低い場合、前記試験対象の細胞は老化されたものとして決定することができる。
【００４９】
ＩＩ．細胞老化調節用組成物
本発明の細胞老化調節用組成物は細胞老化を調節することのできる生体分子を含む。前記生体分子は(a)アンフィファイシン及びカベオリンタンパク質のようなタンパク質；(b)アンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。また、前記生体分子はアンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズすることのできるアンチセンスヌクレオチドを含む。一方、本発明の組成物はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤を含む。
【００５０】
前述のように、前記タンパク質を直接的に送達することもできるが、望ましくは、アンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５１】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。望ましくは、前記エンドサイトシスに関与するタンパク質はアンフィファイシン−1またはカベオリン−1タンパク質である。
【００５２】
ポリヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドはgDNAまたはcDNAが望ましく、これは真核細胞用発現ベクターにより運搬される。アンフィファイシン−1をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは、配列2として示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、より望ましくは、配列1として示すヌクレオチド配列のヌクレオチド111−2195に該当するヌクレオチドを含む。カベオリン−1をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは、配列4として示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、より望ましくは、配列3として示すヌクレオチド配列のヌクレオチド26−559に該当するヌクレオチドを含む。
【００５３】
本発明に利用される発現ベクターは真核細胞宿主、望ましくは哺乳動物細胞、より望ましくはヒト細胞から外来遺伝子を発現する。発現ベクターのプロモーターは哺乳動物細胞のゲノムから由来のもの(例えば、メタロチオネインプロモーター)、または哺乳動物ウイルスから由来のもの(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター)である。万一、調節遺伝子が宿主細胞システムと両立することができる場合には、所望の遺伝子配列に連結されているプロモーターまたは調節配列を利用することも望ましい。ウイルスを利用する多くの発現システムが利用でき、例えば、一般的に利用されるプロモーターはポリオマ及びアデノウイルス2から由来のものであり、最も多く利用されるものはシミアンウイルス40(SV 40)から由来のプロモーターである。適合なポリアデニル化部位を転写単位に挿入することが望ましい。本発明に利用できる商業的に購入可能なベクターの例はpcDNA 3(Invitrogen;サイトメガロウイルスプロモーター及びポリアデニル化信号包含)、pSI(Promega; SV 40プロモーター及びポリアデニル化信号包含)、pCI(Promega;サイトメガロウイルスプロモーター及びポリアデニル化信号包含)、及びpREP7(Invitrogen;RSVプロモーター及びSV 40ポリアデニル化信号包含)を含む。
【００５４】
また、アンフィファイシンまたはカベオリンをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは遺伝子治療のためのウイルスベクターを利用して運搬されることができる。例えば、前記運搬システムは(a)アデノウイルスベクター(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, In: Human Gene Transfer, Eds., Cohen-Haguenauer and Boiron, Editions John Libbey Eurotest, France, 51-61(1991); and Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther., 1:241-256(1991)); (b) アデノ−関連ウイルスベクター(LaFace et al., Virology, 162:483-486(1998); Zhou et al., Exp. Hematol., 21:928-933(1993); and Walsh et al., J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994)); 及び(c) モロニーマウス白血病ウイルスの遺伝子操作された変異体のようなレトロウイルスベクター(Kasahara et al., Science, 266:1373-1376(1994))を含む。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内条件下で、DNAまたはRNAに結合するようになる。二重鎖DNAにアンチセンスオリゴヌクレオチドが結合するようになると、三重−ヘリックスを形成するようになり、RNAに結合するようになると二重−へリックスを形成するようになる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはプロモーター及び他の調節部位、目的遺伝子のエキソン及びイントロンに結合するように製作することができる。本発明に利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のポリヌクレオチドに実質的に相補的である。即ち、アンチセンスコンストラクトは目的遺伝子に幾つかの不一致塩基を有することができる。より望ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリンタンパク質、さらに望ましくはカベオリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。最も望ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリン−1 mRNAの翻訳開始部位にハイブリダイズする。
【００５６】
メチル化剤または脱メチル化剤を含む本発明の組成物で、前記製剤はカベオリン遺伝子の塩基のメチル化程度を調節する。実施例に記載されたように、メチル化されきれなかったカベオリン遺伝子はより増加された発現程度を示す。望ましい具現例で、メチル化または脱メチル化されるカベオリン遺伝子はカベオリン−1遺伝子である。より望ましくは、前記変形される部位はカベオリン−1遺伝子のプロモーターであり、最も望ましくは、カベオリン−1遺伝子のプロモーターにあるCpGアイランドである。本発明に利用されるメチル化剤の例はメチルアゾキシメタノールアセテート、テモゾロミド(temozolomide)及びN-メチル-N-ニトロソウレアを含むが、これに限定されるものではない。脱メチル化剤の非−制限的な例は5−アザ−デオキシシチジン、5−アザシチジン、6−アザシチジン及び8−アザグアニンを含む。
【００５７】
細胞老化を調節する組成物として、本発明はドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子の有効量を含む組成部を提供する。前記ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子はアンフィファイシン−1の機能を抑制するものとして知られている(Shupliakov, O. et al., Science, 276:259(1997); and Wigge P., Curr. Biol., 7:554(1997))。ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子による処置は細胞老化を誘導し、これは実施例で確認することができる。本発明の望ましい具現例によると、前記ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子は配列2として示すアミノ酸配列250乃至588を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５８】
ＩＩＩ．細胞老化調節方法
本発明の方法において、アンフィファイシンまたはカベオリンに関連された生体分子の有効量は典型的に細胞に投与される。特に、アンフィファイシンまたはカベオリンをコードするポリヌクレオチドまたはこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは次の方法によりin vivoまたはex vivoで投与されることができる：(a) 微細注入(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)); (b) カルシウムフォスフェート共沈澱(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)); (c) 電気穿孔(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)); (d) リポソーム−媒介形質感染(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)); (e) DEAE-デキストラン処理(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)); 及び(f) 粒子ボンバード(bombardment) (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))。
【００５９】
本発明の望ましい具現例によると、利用される細胞は哺乳動物、より望ましくはヒト細胞から由来のものである。望ましくは、投与されるタンパク質、ポリヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1に対するものである。望ましくは、投与されるポリヌクレオチドはgDNAまたはcDNAである。より望ましくは、投与されるポリヌクレオチドは真核細胞用発現ベクターで運搬される。アンチセンスコンストラクトを利用する本発明の望ましい具現例で、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリン、より望ましくはカベオリン−1をコードする遺伝子に実質的に相補的なものである。最も望ましい具現例はカベオリン−1 mRNAの翻訳開始部位にハイブリダイズするものである。
【００６０】
メチル化剤または脱メチル化剤を利用する本発明の方法で、前記製剤はカベオリン遺伝子の塩基のメチル化程度を調節する。望ましい具現例で、メチル化または脱メチル化されるカベオリン遺伝子はカベオリン−1遺伝子である。より望ましくは、前記変形される部位はカベオリン−1遺伝子のプロモーターであり、最も望ましくは、カベオリン−1遺伝子のプロモーターにあるCpGアイランドである。本発明に利用されるメチル化剤の例はメチルアゾキシメタノールアセテート、テモゾロミド(temozolomide)及びN-メチル-N-ニトロソウレアを含むが、これに限定されるものではない。脱メチル化剤の非−制限的な例は5−アザ−デオキシシチジン、5−アザシチジン、6−アザシチジン及び8−アザグアニンを含む。
【００６１】
前記I、II及びIIIの共通的な事項は過度な重複を招来する本明細書の複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００６２】
ＩＶ．キット及びバイオマーカー
前述のように、本発明は老化細胞検出用キットを提供する。老化細胞を検出するに必要なすべての必須的な物質及び試薬は一つのキット内に包含させることができる。試験対象の細胞から分離されるDNAまたはRNAにハイブリダイズするに有用なプローブが利用される。また、前記プローブはPCR及びRT−PCRのように当業者に公知された分子生物学分析方法に利用されるプライマーであることができる。また、本発明のキットは核酸増幅に適合な酵素、例えば、Taq重合酵素、増幅反応に必要な反応混合物を提供することのできるdNTP混合物及び緩衝液を含むことができる。
【００６３】
本発明の望ましい具現例で、前記プローブはアンフィファイシン−1タンパク質またはカベオリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のものである。望ましくは、前記プローブは固体支持体上に固定化されたものである。本発明のキットに利用される固体支持体は当業者に公知されたものであって、ガラス、プラスチック、重合体、金属、準金属、セラミックまたは有機物を含む。本発明のより望ましい具現例によると、本発明はアンフィファイシン−1タンパク質またはカベオリン−1タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のプローブのアレイを含むキットを提供する。個体支持体を含むマイクロアレイに対しての一般的な技術はWO 89/10977、米国特許第5,202,231号、 第5,002,867号及び第5,143,854号に開示されている。
【００６４】
本発明の望ましい具現例によると、本発明のキットはプローブの存在を検出するに利用される標識(label)を追加的に含む。前記標識はプローブと試料から分離されたヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを検出できるようにする。最も一般的な標識は3H、14C及び32Pのような放射線物質である。
【００６５】
本発明は細胞老化同定用バイオマーカーを提供する。望ましい具現例で、本発明に適合なタンパク質またはポリヌクレオチドはアンフィファイシン−1またはカベオリン−1から由来のものである。
【００６６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【００６７】
実施例
実施例 I ：細胞培養
実施例 I-1 ：表皮繊維芽細胞の培養
表皮繊維芽細胞の分離及び培養はBoyceとHamの方法(Boyce ST. and Ham RG., J. Invest. Dermato., 81:33-40(1983)) により次のように実施した：先ず、７歳の男児から表皮を収得し、これを薄く剥がして切片にした後、表皮切片を0.25%のコラゲナーゼが含まれたハンクス塩溶液(Hank’s salt solution: Gibco BRL社)10mlに入れて、90分間5%CO2、37℃の恒温培養機で培養させた後、上皮と真皮とを相互分離した。次いで、分離した真皮に0.25%のトリプシン溶液1mlを添加して、抗生剤であるストレプトマイシン100μg/mlとペニシリン(Gibco BRL社)100ユニット/mlを含むDMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium: Sigma社)10mlに入れた後、37℃の恒温培養機で10分間培養した。前記過程により得られた表皮繊維芽細胞を10mlのPBSで洗浄した後、前記のDMEM(10%FBS及び抗生剤包含)で継代培養を次のように続けて実施した：恒温培養機は5%のCO2濃度及び37℃を維持するようにし、DMEMは三日毎に交換して、サブコンフルエンシ(subconfluency)が維持されるようにし、継代培養(subculture)は1：4で実施した。25群落ダブリング(population doublings)以下の細胞は増殖が非常に活発で、これは前老化細胞(または若い細胞)として見做し、反面、60群落ダブリング以上の細胞は老化細胞として見做し、この細胞は延長された群落ダブリング期間(3週以上)を示した。
【００６８】
I-2 ：肺繊維芽細胞 (fetal lung fibroblast) の培養
肺繊維芽細胞であるIMR-90細胞はATCC(CCL-186)から購入して使用した。IMR-90の培養は前記の皮膚繊維芽細胞と同様に実施した。
【００６９】
実施例 II ：細胞老化誘導
II-1 ： H 2 O 2 による細胞老化誘導
先ず、前記実施例I-1で継代培養されたPDL 16の皮膚繊維芽細胞を細胞培養皿に敷いて細胞培養恒温機(37℃, 5% CO2, humidified)で一週間維持して細胞がGl細胞基に停止されるようにした。一方、Gl細胞基に停止されたかのことは次のように確認した：細胞を70%氷冷エタノールで固定した後、PI染色溶液(PBSに50μg/mlのRNase Aと50μg/mlのプロピニウムヨージド(propinium iodide)が包含)を用いて室温で細胞を染色した。これをFACS(Fluorescence-activated cell sorter)を用いてDNAが各々2nと4nの中でどのような形態を示すかを確認することにより細胞基を確認した。Gl細胞基の細胞の場合、大部分のDNA染色状態が2n状態を示した。
【００７０】
Gl細胞基に停止された皮膚繊維芽細胞に400μM H2O2を処理して3時間培養した後、PBS 10mlで2回洗浄した。次いで、細胞を1：4で継代培養した後正常的な細胞培養条件(37℃, 5% CO2, humidified)で培養を持続した。H2O2を処理して７日以後から細胞老化の指標として使用されている老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色をして細胞が老化状態に入ったことを確認して実験に使用した。β−ガラクトシダーゼ活性染色は下記実施例IIIのように実施した。
【００７１】
II-2 ：ヒドロキシウレア (Hydroxyurea) による細胞老化誘導
先ず、前記実施例I-1で継代培養されたPDL 16の皮膚繊維芽細胞をDMEMが含まれた細胞培養皿に敷いて、14時間細胞培養機(37℃, 5% CO2, humidified)で培養した。次いで、400μMのヒドロキシウレアを処理して培養を持続した。培養培地は三日毎に交換し、培地を交換するたびに400μMのヒドロキシウレアを新しく添加した。ヒドロキシウレアを処理して14日後から老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色を下記実施例IIIのように実施し老化状態への進入を確認して実験に使用した。
【００７２】
実施例 III ：老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色
老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色(以下、“SA β−gal活性染色"と称する)はDimriらの方法(Dimri GP. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:9363-9367(1995))により次のように行った：先ず、セミコンフルエント(semiconfluent)繊維芽細胞をPBS 10mlで2回洗浄した後、2%のパラホルムアルデヒドで室温で5分間固定した。固定された細胞をPBSで再び洗浄し、β−ガラクトシダーゼ活性染色溶液(1mg/mlのX-Gal, 40 mMクエン酸/ソジウムフォスフェート(pH 6.0), 5mMポタシウムフェロシアニド(potassium ferrocyanide), 150mM NaCl及び2mM MgCl2)5mlを添加して、37℃の恒温培養機で12〜16時間反応させた。反応が進行される間、光が入らないようにアルミホイルで培養皿を包んで培養した。最終的に、位相差顕微鏡で発色程度を確認した。ヒト表皮繊維芽細胞の場合はPDL 50、IMR 90の場合にはPDL 65からβ−ガラクトシダーゼ活性が現れて、H2O2で処理した場合は処理して10日以後から、ヒドロキシウレアで処理した場合は処理して14〜20日以後からβ−ガラクトシダーゼ活性が現れ細胞が老化に進入したことを確認することができた。
【００７３】
実施例 IV ：エンドサイトシス (endocytosis) の変化確認
IV-1 ：老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下観察
老化細胞で収容体−媒介エンドサイトシスの機能に変化があるかを確認するためにトランスフェリン(transferrin)の運搬程度を次のように観察した：先ず、細胞をカバーグラスの上に敷いた後、細胞培養機(37℃, 5% CO2, humidified)で培養した後、25μg/mlテトラメチルロダミン−接合トランスフェリン(Molecular Probe社)を5分間処理した。次いで、PBS 10mlで洗浄した後、PBS内4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定して、細胞の核をDAPI(Sigma-Aldrich)で染色した。トランスフェリンの運搬程度は共焦点顕微鏡(Biorad社、#MRC 1024)を用いて観察し、その結果は図１に示した。
【００７４】
図１で、パネルAは若い繊維芽細胞(PDL 20)及び老化繊維芽細胞(PDL 54)を示し、パネルBはIMR細胞(PDL 32及び68)を示す。図１で分かるように、若い繊維芽細胞及び若いIMR細胞の場合は蛍光性トランスフェリンが細胞内に運搬されて核の周囲に集まっている様子を示すが、これは細胞内運搬時に現れる典型的な様子として報告されたことがある。これとは反対に、老化細胞は前老化細胞のようにトランスフェリンを効率的に細胞内に運搬することはできなかった。
【００７５】
IV-2 ：処理時間によるトランスフェリン運搬の観察
表皮繊維芽細胞を25μg/mlテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンで10、20、40及び60分間処理して、その実験結果は図２に示した。図２でパネルY、M及びOは各々若い細胞(PDL 24)、中間細胞(PDL 38)及び老化細胞(PDL 54)を示す。図２から確認できるように、PDL 24及び38の若い細胞ではトランスフェリン運搬が効果的に発生し10分から細胞内の核の周辺にその蛍光像が現れ、時間が経過するにつれて持続的に運搬されたトランスフェリンが蓄積されてさらに多い蛍光が観察された。これに反して老化細胞では60分間培養した後にも細胞内に運搬された蛍光が現れなかった。
【００７６】
IV-3 ：トランスフェリン運搬のパルス−チェーシング (pulse-chasing)
IMR 90に5分間25μg/mlロダミン(rhodamine)−接合トランスフェリンを処理した後、0分、5分及び10分間チェーシングした。その後、前記のように固定して、トランスフェリンの運搬程度を共焦点顕微鏡で観察した(参照：図３)。図３で、パネルY、M及びOは若い細胞(PDL 26)、中間細胞(PDL 48)及び老化細胞(PDL 72)を示す。図３から分かるように、若い細胞の場合はただ5分でトランスフェリンを細胞内の骨脂細網系部位に位置させ、5分間のパルスの後固定させた時には既にその蛍光が核周辺で観察されて、10分後には細胞内で処理されその蛍光像が拡散されて現れた。これに反しPDL 48の細胞の場合は、トランスフェリンの運搬が遅延され、10分後細胞内の骨脂細網系部位に蛍光像が淡く現れていることを確認することができた。 一方、PDL 72細胞では時間が経過してもトランスフェリンの運搬自体が行われなかった。
【００７７】
IV-4 ：人為的に誘導された老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下確認
前記実施例IIで人為的に老化が誘導された細胞に前記のように25μg/mlテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンを処理して、蛍光性トランスフェリンの運搬程度を共焦点顕微鏡で観察した(参照：図４)。図４から分かるように、継代培養による自然的老化でだけではなくH2O2やヒドロキシウレアを処理して得られた人為的老化細胞でも収容体−媒介エンドサイトシス機能が低下されていることを確認することができた。
【００７８】
本実施例を通じてヒト繊維芽細胞が老化されるとエンドサイトシス機能が低下されトランスフェリンのようなリガンドを細胞内に流入することができないということを確認した。
【００７９】
実施例 V ：収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質発現分析
老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下を分子的次元から解明するために、収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質の発現をウェスタンブロッティング(Western blotting)実験を通じて次のように確認した。
【００８０】
サブコンフルエント(subconfluent)の初期、中期及び末期−継代細胞を細胞溶解緩衝液(1%トリトンX-100, 0.5% NP-40, 50 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5μg/mlアプロチニン, 5μg/mlロイペプチン, 1 mM NaVO4及び1 mM NaF)を利用し溶解して、音波破砕した後、破砕物を14000×gで10分間遠心分離した後、その上層液を取った。このようにして得られた上層液に対して、ブラッドフォード法(Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976))を利用してタンパク質を定量した後、同量(40μg)のタンパク質を取って5X SDS試料緩衝液(60 mM Tris-Cl(pH 6.8), 25%グリセロール, 2% SDS, 14.4 mM 2-メルカプトエタノール, 0.1%ブロモフェノールブルー)を添加して5分間煮って変性させた。細胞破砕液(10-15μgタンパク質を包含)を電気泳動キット(Biorad社)を利用して8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をして分離させて、分離されたタンパク質をトランスファーキット(Biorad社)を利用してNCメンブレンに転移させた。このブロットを5%脱脂粉乳(Difco社)を含むTTBS(Tris buffered saline with Tween 20)で1時間ブロッキングさせた。前記ブロットを5%脱脂粉乳を含むTTBS内の各々の1次抗体で1時間室温で免疫ブロットして、TTBSで3回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合抗−マウス2次抗体(Jackson Immuno Research Laboratory)を処理した。前記1次抗体として使用された抗体の中で、抗−ダイナミン抗体、抗−α−アダプチン抗体、抗−β−アダプチン抗体及び抗−クラスリン重鎖抗体はTransduction Laboratory社から購入したものであり、マウス単一クローン抗−アンフィファイシン−1抗体は大韓民国の忠北大学校医科大学、キムスンリョル博士から得たものであり(Jin, Y., Kim et al.(in press), Production and characterization of monoclonal antibodies against amphiphysin, Exp. Mol. Med.)、抗−ホスホチロシン抗体と抗−トランスフェリン収容体抗体はSanta Cruz Biotechnologyから購入したものである。シグナルは改善された化学発光システム(ECLキット, Amersham Pharmacia Biotech)を利用して可視化して、その結果は図５に示した。
【００８１】
図５から確認できるように、ただアンフィファイシン−1だけが老化細胞で大幅減少されて、他のエンドサイトシスタンパク質はほとんど変化がなかった。アンフィファイシン−1タンパク質の発現減少は繊維芽細胞及びIMR 90細胞各々の老化細胞で観察された。さらに、H2O2またはヒドロキシウレアから誘導された老化細胞(“＋”で表示)も図５と同一な実験結果を示した(参照：図６)。
【００８２】
前記実験結果から細胞老化過程はアンフィファイシン−1の発現減少と連関されていることが分かる。
【００８３】
実施例 VI ：収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質をコードする mRNA のノーザンブロット分析
前記実施例Vから確認した細胞老化時アンフィファイシン−1タンパク質の発現減少の正確な機構を解明するために、ノーザンブロッティングを次のように実施した。
【００８４】
酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルムを利用して前記実施例Iのヒト表皮繊維芽細胞からRNAを分離して、ホルムアルデヒド試料緩衝液(5X MOPS, 17.5%ホルムアルデヒド及び50%ホルムアミド)と混合した後、電気泳動キット(Hoefer社)を利用して1%アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動が終了された後、NCメンブレンにRNAを転移させて、自動UV交互結合剤(Stratagen社)を利用してRNAをメンブレンに交互結合させた。その後、32P−標識されたプローブ(アンフィファイシン−1 cDNAのヌクレオチド111−1116を包含)とハイブリダイゼーション反応をさせた後、最終的に自動放射線写真を得た(参照：図７)。図７で、パネルYはPDLが27、MはPDLが36そしてOはPDLが60である表皮繊維芽細胞である。図７から分かるように、老化が進行されるにつれてアンフィファイシンmRNA量が減少されることを確認することができた。
【００８５】
前記の実験結果から細胞老化進行は転写段階でのアンフィファイシン−１の減少と連関されていることが分かる。
【００８６】
実施例 VII ：アンフィファイシン−１遺伝子のクローニング
ヒトアンフィファイシン−１遺伝子の全長cDNAは添付の配列１として示すヌクレオチド配列を有し、前記cDNAを運搬するベクターは大韓民国の忠北大学校から入手した。前記ベクターはpGEX-2Tベクター(Pharmacia社)のBamHIとEcoRI制限位置に前記cDNAを挿入してアンフィファイシン−１とグルタチオン−S−トランスフェラーゼが融合された形態に発現されるように製作された。図８はヒトアンフィファイシン−１をコードするcDNAを運搬するベクターの遺伝子地図である。全長cDNAは次のプライマーを利用してPCR増幅した：5_-AACTGTCCACCATGGCCGACATCAAGACGGGC-3_ 及び 5_-GGATCCCTAATCTAAGCGTCGGGT-3_。PCR増幅はPyrobest Taq重合酵素(Takara社)を使用して次の温度で30サイクルを行った：55℃で30秒(アニーリング)、72℃で1.5分(伸長反応)及び92℃で30秒(変性)。増幅されたcDNAをpT7 blueベクター(Novagen社)にクローニングして塩基配列を確認した。次いで、Hind IIIと Bam HIで処理した後、繊維芽細胞にアンフィファイシン−1 cDNAを微細注入するためにpcDNA3ベクター(サイトメガロウイルスのプロモーター及びポリアデニル化シグナル包含)にサブクローニングした。アンフィファイシン−1のcDNAを含むpcDNA 3の遺伝子地図は図９に示されている。
【００８７】
実施例 VIII ：アンフィファイシン− 1 遺伝子による老化細胞の細胞膜収容体性エンドサイトシスの回復
VIII − 1 ：アンフィファイシン− 1 遺伝子の微細注入
実施例Iの老化されたヒト表皮繊維芽細胞(PDL 58)をカバーグラス上に敷いてFBSが入っていないDMEM培地を用いて細胞培養機(37℃, 5% CO2, humidified)で24時間培養した。次いで、前記実施例VIIでpcDNA 3ベクターにクローニングされたアンフィファイシン−1遺伝子(10ng/ml) 10-14l及びラビットIgG(Sigma社, 5mg/ml)10-14l を老化細胞の核に微細注入した。ベクターは微細注入バッファー(50mM HEPES, pH 7.2, 100mM KCl, 50mM NaPO4)で10ng/mlに希釈した。希釈したベクターをトランスゼクター5246 (transjector5246；Eppendorf社)及びマイクロマニピュレーター(micromanipulator；Eppendorf社)を使用して細胞核に微細注入した。
【００８８】
VIII − 2 ：微細注入された細胞でのアンフィファイシン− 1 の発現分析
微細注入された細胞でアンフィファイシン−1の発現を次のように重複免疫蛍光染色を実施して確認した：微細注入後、24時間FBSのないDMEM培地で成長させた細胞を3.7%パラホルムアルデヒド溶液(in PBS)で10分間固定させて、PBS内0.3% Triton X-100で室温で10分間透過化した。次いで、抗−アンフィファイシン−1抗体及びFITC−接合抗−ラットIgG抗体(Jackson Laboratory社)で細胞を連続的に37℃で1時間処理した後、ロダミン−接合抗−ラビットIgG抗体(Jackson Laboratory社：1：100に希釈)で37℃で1時間処理した。像は蛍光顕微鏡(Zeiss社, Axiovert 25, CFL451210)で観察した(参照：図１０)。図１０から分かるように、抗−ラビットIgGはロダミンにより赤色蛍光で確認でき、アンフィファイシン−1は2次抗体のFITCにより緑色蛍光で確認することができた。アンフィファイシン−1の存在を示す緑色蛍光は細胞質で観察された。
【００８９】
従って、アンフィファイシン−1タンパク質は実施例VIII−1の微細注入された細胞で発現されることが分かる。
【００９０】
VIII − 3 ：老化細胞でのエンドサイトシス機能回復の分析
微細注入された細胞をFBSが入っていないDMEMで恒温機(37℃, 5% CO2, humidified)で24時間培養した。次いで、125ng/mlテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンで細胞を30分間処理し、10mlPBSで洗浄した後、PBS内4%パラホルムアルデヒド10mlで10分間固定した。その後、免疫蛍光染色を前記実施例VIII−2と同様に実施した。蛍光顕微鏡(Zeiss社、Axiovert 100)を利用して、微細注入された細胞の確認及びトランスフェリンの運搬程度を観察した。実験結果は表１に示した。
【００９１】
【表１】
前記表１から確認できるように、pcDNA 3ベクターがモック(mock)で微細注入した細胞に比べて、アンフィファイシン−1遺伝子が含まれたpcDNA 3ベクターを微細注入した細胞でトランスフェリンの細胞内運搬が大いに増加されることが分かる。即ち、老化細胞のエンドサイトシス活性はアンフィファイシン−1 cDNAの注入により急激に増加する。このような実験結果はアンフィファイシン−1が老化細胞のエンドサイトシスの機能回復に必須的であり、細胞老化を調節する重要な要素であることを証明する。
【００９３】
実施例 IX ：ドミナントネガティブアンフィファイシン− 1 遺伝子のクローニング
アンフィファイシン−1の機能を遮断するものとして知られているドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子(Shupliakov, O. et al., Science, 276:259(1997);及びWigge P., Curr. Biol., 7:554(1997))を、アンフィファイシン−1 cDNAを鋳型にして特定プライマーを利用しPCRを実施することにより増幅して、これによりアンフィファイシン−1タンパク質の中間部分(アミノ酸250乃至588)をコードする部分的なヌクレオチド配列を増幅した。利用された前方向プライマー及び逆方向プライマーは次の配列を有する； 5’-AACTGTCCACCATGAGTGATTCGGGTCCTCTCCGC-3’ 及び5’-GGATCCCTACTGCTCCGTAGCCAGCTCCGG-3’。PCR増幅産物を実施例VIIの方法と同様にpcDNA(Invitrogen)にサブクローニングした。最終ベクターの遺伝子地図は図１１に示されている。
【００９４】
実施例 X ：ドミナントネガティブアンフィファイシン− 1 遺伝子による若い細胞のエンドサイトシス機能の抑制
前記実施例IXで製作されたベクターを利用して、若い繊維芽細胞(PDL 16)を次のように形質転換させた：前記実施例９で製造したベクター2μg及びpEGFP-N1ベクター(Clontech社)0.5μgをDMEMとプラス試薬8μlと混合した後、室温で15分間放置した。その後、リポフェクタミン(Gibco-BRL社)とDMEMの混合物を前記混合物とよく混合した後、室温で15分間放置した。その後、DMEM 2mlを追加的に添加して、前記最終混合物を若い繊維芽細胞に添加した後37℃で3時間培養した。3時間経過した後、20%FBSを含有するDMEM 2.5mlを加えて、40時間培養した。次いで、細胞に25μg/mlロダミン−接合トランスフェリンを10分間処理した後、共焦点顕微鏡(Biorad社, #MRC1024)で像を観察し、形質転換された細胞(EGFP−由来緑色蛍光発散)または非−形質転換された細胞でのトランスフェリンの運搬程度を解明した(参照：図１２)。図１２から確認できるように、ドミナントネガティブアンフィファイシン−1 cDNAが挿入されたベクターとpEGFP-N1ベクターで同時形質転換された細胞(左側パネル)ではロダミン−接合トランスフェリンの赤色蛍光が観察されなく、即ち、ロダミン−接合トランスフェリンの細胞内運搬が発生されなくて、形質転換されていない細胞(右側パネル)では赤色蛍光が観察された。
【００９５】
前記実験結果はアンフィファイシン−1の機能的不能は収容体−媒介エンドサイトシスを抑制して、これは結局細胞老化を誘導することを示す。
【００９６】
実施例 XI ：ウェスタンブロッティングを利用した Erk − 1/2 の活性分析
ヒト繊維芽細胞またはIMR−90の若い細胞(PDL 30以下)、中間細胞(PDL 35-45)及び老化細胞(PDL 60以上)の各々にEGF(Gibco-BRL社, #13247-051, human, recombinant)100ng/mlを処理して刺激させた。次いで、前記実施例Vに記載された方法に従ってウェスタンブロッティングを実施した。モノクローン抗−ホスホ−Erk-1/2抗体、ポリクローン抗−Erk-1/2抗体及びポリクローン抗−EGFR抗体はSanta Cruz Biotechnology社から購入したものである。図１３（ａ）から確認できるように、若い細胞及び中間細胞はEGF刺激後５分以内にErk-1/2キナーゼがリン酸化(活性化)されて、15分間持続された。しかし、老化細胞の場合はErk-1/2キナーゼのリン酸化が15分経過するまで検出されなかった。一方、群落ダブリングが増加する場合、EGFからErkキナーゼへの信号伝達が減少するにも関わらず、Erkキナーゼ及びEGFRの発現度は変化がないことをウェスタンブロッティングを通じて確認した(参照：図１３（ｂ）)。
【００９７】
従って、老化細胞で現れる成長刺激因子に対しての反応の減少はErk−1/2キナーゼの活性化、即ちリン酸化の減少によるものであることが分かる。
【００９８】
実施例 XII ：ウェスタンブロッティングを利用したカベオリン (caveolin) 発現の分析
カベオリン発現分析のために、ヒト繊維芽細胞またはIMR−90の若い細胞(PDL 30以下)、中間細胞(PDL 35-45)及び老化細胞(PDL 60以上)の各々に対して前記実施例Vと同様にウェスタンブロッティングを実施した。単一クローン抗−カベオリン−1抗体、単一クローン抗−カベオリン−2抗体及び単一クローン抗−カベオリン−3抗体はTransduction Laboratories社から購入したものである。図１４から分かるように、老化が進行されるにつれてヒト繊維芽細胞またはIMR-90でカベオリン−1、カベオリン−2及びカベオリン−3の全てがその発現が増加される。
【００９９】
実施例 XIII ：免疫沈澱による EGFR 及びカベオリン -1 の相互作用の分析
ヒト繊維芽細胞の若い細胞(PDL 30以下)及び老化細胞(PDL 60以上)の各々の細胞試料をIP溶解緩衝溶液(10mMフォスフェート緩衝溶液, pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, 2mM EDTA, 1mM PMSF, 2μg/mlアプロチニン, 2μg/mlロイペプチン, 50mM NaF及び0.2mM Na3VO4)で溶出して、短く音波破砕した後9000rpmで5分間遠心分離しその上層液を取った。次いで、上層液を正常マウス血清、抗−EGFR抗体または抗−カベオリン−1抗体と反応させた後タンパク質A-セファロースビーズ(Amersham Pharmacia Biotech)で免疫複合体を沈澱させて、SDS-PAGEを実施した後、前記実施例Vと同様にウェスタンブロッティングを実施した(参照：図１５)。
【０１００】
図１５から分かるように、ヒト繊維芽細胞の老化細胞でEGFR免疫複合体はカベオリン−1タンパク質を含んでいると分析されたが、若い繊維芽細胞はそうではなかった。
【０１０１】
従って、老化が進行されるにつれて、カベオリン−1タンパク質の発現が増加されて、増加されたカベオリン−1はEGFRと相互作用してEGFRによるErk-1/2キナーゼの活性化作用を抑制することが分かる。
【０１０２】
実施例 XIV ：カベオリン− 1 に対しての電子顕微鏡分析
ヒト繊維芽細胞の若い細胞(PDL 20)と老化細胞(PDL 65)を1000rpmで遠心分離して細胞を沈澱させて、3%グルタルアルデヒド/PBS(pH 7.4)で固定させた後、0.2Mソジウムカコジレート緩衝溶液(pH 7.4)で洗浄した。次いで、細胞沈殿物をカコジレート緩衝溶液内の1%オスミウムテトロキシドで1時間処理した後、プロピレンオキシドを通した等級のエタノール処理により脱水させて、Embed812(Electron Microscope Sciences社)内に細胞試料を埋めた。その後、埋められたマイクロトーム(microtomb；Leichert-JUNG社)を利用して200nmに切断して、切断片をメチレンブルー及びアジュレII(azureII)を利用して染色させた後、光学顕微鏡で観察し、電子顕微鏡で観察する部位を選択した。その後、選択された部位を再びマイクロトームを利用して60nmの厚さで超薄切断して、ウラニルアセテート及びリードシトレートで染色した後、透過電子顕微鏡(H-600, Hitachi)で観察した。図１６から分かるように、老化細胞の場合カベオレ(caveolae)−類似構造の数が若い細胞より多い。
【０１０３】
実施例 XV ：カベオリン -1 cDNA 運搬用プラスミド DNA の製作
ヒト繊維芽細胞の老化細胞からTRIzol(Gibco-BRL社, #15596-026)を利用して総RNAを分離し、これを鋳型にしてRT-PCRを実施して、カベオリン−1のcDNAを得た。この際使用したプライマーは次のようである：前方向プライマー、 5’-atccaagcttccaccatgtctgggggcaaatacgt-3’及び逆方向プライマー、 5’-gcaggatccctatatttctttctgcaagttgat-3’。逆転写酵素はPromega社のAMT RTaseを使用し、TaqポリマラーゼはTakara社のEx Taqを使用した。温度条件は次のようである：60℃で30秒(アニーリング)、72℃で50秒(伸長反応)及び92℃で30秒(変性)。次いで、カベオリン−1のcDNAを確認するために増幅されたcDNAを鎖終結方法(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463(1977))で配列付け(sequencing)した。 カベオリン−1 cDNAのヌクレオチド配列は添付の配列３のようである。増幅されたcDNAをpcDNA 3ベクター(Invitrogen)にHind IIIとBam HI制限位置を利用してサブクローニングした。最終的に製作されたベクターの遺伝子地図は図１７のようである。
【０１０４】
実施例 XVI ：カベオリン -1 cDNA によるヒト繊維芽細胞の形質転換
前記実施例XVで製作されたベクターを利用してヒト繊維芽細胞の若い細胞(PDL 25)を次のように形質転換させた：細胞を皿に敷いて18時間培養し70-80%の融合度(confluency)になるようにした。前記実施例XVで製造したベクター2μgとプラス試薬8μlを混合した後、リポフェクタミン(Gibco-BRL社)12μlとDMEM 238μl混合液とよく混合した後、室温で15分間放置した。次いで、再びDMEM 2mlを加えた後、最終混合物を若い繊維芽細胞に処理して37℃で3時間培養した。3時間後、20%のFBSを含むDMEM 2.5mlを加えて、24時間培養した。30時間が経過した後、100μg/mlのEGFで形質転換された細胞を刺激した。最終的に、前記実施例Vと同様にウェスタンブロッティングを実施してErk-1/2の活性化を調査した。図１８で、Aパネルの1番レーンはpcDNA 3のみで形質転換したものであり、2番レーンはカベオリン−1 cDNAが挿入されたpcDNA 3で形質転換したものである。図１８から確認できるように、カベオリン−1 cDNAが挿入されたpcDNA 3で形質転換された細胞はカベオリンが発現されていることが分かる。図１８でBパネルの1〜3番レーンはpcDNA 3で形質転換された細胞にEGFを各々0分、5分及び20分間処理したものであり、4〜6番レーンはカベオリン-1 cDNAが挿入されたpcDNA 3で形質転換された細胞にEGFを各々0分、5分及び20分間処理したものである。
【０１０５】
図１８から分かるように、カベオリン-1が過発現される細胞ではErk-1/2キナーゼの細胞内発現は変化がないが、モック(mock)で形質転換された細胞に比べてそのリン酸化が大いに抑制されたことが分かる。
【０１０６】
従って、カベオリン-1のDNAで細胞を形質転換させる場合には、EGFによるErk-1/2キナーゼの活性化が遮断されて、外部刺激に対しての反応性が減少され細胞が老化状態に誘導されることが分かる。このような結果は、老化細胞でEGFによるErk-1/2キナーゼの活性化が低下されることはカベオリン-1タンパク質の発現増加によるものであることを示す。
【０１０７】
実施例 XVII ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染 XVII-1 ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
カベオリン-1タンパク質の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相互作用するカベオリン-1 ｍRNAの適合な部位を選択した。次いで、カベオリン-1 ｍRNAの翻訳開始部位に結合して翻訳開始を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。合成されたオリゴヌクレオチドはその5’-末端にフルオレセイン(Genotech)が接合されていて、安定性を増加させるためにホスホロチオエート(phosphorothioate)で変形されたものである。例えば、合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは次のヌクレオチド配列を有する：5’-tttgcccccaga-3’。前記部位に結合するセンスオリゴヌクレオチドも合成した： 5’-atgtctgggggc-3’。
【０１０８】
XVII-2 ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染
老化されたヒト繊維芽細胞(PDL 64)をFBSのないDMEMを含む24ウェル−プレートまたは皿に敷いて、細胞培養機(37℃, 5% CO2)で12時間培養した。次いで、100 uM合成アンチセンスオリゴヌクレオチド1〜5μl及びプラス試薬(Gibco-BRL)を500μl DMEMと混合して室温で15分間反応させた後、結果混合物を12μl Lipofectamin(Gibco-BRL)とDMEMの混合液500μlによく混合して、室温で15分間定置させてリポソーム複合体を形成させた。その後、細胞をDMEM(血清なし)で2回洗浄した後、前記リポソーム複合体1mlを処理して、37℃で3時間反応させた。形質感染された細胞に、10% FBSを含有するDMEM 1〜5mlを添加して、24時間培養した後、培地を10% FBSを含有するDMEMに交替した。次いで、一定時間培養した後、免疫染色及びウェスタンブロッティングを次のように実施した。
【０１０９】
XVII-3 ：免疫染色
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞を4%パラホルムアルデヒド0.5mlで20分間室温で固定させた後、PBS内0.5%トリトンX−100 0.5mlで10分間処理し透過化させて、2% BSA(in PBS)でブロッキングした。次いで、細胞に抗−カベオリン−1抗体(Transduction Laboratory)を4℃で一晩中処理した後、ロダミン−接合2次抗体(Santa Gruz)で室温で1時間処理した。核を可視化するために、DAPI(Molecular Probe)を添加した。観察は共焦点顕微鏡(Biorad, #MRC1024)を利用して実施した。図１９から分かるように、細胞内でのカベオリン−1の発現はアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞で処理時間が経過するにつれて大いに減少したが、センスオリゴヌクレオチドで処理された細胞では変化がなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は変形された細胞形態を示した：拡大されて広がる形状から小さなスピンドル形状に。反対に、センスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は前記した細胞形態変化を示さなかった。
【０１１０】
XVII-4 ：ウェスタンブロッティング
オリゴヌクレオチドを処理した細胞に対して実施例XIIと同様にウェスタンブロッティングを実施した。アンチセンスオリゴヌクレオチドが処理された細胞はカベオリン−1に該当する弱いバンドを示し、これはアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞でカベオリン−1の発現が減少されることを示すものである。
【０１１１】
前記の免疫染色及びウェスタンブロッティングの結果から、カベオリン−1が細胞老化に直接的な関連があり、カベオリン−1の発現を減少させる場合には細胞老化を防止することができるだけではなく老化細胞を若い細胞に転換させることもできるということが分かる。
【０１１２】
実施例 XVIII ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染による Erk-1/2 活性の分析
前記実施例XVIIと同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドを老化繊維芽細胞及び若い繊維芽細胞に処理した。EGF刺激及びウェスタンブロッティングを実施例XIと同様に実施した。図２０は本実施例の結果を示す。図２０から分かるように、若い細胞でErk-1/2キナーゼは強くリン酸化(活性化)された。しかし、非処理された老化細胞及びセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は若い細胞に比べてさらに高い基本的Erk-1/2活性を示し、EGFで刺激した場合、Erk-1/2活性は変化がなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞で、EGFによるErk-1/2活性化は若い細胞と同様に大いに増加した。
【０１１３】
前記実験結果から老化細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを処理してカベオリン-1の発現を抑制するとErkにより仲裁される信号伝達を若い細胞と類似に正常的に回復させることができるということが分かる。
【０１１４】
実施例 XIX ：カベオリン -1 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染による p-Erk-1/2 の核への転位観察
前記実施例XVIIIで活性化されたErk-1/2が核内に転位されて他の遺伝子の発現を調節するのかどうかを確認するために、次のように免疫染色を実施した：実施例XIIIと同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドで若い繊維芽細胞及び老化繊維芽細胞を処理した。処理された細胞を抗-p-Erk(リン酸化されたErk)抗体(New England Biotech)で4℃で一晩中処理した後、FITC-接合2次抗体(Santa Cruz)で室温で1時間処理した。核を可視化するために、DAPI(Molecular Probe)を添加した。p-Erk-1/2局部化像は共焦点顕微鏡(Biorad, #MRC1024)を利用して可視化し、これは図２１及び図２２に示した。図２１及び図２２で、矢印はp-Erk-1/2キナーゼが核へ転位されたことを示す。
【０１１５】
図２１から分かるように、若い細胞で、p-Erk-1/2は処理後5分辺りに細胞質で強く観察されて、核内に転位されたp-Erk-1/2は処理後30分辺りに観察されて、処理後60分辺りにp-Erk-1/2はただ細胞質でのみ弱く観察された。 前記実験結果から、処理後5分内にErk-1/2が活性化(リン酸化)されて、30分辺りにp-Erk-1/2は核内に転位され幾遺伝子の転写を調節し、60分辺りに非活性化されることが分かる。若い細胞とは違って、老化細胞ではEGF処理とは無関係にp-Erk-1/2が細胞質で強く観察されて、これはウェスタンブロッティング分析で確認された。老化細胞では核内に転位されたp-Erk-1/2が観察されなかった。
【０１１６】
また、図２２から分かるように、センスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は核内でp-Erk-1/2が観察されなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞では観察された。
【０１１７】
前記実験結果は、Erk-仲介シグナル伝達の回復がアンチセンスオリゴヌクレオチドによるカベオリン-1の発現抑制により達成できることを示す。また、前記実験結果は、老化細胞で一般的に抑制されている核内への転位を回復するにカベオリン-1が関与できることを示す。
【０１１８】
実施例 XX ：カベオリン -1 遺伝子の CpG アイランドのメチル化
老化が進行されるにつれて、p16/Ink4aのプロモーターに位置したCpGアイランドのメチル化が減少され、これはp16/Ink4aの発現を増加させるということは公知されている(Jarrard DF., Cancer Res., 15;59(12):2957-2964(1999))。また、癌細胞でカベオリン-1も類似なメチル化傾向を有するということも解明されている(Cui J., Prostate, 15;46(3):249-256(2001))。従って、本発明者らはカベオリン-1の減少された発現が前記のメチル化によるものであるかを分析した。
【０１１９】
若いヒト繊維芽細胞(PDL 20)にDMSO内1uM脱メチル化剤5−アザ(aza)−デオキシシチジン(Sigma)を処理して、一定時間毎に培地を交替しながら同時に脱メチル化剤を添加して2〜3週間処理した。細胞老化の誘導は実施例IIIのようにSA β-gal染色で確認した。関連タンパク質の発現を調べるために、処理された細胞を日付別に収穫して前記実施例と同様にウェスタンブロッティングを実施した。ウェスタンブロッティングで、抗−p53抗体、抗−p16抗体、抗−カベオリン−1抗体及び抗−アクチン抗体はSanta Cruz Biotechnology社から入手したものである。
【０１２０】
SA β-gal染色の結果を示した図２３（ａ）から確認できるように、約２週間処理された若い細胞は老化細胞−類似形質を示した。ウェスタンブロッティングの結果を示した図２３（ｂ）から確認できるように、脱メチル化によりp16及びカベオリン−1の発現は増加してp53の発現は変化がなかった。p16の増加は細胞老化の初期段階で検出された反面、カベオリン−1の増加はp16より早い段階で検出された。前記実験結果は、老化細胞でのカベオリン−1の増加は細胞老化またはp16の増加により直接的に招来されるものではなくカベオリン−1遺伝子のプロモーター内CpGアイランドの脱メチル化により直接的に招来されるということを示す。
【０１２１】
結論的に、細胞老化はカベオリン−1遺伝子、特にCpGアイランドのメチル化により調節できることが分かる。
【０１２２】
以上、本発明の望ましい具現例を記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されると言える。
【０１２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】老化細胞での低下されたエンドサイトシスを示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２】若い細胞及び老化細胞での時間によるトランスフェリンの細胞内運搬を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図３】若い細胞及び老化細胞でのトランスフェリンに対してのパルス-チェーシング結果を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図４】H2O2またはヒドロキシウレアにより人為的に老化が誘導された細胞でのトランスフェリンの細胞内運搬程度を確認した共焦点顕微鏡写真である。
【図５】細胞老化に関連されたタンパク質の分析のためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図６】H2O2またはヒドロキシウレアにより人為的に老化が誘導された細胞で細胞老化に関連されたタンパク質の分析のためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図７】細胞老化に関連されたタンパク質をコードするmRNAを分析するためのノーザンブロッティング結果を示す写真である。
【図８】実施例VIIで利用されたヒトアンフィファイシン−1をコードするcDNAを含むベクターの遺伝子地図である。
【図９】実施例VIIで製作されたヒトアンフィファイシン−1をコードするcDNAを含む発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１０】微細注入された細胞でアンフィファイシン−1の発現を分析するための蛍光顕微鏡で観察された像を示す写真である。
【図１１】ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子を含む発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１２】ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子で処理された若い細胞の低下されたエンドサイトシス機能を確認する共焦点顕微鏡写真である。
【図１３】（ａ）若い細胞及び中間細胞でErk-1/2キナーゼの活性(リン酸化)を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
（ｂ）老化細胞でErk-1/2キナーゼの活性(リン酸化)を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１４】若い細胞、中間細胞及び老化細胞でカベオリンのサブタイプ、即ち、カベオリン−1、カベオリン−2及びカベオリン−3の発現を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１５】若い細胞及び老化細胞で表皮成長因子収容体(EGFR)及びカベオリン−1の相互作用を確認するための免疫沈澱の結果を示す写真である。
【図１６】若い細胞及び老化細胞でカベオレ構造を示す電子顕微鏡写真である。
【図１７】実施例XVで製作されたカベオリン−1 cDNAが挿入された発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１８】カベオリン−1 cDNAで形質転換された若い細胞に対してのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１９】カベオリン−1発現がアンチセンスオリゴヌクレオチドにより大いに減少されるということを証明する共焦点顕微鏡写真である。
【図２０】図２０はカベオリン−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染によるErk-1/2の活性を分析するためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図２１】若い細胞及び老化細胞で表皮成長因子(EGF)刺激によるErk-1/2の活性化及び局部化を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２２】カベオリン−1の下向調節、即ち、カベオリン−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染後、若い細胞及び老化細胞でEGF刺激によるErk-1/2の活性化及び局部化を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２３】（ａ）脱メチル化剤、5−アザ−デオキシシチジンで処理された若い細胞に対しての老化−関連β−ガラクトシダーゼ活性染色の結果を示す写真である。
（ｂ）脱メチル化剤、5−アザ−デオキシシチジンで処理された若い細胞に対してのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
Claims (28)
- 細胞老化に関連したタンパク質の量を決定する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン(amphiphysin)− 1タンパク質である老化細胞の検出方法。
- 前記細胞は哺乳動物由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記方法はウェスタンブロッティング法により実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 細胞老化に関連したタンパク質をコードするポリヌクレオチドの量を決定する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質である老化細胞の検出方法。
- 前記細胞は哺乳動物由来のものであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドはgDNA、cDNA及びmRNAからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 細胞老化に関連したタンパク質の有効量を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質である細胞老化調節用組成物。
- 細胞老化に関連したタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質である細胞老化調節用組成物。
- 細胞老化に関連したタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質である細胞老化調節用組成物。
- 前記細胞は哺乳動物由来のものであることを特徴とする請求項７乃至９のいずれか一つの項に記載の細胞老化調節用組成物。
- 前記ポリヌクレオチドはgDNAまたはcDNAであることを特徴とする請求項８に記載の細胞老化調節用組成物。
- 細胞老化に関連したタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは真核細胞用発現ベクターに含まれていることを特徴とする請求項８に記載の細胞老化調節用組成物。
- ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子の有効量を含む細胞老化調節用組成物。
- 前記ドミナントネガティブアンフィファイシン−1遺伝子は配列番号２として示すアミノ酸配列250乃至588からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１３に記載の細胞老化調節用組成物。
- 細胞老化に関連したタンパク質の有効量をヒト以外の哺乳動物に投与する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質である細胞老化調節方法。
- 細胞老化に関連したタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量をヒト以外の哺乳動物に投与する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質である細胞老化調節方法。
- 細胞老化に関連したタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量をヒト以外の哺乳動物に投与する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質である細胞老化調節方法。
- 前記ポリヌクレオチドはgDNAまたはcDNAであることを特徴とする請求項１６に記載の細胞老化調節方法。
- 細胞老化に関連したタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは真核細胞用発現ベクターに含まれていることを特徴とする請求項１６に記載の細胞老化調節方法。
- 次の段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法：
(a) 試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；
(b) 前記細胞からタンパク質を分離する段階；
(c) 細胞老化関連タンパク質であるアンフィファイシン−１タンパク質に対して特異性を有する抗体と前記分離されたタンパク質とを接触させる段階；及び
(d) 前記抗体に結合された前記分離されたタンパク質の量を決定する段階。 - 次の段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法：
(a) 試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；
(b) 前記細胞からRNAを分離する段階；
(c) 細胞老化関連タンパク質であるアンフィファイシン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドから誘導されたプローブと前記分離されたRNAとを接触させる段階；及び
(d) 細胞老化関連タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記分離されたRNAの量を決定する段階。 - 前記細胞は哺乳動物由来のものであることを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
- 細胞老化関連タンパク質であるアンフィファイシン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチド由来のプローブを含む老化細胞検出用キット。
- 前記細胞は哺乳動物由来のものであることを特徴とする請求項２３に記載のキット。
- 前記プローブは固体支持体上に固定化されたものであることを特徴とする請求項２３に記載のキット。
- 前記キットはプローブの存在を検出するに利用される標識(ラベル)を追加的に含むことを特徴とする請求項２３乃至２５のいずれか一つの項に記載のキット。
- 細胞老化関連タンパク質であるアンフィファイシン−１タンパク質を含む細胞老化同定用バイオマーカー(biomarker)。
- 細胞老化関連タンパク質であるアンフィファイシン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞老化同定用バイオマーカー。
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