KR100460190B1

KR100460190B1 - 암피파이신을 이용한 노화 세포의 검출방법, 노화 세포의기능성 회복용 조성물 및 노화 세포의 기능 회복 방법

Info

Publication number: KR100460190B1
Application number: KR10-2000-0053341A
Authority: KR
Inventors: 박상철; 박정수; 박웅양
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2004-12-04
Also published as: KR20020020295A

Abstract

본 발명은 포유동물의 노화된 세포의 검출방법, 노화된 세포의 기능성 회복용 조성물 및 노화 세포의 기능 회복 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암피파이신 1 단백질 및 유전자를 이용한 노화 세포의 검출방법, 노화 세포의 기능성 회복용 조성물 및 노화 세포의 기능 회복 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 노화 세포의 검출방법은 노화 세포를 보다 정확히 확인할 수 있고, 본 발명의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물은 노화 세포의 기능 감소에 관련된 물질을 직접적으로 이용하므로, 노화 세포의 기능성 회복을 효과적으로 할 수 있다.

Description

암피파이신을 이용한 노화 세포의 검출방법, 노화 세포의 기능성 회복용 조성물 및 노화 세포의 기능 회복 방법{A Method for Detecting Senescent Cell, a Compostion for Restoring a Physiological Function of Senescent Cell and a Method for Restoring a Physiological Function of Senescent Cell Using Amphiphysin}

본 발명은 포유동물의 노화된 세포의 검출방법, 노화된 세포의 기능성 회복용 조성물 및 노화 세포의 기능 회복 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암피파이신 1 단백질 및 유전자를 이용한 노화 세포의 검출방법, 노화 세포의 기능성 회복용 조성물 및 노화 세포의 기능 회복 방법에 관한 것이다.

노화의 기전 및 원인에 대한 많은 가설들이 1950년대 이래 꾸준히 발표되어 왔고, 현재 여러 관점에서 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이러한 노화에 대한 가설은 다음과 같이 크게 두 부류로 나눌 수 있다:

첫 번째 가설은 노화의 손상 축적설(Damage accumulation theory of aging)이라 호칭되는 것으로서, 노화를 손상의 축적에 의해 유도되는 현상으로 해석한다.

상기 가설을 상설하면, 개체가 살아가면서 지속적으로 노출되는 여러 환경적 위해 요소 및 유리 산소(oxygen radical)와 같은 자체의 대사과정에서 생성되는 위해 산물에 의해 세포가 손상되고, 이러한 손상의 대부분은 생체 내 손상 수복기전에 의해 수복된다. 그러나, 생체내 수복기능을 능가하여 수복되지 못한 손상은 지속적으로 축적되어 세포막의 지질이나 여러 단백질 등에 변성을 발생시켜 그 기능을 저하시키고, 직접 또는 간접적으로 DNA에 손상을 입히기도 하며, 미토콘드리아에도 영향을 미쳐 그 기능을 저하시키게 된다. 상기 가설은 유리 산소 이론(free radical theory of aging: Harman D,Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7124-7128(1981)), 교결합 이론(crosslinking theory of aging: Bjorksten J.,J. Am. Geriatr Soc., 16, 408-423(1968)), 미토콘드리아 이론(mitochondrial theory of aging: Lee CM et al.,Free Radic. Biol. Med., 22, 1259-1269(1997); Wallace DC et al.,Biofactors, 7, 187-190(1998)) 등 여러 이론으로 설명되고 있다.

노화에 대한 두 번째 가설은 노화 예정설(Genetic program theory of aging)이라 호칭되는 것으로서, 이 가설에 따르면 모든 개체의 유전자 내에 일종의 생물학적 시계(biological clock)가 내재되어 있고, 그 유전적 프로그램에 따라 개체의 발달 및 성장과 함께 노화가 일어난다.

상기 가설을 상설하면, 노화를 일으키는 특정 노화 유전자가 존재하고, 그 유전자의 발현을 통해 노화 과정이 진행되며, 이는 출생 당시부터 이미 유전자 내에 프로그램 되어 있다는 것이다. 대표적인 노화 예정설로는 틸로미어 가설(Telomere hypothesis of aging)이 있다. 틸로미어 가설은 세포가 분열하면서 틸로미어의 길이가 계속 짧아지게 되고, 일정 길이 이상으로 그 길이가 짧아지게 되면 노화에 이르게 된다는 것으로, 현재까지 가장 유력하게 받아들여지고 있는 노화의 가설 중 하나이다 (Harley CB et al.,Curr. Opin. Genet. Dev., 5, 249-255(1995)).

상술한 바와 같이 노화에 대하여 여러 가지의 가설이 제시되어 있으나, 아직까지 노화의 모든 면을 완전하게 설명해 줄 수 있는 가설은 없다. 이는, 노화 자체가 워낙 여러 생리적 변화를 수반하여 나타나는 현상이기 때문이며, 현재는 두 가설 모두 상호 보완적으로 받아들여지고 있다.

한편, 개체의 노화를 이해하기 위해서는 세포 수준에서의 노화, 즉 세포 노화(cellular senescence)에 대한 연구를 통해 그 분자적 기전을 규명하는 것이 필요하다. 세포 노화에 대한 연구결과에 의하면, 노화 세포는 G1 세포기에 정지되어 더 이상 생리적 성장인자들에 의해 S 세포기로 진입하지 못한다. 노화된 세포가 나타내는 두 번째 특징은, 여러 기능의 저하로서, 최종 분화된 세포의 양상을 나타낸다(Goldstein,Science, 249:1129-1133(1990); Campisi J.,Cell, 84:497-500(1996)). 세 번째로 노화된 세포들은 아포프토시스성 세포 사멸(apoptotic-programmed-cell death)에 대해 저항성을 나타낸다(Wang E.,Cancer Res., 55:2284-2292(1995)).

세포 노화에 대한 많은 연구는, 개체의 노화 현상이 잘 반영되는 것으로 보고되고 있는(Campisi J.,Cell, 84:497-500(1996)), 사람 섬유아세포를 이용하여 이루어지고 있다.

엔도사이토시스는 세포의 여러 기능 수행에 있어 매우 중요한 기전으로서, 작은 소분자로부터 크게는 전체 세포에 이르기까지의 물질을 세포 내로 유입하는 과정을 말한다. 엔도사이토시스는 항원 표지(antigen presentation), 영양소의 섭취, 아포프토시스 세포의 제거, 병원체 침입, 수용체 조절, 고혈압, 시냅스 전달, 세포 신호전달 조절 등의 여러 중요한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 엔도사이토시스의 여러 기전 가운데, 세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스는 세포가 세포 외의 트랜스페린, LDL 등의 영양소, EGF와 같은 성장인자 등 여러 수용성 리간드 들을 세포 내로 받아들이고, 그 특정 수용체를 세포 내로 유입하여 그 기능을 조절하는 가장 대표적 기전이다(Pearse BM and Robinson MS,Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 6:151-171(1990); Schmid SL,Annu. Re. Biochem., 66:511-548(1997)).

세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스 과정 중 일부를 요약하면 다음과 같다: 수용체에 리간드가 와서 결합하면 수용체의 세포질쪽 말단부에 AP(assembly protein)2 단백질이 결합하게 된다. 이렇게 결합한 AP2 단백질은 세포질에 존재하던 클라트린 단백질을 세포막으로 이동시키고, 이렇게 형성된 클라트린 그물망에 다이나민(dynamin)이 와서 목을 형성, 클라트린 피복 소포의 버딩이 이루어지게 되고, 이렇게 버딩된 피복 소포로부터 클라트린과 AP2 단백질이 떨어져 나가게 되면수용체와 세포막은 다시 원 세포막으로 돌아가 재순환된다.

한편, 상기 다이나민이 클라트린 피복 소포의 목 부분에 와서 결합하는데는 암피파이신(amphiphysin)이라는 또 다른 단백질이 필요하다(Wigge P. and McMahon HT.,TINS, 21:339-344(1998)). 암피파이신의 여러 아형 중 하나인 암피파이신 1의 SH3 도메인과 다이나민의 프롤린-풍부 도메인이 서로 결합한다는 보고를 통해 암피파이신 1 단백질이 클라트린 매개성 엔도사이토시스에서 중요한 역할을 할 것이라는 가능성이 처음 제기 되었다(David C. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:331-335(1996)).

또한 암피파이신 1 단백질은 COS-7 세포에서도 발현되어 그 기능을 수행함이 보고되어 있고(Wigge P. et al.,Cell, 8:2003-2015(1997)), 이와 같은 결과들은 암피파이신이 뇌에서 뿐만 아니라 다른 장기의 좀 더 일반적인 클라트린 매개성 엔도사이토시스에 있어 실질적인 기능을 수행할 것임을 시사한다(Wigge P. and McMahon HT.,TINS, 21:339-344(1998)).

암피파이신의 다른 아형인 암피파이신 2 는 암피파이신 1 단백질과 유사하게 SH3 도메인을 가지고 있고, 다이나민과 결합하는 것이인 비트로에서 확인되었으며, 암피파이신 1과 세포 내 같은 위치에 존재하며 동시-면역침전됨이 확인되었다. 따라서, 암피파이신 1과 암피파이신 2는 세포 내에서 안정적인 헤테로다이머로 존재하고 있을 것으로 추측되며, 이러한 암피파이신 1-2 헤테로다이머는 다이나민을 클라트린 피복 소포로 불러들여서 피트의 함몰에 중요한 역할을 할 것으로 추측된다.

상술한 바와 같이 세포 노화 시에는 다양한 생리적 기능의 저하가 수반되는 것으로 보고되고 있으나 현재까지도 세포 노화에 대한 분자적 규명은 미진한 상태이고, 더욱이 노화된 세포를 정확히 확인할 수 있는 특정 표지에 대한 요구도 대두되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 세포 노화 시에 외부 반응에 대한 반응성이 현저히 저하된다는 공지의 보고에 착안하여, 세포막 수용체성 엔도사이토시스의 기능이 영향을 받을 것으로 추정하고 그 기능의 저하를 관찰하고, 엔도사이토시스에 관여하는 단백질 중 하나가 세포 노화에 대한 표지로서의 역할을 수행할 수 있으며, 엔도사이토시스의 기능을 수복하는 물질로서 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 포유동물의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물을 제공하는 데에 있다.

한편, 본 발명의 목적은 포유동물의 노화 세포의 기능 회복 방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물을 제공하는 데있다.

도 1은 젊은 세포 및 노화 세포에서의 트랜스페린의 세포 내 운반을 보여주는 콘포칼 현미경 사진,

도 2는 젊은 세포 및 노화 세포에서의 시간에 따른 트랜스페린의 세포내 운반을 보여주는 콘포칼 현미경 사진,

도 3은 젊은 세포 및 노화 세포에서의 트랜스페린에 대한 펄스-채이싱 결과를 보여주는 콘포칼 현미경 사진,

도 4는 인위적으로 노화가 유도된 세포에서의 트랜스페린의 세포내 운반 여부를 확인한 콘포칼 현미경 사진,

도 5는 암피파이신 1에 대한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 사진,

도 6은 암피파이신 1에 대한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 또 다른 사진,

도 7은 암피파이신 1의 mRNA에 대한 노던 블롯팅 결과를 나타내는 사진,

도 8은 암피파이신 1 유전자를 포함하는 pGEX-2T 벡터의 제한효소지도,

도 9는 암피파이신 1 유전자를 포함하는 pcDNA 3 벡터의 제한효소지도,

도 10은 암피파이신 1 유전자를 포함하는 pcDNA 3 벡터가 미세주입된 세포의 형광 현미경 사진,

도 11은 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자를 포함하는 pcDNA 3 벡터의 제한효소지도,

도 12는 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자에 의해 형질 전환된 세포에서의 트랜스페린의 세포내 운반 여부를 확인한 콘포칼 현미경 사진.

본 발명은 포유동물의 세포 내에 존재하는 암피파이신 1 단백질의 함량의 감소를 측정하여 실시되는 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 특징으로 한다.

본 발명은 포유동물의 세포 내에 존재하는 암피파이신 1 단백질의 mRNA의 함량의 감소를 측정하여 실시되는 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 다른 특징으로 한다.

본 발명은 포유동물 세포의 엔도사이토시스 기능을 확인하는 단계를 포함하는 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 다른 특징으로 한다.

본 발명은 암피파이신 1 유전자를 갖는 진핵세포용 발현벡터를 유효성분으로 하는 포유동물의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물을 또 다른 특징으로 한다.

본 발명은 암피파이신 1 유전자를 갖는 진핵세포용 발현벡터를 노화된 동물세포내로 도입하는 단계를 포함하는 포유동물의 노화 세포의 기능 회복 방법을 다른 특징으로 한다.

본 발명은 도미넌트 네가티브 (dominant negative) 암피파이신 1 유전자를 갖는 진핵세포용 발현벡터를 유효성분으로 하는 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물을 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다:

본 발명자들은 포유동물의 노화 세포에서 세포막 수용체성 엔도사이토시스의기능이 현저하게 감소되고, 이는 암피파이신 1 단백질의 세포 내 함량의 감소에 따른 것임을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 노화 세포의 검출방법은, 동물세포내 암피파이신 1 단백질 함량 감소의 측정을 통해 실시하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 웨스턴 블롯팅에 의해 실시된다.

상기 암피파이신 1 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯팅 방법은 종래 일반적으로 실시되는 방법을 이용할 수 있다(참조: Peter B. Kaufma et al.,Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 한편, 상기 웨스턴 블롯팅 방법은 바람직하게는 (ⅰ) 포유동물의 세포 시료를 용해하는 단계; (ⅱ) 용해된 세포로부터 단백질을 수득하는 단계; (ⅲ) 수득된 단백질을 SDS 및 2-머르캅토에탄올을 포함하는 용액으로 변성시키는 단계; (ⅳ) 변성된 단백질을 SDS-PAGE하는 단계; (ⅴ) SDS-PAGE가 완료된 겔 상의 변성 단백질을 NC 멤브레인으로 전이하는 단계; (ⅵ) NC 멤브레인상의 단백질과 1차 항체인 항 암피파이신 1 항체를 반응시키는 단계; (ⅶ) 발색반응을 촉매하는 효소가 결합된 1차 항체와의 결합능을 갖는 2차 항체를 상기 1차 항체와 반응시키는 단계; (ⅷ) 2차 항체에 결합된 효소의 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (ⅸ) 발색반응에 의해 전개된 발색의 정도를 측정하는 단계를 포함한다.

상기 발색반응을 촉매하는 효소는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀 등이 이용된다.

한편, 본 발명자들은 포유동물의 세포가 노화 단계로 진입하게 되면, 세포내 암피파이신 1 단백질의 양이 급격하게 감소된다는 것을 확인하였고, 이에 상기 본 발명의 방법은 정성적인 방법으로 실시할 수 있다. 예컨대, 노화 세포를 대상으로 한 상기한 웨스턴 블롯팅에 의해 최종적으로 형성되는 겔 상의 밴드는 그 세기 및 두께가 육안으로도 용이하게 감지할 수 있을 정도로 현저하게 감소하게 된다. 따라서, 웨스턴 블롯팅에 의한 겔 상의 밴드 중, 노화 상태를 검출하고자 하는 세포 시료의 밴드의 세기 및 두께를 대조군인 정상 세포의 밴드의 세기 및 두께와 육안으로 관찰ㆍ비교하여 노화 여부를 확인할 수 있다.

더불어, 상기한 본 발명의 방법은 정량적인 방법으로도 실시할 수 있으며, 이러한 방법에 의하는 경우에는 블롯팅을 실시한 다음, 발색된 밴드를 갖는 NC 멤브레인을 직접적으로 덴시토미터(densitometor)로 읽거나, 또는 발광 기질을 이용하는 경우(예: 루미놀)에는 필름으로 현상하여 그 필름을 덴시토미터로 읽어 그 차이를 정량화하여 노화 여부를 확인한다. 예컨대, 약 40 ㎍의 단백질을 분석하는 경우에는 젊은 세포와 비교하여 45배 이상 발현이 감소된 경우에는 세포가 노화된 것으로 구분할 수 있다.

본 발명자는 상술한 노화 세포에서의 암피파이신 1 단백질 함량의 감소가암피파이신 1mRNA의 감소에 따른 것임을 확인하였다. 따라서, 또 다른 본 발명의 노화 세포의 검출방법은 암피파이신 1 단백질에 대한 세포내 mRNA의 함량의 감소를 측정함으로써 실시하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는암피파이신 1mRNA의 함량 감소의 측정은 노던 블롯팅에 의해 실시한다.

상기 암피파이신 1 단백질의 mRNA를 검출하기 위한 노던 블롯팅은 종래 일반적으로 실시되는 방법을 이용할 수 있다(참조: Peter B. Kaufma et al.,Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press). 한편, 상기 노던 블롯팅 방법은 바람직하게는 (ⅰ) 포유동물의 세포 시료로 부터 RNA를 수득하는 단계; (ⅱ) 수득한 RNA를 전기영동하는 단계; (ⅲ) 전기영동이 완료된 겔 상의 RNA를 나일론 또는 NC 멤브레인으로 전이하는 단계; (ⅳ) 암피파이신 1 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드 탐짐자와 상기 전이된 mRNA의 혼성화 반응 단계; 및 (ⅴ) 혼성화 반응이 종결된 겔의 자동방사선 사진을 얻는 단계를 포함한다.

한편, 포유동물의 세포가 노화 단계로 진입하게 되면, 세포내암피파이신 1mRNA의 양이 급격하게 감소되므로, 상기 본 발명의 방법은 정성적인 방법으로 실시할 수 있다. 예컨대, 노화 세포를 대상으로 한 상기한 노던 블롯팅에 의해 최종적으로 형성되는 겔 상의 밴드는 그 세기 및 두께가 육안으로도 용이하게 감지할 수 있을 정도로 현저하게 감소하게 된다. 따라서, 노던 블롯팅에 의한 겔상의 밴드 중, 노화 상태를 검출하고자 하는 세포 시료의 밴드의 세기 및 두께를 대조군인 정상 세포의 밴드의 세기 및 두께와 육안으로 관찰ㆍ비교하여 노화 여부를 확인할 수있다.

더불어, 상기한 본 발명의 방법은 정량적인 방법으로도 실시할 수 있으며, 이러한 방법에 의하는 경우에는 최종적으로 얻은 자동방사선 사진에서의 밴드를 덴시토미터로 읽어 그 차이를 정량화하여 노화 여부를 확인한다. 예컨대, 50 ㎍의 RNA를 분석하는 경우에는, 젊은 세포와 비교하여 15배 이상 밴드의 세기가 감소된 경우에는 세포가 노화된 것으로 구분할 수 있다.

본 발명의 노화세포의 검출방법 가운데, 엔도사이토시스의 기능을 직접 확인하는 방법은 엔도사이토시스에 의해 세포내로 운반되는 수용체 (예: 트랜스페린, MHC, 트랜스코발부민 Ⅱ, EGF, 면역 복합체 등) 또는 수용체에 결합되는 리간드가 세포내로 운반되는 정도를 확인함으로써 이루어진다.

예컨대, 트랜스페린에 형광물질을 표지하고, 형광물질 표지된 트랜스페린이 세포내로 운반되는 지 여부를 형광현미경 등으로 관찰하여 엔도사이토시스가 이루어졌는지를 확인하게 된다.

본 발명의 노화된 세포의 기능성 회복용 조성물에 있어서, 진핵세포용 발현벡터에 삽입된 암피파이신 1 유전자는 바람직하게는, 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖고, 보다 바람직하게는, 서열 1에 기재된 염기 서열중 111번째 염기 서열부터 2195번째 염기 서열을 갖는다.

한편, 암피파이신 1 유전자를 동물 세포 내로 안전하게 운반하고, 이를 세포내에서 발현시키는 진핵세포용 발현벡터는 동물을 숙주로 하는 바이러스의 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 발현벡터는 현재 일반적으로 사용되고 있는 pcDNA 3(Invitrogen사; 시토메갈로 바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pSI(Promega사; SV 40 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pCI(Promega사; 시토메갈로 바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pREP7(Invitrogen사; RSV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날을 포함) 등이 있다.

본 발명의 포유동물의 노화된 세포의 기능 회복 방법에 있어서, 암피파이신 1 유전자를 포함하는 발현벡터의 동물세포 내로의 도입은 미세 주입법(참조: Capecchi, M.R.,Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 공동-침전법(참조: Graham, F.L. et al.,Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al.,EMBO J., 1:841(1982)) 및 양 이온성 리포좀 이용법(Wong, T.K. et al.,Gene, 10:87(1980)) 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물에서, 상기 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 단백질은 암피파이신 1 단백질의 기능을 차단하는 것으로서, 암피파이신 1에서 AP2 및 클라트린 결합자리에 해당하는 부위이다(Shupliakov, O. et al.,Science, 276:259(1997); Wigge P.,Curr. Biol., 7:554(1997)). 본 발명의 노화 유도용 조성물에서, 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자는 바람직하게는서열 2에 기재된 아미노산 서열중 250번째 서열부터 588번째 서열을 코딩하는 서열을 갖고, 보다 바람직하게는 서열 1에 기재된 염기서열중 858번째 서열부터 1874번째 서열을 갖는다.

한편, 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자을 세포내로 운반하는 데 사용되는 벡터 및 운반하는 방법은 상기 암피파이신 1 유전자에 기재된 내용과 동일하다.

상술한 바와 같이, 본 발명자는 세포의 노화 상태 여부는 엔도사이토시스의 기능을 조사함으로써 보다 정확하게 판단할 수 있음을 처음으로 확인했고, 암피파이신-1 단백질 및 이의 mRNA가 노화에 대한 생체내 바이오 마커로서 각별하게 이용될 수 있음을 처음으로 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 세포 배양

Ⅰ.표피 섬유아세포(foreskin fibroblasts)의 배양

표피 섬유아세포의 분리 및 배양은 Boyce와 Ham의 방법(Boyce ST. and Ham RG., J. Invest. Dermato., 81:33-40(1983))에 따라 다음과 같이 실시하였다: 먼저, 7세 된 남아로부터 표피를 얻고, 이를 얇게 벗겨내어 절편으로 한 다음, 표피 절편을 0.25%의 콜라겐나아제가 포함된 항크스 염 용액(Hank's salt solution: Gibco BRL사) 10 ㎖에 넣고, 90분동안 5% CO_2,37℃의 항온 배양기에서 배양시킨 후 상피와 진피를 서로 분리하였다.

이어, 분리해 낸 진피에 0.25%의 트립신 용액 1 ㎖을 첨가하고, 항생제인 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖과 페닐실린(Gibco BRL사) 100 유니트/㎖, 그리고 태아 소혈청(fetal bovine serum: FBS, Gibco BRL사)을 10% 넣은 DMEM 세포 배양배지(Dulbecco's modified Eagle medium: Sigma사) 10 ㎖에 넣은 다음, 37℃ 항온 배양기에서 10분동안 배양하였다.

상기 과정에 의해 얻은 표피 섬유아세포를 10 ㎖의 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후, 상기의 DMEM(10% FBS, 항생제 포함) 세포 배양 배지에서 계대 배양을 다음과 같이 계속하여 실시하였다: 항온 배양기는 5% CO₂농도 및 37℃를 항시 유지하도록 하였고, DMEM 배지는 매 3일 마다 교환하였으며, 세포 배양 접시 표면적의 80-90%가 채워졌을 때 1:4로 계대 배양을 실시하였다. 세포를 계대 배양할 때마다 1:4로 배양한 것을 두 번 군락 더블링(population doubling)한 것으로 하여 군락 더블링 수준(population doubling level: PDL)의 수를 2씩 증가시켜 기록하였다.

Ⅱ.폐 섬유아세포(fetal lung fibroblast)의 배양

폐 섬유아세포인 IMR-90 세포는 PDL이 25된 것을 상업적으로 구입하여 사용하였다(ATCC, #CCL186). 배양은 상기한 피부 섬유아세포와 동일한 방법으로 실시하였다.

실시예 2: 사람 섬유아세포의 인위적 노화 유도

Ⅰ.H ₂ O ₂ 에 의한 인위적 노화 유도

먼저, 상기 실시예 1에서 계대 배양된 PDL 16의 어린 피부 섬유아세포를 DMEM를 포함하는 세포 배양 접시에 깔고 세포 배양 항온기(37℃, 5% CO₂, humidified)에서 일주일간 유지하여 세포들이 G1 세포기에 정지되도록 하였다. 한편, G1 세포기에 정지되었는지 여부는 다음과 같이 확인하였다: 세포를 70% 빙냉 에탄올로 고정한 후, PI 염색 용액(PBS에 50 ㎍/㎖의 RNase A와 50 ㎍/㎖의 프로피듐 요오디드가 포함)으로 실온에서 30분간 진탕하며 세포를 염색하였다. 이를 FACS(Fluorescence-activated cell sorter)를 이용하여 DNA가 각각 2n 상태와 4n 상태에 어떤 비율로 나타나는지 확인함으로서 세포기를 확인하였다. G1 세포기의 경우 대부분의 DNA 염색양상이 2n 상태에 나타난다.

G1 세포기에 정지된 피부 섬유아세포에 H₂O₂를 400 μM 농도로 처리하고 3시간 동안 배양한 후 PBS 10 ㎖로 2회 세척하였다. 이어, 이를 1:4로 계대 배양한다음 정상적 세포배양 조건(37℃, 5% CO₂, humidified)에서 배양을 지속하였다.

H₂O₂를 처리한 후 7일 이후부터 세포 노화의 지표로 사용되고 있는 노화관련 β-갈락토시다아제(senescence associated β-galactosidase) 활성 염색을 하여 세포가 노화상태에 들어간 것을 확인하고 실험에 사용하였다. β-갈락토시다아제 활성 염색은 하기 실시예 3과 같이 실시하였다.

Ⅱ.히드록시우레아에 의한 인위적 노화 유도

우선, 상기 실시예 1에서 계대 배양된 PDL 16의 피부 섬유아세포를 DMEM를 포함하는 세포 배양 접시에 약 60% 차도록 깔고 14시간 동안 세포 배양기에서(37℃, 5% CO₂, humidified) 배양하였다. 이어, 히드록시우레아를 400 μM 농도로 처리하고 배양을 지속하였다. 배양 배지는 매 3일 마다 교환하였고, 배지를 교환할 때마다 히드록시우레아를 400 μM 농도로 새롭게 첨가해 주었다. 히드록시우레아를 처리한 후 14일 후부터 노화관련 β-갈락토시다아제 활성 염색을 하기실시예 3과 같이 실시하여 노화상태에 진입했는지 여부를 확인하고 실험에 사용하였다.

실시예 3: 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성 염색

본 발명에서 이용되는 세포의 노화 여부는 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성 염색을 실시하여 확인하였고, 상기 염색은 Dimri 등의 방법(Dimri GP. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 92:9363-9367(1995))에 따라 다음과 같이 수행하였다:우선, 세포를 PBS 10 ㎖로 2번 세척한 후, 2% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS 10 ㎖로 다시 한번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액(1 ㎎/㎖의 X-Gal, 40 mM 시트르산/소듐 포스페이트(pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM NaCl 및 2 mM MgCl₂) 5 ㎖을 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 동안 반응시켰다.반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양 접시를 싸서 배양하였다. 최종적으로, 위상차 현미경으로 발색 정도를 확인하였다.

사람 표피 섬유아세포의 경우에는 PDL 50, IMR 90의 경우에는 PDL 65부터 β-갈락토시다아제 활성이 나타났고, 상기 실시예 2에서 H₂O₂로 처리한 경우에는 처리 후 10일 이후부터, 히드록시우레아로 처리한 경우에는 처리 후 14-20일 이후부터 β-갈락토시다아제 활성이 나타나 세포가 노화로 진입했음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 엔도사이토시스의 기능 확인

Ⅰ.노화 세포에서의 엔도사이토시스의 기능 저하 관찰

노화 세포에서 세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스의 기능에 변화가 있는지를 확인하기 위하여 트랜스페린의 운반 여부를 다음과 같이 관찰하였다: 우선, 세포를 커버 글라스 위에 깐 후, 세포 배양기(37℃, 5% CO₂, humidified)에서 배양한 뒤, 테트라메틸로다민-접합 트랜스페린(Molecular Probe사)을 25 ㎍/㎖ 농도로5분간 처리하였다. 이어, 빙냉 PBS 10 ㎖로 세척한 뒤, PBS내 4% 파라포름알데히드(pH 7.4) 10 ㎖로 실온에서 10분간 고정하였다. 최종적으로, 트랜스페린의 운반 정도는 콘포칼 현미경(Biorad사, #MRC1024)을 이용하여 여기 파장 568 ㎚에서 관찰하였고, 그 결과는 첨부한 도 1에서 확인할 수 있다.

도 1에서, A는 PDL이 각각 20 및 54인 표피 섬유아세포의 젊은 세포, 노화 세포이고, B는 PDL이 각각 32 및 68인 IMR-90 세포이다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 젊은 섬유아세포 및 젊은 IMR-90 세포의 경우는 트랜스페린이 세포 내로 운반되어 핵 주위에 모여있는 양상을 나타내었는데, 이는 세포 내 운반 시에 나타나는 전형적인 모양으로 보고된 바 있다. 이와는 반대로, 노화 세포에서는 이러한 양상을 관찰할 수 없었다.

Ⅱ.시간에 따른 트랜스페린 운반의 관찰

표피 섬유아세포에 대한 상기 테트라메틸로다민-접합 트랜스페린 25 ㎍/㎖의 처리 시간을 10, 20, 40 및 60분으로 연장하여 상기 실시예와 동일하게 실험을 수행하였고, 그 실험 결과는 첨부한 도 2와 같다. 도 2에서 Y, M 및 O는 PDL이 각각 24, 38 및 54인 젊은 세포, 중간 세포 및 노화 세포를 나타낸다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, PDL 24 및 38의 젊은 세포들에서는 트랜스페린 운반이 효과적으로 발생하여 10분부터 세포내의 핵 주변에 그 형광상이 나타났고, 시간이 경과함에 따라 지속적으로 운반된 트랜스페린이 축적되어 더 많은 형광이 관찰되었다. 이에 반해 노화 세포에서는 60분 동안 배양한 후에도 세포 내로 운반된 형광이 나타나지않았다.

Ⅲ.트랜스페린 운반의 펄스-체이싱

IMR 90 폐 섬유아세포에 5분 동안 25 ㎍/㎖ 농도로 로다민-접합 트랜스페린을 처리하고 난 다음, PBS로 세척하고 로다민-접합 트랜스페린이 결여딘 정상 배지를 넣고 5분, 10분 및 20분간 체이스싱하여 배양을 계속하였다. 그런 다음, 상기한 바와 같이 고정하고, 트랜스페린의 운반 정도를 콘포칼 현미경을 이용하여 관찰하였고, 그 결과는 첨부 도 3이다. 도 3에서, Y, M 및 O는 PDL이 각각 26, 48 및 72인 젊은 세포, 중간 세포 및 노화 세포를 나타낸다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 젊은 세포의 경우에는 5분만에 트랜스페린을 세포내 골지세망계 부위에 위치시켜 5분 펄스 후 고정시켰을때 이미 그 형광이 핵 주변에서 관찰되었고, 10분 경과후에는 세포내에서 처리되어 그 형광상이 확산되어 나타났다. 이에 반해 PDL 48의 IMR 90 세포의 경우에는, 트랜스페린 운반이 지연되어 10분이 되었을 때 세포내 골지세망계 부위에 형광상이 약하게 나타나고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 운반은 시간이 지연되어 나타날 뿐 아니라, 그 양 또한 젊은 세포에 비해 매우 적은 양으로 관찰되었다. 한편, PDL 72 세포에서는 시간이 경과하여도 트랜스페린의 운반 자체가 이루어지지 않았다.

Ⅳ.인위적 유도된 노화 세포에서의 엔도사이토시스의 기능 확인

상기 실시예 2에서 인위적으로 노화가 유도된 세포에 상기와 같이 25 ㎍/㎖의 테트라메틸로다민-접합 트랜스페린를 처리하여, 엔도사이토시스의 기능을 확인하였고, 그 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 계대 배양을 통한 자연적 노화에서 뿐 아니라 H₂O₂나 히드록시우레아를 처리하여 얻은 인위적 노화 세포에서도 세포막 수용체성 엔도사이토시스 기능이 저하되어 있음을 확인할 수 있었다.

본 실시예를 통해 사람 섬유아세포가 노화되면 세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스 기능이 저하되어 트랜스페린과 같은 리간드를 세포 내로 유입하지 못한다는 사실을 확인하였다.

실시예 5: 세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스에 관여하는 단백질 발현 분석

상기 실시예 4에서 확인된 노화 세포에서의 엔도사이토시스의 기능 저하를 분자적 차원에서 규명하기 위하여 수용체 매개성 엔도사이토시스에 관여하는 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 실험을 통해 다음과 같이 확인하였다:

PDL이 서로 상이한 섬유아세포를 세포 용해 완충액(1% 트리톤 X-100, 0.5% NP-40, 50 mM 트리스(pH7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO₄, 1 mM NaF 및 1 mM PMSF)을 이용하여 용해하고, 이를 4℃에서 14000×g로 10분 동안 원심분리한 다음, 그 상층액을 취하였다. 이렇게 얻은 세포 추출액을 브래드포드법(Bradford, M.,Anal. Biochem. 72:248-254(1976))을 이용하여 단백질 정량한 다음, 동량(40 ㎍)의 단백질을 취하여 5X SDS 시료 완충액(60 mM Tris-Cl(pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머르캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)을 첨가하고 5분간 끓여 변성시켰다.

10-15 ㎍ 단백질을 포함하는 각 추출액을 전기영동 키트(Biorad사)를 이용하여 8% 폴리아크릴아미드 겔 위에서 전기영동을 하여 분리시키고, 분리된 단백질을 트랜스퍼 키트(Biorad사)를 이용하여 전기블롯팅 완충용액(20 mM Tris/150 mM 글리세린)내에서 겔로부터 NC 멤브레인(Protran사)으로 전이시켰다. 이 블롯을 5% 탈지분유(Difco사)를 포함하는 TTBS(Tris buffered saline with Tween 20)로 1시간 동안 블롯킹시킨 후 희석된 검출하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체와 1시간 동안 반응시켰다.

상기 1차 항체로 사용된 항체 가운데, 항다이나민 항체, 항α-아답틴 항체, 항β-아답틴 항체 및 항클라트린 중사슬 항체는 Transduction Laboratory사로부터 구입한 것이고, 마우스 단일클론 항암피파이신 1 항체는 충북대학교 의과대학, 김승렬 선생님으로부터 얻은 것이며, 항포스포티로신 항체와 항트랜스페린 수용체 항체는 Santa Cruz사로부터 구입한 것이다.

상기 과정에 의해 형성된 면역 복합체의 존재는 호스 래디쉬 페록시다아제가 연결된 토끼 항마우스 항체(Pierce사)와 페록시다아제의 기질을 포함하는 ECL(enhanced chemiluminiscence) 키트(Amersham사, #RPN2108)를 이용하여 확인하였고, 그 결과는 도 5과 같다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 트랜스페린 수용체(CD71), 클라트린 중사슬,α-아답틴, β-아답틴 및 다이나민의 발현은 세포 노화에 관계 없이 거의 변화가 없었다. 한편, 사람 표피 섬유아세포 및 IMR 90 세포 각각에서 노화가 되었을 때 암피파이신 1 단백질의 발현이 크게 감소되어 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 상기 웨스턴 블롯을 실시예 2에서 실시하였던 H₂O₂및 히드록시우레아로부터 유도된 노화세포에 대하여도 동일하게 실시한 경우, 계대 배양을 통해 자연적으로 발생된 노화세포와 동일한 실험결과를 얻을 수 있었다(참조: 도 6).

실시예 6: RNA 분리 및 노던 블롯 분석

상기 실시예 5에서 확인한 세포 노화시 암피파이신 1 단백질의 발현 감소가 단백질 자체의 안정성 감소로부터 야기된 것인지, 단백질을 발현하는 유전자의 전사단계에서 감소된 것인지를 확인하기 위하여 노던 블롯팅을 다음과 같이 실시하였다:

산 구아니디늄 티오시아네이드-페놀-클로로포름 이용방법(Chomczynski 및 Sacchi, 1987)에 따라 상기 실시예 1의 사람 표피 섬유아세포로부터 RNA를 분리하고, 포름알데히드 시료 완충액(5X MOPS, 포름알데히드 17.5%, 포름아미드 50%)과 혼합한 다음 전기영동 키트(Hoefer사)를 이용하여 1% 아가로스 겔에서 포름알데히드 겔 전기영동을 시행하였다.

전기영동이 종료된 다음, 나일론 멤브레인에 RNA를 전이시키고, 자동 UV 교호결합제(Stratagen사)를 이용하여 RNA를 멤브레인에 교호결합시켰다. 그 후,³²P방사선 표지된 탐침자(암피파이신 1 cDNA의 111~1116을 포함)와 혼성화 반응을 시킨 다음, 최종적으로 자동방사선 사진을 얻었고, 그 결과는 첨부 도 7과 같다.

도 7에서 Y는 PDL이 27, M은 PDL이 36 그리고 O는 PDL이 60인 표피 섬유 아세포이다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 노화가 진행됨에 따라암피파이신 1mRNA 양이 감소됨을 확인할 수 있었고, 결국 노화에 따른 암피파이신 1의 감소는 전사단계에서 그 조절이 이루어지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: 암피파이신 1 유전자의 클로닝

첨부한 서열 1을 갖는 암피파이신 1 유전자의 cDNA가 GST 퓨젼 단백질로 pGEX-2T 벡터(Pharmacia 사)의 BamHI과 EcoRI 위치에 클로닝 되어 있는 벡터를 충북대학교 의과대학으로부터 입수하였고, 그 제한효소 지도는 첨부한 도 8과 같다. 상기 벡터를 PCR 주형으로 하여 암피파이신 1 발현벡터를 클로닝하였다. PCR에서 사용될 프라이머는 제이 엘 과학(제노텍(주))에 의뢰하여 제작하였고, 그 서열은 전방향 프라이머인 경우에는 5'AACTGT CCACC ATG GCC GAC ATC AAG ACG GGC 3'이고; 및 역방향 프라이머인 경우에는 5' GGATCC CTA ATC TAA GCG TCG GGT 3'이다. 상기 전방향 프라이머 서열에서 AACTGT는 Hind Ⅲ 절단위치이고, CCACC는 코자크(kozak) 서열이며, ATG는 출발코돈으로 되는 부분이다. 상기 역방향 프라이머 서열에서 GGATCC는 Bam HI 절단 위치이고, CTA는 정지 코돈으로 되는 부분이다.

상기 프라이머를 이용하여 코자크 서열을 포함하는 암피파이신 1 유전자cDNA의 전장을 다음과 같이 PCR로 증폭하였다: PCR은 Pyrobest Taq 중합효소(Takara사)를 사용하여 수행하였다. 어닐링은 55℃에서 30초간 수행하였고, 연장반응은 72℃에서 1분 30초간 수행하였다. 변성은 92℃에서 30초간으로 하여 총 40 사이클을 수행하였다.

상기 PCR에 의해 증폭된 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 섬유아세포에 주입하기 위하여, 진핵세포 발현벡터인 pcDNA 3(Invitrogen사; 시토메갈로바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함) 벡터에 다음과 같이 서브 클로닝하였다: 우선, PCR 산물을 pT7 blue 벡터(Novagen 사)에 클로닝하여 염기 서열을 확인한 후, 이를 Hind Ⅲ와 Bam HI 제한효소로 처리하여 pcDNA3 벡터에 서브 클로닝하였다. 최종적으로 제조된 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 포함하는 pcDNA 3의 제한효소 지도는 도 9에 나타내었다.

실시예 8: 암피파이신 1 유전자에 의한 노화 세포의 세포막 수용체성 엔도 사이토시스의 회복

Ⅰ.암피파이신 1 유전자의 미세주입(microinjection)

우선, 실시예 1의 PDL이 58인 노화된 사람 표피 섬유아세포를 커버 글라스 위에 깔고 24시간 동안 FBS가 들어있지 않은 DMEM 배지로 세포 배양기(37℃, 5% CO2, humidified)에서 배양하였다.

이어, 상기 실시예 7에서 pcDNA 3 벡터에 클로닝된 암피파이신 1 유전자(10ng/㎖) 10^-14ℓ및 토끼 IgG (Sigma사, 5 ㎎/㎖) 10^-14ℓ를 노화 세포의 핵에 다음과 같이 미세 주입하였다: 미세주입을 위해 DNA를 미세주입 버퍼-A(50mM HEPES, pH7.2, 100mM KCl, 50mM NaPO4)에 10 ng/㎖로 희석하였다. 희석한 DNA를 유리 모세바늘에 넣고 마이크로인젝터(Transjector5246: Eppendorf사)와 마이크로매너퓰레이터5171(Eppendorf사)를 사용하여 세포 핵에 미세 주입하였다. 유리 모세바늘은 주사바늘 제조장치(KOPF vertical pipette puller model 720)로 제작하여 사용하였다.

Ⅱ.미세 주입된 세포에서의 암피파이신 1의 발현 확인

미세 주입된 세포에서 암피파이신 1의 발현 여부를 다음과 같이 중복 면역 형광 염색을 실시하여 확인하였다: 우선, 미세 주입후 24시간 동안 FBS가 없는 DMEM 배지에서 커버 글라스 위에 키운 세포를 3.7% 파라포름알데히드 용액(in PBS)으로 고정한 후, 1% BSA가 포함된 PBS로 실온에서 15분간 블록킹하였다. 그 후 1차 항체로서 충북대학교 의과대학으로부터 얻은 마우스 단일클론 항암피파이신 1 항체를 PBS로 100배 희석하여 세포에 가하였다. 이를 37℃에서 1시간동안 습윤 챔버에 넣어 방치한 후, PBS로 5분간 세 번씩 세척하였다. 그 후 2차 항체로 FITC(Fluorescein isothiocyanate)-접합 항마우스 IgG(Jackson Laboratory사)를 PBS로 100배 희석하여 빛을 차단하고 실온에서 습윤 챔버에 넣어 방치하였다. 이를 앞서와 마찬가지로 PBS로 5분씩 세 번 세척하였다. 또한, 상기 2차 항체 배양시 항토끼 IgG에 대한 항체에 로다민이 표지된 2차 항체(Jackson Laboratory사: 1:100 희석)를 함께 배양하여 중복 면역 형광 염색을 수행하였고, 그 상은 형광 현미경(Zeiss사,Axiovert25, CFL451210)으로 관찰하였으며, 결과는 도 10과 같다.

도 10에서 볼 수 있듯이, 토끼 IgG는 2차 항체에 결합되어 있는 로다민에 의해 적색 형광으로 확인할 수 있고, 암피파이신 1은 2차 항체에 결합되어 있는 FITC에 의해 녹색 형광으로 확인할 수 있다. 암피파이신 1의 존재를 나타내는 녹색 형광은 세포질에서 관찰되었다.

Ⅲ.세포막 수용체성 엔도사이토시스의 회복의 확인

미세 주입된 세포를 FBS가 들어있지 않은 DMEM 배지에서 세포 배양 항온기(37℃, 5% CO₂, humidified)에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 테트라메틸로다민-접합 트랜스페린을 125 ng/㎖ 농도로 30분동안 처리하고, 빙냉 PBS 10 ㎖로 세척한 다음, PBS내 4% 파라포름알데히드(pH 7.4) 10 ㎖로 실온에서 10분간 고정하였다.

그런 다음, 미세 주입된 세포를 확인하기 위하여 상기한 바와 같이, 형광표지 항체를 이용하여 형광 염색하였다. 그리고 나서, 형광 현미경(Zeiss사, Axiovert 100)으로 미세 주입된 세포의 확인 및 트랜스페린의 운반 여부를 관찰하였으며, 그 결과는 표 1과 같다:

미세주입 DNA	미세주입 세포 확인용 항체	비미세주입 세포	미세주입된 세포
		트랜스페린^*	총세포수	평균(%)	트랜스페린^*	총세포수	평균(%)
pcDNA 3	항토끼 IgG 항체	1	12	7.50	4	32	11.09
		1	15		3	31
암피파이신 1 유전자 + pcDNA 3	항토끼 IgG 항체	1	12	7.50	18	46	36.81
		1	15		10	29
	항암피파이신 1 항체	1	12	10.42	18	37	48.65
		2	16
^*형광 표지된 트랜스페린이 세포내에서 관찰된 세포수

상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, pcDNA 3 벡터가 모크(mock)로 미세 주입한 세포와 비교하여, 암피파이신 1 유전자가 포함된 pcDNA 3 벡터를 미세주입한 세포에서 트랜스페린의 세포 내 운반이 크게 증가됨을 알 수 있다.

실시예 9: 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 클로닝

암피파이신 1 단백질의 기능을 차단하는 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 (Shupliakov, O. et al.,Science, 276:259(1997); Wigge P.,Curr. Biol., 7:554(1997)) 유전자를 클로닝하기 위하여, 서열 1에 기재된 암피파이신 1 유전자를 주형으로 하여 250-588번째의 아미노산에 해당하는 cDNA만을 선택적으로 PCR을 수행하였다. PCR에서 사용될 프라이머는 제이 엘 과학(제노텍(주))에 의뢰하여 제작하였고, 그 서열은 전방향 프라이머인 경우에는 5'AACTGT CCACC ATG AGT GATTCG GGT CCT CTC CGC 3'이고; 및 역방향 프라이머인 경우에는 5' GGATCC CTA CTG CTC CGT AGC CAG CTC CGG 3'이다.

상기 프라이머를 이용하여 코자크 서열을 포함하는 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 상기 실시예 7과 동일하게 PCR로 증폭하였다.

상기 PCR에 의해 증폭된 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 섬유아세포에 주입하기 위하여, 진핵세포 발현벡터인 pcDNA 3(Invitrogen사) 벡터에 상기 실시예 7과 동일하게 서브 클로닝하였고, 최종적으로 제조된 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 포함하는 pcDNA 3의 제한효소 지도는 도 11과 같다.

실시예 10: 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자에 의한 젊은 세포의 세포막 수

용체성 엔도사이토시스의 기능 억제

상기 실시예 9에서 제작된 벡터를 이용하여 사람 섬유아세포의 젊은 세포 (PDL 16)에 다음과 같이 형질 전환을 실시하였다: 세포를 반지름 60 ㎜ 디쉬에 깔고 18시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 실시예 9에서 제조한 발현벡터 2 ㎍ 및 pEGFP-N1 벡터 (Clontech사) 0.5 ㎍을 DMEM과 플러스 시약 8 ㎕와 혼합한 후, 실온에서 15분 동안 방치하였다. 그런 다음, 리포펙타민 (Gibco-BRL사)과 DMEM 의 혼합물을 상기 DNA 시료와 잘 혼합한 다음, 실온에서 15분 동안 방치하였다. 그리고 나서, 다시 DMEM 배지 2 ㎖을 가하여 총 부피가 2.5 ㎖이 되도록 한 다음 상기 세포에 처리하고, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간 경과한 다음, 20%의 FBS를 함유하는 DMEM 2.5 ㎖을 가하고, 40시간 동안 배양하였다.

이어, 로다민-접합 트랜스페린을 25 ㎍/㎖의 농도로 10분 동안 처리한 다음, 콘포칼 현미경(Biorad사, #MRC1024)으로 관찰하여 EGFP의 형광 (녹색)이 관찰되는세포 (형질 전환이 발생된 세포)와 그렇지 않은 세포 (형질전환이 발생되지 않은 세포)에서의 트렌스페린의 운반 여부를 확인하였고, 그 결과는 도 12와 같다.

첨부 도 12에서 확인할 수 있듯이, 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 cDNA가 삽입된 벡터와 pEGFP-N1 벡터로 동시 형질 전환된 세포 (왼쪽 패널 사진)에서는 로다민-접합 트랜스페린의 적색 형광이 관찰되지 않았고, 즉 로다민-접합 트랜스페린의 세포내 운반이 발생되지 않았으며, 형질 전환되지 않은 세포 (오른쪽 패널 사진)에서는 로다민-접합 트랜스페린의 적색 형광이 관찰되었다.

즉, 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 발현에 의해 세포막 수용체성 엔도사이토시스의 기능이 억제되고, 이에 세포의 노화상태를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 포유동물의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물을 제공한다. 한편, 본 발명은 포유동물의 노화 세포의 기능 회복 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 포유동물의 노화 유도용 조성물을 제공한다. 본 발명의 노화 세포의 검출방법은 노화에 직접적으로 관련된 단백질 및 이의 mRNA를 이용함으로써 노화 세포를 보다 정확히 확인할 수 있고, 본 발명의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물은 노화 세포의 기능 감소에 관련된 물질을 직접적으로 이용하므로, 노화 세포의 기능성 회복을 효과적으로 할 수 있다.

<110> Metabolic Engineering Laboratories Co., LTD. <120> A Method for Detecting Senescent Cell, a Compostion for Restoring a Physiological Function of Senescent Cell, a Method for Restori ng a Physiological Function of Senescent Cell Using Amphyphisin <130> 00-0001 <160> 1 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 2377 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (111)..(2195) <400> 1 cggctctcag ctgcactcct gtacatccac ctgtcttcag gagagcactg tttgtgtgtg 60 cccagccccg ctgcgcgctc tgctcttcgc agctccccgg acccgcagcc atg gcc gac 119 Met Ala Asp 1 atc aag acg ggc atc ttc gcc aag aac atc cag aag cga ctc aac cgc 167 Ile Lys Thr Gly Ile Phe Ala Lys Asn Ile Gln Lys Arg Leu Asn Arg 5 10 15 gcg cag gaa aag gtc ctc caa aag ctg ggg aaa gct gat gag aca aaa 215 Ala Gln Glu Lys Val Leu Gln Lys Leu Gly Lys Ala Asp Glu Thr Lys 20 25 30 35 gac gaa cag ttc gaa gaa tat gtc cag aac ttc aaa cgg caa gaa gca 263 Asp Glu Gln Phe Glu Glu Tyr Val Gln Asn Phe Lys Arg Gln Glu Ala 40 45 50 gag ggt acc aga ctt cag cga gaa ctc cga gga tat tta gca gca atc 311 Glu Gly Thr Arg Leu Gln Arg Glu Leu Arg Gly Tyr Leu Ala Ala Ile 55 60 65 aaa ggc atg cag gag gcc tcc atg aag ctc aca gag tcg ctg cat gaa 359 Lys Gly Met Gln Glu Ala Ser Met Lys Leu Thr Glu Ser Leu His Glu 70 75 80 gtc tat gag cct gac tgg tat ggg cgg gaa gat gtg aaa atg gtt ggt 407 Val Tyr Glu Pro Asp Trp Tyr Gly Arg Glu Asp Val Lys Met Val Gly 85 90 95 gag aaa tgt gat gtg ctg tgg gaa gac ttc cat caa aaa ctc gtg gat 455 Glu Lys Cys Asp Val Leu Trp Glu Asp Phe His Gln Lys Leu Val Asp 100 105 110 115 ggg tcc ttg cta aca ctg gat acc tac ctg ggg caa ttt cct gac ata 503 Gly Ser Leu Leu Thr Leu Asp Thr Tyr Leu Gly Gln Phe Pro Asp Ile 120 125 130 aag aat cgc atc gcc aag cgc agc agg aag cta gtg gac tat gac agt 551 Lys Asn Arg Ile Ala Lys Arg Ser Arg Lys Leu Val Asp Tyr Asp Ser 135 140 145 gcc cgc cac cat ctg gaa gct ctg cag agc tcc aag agg aag gat gag 599 Ala Arg His His Leu Glu Ala Leu Gln Ser Ser Lys Arg Lys Asp Glu 150 155 160 agt cga atc tct aag gca gaa gaa gaa ttt cag aaa gca cag aaa gtg 647 Ser Arg Ile Ser Lys Ala Glu Glu Glu Phe Gln Lys Ala Gln Lys Val 165 170 175 ttt gaa gag ttt aac gtt gac tta caa gaa gag tta cca tca tta tgg 695 Phe Glu Glu Phe Asn Val Asp Leu Gln Glu Glu Leu Pro Ser Leu Trp 180 185 190 195 tca aga cga gtt gga ttt tat gtt aat act ttc aaa aac gtc tcc agc 743 Ser Arg Arg Val Gly Phe Tyr Val Asn Thr Phe Lys Asn Val Ser Ser 200 205 210 ctt gaa gcc aag ttt cat aag gaa att gcg gtg ctt tgc cac aaa ctg 791 Leu Glu Ala Lys Phe His Lys Glu Ile Ala Val Leu Cys His Lys Leu 215 220 225 tat gaa gtg atg aca aaa ctg ggt gac cag cac gcc gac aag gcc ttc 839 Tyr Glu Val Met Thr Lys Leu Gly Asp Gln His Ala Asp Lys Ala Phe 230 235 240 acc atc caa gga gcg ccc agt gat tcg ggt cct ctc cgc att gca aag 887 Thr Ile Gln Gly Ala Pro Ser Asp Ser Gly Pro Leu Arg Ile Ala Lys 245 250 255 aca cca tca ccg cct gag gag cct tca ccc ctc ccg agc ccg aca gca 935 Thr Pro Ser Pro Pro Glu Glu Pro Ser Pro Leu Pro Ser Pro Thr Ala 260 265 270 275 agt cca aat cat aca tta gca cct gcg tct ccc gca cca gca cgg cct 983 Ser Pro Asn His Thr Leu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Arg Pro 280 285 290 cgg tca cct tca cag aca agg aaa ggg cct cct gtc cca cct cta cct 1031 Arg Ser Pro Ser Gln Thr Arg Lys Gly Pro Pro Val Pro Pro Leu Pro 295 300 305 aaa gtc acc ccg aca aag gaa ctg cag cag gag aac atc atc agt ttc 1079 Lys Val Thr Pro Thr Lys Glu Leu Gln Gln Glu Asn Ile Ile Ser Phe 310 315 320 ttt gag gac aac ttt gtt cca gaa atc agt gtg aca aca cct tcc cag 1127 Phe Glu Asp Asn Phe Val Pro Glu Ile Ser Val Thr Thr Pro Ser Gln 325 330 335 aat gaa gtc cct gag gtg aag aaa gag gag act ttg ctg gat ctg gac 1175 Asn Glu Val Pro Glu Val Lys Lys Glu Glu Thr Leu Leu Asp Leu Asp 340 345 350 355 ttt gat cct ttc aag ccc gag gtg aca cct gca ggt tct gct gga gtg 1223 Phe Asp Pro Phe Lys Pro Glu Val Thr Pro Ala Gly Ser Ala Gly Val 360 365 370 acc cac tca ccc atg tct cag aca ttg ccc tgg gac cta tgg acg aca 1271 Thr His Ser Pro Met Ser Gln Thr Leu Pro Trp Asp Leu Trp Thr Thr 375 380 385 agc act gat ttg gta cag ccg gct tct ggt ggt tca ttt aat gga ttc 1319 Ser Thr Asp Leu Val Gln Pro Ala Ser Gly Gly Ser Phe Asn Gly Phe 390 395 400 aca cag ccc cag gat act tca tta ttc aca atg cag aca gac cag agt 1367 Thr Gln Pro Gln Asp Thr Ser Leu Phe Thr Met Gln Thr Asp Gln Ser 405 410 415 atg atc tgc aac ttg gct gaa tct gaa cag gct cca ccc aca gag cca 1415 Met Ile Cys Asn Leu Ala Glu Ser Glu Gln Ala Pro Pro Thr Glu Pro 420 425 430 435 aaa gca gag gag cct ctg gct gct gtc aca cct gcc gtt ggt ctg gac 1463 Lys Ala Glu Glu Pro Leu Ala Ala Val Thr Pro Ala Val Gly Leu Asp 440 445 450 ctt gga atg gac act cgg gct gag gag cca gtg gag gag gca gtg atc 1511 Leu Gly Met Asp Thr Arg Ala Glu Glu Pro Val Glu Glu Ala Val Ile 455 460 465 ata cct gga gct gat gct gat gca gct gtt gga acc ttg gtg tca gca 1559 Ile Pro Gly Ala Asp Ala Asp Ala Ala Val Gly Thr Leu Val Ser Ala 470 475 480 gct gag ggg gcc cca gga gag gaa gca gag gcg gag aag gcc act gtc 1607 Ala Glu Gly Ala Pro Gly Glu Glu Ala Glu Ala Glu Lys Ala Thr Val 485 490 495 cct gcc ggg gaa gga gta agt tta gag gag gcc aaa att gga act gaa 1655 Pro Ala Gly Glu Gly Val Ser Leu Glu Glu Ala Lys Ile Gly Thr Glu 500 505 510 515 acc act gag ggt gca gag agt gcc caa cct gaa gca gag gag ctc gaa 1703 Thr Thr Glu Gly Ala Glu Ser Ala Gln Pro Glu Ala Glu Glu Leu Glu 520 525 530 gca aca gtg cct cag gag aag gtc att cct tcg gtg gtc ata gag cct 1751 Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Val Ile Pro Ser Val Val Ile Glu Pro 535 540 545 gcc tcc aac cat gaa gag gaa gga gaa aac gaa ata act ata ggt gca 1799 Ala Ser Asn His Glu Glu Glu Gly Glu Asn Glu Ile Thr Ile Gly Ala 550 555 560 gag ccc aag gag acc acc gag gac gcg gct cct ccg ggc ccc acc agc 1847 Glu Pro Lys Glu Thr Thr Glu Asp Ala Ala Pro Pro Gly Pro Thr Ser 565 570 575 gag aca ccg gag ctg gct acg gag cag aag cct atc cag gac cct cag 1895 Glu Thr Pro Glu Leu Ala Thr Glu Gln Lys Pro Ile Gln Asp Pro Gln 580 585 590 595 ccc acg cct tct gca cca gcc atg ggg gct gct gac cag cta gca tct 1943 Pro Thr Pro Ser Ala Pro Ala Met Gly Ala Ala Asp Gln Leu Ala Ser 600 605 610 gca agg gag gcc tct cag gaa ttg cct cct ggc ttt ctc tac aag gtg 1991 Ala Arg Glu Ala Ser Gln Glu Leu Pro Pro Gly Phe Leu Tyr Lys Val 615 620 625 gaa aca ctg cat gat ttt gag gca gca aat tct gat gaa ctt acc tta 2039 Glu Thr Leu His Asp Phe Glu Ala Ala Asn Ser Asp Glu Leu Thr Leu 630 635 640 caa agg ggt gat gtg gtg ctg gtg gtc ccc tca gat tca gaa gct gat 2087 Gln Arg Gly Asp Val Val Leu Val Val Pro Ser Asp Ser Glu Ala Asp 645 650 655 cag gat gca ggc tgg ctg gtg gga gtg aag gaa tca gac tgg ctt cag 2135 Gln Asp Ala Gly Trp Leu Val Gly Val Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gln 660 665 670 675 tac aga gac ctt gcc acc tac aaa ggc ctc ttt cca gag aac ttc acc 2183 Tyr Arg Asp Leu Ala Thr Tyr Lys Gly Leu Phe Pro Glu Asn Phe Thr 680 685 690 cga cgc tta gat taggg caacaagtac tgcaagaagg agctcagtta cggggttttt 2240 Arg Arg Leu Asp 695 aaaccttcat gaaaacctga agagttcact tttgttatta tgctcttaat gatttacaga 2300 ctgatgccag acaaaccttg ggaagatgta tcaatggagc atgtgtgcaa 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Leu Trp Ser Arg Arg Val Gly Phe Tyr Val Asn Thr Phe Lys Asn 195 200 205 Val Ser Ser Leu Glu Ala Lys Phe His Lys Glu Ile Ala Val Leu Cys 210 215 220 His Lys Leu Tyr Glu Val Met Thr Lys Leu Gly Asp Gln His Ala Asp 225 230 235 240 Lys Ala Phe Thr Ile Gln Gly Ala Pro Ser Asp Ser Gly Pro Leu Arg 245 250 255 Ile Ala Lys Thr Pro Ser Pro Pro Glu Glu Pro Ser Pro Leu Pro Ser 260 265 270 Pro Thr Ala Ser Pro Asn His Thr Leu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro 275 280 285 Ala Arg Pro Arg Ser Pro Ser Gln Thr Arg Lys Gly Pro Pro Val Pro 290 295 300 Pro Leu Pro Lys Val Thr Pro Thr Lys Glu Leu Gln Gln Glu Asn Ile 305 310 315 320 Ile Ser Phe Phe Glu Asp Asn Phe Val Pro Glu Ile Ser Val Thr Thr 325 330 335 Pro Ser Gln Asn Glu Val Pro Glu Val Lys Lys Glu Glu Thr Leu Leu 340 345 350 Asp Leu Asp Phe Asp Pro Phe Lys Pro Glu Val Thr Pro Ala Gly Ser 355 360 365 Ala Gly Val Thr His Ser Pro Met Ser Gln Thr Leu Pro Trp Asp Leu 370 375 380 Trp Thr Thr Ser Thr Asp Leu Val Gln Pro Ala Ser Gly Gly Ser Phe 385 390 395 400 Asn Gly Phe Thr Gln Pro Gln Asp Thr Ser Leu Phe Thr Met Gln Thr 405 410 415 Asp Gln Ser Met Ile Cys Asn Leu Ala Glu Ser Glu Gln Ala Pro Pro 420 425 430 Thr Glu Pro Lys Ala Glu Glu Pro Leu Ala Ala Val Thr Pro Ala Val 435 440 445 Gly Leu Asp Leu Gly Met Asp Thr Arg Ala Glu Glu Pro Val Glu Glu 450 455 460 Ala Val Ile Ile Pro Gly Ala Asp Ala Asp Ala Ala Val Gly Thr Leu 465 470 475 480 Val Ser Ala Ala Glu Gly Ala Pro Gly Glu Glu Ala Glu Ala Glu Lys 485 490 495 Ala Thr Val Pro Ala Gly Glu Gly Val Ser Leu Glu Glu Ala Lys Ile 500 505 510 Gly Thr Glu Thr Thr Glu Gly Ala Glu Ser Ala Gln Pro Glu Ala Glu 515 520 525 Glu Leu Glu Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Val Ile Pro Ser Val Val 530 535 540 Ile Glu Pro Ala Ser Asn His Glu Glu Glu Gly Glu Asn Glu Ile Thr 545 550 555 560 Ile Gly Ala Glu Pro Lys Glu Thr Thr Glu Asp Ala Ala Pro Pro Gly 565 570 575 Pro Thr Ser Glu Thr Pro Glu Leu Ala Thr Glu Gln Lys Pro Ile Gln 580 585 590 Asp Pro Gln Pro Thr Pro Ser Ala Pro Ala Met Gly Ala Ala Asp Gln 595 600 605 Leu Ala Ser Ala Arg Glu Ala Ser Gln Glu Leu Pro Pro Gly Phe Leu 610 615 620 Tyr Lys Val Glu Thr Leu His Asp Phe Glu Ala Ala Asn Ser Asp Glu 625 630 635 640 Leu Thr Leu Gln Arg Gly Asp Val Val Leu Val Val Pro Ser Asp Ser 645 650 655 Glu Ala Asp Gln Asp Ala Gly Trp Leu Val Gly Val Lys Glu Ser Asp 660 665 670 Trp Leu Gln Tyr Arg Asp Leu Ala Thr Tyr Lys Gly Leu Phe Pro Glu 675 680 685 Asn Phe Thr Arg Arg Leu Asp 690 695

Claims

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도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자를 갖는 진핵세포용 발현벡터로서, 도 11의 유전자 지도를 가지는 발현벡터를 유효성분으로 하는 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자는 서열 2에 기재된 아미노산 서열중 250번째 서열부터 588번째 서열을 코딩하는 서열을 갖음을 특징으로 하는 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자는 서열 1에 기재된 염기서열중 858번째 서열부터 1874번째 서열을 갖음을 특징으로 하는 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물.
암피파이신 1 단백질을 포함하는 노화 세포의 확인용 표지.
암피파이신 1 단백질의 mRNA를 포함하는 노화 세포의 확인용 표지.
(ⅰ) 암피파이신 1 유전자; (ⅱ) 동물을 숙주로 하는 바이러스의 프로모터; 및 (ⅲ) 폴리아데닐화 시그널을 가지며, 도 9에 기재된 유전자 지도를 가지는 포유동물 노화 세포의 젊은 세포로의 전환용 발현벡터.
제 19 항에 있어서, 상기 암피파이신 1 유전자는 서열 2에 기재된 아미노산을 코딩하는 서열을 갖음을 특징으로 하는 포유동물 노화 세포의 젊은 세포로의 전환용 발현벡터.
제 20 항에 있어서, 상기 암피파이신 1 유전자는 서열 1에 기재된 염기서열을 갖음을 특징으로 하는 포유동물 노화 세포의 젊은 세포로의 전환용 발현벡터.
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