KR102249040B1

KR102249040B1 - 노화 억제 활성을 갖는 암피피신―ｉ 돌연변이체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102249040B1
Application number: KR1020190121807A
Authority: KR
Inventors: 김응국; 신은영
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-01
Filing date: 2019-10-01
Publication date: 2021-05-06
Also published as: KR102249040B9; KR20210039227A

Abstract

본 발명은 노화 억제 활성을 갖는 암피피신-I 돌연변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 암피피신-I(amphiphysin -I; AMPH-I)의 아미노산 서열에서 392번째 아미노산인 발린(V)이 글리신(G)으로 치환된 암피피신-I 돌연변이체, 상기 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 세포 노화 억제용 조성물, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 세포 노화 억제 방법 및 세포 노화 억제제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암피피신-I 돌연변이체는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의한 세포노화 촉진 및 세포이입의 감소를 모두 억제할 수 있고, βPIX 발현 억제에 의한 세포노화에서 단백질 분해효소인 칼페인에 의한 암피피신-I 단백질의 절단이 발생하지 않으며, 세포 노화 지표들의 발현을 억제할 수 있는 바, 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체는 노화 또는 노화 관련 질환의 새로운 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

노화 억제 활성을 갖는 암피피신―Ｉ 돌연변이체 및 이의 용도{Amphiphysin-I mutant having anti-senescence activity and use thereof}

본 발명은 노화 억제 활성을 갖는 암피피신-I(amphiphysin-I) 돌연변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.

세포 노화는 개체의 노화를 유발하는 주요 원인으로 DNA 손상, 텔로미어 침식, 세포 스트레스의 축적, 세포 복제 능력의 상실 등 수많은 요인에 의해 발생한다. 세포 노화를 규정하는 지표로서, 노화된 세포는 모양이 커지고 편평해지며, 핵에 이질염색질이 증가하고, 세포질에 공포가 많아지는 형태학적 특징과 함께, 미토콘드리아의 이상이 초래되며 SA-β-gal (senescence-associated β-galatosidase) 활성이 증가하고, p53, p16/INK4 (p16), p21과 같은 세포성장을 억제하는 단백질들의 양이 많아지며, 인슐린양성장인자 결합단백질 (insulin-like growth factor binding proteins; IGFBPs), 인터루킨-6 (interleukin-6), 전환성장인자-β (transforming growth factor-β;TGF-β), 인터페론 (interferon)과 같은 여러 가지 염증 단백질들을 분비하는 것으로 알려져 있다.

이러한 세포 노화는 단순히 개체나 조직의 노화에 기여할 뿐만 아니라, 여러 가지 다양한 질병의 병인에 중요한 역할을 한다. 노화세포는 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화 혈관조직 등과 같은 염증성 병변 조직에서 많이 관찰되며, 또한 전립샘 증식증과 간염, 간암 등에서도 세포노화 현상이 관찰된다.

노화세포가 축적되면 노화세포는 잘 분열하지 못하므로 손상된 조직이 적절히 복구되지 못할 뿐만 아니라, 주위 조직을 분해하는 효소나 염증성 사이토카인 등을 분비하므로 조직의 손상을 가속시키므로, 노화와 관련된 질병의 병인에 기여한다. 따라서 세포성 노화가 노화의 필수 원인 요소라 할 수 있기 때문에 세포성 노화를 지연시키는 연구가 진행되고 있고, 특히 세포노화를 조절할 수 있는 물질을 탐색하여, 이를 질병의 예방과 치료에 활용하고자 하는 연구가 진행되고 있다.

세포 노화 시, 세포는 외부 반응에 대한 반응성이 현저히 저하되며 세포막 수용체성 세포이입(endocytosis)의 기능이 감소된다고 알려져 있다. 이와 관련하여 젊은 세포와 노화된 세포를 대상으로 세포막 수용체 매개로 일어나는 트랜스페린의 이입(endocytosis) 여부의 분석을 통해 노화 세포에서는 세포막 수용체 매개로 일어나는 트랜스페린의 이입(endocytosis)이 젊은 세포에 비해 현저하게 감소된다는 연구가 보고된 바 있다.

또한, 세포막 수용체 매개성 세포이입은 클라트린 소포체(clathrin coated vesicle)를 경유하여 여러 단계의 과정을 거쳐 일어나며 이러한 과정에 clathrin, AP2, dynamin 및 amphiphysin-I 등이 관여한다고 알려져 있다.

한편, 암피피신(amphiphysin) 단백질은 세포막의 만곡을 생성함으로써 클라트린 매개 세포이입(clathrin-mediated endocytosis: CME) endocytic pit을 만드는 데 기여하며, dynamin 단백질은 GTPase 활성이 있는 G 단백질로 완숙된 endocytic pit의 목 부위를 절단함으로써 세포내 소포체(endocytic vesicle)를 만든다. 이러한 세포이입은 인테그린에 의해 유도되는 세포부착(focal adhesion, FA)의 해체에도 관여하기 때문에, 세포부착에 의해 조절되는 다양한 세포 기능, 즉 세포 성장, 분화 및 사멸에 중요한 역할을 한다.

또한 노화된 세포에서 암피피신-I(amphiphysin-I) 단백질의 발현이 감소되어 수용체에 의한 세포이입을 조절한다는 것이 보고되어 노화를 조절할 수 있는 분자로써 암피피신-I 단백질의 사용 가능성을 예견하고 있다. 그러나 암피피신-I(amphiphysin-I) 단백질과 노화의 관련성에 대한 구체적인 작용 기전에 대한 연구가 거의 없는 실정이다.

대한민국 등록특허 10-0460190

이에 본 발명자들은 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의해 세포 노화가 촉진되며 세포이입이 감소됨을 확인하였고, 이 과정에서 단백질 분해효소인 칼페인에 의해 암피피신-I(amphiphysin-I ; AMPH-I) 단백질의 절단 현상이 발생한다는 것을 확인하였다. 이에 칼페인에 의해 절단이 발생하지 않는 암피피신-I 돌연변이체(AMPH-V329G)를 노화가 일어나는 세포에 처리한 결과, 세포 노화 지표들의 발현이 억제되고 노화에 의해 감소되었던 세포이입도 다시 회복됨을 확인함에 따라, 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체를 세포 노화 억제제로 사용할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 암피피신-I(amphiphysin-I ; AMPH-I)의 아미노산 서열에서 392번째 아미노산인 발린(V)이 글리신(G)으로 치환된, 암피피신-I 돌연변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체 또는 이를 코딩하는 유전자가 포함된 발현벡터를 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 암피피신-I 단백질이 발현되는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질에 의해 서열번호 1의 암피피신-I 단백질에서 392번째 아미노산의 절단 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 암피피신-I(amphiphysin-I ; AMPH-I)의 아미노산 서열에서 392번째 아미노산인 발린(V)이 글리신(G)으로 치환된, 암피피신-I 돌연변이체를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암피피신-I 돌연변이체는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의한, 세포 노화를 억제하고 세포 이입(endocytosis)의 저해를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암피피신-I 돌연변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 392번째의 아미노산 부위가 단백질 분해효소인 칼페인(calpain)에 의해 절단되지 않는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 노화 또는 노화 관련 질환은 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제로 유발되는 질환일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암피피신-I 돌연변이체는, SA-β-갈락토시다아제 활성 억제; p16 단백질의 발현 억제; 트랜스페린(transferrin)의 세포이입 감소 억제; 및 인테그린 β1(integrin β1)의 세포이입 감소 억제 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체 또는 이를 코딩하는 유전자가 포함된 발현벡터를 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 암피피신-I 단백질이 발현되는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질에 의해 서열번호 1의 암피피신-I 단백질에서 392번째 아미노산의 절단 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 노화는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보물질이 서열번호 1로 표시되는 암피피신-I 단백질의 392번째 아미노산을 절단하지 않는 경우, 상기 후보물질은 세포 노화 억제제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 암피피신-I 돌연변이체는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의한 세포노화 촉진 및 세포이입의 감소를 모두 억제할 수 있고, βPIX 발현 억제에 의한 세포노화에서 단백질 분해효소인 칼페인에 의한 암피피신-I 단백질의 절단이 발생하지 않으며, 세포 노화 지표들의 발현을 억제할 수 있는 바, 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체는 노화 또는 노화 관련 질환의 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 노화에 따른 βPIX 의 발현수준 변화를 분석한 결과로서, 1A는 고3, 15, 24 개월령의 마우스로부터 수득한 조직(폐, 신장, 비장, 심장 및 피부)을 대상으로 βPIX의 발현수준을 면역블롯팅을 통해 확인한 결과이며, 1B는 각 마우스의 폐조직에 대하여 βPIX 및 p16의 발현 정도를 면역조직화학법으로 확인한 결과이며, 1C는 면역조직화학법 분석에 의한 βPIX 및 p16의 발현수준을 막대그래프로 나타낸 것이고, 1D 및 1E는 젊은 사람 및 고령의 사람으로부터 수득한 폐 조직에서 βPIX 및 p16의 발현 수준을 면역조직화학법으로 확인한 결과 및 각 발현수준을 막대그래프로 각각 나타낸 것이며, 1F는 계대배양을 달리한 HDF 세포를 대상으로 βPIX 및 p16의 발현 수준을 면역블롯팅으로 분석한 것이고, 1G는 SA-β-Gal 활성 어세이 분석 결과를 나타낸 것이며, 1H는 SA-β-Gal 염색을 통해 SA-β-Gal 양성 세포를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 βPIX 의 발현 억제에 따른 세포이입(endocytosis) 감소 효과를 확인한 결과로서, 2A는 βPIX에 대한 siRNA가 처리된 HDF 세포에 노코다졸(nocodazole)을 처리한 후, 활성형의 인테그린 β1 항체를 이용한 염색법을 통해 인테그린 β1의 세포이입 정도를 확인한 사진을 나타낸 것이고, 2B는 인테그린 β1의 세포이입 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이며, 2C는 βPIX에 대한 siRNA가 처리된 HDF 세포로부터 트랜스페린의 세포이입 정도를 형광현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이며, 2D는 트랜스페린의 세포이입 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이고, 2E는 βPIX에 대한 siRNA를 주입한 마우스의 폐 조직에서의 트랜스페린의 세포이입 정도를 공초점 현미경 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이며, 2F는 이를 정량적으로 측정한 결과를 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 노화에 의한 암피피신 1(AMPH1)의 발현 양상을 분석한 것으로, 3A는 βPIX siRNA를 HDF 세포에 처리하여 βPIX 억제에 따른 세포 노화를 유도한 후, 노화된 세포에서 AMPH1의 C말단이 절단된 절편의 유무를 면역블롯팅을 통해 확인한 것이고(AMPH-Fl:full length AMPH-I, AMPH-Cl: cleaved AMPH-I), 3B는 βPIX siRNA가 처리된 마우스의 폐 조직을 면역조직화학법으로 분석하여 βPIX 및 AMPH의 발현 정도를 관찰한 사진을 나타낸 것이고, 3C는 3B의 결과를 정량적으로 측정한 값을 막대그래프로 나타낸 것이며, 3D는 1 개월령의 젊은 마우스 및 24 개월령의 늙은 마우스의 폐에서 AMPH-I의 절단 현상 여부를 면역블롯팅 분석을 통해 확인한 것을 나타낸 것이고, 3E는 1 개월령의 젊은 마우스 및 22 개월령의 늙은 마우스의 폐에서 트랜스페린의 세포이입 정도를 공초점 현미경을 분석한 사진과 정량 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4A는 AMPH-I 단백질에서 칼페인(calpain)이 절단할 수 있을 것으로 예상되는 부위(S333, S377, V392)를 모식도로 나타낸 것이고, 4B는 AMPH-I의 S333, S377, V392 부위를 각각 돌연변이 시킨 돌연변이체(S333G, S377G, V392G)들의 칼페인(calpain)에 의한 절단 여부를 분석한 결과로서, 각 돌연변이체의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 293T 세포에 형질도입 후 293T 세포 용해물을 수득한 다음, AMPH-I의 항체를 이용하여 면역블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5A는 βPIX siRNA의 처리에 의해 βPIX의 발현이 억제된 HDF 세포(βPIX의 억제로 노화가 진행된 HDF 세포)에서 AMPH-WT 및 AMPH-V392G(칼페인에 의한 절단이 유발되지 않는 돌연변이체)에 대한 절단현상 여부를 면역블롯팅으로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 5B는 βPIX의 발현이 억제된 HDF 세포에 AMPH1-WT 및 AMPH-V392G을 처리한 후, 트랜스페린의 세포이입 정도를 공초점 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이며, 5C는 5B의 실험군에 대한 트랜스페린의 세포이입 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이고, 5D는 β1 인테그린의 세포이입 정도를, 5e는 노화지표인 SA-β-gal 양성 세포주를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 AMPH-V392G 돌연변이체의 세포 노화 억제 활성을 확인한 결과로서, 6A는 실험 스케줄에 대한 모식도를 나타낸 것이고, 6B는 βPIX siRNA 및 siCtrl(대조군)이 각각 도입된 마우스의 폐 조직을 대상으로 GFP, AMPH1-WT 및 AMPH1-V392G 돌연변이체를 각각 주입 후, 폐 조직에서의 트랜스페린의 세포이입 정도를 형광현미경으로 관찰한 것이고, 6C는 트랜스페린의 세포이입 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 6D는 βPIX siRNA 및 siCtrl(대조군)이 각각 도입된 마우스의 폐 조직을 대상으로 GFP, AMPH-WT 및 AMPH-V392G 돌연변이체를 각각 주입 후, 노화지표로 알려진 p16 발현과 SA-β-gal의 활성 양상을 면역조직염색법으로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 6E는 SA-β-gal 활성 및 p16와 βPIX의 발현 정도를 정량적으로 측정하여 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에서 암피피신-I-WT(야생형) 및 암피피신-I-V392G(돌연변이체)의 과발현을 위해 제조한 재조합 발현벡터인 pHR-CMV-SV-Puro-Amphiphysin I-WT 재조합 벡터 및 pHR-CMV-SV-Puro-Amphiphysin I-V392G 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

본 발명은 암피피신-I(Amphiphysin-I; AMPH-I) 단백질의 돌연변이체 (V392G)가 노화를 억제하는 활성이 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

본 발명자들은 신규한 노화 조절 기전을 연구하던 중, 노화된 세포에서 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현이 감소되어 있다는 것을 확인하였다. 또한, βPIX의 발현이 감소된 노화 세포에서는 젊은 세포와 비교하여 활성화된 인테그린 β1 및 트랜스페린의 세포 이입(endocytosis)이 감소된다는 것을 확인하였으며, 이는 세포 이입을 조절하는 암피피신-I(Amphiphysin-I) 단백질이 단백질분해효소인 칼페인에 의해 절단되는 현상에 의해 발생됨을 확인하였다.

먼저 본 발명의 일실시예에 따르면, 노화에 따른 βPIX의 발현수준 변화를 먼저 분석하였는데, 1 개월령의 젊은 마우스와 24 개월령의 늙은 마우스로부터 수득한 폐, 신장 및 피부 등의 조직에서 βPIX 단백질의 발현수준을 측정한 결과, 젊은 마우스 유래 조직에 비해 늙은 마우스 유래 조직들에서는 모두 βPIX의 발현 수준이 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났고(도 1A 참조), 이러한 결과는 인간섬유세포(HDF)에서도 동일하게 나타났다. 또한, 젊은 혹은 늙은 마우스와 사람의 폐조직에서 βPIX의 발현 감소와 노화의 지표인 p16의 발현 증가를 확인 하였다(도 1B-1E). 노화된 HDF 세포에서는 βPIX의 발현이 젊은 HDF 세포에 비해 현저하게 감소되어 있었고, 노화지표들로 알려진 p16의 발현 증가와 SA-β-gal (senescence-associated β-galatosidase)의 활성 증가도 관찰하였다(도 1F~1H). 그러므로 βPIX는 노화와 밀접한 상관성이 있으며, βPIX의 발현 또는 활성 저해가 노화의 주요원인이 될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는, 세포 노화와 세포 이입(endosytosis)과의 관련성을 분석하였는데, 노화된 세포에서는 인테그린 β1 및 트랜스페린(transferrin)의 세포 이입이 감소되는 것으로 나타났다(도 2 참조).

뿐만 아니라, βPIX의 발현억제에 의해 노화된 세포에서는 세포이입에 관여하는 것으로 알려진 암피피신-I 단백질이 절단되어 약 50 kDa의 절편이 확인되었고, 이러한 절단 현상은 βPIX의 발현이 억제되지 않은 세포, 즉 노화되지 않은 세포에서는 발생하는 않는 것으로 나타났으며, 어린 마우스 및 늙은 마우스의 폐 조직을 대상으로 수행한 실험에서도 동일한 결과를 보였다(도 3 참조).

또한, 노화된 세포 또는 조직에서의 세포이입 조절 단백질들의 절단 현상은 암피피신-I 단백질 특이적으로 발생하는 것으로 나타났는데, 이는 세포이입 조절 단백질로 알려진 dynamin 단백질의 경우, 세포 노화에 따른 단백질 절단현상이 발생하지 않음을 통해 알 수 있었다(도 3A 및 3D 참조). 이러한 결과를 통해 암피피신-I(Amphiphysin-I) 단백질의 절단, 구체적으로 C-말단의 절단은 세포 노화와 밀접한 관련성이 있다는 것을 알 수 있었다.

한편, 칼페인(Calpain)은 칼슘 의존성 시스테인 단백질 분해효소로서 암피피신-I(Amphiphysin-I) 단백질을 절단할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 노화된 세포에서 암피피신-I 단백질의 C-말단이 절단되는 현상을 확인함에 따라, 이러한 절단이 칼페인에 의한 작용인지를 확인하였는데, 그 결과, βPIX의 발현이 억제된 노화 세포에서 칼페인 억제제인 ALLM을 처리한 군은 ALLM을 처리하지 않은 군에 비해 암피피신-I 단백질의 C-말단 절편이 검출되지 않았다(도 3A). 이는 βPIX의 발현억제에 따른 세포 노화 현상에서 암피피신-I 단백질의 C-말단 절단은 칼페인 의존적인 것임을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 칼페인 절단하는 암피피신-I 단백질의 부위를 규명하기 위해, 3군데의 예상 부위를 선정하고(S333, S377, V392), 이들 아미노산 부위를 각각 글리신(G)으로 치환시킨 돌연변이체를 각각 제조한 후(AMPH-S333G, AMPH-S377G, AMPH-V392G), 노화 세포에서 각 돌연변이체들의 절단 현상 여부를 분석하였다(도 4A). 그 결과, AMPH-S333G 및 AMPH-S377G 돌연변이체들은 βPIX의 발현이 억제된 노화 세포에 칼페인의 활성화를 유도하는 ionomycin을 처리한 결과, 칼페인에 의해 잘려진 C-말단 절편들이 확인된 반면, AMPH-V392G 돌연변이체만이 잘려진 C-말단 절편을 관찰할 수 없었다(도 4B). 이러한 결과는 세포 노화에서 칼페인에 의한 AMPH C-말단의 절단이 AMPH의 V392 부위에서만 특이적으로 일어난다는 것을 의미한다.

따라서 본 발명자들은 AMPH-V392G 돌연변이체, 구체적으로 서열번호 1로 이루어진 AMPH-I 단백질의 아미노산 서열에서 392번째의 발린(V) 아미노산이 글리신(G)으로 치환된 AMPH-V392G 돌연변이체가 세포 노화에서 발생하는 칼페인에 의한 AMPH-I 절단을 억제할 수 있고, 세포 노화를 억제할 수 있는 바, 새로운 노화 억제제로 사용 가능함을 예측할 수 있었다.

이를 증명하기 위해, 본 발명의 다른 일실시예에서는, βPIX의 발현억제로 노화가 유도된 HDF 세포에 AMPH-WT 및 AMPH-V392G 돌연변이체를 각각 처리한 후, 세포 이입 및 세포 노화 현상을 분석하였는데, AMPH1-WT 처리군은 βPIX의 발현억제로 노화가 유도된 HDF 세포에서 트랜스페린 및 인테그린 β1의 세포이입이 모두 감소하는 것으로 나타났고, 세포노화 지표인 SA-β-gal 양성 세포수도 증가한 것으로 나타났다. 반면, 본 발명의 AMPH-V392G 돌연변이체를 처리한 군은 트랜스페린 및 인테그린 β1의 세포이입 변화가 거의 나타나지 않았고, SA-β-gal로 염색되어 관찰되는 세포 노화가 감소되는 것으로 나타났다(도 5 참조).

뿐만 아니라 마우스의 폐 조직을 대상으로 수행한 실험 결과에서도 동일한 결과를 보였는데, 마우스 폐에 AMPH-WT와 AMPH-V392G 돌연변이체를 렌티바이러스로 감염시킨 후, βPIX siRNA를 처리하여 βPIX 발현 억제에 의한 폐의 노화를 유도한 다음, 각 폐 조직에서의 트랜스페린의 세포이입과 SA-β-gal 활성도를 분석하였다. 그 결과, AMPH-V392G 돌연변이체를 발현하는 군에서는 βPIX 발현이 억제되더라도 AMPH-WT를 발현하는 군에 비하여 세포이입의 억제효과가 감소하였고, 세포 노화도 현저히 감소되는 것을 관찰하였다(도 6 참조). 그러므로 본 발명의 AMPH-V392G 돌연변이체가 세포 노화에서 일어나는 세포 이입의 감소를 억제할 수 있고, 노화 지표들의 발현을 억제하여 궁극적으로 노화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

이에 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 암피피신-I(Amphiphysin-I; AMPH-I)의 아미노산 서열에서 392번째 아미노산인 발린(V)이 글리신(G)으로 치환된, 암피피신 1 돌연변이체(AMPH-V392G)를 제공하며, 본 발명에 따른 AMPH-V392G 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다.

본 발명에 따른 암피피신-I 돌연변이체는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의한 세포 노화를 억제하고, 세포 이입(endocytosis)의 저해를 억제하며, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 392번째의 아미노산 부위가 단백질 분해효소인 칼페인(calpain)에 의해 절단되지 않는다는 특징을 갖는다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 암피피신-I 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 암피피신-I 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 암피피신-I 돌연변이체는 앞서 기술한 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 암피피신-I(Amphiphysin-I; AMPH-I)의 아미노산 서열에서 392번째 아미노산인 발린(V)이 글리신(G)으로 치환된 돌연변이체로서, SA-β-갈락토시다아제 활성 억제; p16 단백질의 발현 억제; 트랜스페린(transferrin)의 세포이입 감소 억제; 및 인테그린 β1(integrin β1)의 세포이입 감소 억제 활성을 갖는다.

상기 암피피신-I 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 암피피신 1의 아미노산 서열에서 392번째 아미노산인 발린(V)이 글리신(G)으로 치환된 폴리펩티드 형태로 상기 조성물에 포함될 수 있고, 또는 상기 암피피신-I 돌연변이체를 코딩하는 유전자가 포함된 발현벡터의 형태로 상기 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명에서 상기 암피피신-I 단백질의 야생형을 코딩하는 유전자는 당업계에 알려진 Human AMPH I NM_001635.3(GeneBank number)에 기재된 2085bp의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 벡터는 이에 제한되지는 않으나, 당업계에 공지된 플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 또한 본 발명에서 상기 AMPH-V392G 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있는데, AMPH-V392G 돌연변이체를 암호화하는 염기서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

바람직하게 상기 발현벡터는 AMPH-V392G 돌연변이 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명의 상기 렌티바이러스 벡터는 AMPH-V392G 돌연변이체를 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결된"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 말하며, 용어 "프로모터"는 특정 서열과 연결된 경우 특정 뉴클레오티드 서열이 mRNA로 전사되는 것을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 통상적으로, 프로모터는 모든 경우에 적용되는 것은 아니나 mRNA로 전사될 목적하는 뉴클레오티드 서열의 5' (즉, 상류)에 존재하고 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 개시를 위한 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다.

본 발명의 프로모터는 구성적이거나 조절가능한 프로모터를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 구성적 프로모터이다. 프로모터와 관련하여 사용되는 용어 "구성적"은 프로모터가 자극 (예, 열 쇼크, 화학물질 등) 없이도 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 반면, "조절 가능한" 프로모터는 자극 (예, 열 쇼크, 화학물질 등)이 존재하는 경우 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 자극 없는 경우와 구별되게 지시할 수 있는 프로모터를 의미한다.

또한 상기 벡터에는 추가로 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 형광 단백질은 형질도입된 세포 또는 조직에서 목적하는 유전자의 발현 여부를 검출할 수 있는 목적을 위한 것일 수 있고, 세포나 조직에서 발현되었을 때, 형광을 낼 수 있는 단백질이라면 모두 사용가능하며, 특별히 한정하지 않으나, 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 치료란 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 질환은 노화 또는 노화 관련 질환일 수 있고, 상기 질환은 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제로 유발되는 노화 및 상기 노화의 진행에 의해 발병될 수 있는 노화 관련 질환일 수 있다.

상기 노화 관련 질환은 이에 제한되지는 않으나, 죽상경화, 피부노화, 골다공증, 류마티스 골관절염, 퇴행성 골관절염, 탈모증, 주름 및 곱사등을 포함할 수 있다.

나아가 본 발명은 본 발명의 암피피신-I 돌연변이체(AMPH-V392G) 또는 이를 코딩하는 유전자가 포함된 발현벡터를 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 암피피신-I(amphiphysin-I) 단백질이 발현되는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질에 의해 서열번호 1의 암피피신-I 단백질에서 392번째 아미노산의 절단 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

이때 상기 후보물질이 서열번호 1로 표시되는 암피피신-I 단백질의 392번째 아미노산을 절단하지 않는 경우, 상기 후보물질은 세포 노화 억제제로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 준비예 >

시약 및 실험방법

실시예들의 실험에서 사용한 시약들 및 실험방법은 다음과 같다.

시약준비

인비보펙타민(Invivofectamine), 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000), DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium), FBS(Fetal Bovine Serum), OPTI-MEM, Alexa Fluor 594접합된 트랜스패린 및 Alexa Fluor접합된 2차 항체들은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)에서 구입하여 사용하였다.

Calpain 억제제 II (ALLM), SA-β-gal 염색용액 및 다른 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하여 사용하였다.

또한, 하기 실험에서 사용한 siRNAs의 서열들은 다음과 같다.

siPIX1: 5′-UCAACUGGUAGUAAGAGCAAAGUUU-3'

siPIX2: 5′-UUGAGCUGCAGAUCCUGACGGAAGC-3'

siCtrl: 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3'

hCalpain-2:5′-GGCAUUAGAAGAAGCAGGUUU-3'

siPIXr1: 5-ACUGGUAGUACGAGCCAAGUU-3'

siPIXr2: 5-GGAGGAUUAUGAUCCUGAUAG-3'

siPIXm1: 5′-CCAACUGGUAGUACGAGCCAAGUUU-3'

siPIXm2: 5′-GAGGACCUAGGAGAGUUCAUGGAAA-3'

siFAK: 5′-AACCACCUGGGCCAGUAUUAU-3'

실험동물준비

실험에 사용한 동물들은 충북대학교 동물실험 윤리심의위원회 (CBNUA-901-15-01)가 정한 승인된 동물 프로토콜 및 지침에 따라 모든 실험을 수행하였다. 마우스는 다한바이오링크(서울)에서 입수하여 사용하였다.

조직샘플준비

충북대학교 병원(청주시)에서 수술을 받은 기흉 환자에서 채취한 폐 세포 및 폐 조직을 사용하였다. 또한 상기 환자들은 폐에 다른 병리를 보이지 않았으며, 모든 연구는 충북대학교 병원임상 시험심사위원회(2014-02-009-009)의 검토와 승인 하에 수행하였다.

항체준비

Anti-pFAK (Y576) (#3281, 1:500), FAK (#3258, 1:1,000 for immunoblotting/1:200 for immunohistochemistry), p53(#2524, 1:1,000), pp53 (S15) (#9284, 1:500), pPAK1(T423) (#2610, 1:500), ppaxillin (Y118) (#2541, 1:500), 및 pγH2AX (S139) (#9713, 1:200) 항체들은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)로부터 구입하여 사용하였다. 또한, Anti-pFAK (Y397) (611806, 1:500), paxillin(610051, 1:1,000 ), GIT2 (P94020, 1:1,000), Cdk2 (610145, 1:500), Cdk4 (610147, 1:500), Cyclin D (610279, 1:500), Cyclin E (551159, 1:500), pRB (610884, 1:500), ppRB (610490, 1:500) 및 p19(610530, 1:500) 항체들은 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 구입하여 사용하였다. calpain-2 (sc-373966, 1:1000) 및 4(sc-30065, 1:1,000), p16(sc28260, 1:500 < immunoblotting 분석용>/1:200 <immunohistochemistry 분석용>), p21 (sc-6246, 1:500), GIT1 (sc-9657, 1:500) 및 amphiphysin I (sc-376402 및 sc-39028, 1:1,000)에 대한 항체들은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)로부터 구입하여 사용하였다.

또한, GFP (NB600-308, 1:1,000 <immunoblotting 분석용>/1:200 < immunohistochemistry 분석용>) 항체는 Novus Biologicals (Centennial, CO)에서 구입하여 사용하였다. 활성형 integrin β1 (MAB2079Z, 1:50) 및 GST (A00895, 1:1,000) 항체들은 Merck Millipore (Burlington, MA) 및 Genscript (Piscataway, NJ)에서 각각 구입하여 사용하였다. Anti-β1 integrin 항체 (ab30394, 1: 50) 및 6xHis-tag (ab18184, 1:1,000) 항체들은 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하여 사용하였다. Anti-βPIX 항체(1: 1,000 <immunoblotting 분석용>/1: 200 < immunohistochemistry 분석용>)는 βPIX의 C-terminal 부위(439~648 aa)에 대한 항체를 사용하였다.

플라스미드 및 DNA 구조물

βPIX 구조물(βPIX constructs), si-rPIX (WT) 및 si-rPIX (DHmt)은 렌티바이러스 발현을 위해 pHR-CMV SV40에 클로닝 하였다. si-rPIX (WT) 및 si-rPIX의 변이체의 제조는 QuickChange II site-directed mutagenesis kit (Agilent)를 이용하여 제조하였다. Amphiphysin I에 대한 N-말단 (NT, aa 1~351) 및 C-말단 (CT, 346~695) 부위와 calpain-2는 pGEX4T-1에 클로닝하였다. Amphiphysin I에 야생형(WT) 및 돌연변이체(MT (V392G))는 렌티바이러스 발현을 위해 pHR-CMV SV40로 클로닝하였다. Calpain-2는 pGEX4T-1로 클로닝하였다. Calpain-2 cDNA는 OriGene에서 구입하여 사용하였다. GIT1 C-말단 (CT, aa 376-770)은 박테리아에서의 발현을 위해 pGEX4T-1 벡터에 클로닝하였고, 렌티바이러스에서의 발현을 위해 pHR-CMV SV40 벡터로 각각 클로닝하였다. 본 발명의 암피피신-I-WT(야생형) 및 암피피신-I-V392G(돌연변이체)의 과발현을 위해 클로닝하여 제조한 각각의 재조합 발현벡터인 pHR-CMV-SV-Puro-Amphiphysin I-WT 재조합 벡터 및 pHR-CMV-SV-Puro-Amphiphysin I-V392G 재조합 벡터의 개열지도는 도 7에 나타내었다.

siRNA , 렌티바이러스 또는 트랜스페린(transferrin)의 in vivo로의 전달

동물 마우스에 avertin(2-2-2 트리브로모 에탄올, 체중 0.45 mg/g의 체중)을 복강내 주사하여 마우스를 마취시키고 마우스의 앞니를 플랫폼 상의 바에 고정시켰다. 블런티드 바늘이 구비된 1 인치, 22 게이지의 Safelet IV 카테터는 기관지(trachea)에서 방출되는 백색광을 찾을 수 있도록 입 안쪽에 위치시켰다. 기관지에 위치한 카테터를 확인 후, 카테터로부터 바늘을 제거하였다. 이후 InvivofectamineRNAi 복합체(75μl liposomes)는 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였고, 렌티바이러스 입자 또는 Alexa Fluor 594-트랜스페린을 카테터의 개구부에 직접적으로 피펫팅하여 siRNA, 렌티바이러스 또는 트랜스페린(transferrin)을 in vivo로 전달하였다.

세포배양

HDF(human diploid fibroblast) 세포 및 293 T 세포들은 10% FBS 및 항생제가 포함된 DMEM(Dulbeccos’ modified Eagle’s medium) 배지에서 37°C 및 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다.

β- galactosidase (SA-β-gal) 어세이

노화 관련 β- 갈락토시다제 (SA-β-Gal) 활성 측정은 pH 6.0의 조건에서 Proc Natl Acad Sci USA 92, 9363-9367 (1995)에 기재된 방법을 조금 변형하여 수행하였다. 구체적으로, 세포를 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 5분 동안 3% 포름알데히드로 고정시킨 다음 PBS로 세척하였다. 이후 세포를 37 ℃에서 13-14 시간 동안 SA-β-gal 염색용액(Sigma-Aldrich)에서 배양한 후, 30분 동안 Hoechst 33258로 염색하여 세포수를 세었다. 세포 노화는 총 세포수에 대한 SA-β-gal- 양성 세포(청색 염색)의 백분율로 계산하였고, 조직의 경우, 동물을 마취시키고 식염수로 관류시킨 다음, 조직을 액체 질소에서 급속 냉동시키고 OCT 화합물로 임배드시켰다. 이후 조직을 즉시 10 μm의 두께로 절단하였고, 1% 포름알데히드가 함유된 PBS 용액으로 고정시킨 다음, PBS로 세척하고, 37℃에서 13-14 시간 동안 SA-β -gal 염색 용액에서 배양하였다. 이후, 핵은 사프라닌-O로 염색하고 Vectashield 마운팅 배지(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)로 분석하였다.

일시적 형질감염(Transient transfection )

DNA 또는 siRNA를 이용한 형질감염은 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 또는 Lipofectamine RNAiMAX 형질감염 시약을 사용하여 수행하였다. 세포를 피브로넥틴으로 코팅된 플레이트 또는 유리 커버 슬립에 분주한 후, 지시된 DNA로 형질 감염시킬 경우에는 1일 동안 수행하였고, siRNA로 형질 감염시킬 경우에는 3-4 일 동안 수행하였다.

면역조직화학( Immunohistochemistry )

조직을 10 % 중성 완충 포르말린으로 고정시키고, 탈수시킨 후 파라핀에 포매시켰다. 포르말린으로 고정된 파라핀 포매된 조직 블록들을 섹션화 시켰다(두께 4㎛). 이후 탈파라핀화 시키고, 슬라이드는 압력 밥솥(Decloaking chamber; Biocare Medical)을 사용하여 10mM 시트르산 나트륨 완충액 (pH 6.0)에서 10 분 동안 항원 검색 절차를 거친 다음, 차단 용액(0.3% Triton X-100, 1% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20, 0.1% cold-water fish gelatin 및 0.05% sodium azide in PBS)으로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체들은 상기 각 섹션들과 함께 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 이후 0.1% Tween 20, 0.1% BSA가 함유된 PBS로 5회 세척하였고, 각 슬라이드들은 Alexa Fluor-접합된 2차 항체 (1:200)로 암실에서 상온의 온도로 1시간 동안 반응시켰다. 이후 여러차례 세척을 진행하고 슬라이들은 Hoechst 33258로 염색하였고, Vectashield 마운팅 매체(Vector Laboratories, Inc)로 분석하였다. DAB(diaminobenzidine-HCl) 염색을 위해 슬라이드를 0.3% 과산화수소가 함유된 메탄올을 이용하여 상온에서 20분동안 반응시켜 블록킹 용액을 처리하지 전에 내재적인 퍼옥시다제의 활성을 차단시켰다. 이후 슬라이드를 비오틴-결합 이차 항체로 상온에서 30분 동안 반응시키고 최종적으로 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘으로 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 퍼옥시다제 활성은 DAB를 기질로 하여 측정하였고, 음성 대조군으로는 1차 항체를 처리하지 않은 TBS 용액만을 처리한 섹션을 사용하였다. 조직학적 분석을 위해 섹션을 H & E로 염색하였다.

면역세포화학( Immunocytochemistry )

세포를 3.7 % 파라포름알데히드로 15 분 동안 고정시키고, 0.2% Triton X-100으로 5분 동안 투과시키고, 2% BSA가 함유된 PBS로 25℃에서 30 분 동안 블록킹시켰다. 항원 염색을 위해, 세포를 1차 항체로 25 ℃에서 1 시간 동안 반응시키고, 이후 2차 Alexa Fluor- 접합된 항체로 1시간 동안 반응시켰다. F-액틴의 가시화를 위해 세포를 25℃에서 30분 동안 Alexa Fluor 568- 접합된 phalloidin로 염색 하였고, 염색된 단백질의 발현은 MetaMorph 소프트웨어 버전 7.1.7 (Molecular Devices)로 분석하였다.

면역블롯팅 ( Immunoblotting ) 및 면역침강법 ( immunoprecipitation )

세포를 차가운 용해 완충액(50mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1 % 트리톤 X-100, 500μM EDTA, 200μM 피루브산 나트륨, 50mM β- 글리세로 포스페이트)으로 용해시키고, 상층액을 1차 항체로 4 ℃에서 18 시간 반응시켜 면역침강을 수행하였다. 면역 침전물들을 8-10 % SDS-PAGE로 전기영동하고, 트리스-글리신-메탄올 완충액(25 mM Tris base, 200 mM glycine and 20% methanol) 상에서 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 이후 막은 3 % BSA가 함유된 Tris- 완충 식염수 (TBS-T; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween-20)를 이용하여 30분 동안 블록킹 시켰고, 1 차 항체로 상온에서 1 시간 반응시킨 다음, TBS-T로 3회 세척 하였다. 이어 막을 2차 horseradish peroxidase접합된 항체를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고 TBS-T로 3 회 세척한 후, 강화 화학 발광 시약을 사용하여 신호를 검출하였다.

트랜스페린 세포이입 ( Transferrin endocytosis )

세포를 20mM 글루코스 및 1% BSA를 함유하는 차가운 생세포 이미지 용액 (LICS : 140mM NaCl, 20mM HEPES, 2.5mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1.0mM MgCl2, pH 7.4)으로 아이스 상에서 10 분 동안 처리하였다. 세포에 20mM 글루코스 및 1 % BSA를 함유하는 LCIS 용액과 20㎍/ml Alexa Fluor 594- 트랜스페린을 함께 처리하고 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 세척하고,4 % 파라포름알데히드로 10 분 동안 고정시켰다. 마우스의 폐에서 트랜스페린 엔도사이토 시스를 분석하기 위해, 0.1 μM Alexa Fluor 594-Transferrin을 카테터의 개구부에 직접 삽입하여 기관지 내 전달시켰다. 1 시간 후, PBS로 동물의 심장을 관통하도록 관류시켰다. 조직을 절개하고 액체 질소에서 냉동 동결시킨 다음 즉시 동결 마이크로톰으로 10μm 두께를 갖도록 슬라이스하고, 10 분 동안 차가운 아세톤으로 고정시켰다. 슬라이스된 각 섹션들은 DAPI (10 μg / ml)로 염색하여 핵을 표지하도록 하였고 Vectashield 장착 매체를 이용하여 마운팅하였다. 세포내 이입된 트랜스페린(Endocytotic transferrin)은 Olympus FluoView 공초점 현미경 (FV10i, Olympus, Japan) 또는 형광 현미경 (DP30BW, Olympus, Japan)으로 관찰하였고 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어로 분석하였다.

인테그린 β1 세포이입

기근 상태의 세포를 20분 동안 10μM의 노코다졸(nocodazole)로 전처리하고 37℃에서 40 분 동안 항-활성형 β1 인테그린 항체(1 : 200)를 처리하여 반응시켰다. 이후 결합되지 않은 항체 및 노코다졸을 PBS로 세척하고, 60분 동안 추적을 수행하였다. 이후 세포를 따뜻한 PBS로 세척하고, 산 린스(acid rinse; 0.5 % 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 3.0)로 표면 항체를 제거하였다. 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고 0.2 % 트윈 20으로 투과시켰다. 내재화된 β1 인테그린은 Alexa Fluor- 접합된 이차 항체 (1 : 200)로 1시간 동안 반응시키고 분석하였다.

통계처리

모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표현하였다; 적어도 3 개의 독립적인 실험으로부터의 대표 데이터가 분석되었다. 통계적 유의성은 Windows 용 Sigma Plot (버전 12)을 사용하는 Student 's t-test, WilcoxonMann-Whitney test 의해 평가되었다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

< 실시예 1>

노화된 조직 및 세포에서 βPIX의 발현수준 분석

본 발명자들은 노화 과정에 따른 βPIX 단백질의 발현수준에 변화가 발생하는지 확인하기 위해, 3, 15, 24 개월령의 노화가 진행되는 마우스로부터 폐, 신장, 비장, 심장 및 피부 조직을 수득한 후, 이들 조직에서의 βPIX 발현 수준을 면역블롯팅 및 면역화학조직 염색을 통해 확인하였다. 그 결과, 늙은 마우스의 조직(폐, 신장, 비장, 심장 및 피부)에서 βPIX의 발현수준은 젊은 마우스의 조직에 비해 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 1A 참조).

또한, 이를 더 구체적으로 확인하기 위해, 젊은 마우스(3 개월령)와 늙은 마우스(24 개월령)의 폐조직으로부터 βPIX와 노화지표로 알려진 p16 단백질의 발현을 면역화학조직염색법으로 분석한 결과, 늙은 마우스의 폐에서는 βPIX의 발현이 젊은 마우스에 비해 현저하게 감소되어 있고, 반면 노화의 지표인 p16의 발현은 늙은 마우스에서 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1B 및 1C 참조). 이러한 결과는 젊은 사람의 폐(14살)와 고령의 사람(73살)으로부터 수득한 폐 조직을 대상으로 βPIX 및 p16 단백질의 발현수준을 면역조직화학염색법으로 분석한 결과에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었는데, 고령 사람의 폐 조직에서 βPIX 의 발현이 감소되어 있고 반면 p16 단백질의 수준은 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1D 및 1E).

뿐만 아니라, 이러한 결과가 조직이 아닌 세포에서도 동일하게 나타나는지 확인하기 위해, 젊은 HDF 세포 (young passage human dermal fibroblasts cell) 및 노화된 HDF 세포(old passage human dermal fibroblasts cell)에서의 βPIX와 p16 발현 수준을 측정하였는데, 그 결과, 노화된 HDF 세포에서 βPIX의 발현이 젊은 HDF 세포에 비해 감소된 것으로 나타난 반면, p16의 발현은 증가되어 있는 것으로 나타났고, 노화의 또 다른 지표로 알려진 SA-β-gal(senescence associated-β-galactosidase) 역시 노화된 HDF 세포에서 활성이 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1F~1H 참조).

따라서 노화가 진행됨에 따라 βPIX의 발현은 감소된다는 것을 알 수 있었고, βPIX의 발현 감소가 노화와 밀접한 관련이 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

βPIX의 발현 억제에 따른 인테그린 β1 및 트랜스페린의 세포이입 감소

실시예 1에서 확인한 바와 같이, 노화가 일어나면 βPIX의 발현이 감소됨을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 βPIX의 발현 감소에 따른 노화 기전으로 세포이입(endocytosis)의 작용이 감소되는지를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다. 즉, βPIX 발현 억제 시 세포부착을 조절하는 integrin β1의 세포이입에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 피부섬유아세포 (HDF)에 βPIX에 대한 siRNA와 노코다졸(nocodazole)을 처리하여 배양한 후, 활성형 integrin β1의 항체로 반응시킨 후, integrin β1 항체를 이용한 염색방법을 통해 세포내 이입된 integrin β1을 분석하였다.

또한, βPIX 발현 억제 시 트랜스페린의 세포이입에 미치는 영향을 분석하기 위해, 피부섬유아세포 (HDF)에 βPIX에 대한 siRNA을 처리한 후, LCIS 용액과 Alexa Fluor 594- 트랜스페린을 함께 처리하여 반응시킨 다음, 세포내 이입된 트랜스페린(Endocytotic transferrin)은 Olympus FluoView 공초점 현미경 (FV10i, Olympus, Japan) 또는 형광 현미경 (DP30BW, Olympus, Japan)으로 관찰하였고 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어로 분석하였다. 또한 마우스의 폐 조직을 대상으로 트랜스페린 엔도사이토 시스를 분석하기 위해, Alexa Fluor 594-Transferrin을 카테터의 개구부에 직접 삽입하여 기관지 내 전달시킨 후, 폐조직을 슬라이스화한 후, 트랜스페린의 항체를 이용한 염색을 수행하였고, 공초점 현미경 또는 형광 현미경으로 관찰하였다.

또한, βPIX 발현 억제를 위해 사용한 siRNA는 다음과 같다.

siPIX1: 5′-UCAACUGGUAGUAAGAGCAAAGUUU-3’

siPIX2: 5′-UUGAGCUGCAGAUCCUGACGGAAGC-3’

siCtrl: 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3’

siPIXm1: 5′-CCAACUGGUAGUACGAGCCAAGUUU-3’

siPIXm2: 5′-GAGGACCUAGGAGAGUUCAUGGAAA-3’

분석 결과, HDF 세포주를 대상으로 세포 부착을 조절하는 integrin β1의 세포이입을 확인한 결과, βPIX의 발현이 억제된 군에서 βPIX의 발현을 억제하지 않은 군(siCtrl 처리군)에 integrin β1의 세포이입이 비해 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났고(도 2A 및 2B 참조), 대표적인 세포이입 지표 단백질인 transferrin의 세포이입도 βPIX의 발현을 억제한 군에서 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 2C 및 2D 참조). 또한 이러한 결과는 βPIX의 siRNA가 주입된 마우스의 폐 조직에서도 동일한 결과를 보였는데, βPIX의 발현이 억제된 조직에서 transferrin의 세포이입이 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 2E 및 2F 참조).

따라서 이러한 결과들을 통해, βPIX의 발현 억제가 노화를 촉진할 수 있으며, 노화가 일어나면 세포이입의 작용이 감소한다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

노화에 의해 유도되는 암피피신 -I( AMPH -I)의 절단 확인

앞서 실시예 2의 결과를 통해, 노화가 일어나면 세포이입, 즉 세포이입(endocytosis)가 감소된다는 것을 확인함에 따라 본 발명자들은 노화와 관련하여 βPIX의 발현이 어떠한 작용기전에 의해 세포이입을 조절하는 것인지를 분석하였다. 이를 위해 βPIX siRNA를 HDF 세포에 처리하여 βPIX의 발현을 억제시킨 후, 세포이입 조절 단백질들의 발현 양상의 변화를 면역블롯팅을 통해 분석하였는데, 세포이입에 관여하는 단백질들 중, 암피피신(AMPH)-I이 βPIX의 발현억제를 통해 C-말단 부위(약 50 kDa)가 잘려진 AMPH-Cl 절편을 확인하였다. 한편, βPIX의 발현을 억제시키지 않은 군에서는 C 말단이 잘려진 AMPH-Cl 절편이 관찰되지 않았다. 또한, 세포이입의 다른 조절 단백질인 dynamin II 단백질은 βPIX의 발현이 하여도 암피피신 1과 같은 단백질 절단 현상이 발생하지 않았다(도 3A 참조). 또한, 마우스의 폐 조직을 대상으로 수행한 결과에 의하면, βPIX의 발현이 억제된 마우스의 폐에서는 대조군에 비해 암피피신-I(AMPH-I)의 발현이 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 3B 및 3C 참조).

나아가 본 발명자들은 노화와 AMPH-I의 C-말단 절단 현상을 검증하기 위해 어린 마우스(1 개월령)과 늙은 마우스(22 개월/24 개월령)의 폐를 수득한 후, 이들 마우스의 폐 조직에서 AMPH-I 및 βPIX 단백질의 발현 수준을 면역블롯팅을 통해 확인하였고, 트랜스페린(transferrin)에 의한 세포이입 변화를 관찰하였다. 그 결과, 늙은 마우스의 폐에서 AMPH-I의 전달 현상이 발생하여 분해된 AMPH C-말단 절편들을 확인하였고, 반면, 어린 마우스에서는 AMPH C-말단 절편들이 검출되지 않았다(도 3D 참조). 또한, 늙은 마우스의 폐에서는 βPIX/GIT 복합체의 발현이 감소되어 있는 것으로 나타났고, 트랜스페린의 세포이입도 어린 마우스에 비해 늙은 마우스 폐에서 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 3E 참조).

이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 βPIX 발현 감소(억제) 시, 노화가 진행되며 이러한 노화 진행은 AMPH의 절단(C-말단)에 의해 세포이입의 작용을 감소시킨 다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

노화에 의해 유도되는 암피피신 -I( AMPH -I)의 절단 부위 확인

βPIX 발현 저해에 따른 노화 촉진 과정에서 암피피신-I(AMPH-I)의 C말단이 절단된다는 것을 상기 실시예 3을 통해 확인하였다. 이에 본 발명자들은 노화 진행 시, AMPH-I의 C말단을 절단하는 작용자 및 구체적인 절단 아미노산 부위를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 칼페인(calpain)는 칼슘 이온으로 활성화되는 세포내 단백질 분해효소로서, 세포막이나 세포 골격에 근접해 존재하는 단백질 및 세포신호전달에 관여하는 단백질 등을 한정적으로 분해하는 작용하며, AMPH-I이 칼페인-2의 기질로 작용함이 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 단백질 분해효소인 칼페인-2가 AMPH-I에 작용할 것으로 예상되는 3곳의 타겟 부위(AMPH-I 아미노산 서열의 333번째의 세린(S333), 377번째의 세린(S377) 및 392번째의 발린(V392)을 선정한 후, 각 해당 아미노산을 글리신(G) 아미노산으로 치환한 돌연변이체 AMPH-S333G, AMPH-S377G, AMPH-V392G를 각각 제조하였다. 상기 돌연변이체들은 AMPH-I-wild type (WT)을 주형으로 점돌연변이 키트 (QuikChange II Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)를 이용하여 각각 제조하였다(도 4A 참조). 세 종류의 돌연변이체 AMPH-1을 함유한 발현벡터를 293T 세포에 형질 감염시킨 후, 칼페인의 활성화를 유도할 수 있는 ionomycin의 처리 유무에 따른 AMPH-I 절단 여부를 분석하였다. 그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 3 가지 돌연변이체 중에서 유일하게 AMPH-V392G 돌연변이체만이 활성화 된 칼페인에 의해 절단되지 않음을 확인하였다(도 4B).

따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 활성화된 칼페인-2에 의한 AMPH-I의 절단 부위는 아미노산 세린 392(S392) 부위임을 알 수 있었고, 이 부분을 치환한 돌연변이체 AMPH-V392G는 절단되지 않음으로 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

βPIX 발현 억제에 의해 유도되는 세포이입 감소 및 세포노화 촉진에서 AMPH - V392G 돌연변이체가 미치는 영향분석

βPIX 발현 억제에 의해 유도되는 세포이입 감소 및 노화 촉진과 관련하여 본 발명에 따른 AMPH-V392G 돌연변이체의 기능을 확인하기 위해, HDF 세포주에 AMPH-WT 및 AMPH-V392G 돌연변이체를 각각 도입시켜 세포 내에서 발현을 유도한 후, βPIX siRNA를 처리하여 βPIX의 발현을 억제한 조건에서, AMPH-I 단백질의 절단이 일어나는지를 면역블롯팅을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, βPIX 발현 억제에 의해 유도되는 AMPH-I 단백질의 절단 현상은 본 발명의 AMPH-V392G 돌연변이체에서는 일어나지 않는 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 AMPH-V392G 돌연변이가 βPIX 발현 억제에 의해 유도되는 세포이입 억제와 노화 증가에 밀접하게 관련되어 있음을 의미한다. 이에 본 발명자들은 AMPH-WT와 AMPH-V392G 돌연변이체를 βPIX 발현이 억제된 HDF 세포에 처리할 경우, 트랜스페린과 integrin β1의 세포이입에 미치는 영향을 관찰하였다. 그 결과, AMPH-WT은 siPIX 처리에 의해 βPIX의 발현이 억제되면 세포이입이 현저히 감소하는 것으로 나타났으나, AMPH1-V392G 돌연변이체를 처리한 군에서는 트랜스페린 및 integrin β1의 세포이입의 억제 효과가 나타나지 않음을 확인하였다(도 5B~5D 참조).

나아가 본 발명의 돌연변이체가 βPIX의 발현 억제에 의한 노화를 억제시킬 수 있는지 확인하기 위해, 상기 실험에 사용된 실험군들을 대상으로 SA-β-gal의 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 5E에 나타낸 바와 같이, AMPH-V392G 돌연변이체를 처리한 군에서는 노화 지표로 알려진 SA-β-gal의 효소 활성이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 βPIX 발현 억제에 의해 나타나는 노화 현상은 세포이입과 밀접한 관련성이 있으며, 이는 AMPH-I의 392번째 발린 잔기가 칼페인-2에 의해 절단되기 때문임을 확인하였을 뿐만 아니라, 본 발명을 통해 칼페인-2에 의해 절단되지 못하도록 고안한 AMPH-I의 392번째 발린이 글리신 잔기로 치환된 돌연변이체(AMPH-V392G)가 βPIX 발현 억제에 의해 유도되는 노화를 억제시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

< 실시예 6>

AMPH - V392G 돌연변이체의 세포 노화억제 활성 분석

실시예 5에서 확인한 AMPH1-V392G 돌연변이체의 세포 노화 억제 효과를 in vivo 동물 모델에서 재확인하기 위해, 마우스의 폐에 AMPH-WT 및 AMPH-V392G 렌티바이러스를 일차적으로 감염시킨 후, βPIX의 siRNA를 처리하여 βPIX 발현 억제에 의한 폐 조직의 노화를 유도하였다. 이러한 실험절차는 도 6A에 나타내었다. 상기 조건으로 실험한 결과, 본 발명의 돌연변이체인 AMPH-V392G를 발현하는 폐 조직에서는 βPIX 발현이 억제되더라도 AMPH-WT를 발현하는 폐에 비하여 세포이입의 억제효과가 감소하는 것으로 나타났고(도 6B 및 6C 참조), 더불어 세포노화의 지표인 SA-β-gal 활성과 p16의 발현이 현저히 감소되는 것으로 나타났다(도 6D 및 6E).

이러한 결과들은 βPIX의 발현 억제에 의해 유도되는 세포 노화에서 AMPH-I의 V392 부위의 절단이 세포이입 억제와 노화 촉진 현상을 유발한다는 것을 나타내며, 본 발명에 따른 AMPH-I의 V392 부위가 calpain에 의해 잘리지 않도록 돌연변이 시킨 AMPH-V392G 돌연변이체가 βPIX의 발현 억제에 의해 유도되는 세포이입 감소 및 노화 촉진을 저해할 수 있음을 확인하였다. 그러므로 본 발명자들은 본 발명의 AMPH-V392G 돌연변이체를 노화를 조절할 수 있는 용도로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University <120> Amphiphysin-I mutant having anti-senescence activity and use thereof <130> NPDC80183 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPH1 WT amino acid sequence <400> 1 Met Ala Asp Ile Lys Thr Gly Ile Phe Ala Lys Asn Val Gln Lys Arg 1 5 10 15 Leu Asn Arg Ala Gln Glu Lys Val Leu Gln Lys Leu Gly Lys Ala Asp 20 25 30 Glu Thr Lys Asp Glu Gln Phe Glu Glu Tyr Val Gln Asn Phe Lys Arg 35 40 45 Gln Glu Ala Glu Gly Thr Arg Leu Gln Arg Glu Leu Arg Gly Tyr Leu 50 55 60 Ala Ala Ile Lys Gly Met Gln Glu Ala Ser Met Lys Leu Thr Glu Ser 65 70 75 80 Leu His Glu Val Tyr Glu Pro Asp Trp Tyr Gly Arg Glu Asp Val Lys 85 90 95 Met Val Gly Glu Lys Cys Asp Val Leu Trp Glu Asp Phe His Gln Lys 100 105 110 Leu Val Asp Gly Ser Leu Leu Thr Leu Asp Thr Tyr Leu Gly Gln Phe 115 120 125 Pro Asp Ile Lys Asn Arg Ile Ala Lys Arg Ser Arg Lys Leu Val Asp 130 135 140 Tyr Asp Ser Ala Arg His His Leu Glu Ala Leu Gln Ser Ser Lys Arg 145 150 155 160 Lys Asp Glu Ser Arg Ile Ser Lys Ala Glu Glu Glu Phe Gln Lys Ala 165 170 175 Gln Lys Val Phe Glu Glu Phe Asn Val Asp Leu Gln Glu Glu Leu Pro 180 185 190 Ser Leu Trp Ser Arg Arg Val Gly Phe Tyr Val Asn Thr Phe Lys Asn 195 200 205 Val Ser Ser Leu Glu Ala Lys Phe His Lys Glu Ile Ala Val Leu Cys 210 215 220 His Lys Leu Tyr Glu Val Met Thr Lys Leu Gly Asp Gln His Ala Asp 225 230 235 240 Lys Ala Phe Thr Ile Gln Gly Ala Pro Ser Asp Ser Gly Pro Leu Arg 245 250 255 Ile Ala Lys Thr Pro Ser Pro Pro Glu Glu Pro Ser Pro Leu Pro Ser 260 265 270 Pro Thr Ala Ser Pro Asn His Thr Leu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro 275 280 285 Ala Arg Pro Arg Ser Pro Ser Gln Thr Arg Lys Gly Pro Pro Val Pro 290 295 300 Pro Leu Pro Lys Val Thr Pro Thr Lys Glu Leu Gln Gln Glu Asn Ile 305 310 315 320 Ile Ser Phe Phe Glu Asp Asn Phe Val Pro Glu Ile Ser Val Thr Thr 325 330 335 Pro Ser Gln Asn Glu Val Pro Glu Val Lys Lys Glu Glu Thr Leu Leu 340 345 350 Asp Leu Asp Phe Asp Pro Phe Lys Pro Glu Val Thr Pro Ala Gly Ser 355 360 365 Ala Gly Val Thr His Ser Pro Met Ser Gln Thr Leu Pro Trp Asp Leu 370 375 380 Trp Thr Thr Ser Thr Asp Leu Val Gln Pro Ala Ser Gly Gly Ser Phe 385 390 395 400 Asn Gly Phe Thr Gln Pro Gln Asp Thr Ser Leu Phe Thr Met Gln Thr 405 410 415 Asp Gln Ser Met Ile Cys Asn Leu Ala Glu Ser Glu Gln Ala Pro Pro 420 425 430 Thr Glu Pro Lys Ala Glu Glu Pro Leu Ala Ala Val Thr Pro Ala Val 435 440 445 Gly Leu Asp Leu Gly Met Asp Thr Arg Ala Glu Glu Pro Val Glu Glu 450 455 460 Ala Val Ile Ile Pro Gly Ala Asp Ala Asp Ala Ala Val Gly Thr Leu 465 470 475 480 Val Ser Ala Ala Glu Gly Ala Pro Gly Glu Glu Ala Glu Ala Glu Lys 485 490 495 Ala Thr Val Pro Ala Gly Glu Gly Val Ser Leu Glu Glu Ala Lys Ile 500 505 510 Gly Thr Glu Thr Thr Glu Gly Ala Glu Ser Ala Gln Pro Glu Ala Glu 515 520 525 Glu Leu Glu Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Val Ile Pro Ser Val Val 530 535 540 Ile Glu Pro Ala Ser Asn His Glu Glu Glu Gly Glu Asn Glu Ile Thr 545 550 555 560 Ile Gly Ala Glu Pro Lys Glu Thr Thr Glu Asp Ala Ala Pro Pro Gly 565 570 575 Pro Thr Ser Glu Thr Pro Glu Leu Ala Thr Glu Gln Lys Pro Ile Gln 580 585 590 Asp Pro Gln Pro Thr Pro Ser Ala Pro Ala Met Gly Ala Ala Asp Gln 595 600 605 Leu Ala Ser Ala Arg Glu Ala Ser Gln Glu Leu Pro Pro Gly Phe Leu 610 615 620 Tyr Lys Val Glu Thr Leu His Asp Phe Glu Ala Ala Asn Ser Asp Glu 625 630 635 640 Leu Thr Leu Gln Arg Gly Asp Val Val Leu Val Val Pro Ser Asp Ser 645 650 655 Glu Ala Asp Gln Asp Ala Gly Trp Leu Val Gly Val Lys Glu Ser Asp 660 665 670 Trp Leu Gln Tyr Arg Asp Leu Ala Thr Tyr Lys Gly Leu Phe Pro Glu 675 680 685 Asn Phe Thr Arg Arg Leu Asp 690 695 <210> 2 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMPH1 V392G mutant amino acid sequence <400> 2 Met Ala Asp Ile Lys Thr Gly Ile Phe Ala Lys Asn Val Gln Lys Arg 1 5 10 15 Leu Asn Arg Ala Gln Glu Lys Val Leu Gln Lys Leu Gly Lys Ala Asp 20 25 30 Glu Thr Lys Asp Glu Gln Phe Glu Glu Tyr Val Gln Asn Phe Lys Arg 35 40 45 Gln Glu Ala Glu Gly Thr Arg Leu Gln Arg Glu Leu Arg Gly Tyr Leu 50 55 60 Ala Ala Ile Lys Gly Met Gln Glu Ala Ser Met Lys Leu Thr Glu Ser 65 70 75 80 Leu His Glu Val Tyr Glu Pro Asp Trp Tyr Gly Arg Glu Asp Val Lys 85 90 95 Met Val Gly Glu Lys Cys Asp Val Leu Trp Glu Asp Phe His Gln Lys 100 105 110 Leu Val Asp Gly Ser Leu Leu Thr Leu Asp Thr Tyr Leu Gly Gln Phe 115 120 125 Pro Asp Ile Lys Asn Arg Ile Ala Lys Arg Ser Arg Lys Leu Val Asp 130 135 140 Tyr Asp Ser Ala Arg His His Leu Glu Ala Leu Gln Ser Ser Lys Arg 145 150 155 160 Lys Asp Glu Ser Arg Ile Ser Lys Ala Glu Glu Glu Phe Gln Lys Ala 165 170 175 Gln Lys Val Phe Glu Glu Phe Asn Val Asp Leu Gln Glu Glu Leu Pro 180 185 190 Ser Leu Trp Ser Arg Arg Val Gly Phe Tyr Val Asn Thr Phe Lys Asn 195 200 205 Val Ser Ser Leu Glu Ala Lys Phe His Lys Glu Ile Ala Val Leu Cys 210 215 220 His Lys Leu Tyr Glu Val Met Thr Lys Leu Gly Asp Gln His Ala Asp 225 230 235 240 Lys Ala Phe Thr Ile Gln Gly Ala Pro Ser Asp Ser Gly Pro Leu Arg 245 250 255 Ile Ala Lys Thr Pro Ser Pro Pro Glu Glu Pro Ser Pro Leu Pro Ser 260 265 270 Pro Thr Ala Ser Pro Asn His Thr Leu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro 275 280 285 Ala Arg Pro Arg Ser Pro Ser Gln Thr Arg Lys Gly Pro Pro Val Pro 290 295 300 Pro Leu Pro Lys Val Thr Pro Thr Lys Glu Leu Gln Gln Glu Asn Ile 305 310 315 320 Ile Ser Phe Phe Glu Asp Asn Phe Val Pro Glu Ile Ser Val Thr Thr 325 330 335 Pro Ser Gln Asn Glu Val Pro Glu Val Lys Lys Glu Glu Thr Leu Leu 340 345 350 Asp Leu Asp Phe Asp Pro Phe Lys Pro Glu Val Thr Pro Ala Gly Ser 355 360 365 Ala Gly Val Thr His Ser Pro Met Ser Gln Thr Leu Pro Trp Asp Leu 370 375 380 Trp Thr Thr Ser Thr Asp Leu Gly Gln Pro Ala Ser Gly Gly Ser Phe 385 390 395 400 Asn Gly Phe Thr Gln Pro Gln Asp Thr Ser Leu Phe Thr Met Gln Thr 405 410 415 Asp Gln Ser Met Ile Cys Asn Leu Ala Glu Ser Glu Gln Ala Pro Pro 420 425 430 Thr Glu Pro Lys Ala Glu Glu Pro Leu Ala Ala Val Thr Pro Ala Val 435 440 445 Gly Leu Asp Leu Gly Met Asp Thr Arg Ala Glu Glu Pro Val Glu Glu 450 455 460 Ala Val Ile Ile Pro Gly Ala Asp Ala Asp Ala Ala Val Gly Thr Leu 465 470 475 480 Val Ser Ala Ala Glu Gly Ala Pro Gly Glu Glu Ala Glu Ala Glu Lys 485 490 495 Ala Thr Val Pro Ala Gly Glu Gly Val Ser Leu Glu Glu Ala Lys Ile 500 505 510 Gly Thr Glu Thr Thr Glu Gly Ala Glu Ser Ala Gln Pro Glu Ala Glu 515 520 525 Glu Leu Glu Ala Thr Val Pro Gln Glu Lys Val Ile Pro Ser Val Val 530 535 540 Ile Glu Pro Ala Ser Asn His Glu Glu Glu Gly Glu Asn Glu Ile Thr 545 550 555 560 Ile Gly Ala Glu Pro Lys Glu Thr Thr Glu Asp Ala Ala Pro Pro Gly 565 570 575 Pro Thr Ser Glu Thr Pro Glu Leu Ala Thr Glu Gln Lys Pro Ile Gln 580 585 590 Asp Pro Gln Pro Thr Pro Ser Ala Pro Ala Met Gly Ala Ala Asp Gln 595 600 605 Leu Ala Ser Ala Arg Glu Ala Ser Gln Glu Leu Pro Pro Gly Phe Leu 610 615 620 Tyr Lys Val Glu Thr Leu His Asp Phe Glu Ala Ala Asn Ser Asp Glu 625 630 635 640 Leu Thr Leu Gln Arg Gly Asp Val Val Leu Val Val Pro Ser Asp Ser 645 650 655 Glu Ala Asp Gln Asp Ala Gly Trp Leu Val Gly Val Lys Glu Ser Asp 660 665 670 Trp Leu Gln Tyr Arg Asp Leu Ala Thr Tyr Lys Gly Leu Phe Pro Glu 675 680 685 Asn Phe Thr Arg Arg Leu Asp 690 695

Claims

서열번호 1로 표시되는 암피피신-I(amphiphysin-I; AMPH-I)의 아미노산 서열에서 392번째 아미노산인 발린(V)이 글리신(G)으로 치환된, 암피피신-I 돌연변이체.
제1항의 암피피신-I 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제로 유발되는 세포 노화 억제용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 암피피신-I 돌연변이체는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의한 세포 노화를 억제하고, 세포 이입(endocytosis)의 저해를 억제하는 것을 특징으로 하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제로 유발되는 세포 노화 억제용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 암피피신-I 돌연변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 392번째의 발린 아미노산 부위가 단백질 분해효소인 칼페인(calpain)에 의해 절단되지 않는 것을 특징으로 하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제로 유발되는 세포 노화 억제용 조성물.
제1항의 암피피신-I 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제로 유발되는 죽상경화, 피부노화, 골다공증, 류마티스 골관절염, 퇴행성 골관절염, 탈모증 및 곱사등으로 이루어진 군 중에서 선택되는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제5항에 있어서,
상기 암피피신-I 돌연변이체는,
SA-β-갈락토시다아제 활성 억제;
p16 단백질의 발현 억제;
트랜스페린(transferrin)의 세포이입 감소 억제; 및
인테그린 β1(integrin β1)의 세포이입 감소 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제로 유발되는 죽상경화, 피부노화, 골다공증, 류마티스 골관절염, 퇴행성 골관절염, 탈모증 및 곱사등으로 이루어진 군 중에서 선택되는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항의 암피피신-I 돌연변이체 또는 이를 코딩하는 유전자가 포함된 발현벡터를 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제방법.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 암피피신-I(amphiphysin-I) 단백질이 발현되는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
상기 후보물질에 의해 서열번호 1의 암피피신-I 단백질에서 392번째 아미노산의 절단 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제제를 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 세포 노화는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의한 것임을 특징으로 하는, 세포 노화 억제제의 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 후보물질이 서열번호 1로 표시되는 암피피신-I 단백질의 392번째 발린 아미노산을 절단하지 않는 경우, 상기 후보물질은 세포 노화 억제제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 노화 억제제의 스크리닝 방법.