KR102323971B1 - 노화 억제 활성을 갖는 ｇｉｔ의 신규 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노화 억제 활성을 갖는 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 GIT 또는 GIT의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 세포 노화 억제용 조성물, 세포 노화 억제제를 스크리닝 하는 방법 및 세포 노화 억제방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 βPIX의 발현 감소에 의한 노화된 세포에 GIT 혹은 GIT-CT를 과발현 시킨 결과, 노화 지표들의 발현이 감소됨을 확인하였고, 노화로 인한 세포이입의 감소도 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 GIT는 세포 노화 억제 활성을 가지고 있는 바, 노화 또는 노화 관련 질환의 새로운 치료제로서 사용 가능하다.

Description

노화 억제 활성을 갖는 ＧＩＴ의 신규 용도{Novel use of GIT having anti-senescence activity}

본 발명은 노화 억제 활성을 갖는 GIT 단백질의 신규 용도에 관한 것이다.

세포 노화는 개체의 노화를 유발하는 주요 원인으로 DNA 손상, 텔로미어 침식, 세포 스트레스의 축적, 세포 복제 능력의 상실 등 수많은 요인에 의해 발생한다. 세포 노화를 규정하는 지표로서, 노화된 세포는 크기가 커지고, 모양이 편평해지며, 핵에 이질염색질이 증가하고, 세포질에 공포가 많아지는 형태학적 특징이 나타난다. 또한 노화를 규정짓는 대표적인 생화학적 지표로는 SA-β-gal (senescence-associated β-galatosidase) 활성 증가, p53, p16/INK4 (p16), p21과 같은 세포성장을 억제하는 분자들의 발현 증가, 인슐린 성장인자 결합단백질 (insulin-like growth factor binding proteins; IGFBPs), 인터루킨-6 (interleukin-6), 전환성장인자-β (transforming growth factor-β;TGF-β), 인터페론 (interferon)과 같은 염증 관련 단백질들을 분비 증가가 있다.

세포 노화는 단순히 개체나 조직의 노화에 기여할 뿐만 아니라, 여러 가지 다양한 질병의 병인에 중요한 역할을 한다. 노화세포는 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화 혈관조직 등과 같은 염증성 병변 조직에서 많이 관찰되며, 또한 전립샘 증식증과 간염, 간암 등에서도 세포노화 현상이 관찰된다.

노화 세포가 축적되면 노화된 세포는 잘 분열하지 못하고, 손상된 조직은 적절히 복구되지 못한다. 또한 주위 조직을 분해하는 효소나 염증성 사이토카인 등의 분비를 촉진함으로 조직의 손상을 가속시켜 노화와 관련된 질환 발병에 기여한다. 따라서 세포의 노화가 개체의 노화와 밀접한 관련이 있기 때문에 세성 노화를 지연시킴으로 개체 노화를 조절하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

또한 세포 노화 시, 세포는 외부 반응에 대한 반응성이 현저히 저하되며 세포막 수용체성 세포이입(receptor-mediated endocytosis)의 기능이 감소된다고 알려져 있으며, 이와 관련하여 젊은 세포와 노화된 세포를 대상으로 세포막 수용체 매개로 일어나는 트랜스페린(transferrin)의 이입(endocytosis) 여부의 분석을 통해 노화 세포에서는 세포막 수용체 매개로 일어나는 트랜스페린의 이입(endocytosis)이 젊은 세포에 비해 현저하게 감소된다는 연구가 보고 되었다. 세포막 수용체 매개성 세포이입은 클라트린 소포체(clathrin coated vesicle)를 경유하여 여러 단계의 과정을 거쳐 일어나며 이러한 과정에 clathrin, AP2, dynamin 및 amphiphysin 등이 관여한다고 알려져 있다.

또한, 노화된 세포는 큰 세포부착(focal adhesion), 활성화된 FAK(focal adhesion kinase) 등에 의해 기질에 대해 강하게 결합하는 고-부착성 세포 표현형을 띠게 된다.

한편, GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 단백질은 다기능 어댑터 단백질로서, ARF small GTPases에 대한 GTPase-활성화 도메인 (ARF GAP domain)을 포함한 몇몇 도메인으로 이루어져 있고, GRK, PIX, FAK, PLCγ, MEK1, Piccolo, liprin-α, paxillin과 같은 다양한 신호 전달 단백질 및 어댑터 단백질과 결합한다는 것이 알려져 있다.

그러나 아직까지 GIT에 대한 연구는 미비한 실정이며 특히, 세포 노화와의 관련성에 대해서는 연구된 바가 없다.

대한민국 공개특허 10-2019-0095502

이에 본 발명자들은 아직까지 규명된 바 없었던 GIT의 세포 노화 억제 활성을 최초로 규명하였으며, βPIX(PAK-interacting exchange factor beta)의 발현 억제에 의해 세포 노화가 촉진되며 세포이입이 감소됨을 확인하였고, βPIX의 발현 감소에 의한 노화된 세포에 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins)를 과발현 시킨 결과, 노화 지표들의 발현이 감소되고 노화로 인한 세포이입의 감소도 억제되는 것을 확인함으로써, GIT를 세포 노화 억제제, 궁극적으로 노화 또는 노화 관련 질환의 새로운 치료제로서 사용 가능함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 또는 GIT의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 또는 GIT의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GIT 단백질 또는 GIT 유전자가 포함된 발현벡터를 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 또는 GIT의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GIT는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 GIT의 활성화제는 GIT의 발현 또는 활성을 증진시킬 수 있는 단백질, 화합물 또는 핵산일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GIT는 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 GIT 유전자가 발현 벡터에 삽입되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 노화 또는 노화 관련 질환은 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 감소로 인한 질환일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 SA-β-갈락토시다아제 활성 억제; p16의 발현 억제; 및 세포 노화에 의한 세포 이입(endocytosis) 감소 억제활성을 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 또는 GIT의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GIT는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 GIT의 활성화제는 GIT의 발현 또는 활성을 증진시킬 수 있는 단백질, 화합물 또는 핵산일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GIT는 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 GIT 유전자가 발현 벡터에 삽입되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 노화는 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 감소로 인한 세포 노화일 수 있다.

또한 본 발명은, 생물학적 시료에 임의의 후보물질을 처리하는 단계; 상기 생물학적 시료로부터 GIT 단백질 또는 GIT 유전자의 발현수준을 검출하는 단계; 및 상기 발현수준을 임의의 후보물질을 처리하지 않은 대조군에서의 동일 유전자 또는 동일 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 후보물질을 처리한 군에서 대조군에 비해 GIT 단백질 또는 GIT 유전자의 발현수준이 증가된 경우, 상기 후보물질을 세포 노화 억제제로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

나아가 본 발명은 GIT 단백질 또는 GIT 유전자가 포함된 발현벡터를 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GIT 단백질은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 GIT 유전자는 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명은 GIT의 세포 노화 억제 활성을 최초로 규명한 것으로, βPIX의 발현 감소로 유도된 노화 세포에서 GIT를 과발현시킨 결과, 노화 지표들의 발현이 감소되고 노화로 인한 세포이입의 감소도 억제되는 것을 확인하였고, βPIX의 발현 감소로 인한 세포노화와 관련된 세포부착 및 세포이입과의 관련성도 규명하였다. 따라서 본 발명에 따른 GIT는 세포 노화 억제 활성을 갖는 바, 노화 또는 노화 관련 질환의 새로운 치료제로서 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 노화에 따른 βPIX 의 발현수준 변화를 분석한 결과로서, 1A는 3, 15, 24 개월령의 마우스로부터 수득한 조직(폐, 신장, 비장, 심장 및 피부)을 대상으로 βPIX의 발현수준을 면역블롯팅을 통해 확인한 결과이며, 1B는 각 마우스의 폐조직에 대하여 βPIX 및 p16의 발현 정도를 면역조직화학법으로 확인한 결과이며, 1C는 면역조직화학법 분석에 의한 βPIX 및 p16의 발현수준을 막대그래프로 나타낸 것이고, 1D 및 1E는 젊은 사람 및 고령의 사람으로부터 수득한 폐 조직에서 βPIX 및 p16의 발현 수준을 면역조직화학법으로 확인한 결과 및 각 발현수준을 막대그래프로 각각 나타낸 것이며, 1F는 계대배양을 달리한 HDF 세포를 대상으로 βPIX 및 p16의 발현 수준을 면역블롯팅으로 분석한 것이고, 1G는 SA-β-Gal 활성 어세이 분석 결과를 나타낸 것이며, 1H는 SA-β-Gal 염색을 통해 SA-β-Gal 양성 세포를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 βPIX 의 발현억제에 따른 세포이입(endocytosis) 감소 효과를 확인한 결과로서, 2A는 βPIX에 대한 siRNA가 처리된 HDF 세포에 노코다졸(nocodazole)을 처리한 후, 인테그린 β1 항체를 이용한 염색법을 통해 인테그린 β1의 세포이입 정도를 확인한 사진을 나타낸 것이고, 2B는 인테그린 β1의 세포이입 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이며, 2C는 βPIX에 대한 siRNA가 처리된 HDF 세포로부터 트랜스페린의 세포이입 정도를 형광현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이며, 2D는 트랜스페린의 세포이입 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이고, 2E는 βPIX에 대한 siRNA를 주입한 마우스의 폐 조직에서의 트랜스페린의 세포이입 정도를 공초점 현미경 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이며, 2F는 이를 정량적으로 측정한 결과를 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 βPIX의 발현억제에 의한 세포 노화 시 세포부착 부위에서는 단백질 복합체들의 결합 양상을 확인한 결과로서, 3A는 βPIX에 대한 siRNA가 처리된 HDF 세포주에서 paxillin 및 calpain-2의 결합여부를 면역침강법 및 면역블롯팅을 수행하여 확인한 결과를 나타낸 것이고, 3B는 βPIX 또는 GIT1/2의 발현이 억제된 HDF 세포주에서 paxillin, calpain-2 및 AMPH(amphiphysin)의 결합양상을 확인한 결과를 나타낸 것이며, 3C는 GIT의 발현이 억제된 HDF 세포주에서 AMPH의 절단현상을 확인한 결과를 결과이고, 3D 및 3E는 GIT의 발현이 억제된 HDF 세포주에서 트랜스페린의 세포이입(3D) 정도 및 β1 인테그린의 세포이입(3E) 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 3F는 βPIX의 발현이 억제된 HDF 세포주에서 GIT 및 paxillin의 결합양상을 확인한 결과이고, 3G는 Cy5-표지된 siCtrl 및 siβPIX를 HDF 세포주에 각각 처리한 후, paxillin에 대한 항체 및 GIT에 대한 항체를 이용하여 공초점 현미경 관찰로 GIT 및 paxillin의 세포내 위치를 확인한 결과이며, 3I는 calpain-2 및 paxillin의 세포내 위치를 확인한 결과이고, 3H 및 3J는 세포부착부위(FA)에 위치하고 있는 GIT 및 calpain-2/paxillin를 정량분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 세포부착 단백질 paxillin과 AMPH-I 및 calpain-2의 결합 양상을 분석한 결과로서, 4A는 AMPH-I 및 calpain-2가 paxillin과 결합하고 있음을 면역침강 및 면역블롯팅(anti-calpain 2: 왼쪽, anti-AMPH-I: 오른쪽)으로 확인한 결과이며, 4b는 GST pull down으로 paxillin과 calpain-2의 직접적인 결합을, 4C는 paxillin과 AMPH-I의 직접적인 결합을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 4D는 βPIX의 여부에 따른 세포 부착부위에서의 단백질 복합체의 결합양상의 변화를 모식도로 나타낸 것이다.
도 5는 세포부착 조절 단백질 paxillin에 대해 GIT와 calpain-2의 결합 양상을 분석한 결과로서, 5A는 paxillin에 대한 GIT1 및 calpain-2의 경쟁적 결합양상을 확인한 것으로, Ni2+ 비드가 결합된 paxillin을 GST-calpain2와 반응시킨 후, GST-GIT-CT(C말단) 및 GST의 농도를 달리하여 첨가하면서 이들 단백질들의 결합 정도를 면역블롯팅으로 확인한 것이다. 5B는 siβPIX가 처리된 HDF 세포주에 GFP 또는 GFP-GIT-CT를 렌티바이러스로 감염시킨 다음, GFP-GIT-CT 및 paxillin을 공동 면역침강하여 확인한 결과를 나타낸 것이고, 5C는 siβPIX가 처리된 HDF 세포주에서 세포부착부위(FA)에서의GIT-CT 및 paxillin 단백질의 위치를 공초점 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이며, 5D는 GIT-CT 및 paxillin 단백질의 공동위치 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 5E는 siβPIX를 HDF 세포주에 처리하기 이전에 상기 세포에 lenti-GFP 또는 lenti-GFP-GIT-CT를 처리한 후, 노화지표인 SA-β-Gal 양성 세포수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 GIT-CT(GIT-C 말단)의 과발현에 따른 세포 노화 억제 및 세포 이입 감소 억제 활성을 확인한 결과로서, 6A는 마우스를 대상으로 수행한 실험스케줄을 나타낸 것이고, 6B 및 6B는 siβPIX가 처리된 마우스의 폐 조직에 GFP 또는 GFP-GIT-CT를 발현하도록 한 후, 폐에서의 트랜스페린의 세포이입 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 6D는 면역조직화학염색법으로 세포 노화 지표인 SA-β-Gal 및 p16과 βPIX의 발현 수준을 확인한 사진이며, 6E는 이들 지표의 발현양을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 7은 세포 노화에 있어서 βPIX/GIT 복합체의 기작을 나타낸 것으로, βPIX의 발현 여부에 따른 세포부착 부위(FA)에서의 단백질 복합체들의 결합양상 변화를 종합적으로 모식화하여 나타낸 것으로, 왼쪽 도면은 βPIX/GIT 복합체가 충분히 존재할 때의 양상을 나타낸 것이고, 중간 도면은 βPIX 및/또는 GIT이 고갈될 때, calpain-2는 paxillin에 결합하고 AMPH의 절단이 발생함을 나타낸 것이며, 오른쪽 도면은 βPIX 및/또는 GIT의 고갈에 의해 노화가 진행된다는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에서 GIT1 C-말단을 포함하는 재조합 발현벡터인 pHR-CMV-SV-Puro-GIT1 C-terminus 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

본 발명은 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 단백질의 노화 억제 활성이 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

본 발명자들은 신규한 노화 억제제를 발굴하기 위해 연구하던 중, 노화된 세포에서 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현이 억제되어 있으며, βPIX의 발현 억제에 의해 노화된 세포에 GIT를 과발현시킨 결과, 세포 노화가 억제된다는 것을 최초로 규명하였다.

이와 관련하여 본 발명의 일실시예에 따르면, 노화에 따른 βPIX의 발현수준 변화를 분석하였는데, 3, 15, 24 개월령의 마우스로부터 수득한 폐, 신장, 비장, 심장 및 피부 조직에 대하여 βPIX와 GIT 단백질의 발현수준을 측정한 결과, 젊은 마우스 유래 조직에 비해 늙은 마우스 유래 조직들에서는 모두 βPIX와 함께 GIT 단백질의 발현 수준이 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났고(도 1A 참조), 이와 비례하여 노화 지표인 p16 발현이 증가하는 것을 관찰하였다.

또한, 고령의 노화된 마우스와 사람의 폐 조직 및 노화된 HDF 세포에서는 βPIX의 발현수준이 젊은 폐 조직 및 세포에 비해 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났고, 반면 노화지표들로 알려진 p16의 발현수준은 증가되어 있으며 SA-β-gal (senescence-associated β-galatosidase)의 활성도 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1B~1H 참조). 그러므로 βPIX와 GIT의 발현 변화는 노화와 밀접한 상관성이 있으며, βPIX의 발현 또는 활성 저해가 노화의 주요 원인이라는 것을 알 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는, 세포 노화와 세포 이입(endosytosis)과의 관련성을 분석하였는데, 노화된 세포에서는 인테그린 β1 및 트랜스페린(transferrin)의 세포 이입이 감소되는 것으로 나타났다(도 2 참조). 따라서 βPIX의 발현이 억제되면 노화 지표 인자들의 발현을 증가시키며, 세포 이입의 작용을 감소시켜 노화를 유도시킨다.

또한, 세포 노화는 다양한 기전에 의해 조절되어 지는데, 특히 세포부착(focal adhesion, FA) 부위에서 조절 단백질들의 어셈블리(assembly) 및 디스어셈블리(disassembly)의 정상적인 조절은 세포의 성장과 이동뿐만 아니라 세포 노화에도 관여한다. 따라서 세포부착 조절 단백질과 세포 노화 단백질 간의 상호작용이 노화를 조절할 수 있는 주요한 기전이 될 수 있다.

이에 본 발명에서는 세포부착 단백질인 paxillin과 결합하는 GIT 단백질 및 GIT와 복합체로 작용하는 βPIX에 대한 상호작용 연구를 통해 세포노화를 조절하는데 있어서 GIT의 새로운 용도 및 βPIX 발현 억제에 기인하는 세포 노화의 기전을 규명하였다.

세포 부착 부위에서의 단백질 복합체들의 결합 양상이 세포 노화에 의해 변화되는지를 확인하기 위해, βPIX의 발현 억제로 노화된 세포 및 βPIX이 발현되고 있는 젊은 세포를 대상으로 세포 부착 단백질로 알려진 paxillin 단백질과 단백질 분해효소로 알려진 calpain-2, 세포 이입 조절 단백질로 알려진 amphiphysin-I(AMPH-I) 및 GIT1/2 단백질들의 결합양상을 분석하였다.

그 결과, βPIX의 발현억제는 calpain-2 단백질과 AMPH-I 단백질의 paxillin에 대한 결합을 증진시키는 것으로 나타났고, GIT1/2의 발현을 억제한 경우에서도 paxillin에 대한 AMPH-I 단백질의 결합이 증진되는 것으로 나타났으며 동시에 AMPH-I이 절단되는 현상이 나타났다. 또한 GIT1/2의 발현을 억제하면 트랜스페린 및 β1 인테그린의 세포 이입 현상도 감소되는 것으로 나타났다(도 3A-3F참조). 또한 βPIX의 발현억제는 세포 부착 부위(focal adhesion, FA)로의 GIT와 calpain-2의 이동을 억제함을 관찰할 수 있었다(도 3G-3J참조).

βPIX의 발현이 억제되어 세포의 노화가 유도되면, 세포부착 단백질인 paxillin에 결합하는 단백질의 결합 양상에 변화가 있다는 것을 알 수 있었고, 구체적으로 βPIX 발현이 억제되면 paxillin에 대한 GIT1/2의 결합은 감소되며, calpain-2와 AMPH-I의 결합은 증진되는 것으로 나타났다.

세포 노화 시, 세포 부착부위에서는 paxillin에 대한 calpain-2 및 AMPH-I 단백질의 결합이 증진되는 것을 확인함에 따라 paxillin와 calpain-2 및 AMPH-I 단백질의 결합 부위를 각각 분석하였는데, βPIX의 발현이 억제된 노화 세포에서 paxillin, calpain-2 및 AMPH-I의 3가지 단백질은 서로 결합되어 있음을 확인하였고, 이때 AMPH-I의 N 말단이 paxillin과 직접 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 한편, βPIX의 발현이 충분이 일어나고 있는 젊은 세포에서는 paxillin/GIT/βPIX/calpain-2/AMPH-I의 단백질이 복합체를 형성하여 적절하게 결합되어 있을 것이라는 가설을 설정하게 되었다(도 4D 참조).

나아가, 본 발명자들은 βPIX의 발현 억제로 유도되는 세포 노화 시, paxillin에 대한 GIT 및 calpain-2 단백질의 결합이 서로 경쟁 구도에 있는지 확인하기 위해, paxillin에 결합하는 GIT의 C 말단 및 calpain-2를 박테리아에서 각각 과발현시킨 후, 경쟁적 결합 저해 효과를 분석하였다.

그 결과, GIT-C 말단의 첨가량이 많을수록 paxillin에 결합하는 calpain-2의 결합양이 감소하는 것으로 나타나, GIT 및 calpain-2는 paxillin에 대해 서로 경쟁적 결합 구도를 형성하고 있다는 것을 확인하였다(도 5A 및 5B 참조).

또한, βPIX 발현이 억제된 조건에서도 세포부착 부위에서 GIT-CT (C-말단) 부위는 paxillin과 특이적으로 함께 존재(co-localization)하는 것을 확인할 수 있었고, 특히, βPIX 발현이 억제된 조건에서 GIT-CT의 과발현이 βPIX 발현 억제에 의해 유도되는 세포 노화를 현저하게 감소시킬 수 있다는 것을 SA-β-Gal 염색을 통해 확인할 수 있었다(도 5C-5E 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 GIT를 과발현시키면 βPIX 발현 억제에 의해 유도되는 세포 노화를 억제할 수 있다는 것을 실험을 통해 최초로 확인함에 따라, GIT를 세포 노화의 새로운 억제제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 마우스의 폐 조직을 대상으로 수행한 실험에서도 GIT-CT 부위를 과발현시킨 군이 대조군에 비해 SA-β-Gal 염색과 p16의 발현이 감소되는 것으로 나타났고, 세포 이입의 감소도 억제되는 것으로 나타났다(도 6 참조).

따라서 이러한 결과는, GIT 단백질 또는 GIT의 발현 촉진제는 βPIX 발현 억제에 의해 유도되는 세포 노화를 효과적으로 억제할 수 있는 바, 노화 또는 노화 관련 질환의 새로운 치료제로 사용 가능하다는 것을 의미한다.

본 발명자들의 상기 결과들을 정리하여, βPIX 발현 여부에 의한 세포 부착 부위(FA)에서의 단백질 복합체들의 상호작용에 의한 결합 양상을 분석하였다(도 7). βPIX가 세포에서 충분히 발현될 경우에는 세포부착 부위의 단백질들은 paxillin과 정상적인 결합상태를 유지하여 세포부착과 세포이입을 조절하고 있으나(도 7A), βPIX의 발현이 억제되면 βPIX와 복합체를 형성하는 GIT 단백질이 paxillin으로부터 떨어져 나가고(도 7B), 그 자리에 단백질 분해효소인 calpain-2 결합이 증가하며 calpain-2에 의해 AMPH의 C 말단은 절단되고, AMPH-C 말단의 절단은 세포이입의 감소를 초래하며, 특히 인테그린 신호전달계의 지속적인 활성화를 유도하는 등 세포 노화를 촉진시킨다는 것을 확인하였다(도 7C).

그러므로 본 발명은 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 또는 GIT의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 노화 또는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins)는 GIT1 및 GIT2를 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 여기서 상기 서열번호 1의 아미노산은 GIT1의 전장 단백질의 서열이고, 서열번호 2의 아미노산 서열은 GIT1의 C 말단에 해당하는 서열이며, 서열번호 3의 아미노산은 GIT2의 전장 단백질 서열이고, 서열번호 4의 아미노산 서열은 GIT2의 C 말단에 해당하는 서열이다. 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 GIT1의 C 말단에 해당하는 서열일 수 있다.

또한, 상기 GIT 활성화제는 GIT의 발현 또는 활성을 증진시킬 수 있는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, GIT에 특이적인 단백질, 화합물 또는 핵산일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 GIT의 발현 증진을 위해 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 GIT 유전자가 삽입된 발현 벡터를 사용하여 GIT의 과발현을 유도하였다.

상기 서열번호 5의 염기서열은 GIT1의 전장 DNA 서열이고, 서열번호 6의 염기서열은 GIT1의 C 말단에 대한 염기서열이며, 서열번호 7의 염기서열은 GIT2의 전장 DNA 서열이고, 서열번호 8의 염기서열은 GIT2의 C 말단에 해당하는 염기서열이다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 벡터는 이에 제한되지는 않으나, 당업계에 공지된 플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 또한 본 발명에서 상기 GIT를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있는데, GIT를 암호화하는 염기서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

바람직하게 상기 GIT 활성화제는 GIT 유전자가 삽입된 발현 벡터일 수 있고, 더욱 바람직하게는 GIT유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명의 상기 렌티바이러스 벡터는 GIT 단백질을 코딩하는 GIT 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결된"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 말하며, 용어 "프로모터"는 특정 서열과 연결된 경우 특정 뉴클레오티드 서열이 mRNA로 전사되는 것을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 통상적으로, 프로모터는 모든 경우에 적용되는 것은 아니나 mRNA로 전사될 목적하는 뉴클레오티드 서열의 5' (즉, 상류)에 존재하고 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 개시를 위한 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다.

본 발명의 프로모터는 구성적이거나 조절가능한 프로모터를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 구성적 프로모터이다. 프로모터와 관련하여 사용되는 용어 "구성적"은 프로모터가 자극 (예, 열 쇼크, 화학물질 등) 없이도 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 반면, "조절 가능한" 프로모터는 자극 (예, 열 쇼크, 화학물질 등)이 존재하는 경우 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 자극 없는 경우와 구별되게 지시할 수 있는 프로모터를 의미한다.

또한 상기 벡터에는 추가로 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 형광 단백질은 형질도입된 세포 또는 조직에서 목적하는 유전자의 발현 여부를 검출할 수 있는 목적을 위한 것일 수 있고, 세포나 조직에서 발현되었을 때, 형광을 낼 수 있는 단백질이라면 모두 사용가능하며, 특별히 한정하지 않으나, 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 치료란 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 질환은 노화 또는 노화 관련 질환일 수 있고, 상기 질환은 βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 억제로 유발되는 노화 및 상기 노화의 진행에 의해 발병될 수 있는 노화 관련 질환일 수 있다.

상기 노화 관련 질환은 이에 제한되지는 않으나, 죽상경화, 피부노화, 골다공증, 류마티스 골관절염, 퇴행성 골관절염, 탈모증, 주름 및 곱사등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 SA-β-갈락토시다아제 활성 억제; p16의 발현 억제; 및 세포 노화에 의한 세포 이입(endocytosis) 감소 억제활성을 통해 노화 또는 노화 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한 본 발명은 GIT(G-protein-coupled receptor (GPCR) kinase-interacting proteins) 또는 GIT의 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 세포 노화 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

앞서 기술한 바와 같이, GIT의 발현 수준을 세포 또는 조직에서 증가시킬 경우, 노화를 억제시킬 수 있음을 확인하였다.

또한 본 발명은 세포 노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은, 생물학적 시료에 임의의 후보물질을 처리하는 단계; 상기 생물학적 시료로부터 GIT 단백질 또는 GIT 유전자의 발현수준을 검출하는 단계; 및 상기 발현수준을 임의의 후보물질을 처리하지 않은 대조군에서의 동일 유전자 또는 동일 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

상기 방법에서 후보물질을 처리한 군이 대조군에 비해 GIT 단백질 또는 GIT 유전자의 발현수준이 증가된 경우, 상기 후보물질을 세포 노화 억제제로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

여기서 상기 생물학적 시료는 조직 또는 세포일 수 있다.

상기 GIT 단백질의 발현수준을 검출 또는 측정하는 방법은, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블랏(면역블롯팅), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 또는 단백질칩(protein chip)을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 GIT 유전자의 발현 수준 측정은, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법 또는 노던 블랏을 이용하여 수행할 수 있다.

나아가 본 발명은 GIT 단백질 또는 GIT 유전자가 포함된 발현벡터를 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포 노화 억제 방법을 제공할 수 있다.

즉, 상기 조직 또는 세포에 GIT 단백질 또는 GIT 유전자가 포함된 발현벡터를 도입시켜, GIT의 발현증가를 통해 세포의 노화를 억제할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 준비예 >

시약 및 실험방법

하기 실시예들의 실험에서 사용한 시약들 및 실험방법은 다음과 같다.

시약준비

인비보펙타민(Invivofectamine), 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000), DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium), FBS(Fetal Bovine Serum), OPTI-MEM, Alexa Fluor 594접합된 트랜스패린 및 Alexa Fluor접합된 2차 항체들은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)에서 구입하여 사용하였다.

p16 and p53을 위한 shRNA 렌티바이러스는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)로부터 구입한 것을 사용하였으며, amphiphysins, si-rPIXs 및 GIT-CT를 위한 렌티바이러스는 성 박사(KRIB, Cheongju, Korea)로부터 제공받아 사용하였다. 또한, GFP (LVP690) 및 GFP-βPIX (LVP718951)을 위한 렌티바이러스는 Abm Inc (Richmond, Canada)로부터 구입하여 사용하였다.

Calpain 억제제 II (ALLM), SA-β-gal 염색용액 및 다른 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하여 사용하였다.

재조합 paxillin-His 단백질은 RayBiotech (Peachtree Corners, GA)에서 구입하여 사용하였다.

인간 염증 항체 어레이는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하여 사용하였다.

GIT1(SI02224467) 및 GIT2(HSS114794)에 대한 siRNA들은 Qiagen (Germantown, MD)에서 구입하여 사용하였고, βPIX, calpain-2 및 siFAK에 대한 siRNA들은Thermo Fisher Scientific 및 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

또한, 하기 실험에서 사용한 siRNAs의 서열들은 다음과 같다.

siPIX1: 5′-UCAACUGGUAGUAAGAGCAAAGUUU-3'

siPIX2: 5′-UUGAGCUGCAGAUCCUGACGGAAGC-3'

siCtrl: 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3'

hCalpain-2:5′-GGCAUUAGAAGAAGCAGGUUU-3'

siPIXr1: 5-ACUGGUAGUACGAGCCAAGUU-3'

siPIXr2: 5-GGAGGAUUAUGAUCCUGAUAG-3'

siPIXm1: 5′-CCAACUGGUAGUACGAGCCAAGUUU-3'

siPIXm2: 5′-GAGGACCUAGGAGAGUUCAUGGAAA-3'

siFAK: 5′-AACCACCUGGGCCAGUAUUAU-3'

실험동물준비

실험에 사용한 동물들은 충북대학교 동물실험 윤리심의위원회 (CBNUA-901-15-01)가 정한 승인된 동물 프로토콜 및 지침에 따라 모든 실험을 수행하였다. 마우스는 다한바이오링크(서울)에서 입수하여 사용하였다.

조직샘플준비

충북대학교 병원(청주시)에서 수술을 받은 기흉 환자에서 채취한 폐 세포 및 폐 조직을 사용하였다. 또한 상기 환자들은 폐에 다른 병리를 보이지 않았으며, 모든 연구는 충북대학교 병원임상 시험심사위원회(2014-02-009-009)의 검토와 승인 하에 수행하였다.

항체준비

Anti-pFAK (Y576) (#3281, 1:500), FAK (#3258, 1:1,000 for immunoblotting/1:200 for immunohistochemistry), p53(#2524, 1:1,000), pp53 (S15) (#9284, 1:500), pPAK1(T423) (#2610, 1:500), ppaxillin (Y118) (#2541, 1:500), 및 pγH2AX (S139) (#9713, 1:200) 항체들은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)로부터 구입하여 사용하였다. 또한, Anti-pFAK (Y397) (611806, 1:500), paxillin(610051, 1:1,000 ), GIT2 (P94020, 1:1,000), Cdk2 (610145, 1:500), Cdk4 (610147, 1:500), Cyclin D (610279, 1:500), Cyclin E (551159, 1:500), pRB (610884, 1:500), ppRB (610490, 1:500) 및 p19(610530, 1:500) 항체들은 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 구입하여 사용하였다. calpain-2 (sc-373966, 1:1000) 및 4(sc-30065, 1:1,000), p16(sc28260, 1:500 < immunoblotting 분석용>/1:200 <immunohistochemistry 분석용>), p21 (sc-6246, 1:500), GIT1 (sc-9657, 1:500) 및 amphiphysin I (sc-376402 및 sc-39028, 1:1,000)에 대한 항체들은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)로부터 구입하여 사용하였다.

또한, GFP (NB600-308, 1:1,000 <immunoblotting 분석용>/1:200 < immunohistochemistry 분석용>) 항체는 Novus Biologicals (Centennial, CO)에서 구입하여 사용하였다. 활성형 integrin β1 (MAB2079Z, 1:50) 및 GST (A00895, 1:1,000) 항체들은 Merck Millipore (Burlington, MA) 및 Genscript (Piscataway, NJ)에서 각각 구입하여 사용하였다. Anti-β1 integrin 항체 (ab30394, 1: 50) 및 6xHis-tag (ab18184, 1:1,000) 항체들은 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하여 사용하였다. Anti-βPIX 항체(1: 1,000 <immunoblotting 분석용>/1: 200 < immunohistochemistry 분석용>)는 βPIX의 C-terminal 부위(439~648 aa)에 대한 항체를 사용하였다.

플라스미드 및 DNA 구조물

βPIX 구조물(βPIX constructs), si-rPIX (WT) 및 si-rPIX (DHmt)은 렌티바이러스 발현을 위해 pHR-CMV SV40에 클로닝 하였다. si-rPIX (WT) 및 si-rPIX의 변이체의 제조는 QuickChange II site-directed mutagenesis kit (Agilent)를 이용하여 제조하였다. Amphiphysin I에 대한 N-말단 (NT, aa 1~351) 및 C-말단 (CT, 346~695) 부위와 calpain-2는 pGEX4T-1에 클로닝하였다. Amphiphysin I에 야생형(WT) 및 돌연변이체(MT (V392G))는 렌티바이러스 발현을 위해 pHR-CMV SV40로 클로닝하였다. Calpain-2는 pGEX4T-1로 클로닝하였다. Calpain-2 cDNA는 OriGene에서 구입하여 사용하였다. GIT1 C-말단 (CT, aa 376-770)은 박테리아에서의 발현을 위해 pGEX4T-1 벡터에 클로닝하였고, 렌티바이러스에서의 발현을 위해 pHR-CMV SV40 벡터로 각각 클로닝하였다. 본 발명에서 GIT1 C-말단을 포함하는 재조합 발현벡터ㅇ인 pHR-CMV-SV-Puro-GIT1 C-terminus 벡터의 개열지도는 도 8에 나타내었다.

siRNA , 렌티바이러스 또는 트랜스페린(transferrin)의 in vivo로의 전달

동물 마우스에 avertin(2-2-2 트리브로모 에탄올, 체중 0.45 mg/g의 체중)을 복강내 주사하여 마우스를 마취시키고 마우스의 앞니를 플랫폼 상의 바에 고정시켰다. 블런티드 바늘이 구비된 1 인치, 22 게이지의 Safelet IV 카테터는 기관지(trachea)에서 방출되는 백색광을 찾을 수 있도록 입 안쪽에 위치시켰다. 기관지에 위치한 카테터를 확인 후, 카테터로부터 바늘을 제거하였다. 이후 InvivofectamineRNAi 복합체(75μl liposomes)는 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였고, 렌티바이러스 입자 또는 Alexa Fluor 594-트랜스페린을 카테터의 개구부에 직접적으로 피펫팅하여 siRNA, 렌티바이러스 또는 트랜스페린(transferrin)을 in vivo로 전달하였다.

세포배양

HDF(human diploid fibroblast) 세포 및 293 T 세포들은 10% FBS 및 항생제가 포함된 DMEM(Dulbeccos’ modified Eagle’s medium) 배지에서 37°C 및 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다.

β- galactosidase (SA-β-gal) 어세이

노화 관련 β- 갈락토시다제 (SA-β-Gal) 활성 측정은 pH 6.0의 조건에서 Proc Natl Acad Sci USA 92, 9363-9367 (1995)에 기재된 방법을 조금 변형하여 수행하였다. 구체적으로, 세포를 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 5분 동안 3% 포름알데히드로 고정시킨 다음 PBS로 세척하였다. 이후 세포를 37 ℃에서 13-14 시간 동안 SA-β-gal 염색용액(Sigma-Aldrich)에서 배양한 후, 30분 동안 Hoechst 33258로 염색하여 세포수를 세었다. 세포 노화는 총 세포수에 대한 SA-β-gal- 양성 세포(청색 염색)의 백분율로 계산하였고, 조직의 경우, 동물을 마취시키고 식염수로 관류시킨 다음, 조직을 액체 질소에서 급속 냉동시키고 OCT 화합물로 임배드시켰다. 이후 조직을 즉시 10 μm의 두께로 절단하였고, 1% 포름알데히드가 함유된 PBS 용액으로 고정시킨 다음, PBS로 세척하고, 37℃에서 13-14 시간 동안 SA-β -gal 염색 용액에서 배양하였다. 이후, 핵은 사프라닌-O로 염색하고 Vectashield 마운팅 배지(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)로 분석하였다.

인비트로 결합 어세이

GST- 태깅 또는 6xHis- 태깅된 단백질을 각각 글루타티온 또는 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 단백질은 실온에서 30 분 동안 결합 완충액(20 mM Hepes, pH7.4, 0.15 M NaCl, 1 mM DTT, 0.2% Triton X-100, 5 μM MgSO4, 및 프로테아제 억제제(protease inhibitor))에서 반응시켰다. 비드를 결합 완충제로 5회 세척한 다음 SDS-PAGE에 전기영동한 후, 항체들을 이용하여 면역 블롯팅을 수행하였다.

국소접착 분석(Focal adhesion analysis)

HDF 세포를 피브로넥틴으로 코팅된 커버 슬립 상에 플레이팅 하였다. 1 일 후, 세포를 siRNA로 형질 감염시켰고, 이후 대조군 또는 RGD 펩티드로 3일 동안 처리하였다. 이후 paxillin 및 Alexa Fluor 568-Phalloidin에 대한 항체로 염색하였다. FAs는 쿨 CCD 카메라인 Cascade 512B(Photometrics)가 장착된 Olympus FluoView FV1000 또는 1 x 81-ZDC 도립 현미경(일본 올림푸스)을 이용하여 관찰하였다. FA 번호 및 액틴 강도는 Image J 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

일시적 형질감염(Transient transfection )

DNA 또는 siRNA를 이용한 형질감염은 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 또는 Lipofectamine RNAiMAX 형질감염 시약을 사용하여 수행하였다. 세포를 피브로넥틴으로 코팅된 플레이트 또는 유리 커버 슬립에 분주한 후, 지시된 DNA로 형질 감염시킬 경우에는 1일 동안 수행하였고, siRNA로 형질 감염시킬 경우에는 3-4 일 동안 수행하였다.

면역조직화학( Immunohistochemistry )

조직을 10 % 중성 완충 포르말린으로 고정시키고, 탈수시킨 후 파라핀에 포매시켰다. 포르말린으로 고정된 파라핀 포매된 조직 블록들을 섹션화 시켰다(두께 4㎛). 이후 탈파라핀화 시키고, 슬라이드는 압력 밥솥(Decloaking chamber; Biocare Medical)을 사용하여 10mM 시트르산 나트륨 완충액 (pH 6.0)에서 10 분 동안 항원 검색 절차를 거친 다음, 차단 용액(0.3% Triton X-100, 1% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20, 0.1% cold-water fish gelatin 및 0.05% sodium azide in PBS)으로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체들은 상기 각 섹션들과 함께 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 이후 0.1% Tween 20, 0.1% BSA가 함유된 PBS로 5회 세척하였고, 각 슬라이드들은 Alexa Fluor-접합된 2차 항체 (1:200)로 암실에서 상온의 온도로 1시간 동안 반응시켰다. 이후 여러차례 세척을 진행하고 슬라이들은 Hoechst 33258로 염색하였고, Vectashield 마운팅 매체(Vector Laboratories, Inc)로 분석하였다. DAB(diaminobenzidine-HCl) 염색을 위해 슬라이드를 0.3% 과산화수소가 함유된 메탄올을 이용하여 상온에서 20분동안 반응시켜 블록킹 용액을 처리하지 전에 내재적인 퍼옥시다제의 활성을 차단시켰다. 이후 슬라이드를 비오틴-결합 이차 항체로 상온에서 30분 동안 반응시키고 최종적으로 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘으로 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 퍼옥시다제 활성은 DAB를 기질로 하여 측정하였고, 음성 대조군으로는 1차 항체를 처리하지 않은 TBS 용액만을 처리한 섹션을 사용하였다. 조직학적 분석을 위해 섹션을 H & E로 염색하였다.

면역세포화학( Immunocytochemistry )

세포를 3.7 % 파라포름알데히드로 15 분 동안 고정시키고, 0.2% Triton X-100으로 5분 동안 투과시키고, 2% BSA가 함유된 PBS로 25℃에서 30 분 동안 블록킹시켰다. 항원 염색을 위해, 세포를 1차 항체로 25 ℃에서 1 시간 동안 반응시키고, 이후 2차 Alexa Fluor- 접합된 항체로 1시간 동안 반응시켰다. F-액틴의 가시화를 위해 세포를 25℃에서 30분 동안 Alexa Fluor 568- 접합된 phalloidin로 염색 하였고, 염색된 단백질의 발현은 MetaMorph 소프트웨어 버전 7.1.7 (Molecular Devices)로 분석하였다.

면역블롯팅 ( Immunoblotting ) 및 면역침강법 ( immunoprecipitation )

세포를 차가운 용해 완충액(50mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1 % 트리톤 X-100, 500μM EDTA, 200μM 피루브산 나트륨, 50mM β- 글리세로 포스페이트)으로 용해시키고, 상층액을 1차 항체로 4 ℃에서 18 시간 반응시켜 면역침강을 수행하였다. 면역 침전물들을 8-10 % SDS-PAGE로 전기영동하고, 트리스-글리신-메탄올 완충액(25 mM Tris base, 200 mM glycine and 20% methanol) 상에서 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 이후 막은 3 % BSA가 함유된 Tris- 완충 식염수 (TBS-T; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween-20)를 이용하여 30분 동안 블록킹 시켰고, 1 차 항체로 상온에서 1 시간 반응시킨 다음, TBS-T로 3회 세척 하였다. 이어 막을 2차 horseradish peroxidase접합된 항체를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고 TBS-T로 3 회 세척한 후, 강화 화학 발광 시약을 사용하여 신호를 검출하였다.

트랜스페린 세포이입 ( Transferrin endocytosis )

세포를 20mM 글루코스 및 1% BSA를 함유하는 차가운 생세포 이미지 용액 (LICS : 140mM NaCl, 20mM HEPES, 2.5mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1.0mM MgCl2, pH 7.4)으로 아이스 상에서 10 분 동안 처리하였다. 세포에 20mM 글루코스 및 1 % BSA를 함유하는 LCIS 용액과 20㎍/ml Alexa Fluor 594- 트랜스페린을 함께 처리하고 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 세척하고,4 % 파라포름알데히드로 10 분 동안 고정시켰다. 마우스의 폐에서 트랜스페린 엔도사이토 시스를 분석하기 위해, 0.1 μM Alexa Fluor 594-Transferrin을 카테터의 개구부에 직접 삽입하여 기관지 내 전달시켰다. 1 시간 후, PBS로 동물의 심장을 관통하도록 관류시켰다. 조직을 절개하고 액체 질소에서 냉동 동결시킨 다음 즉시 동결 마이크로톰으로 10μm 두께를 갖도록 슬라이스하고, 10 분 동안 차가운 아세톤으로 고정시켰다. 슬라이스된 각 섹션들은 DAPI (10 μg / ml)로 염색하여 핵을 표지하도록 하였고 Vectashield 장착 매체를 이용하여 마운팅하였다. 세포내 이입된 트랜스페린(Endocytotic transferrin)은 Olympus FluoView 공초점 현미경 (FV10i, Olympus, Japan) 또는 형광 현미경 (DP30BW, Olympus, Japan)으로 관찰하였고 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어로 분석하였다.

인테그린 β1 세포이입

기근 상태의 세포를 20분 동안 10μM의 노코다졸(nocodazole)로 전처리하고 37℃에서 40 분 동안 항-활성형 β1 인테그린 항체(1 : 200)를 처리하여 반응시켰다. 이후 결합되지 않은 항체 및 노코다졸을 PBS로 세척하고, 60분 동안 추적을 수행하였다. 이후 세포를 따뜻한 PBS로 세척하고, 산 린스(acid rinse; 0.5 % 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 3.0)로 표면 항체를 제거하였다. 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고 0.2 % 트윈 20으로 투과시켰다. 내재화된 β1 인테그린은 Alexa Fluor- 접합된 이차 항체 (1 : 200)로 1시간 동안 반응시키고 분석하였다.

GST - PBD 풀다운 어세이 ( GST - PBD pulldown assay)

글루타티온-세파로스가 결합된 GST-PBD 단백질을 siRNA가 처리된 세포 용해물과 함께 실온에서 20 분 동안 반응시키고, PBS로 5회 세척하였다. GST-PBD 세파로스 비드를 12% SDS-PAGE에 전기영동시킨 후, PVDF 막으로 옮기고 항체를 이용하여 면역 블롯팅을 수행하였다.

통계처리

모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표현하였다; 적어도 3 개의 독립적인 실험으로부터의 대표 데이터가 분석되었다. 통계적 유의성은 Windows 용 Sigma Plot (버전 12)을 사용하는 Student 's t-test, WilcoxonMann-Whitney test 또는 One Way ANOVA에 의해 평가되었다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

< 실시예 1>

노화된 조직 및 세포에서 βPIX의 발현수준 분석

본 발명자들은 노화 과정에 따른 βPIX 단백질의 발현수준에 변화가 발생하는지 확인하기 위해, 3, 15, 24 개월령의 노화가 진행되는 마우스로부터 폐, 신장, 비장, 심장 및 피부 조직을 수득한 후, 이들 조직에서의 βPIX와 GIT 단백질의 발현 수준을 면역블롯팅을 통해 확인하였다. 그 결과, 늙은 마우스의 조직(폐, 신장, 비장, 심장 및 피부)에서 βPIX와 GIT 단백질의 발현수준은 젊은 마우스의 조직에 비해 현저히 감소되어 있고, 노화 지표인 p16의 발현은 증가되는 것으로 나타났다(도 1A 참조).

또한, 이를 더 구체적으로 확인하기 위해, 젊은 마우스(3 개월령)와 늙은 마우스(24 개월령)의 폐 조직으로부터 βPIX와 노화지표로 알려진 p16 단백질의 발현을 면역화학조직염색법으로 분석한 결과, 늙은 마우스의 폐에서는 βPIX의 발현이 젊은 마우스에 비해 현저하게 감소되어 있고, 반면 노화의 지표인 p16의 발현은 늙은 마우스에서 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1B 및 1C 참조). 이러한 결과는 젊은 사람의 폐(10대)와 고령의 사람(70대)으로부터 수득한 폐 조직을 대상으로 βPIX 및 p16 단백질의 발현수준을 면역조직화학염색법으로 분석한 결과에서도 동일한 결과를 얻을 수 있었는데, 고령 사람의 폐 조직에서 βPIX 의 발현이 감소되어 있고 반면 p16 단백질의 수준은 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1D 및 1E).

뿐만 아니라, 이러한 결과가 조직이 아닌 세포에서도 동일하게 나타나는지 확인하기 위해, 젊은 HDF 세포 (young passage human dermal fibroblasts cell) 및 노화된 HDF 세포(old passage human dermal fibroblasts cell)에서의 βPIX와 p16 발현 수준을 측정하였는데, 그 결과, 노화된 HDF 세포에서 βPIX의 발현이 젊은 HDF 세포에 비해 감소된 것으로 나타난 반면, p16의 발현은 증가되어 있는 것으로 나타났고, 노화의 또 다른 지표로 알려진 SA-β-gal(senescence associated-β-galactosidase) 역시 노화된 HDF 세포에서 활성이 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1F~1H 참조).따라서 노화가 진행됨에 따라 βPIX 뿐만 아니라 GIT 단백질의 발현이 감소된다는 것을 알 수 있었고, βPIX-GIT의 발현 감소가 노화를 밀접한 관련이 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

βPIX의 발현 억제에 따른 인테그린 β 1 및 트랜스페린의 세포이입 감소

실시예 1에서 확인한 바와 같이, 노화가 일어나면 βPIX의 발현이 감소됨을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 βPIX의 발현 감소에 따른 노화 기전으로 세포이입(endocytosis)의 작용이 감소되는지를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.

즉, βPIX 발현 억제 시 세포부착을 조절하는 integrin β1의 세포이입에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 피부섬유아세포 (HDF)에 βPIX에 대한 siRNA와 노코다졸(nocodazole)을 처리하여 배양한 후, 활성형 integrin β1의 항체로 반응시킨 후, integrin β1 항체를 이용한 염색방법을 통해 세포내 이입된 integrin β1을 분석하였다.

또한, βPIX 발현 억제 시 트랜스페린의 세포이입에 미치는 영향을 분석하기 위해, 피부섬유아세포 (HDF)에 βPIX에 대한 siRNA을 처리한 후, Alexa Fluor 594-트랜스페린의 세포내 이입(endocytotic transferrin) 정도를 분석하였다. 또한 βPIX에 대한 siRNA을 처리한 마우스의 폐 조직을 대상으로 Alexa Fluor 594-Transferrin의 폐 소기관지에서의 endocytosis를 분석하였다.

이때 사용한 βPIX 발현 억제를 위해 사용한 siRNA는 다음과 같다.

siPIX1: 5′-UCAACUGGUAGUAAGAGCAAAGUUU-3’

siPIX2: 5′-UUGAGCUGCAGAUCCUGACGGAAGC-3’

siCtrl: 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3’

siPIXm1: 5′-CCAACUGGUAGUACGAGCCAAGUUU-3’

siPIXm2: 5′-GAGGACCUAGGAGAGUUCAUGGAAA-3’

분석 결과, HDF 세포주를 대상으로 세포 부착을 조절하는 integrin β1의 세포이입을 확인한 결과, βPIX의 발현이 억제된 군에서 βPIX의 발현을 억제하지 않은 군(siCtrl 처리군)에 integrin β1의 세포이입이 비해 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났고(도 2A 및 2B 참조), 대표적인 세포이입 지표 단백질인 transferrin의 세포이입도 βPIX의 발현을 억제한 군에서 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 2C 및 2D 참조). 이러한 결과는 βPIX의 siRNA가 주입된 마우스의 폐 조직에서도 동일한 결과를 보였는데, βPIX의 발현이 억제된 조직에서 transferrin의 세포이입이 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 2E 및 2F 참조). 따라서 이러한 결과들을 통해, βPIX의 발현 억제가 노화를 촉진할 수 있으며, 노화가 일어나면 세포이입의 작용이 감소한다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

βPIX의 발현 억제 시 유도되는 GIT와 세포부착 부위 단백질들간의 상호작용 분석

βPIX에 대한 siRNA 처리로 βPIX의 발현이 억제되어 노화된 세포를 대상으로, 세포부착(focal adhesion, FA) 부위에서의 관찰되는 단백질들의 변화를 관찰하기 위해 대표적인 세포부착 조절 단백질인 paxillin 항체로 면역침전(immunoprecipitation)을 수행하여 노화된 세포에서의 paxillin 단백질 복합체의 변화를 분석하였다.

그 결과, βPIX 발현억제에 의해 노화된 세포에서는 calpain-2 라는 단백질 분해효소와 세포이입 조절 단백질인 AMPH-I(amphiphysin-I)이 paxillin에 대한 결합이 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 3A와 3B 참조). 또한 βPIX와 복합체를 형성하여 작용하는 GIT1/2 단백질의 발현을 GIT1/2에 대한 siRNA의 처리로 억제하였을 때도 paxillin에 대한 AMPH의 결합이 증가되는 것으로 나타났고, 또한 AMPH-I이 절단되는 것을 관찰 하였다(도 3C 참조).

뿐만 아니라 GIT1/2에 대한 특이적인 siRNA를 처리하여 GIT1/2의 발현을 억제하였을 때, 트랜스페린(transferrin) 및 인테그린(integrin) β1의 세포이입( endocytosis)이 감소되는 것으로 나타났고(도 3D 및 3E 참조), βPIX 발현이 억제된 세포 노화 조건에서 세포부착 단백질인 paxillin에 결합하는 GIT1/2가 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 3F 참조).

또한 본 발명자들은 βPIX의 발현 억제로 노화된 세포에서 세포부착 단백질인 paxillin 단백질의 위치와 GIT1/2 단백질의 위치 변화가 있는지 확인하기 위해 HDF 세포주에 Cy5-표지된 siCtrl(대조군) 및 siβPIX을 각각 처리한 후, 각 세포들을 paxillin에 대한 항체, GIT에 대한 항체 및 calpain-2에 대한 항체를 이용하여 염색한 후 세포부착 부위(FA)에서 각 단백질의 위치를 공초점 현미경을 통해 관찰하였다.

그 결과, βPIX의 발현 억제로 노화된 세포는 세포부착 부위(FA)에서 paxillin-GIT 복합체의 co-localization은 감소되지만, paxillin-calpain-2 복합체의 co-localization은 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 3G~3J 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 세포 노화가 일어나면 세포 부착부위에서는 단백질 복합체 및 단백질의 위치에 변화가 생긴다는 것을 알 수 있었고, 특히 βPIX의 발현 억제로 노화된 세포의 경우, 세포부착 단백질인 paxillin과 GIT1/2의 결합은 감소되고, 반면 calpain-2 및 AMPH의 결합은 증가된다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

세포부착 단백질 paxillin과 AMPH -I( amphiphysin -I) 및 calpain -2의 결합 양상 분석

세포부착 단백질 paxillin과 AMPH-I 및 calpain-2의 결합 양상을 분석하기 위해, 먼저 HDF 세포에서 calpain-2 항체와 AMPH-I 항체를 이용하여 각각 면역침전을 한 후, paxillin을 포함한 각 단백질의 결합 양상을 면역블롯팅으로 분석하였다. 그 결과, paxillin과 AMPH-I 및 calpain-2의 3가지 단백질은 서로 결합된 복합체로 존재하고 있는 것으로 나타났다(도 4A 참조).

이에 본 발명자들은 이러한 결과를 보다 구체적으로 확인하기 위해 박테리아에서 과발현시킨 paxillin과 calpain-2의 결합 여부를 GST pull-down 방법을 수행하여 분석하였는데, 그 결과, paxillin과 calpain-2이 서로 결합되어 있음을 확인하였고(도 4B 참조), 또한, paxillin에 대한 AMPH-I의 결합부위를 확인하기 위하여 AMPH-N-말단(N-terminus, NT) 및 AMPH-C-말단(C-terminus, CT) 부위를 과발현시킨 후, GST pull-down 방법을 수행하여 확인한 결과, AMPH-I는 paxillin과 AMPH-N 말단을 통해 직접 결합하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 4C 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 세포부착 부위에서 βPIX의 발현 여부에 따라 paxillin과 결합하는 단백질들의 양상에 변화가 있음을 알 수 있었고, 상기와 같은 결과를 토대로 도 4D와 같은 세포 내 단백질들의 결합 양상 모식도를 도출할 수 있었다.

즉, βPIX가 세포 내에서 충분히 발현되는 노화가 일어나지 않은 세포에서는 paxillin/GIT/βPIX/calpain/AMPH가 서로 적절히 결합된 복합체를 형성하고 있으며, 노화가 진행됨에 따라 βPIX의 발현이 감소하면 βPIX와 함께 GIT가 세포부착 부위의 paxillin으로부터 떨어져 나오고, 그 자리에 더 많은 calpain-2와 AMPH-I 단백질이 결합하여 paxillin/calpain/AMPH의 복합체가 형성되고, 이 때 calpain-2는 AMPH-I을 절단함으로써 인테그린 β1 및 트랜스페린과 같은 clathrin-dependent endocytosis를 억제하여 세포의 노화를 유도할 수 있다는 것을 예측할 수 있었다. 또한 이러한 결과로 βPIX가 발현되는 경우에는 GIT와 calpain-2가 paxillin에 대한 결합 부위를 두고 서로 경쟁하고 있음을 알 수 있었다(도 4D).

< 실시예 5>

세포부착 조절 단백질 paxillin에 대한 GIT와 calpain -2의 결합 양상 분석

βPIX 단백질의 발현 양에 따라 세포부착 조절 단백질 paxillin에 대해 GIT와 calpain-2의 결합이 조절되는 가를 관찰하기 위해 세 단백질간의 경쟁적 결합 특성를 분석하였다. Paxillin 결합 부위로 알려진 GIT1-C-말단 (GIT-CT, 아미노산 376-770번)과 calpain-2를 박테리아에서 각각 과발현시킨 후, Ni2+ 비드가 결합된 paxillin을 GST-calpain-2와 반응시킨다. 이때 GST-GIT1-CT 단백질을 0, 1, 3, 10 ug으로 농도를 증가시키면서 첨가하였을 때 paxillin에 결합한 GST-calpain-2의 양 변화를 면역블롯팅으로 확인하였다. 그 결과, 첨가하는 GST-GIT-CT 단백질의 양이 증가할수록 paxillin에 결합하는 calpain-2의 결합양은 감소하는 것으로 나타났고, 대조군으로 증가된 농도의 GST 단백질을 첨가한 경우 결합의 차이는 관찰할 수 없었다(도 5A 참조).

또한, HDF 세포주에 βPIX의 siRNA을 처리하여 βPIX의 발현을 억제시킨 조건에서, GFP 및 GFP-GIT-CT 과발현시키고, paxillin에 대한 항체를 이용하여 공동 면역침강을 수행한 후, 면역블롯팅을 통해 paxillin과 GIT-CT과 직접 결합함(도 5B 참조)과, 세포부착 부위(FA)에서 GIT-CT 부위가 paxillin과 특이적으로 함께 존재(co-localization)하고 있음을 확인하였다(도 5C 및 5D 참조). 뿐만 아니라, βPIX의 발현이 억제된 HDF 세포에 GIT-CT의 과발현을 유도하면 βPIX의 발현 억제에 의해 증가하는 노화 지표인 SA-β-gal 활성 증가가 현저히 감소하는 것으로 나타났다(도 5F 참조).

이러한 결과는 GIT의 과발현을 통해 βPIX 발현 감소에 의해 유도되는 세포노화를 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.

< 실시예 6>

동물모델에서 GIT의 과발현에 따른 세포노화 및 세포이입 감소 억제 효과 분석

GIT를 과발현시킬 경우, 세포 노화의 억제 가능성을 실시예 5의 in vitro 세포 실험을 통해 확인하였다. 이에 본 발명자들은 GIT의 과발현에 따른 세포노화 억제 및 세포이입 감소억제 활성을 in vivo에서 마우스를 대상으로 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 GFP-GIT-CT 유전자 및 GFP(대조군)를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 각각 제조한 후, 이를 마우스의 폐에 각각 주입한 다음, 1주일 후 siβPIX 및 siCtrl를 처리하고 siRNA 처리 후 4주 후에 마우스의 폐 조직을 대상으로 세포노화 정도 및 세포 이입 정도를 분석하였다. 상기와 같은 실험스케줄은 도 6A에 모식도로 나타내었다.

분석 결과, βPIX 발현의 억제에 의해 노화된 마우스 폐 조직에서 일어나는트렌스페린의 세포이입 감소는 GFP-GIT-CT의 과발현에 의해 현저히 억제되는 것으로 나타났고(도 6B 및 6C 참조), 세포 노화 지표인 SA-β-Gal 및 p16의 발현 수준 측정 결과, 이들 노화 지표들의 발현도 GFP-GIT-CT를 과발현시킨 군에서 대조군에 비해 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 7D 및 7E 참조).

< 실시예 7>

βPIX 발현 감소에 의해 유도된 노화 조절 기전 확인

따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 βPIX가 충분히 존재할 때, 즉 세포 노화가 진행되지 않는 조건에서는 세포부착 부위의 단백질들은 paxillin과 정상적인 결합상태를 유지하여 세포부착과 세포이입을 조절하고 있음을 알 수 있었다. 그러나 노화에 의해 βPIX의 발현이 감소되면, βPIX와 함께 복합체를 형성하는 GIT 단백질이 세포부착 부위에서 떨어져 나가고, 그 자리에 단백질 분해효소인 calpain-2 결합이 증가하고 이로 인해 AMPH-I을 절단하게 된다. AMPH-I의 절단은 세포이입의 감소를 초래하게 되고, 특히 인테그린 신호전달계의 지속적인 활성화를 유도하고, 이 과정에서 세포노화가 촉진된다는 것을 확인하였다(도 7 참조).

이로써 본 발명에서 규명한 실험 결과들은 아직까지 명확하게 규명되지 못하고 있는 세포부착-세포이입-세포노화의 구체적인 기작을 확인한 최초의 결과라 할 수 있으며, 특히 βPIX의 발현 억제에 따른 세포 노화를 GIT 단백질의 과발현을 통해 억제할 수 있음을 확인함에 따라, GIT 전장 단백질 또는 GIT-CT 단백질을 세포 노화 억제제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University <120> Novel use of GIT having anti-senescence activity <130> NPDC80184 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 770 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIT1 full length amino acid sequence <400> 1 Met Ser Arg Lys Gly Pro Arg Ala Glu Val Cys Ala Asp Cys Ser Ala 1 5 10 15 Pro Asp Pro Gly Trp Ala Ser Ile Ser Arg Gly Val Leu Val Cys Asp 20 25 30 Glu Cys Cys Ser Val His Arg Ser Leu Gly Arg His Ile Ser Ile Val 35 40 45 Lys His Leu Arg His Ser Ala Trp Pro Pro Thr Leu Leu Gln Met Val 50 55 60 His Thr Leu Ala Ser Asn Gly Ala Asn Ser Ile Trp Glu His Ser Leu 65 70 75 80 Leu Asp Pro Ala Gln Val Gln Ser Gly Arg Arg Lys Ala Asn Pro Gln 85 90 95 Asp Lys Val His Pro Ile Lys Ser Glu Phe Ile Arg Ala Lys Tyr Gln 100 105 110 Met Leu Ala Phe Val His Lys Leu Pro Cys Arg Asp Asp Asp Gly Val 115 120 125 Thr Ala Lys Asp Leu Ser Lys Gln Leu His Ser Ser Val Arg Thr Gly 130 135 140 Asn Leu Glu Thr Cys Leu Arg Leu Leu Ser Leu Gly Ala Gln Ala Asn 145 150 155 160 Phe Phe His Pro Glu Lys Gly Thr Thr Pro Leu His Val Ala Ala Lys 165 170 175 Ala Gly Gln Thr Leu Gln Ala Glu Leu Leu Val Val Tyr Gly Ala Asp 180 185 190 Pro Gly Ser Pro Asp Val Asn Gly Arg Thr Pro Ile Asp Tyr Ala Arg 195 200 205 Gln Ala Gly His His Glu Leu Ala Glu Arg Leu Val Glu Cys Gln Tyr 210 215 220 Glu Leu Thr Asp Arg Leu Ala Phe Tyr Leu Cys Gly Arg Lys Pro Asp 225 230 235 240 His Lys Asn Gly His Tyr Ile Ile Pro Gln Met Ala Asp Arg Ser Arg 245 250 255 Gln Lys Cys Met Ser Gln Ser Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ala Lys Ala 260 265 270 Ala Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Ser Asn Arg Leu Phe Glu Glu Leu 275 280 285 Ala Met Asp Val Tyr Asp Glu Val Asp Arg Arg Glu Asn Asp Ala Val 290 295 300 Trp Leu Ala Thr Gln Asn His Ser Thr Leu Val Thr Glu Arg Ser Ala 305 310 315 320 Val Pro Phe Leu Pro Val Asn Pro Glu Tyr Ser Ala Thr Arg Asn Gln 325 330 335 Gly Arg Gln Lys Leu Ala Arg Phe Asn Ala Arg Glu Phe Ala Thr Leu 340 345 350 Ile Ile Asp Ile Leu Ser Glu Ala Lys Arg Arg Gln Gln Gly Lys Ser 355 360 365 Leu Ser Ser Pro Thr Asp Asn Leu Glu Leu Ser Ala Arg Asn Gln Ser 370 375 380 Asp Leu Asp Asp Gln His Asp Tyr Asp Ser Val Ala Ser Asp Glu Asp 385 390 395 400 Thr Asp Gln Glu Pro Leu Pro Ser Ala Gly Ala Thr Arg Asn Asn Arg 405 410 415 Ala Arg Ser Met Asp Ser Ser Asp Leu Ser Asp Gly Ala Val Thr Leu 420 425 430 Gln Glu Tyr Leu Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ala Thr Ser Glu Ala Lys 435 440 445 Val Gln Gln Leu Met Lys Val Asn Ser Ser Leu Ser Asp Glu Leu Arg 450 455 460 Lys Leu Gln Arg Glu Ile His Lys Leu Gln Ala Glu Asn Leu Gln Leu 465 470 475 480 Arg Gln Pro Pro Gly Pro Val Pro Val Pro Ser Leu Pro Ser Glu Arg 485 490 495 Ala Glu His Thr Leu Met Gly Pro Gly Gly Ser Thr His Arg Arg Asp 500 505 510 Arg Gln Ala Phe Ser Met Tyr Glu Pro Gly Ser Ala Leu Lys Pro Phe 515 520 525 Gly Gly Ala Pro Gly Asp Glu Leu Ala Thr Arg Leu Gln Pro Phe His 530 535 540 Ser Thr Glu Leu Glu Asp Asp Ala Ile Tyr Ser Val His Val Pro Ala 545 550 555 560 Gly Leu Tyr Arg Ile Arg Lys Gly Val Ser Ala Ser Ser Val Thr Phe 565 570 575 Thr Pro Ser Ser Pro Leu Leu Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Arg His 580 585 590 Ala Ser Lys Leu Ser Arg His Gly Ser Gly Ala Glu Ser Asp Tyr Glu 595 600 605 Asn Thr Gln Ser Gly Glu Pro Leu Leu Gly Leu Glu Gly Lys Arg Phe 610 615 620 Leu Glu Leu Ser Lys Glu Asp Glu Leu His Ala Glu Leu Glu Ser Leu 625 630 635 640 Asp Gly Asp Pro Asp Pro Gly Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Ile Leu 645 650 655 Lys Thr Glu Gln Val Thr Lys Asn Ile Gln Glu Leu Leu Arg Ala Ala 660 665 670 Gln Glu Phe Lys His Asp Ser Phe Val Pro Cys Ser Glu Lys Ile His 675 680 685 Leu Ala Val Thr Glu Met Ala Ser Leu Phe Pro Lys Arg Pro Ala Leu 690 695 700 Glu Pro Val Arg Ser Ser Leu Arg Leu Leu Asn Ala Ser Ala Tyr Arg 705 710 715 720 Leu Gln Ser Glu Cys Arg Lys Thr Val Pro Pro Glu Pro Gly Ala Pro 725 730 735 Val Asp Phe Gln Leu Leu Thr Gln Gln Val Ile Gln Cys Ala Tyr Asp 740 745 750 Ile Ala Lys Ala Ala Lys Gln Leu Val Thr Ile Thr Thr Arg Glu Lys 755 760 765 Lys Gln 770 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIT1 C terminal amino acid sequence <400> 2 Leu Glu Leu Ser Ala Arg Asn Gln Ser Asp Leu Asp Asp Gln His Asp 1 5 10 15 Tyr Asp Ser Val Ala Ser Asp Glu Asp Thr Asp Gln Glu Pro Leu Pro 20 25 30 Ser Ala Gly Ala Thr Arg Asn Asn Arg Ala Arg Ser Met Asp Ser Ser 35 40 45 Asp Leu Ser Asp Gly Ala Val Thr Leu Gln Glu Tyr Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Lys Ala Leu Ala Thr Ser Glu Ala Lys Val Gln Gln Leu Met Lys Val 65 70 75 80 Asn Ser Ser Leu Ser Asp Glu Leu Arg Lys Leu Gln Arg Glu Ile His 85 90 95 Lys Leu Gln Ala Glu Asn Leu Gln Leu Arg Gln Pro Pro Gly Pro Val 100 105 110 Pro Val Pro Ser Leu Pro Ser Glu Arg Ala Glu His Thr Leu Met Gly 115 120 125 Pro Gly Gly Ser Thr His Arg Arg Asp Arg Gln Ala Phe Ser Met Tyr 130 135 140 Glu Pro Gly Ser Ala Leu Lys Pro Phe Gly Gly Ala Pro Gly Asp Glu 145 150 155 160 Leu Ala Thr Arg Leu Gln Pro Phe His Ser Thr Glu Leu Glu Asp Asp 165 170 175 Ala Ile Tyr Ser Val His Val Pro Ala Gly Leu Tyr Arg Ile Arg Lys 180 185 190 Gly Val Ser Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Pro Ser Ser Pro Leu Leu 195 200 205 Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Arg His Ala Ser Lys Leu Ser Arg His 210 215 220 Gly Ser Gly Ala Glu Ser Asp Tyr Glu Asn Thr Gln Ser Gly Glu Pro 225 230 235 240 Leu Leu Gly Leu Glu Gly Lys Arg Phe Leu Glu Leu Ser Lys Glu Asp 245 250 255 Glu Leu His Ala Glu Leu Glu Ser Leu Asp Gly Asp Pro Asp Pro Gly 260 265 270 Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Ile Leu Lys Thr Glu Gln Val Thr Lys 275 280 285 Asn Ile Gln Glu Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Phe Lys His Asp Ser 290 295 300 Phe Val Pro Cys Ser Glu Lys Ile His Leu Ala Val Thr Glu Met Ala 305 310 315 320 Ser Leu Phe Pro Lys Arg Pro Ala Leu Glu Pro Val Arg Ser Ser Leu 325 330 335 Arg Leu Leu Asn Ala Ser Ala Tyr Arg Leu Gln Ser Glu Cys Arg Lys 340 345 350 Thr Val Pro Pro Glu Pro Gly Ala Pro Val Asp Phe Gln Leu Leu Thr 355 360 365 Gln Gln Val Ile Gln Cys Ala Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Lys Gln 370 375 380 Leu Val Thr Ile Thr Thr Arg Glu Lys Lys Gln 385 390 395 <210> 3 <211> 759 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIT2 full length amino acid sequence <400> 3 Met Ser Lys Arg Leu Arg Ser Asn Asp Val Cys Ala Asp Cys Ser Gly 1 5 10 15 Pro Asp Pro Ser Trp Ala Ser Val Asn Arg Gly Thr Leu Ile Cys Asp 20 25 30 Glu Cys Cys Ser Val His Arg Ser Leu Gly Arg His Ile Ser Gln Val 35 40 45 Arg His Leu Lys His Thr Pro Trp Pro Pro Thr Leu Leu Gln Met Val 50 55 60 Glu Thr Leu Tyr Ser Asn Gly Ala Asn Ser Ile Trp Glu His Ser Leu 65 70 75 80 Leu Asp Pro Ala Ser Val Met Ser Gly Arg Arg Lys Ala Asn Pro Gln 85 90 95 Asp Lys Val His Pro Asn Lys Ala Glu Phe Ile Arg Ala Lys Tyr Gln 100 105 110 Met Leu Ala Phe Val His Arg Leu Pro Cys Arg Asp Asp Asp Ser Val 115 120 125 Thr Ala Lys Asp Leu Ser Lys Gln Leu His Ser Ser Val Arg Thr Gly 130 135 140 Asn Leu Glu Thr Cys Leu Arg Leu Leu Ser Leu Gly Ala Gln Ala Asn 145 150 155 160 Phe Phe His Pro Glu Lys Gly Ser Thr Pro Leu His Val Ala Ser Lys 165 170 175 Ala Gly Gln Ile Leu Gln Ala Glu Leu Leu Ala Val Tyr Gly Ala Asp 180 185 190 Pro Gly Thr His Asp Ser Ser Gly Lys Thr Pro Val Asp Tyr Ala Arg 195 200 205 Gln Gly Gly His Arg Glu Leu Ala Glu Arg Leu Val Glu Ile Gln Tyr 210 215 220 Glu Leu Thr Asp Arg Leu Ala Phe Tyr Leu Cys Gly Arg Lys Pro Asp 225 230 235 240 His Lys Asn Gly Gln His Phe Ile Ile Pro Gln Met Ala Asp Ser Ser 245 250 255 Leu Asp Leu Ser Glu Leu Ala Lys Ala Ala Lys Lys Lys Leu Gln Ser 260 265 270 Leu Ser Asn His Leu Phe Glu Glu Leu Ala Met Asp Val Tyr Asp Glu 275 280 285 Val Asp Arg Arg Glu Thr Asp Ala Val Trp Leu Ala Thr Gln Asn His 290 295 300 Ser Thr Leu Val Thr Glu Thr Thr Val Val Pro Phe Leu Pro Val Asn 305 310 315 320 Pro Glu Tyr Ser Ser Thr Arg Asn Gln Gly Arg Gln Lys Leu Ala Arg 325 330 335 Phe Asn Ala His Glu Phe Ala Thr Leu Val Ile Asp Ile Leu Ser Asp 340 345 350 Ala Lys Arg Arg Gln Gln Gly Ser Pro Leu Ser Arg Ser Lys Asp Asn 355 360 365 Val Glu Leu Ile Leu Arg Thr Val Ser Asn Gln His Ser Thr Glu Ser 370 375 380 Gln Asp Asn Asp Gln Pro Asp Tyr Asp Ser Val Ala Ser Asp Glu Asp 385 390 395 400 Thr Asp Val Glu Thr Arg Ala Ser Arg Thr Asn Arg Gln Lys Ser Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Leu Ser Asp Gly Pro Val Thr Val Gln Glu Phe Met Glu 420 425 430 Val Lys His Ala Leu Val Ala Ser Glu Ala Lys Arg Gln Gln Leu Met 435 440 445 Lys Val Asn Asn Asn Leu Ser Gly Glu Leu Arg Ile Met Gln Lys Lys 450 455 460 Leu Gln Thr Leu Gln Ser Glu Asn Ser Ser Leu Arg Arg Gln Ala Thr 465 470 475 480 Ala Ser Ala Cys Gln Val Gln Thr Ala Ser Asp His Lys Asp Thr Val 485 490 495 Ser His Ser Ser Leu Lys Arg Arg Pro Ser Ala Arg Gly Ser Arg Pro 500 505 510 Met Ser Met Tyr Glu Thr Gly Ser Gly Gln Lys Pro Tyr Leu Pro Met 515 520 525 Gly Glu Ala Asn His Pro Glu Glu Ser Arg Thr Arg Leu Gln Pro Phe 530 535 540 Pro Thr His Ile Gly Arg Ser Ala Leu Val Thr Ser Ser Ser Ser Leu 545 550 555 560 Pro Ser Phe Pro Ser Thr Leu Ser Trp Ser Arg Asp Glu Ser Thr Arg 565 570 575 Arg Ala Ser Arg Leu Glu Lys Gln Asn Ser Thr Pro Glu Ser Asp Tyr 580 585 590 Asp Asn Thr Ala Tyr Asp Pro Glu Pro Asp Asp Thr Val Ser Gly Arg 595 600 605 Lys Gly Arg Gln Arg Ser Met Leu Trp Gln Gly Asp Gly Pro Leu Pro 610 615 620 Asp Thr Ala Glu Pro His Ala Val Pro Ser Pro Ala Leu Pro Ser Thr 625 630 635 640 Glu Asp Val Ile Arg Lys Thr Glu Gln Ile Thr Lys Asn Ile Gln Glu 645 650 655 Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Asn Lys His Asp Ser Tyr Ile Pro Cys 660 665 670 Ser Glu Arg Ile His Ala Ala Val Thr Glu Met Ala Ala Leu Phe Pro 675 680 685 Lys Lys Pro Lys Ser Asp Thr Val Arg Thr Ser Leu Arg Leu Leu Thr 690 695 700 Ala Ser Ala Tyr Arg Leu Gln Ser Glu Cys Arg Lys Ala Leu Pro Gly 705 710 715 720 Asp Ser Ser Leu Pro Thr Asp Val Gln Leu Val Thr Gln Gln Val Ile 725 730 735 Gln Cys Ala Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Lys Gln Leu Val Thr Ile 740 745 750 Thr Thr Lys Glu Asn Ser Ser 755 <210> 4 <211> 384 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GIT2 C terminal amino acid sequence <400> 4 Val Ser Asn Gln His Ser Thr Glu Ser Gln Asp Asn Asp Gln Pro Asp 1 5 10 15 Tyr Asp Ser Val Ala Ser Asp Glu Asp Thr Asp Val Glu Thr Arg Ala 20 25 30 Ser Arg Thr Asn Arg Gln Lys Ser Leu Asp Ser Asp Leu Ser Asp Gly 35 40 45 Pro Val Thr Val Gln Glu Phe Met Glu Val Lys His Ala Leu Val Ala 50 55 60 Ser Glu Ala Lys Arg Gln Gln Leu Met Lys Val Asn Asn Asn Leu Ser 65 70 75 80 Gly Glu Leu Arg Ile Met Gln Lys Lys Leu Gln Thr Leu Gln Ser Glu 85 90 95 Asn Ser Ser Leu Arg Arg Gln Ala Thr Ala Ser Ala Cys Gln Val Gln 100 105 110 Thr Ala Ser Asp His Lys Asp Thr Val Ser His Ser Ser Leu Lys Arg 115 120 125 Arg Pro Ser Ala Arg Gly Ser Arg Pro Met Ser Met Tyr Glu Thr Gly 130 135 140 Ser Gly Gln Lys Pro Tyr Leu Pro Met Gly Glu Ala Asn His Pro Glu 145 150 155 160 Glu Ser Arg Thr Arg Leu Gln Pro Phe Pro Thr His Ile Gly Arg Ser 165 170 175 Ala Leu Val Thr Ser Ser Ser Ser Leu Pro Ser Phe Pro Ser Thr Leu 180 185 190 Ser Trp Ser Arg Asp Glu Ser Thr Arg Arg Ala Ser Arg Leu Glu Lys 195 200 205 Gln Asn Ser Thr Pro Glu Ser Asp Tyr Asp Asn Thr Ala Tyr Asp Pro 210 215 220 Glu Pro Asp Asp Thr Val Ser Gly Arg Lys Gly Arg Gln Arg Ser Met 225 230 235 240 Leu Trp Gln Gly Asp Gly Pro Leu Pro Asp Thr Ala Glu Pro His Ala 245 250 255 Val Pro Ser Pro Ala Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Ile Arg Lys Thr 260 265 270 Glu Gln Ile Thr Lys Asn Ile Gln Glu Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu 275 280 285 Asn Lys His Asp Ser Tyr Ile Pro Cys Ser Glu Arg Ile His Ala Ala 290 295 300 Val Thr Glu Met Ala Ala Leu Phe Pro Lys Lys Pro Lys Ser Asp Thr 305 310 315 320 Val Arg Thr Ser Leu Arg Leu Leu Thr Ala Ser Ala Tyr Arg Leu Gln 325 330 335 Ser Glu Cys Arg Lys Ala Leu Pro Gly Asp Ser Ser Leu Pro Thr Asp 340 345 350 Val Gln Leu Val Thr Gln Gln Val Ile Gln Cys Ala Tyr Asp Ile Ala 355 360 365 Lys Ala Ala Lys Gln Leu Val Thr Ile Thr Thr Lys Glu Asn Ser Ser 370 375 380 <210> 5 <211> 2313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GIT1 full length DNA sequence <400> 5 atgtcccgga aggggccgcg agcggaggtg tgtgcggact gcagcgcccc tgaccctggc 60 tgggcatcta tcagcagagg tgtgctggtt tgtgacgagt gctgcagtgt gcaccggagc 120 ctgggacgac acatctccat tgtcaaacac cttcgccaca gcgcctggcc tcctacgctg 180 ctacagatgg tgcacacgct tgccagcaac ggggccaact ctatctggga gcattccctg 240 ctggaccctg cacaagtgca aagtggccgg cgcaaagcca acccccaaga caaagtccac 300 cccatcaagt cagagttcat cagggcaaag taccagatgc tggcgtttgt gcacaagctt 360 ccctgccgtg atgatgatgg ggtcaccgcc aaagacctca gcaagcaact gcactcgagt 420 gtgcgaacag gcaacctgga gacctgtctg cgcctgcttt ccctgggtgc ccaggccaac 480 ttcttccacc cagaaaaggg cactacacct ctacacgtgg ctgccaaggc agggcagaca 540 ctgcaggctg agctgctagt agtgtatggg gctgacccag gctcccctga tgtcaatggc 600 cgcacaccca ttgactatgc caggcaggcg gggcaccatg aactggcaga aaggctagtt 660 gagtgccagt atgagctcac tgaccggttg gccttctacc tctgtggacg gaagcctgat 720 cacaagaatg ggcattacat cataccacag atggctgaca gatctcggca aaagtgcatg 780 tctcagagtt tggatctgtc tgaattggcc aaagctgcca agaagaagct acaagcactc 840 agcaaccggc tctttgagga gctcgccatg gatgtgtatg acgaagtgga ccggagagaa 900 aatgatgcag tgtggctagc tacccagaat catagcaccc tggtgacaga acgcagtgct 960 gtgcccttcc tgccagtcaa ccctgaatac tcagccactc ggaatcaggg acgacagaaa 1020 ttggctcgtt ttaatgcccg agagtttgcc accttgatca tcgacatcct cagtgaggcc 1080 aaacggaggc agcagggcaa gagtctgagc agccccacag acaacctcga gctgtctgca 1140 cggaaccaaa gtgacctgga cgaccagcac gactacgata gtgtggcttc tgacgaagac 1200 acagaccagg agcccttgcc cagtgctggc gccacgcgga acaatcgtgc caggagcatg 1260 gactcctcag atctgtcgga tggggctgtg acgctgcagg agtacctgga gctgaagaag 1320 gctctggcta cctccgaggc caaagtgcag cagctcatga aagtcaacag cagtctgagt 1380 gacgagcttc ggaagctgca gagggagatc cacaaactgc aggcagagaa cctgcagctc 1440 cggcagccac caggaccagt gcctgtaccc tcacttccca gtgaacgggc agaacacaca 1500 ctcatgggcc ctggtggaag tacccatcgc agggaccgcc aggccttctc tatgtatgag 1560 ccaggctccg ccctgaagcc ctttggaggt gcacctgggg atgagctcgc cacacggctc 1620 cagcctttcc acagcacaga gctggaagat gatgccatct attcagtaca tgtccctgct 1680 ggcctttacc ggatccggaa gggggtgtct gcctcttctg tgaccttcac tccctcctcc 1740 ccactgctgt caagctccca agaaggaagt cgccatgcga gcaagctttc acgccacggc 1800 agtggcgcag agagtgacta tgagaacaca cagagtggag agcctctgct gggacttgaa 1860 gggaagcgat tcctagagct gagcaaggag gatgagctgc acgctgagct ggagagctta 1920 gatggagacc cagaccccgg gctccccagc acagaagatg tcatcctaaa gacagagcag 1980 gtcaccaaga acattcagga gctattgcgg gcagcccagg agttcaaaca tgacagcttt 2040 gtgccctgtt cagaaaagat ccatttggct gtgactgaga tggcctctct cttcccaaag 2100 aggccagccc tggagcctgt gcgcagttca ctgcggctgc tcaacgccag cgcctaccgg 2160 ctgcagagtg aatgccggaa gacagtgcct ccagaacctg gcgcccctgt ggacttccag 2220 ctactgactc agcaggtgat ccagtgcgcc tatgacatcg ccaaggctgc caagcagctg 2280 gtcaccatca ccacccgaga gaagaaacag tga 2313 <210> 6 <211> 1188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GIT1 C terminal DNA sequence <400> 6 ctcgagctgt ctgcacggaa ccaaagtgac ctggacgacc agcacgacta cgatagtgtg 60 gcttctgacg aagacacaga ccaggagccc ttgcccagtg ctggcgccac gcggaacaat 120 cgtgccagga gcatggactc ctcagatctg tcggatgggg ctgtgacgct gcaggagtac 180 ctggagctga agaaggctct ggctacctcc gaggccaaag tgcagcagct catgaaagtc 240 aacagcagtc tgagtgacga gcttcggaag ctgcagaggg agatccacaa actgcaggca 300 gagaacctgc agctccggca gccaccagga ccagtgcctg taccctcact tcccagtgaa 360 cgggcagaac acacactcat gggccctggt ggaagtaccc atcgcaggga ccgccaggcc 420 ttctctatgt atgagccagg ctccgccctg aagccctttg gaggtgcacc tggggatgag 480 ctcgccacac ggctccagcc tttccacagc acagagctgg aagatgatgc catctattca 540 gtacatgtcc ctgctggcct ttaccggatc cggaaggggg tgtctgcctc ttctgtgacc 600 ttcactccct cctccccact gctgtcaagc tcccaagaag gaagtcgcca tgcgagcaag 660 ctttcacgcc acggcagtgg cgcagagagt gactatgaga acacacagag tggagagcct 720 ctgctgggac ttgaagggaa gcgattccta gagctgagca aggaggatga gctgcacgct 780 gagctggaga gcttagatgg agacccagac cccgggctcc ccagcacaga agatgtcatc 840 ctaaagacag agcaggtcac caagaacatt caggagctat tgcgggcagc ccaggagttc 900 aaacatgaca gctttgtgcc ctgttcagaa aagatccatt tggctgtgac tgagatggcc 960 tctctcttcc caaagaggcc agccctggag cctgtgcgca gttcactgcg gctgctcaac 1020 gccagcgcct accggctgca gagtgaatgc cggaagacag tgcctccaga acctggcgcc 1080 cctgtggact tccagctact gactcagcag gtgatccagt gcgcctatga catcgccaag 1140 gctgccaagc agctggtcac catcaccacc cgagagaaga aacagtga 1188 <210> 7 <211> 2280 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GIT2 full length DNA sequence <400> 7 atgtcgaagc gtctccggag caacgacgtg tgcgccgact gcagcgggcc tgatccttcc 60 tgggcatcag tgaacagggg gactctcata tgtgatgagt gctgcagtgt tcatcggagc 120 ctagggcgcc acatctccca agtcaggcat cttaaacaca caccatggcc tccaaccctg 180 cttcagatgg ttgagacctt gtatagcaat ggtgctaatt ctatctggga gcattctttg 240 ctggaccctg cttctgttat gagtgggaga cggaaagcca atccacagga taaagtccac 300 cccaataaag cagaattcat cagagccaag tatcagatgt tagcatttgt acacagattg 360 ccctgccgtg acgacgacag tgtgactgcc aaagatctta gtaagcaact ccattcaagt 420 gtgagaacag ggaatcttga gacctgtctg agactgttgt cgttaggagc ccaagccaac 480 ttcttccatc ctgaaaaagg aagcactcca ctccacgtcg cctccaaagc aggacagatc 540 ctacaggctg aattgctggc agtgtacgga gctgacccag gcacacacga ttctagtggg 600 aagactcctg ttgactatgc aaggcaagga ggacaccgtg agctggccga acgcctcgta 660 gaaatacagt acgagctgac ggacaggctg gccttctacc tctgcggccg gaaaccagat 720 cataaaaacg gacagcactt tataatccct cagatggcag acagcagcct ggatttgtct 780 gagttggcaa aagctgccaa gaagaaactt cagtctctaa gtaatcattt gtttgaagaa 840 cttgccatgg atgtgtacga tgaagttgac agacgagaga ctgatgcagt ctggcttgcc 900 acgcaaaacc acagcacctt ggtaactgag acaaccgtcg ttccctttct tccggtcaac 960 cctgagtact cctcgacacg aaaccagggc agacagaaat tagctcggtt taatgcccat 1020 gaatttgcta cactggtcat cgacatcctc agtgacgcca agaggagaca gcaaggcagt 1080 cctctctcca ggtcaaaaga caatgtggaa ctcatattga gaacagtcag taaccagcac 1140 agcactgaga gccaggacaa tgaccagcca gactatgaca gcgtggcctc agatgaagac 1200 acagacgtgg agaccagagc aagcaggaca aaccggcaga agagcctaga ttcagatttg 1260 tcagatggac cagtcactgt gcaggagttt atggaggtca aacacgccct agtggcttct 1320 gaggccaaga gacagcagct aatgaaggtg aataacaacc tgagtggcga gctgagaatt 1380 atgcagaaaa agcttcaaac tctacagagt gagaactcaa gcctcaggag acaggccaca 1440 gccagtgcct gtcaggtcca gactgcctct gaccacaaag acactgtgag ccactcctcc 1500 ctgaagcgcc ggccatcagc ccggggcagt agacccatgt ccatgtatga gactggatca 1560 ggccagaaac catacctccc aatgggagaa gccaaccacc ctgaagaaag ccggacaaga 1620 cttcagccct tccccactca tattgggagg agtgcacttg tgacctcctc ttcgtctctg 1680 ccttccttcc cctccacact ttcctggtcc agggacgaaa gcacccgaag ggcctccagg 1740 ttggagaagc agaacagcac cccagagagc gattatgaca acactgccta tgaccctgaa 1800 ccagatgaca cggtgtcagg ccggaagggg cggcagcgga gtatgctctg gcaaggtgat 1860 ggcccactgc cagacacagc agagccccac gcggtcccca gccccgccct ccccagcaca 1920 gaagatgtca tccgcaagac tgaacagatc accaaaaaca tccaggagct cctcagagca 1980 gcccaggaga acaagcatga cagctacatt ccctgctcag agaggataca cgccgctgtg 2040 accgagatgg cagccctgtt ccccaaaaaa cctaagtctg acacggtgag gacttccctc 2100 cgcctactaa cggccagtgc ctaccggctc cagtcagagt gcagaaaggc tctcccagga 2160 gactcgagct tgcccacgga tgtgcagctg gtcacacagc aggtcatcca gtgtgcctat 2220 gacattgcca aggccgccaa acagctggtc acaatcacca ccaaagagaa cagcagctga 2280 2280 <210> 8 <211> 1155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GIT2 C terminal DNA sequence <400> 8 gtcagtaacc agcacagcac tgagagccag gacaatgacc agccagacta tgacagcgtg 60 gcctcagatg aagacacaga cgtggagacc agagcaagca 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gtctgacacg 960 gtgaggactt ccctccgcct actaacggcc agtgcctacc ggctccagtc agagtgcaga 1020 aaggctctcc caggagactc gagcttgccc acggatgtgc agctggtcac acagcaggtc 1080 atccagtgtg cctatgacat tgccaaggcc gccaaacagc tggtcacaat caccaccaaa 1140 gagaacagca gctga 1155

Claims (13)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GIT(G-protein-coupled receptor(GPCR) kinase-interacting proteins)1의 C 말단 단편을 유효성분으로 포함하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 감소로 유발되는 죽상경화, 피부노화, 골다공증, 류마티스 골관절염, 퇴행성 골관절염, 탈모증 및 곱사등으로 이루어진 군 중에서 선택되는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 GIT(G-protein-coupled receptor(GPCR) kinase-interacting proteins)1의 C 말단 단편은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 GIT1의 C 말단에 대한 염기서열이 발현 벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 감소로 유발되는 죽상경화, 피부노화, 골다공증, 류마티스 골관절염, 퇴행성 골관절염, 탈모증 및 곱사등으로 이루어진 군 중에서 선택되는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 SA-β-갈락토시다아제 활성 억제;
   p16의 발현 억제; 및
   세포 노화에 의한 세포 이입(endocytosis) 감소 억제; 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, βPIX(PAK1-interacting exchange factor beta)의 발현 감소로 유발되는 죽상경화, 피부노화, 골다공증, 류마티스 골관절염, 퇴행성 골관절염, 탈모증 및 곱사등으로 이루어진 군 중에서 선택되는 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

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