KR20110046521A

KR20110046521A - 라이실 ｔＲＮＡ 합성효소의 세포내 수준을 조절하여 암 전이 또는 암 세포의 이동을 조절하는 방법

Info

Publication number: KR20110046521A
Application number: KR1020117005065A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 최진우
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2008-08-18
Filing date: 2008-08-18
Publication date: 2011-05-04
Also published as: EP2334791A1; WO2010021415A1; CN102124104A; BRPI0823016A2; JP5628807B2; US9511085B2; EP2334791B1; AU2008360729A1; US10139394B2; JP2012500256A; CA2734892A1; KR101453141B1; EP2334791A4; US20110189195A1; MX2011001900A; US20170108489A1

Abstract

본 발명은 라이실 tRNA 합성효소가 원형질막으로 전좌(translocation)되어 67LR과 상호작용함으로써 종양(또는 암) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이(metastasis)에 영향을 미친다는 라이실 tRNA 합성효소의 신규한 기능에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 신규한 기능을 활용하여, 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 조절하여 암 전이 또는 암 세포의 이동을 조절하는 방법, 암 예방 또는 치료를 위하여, KRS의 발현을 억제하는 구성을 가지는 발현 벡터의 용도, 암 예방 또는 치료를 위하여, KRS 활성을 저해하는 제제의 용도, 암 전이 또는 암 세포 이동 조절 제제를 스크리닝하는 방법 및 KRS 및 67LR의 상호작용을 저해하는 제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 KRS를 이용하여 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절할 수 있으며, 나아가 원형질막의 라미닌 수용체(67LR)과 관계된 세포 내 대사를 조절할 수 있다. 본 발명에서 규명한 KRS와 라미닌 수용체의 관계는 이와 관계된 다양한 질환 또는 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 조절하여 암 전이 또는 암 세포의 이동을 조절하는 방법{METHOD FOR CONTROLLING CANCER METASTASIS OR CANCER CELL MIGRATION BY MODULATING THE CELLULAR LEVEL OF LYSYL TRNA SYNTHETASE}

본 발명은 라이실 tRNA 합성효소의 신규한 기능에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 신규한 기능을 활용하여, 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 조절하여 암 전이 또는 암 세포의 이동을 조절하는 방법, 암 예방 또는 치료를 위하여, KRS의 발현을 억제하는 구성을 가지는 발현 벡터의 용도, 암 예방 또는 치료를 위하여, KRS 활성을 저해하는 제제의 용도, 암 전이 또는 암 세포 이동 조절 제제를 스크리닝하는 방법 및 KRS 및 67LR의 상호작용을 저해하는 제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

암(또는 종양)은 비정상적이고 비제어성이며 무질서한 세포증식의 산물이다. 특히, 파괴적인 성장성, 침투성 및 전이성이 있다면 악성으로 분류된다. 침투성이란 주위 조직을 침투 또는 파괴하는 성질로서, 일반적으로 조직의 경계를 이루는 기저층을 파괴시켜 종양이 국부적으로 전파되는 것을 의미하며, 종종 체내의 순환계로도 유입된다. 전이란 일반적으로 림프관(lymphotic) 또는 혈관에 의해 원발 위치와는 다른 곳으로 종양 세포가 퍼지는 것을 의미한다. 전이는 또한 장액성 체강 또는 다른 공간을 통해 직접 신장하여 종양 세포를 이동시키는 것을 의미하기도 한다.

현재, 암은 주로 3가지 치료법, 즉 외과적인 수술, 방사선조사 및 화학요법 중 1가지 또는 이들의 조합을 통해 치료되고 있다. 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 것을 포함한다. 이러한 외과적 수술은 특정 부위, 예컨대 유방, 결장 및 피부에 위치한 종양을 제거하는 데에는 효과적이지만, 척추와 같이 일부 구역에 있는 종양을 치료하거나 백혈병과 같은 분산성 종양질환을 치료하는 데는 사용할 수 없다.

화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사를 붕괴시키며, 흔히 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 많이 사용되는데, 종양 질병을 치료하는데 사용되는 전신성 화학요법의 부작용은 암 치료를 받는 환자들에게 가장 문제가 된다. 이러한 부작용 중에서 멀미와 구토는 가장 일반적이며 심각한 부작용이다. 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 큰 영향을 미치며 치료에 대한 환자의 순응성을 급격하게 변화시킬 수 있다. 또한, 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여시 주의해야 하는 용량 제한 독성(DLT, Dose Limiting Toxicity)이 있다. 예를 들어, 점막염은 여러 항암제, 예컨대 항 대사물질 세포독소제인 5-플루오로우라실, 메소트렉세이트 및 항종양 항생제(예, 독소루비신) 등에 대한 용량 제한 독성이 있다. 이러한 화학요법 유래의 부작용 중 대부분은 심한 경우 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위해 진통제를 필요로 하기도 한다. 이와 같이 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 임상적 처치시 주요 문제가 되고 있다.

유전자 치료란 DNA 재조합 방법을 이용하여 치료용 유전자를 환자의 세포 안으로 도입시켜 유전자 결함을 교정시키거나 세포에 새로운 기능을 추가시켜 인체 세포의 유전적 변형을 통해 각종 유전질환, 암, 심혈관질환, 감염성 질병, 그리고 자가면역질환 등과 같은 질환을 치료하거나 예방하는 방법이다. 즉, 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포내에서 치료용 혹은 정상 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것을 유전자치료라고 한다. 유전자치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간동안 적용할 수 있다. 유전자 치료는 단순히 질병의 증상을 치료하는 데에 그치지 않고 질병의 원인을 치료하고 제거하는 방식이다. 이러한 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료유전자를 원하는 표적세포로 전달하여 높은 발현 효율을 얻을 수 있도록 하는 유전자 전달기술이 필요하다.

유전자 전달체는 원하는 치료 유전자를 대상 세포에 도입하기 위해 필요한 매개체로써, 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량 생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있으며 지속적으로 유전자를 발현할 수 있어야 한다. 유전자 전달체 기술은 유전자 치료 기술의 핵심 요소로서, 현재 유전자 치료에 많이 이용되는 대표적 유전자 전달체로는 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 레트로 바이러스와 같은 바이러스성 전달체와 리포좀, 폴리에틸렌이민과 같은 비바이러스성 전달체가 있다.

유전자 치료의 전략 중 종양 세포를 제어하는 전략으로는 종양억제 유전자를 이용하는 방법, 종양 선택적 살상 바이러스를 이용하는 방법, 자살 유전자를 이용하는 방법, 면역조절 유전자를 도입하는 방법 등이 있다. 종양억제 유전자를 이용하는 방법은 상당수의 암환자에서 유전자가 결손 또는 변형되어 있는 p53과 같은 종양억제 유전자를 원형으로 인체에 전달하여 암을 치료하려는 방법이며, 종양선택적 살상바이러스를 이용하는 방법은 암조직에서 변형되어 있는 종양억제 유전자의 활성을 이용하여 종양세포에서만 선택적으로 증식할 수 있는 바이러스 유전자 전달체를 인체에 도입하여 치료효과를 거두려는 방법으로서 모두 종양세포를 직접 살상시키는 전략이다. 자살 유전자를 이용하는 방법도 HSV-TK와 같은 감수성 유전자를 도입하여 종양세포의 자살을 유도하는 방법도 이와 같은 범주에 속한다. 반면, 면역 조절 유전자를 도입하는 방법은 항종양 면역반응을 증강하게 하는 인터루킨 12, 인터루킨 4, 인터루킨 7, 감마 인터페론, 종양괴사인자 등의 유전자를 인체에 전달하여 T세포에게 종양을 인식하도록 유발하거나, 종양 유발 단백질을 차단하여 세포 자살을 유도하여 간접적으로 질병을 치료하는 전략이다. 안지오스타틴, 엔도스타틴과 같은 혈관생성억제인자를 발현시켜 종양으로의 영양공급을 차단하여 괴사시키는 방법도 이와 같은 간접적 질병치료 전략으로 널리 인식되고 있다.

종양의 전이는 암의 생존률에 있어서 결정적인 요소이다. 67 kDa의 라미닌 수용체(67LR)는 원형질막에 포매된(embedded) 비-인테그린형 수용체로서, 암의 침습(침윤) 및 전이와 연관이 있다(Nelson, J. et al. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008)). 67LR은 이들의 37kDa 전구체(37LRP)의 중합(dimerization)에 의해 생성되는데, 이러한 변화 과정에 대한 분자적인 세부기작은 잘 알려져 있지 않다. 37LRP는 폴리좀 형성에 관여하는 리보좀 서브유닛 p40과 동일하다(Auth, D. ＆ Brawerman,G. A 33-kDa polypeptide with homology to the laminin receptor: component of translation machinery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4368-4372 (1992)). 67LR은 종종 다양한 종류의 암에서 고농도로 관찰된다(Nelson, J. et al. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008); Menard, S., Castronovo, V., Tagliabue, E. ＆ Sobel, M. E.New insights into the metastasis-associated 67 kD laminin receptor. J. Cell. Biochem. 67, 155-165 (1997)). 그러나, 67LR의 막내 존재에서의 조절자나 분자적 기작은 아직 밝혀지지 않았다.

KRS는 단백질 합성을 위하여 동족의(cognate) 아미노산 및 tRNA를 접합시키는 aminoacyl-t-RNA synthetases(ARSs)에 속한다. 이들 원시 효소들은 촉매적 활성 외에도 다면적(pleiotropic) 특징을 갖는다(Park, S. G., Ewalt, K. L. ＆ Kim, S. Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers. Trends Biochem. Sci . 30 , 569-574 (2005)). 이에 반해, KRS를 포함한 몇몇 포유류의 ARS는 구성 단백질의 다양한 기능을 조절하기 위하여, 분자 저장소(molecular reservoir)로서 작용하는(Ray, P. S., Arif, A. ＆ Fox, P. Macromolecular complexes as depots for releasable regulatory proteins. Trends Biochem. Sci. 32, 158-164 (2007)) 거대분자 복합체를 형성한다(Lee, S. W., Cho, B. H.,Park, S. G. ＆ Kim, S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation. J. Cell. Sci. 117, 3725-3734 (2004); Han, J. M., Kim, J. Y. ＆ Kim, S. Molecular network and functional implications of macromolecular tRNA synthetase complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 985-993 (2003)). 인간 KRS는 RNA와 기타 단백질간의 상호작용에 관여하는 고유한 N말단 연장부위를 함유하고 있다(Rho, S. B. et al. Genetic dissection of protein-protein interactions in multi-tRNA synthetase complex. Proc. Natl. Sci. Acad. USA 96, 4488-4493 (1999); Francin, M., Kaminska, M., Kerjan,P. ＆Mirande. M. The N-terminal domain of mammalian Lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain. J. Biol. Chem. 277, 1762-1769 (2002)).

발명의 상세한 설명

기술적 과제

인간 KRS의 기능적 다양성과 관련하여 이 펩티드의 유의성을 확인하고자, 본 발명자들은 인간 KRS의 N말단 116개 아미노산 펩티드를 분리하여 이스트 투 하이브리드를 이용한 HeLa 세포주 cDNA 라이브러리로부터 인간 KRS에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 탐침(bait;미끼)용으로 사용하였다. 상기 스크리닝으로부터, 본 발명자들은 본 발명에서 결합 가능성이 있는 단백질의 하나로서 37LRP/p40을 확인하였고, KRS와 라미닌 수용체간의 상호작용에 있어서의 기능적 연관성을 조사하였다.

그 결과, 라이실 t-RNA 합성효소(lysyl-t-RNA synthetase, KRS)가 원형질 막에 있는 67LR을 안정화시킴으로써 세포 이동 및 암 전이를 촉진하는 등 KRS가 원형질 막의 라미닌 수용체를 통해서 암 전이 또는 암 세포 이동에 영향을 미친다는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 전이 또는 암 세포 이동에 관하여 라이실 tRNA 합성효소(lysyl tRNA synthetase, KRS)의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS)의 세포내 수준을 조절하여 암 전이(cancer metastasis)를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 조절하여 암 세포의 이동(cancer cell migration)을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 치료제를 제조하기 위한, 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KRS의 활성을 저해하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KRS의 활성을 저해하는 제제를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 치료제를 제조하기 위한, KRS의 활성을 저해하는 제제의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 시험 제제의 존재하에서 KRS와 시험 제제를 접촉시키는 단계;

(b) KRS의 활성을 측정하여 KRS의 활성을 변화시키는 시험 제제를 선별하는 단계; 및

(c) 선별된 제제가 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는지를 테스트하는 단계를 포함하는 암 전이 또는 암 세포 이동 조절 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 시험 제제의 존재하에서 KRS, 라미닌 수용체(67LR) 및 시험 제제를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 시험 제제가 KRS와 라미닌 수용체의 상호작용(interaction)을 조절하는지 테스트하는 단계를 포함하는 KRS와 67LR의 상호작용을 저해하는 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 시료에서 67LR의 과발현 여부를 분석하는 단계; 및

(b) 67LR이 과발현된 시료에서 KRS의 과발현 여부를 분석하는 단계를 포함하는 폐암 또는 유방암을 진단하는 방법을 제공한다.

기술적 해결방법

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 KRS가 암 전이 또는 암 세포 이동에 미치는 영향을 처음으로 규명하였다. 즉, 본 발명은 KRS가 원형질 막의 라미닌 수용체를 통해서 암 전이 또는 암 세포 이동에 영향을 미친다는 것을 규명하였다.

정의

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.

본 발명에서 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.

본 발명에서 "숙주세포(host cell)"이라 함은 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다.

본 발명에서 "분리된(isolated)"라 함은 그것의 기원 환경(예: 만일 자연적으로 생성되는 것이라면 자연 환경)으로부터 제거된 물질을 의미한다. 예컨대, 자연적으로 생성되는 핵산, 폴리펩티드, 또는 살아있는 동물에 존재하는 세포는 분리된 것이 아니지만, 동일한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 공동 존재하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된(separated) 세포는 이후, 그것이 자연 시스템으로 재도입된다 할지라도 분리된(isolated) 것이다. 상기 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/있거나 상기 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 상기 벡터나 조성물은 자연 환경의 일부가 아닌, 분리된 것이다.

본 발명에서 KRS의 생체활성과 대하여 "조절한다(modulate)"이라 함은 KRS의 세포 내 수준의 변화를 말한다. KRS 활성의 조절은 상향 조절(up-regulation)(즉, 활성화 또는 촉진) 또는 하향 조절(down-regulation)(즉, 저해 또는 억제)일 수 있다. 예컨대, 조절은 KRS의 세포 내 수준, KRS 단백질의 안정성, KRS의 효소적 수식(예: 인산화), 결합 특성(예: 표적 전사 조절 인자에 대한 결합), 또는 KRS의 다른 생물학적, 기능적 및 면역학적 특성의 변화를 야기할 수 있다. KRS의 생체활성의 변화는, 예컨대, KRS 유전자 발현의 증가 또는 감소, KRS 단백질을 암호화하는 mRNA의 안정성, 번역 효율로부터 초래될 수 있다. KRS 조절자(modulator)의 작용 방식(mode)는 예컨대, KRS 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자에 대한 결합을 통해 직접적인 것일 수도 있다. 또한 상기 변화는 KRS를 조절하는 다른 물질(예: KRS를 특이적으로 인산화시키는 카이네이즈)에 대한 결합 및/또는 수식(예: 효소학적으로)을 통한 간접적인 것일 수도 있다.

본 발명에서 "폴리펩티드(polypeptide)"는 "폴리펩티드들(polypeptides)" 또는 "단백질(들)"과 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "KRS 폴리펩티드"는 라이실 tRNA 합성효소로 알려져 있는 폴리펩티드를 말한다. 상기 KRS 폴리펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다(Genbank Accession No. NP_005539.1). 또한 본 발명의 KRS는 이의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 기능적 동등물이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서,"실질적으로 동질의 생리활성"이란 원형질막의 라미닌 수용체와 상호작용하며, 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 KRS 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 KRS 폴리펩티드 의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 KRS 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 KRS의 아미노산 서열(서열번호 1)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 KRS의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, KRS의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

본 발명에 따른 KRS폴리펩티드는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 KRS또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예: 서열번호 2(Genbank Accession No. D32053))을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

본 발명에서 67 kDa의 라미닌 수용체(67LR)는 원형질막에 포매된(embedded) 비-인테그린형 수용체로서 예를 들어, Genbank Accession No. NM_002295, S37431, AF284768, S37431, AF284768, J03799, XP 370865, XP 001083023.에 기재된 염기서열 또는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 "핵산", "DNA 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 발명에서 "상기 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는다. 상기 핵산은 천연에서 분리되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 "아날로그(analog)"라 함은 표준 물질(reference molecule)과 구조적으로 유사하지만, 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 표준물질과 비교할 때, 아날로그는 당업자에 의해 예상될 수 있는 바와 같이 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성(utility)를 가진다. 향상된 성질(예: 표적 물질에 대한 더 높은 결합 친화력)을 갖는 공지의 화합물 변이체를 규명하기 위한 아날로그의 합성 및 스크리닝은 약리 화학적 분야에 공지된 방법이다.

본 발명에서 "상동체(homologues)"라 함은 단백질 및/또는 단백질 서열을 언급하는 경우에는 공통의 조상 단백질(common ancestral protein) 또는 단백질 서열에서 자연적으로 또는 인위적으로 유래된 것을 나타낸다. 유사하게 핵산 및/또는 핵산 서열은 그들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래되었을 때 상동하다.

본 발명에서 "유효량(effective amount)"이라 함은 세포 또는 조직 내에서 KRS의 생체활성(예: 세포 내 수준 등)을 정상 세포나 조직과 다르게 변경시키는 효과 또는 암 전이 또는 암 세포 이동 양태를 대조군에 비해서 의미있는 변화를 나타내는 양을 말한다.

본 발명에서 "접촉(contacting)"이라 함은 이의 일반적인 의미(normal meaning)이며, 2개 이상의 제제(예: 2개의 폴리펩티드)를 결합(combine)시키거나, 제제와 세포(예; 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpresion)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다.

본 발명에서 "제제(agent)" 또는 "시험 제제(test agent)"라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험 제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.

상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).

본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 KRS 또는 이의 단편이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 KRS에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. KRS의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisengerg ＆ D. C. Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). KRS의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 5, 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4^th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 본 발명의 KRS는 원형질막으로 전좌(translocation)되어 67LR과 상호작용함으로써 종양(또는 암) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이(metastasis)에 영향을 미친다는 것을 밝혔다. 아울러, 마우스를 이용한 in vivo 실험을 통해서 KRS의 과발현 또는 발현 억제가 종양(또는 암)세포의 전이를 조절할 수 있음을 밝혔다.

따라서, 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS)의 세포내 수준을 조절(modulating)하여 암 전이(cancer metastasis)를 조절하는 방법을 제공한다.

이를 보다 상세히 설명하면, 본 발명의 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 감소시키는 경우 암 전이를 억제할 수 있으며, 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 증가시키는 경우 암 전이를 증진할 수 있다.

세포내 수준의 감소 또는 증가는 상기에서 기재한 바와 더불어 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 세포내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법, 또는 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법, 예를 들면 프로모터 또는 유전자 부위의 돌연변이를 유도하여 프로모터 활성 또는 단백질의 기능을 저해하는 방법, 안티센스(antisense) 유전자를 발현시키는 방법, siRNA 또는 마이크로RNA(microRNA) 방법 등에 의해 수행될 수 있다.

전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진 또는 저해시키기 위한 방법, 예를 들면, KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진 또는 저해하는 방법, 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성을 증진 또는 저해하는 방법 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 활성을 증진 또는 저해하는 방법에 의해 수행될 수 있다

상기 방법의 보다 구체적인 예로 1군 인트론 타입, Ml RNA 타입, 망치머리(hammerhead) 형, 또는 머리핀(hairpin) 형 또는 마이크로RNA 형 등의 전사된 mRNA에 작용하는 RNA를 암호화하는 DNA서열로 형질전환하거나, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환을 통한 동시억제(cosuppression)를 유도할 수 있다.

바람직하게는 본 발명에서 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포내 수준을 조절하는 것은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가 또는 감소시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가 또는 감소시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시키거나, 프로모터에 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 또는 siRNA 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 감소시킬 수 있다. 이 때 상기 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

아울러, 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 조절하여 암 세포의 이동(cancer cell migration)을 조절하는 방법을 제공하며, 세포내 수준의 조절 등에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.

또한, 본 발명의 KRS는 그 발현을 억제시키는 경우 종양(또는 암)의 전이가 억제되므로 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 KRS에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 상기에서 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자는 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA일 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 질환은 암일 수 있다. 상기 암은 이에 제한되지는 않으나, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 등을 포함한다.

상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 KRS에 대한 항체를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및 치료 방법을 제공한다. 이 때, 구조 유전자는 상기에 기재한 바와 같으므로 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 또는 KRS에 대한 항체를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 '유효한 양'이라 함은 본 발명의 발현벡터가 투여 대상인 개체 내에서 암 의 예방 또는 치료하는 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체(subject)'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다.

또한, 본 발명은 암 치료제를 제조하기 위한, 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 KRS에 대한 항체의 용도를 제공한다. 보다 상세하게는 본 발명은 암 치료제를 제조하기 위한, 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 또는 KRS에 대한 항체의 용도를 제공한다. 상기에서 프로모터, KRS, 발현 벡터, 적용되는 암에 대해서는 상기에 기재한 바와 같다.

상기에서 KRS에 대한 항체는 KRS의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 KRS 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같은 KRS에 대한 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 KRS 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

하이브리도마 방법은 폐암 진단 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, KRS 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 파지 항체 라이브러리 방법은 세포내에 존재하는, 다양한 폐암 마커에 대한항체 유전자(Single chain fragmentvariable, scFv형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 폐암 단백질과 결합하는 모노크로날 항체를 분리, 제작하는 방법이다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리한다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

아울러, 본 발명에서는 KRS의 세포내 수준을 감소시키는 경우 암의 전이를 억제하여 암의 예방 및 치료에 이용할 수 있다는 점을 밝혔으므로 본 발명은 KRS의 활성을 저해하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 KRS의 활성을 저해하는 제제를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및 치료 방법을 제공하며, 암 치료제를 제조하기 위한, KRS의 활성을 저해하는 제제의 용도도 제공한다. 암, 개체, 유효한 양 등에 대해서는 상기에 기재한 바와 같다.

KRS의 활성을 저해하는 제제는 KRS의 발현을 저해, 즉, mRNA 또는 단백질 수준에서의 발현을 저해하는 제제, 예를 들어, KRS에 대한 antisense RNA 또는 siRNA일 수 있으며, 발현된 KRS의 활성을 저해하는 경쟁적 저해제(competitive inhibitor) 또는 비경쟁적 저해제, 예를 들어 KRS에 대한 항체일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

KRS의 세포내 수준을 감소시키는 경우 암의 전이를 억제하여 암의 예방 및 치료에 이용할 수 있으므로 조성물, 방법 및 용도는 그 자체 뿐만 아니라 종래에 공지된 다양한 암 예방 및 치료방법이나 항암제와 결합하여 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물, 방법 등은 암의 전이를 억제할 수 있으므로 종래 항암제 또는 암 예방 및 치료방법과 결부하여 치료에 이용한다면 암의 전이가 억제되어 주된 종양 부위의 치료를 통한 암의 완치에 효과적일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드에 연결될 수 있는 항암제 또는 암 예방 및 치료방법은 종래 암 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 항암제로서는 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea) 등이 있다. 상기 제제와 본 발명의 조성물 또는 예방 및 치료방법의 결합은 항암제의 종류 및 양에 따라 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 수행될 수 있다.

본 발명의 발현벡터, KRS에 대한 항체 또는 KRS의 활성을 저해하는 제제는, 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 상기 발현벡터, KRS에 대한 항체 또는 KRS의 활성을 저해하는 제제는 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 각종 약학적 제형의 형태로 제조될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 발현벡터, KRS에 대한 항체 또는 KRS의 활성을 저해하는 제제를 포함하는 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer)등의 형태로 제조할 수 있으며 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 발현벡터, KRS에 대한 항체 또는 KRS의 활성을 저해하는 제제의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 발현벡터, KRS에 대한 항체 또는 KRS의 활성을 저해하는 제제를 포함하는 조성물은 질환의 정도 및/또는 목적에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 1회 투여시 0.1 ㎍ 내지 100 mg, 바람직하게는 1 ㎍ 내지 10 mg의 유효 용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다. 그러나, 상기 발현벡터 또는 KRS의 활성을 저해하는 제제의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 발현벡터 또는 KRS의 활성을 저해하는 제제를 함유하는 약학적 조성물은 본 발명에 의한 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

한편. 상기 발현벡터는 감염(infection), 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터를 이용한 유전자 전달 방법은 포유동물 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서, FDA로부터 승인받은 인간에게 사용할 수 있는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다. 상기 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한, 상기 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus), 렌티바이러스(Lenti virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다(Miller, A.D., Nature, 357:455-460, 1992). FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986). 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다(Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155, 1992; Jaffe et al., Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.

또한 상기 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자는 다른 방법, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직의 종양세포를 치료하기 위한 유효량으로 표적 암 또는 종양세포 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식기관, 폐 및 기관지 시스템과 같은 체강(body cavity)에 있는 암 또는 종양의 경우에는 본 발명의 구조유전자(또는 본 발명의 구조유전자를 포함하는 발현벡터)를 함유하는 약학적 조성물을 암 또는 종양에 의해 영향을 받는 유강 기관(hollow organ) 내에 바늘, 도관(catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다. 이때, X-선, 소노그램(sonogram), 또는 광섬유 시스템(fiberoptic visualization system)과 같은 영상 장치가 표적조직의 위치확인과 바늘 또는 도관의 주입에 사용될 수 있다. 그 밖에, 직접적으로 도달할 수 없거나 분석학적으로 분리해낼 수 없는 종양 또는 암의 경우에는 본 발명의 조성물을 혈액순환계 내로 투여할 수 있다.

또한 본 발명은

상기 스크리닝 방법은 당업계에 공지된 다양한 생화학적 및 분자생물학적 기술이 상기 방법을 실시하는데 이용될 수 있다. 상기 기술은 다음의 문헌에 개시되어 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York(1987-1999).

바람직하게는, 상기 시험 제제가 먼저 KRS의 생물학적 활성을 조절하는 능력이 있는지 어세이한다(1차 어세이 단계). 구체적으로 1차 단계에서는 시험 제제의 존재 하에서 분리된 KRS의 생물학적 활성을 어세이(assay)하여 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절하는 조절 제제(modulating agent)를 규명(identify)한다. 보다 바람직하게는 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(b) KRS의 활성을 측정하여 KRS의 활성을 변화시키는 시험 제제를 선별하는 단계;

1차 어세이 단계에서는 KRS의 여러 생물학적 활성에 대한 조절이 어세이될 수 있다. 예컨대, 시험 제제는 KRS의 발현 수준, 예컨대, 전사 또는 번역을 조절하는 활성이 있는지에 대하여 어세이될 수 있다. 또한 상기 시험 제제는 KRS의 세포 내 수준 또는 안정성, 예컨대 번역 후 수식(post-translational modification) 또는 가수분해를 조절하는 활성이 있는지에 대하여 어세이될 수 있다.

이후, 상기 1차 어세이 단계를 통하여 KRS의 생물학적 활성을 증가시키는 조절 제제를 규명한 후, 상기 시험 제제가 라미닌 수용체(67LR), 나아가 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는 능력이 있는지를 KRS의 존재 하에서 더욱 테스트한다(2차 시험 단계). 예컨대, 상기 시험 제제는 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는 활성이 있는지에 대하여 더욱 테스트된다.

위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 규명된 KRS-조절 제제는 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절할 수 있다. 만약, 상기 1차 어세이 단계에서 규명된 시험 제제가 KRS-조절 제제의 세포 내 수준(예: 전사 활성의 변경에 의하여)을 조절한다면, 그것은 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절할 수 있다.

한편, 만약 시험 제제가 KRS의 세포 내 수준이 아닌 다른 활성을 조절한다면, KRS에 대한 상기 시험 제제의 조절 효과가 암 전이 또는 암 세포 이동을 실제로 조절하는지를 확인하는 것이 필요하다. 예컨대, KRS의 인산화 활성을 조절하는 시험 제제는 KRS의 인산화 활성의 조절이 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절할 수 있는지를 확인하기 위하여 더욱 테스트될 것을 필요로 한다.

상기 1차 및 2차 단계 모두, 변하지 않은(intact) KRS 및 이의 단편, 아날로그, 또는 기능적 동등물을 사용할 수 있다. 이들 어세이에 사용될 수 있는 단편은 일반적으로 KRS 의 생물학적 활성을 하나 이상 보유한다. 바람직하게는 KRS의 단편은 서열번호 1의 1-72의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한 상기 단편 또는 아날로그를 포함하는 융합 단백질이 시험 제제를 위한 스크리닝에 사용될 수 있다. KRS 의 기능적 동등물은 아미노산 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 가지기는 하나 KRS와 동일한 생체활성을 보유하는 것이므로 본 발명의 스크리닝 방법을 실시하는데 사용될 수 있다.

당업계에 통상적으로 실시되고 있는 다양한 어세이들이 KRS를 조절하는 제제를 규명하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 제제는 세포 기반 어세이 시스템(cell based assay system)으로 스크리닝될 수 있다. 예컨대, 스크리닝하기 위한 전형적인 세포 기반 어세이에서(즉, 2차 시험 단계에서), 시험 제제의 존재 하에서 리포터 유전자 활성(예: 효소 활성)을 측정하고, 이를 시험 제제의 부재 하에서의 리포터 유전자의 활성과 비교한다. 상기 리포터 유전자는 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 폴리펩티드(반응 또는 리포터 폴리펩티드), 예컨대, 형광 또는 인광(phosphorescence)에 의해 검출가능한 폴리펩티드나 그것이 보유하고 있는 효소 활성에 의해 검출가능한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 검출가능한 반응 폴리펩티드(detectable reponse polypeptide)는, 예컨대, 루시퍼라제, 알파-글루쿠로니다제(glucuronidase), 알파-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질 및 인간 분비된 알칼린 인산화효소일 수 있다.

세포-기반 어세이에서, 시험 제제(예: 펩티드 또는 폴리펩티드)는 숙주세포 내에 존재하는 다른 벡터에 의해 발현될 수 있다. 어떤 방법에서는, 시험 제제의 라이브러리가 상기 벡터의 라이브러리(예: cDNA 라이브러리)에 의해 암호화된다. 상기 라이브러리는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있으며(Sambrook et al. and Ausubel et al., supra), 또는 다양한 상업적인 출처로부터 얻어질 수 있다.

상기 기재한 세포-기반 어세이 이외에, 비-세포 기반 방법에 의해서도 스크리닝될 수 있다. 상기 방법은, 예컨대, 모빌리티 쉬프트 DNA 결합 어세이(mobility shift DNA-binding assays), 메틸화 및 우라실 간섭 어세이(methylation and uracil interference assays), DNase 및 히드록시 라디칼 풋프린팅 분석(DNase and hydroxyl radical footprinting analysis), 형광 편광(fluorescence polarization) 및 UV 교차결합(crosslinking) 또는 화학적 가교제(cross-linkers)를 포함한다. 일반적인 개요는 Ausubel 등의 문헌에 개시되어 있다(Ausubel et al., supra, chapter 12, DNA-Protein Interaction). 핵산 및 DNA/RNA 결합 단백질을 포함하는 공동-결합된 단백질(co-associating protein)을 분리하는 기술은, 절단가능한 가교제 디티오비스(dithiobis)(succinimidylpropionate) 및 3,3'-디티오비스(sulfosuccinimidyl-propionate)를 포함하는 UV 교차결합 또는 화학적 가교제를 포함한다(McLaughlin, Am. J. Hum. Genet., 59:561-569, 1996; Tang, Biochemistry, 35:8216-8225, 1996; Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:10712, 1996; and Chodosh, Mol. Cell. Biol., 6:4723-4733, 1986).

1차 어세이 단계: KRS를 조절하는 제제의 스크리닝

많은 어세이 시스템이 KRS의 조절인자를 위한 시험 제제를 스크리닝하는데 적용될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 상기 스크리닝은 시험관 내 어세이 시스템 또는 세포-기반 어세이 시스템을 이용할 수 있다. 이 스크리닝 단계에서, 시험 제제는 KRS와의 결합, KRS의 세포내 수준 변경, 또는 KRS의 다른 생물학적 활성의 조절에 대하여 스크리닝될 수 있다.

1) KRS에 결합하는 제제의 스크리닝

1차 스크리닝 단계에서 KRS와 시험 제제의 결합이 측정될 수 있다. KRS에 대한 시험 제제의 결합은, 예컨대, 표지된 시험관 내 단백질-단백질 결합 어세이, EMSA(electrophoretic mobility shift assays), 단백질 결합을 검출하기 위한 면역어세이, 기능적 어세이(인산화 어세이 등) 등과 같은 다양한 방법으로 어세이될 수 있다(U.S. Pat. Nos. 4,366,241:4,376,110; 4,517,288 and 4,837,168; and Bevan et al., Trends in Biotechnology, 13:115-122, 1995; Ecker et al., Bio/Technology, 13:351-360, 1995; and Hodgson, Bio/Technology, 10:973-980, 1992). 시험 제제는 KRS와의 직접적인 결합, 예컨대, KRS에 대한 항체에 의한 KRS 폴리펩티드와의 공동-침전(co-immunoprecipitation)을 검출함으로써 확인될 수 있다. 또한 시험 제제는 KRS와 시험 제제의 결합을 나타낼 수 있는 시그널, 예컨대, 형광 퀀칭(quenching)을 검출함으로써 확인될 수 있다.

경쟁 어세이(competition assays)는 KRS에 특이적으로 결합하는 시험 제제를 규명하는데 적당한 포맷(format)을 제공한다. 상기 포맷에서, 시험 제제는 KRS와 결합하는 것으로 이미 공지된 화합물과의 경쟁을 통해 스크리닝된다. 공지된 결합 화합물은 합성 화합물일 수 있다. 또한 그것은 KRS를 특이적으로 인식하는 항체, 예컨대, KRS에 대한 단일클론 항체일 수 있다. 만일 시험 제제가 공지된 KRS과 공지된 화합물의 결합을 저해한다면, 상기 시험 제제는 KRS에도 결합한다.

다양한 종류의 경쟁 어세이들이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 고체상 직접 또는 간접적 효소 방사면역측정법(solid phase direct or indirect radioimmunoassay, RIA), 고체상 직접 또는 간접적 효소 면역측정법(EIA), 샌드위치 경쟁 어세이(Stahli et al., Methods in Enzymology, 9:242-2453, 1983); 고체상 직접 바이오틴-아비틴 EIA(Kirkland et al., J. Immunol., 137:3614-3619, 1986); 고체상 직접 표지화된 어세이, 고체상 직접 표지화된 샌드위치 어세이(Harlow and Lane, Antibodies, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988); ¹²⁵I를 이용한 고체상 직접 표지 RIA(Morel et al., Mol. Immuno., 25(1);7-15, 1988; 고체상 직접 바이오틴-아비틴 EIA(Cheung et al., Virology, 176:546-552, 1990); 및 직접 표지화된 RIA(Moldenhauer et al., Sacnd. J. Immunol., 32:77-82, 1990). 일반적으로 상기 어세이들은 비표지화된 시험 제제 및 표지화된 대조 화합물을 포함하고 있는 세포 또는 고체 표면에 결합되어 있는 정제된 폴리펩티드의 이용을 포함한다. 경쟁적 저해는 시험 제제의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 경쟁 어세이에 의해 규명된 조절 제제는 대조 화합물과 동일한 에피토프에 결합하는 제제 및 입체 저해(steric hindrance)가 일어나도록 하기 위해 대조 화합물에 의해 결합된 에피토프에 충분하게 근접한 인접 에피토프와 결합하는 제제를 포함한다. 통상적으로 경쟁 저해가 과도하게 존재할 때, 일반적인 표적 폴리펩티드에 대한 대조 화합물의 특이적인 결합이 적어도 50 또는 75％ 저해될 것이다.

상기 스크리닝 어세이는 불용성 또는 용해성 포맷일 수 있다. 불용성 어세이의 일 예는 KRS 또는 이의 단편을 고체 상 매트릭스에서 고정화하는 것이다. 이후, 시험 제제가 결합하기에 충분한 시간 동안 고체상 매트릭스를 시험 제제와 접촉하여 둔다. 이후, 고체상 매트릭스로부터 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거한 후, 고체상에 결합된 제제의 존재를 확인한다. 상기 방법은 고체상 매트릭스로부터 결합된 제제를 용리하여 제제를 분리하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 양자택일적으로, KRS를 고정화시키는 다른 방법은 시험 제제를 고체상 매트릭스에 결합시킨 후, KRS를 첨가하는 것이다.

용해성 어세이는 위에 기재된 몇몇 결합 라이브러리 스크리닝 방법을 포함한다. 용해성 어세이 포맷하에서, 시험 제제나 KRS는 모두 고체 지지대에 결합하지 않는다. 시험 제제에 대한 KRS 또는 이의 단편의 결합은 예컨대, KRS 및/또는 시험 제제의 형광에 의해 측정될 수 있다. 형광은 내재적이거나(intrinsic) 형광물질(fluorophor)을 가진 성분의 표지에 의해 부여될 수 있다.

몇몇 결합 어세이에서, KRS, 시험 제제 또는 제3의 물질(예: KRS에 결합하는 항체)은, 주어진 조건에서 상기 폴리펩티드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 공유적으로 결합 또는 검출가능한 표지나 그룹, 또는 가교가능한 그룹에 링크되어 제공될 수 있다. 이들 검출가능한 그룹들은 검출가능한 폴리펩티드 그룹, 예컨대, 어세이가능한(assayable) 효소 또는 항체 에피토프를 포함한다. 양자택일적으로, 상기 검출가능한 그룹은 방사성동위원소(예: ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S) 또는 화학발광성 또는 형광성 그룹과 같은 다른 검출가능한 그룹 또는 라벨에서 선택될 수 있다. 유사하게, 상기 검출가능한 그룹은 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다.

2) KRS의 다른 생체활성을 조절하는 제제의 스크리닝

KRS와 시험 제제의 결합은 시험 제제가 KRS의 조절자임을 나타낸다. 또한 이는 상기 제제가 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하기 위해서 라미닌 수용체의 생체활성을 조절할 수 있음을 제시한다. 따라서, KRS와 결합하는 시험 제제는 라미닌 수용체 활성을 조절하는 능력을 가지고 있는지 더욱 테스트되어야 한다.

양자택일적으로, KRS와 결합하는 시험 제제는 KRS에 대한 그의 활성을 측정하기 위하여 더욱 조사될 수 있다. 그런 활성의 존재, 성질 또는 범위는 활성 어세이에 의해 테스트될 수 있다. 상기 활성 어세이는 KRS에 대한 시험 제제의 결합이 실제로 KRS에 대한 조절 활성을 갖는 것을 확인할 수 있다. 매우 흔히, 상기 조절 어세이들은 KRS의 활성을 조절하는 시험 제제를 규명하기 위하여 독립적으로 사용될 수 있다(즉, KRS에 결합하는 능력을 어세이하는 첫 단계 없이). 일반적으로 상기 방법들은 KRS의 생물학적 활성을 테스트하는데 필요한 다른 물질 또는 시약의 존재 또는 부재 하에서 KRS를 포함하는 샘플에 시험 제제를 첨가하고, KRS의 생물학적 활성의 변경을 측정하는 것을 포함한다. KRS의 효소 또는 다른 생물학적 활성을 조절하는 제제를 스크리닝하는 어세이에 더하여, 상기 활성 어세이는 KRS의 발현 또는 세포 내 수준의 변화를 위한 시험관 내 스크리닝 및 생체 내 스크리닝을 포함한다.

2차 시험 단계: 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는 제제의 스크리닝

일단 조절 제제가 KRS와 결합하거나 및/또는 KRS의 생물학적 활성(세포 내 수준을 포함)을 조절하는 것으로 규명되면, 상기 제제는 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는 능력을 가지고 있는지에 대하여 더욱 테스트될 수 있다. 상기 조절 제제에 의한 암 전이 또는 암 세포 이동의 조절은 일반적으로 KRS의 존재 하에서 테스트된다. 만약 세포-기반 스크리닝 시스템을 이용하는 경우, KRS는 숙주세포에 도입된 발현 벡터로부터 발현될 수 있다. 양자택일적으로 KRS는 스크리닝 시스템에서 숙주세포에 의하여 내생적으로 공급될 수도 있다.

또한 본 발명은

상기 제제는 KRS와 라미닌 수용체(67LR)의 상호작용을 촉진 또는 강화하는 것일 수 있으며, 반대로 상기 상호작용을 억제 또는 약화시키는 것일 수 있다.

상기 (b) 단계의 테스트는 상기 조절 제제가 접촉되지 않은 세포 또는 이의 용해물에서의 67LR과 KRS의 상호작용 수준에 대한 상기 조절 제제가 접촉된 세포 또는 이의 용해물에서의 67LR과 KRS의 상호작용 수준의 상대적인 변화를 측정(detecting)하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 위에서 언급한 바와 같은 표지된 시험관 내 단백질-단백질 결합 어세이(시험관 내 풀-다운 어세이), EMSA(electrophoretic mobility shift assays), 단백질 결합을 위한 면역어세이, 기능적 어세이(인산화 어세이 등), 효모-2 하이브리드 어세이, 비면역침전 어세이, 면역침전 웨스턴 블럿 어세이, 면역-공동-위치화 어세이(immuno-co-localization) 등 당업계에 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있다.

예컨대, 박테리아 리프레서 LexA 또는 효모 GAL4의 DNA-결합 도메인 및 효모 GAL4 단백질의 트랜스엑티베이션(transactivaton) 도메인에 각각 융합된, KRS와 67LR, 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체(homologues)를 발현하는 효모를 이용하여 효모-2 하이브리드 어세이를 수행할 수 있다(KIM, M. J. et al., Nat. Gent., 34:330-336, 2003). KRS와 67LR의 상호작용은 LexA 단백질 또는 GAL4의 DNA-결합 도메인에 결합된 조절 서열을 가지고 있는 프로모터의 통제 하에서 리포터 유전자의 발현을 유도하는 트랜스엑티베이터를 재구성하게 한다.

상기 리포터 유전자로는 위에서 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 폴리펩티드를 암호화하는 유전자(예: CAT(chloramphenicol acetyltransferase), 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시타제, 알칼린 포스파타제 및 GFP(green fluorescent protein) 등 를 사용할 수 있다. 만약 KRS와 67LR, 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체의 상호작용은 시험 제제에 의해 촉진되거나 강화되는 경우, 상기 리포터 유전자의 발현은 정상 조건에 비해 더욱 증가된다. 반대로, 상기 상호작용이 시험 제제에 의해 저해되거나 약화되는 경우, 상기 리포터 유전자는 발현되지 않거나 정상 조건에 비해 덜 발현된다.

또한 리포터 유전자로는 효모의 성장을 가능하게 하는 단백질(즉, 상기 리포터 유전자가 발현되지 않을 때 효모의 성장이 억제된다)을 암호화하는 것으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 또는 질소 염기를 위한 생합성 과정에 관계있는 효소를 암호화하는 영양요구성(auxotropic) 유전자(예: ADE3, HIS3 등의 효모 유전자 또는 다른 종 유래의 동등 유전자)일 수 있다. 이 시스템에서 발현된 KRS와 67LR, 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체의 상호작용은 시험 제제에 의해 억제되거나 약화되는 경우, 리포터 유전자는 발현되지 않거나 덜 발현된다. 따라서, 상기 조건 하에서 효모의 성장은 정지되거나 느려진다. 이러한 리포터 유전자의 발현에 의한 효과는 육안이나 장치(예: 현미경)를 통하여 관찰될 수 있다.

아울러, 본 발명에서는 폐암 또는 유방암 환자를 대상으로 하여 67LR 및 KRS의 과발현 여부를 확인한 결과, 67LR이 과발현된 경우 KRS의 과발현과 폐암 또는 유방암과의 관련성이 높음을 알 수 있었다(표 1 참조). 따라서, 본 발명은

(a) 시료에서 67LR의 과발현 여부를 분석하는 단계; 및

진단을 위한 시료의 채취 및 처리와 67LR 및 KRS의 과발현 여부의 분석은 통상적인 분자생물학적 기법을 사용할 수 있으며, 이는 상기에서 기재한 바와 같다.

본 발명에 기재된 도면에 대해서 다음과 같이 설명한다.

도 1 내지 도 6은 인간 KRS와 라미닌 수용체의 특이적 상호작용을 확인한 것이다. 도 1에서, 전체 길이의 인간 KRS와 37LRP/p40간의 상호작용은 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 수행되었다. 다중-ARS 복합체의 두 구성요소인 AIMP1 및 AIMP2는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. 양성 상호작용은 x-gal을 함유한 효모배지에서 청색 콜로니의 형성에 의해 표지되었다. 도 2에서, 37LRP는 35S 메티오닌의 존재하에서 in vitro 번역에 의해 합성되었고, 이들을 GST-KRS 또는 GST와 반응하였다(pull-down). GST-KRS와 공침전된(co-precipitated) 37LRP은 자가방사촬영법을 이용하여 측정하였다. 도 3에서, KRS 및 37LRP의 상호작용에 연관된 펩티드 부위는 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 측정되었다. N말단의 세포내 부위(54 내지 113번째 아미노산) 및 C말단의 세포외 부위(137 내지 210번째 아미노산)를 가지고 있는 296개 아미노산을 가진 37LRP는 막간 도메인(113 내지 137번째 아미노산)에 의해 구분되어 진다. 인간 KRS(597개의 아미노산)의 N말단 특이적 확장(약 70개의 아미노산)부위 다음에 OB-fold 안티코돈-결합성 도메인(약 70 내지 214 아미노산)과 촉매 도메인(약 220 내지 574 아미노산)이 위치해 있다. 도 4에서, Myc-KRS에 감염된 A549 세포를 용해하여 항-Myc 및 항-라미닌 수용체 항체로 면역블롯을 실시하였다. Myc-KRS를 항-Myc 항체와 면역침전시키고, 67LR 및 37LRP로 공침전시켜 면역블롯을 수행하였다. 37LRP 및 67LR의 특이적 블롯을 위해, 다중항체인 H-141 및 F-18(Santacruz)이 각각 사용되었다.(WCL : whole cell lysate) 도 5에서, Myc-KRS로 감염된 A549 세포의 용해물을 지시한 항체로 웨스턴블롯을 시행하였다. 세포는 세포질(C) 및 막 분획(M)으로 분리되어 항-Myc 항체로 면역침전되었고, 37LRP 및 67LR로 공침전된 것은 웨스턴블롯으로 조사하였다. 대조군으로서 IgG를 사용하였다. 도 6에서 라미닌(10ug/ml, 1h) 처리했을 경우, 67LR 과 KRS 간의 결합이 늘었음을 확인하였다. 이를 보기 위해, 67LR 를 인식하는 antibody(abcam, cat ＃ ab2508)로 면역침전(immunoprecipitation)을 하였고, 왼쪽의 IgG 라벨은 토끼 으로부터 얻은 전체 IgG(total IgG)로서 음성대조군으로 사용되었다. 10％ SDS PAGE를 수행한 다음, PVDF 막 에 옮긴 뒤, KRS와 67LR을 인식하는 항체로 각각 면역블럿을 하였다.

도 7 내지 도 12는 라미닌-유도성 막 전위(translocation) 및 KRS의 인산화에 대해서 확인한 것이다. 도 7에서, A549 세포를 라미닌(10ug/ml)으로 처리하여 웨스턴블롯을 이용하여 67LR, 37LRP 및 KRS의 양(level)을 시간대별로 관찰하였다. Hsp90 및 케드헤린(Cad)을 각각 세포질 및 막의 마커로 사용하였다. 도 8에서, A549 세포를 1시간동안 라미닌으로 처리, 또는 무처리하여 항-67LR(MLuC5, Santacruz, sc-59732)(적색) 및 KRS 항체(녹색)을 사용하여 면역형광염색을 실시하였다. 도 9에서, A549 세포를 PLC-감마, PKC 및 PI3K를 각각 억제하는 U73122(U), 스타우로스포린(staurosporin, ST) 및 LY294002(LY)로 3시간동안 처리하고 라미닌으로 1시간동안 처리한 후, 이들 인산화효소 억제제가 67LR 및 KRS의 세포질 및 막에 어떠한 영향을 끼치는지를 확인하였다. 도 10에서, A549세포를 Myc-KRS로 감염시켜 24시간동안 배양하였다. 이후, 표시된(indicated) 약물로 처리하고, 상기와 같이 라미닌으로 처리하였다. Myc-KRS으로 면역침전하고, 항-p-Thr, -Ser, 및 -Tyr 항체로 면역블롯을 실시하였다. 도 11에서, A549 세포 세포를 Myc-KRS로 감염시켜 24시간동안 배양하였다. 감염된 세포를 LY294002로 3시간동안 전처리하고, 라미닌으로 1시간동안 처리하였다. Myc-KRS는 면역침전되었고, 67LR의 공침전은 웨스턴블롯으로 조사하였다. 면역침전법의 대조군으로서 IgG를 사용하였다. 도 12에서, 상기한 바와 같이 A549세포를 라미닌 및 LY294002의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. EPRS(glutamyl-prolyl-tRNA synthetase)는 이에 특이적인 항체(AbCam)와 면역침전되었고, KRS의 공침전은 웨스턴블롯으로 확인하였다(상). 면역-소진 상층액(immune-depleted supernatant: ID)으로 항-KRS 및 EPRS 항체와 웨스턴블롯을 수행하였다.

도 13 내지 도 17은 KRS는 막-결합성 67LR을 안정화시킨다는 점을 확인한 것이다. 도 13에서, A549 세포를 si-대조군(si-cont) 또는 si-KRS로 감염시키고, 라미닌의 존재 또는 부존재 하에서 배양시켰다. 이후, 세포들을 세포질과 막 분획으로 분리하여 각각의 분획에서의 67LR 및 KRS의 양을 웨스턴블롯으로 확인하였다. 케드헤린(적색) 및 hsp90을 각각 세포막 및 세포질의 마커로 사용하였다. 도 14에서, A549 세포에 있어서 막-결합성 67LR의 양은 항-LR 항체(MluC5)를 이용하여 유세포 분석기로 관찰되었다. 공벡터 또는 KRS 플라스미드로 감염된 세포들을 24시간동안 배양하였다.(상) 67LR의 양에 있어서 KRS 억제의 효과를 보기 위하여, 세포를 si-KRS 또는 si-대조군로 감염시키고 48시간동안 배양하였다.(하) 도 15에서, EV(공벡터) 또는 KRS로 감염시킨 A549 세포를 G418로 1주일간 선별하고 항-LR 항체(MluC5)를 이용한 면역형광 염색을 이용하여 67LR의 세포내 분포를 확인하였다. 막에 분포한 LR은 흰색 화살표로 강조하였다. 도 16에서, A549 세포를 시클로헥시미드로 처리하여 새로운(de novo) 단백질 합성을 억제하고 세포막과 세포질 내의 67LR 양에 있어서 KRS 양의 효과를 웨스턴블롯으로 조사하였다. 도 17에서, 67LR의 세포적 안정성에 있어서 KRS의 중요성은 펄스-체이스 실험을 통하여 조사되었다. 293 세포를 si-KRS 또는 si-대조군로 감염시키고 방사성 메티오닌을 1시간동안 반응시켰다. 67LR을 67LR에 특이적으로 반응하는 항체(F-18, Santacruz)와 면역침전 시키고, SDS-PAGE에 의해 분리시킨 후, 자가방사촬영법을 실시하였다. 특이성 siRNA에 의한 KRS의 억제는 웨스턴블롯에 의해 수행되었으며, 로딩 대조군으로서 튜불린을 사용하였다.

도 18 내지 도 22는 KRS는 67LR을 통하여 세포 이동(cell migration) 및 암 전이를 촉진한다는 점을 확인한 것이다. 도 18에서, A549 세포를 표시된(indicated) 플라스미드로 감염시키고 라미닌의 부존재 또는 존재 하에서 배양하였고, 이들의 세포 이동에 대한 효과는 트렌스웰 챔버에서 이동한 세포를 측정하여 확인하였다. 막을 통과한 세포의 수를 계수하여 각 패널에 표시하였다. 실험은 3회 반복하였다. 도 19에서, 상기와 같이 처리한 세포들을 MMP-2의 활성 및 양 측정을 위하여 각각 자이모그래피 및 웨스턴블롯을 실시하는데 사용하였다. 도 20에서, 유방암 세포주인 4T-1 세포를 표시된(indicated) siRNA로 감염시키고, Balb/C 마우스의 등에 피하주사하였다. 21일 경과후, 마우스의 폐를 적출하여 직경 1mm 이상의 종양 결절을 계수하였다. 도 21에서, 외인성 KRS(KRS-1, 및 KRS-2)를 발현하는 2종의 서로 다른 4T-1 세포를 상기와 같이 접종하고 30일 경과후 계수하였다. 공벡터를 감염시킨 세포를 대조군으로 사용하였다. 도 22에서, 폐암(상) 및 유방암(하) 조직에서의 KRS 및 67LR의 발현량을 이들 각각의 항체를 이용한 면역조직화학 염색법을 사용하여 비교하였다. 39개의 폐암 및 40개의 유방암 조직을 이용하여 항-KRS 및 항-67LR 항체로 면역조직화학 염색을 실시하였고, 이들의 발현량은 정상조직의 그것과 비교되었다(각 조직당 9개의 시료). 여기에 보이는 동일 환자의 대표적인 쌍들은 KRS와 67LR의 과발현을 보여준다. KRS와 67LR의 통계학적 상관관계는 표 1에서 보여주고 있다.

도 23에서는 67LR의 막에서의 양은 KRS 발현에 의존한다는 점을 보여 준다. 도 23에서, 표시된(indicated) 플라스미드로 감염된 293 세포를 세포질 및 세포막 분획으로 분리하고, 각각의 분획에서 67LR, 37LRP 및 KRS의 양을 상응하는 항체를 이용한 웨스턴블롯을 수행하여 확인하였다.

도 24 내지 도 27은 세포이동, 단백질 합성 및 세포주기에 있어서 세포내 및 세포외 KRS의 효과를 확인한 것이다. 도 24에서, 라미닌 부존재 하에서 배양된 A549 세포의 이동은 트렌스웰 챔버에서 이동한 세포를 측정하여 확인하였다. 도 25에서, KRS의 화학주성적(chemotactic) 활성을 보고자, 표시된 농도로 KRS를 함유한 무혈청 배지를 트랜스웰 챔버의 아래 챔버에 넣고, A549 세포를 위 챔버에 넣어 배양하였다. 배양 6시간 경과후, 이동한 세포를 계수하였다. 도 26에서, A549 세포에서 KRS의 양은 siRNA와 외인성 KRS의 도입에 의해 하락 조절 또는 상승 조절되었다(도 26 및 도 27의 하단 패널). 감염된 세포는 각각 48시간 및 24시간 배양되고 무-메티오닌 배지에서 1시간동안 배양하여 영양결핍상태를 만든후 방사성 표지가 된 메티오닌으로 2시간동안 표지하였다. 세척후, 세포를 4시간동안 배양하고 0.5％ 트리톤 X-100 용해액으로 용해시키고 방사성 활성을 액상 섬광 계수기(liquid scintillation counting)로 측정하였다. 도 27에서, A549 세포를 표시된 바와 같이 감염시키고, 고정시켜 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide)로 염색하여 유세포 분석기에서 분석하였다.

도 28 내지 도 30은 암 전이에 있어서 KRS 억제의 효과를 확인한 것이다. 도 28에서, 표적 단백질의 발현에 있어서 si-KRS 및 si-DRS의 효과는 웨스턴블롯에 의해 조사되었다. 로딩 대조군으로서는 튜불린을 사용하였다. 도 29에서, siRNA가 감염된 세포(1 x 10⁶)을 상기의 방법과 같이 주사하였고, 21일 경과 후 종양의 크기 및 부피를 측정함으로써 1차 종양 증식에 있어서 KRS 및 DRS 억제의 효과를 조사하였다. 각각의 그룹은 5마리의 마우스를 사용하였다. 도 30에서, 상기의 마우스에서 적출된 폐는 10％ 포르말린 용액에 고정되었다. 전이성 종양 결절 및 수는 보여지는 바와 같다.

도 31 내지 도 33은 암 전이에 있어서 KRS 과발현의 효과를 확인한 것이다. 도 31에서, KRS-1 및 KRS-2세포주의 과발현은 웨스턴블롯에 의해 관찰되었다. 도 32에서, 1차 종양 증식에 있어서의 KRS 과발현의 효과는 서로 비교되었다. 도 33에서, 종양 전이에 있어서의 KRS 과발현의 효과는 접종후 30일째에 조사되었다. 각각의 그룹은 4마리의 마우스를 사용하였다.

도 1은 인간 KRS와 37LRP/p40간의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 확인한 것이다.
도 2는 인간 KRS와 37LRP의 상호작용을 풀 다운 분석을 통해서 확인한 것이다.
도 3은 인간 KRS와 37LRP의 상호작용 부위를 확인한 것이다.
도 4는 KRS의 67LR 및 37LRP와의 결합을 확인하기 위하여 Myc-KRS에 감염된 A549 세포에 대해서 항-Myc 및 항-라미닌 수용체 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 한 결과이다.
도 5는 KRS의 67LR 및 37LRP와의 결합을 확인하기 위하여 Myc-KRS로 감염된 A549 세포의 용해물에 대한 웨스턴블롯 분석을 한 결과이다.
도 6은 라미닌 처리에 따른 KRS 및 67LR의 결합을 면역 침전으로 확인한 것이다.
도 7은 A549 세포에 라미닌 처리시 67LR, 37LRP 및 KRS의 양(level)을 웨스턴블롯으로 확인한 것이다.
도 8은 A549 세포를 라미닌으로 처리 또는 무처리시 67 LR 및 KRS의 발현을 면역형광염색으로 확인한 것이다.
도 9는 인산화효소 억제제가 67LR 및 KRS의 세포질 및 막에서의 발현에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 10은 KRS를 발현하는 A549세포에서 라미닌 및 인산화효소 억제제 처리시 인산화 정도를 p-Thr, -Ser, 및 -Tyr 항체로 면역블롯을 실시하여 확인한 것이다.
도 11은 KRS를 발현하는 A549세포에서 인산화된 KRS의 67LR과의 결합여부를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 12는 KRS와 EPRS의 결합에 라미닌이 미치는 영향을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 13은 si-대조군 또는 si-KRS의 형질감염시 67L 및 KRS의 양을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 14는 A549 세포에 있어서 막-결합성 67LR의 양을 유세포 분석기로 확인한 것이다.
도 15는 EV(공벡터) 또는 KRS로 감염시킨 A549 세포에 대해서 67LR의 세포내 분포를 면역형광 염색으로 확인한 것이다.
도 16은 새로운 단백질 합성이 억제된 A549 세포에서 세포막과 세포질 내의 67LR 양에 있어서 KRS 양의 효과를 웨스턴블롯으로 확인한 것이다.
도 17은 67LR의 세포적 안정성에 KRS이 미치는 영향을 펄스-체이스 실험으로 확인한 것이다.
도 18은 KRS 및/또는 67LR의 발현 억제시 세포 이동에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 19는 KRS 및/또는 67LR의 발현 억제시 MMP-2 활성 및 양을 자이모그래피 및 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 20은 4T-1 세포주가 이식된 마우스에서 KRS발현 억제시 종양 결절의 수를 나타낸 것이다.
도 21은 4T-1 세포주가 이식된 마우스에서 KRS발현 증진시 종양 결절의 수를 나타낸 것이다.
도 22는 폐암 및 유방암 조직에서의 KRS 및 67LR의 발현량을 면역조직화학 염색법으로 확인한 것이다.
도 23은 67LR의 막에서의 양에 KRS 발현이 미치는 영향을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 24는 라미닌 부존재 하에서 배양된 A549 세포의 이동을 측정한 것이다.
도 25는 세포이동에 대한 KRS의 화학주성적(chemotactic) 활성을 측정한 것이다.
도 26은 A549 세포에서 siRNA와 외인성 KRS의 도입에 따른 KRS의 양 및 세포내 전체 단백질 합성량을 확인한 것이다.
도 27은 A549 세포에서 siRNA와 외인성 KRS의 도입에 따른 KRS의 양 및 세포 주기를 확인한 것이다.
도 28은 표적 단백질의 발현에 있어서 si-KRS 및 si-DRS의 효과를 웨스턴블롯으로 확인한 것이다.
도 29는 종양세포 이식에 따른 1차 종양 증식에 있어서 KRS 및 DRS 억제의 효과를 확인한 것이다.
도 30은 종양세포 이식에 따른 전이성 종양 결절 및 수를 확인한 것이다.
도 31은 KRS-1 및 KRS-2세포주의 KRS의 과발현을 웨스턴블롯으로 확인한 것이다.
도 32는 종양세포 이식에 따른 1차 종양 증식에 있어서 KRS 과발현의 효과를 확인한 것이다.
도 33은 종양세포 이식에 따른 전이성 종양 결절 및 수를 확인한 것이다.

발명의 실시를 위한 형태

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

＜실험 방법＞

1. 세포배양 및 재료들

A549 및 HEK293 세포는 ATCC로부터 구입하였다. 마우스 유방암(mammary carcinoma) 4T-1 세포주는 김성진 박사(가천의대)로부터 얻었다. 10％ 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) 및 1％ 항체를 포함하는, RPMI(A549 세포 및 4T-1 세포에 대한) 및 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 다른 새포에 대한) 배지를 세포 배양에 사용하였다. 37LRP를 암호화하는 pcDNA3.1 벡터는 타치바나 히로푸미 박사(큐슈 대학)로부터 얻었다. Myc이 부착된(Myc-tagged) 인간 KRS 및 DRS는 pcDNA3 벡터의 EcoRI/XhoI 제한효소 부위에 클로닝하였다. 설치류 KRS cDNA는 RT-PCR로 확보하였으며, pcDNA3.1 벡터의 HindIII/XhoI 제한효소 부위에 클로닝하였다. 설치류 및 인간 KRS 및 DRS에 타겟팅(targeting)하는 siRNA는 Invitrogen사로부터 구입하였다. siRNA의 서열은 요청하면 제공될 것이다. 유전자 포터(Gene porter, GTS) 및 리포펙타민 2000(invitrogen)은 형질감염 시약으로 사용되었다. LY294002, U73122 및 스타우로스포린(staurosporin)은 Calbiochem으로부터 구입하였고, 싸이클로헥시마이드(cycloheximide) 및 라미닌(laminin, Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma)은 Sigma로부터 구입하였다.

2. 면역침강 및 웨스턴 블럿

세포를 150mM NaCl, 0.5％ 트리톤 X-100, 0.1％ SDS 및 단백질 분해효소 저해제를 포함하는 20mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4, 용해버퍼)로 용해하였다. 단백질 추출물을 정상 IgG 및 단백질 G 아가로스와 2시간동안 배양한 다음(incubation), 비특이적으로 IgG에 결합한 단백질을 제거하기 위해 원심분리하였다. 상등액을 정제도니 67LR 항체(F-18, Santacruz)와 혼합한 다음, 흔들어 주면서 4℃에서 2시간 동안 배양하고, 단백질 A 아가로스를 혼합하였다. 얼음으로 차갑게 냉각한 용해버퍼를 이용하여 3회 세척한 다음, 침전물을 SDS-샘플 버퍼에 녹이고, SDS-PAGE로 분리하였다. 서로 다른 세포 분획에서 KRS 및 LR의 결합을 확인하기 위하여, pcDNA3.1-Myc-KRS로 형질감염을 하고, proteoextract 키트(Calbiochem)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 플라스마 멤브레인과 싸이토플라즘 분획을 분리한 다음, 상기와 같이 공동-면역침강을 수행하였다. 단백질 수준을 분석하기 위해, 단백질을 세포에서 추출한 다음 10％ SDS-PAGE로 분리하였다. 따로 언급하지 않는 한 항-LR 항체(Abcam, ab2508)을 37LRP 및 67LR의 동시 면역 블롯팅에 사용하였다. hsp90 및 팬-캐드헤린(Pan-cadherin)에 대한 항체는 Santacruz로부터 구입하였다.

3. 유세포 분석(flow cytometry)

세포 싸이클을 address하기 위하여, 배양된 세포를 표시된 벡터 또는 화합물로 형질감염 또는 처리하고, 70％ 에탄올로 4℃에서 1시간동안 고정한 다음 얼음으로 냉각한 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 세포를 propidium iodide(50μg/ml), 0.1％ sodium citrate, 0.3％ NP40 및 RNaseA(50μg/ml)로 40분간 염색한 다음, 플로우 싸이토메트리(FACS Calibur, Beckton-Dickinson)를 수행하였다. 각각의 샘플에 대해서, Cell Quest Pro 소프트웨어를 사용하여 20000 세포를 분석하였다. 세포 표면의 67kD LR의 양을 분석하기 위하여, 1 x 10⁶세포를 IgG 또는 67LR의 세포외 도메인을 인식하는 항-LR 항체(MLuC5, 1ug)와 배양한 다음, FITC 2차 항체와 배양하였다. PBS로 세척한 다음 샘플을 FACS로 스캔하였다.

4. 면역형광염색 또는 면역조직화학염색

9mm 커버 슬립(cover slip)위의 A549 세포를 70％ 메틸알콜로 고정한 다음 찬 PBS로 간단히 세척하였다. 1％ CAS, 3％ BSA 및 0.5％ triton X-100을 포함하는 블로킹 버퍼로 30분간 처리한(incubation) 다음, 세포를 KRS에 대한 항체(Abcam), 및 MLuC-5에 대한 항체(Santacruz)로 1시간 동안 배양하였다. 알렉사488 및 568(invitrogen)을 첨가한 다음 실온에서 30분간 처리하였다. 찬 PBS로 30분간 세척한 다음, 표본을 레이저 스캐닝 마이크로스코피로 관찰하였다. 유방암 및 폐암에 대한 조직 배열 슬라이드(tissue array slide)를 Super-Biochip(한국)으로부터 구입하였고, 67LR 및 KRS의 발현 수준을 확인하기 위하여 문헌(Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005))에 언급된 상응하는 항체와 면역조직화학염색을 수행하였다. 67LR 및 KRS의 발현간의 상관관계를 계산하기 위하여 피어슨 χ² 테스트 및 스튜던트 t 테스트를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. P 값이 ＜0.05이면 의미있는 것으로 간주하였다. 모든 통계적 분석은 SPSS v11.5 소프트웨어(SPSS, Chicago, Ill)를 사용하여 수행되었다.

5. 펄스-체이스 실험(Pulse-chase experiment)

293세포를 리포펙타민 2000을 이용하여 si-KRS 또는 si-대조군(invitrogen)으로 형질감염시켰다. 이를 메티오닌이 들어 있지 않은 배지에서 1시간동안 배양한 다음, [³⁵S] 메티오닌(50μCi/ml)을 철가하고 1시간동안 배양하였다. 신선한 배지로 방사선 메티오닌을 씻어낸 다음, 67LR을 이에 특이적인 항체(Santacruz)로 면역 침강시키고, 12％ SDS-PAGE로 분리한 다음, BAS(FLA-3000, Fujifilm)을 이용하여 노출시켰다(autoradiography). 67LR의 양은 Multi-gauge 프로그램(V3.0, Fujifilm)을 이용하여 측정하였다.

6. 이스트 투 하이브리드(yeast two hybrid) 분석

인간 KRS의 여러 단편을 암호화하는 cDNA를 상응하는 프라이머를 이용하여 PCR로 얻었다. KRS에 대한 PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI으로 절단하고, pEG202 벡터(LexA-융합 단백질의 제조를 위함) 및 pJG4-5 벡터(B42-융합 단백질의 제조를 위함)의 상응하는 위치에 연결하였다. 37LRP 단편을 암호화하는 cDNA는 Barbara J. Ballermann 박사(알버타 대학)로부터 얻었고, 이를 pJG4-5 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위에 삽입하였다. 두 융합 단백질간의 상호작용은 X-gal-함유 효모 배지상에서 파란색 콜로니의 형성여부로 분석하였다.

7. In vitro 결합 분석

GST-KRS 또는 GST를 대장균 로제타(DE3) 스트레인에서 발현시키고, 상기 단백질 추출물을 1％ Triton X-100 및 0.5％ N-라우릴사코신이 함유된 PBS 버퍼에서 4℃에서 2시간동안 글루타치온-세파로스와 혼합하였다. 인간 37LRP는 TNT Quick coupled Transcription/Translation system(Promega)를 사용하고, pcDNA3-37LRP를 주형으로 사용하며, [³⁵S]메티오닌의 존재하에서 in vitro translation에 의해 합성하였다. 합성된 37LRP는 상기 GST 단백질 혼합물에 첨가하고, 1％ Triton X-100, 0.5％ N-라우릴사코신, 1mM DTT, 2mM EDTA 및 300μM 페닐메틸설포닐 플루오라이드가 함유된 PBS 버퍼에서 교반을 하면서 4℃에서 4시간 동안 배양한 다음, 0.5％ Triton X-100을 함유하는 같은 버퍼로 6회 세척하였다. 그런 다음 세파로스 비드에 결합된 단백질을 SDS 샘플 버퍼로 용출하고, SDS-PAGE로 분리하고, 방사선을 측정하였다(autoradiograph).

8. 세포 이동(cell migration) 분석

세포 이동은 선행 문헌(Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005))에 기재한 바와 같이 폴리카보네이트 막(8.0μm 공극 싸이즈, Costar)를 가진 24-웰 트랜스웰 챔버로 측정하였다. A549 세포를 무혈청(serum-free) RPMI 배지에 현탁한 다음 각 웰당 1 x 10⁵ 세포의 농도로 상위 챔버에 넣었다. 표시된 농도의 정제된 인간 KRS, 라미닌(10μg/ml) 또는 젤라틴(10μg/ml)을 하위 웰에 넣고, 세포가 CO₂ 배양기에서 37℃에서 6시간동안 이동하도록 하였다. 세포는 70％ 메틸알콜을 포함하는 PBS로 30분간 고정한 다음 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 헤마토실린(Sigma)로 10분간 염색한 다음, 증류수로 세척하였다. 면봉으로 막의 윗 부분에서 이동하지 않은 세포를 제거하였다. 막을 챔버로부터 분리해 낸 다음 Gel Mount(Biomeda,미국)에 올려 놓았다(mount). 이동한 세포(막의 하위 면에 부착된 것들)를 현미경 하에서(x20) 4곳을 임의로 선별하여 계측하는 방식으로 측정하였다.

9. 자이모그래피(zymography)

표시된 siRNA 및 재조합 KRS(또는 DRS)를 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 A549 세포를 각각 48시간 및 24시간도안 배양한 다음 10％ FBS를 함유하는 RPMI 배지에 접종하였다(1 x 10⁵ 세포/웰). 세포를 무혈청 RPMI 배지에서 2시간 동안 기아처리(starving)한 다음, 라미닌을 첨가하여 10μg/ml로 24시간동안 배양하였다. 20μl의 배양 배지를 5x FOD 버퍼(4％ SDS, 20％ 글리세롤 및 0.01％ 브로모페놀 블루를 함유하는 0.125M Tris-HCl, pH 6.8)와 혼합한 다음, 1mg/ml의 젤라틴을 함유하는 10％ SDS-PAGE를 수행하였다. 젤을 2.5％ 트리톤 X-100으로 각각 20분씩 2회 세척하고, 증류수로 각각 20분씩 2회 세척한 다음 반응버퍼(10mM CaCl₂, 150mM NaCl, 1μM ZnCl₂, 1％ Triton X-100, 0.002％ sodium azide를 함유하는 50mM Tris-HCl, pH 7.5)와 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 젤을 증류수로 세척하고, 쿠마시 블루 R250으로 염색한 다음 35％ 메탄올로 탈염(destain)하였다.

10. 생체내에서 암 전이 실험

마우스 유방암 4T-1 세포를 si-KRS, si-DRS 또는 si-대조군으로 형질감염시킨다음 24시간동안 배양하였다. 세포(1 x 10⁶)를 6주령 암컷 Balb/c 마우스의 등에 피하 주사의 방법으로 주입하였다. 타겟에 대한 siRNA의 효과를 형질감염 후 48시간이후에 남은 세포에서 측정하였다. 또한, 주입 후 3일부터 10일까지 2일 간격으로 1차 종양(primary tumor)에서 타겟에 대한 siRNA의 효과를 상응하는 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석으로 측정하였다. 종양의 성장은 주당 3회씩 종양 크기를 측정하여 모니터하였다. 이와 동시에 전체 체중도 측정하였다. 주입 후 21일째에 마우스를 희생시키고, 1차 종양과 폐를 마우스로부터 절제하였다. 폐는 10％ 포르말린으로 24시간 동안 고정하였다. 폐에 전이된 종양 결절(nodule)의 수와 크기를 측정하고, 직경이 1mm보다 큰 종양 결절에 대해서도 별도로 기록하였다. 1차 종양의 질량도 측정하였다. KRS 과발현이 종양 전이에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 설치류 KRS 벡터 및 공 벡터(empty vector)를 4T-1 세포에 형질감염시킨 다음 안정적인 형질감염체를 G418의 존재하에 3주간 배양하여 선별하였다. 여러 단일 콜로니를 골라낸 다음, 웨스턴 블럿으로 KRS 발현 수준을 비교하였다. 대조군 세포보다 높은 수준으로 KRS를 발현하는 두 개의 다른 콜로니(KRS-1, KRS-2)를 선택하고, 주입하는 데에 사용하였다. 주입 후 30일째에 마우스를 희생시킨 것을 제외하고는 상기 방법과 동일하게 이후 실험을 수행하였다.

＜실험 결과 및 고찰＞

전체 길이의 KRS와 37LRP와의 특이적 상호작용은 이스트 투 하이브리드 분석에 의하여 확인되었다. LexA-KRS는 KRS의 파트너로 알려진(Kim, J.Y. et al. p38 is essential for the assembly and stability of macromolecular tRNA synthetase complex: Implications for its physiological significance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7912-7916 (2002)) AIMP2 뿐만 아니라, B42-37LRP와 결합(paired)하여 청색 콜로니를 형성하였으며, AIMP1에 대해서는 그러하지 않았다(도 1). 인비트로 바인딩 어세이에 대해서는, [³⁵S]메티오닌으로 표지된 37LRP를 GST-KRS 또는 GST와 혼합하고, 글루타티온-세파로즈로 침전시킨후, 자가방사선촬영을 하였다. 37LRP는 GST-KRS와 함께 침전하였으나, GST와는 아니었다(도 2). 이스트 투 하이드리드 분석에 의한 소실 지도(deletion mapping)로 인간 KRS의 N말단 연장부위와 LR의 C-말단 세포외 도메인이 그들의 결합에 관여함을 확인하였다(도 3).

세포질내 37LRP는 막-포매성 67LR로 전환되므로, 본 발병자들은 KRS가 37LRP 및 67LR에 서로 다르게 결합하는지를 확인하였다. Myc-KRS를 폐암세포주 A549 세포에 도입하여 항-Myc 항체와 면역침전시켰다. 세포 용해물의 웨스턴블롯 결과, 67LR은 37LRP 보다 적은 양으로 존재하였다(도 4 우측). 하지만, Myc-KRS는 37LRP 보다 67LR에 더 우선적으로 결합하였다(도 4 좌측). 본 발명자들은 이후, A549세포를 세포질과 원형질 막 분획으로 분리하여 Myc-KRS와 37LRP 및 67LR의 상호작용을 확인하였다. 37LRP은 세포질에서 67LR은 원형질 막에서 각각 우세하게 관찰된 반면(도 5 우측), KRS는 세포질에서 더 많은 양이 관찰되었지만, 두 분획 모두에서 존재하였다. 두 분획 모두를 항-Myc 항체와 면역침전 시켰을 때, 비록 세포질 내 소량의 37LRP도 침전되었지만, 막에 존재하는 67LR가 주로 KRS와 함께 침전되었는데(도 5 좌측), 이는 막에 존재하는 67LR 및 KRS 간의 선호적 상호작용을 시사하였다.

본 발명자들은 이후, KRS의 세포내 분포가 A549 세포의 라미닌 처리에 의해 변화하는지를 세포 분획과 면역형광염색법을 통하여 조사하였다. 라미닌 처리 후, KRS와 67LR의 막내 존재량은 세포질 내의 KRS 및 37LRP 양이나 이들의 발현에는 거의 변화없이 점차적으로 증가하였다(도 7 및 결과 미도시). 면역형광염색에서도 또한 67LR 및 KRS가 라미닌 처리에 의해 막 쪽으로 이동함을 설명해 주었다(도 8, 각각 적색 및 녹색). 발명자들은 이후 KRS의 막 전좌(translocation)가 번역후 변형(post-transcriptional modification)에 관여하는지를 조사하였다. 포스포이노시티드 3-OH 카이네이즈(phosphoinositide 3-OH kinase, PI3K)(Shaw, L. M., Rabinovitz, I., Wang, H. H., Toker, A. ＆ Mericurio. A.M. Activation of phosphoinositide 3-OH kinase by the alpha6beta4 integrin promotes carcinoma invasion. Cell 91, 949-960 (1997)), 단백질 인산화효소 C(Protein kinase C, PKC)(Li, Y. Q. et al. Protein kinase C mediates the signal for interferon-gamma mRNA expression in cytotoxic T cells after their adhesion to laminin. Immunology 93, 455-461 (1998)), 및 포스포리페이즈 C-감마(phospholipase C-gamma, PLC-gamma)(Vossmeyer, D., Hofmann, W., Loster, K., Reutter, W. ＆ Danker, K. Phospholipase C-gamma binds alpha1beta1 integrin and modulates alpha1beta1 integrin-specific adhesion. J. Biol. Chem. 277, 4636-4643 (2002); Kanner, S. B., Grosmaire, L. S., Ledbetter, J. A. ＆ Damle, N. K. Beta 2-integrin LFA-1 signaling through phospholipase C-gamma 1 activation. Proc .Natl. Acad. Sci. USA 90, 7099-7103 (1993))와 같은 몇몇 서로 다른 인산화효소들이 라미닌에 의해 활성화된다고 알려져 있다. 이러한 인산화효소들 중 어떠한 것들이 KRS의 라미닌 의존성 막 전좌에 관여하는 지를 알아보고자, 본 발명자들은 각각의 카이네이즈에 특이적인 억제제로 각각의 인산화효소를 차단하고, 이 처리가 어떻게 KRS의 라미닌 의존성 막 전좌에 영향을 주는지를 확인하였다. 막 분획에서 KRS와 67LR의 라미닌 의존적 증가는 PI3K 억제제인 LY294002의 존재하에서 억제되는데 반해서, U73122 또는 스타우로스포린으로 처리한 세포들은 대조군 세포와 마찬가지로 67LRS의 라미닌 의존적 증가를 보였다(도 9 상 및 결과 미도시). 이들 인산화효소들 중 어떤 것도 세포내 KRS의 양에 영향을 준 것은 없었다(도 9 하). 이들 결과는 PI3K가 KPS의 라미닌 유도성 인산화에 연관된 것임을 암시한다. 사실, 티로신이 아닌 트레오닌과 세린에서 인산화된 KRS는 라미닌 처리에 의해 증가된 반면, LY294002의 존재하에서는 억제되었으며, 스타우로스포린은 어떠한 영향도 주지 못했다(도 10). 본 발명자들은 또한, KRS의 라미닌 유도성 인산화가 67LR과의 상호작용에 필요한지를 조사하였다. LY294002 처리는 KRS와 67LR의 라미닌 유도성 결합을 억제하였다(도 11) 세포질 KRS가 다중-ARS 복합체에 고정되어 있으므로, 본 발명자들은 또한 KRS의 라미닌 의존적 인산화가 KRS와 복합체의 다른 효소 구성성분인 글루타밀-프롤릴-tRNA 합성효소(glutamyl-prolyl-tRNA synthetase, EPRS)와 공-면역침전함으로써 다중-ARS 복합체와의 결합에 영향을 주는지를 조사하였다. LY 화합물의 부재 하에서, 라미닌 처리는 KRS와 EPRS의 결합을 감소시켰고, 동시에 면역-소진된 용해성 분획(immuno-depleted soluble fraction)의 KRS를 증가시켰다(도 12 상,하 패널의 좌측 레인). 이에 반해, EPRS에 결합한 KRS는 세포가 LY294002로 전처리 되었을 때 라미닌 처리에 영향을 받지 않았는데(도 12 상,하 패널의 우측 레인) 이는 KRS의 인산화가 KRS와 복합체의 라미닌-의존적 결합에 필요함을 시사한다.

본 발명자들은 이후, KRS가 A549 세포에 있어서 67LR의 막 내 존재량에 영향을 주는지 확인하였다. 67LR의 양은 라미닌에 의해 증가되나, 라미닌 효과는 KRS가 이에 대한 특이적 siRNA에 의해 억제될 때에는 사라지는데(도 13 좌측) 이는 67LR의 라미닌 의존적 촉진에 있어서 KRS의 중요성을 시사한다. 본 발명자들은 또한, 유세포 분석기를 통하여 막에 존재하는 67LR을 조사하였다. 막에 존재하는 67LR의 양은 세포를 KRS로 형질감염시키거나, si-KRS로 형질감염시켰을 때, 각각 증가 및 감소하였다(도 14). 라미닌 수용체의 세포내 분포는 공벡터(EV) 또는 KRS에 형질감염된 A549 세포간에서 면역형광염색을 통하여 비교되었다. 라미닌 수용체는 대조군과 비교하여 KRS 과발현 세포의 막 부위에 강하게 염색되었다(도 15). 이후, KRS와 67LR 간의 양성적 상관관계(positive correlation)는 다양한 KRS 양에 따른 막 및 세포질 내의 67LR 존재량을 측정함으로써 확인되었다(도 23).

본 발명자들은, KRS가 어떻게 67LR의 막 내 존재량을 증가시키는지를 조사하였다. KRS는 37LRP로부터 전사 또는 전환(conversion) 을 통하여 67LR을 촉진할 수 있다. 그러나, KRS의 감염은 LR 전사 조절의 잠정적 역할을 제외하고는 LR 전사를 증가시키지 않았다(결과 미도시). 게다가, KRS는 세포질 내에서 37LRP와 잘 결합하지 않으므로(도 4, 도 5), KRS가 37LRP를 67LR로 전환하는 과정을 촉진하는 것 같다. 본 발명자들은 또한, 37LRP의 변형이 37LRP가 67LR로 전환되는데 있어서 선행요건으로 알려져 있으므로(Landowski, T. H., Dratz, E.,A. ＆ Starkey, J. R. Studies of the structure of the metastasis-associated 67 kDa laminin binding protein: fatty acid acylation and evidence supporting dimerization of the 32 kDa gene product to form the mature protein. Biochemistry 34, 11276-11287 (1995); Buto, S. et al. Formation of the 67-kDa laminin receptor by acylation of the precursor. J. Cell. Biochem. 69, 244-251 (1998)), KRS가 37LRP의 지방족 아실화(fatty acylation)를 매개하는지를 조사하였다. 본 발명에 있어서, KRS는 37LRP의 지방족 아실화에 전혀 영향을 주지 않았다(결과 미도시). KRS는 막에 존재하는 67LR의 세포내 안정성을 증진시킬 수 있으므로, 본 발명자들은 KRS가 막에 존재하는 67LR의 식세포작용(endocytosis)를 방해할 수 있는지를 조사하였다. 상기 가능성을 확인하고자, 본 발명자들은 시클로헥시미드(cyclohexamide)를 이용하여 근원적으로(de novo) 단백질 합성을 저지하여 KRS가 세포막과 세포질에서의 67LR의 존재량에 영향을 끼치는지를 실험하였다. KRS의 발현이 이에 특이적인 siRNA에 의하여 억제될 때에는 67LR의 막 내 존재량이 감소하면서 동시에 세포질 분획에서의 양은 증가하였다(도 16 좌측). 이와는 반대로, KRS의 과발현은 상기와 같이 막 내 67LR의 존재량을 증가시켰다(도 16 우측). 이러한 결과를 토대로, KRS는 67LR에 세포질 내로 다시 들어가는 것을 억제함으로써 막 내 67LR의 존재량을 증가시키는 것 같다. 본 발명자들은 또한, 펄스-체이스(pulse-chase) 실험을 통하여 67LR의 대사전환(turn over)에 있어서 KRS의 효과를 조사하였다. 초기 단백질 합성은 방사성 메티오닌으로 표지되었고, 이후 시클로헥시미드로 억제되었다. 이후, 67LR의 소멸(disappearance)는 시간적 간격을 두고 자가방사촬영에 의해 관찰되었다. 67LR은 KRS가 siRNA에 의해 억제될 때 급격하게 감소되었으나, 이 수치는 si-대조군에 있어서는 시간 간격에 따라 유지된 것과 대조적이다(도 17). 따라서, 67LR의 분해과정에 대해 추가적인 연구가 필요하지만, KRS는 원형질 막에서 67LR과 결합함으로써 67LR의 반감기를 증가시켜 67LR의 식세포작용을 억제하는 것 같다.

본 연구자들은 이후, KRS의 발현정도가 라미닌-의존적 A549 세포 이동에 영향을 주는지를 트랜스웰 맴브레인 분석을 통하여 조사하였다. 대조군 세포의 이동은 라미닌 처리에 의해 평균 6배 가량 촉진되었다(도 24 및 도 18) 그러나, 라미닌 의존적 세포 이동은 KRS가 si-RNA에 의해 억제되었을 때 감소하였다(도 18, si-대조군 및 si-KRS). 이와는 반대로, KRS 과발현은 라미닌 처리에 의해 촉진된 세포이동을 증가시켰다(도 18, EV 및 KRS). 그러나, 세포 이동에 있어서 KRS의 효과는 라미닌 수용체가 si-RNA에 의해 억제되면 사라진다(도 18, si-LR, 아래 패널). KRS는 몇몇 암세포에서 사이토카인으로 분비되므로(Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005)), 본 발명자들은 세포외인성 KRS가 세포 이동에 영향을 주는지를 조사하였다. A549 세포를 서로 다른 농도의 정제된 KRS로 처리하였을 때, 이 분석에서 KRS의 세포외인성 효과를 제외하면, 세포 이동은 거의 영향을 받지 않았다(도 25). 반면, 세포 단백질의 합성 및 세포 주기는 실험하는 동안 KRS의 억제 및 과발현에 영향을 받지 않았는데, 이는 KRS-의존적 세포 이동이 상기 과정의 효과에 기인하지 않음을 시사한다(도 26 및 도 27). 라미닌 처리가 MMP-2(matrix metllo-proteinase-2)의 활성화를 초래하므로(Givant-Horwitz, V., Davidson, B. ＆ Reich, R. Laminin-induced signaling in tumor cells the role of the M(r) 67,000 laminin receptor. Cancer Res. 64, 3572-3579 (2004)), MMP-2의 라미닌 의존적 활성화에 있어서 KRS의 역할을 in vitro 자이모그래피 분석을 통하여 조사하였다. MMP-2 활성은 라미닌에 의해 활성화 되었고, 이는 si-KRS의 존재 하에서 억제되었다(도 19 우측). MMP-2의 발현량은 KRS에 영향을 받지 않았다(도 19 하).

KRS가 암 전이와 관련된 67LR을 통해 세포 이동을 촉진할 수 있기 때문에, 폐로 전이가 잘되는 마우스 유방암 4T-1 세포를 사용하여 KRS의 발현 수준에 의해 암 전이가 영향을 받을 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 KRS 또는 다중-ARS 복합체의 다른 구성요소인 DRS(aspartyl-tRNA synthetase)를 그들에 특이적인 siRNA로 발현을 억제하고, 어떻게 KRS 및 DRS의 발현 감소가 암 전이에 영향을 미치는지 비교하였다. si-KRS 및 si-DRS의 억제 효과를 웨스턴 블럿으로 확인한 다음에(도 28), 이들 세포 각각 및 si-대조군으로 처리한 세포를 Balb/c 마우스의 등 피부에 피하 주사로 주입하였다. 주입된 3종 모두 유사한 질량 및 부피의 종양을 발생시켜(도 29), KRS의 수준이 1차 종양의 성장에는 영향을 미치지 않음을 알려주었다. 폐를 주입 후 21일째 분리하였으며, 전이성 종양 결절(직경 1mm보다 큰 것)의 수를 3 그룹간에 비교하였다. 전이성 결절의 수는 대조군 및 DRS가 억제된 세포에서 얻은 것에 비해 KRS의 억제에 의해 크게 감소하였다(도 20 및 도 30). 역으로, 상기 방법에 따라 KRS의 과발현이 암 전이를 증진하는지를 조사하였다. 우리는 KRS를 암호화하는 플라스미드의 형질감염 및 G418 스크리닝에 의해 KRS를 안정적으로 과발현하는 4T-1 세포 주를 처음으로 구축하였다. 구축된 세포 주에서 KRS 과발현은 웨스턴 블럿으로 확인하였고, 공 벡터로 형질감염된 세포들에 비해서 많은 양으로 KRS를 발현하는 2개의 서로 다른 세포(KRS-1 및 KRS-2)를 선별하였다(도 31). 이들 세포도 유사한 질량과 크기의 1차 종양을 생성하였다(도 32). 이들 세포를 주입한 후 30일 째 폐를 검사하였을 때, KRS-과발현 세포 둘 다 대조군 세포에 비해서 더 많은 결절을 생성하였다(도 21 및 도 33). 이러한 결과는 KRS가 생체 내에서 암 전이를 유도한다는 것을 암시한다.

라미닌 수용체의 암 특이적 과발현은 자주 관찰되므로(Fontanini, G. et al. 67-Kilodalton laminin receptor expression correlates with worse prognostic indicators in non-small cell lung carcinomas. Clin. Cancer Res. 3, 227-231 (1997); Viacava, P. et al.The spectrum of 67-kD laminin receptor expression in breast carcinoma progression. J. Pathol. 182, 36-44 (1997)), 67LR의 과발현이 또한 KRS의 과발현과 연관되어 있는지를 폐암 및 유방암을 예로서 67LR 및 KRS의 면역 조직화학 염색에 의해서 분석하였다. 39개의 검사한 폐암 조직 중에서 67LR 과발현은 21 사례(54％)에서 관찰되었으며, 그 가운데, KRS 수준은 19 사례(약 90％)에서 증가되어 있었다(표 1 및 도 22 상위). 마찬가지로, 40 개의 검사한 유방암 환자 중 21 사례에서 67LR 과발현이 관찰되었다. 이들 중 21 사례 모두 KRS의 수준이 증가되었다(표 1 및 도 22 하위). 그들의 동시-발현이 전이에 있어서 실제로 연관되어 있는지는 확인해 보아야 함에도 불구하고, 두 경우 모두 두 단백질의 발현간에 밀접한 연관이 나타났다.

이 때, 상기 표 1에 대해서는 다음의 기재를 참조할 수 있다: 표 1은 종양조직에 있어서 67LR 과 KRS 발현의 상관관계를 나타낸 것이다. 표 1에서는 67LR의 발현량이 KRS의 발현량과 관계가 있는지를 알아보고자, 폐암 및 유방암 환자의 조직 마이크로 어레이들을 이용하여 각각의 항체에 대한 면역염색을 실시하였고, 상기 두 단백질들의 상대적 발현량을 측정하였다. 67LR의 표지를 위하여 MluC5항체가 사용되었다. 발현량은 시료의 염색농도를 통하여 측정되었고, 4개의 그룹으로 분류되었다(0, 1, 2, 및 3점). 최종평가에서, 시료들은 정상그룹(0점 또는 1점)과 과발현 그룹(2점 또는 3점)로 분류되었다. 67LR 과 KRS 발현의 상관관계를 평가하기 위한 통계학적 분석은 피어슨 χ² 테스트 및 Student t 테스트를 통하여 수행되었다. 이때, P값이 0.05미만이면(P＜0.05) 유효한 수치로 간주하였다. 모든 통계학적 분석은 SPSS v11.5 소프트웨어(SPSS, Chicago, Ill)를 통하여 수행하였다.

리보솜 구성인자를 포함하는 많은 번역 인자들이 다면적이며(Wool, I. G. Extraribosomal functions of ribosomal proteins Trends Biochem. Sci. 21, 164-165 (1996)), 여러 가지 종양 생성과정에 관여되어 있다(Lee, S. W., Kang, Y. S. ＆ Kim, S.Multi-functional proteins in tumorigenesis: Aminoacyl-tRNA synthetases and translational components. Curr. Proteomics 3, 233-247 (2006)). 여기서 우리는 두 개의 번역 인자인 KRS 및 p40/37LRP가 생체 내에서 세포 이동 및 암 전이에 함께 작용한다는 것을 보였다(도 18 내지 도 22). 현 시점에서는 이 두 단백질의 잠재적인 연관이 진화적 우연인지 아니면 이후 밝혀질 필요가 있는 단백질 합성에 있어서 생리학적 이유를 가지고 있는지는 알 수는 없다. 다중 ARS-복합체의 구성요소 가운데, KRS는 가장 안정적인 단백질이며, 다른 구성요소의 안정성을 위하여 필요한데(Han, J. M. et al. Hierarchical Network between the components of the multi-tRNA synthetase complex: Implications for complex formation. J. Biol. Chem. 281, 38663-38667 (2006)), 이는 다른 관계되는 단백질을 안정화시키는 KRS의 잠재 능력을 암시하는 것이다. 여기서, 우리는 KRS 능력이 67LR에서의 세포 안정성으로도 확대됨을 보였다(도 17).

KRS의 67LR과의 연관은 다른 기능적 암시를 가지고 있을 수 있다. 생리적 조건하에서, 세포질 KRS의 일 부분이 인산화되고, 여러 가지 성장 자극이나 생존 신호에 의해 라미닌 신호를 매개하는 67LR과 결합하기 위하여 원형질 막으로 이동된다. 암 세포에서는 과발현 또는 PI3K와 같은 과-활성화된 상위 인산화효소로 인한 결과로 구조적인(constitutive) 막 전이로 인하여 KRS의 막 수준이 비정상적으로 증가된다. 아마도, 이러한 과량의 KRS가 원형질막을 67LR를 모으거나 배출하도록 할 수 있다. 또한, PI3K의 활성화를 감소시키는 것이 자주 종양 성장 및 전이와 연관된다는 점(Wymann, M. P. ＆ Marone, R. Phosphoinositide 3-kinase in disease: timing, location, and scaffolding. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 141-149 (2005)) 및 라미닌이 PI3K를 통해 암 침윤를 증진한다는 점(Baba, Y. et al. Laminin-332 promotes the invasion of oesophageal squamous cell carcinoma via PI3K activation . Br. J. Cancer 98, 974-980 (2008))을 염두에 둘 가치가 있다. PI3K의 구조적인 활성화는 막으로 이동시키는 KRS의 인산화를 리드할 수 있다. 이러한 조건들의 일부 또는 전부가 원형질막에서의 67LR의 증가에 기여할 수 있고, 암 전이에 대한 라미닌 신호전달을 증폭시킬 수 있다. 암의 전이성 확장을 조절하는 많은 연구가 진행되어 왔다. 이러한 점에서, 암 전이에 있어서 67LR을 통한 KRS의 활성은 암 진단 및 치료를 위한 종전에는 개척되지 않은 새로운 창을 제공해 줄 수 있다.

산업상 이용가능성

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 KRS가 원형질막으로 전좌(translocation)되어 67LR과 상호작용함으로써 종양(또는 암) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이(metastasis)에 영향을 미친다는 것을 규명하였다. 또한, 마우스를 이용한 in vivo 실험을 통해서 KRS의 과발현 또는 발현 억제가 암의 전이를 조절할 수 있음을 규명하였다. 따라서, 본 발명의 KRS를 이용하여 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절할 수 있으며, 나아가 원형질막의 라미닌 수용체(67LR)과 관계된 세포 내 대사를 조절할 수 있다. 본 발명에서 규명한 KRS와 라미닌 수용체의 관계는 이와 관계된 다양한 질환 또는 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS)의 세포내 수준을 조절하여 암 전이(cancer metastasis)를 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 감소시켜 암 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 증가시켜 암 전이를 증진하는 것을 특징으로 하는 암 전이를 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 라이실 tRNA 합성효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 조절하여 암 세포의 이동(cancer cell migration)을 조절하는 방법.
제5항에 있어서, 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 감소시켜 암 세포의 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는 암세포의 이동을 조절하는 방법.
제5항에 있어서, 라이실 tRNA 합성효소의 세포내 수준을 증가시켜 암 세포의 이동을 촉진하는 것을 특징으로 하는 암세포의 이동을 조절하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 라이실 tRNA 합성효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 또는 KRS에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 또는 KRS에 대한 항체를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 및 치료 방법.
암 치료제를 제조하기 위한, 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 siRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 또는 KRS에 대한 항체의 용도.
(a) 시험 제제의 존재하에서 KRS와 시험 제제를 접촉시키는 단계;
(b) KRS의 활성을 측정하여 KRS의 활성을 변화시키는 시험 제제를 선별하는 단계; 및
(c) 선별된 제제가 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는지를 테스트하는 단계를 포함하는 암 전이 또는 암 세포 이동 조절 제제를 스크리닝하는 방법.
(a) 시험 제제의 존재하에서 KRS, 라미닌 수용체(67LR) 및 시험 제제를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 제제가 KRS와 라미닌 수용체의 상호작용(interaction)을 조절하는지 테스트하는 단계를 포함하는 KRS와 67LR의 상호작용을 저해하는 제제를 스크리닝하는 방법.
(a) 시료에서 67LR의 과발현 여부를 분석하는 단계; 및
(b) 67LR이 과발현된 시료에서 KRS의 과발현 여부를 분석하는 단계를 포함하는 폐암 또는 유방암을 진단하는 방법.