KR102133929B1

KR102133929B1 - 면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102133929B1
Application number: KR1020180069146A
Authority: KR
Inventors: 권남훈; 김성훈; 이진영; 김건호
Original assignee: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2020-07-14
Also published as: KR20180137427A; WO2018231025A2; WO2018231025A3; US11378572B2; US20200141923A1; WO2018231025A9

Abstract

본 발명은, 면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 KRS 저해제(발현 또는 활성 저해제)를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, KRS의 면역 세포 내 수준 조절, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법, 및 KRS를 이용한 면역세포 이동에 의한 질환 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 본 발명에 따라 KRS를 이용하여 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이는 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법{Therapeutic agent of immunocyte migration-related diseases and method for screening thereof}

본 발명은 면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 KRS(라이실 tRNA 합성효소) 저해제(발현 또는 활성 저해제)를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, KRS의 면역 세포 내 수준 조절, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법, 및 KRS를 이용한 면역세포 이동에 의한 질환 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다.

체내의 여러 조직에서, 각각의 세포는 그들의 유전적 특성과 환경에 따라 다른 방식으로 이주한다. 통제되지 않은 세포 이동은 염증성 질환, 암 전이 등의 다양한 질병 상태들과 관계되나, 각각의 세포들이 지니는 이동 시그널링 및 메커니즘 특성이 완전히 규명되지 못한 상태이다. 특히, 각각의 세포에 따라서는 동일한 인자라도 관계하는 방식이 다른 것으로 보고되어 시그널링 과정 및 메커니즘 규명에 어려움이 더해지고 있는데, 일례로 AQP1(water channel aquaporin-1)은 상피 세포 등에서 세포의 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있으며 특히 암 전이를 촉진시키는 것으로 알려졌지만(Hara-Chikuma M et al., Aquaporin-1 facilitates epithelial cell migration in kidney proximal tubule, J Am Soc Nephrol. 2006 Jan;17(1):39-45; Jiang Y, Aquaporin-1 activity of plasma membrane affects HT20 colon cancer cell migration, IUBMB Life. 2009 Oct;61(10):1001-9), 대식세포의 경우 상기 AQP1를 발현함에도 불구하고 이것이 대식세포의 이동을 억제하는 것으로 보고 되었다(Tyteca D et al., Regulation of Macrophage Motility by the Water Channel Aquaporin-1: Crucial Role of M0/M2 Phenotype Switch, PLoS One. 2015 Feb 26;10(2):e0117398). 이처럼 각 세포들은 이들의 이동에 여러 가지 방식 및 특성이 존재하기 때문에, 기존에 특정 세포의 이동을 방지하기 위해 설계된 약물들은 상당히 제한적이고 불충분한 효능을 보이고 있다. 따라서 세포의 이동성 스위치(migratory switch)를 제어하고 이주 관련 질병을 치료하는 새로운 전략을 모색하는 것이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 면역세포는 체내의 1차 방어망이기도 하지만, 최근 과도한 면역세포의 활성화가 주요한 병리 기전중의 하나임이 보고되고 있다. 염증성 면역세포의 활성화시 일반적으로 면역세포의 이동성 증가가 관찰되는데, 구체적으로 다음과 같은 질병들에서 이러한 면역세포 이동 및 침윤이 질병의 병리와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.

일례로, 심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 죽상동맥경화증과 관상동맥 질환 등이 포함된다(Ross R et al., New Engl J Med, 1999:340(2):115-26, Poli G et al., Redox Biol 2013;1(1):125-30, Libby P et al., Circulation 2002;5;105(9):1135-43). 죽상동맥경화증은 콜레스테롤에 의한 염증성 질환이고, 동맥 안쪽 막에 침착한 콜레스테롤과 혈액에서 동맥 안쪽으로 이동한 면역세포로 구성된 죽종에 의하여 발병한다. 즉, 콜레스테롤 산화물이 염증을 일으키고 있는 부위로 단핵구와 같은 면역세포가 이동하면서 죽종이 형성된다. 죽종이 형성될 경우 혈관의 내면은 껄끄러워지고 벽은 두꺼워지면서 혈액이 흐르는 내부의 지름이 좁아져 혈액순환에 장애가 생긴다. 죽종 주위를 둘러싼 섬유성막이 터지면 혈관 안에 혈전이 발생하고, 죽종 안으로 출혈이 일어나 혈관 내경이 급격하게 좁아지거나 막히게 된다. 주로 심장에 피를 공급하는 혈관, 뇌에 피를 공급하는 혈관, 콩팥에 피를 공급하는 혈관 및 말초혈관에 발생하여 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌혈관질환(뇌졸중), 신부전, 사지 허혈성 동맥 질환을 일으킨다. 기존에 이러한 심혈관계 질환의 발생 및 발달에는 단핵구의 이동을 유도함으로써 염증반응을 일으키는 CCL2(CCChemokine ligand 2, MCP-1)가 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져, CCL2의 작용 및 이에 따른 단핵구의 이동을 억제함으로써 상기와 같은 심혈관계 질환을 치료하는 방법이 새로이 제시되기도 하였다(Gu L et al., Mol Cell, 1998;2(2):275-81, Aiello RJ et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19(6):1518-25, Gosling J1 et al., Clin Invest 1999;103(6):773-8, Harrington JR et al., Stem Cells 2000;18(1):65-6, Ikeda U et al., Clin Cardiol 2002;25(4):143-7). 또한 고혈압에서도 염증성 사이토카인을 분비하는 다양한 면역세포 등이 혈관으로 과도하게 이동하여 혈관벽이 두꺼워지고, 혈관의 탄력성을 상실하는 병리가 관계된다.

또한 폐동맥 고혈압(Pulmonary Arterial Hypertension, PAH)은 폐 고혈압 세계 보건기구 (WHO) 임상 분류 시스템 (ESC Guidelines, European Heart Journal 2015)의 Group 1으로 분류되며, 호흡곤란, 평균 폐동맥압 (mean pulmonary artery pressure, mPAP)의 상승 (mPAP > 25 mmHg) 및 우심실 기능부전을 공통적 임상특징으로 하는 희귀질환이다. 이러한 폐동맥 고혈압은 유전, 감염, 연관질환 등 여러 가지 선재요인이 관여하지만 혈관손상 (endothelial cell injury)에 따른 면역반응이 핵심 병리적 요인으로 작용하는 것으로 알려졌다(Huertas et al., Circulation, 129:1332-1340, 2014). 이러한 현상에는 면역세포의 침윤과 기능장애(dysfunction)에 따른 일련의 과정이 병리현상과 깊게 연관되어 있는 것으로 알려졌으며, 특히 PAH에서 면역세포와 혈관내피세포 상호작용이 중요한 것으로 알려졌다. 뿐만 아니라 최근 알포트 증후군(Alport syndrome)에 있어서도 단핵구, 대식세포의 침윤이 상기 병의 진행을 촉진시킨다는 보고가 있었다.

한편, 섬유화(fibrosis) 관련 질병에 있어서, 지속적인(만성적인) 염증반응이 상처치유 프로그램(wound-healing program)을 활성화시키게 되는데 이것이 섬유증(fibrosis)으로 이어지게 된다. 조직의 손상 후 단핵구/대식세포나 호중성 백혈구, 호산백혈구, 비만세포 등의 염증성 면역세포가 손상 부위로 빠르게 침투 하면서 활성화되며 여러 사이토카인을 분비하게 되고 이것들은 주위의 섬유아세포나 상피세포, 평활근세포를 다시 활성화 시켜 이들을 미요브라스트형의 세포로 활성화시키는데 이 미요브라스트형의 세포는 다량의 세포외 기질 단백질을 생산 분비하게 하여 궁극적으로 조직에 세포외 기질 단백질의 다량 축적을 초래하여 상처를 남기며 또한 조직의 섬유화나 비대화를 유도하게 된다 (Gurtner GC et al., Trends Cell Biol. 15 : 599-607, 2005). 이 병리 기전은 창상, 화상, 욕창등에 의한 피부 상처시 발생되는 피부 조직 내의 상흔 형성이나 간, 신장, 혈관, 폐 등의 조직의 경화성 섬유화 현상의 근본적인 원인중 하나이다. 또한 만성 자가면역 질환인 경피증 (scleroderma), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus)에서도 섬유화는 주된 병리적 특성으로 나타난다. 아울러 아토피 질환, 천식 질환, COPD, 건선증, 켈로이드, 증식성 망막증 등 에서도 염증성 면역세포의 활성화가 병리 현상에 기여한다고 알려져 있다.

특히, 상기 상처치유 프로그램(wound-healing program)에 있어서 미요브라스트형의 세포로 활성화된 섬유아세포를 myofibroblast(근섬유아세포)라고 한다. myofibroblast는 섬유화(fibrosis) 관련된 모든 질환병리의 중심에 있으므로 myofibroblast의 활성을 유도하는 분자생물학적 혹은 면역학적 기전을 제거하는 것이 질환치료의 핵심 요소가 된다. 많은 선천적 (innate immunity) 혹은 후천적 (adaptive immunity) 면역이 fibroblast의 활성과 분화에 중요하다는 사실은 널리 알려져 있으며, 이에 상처부위에서 염증반응을 제거하는 것이 섬유화로의 tissue remodeling 을 중단시키고 정상조직형태를 유지하는 핵심적 요소가 된다. 하지만 실제적으로 염증반응의 제거가 쉽게 이뤄지지 않으므로 선천적 후천적 면역의 기전을 이해하여 핵심 매개체(mediator)를 찾는 것이 섬유화를 늦추는데 중요하다.

단핵구, 대식세포 등은 wound healing에도 기여하는 부분이 있으나 reactive oxygen, nitrogen등을 분비하므로 주변 세포에 해로운 영향을 끼치게 된다. 따라서 단핵구, 대식세포의 신속한 제거가 없다면 조직 손상을 더 유발하게 되며 섬유화를 초래하게 된다. 따라서 상기 질병의 초기에 가장 먼저 반응하는 단핵구, 대식세포들을 제한하는 것은 다양한 만성 염증 및 섬유화 관련 질환에 있어서 하나의 치료적 전략으로 여겨진다.

상기 wound-healing 기전이 섬유화 반응을 촉발 시킬 때, 혈구 응집에 관련된 PDGF(platelet-derived growth factor)는 다른 염증반응 면역세포들을 상처부위로 불러들이고 TGF-β1은 국소 fibroblast로부터 세포외 기질 합성을 촉진시키는 것으로 알려졌다. 하지만 상기 혈구응집 반응에 관련된 요소들은 이들이 결핍된 경우에도 섬유화를 유도하는 결과를 보임이 보고되었다.

상기와 같이 과도한 면역세포 활성화가 문제되는 질환들에 있어서 기존에 면역세포들의 이동(및 침윤)을 막기 위한 타겟 인자(target factor)들이 제시되어왔고 이들을 대상으로 질병의 치료적 방법을 고안하는 시도가 이루어지고 있지만 각각의 한계점들이 보고되고 있는 실정이며, 이에 따라 효과적인 질병 치료를 위해 여전히 면역세포 이동에 있어서 핵심 매개체(mediator)가 무엇인지 이를 제어할 전략은 무엇인지를 찾는 것이 중요한 해결 과제로서 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 면역세포 이동(침윤) 관련 질환의 새로운 치료적 전략을 찾고자 연구하던 중, 라이실 tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase, KRS)가 면역세포 이동 조절 활성이 있으며 특히, 면역세포(단핵구/대식세포)의 세포막 위치에 특이적으로 KRS 수준이 증가되는 현상이 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상이며 이는 라미닌(특히, 라미닌 아형 α4β2γ1)과 특별한 연관성을 가짐을 확인하여 이를 이용한 상기 질환의 치료제 스크리닝 전략을 새롭게 고안하였으며, KRS의 발현 또는 활성을 억제하는 KRS 저해제의 처리가 섬유화 질환, 폐동맥 고혈압 등 실제 여러가지 면역세포 이동 및 침윤 관련 질환의 예방 및 치료효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, KRS(라이실 tRNA 합성효소)의 면역 세포 내 수준 조절, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은,

(A) 시험물질이 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS)를 저해하는지 여부를 측정하는 단계:

(B) 면역세포에 라미닌(laminine)을 처리하는 단계; 및

(C) 상기 (A) 단계에서 KRS 저해 활성이 있는 것으로 확인된 시험물질을 (B) 단계의 면역세포에 처리하여 면역세포의 이동을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은,

(a) 면역세포에 라미닌 및 시험물질을 처리하고 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동을 모니터링 하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 면역세포에서 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동이 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 낮을 경우에 상기 시험물질을 면역세포 이동과 관련된 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는,

면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KRS(라이실 tRNA 합성효소)의 면역 세포 내 수준 조절, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(B) 면역세포에 라미닌(laminine)을 처리하는 단계; 및

(C) 상기 (A) 단계에서 KRS 저해 활성이 있는 것으로 확인된 시험물질을 (B) 단계의 면역세포에 처리하여 면역세포의 이동을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

정의

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.

본 발명에서 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.

본 발명에서 "숙주세포(host cell)"라 함은 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다.

본 발명에서 용어 조절은 상향 조절(촉진, 증가, up-regulation) 또는 하향 조절(억제, 감소, 저해, down-regulation)를 포함하는 의미이다.

본 발명에서 "단백질" 은 "폴리펩티드(polypeptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "KRS 단백질"은 라이실 tRNA 합성효소로 알려져 있는 폴리펩티드를 의미한다. KRS는 아미노산 라이신(lysine)과 tRNA의 아미노아실레이션(aminoacylation) 반응을 매개하는 효소이다. 본 발명에서 KRS는 당업계에 라이실 티알엔에이 합성 효소로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명의 KRS는 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_005539.1 등으로 공지된 것을 포함하고, 마우스(Mus musculus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_444322.1 등으로 공지된 것을 포함하며, 랫(Rattus norvegicus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. XP_006255692.1 등으로 공지된 것을 포함하며, 이외에도 하기의 서열정보를 참조로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다: XP_005004655.1(guinea-pig: Cavia porcellus), XP_021503253.1(gerbil, Meriones unguiculatus), XP_002711778.1(rabbit, Oryctolagus cuniculus), XP_536777.2(dog, Canis lupus familiaris), XP_003126904.2(swine, Sus scrofa), XP_011755768.1(monkey, Macaca nemestrina), XP_008984479.1 (marmoset, Callithrix jacchus), XP_019834275.1 (cow, Bos indicus), XP_511115.2 (chimpanzee, Pan troglodytes).

바람직하게 상기 KRS 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다(Genbank Accession No. NP_005539.1). 또한 본 발명에서 상기 KRS는 이의 기능적 동등물을 포함한다.

본 발명에서 KRS 단백질은 바람직하게 세포내(intracellular) KRS 또는 세포막에 내재된 상태의 KRS를 의미하는 것으로, 이는 세포 외(extracellular)로 완전히 분비된 KRS와는 구별되는 의미이다.

상기 세포 내 KRS는 cytoplasmic form(lysyl-tRNA synthetase, cytoplasmic)과 mitochondrial form(lysyl-tRNA synthetase, mitochondrial)의 두 가지 아형(isoform)이 있다. 본 발명에서의 KRS는 바람직하게는 cytoplasmic form이다.

상기 기능적 동등물이란, 공지의 KRS 단백질을 구성하는 아미노산 서열(바람직한 일례로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 모태가 된 상기 공지의 KRS 단백질(바람직한 일례로, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드)과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서,"실질적으로 동질의 생리활성"이란 면역세포 이동을 조절하는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에서 KRS의 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys,Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 KRS의 기능적 동등물에는, KRS 단백질의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 KRS의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 KRS의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 KRS의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 KRS의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은, 원본 서열(아미노산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 1, 또는 핵산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 2)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후, 원본 서열에 대한 후보 서열의 동일 매칭 잔기(아민노산 잔기 또는 염기)의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한 단백질 서열 상동성 또는 동질성 판단의 경우에 있어서, KRS 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

본 발명에서 용어 "라미닌(laminin)"은 α, β, γ 사슬로 이루어지는 헤테로 삼량체 분자로, 서브유닛 사슬의 조성이 상이한 아이소폼(isoform, 아형)이 존재하는 세포외 매트릭스 단백질이다. 구체적으로는, 라미닌은 5 종의 α 사슬, 4 종의 β 사슬 및 3 종의 γ 사슬의 헤테로 삼량체의 조합으로 약 15 종류의 아이소폼을 갖는다. α 사슬 (α1 ~ α5), β 사슬 (β1 ~ β4) 및 γ 사슬 (γ1 ~ γ3) 의 각각의 숫자를 조합하여, 라미닌의 명칭이 정해지고 있다. 예를 들어 α1 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN111 이라고 하고, α5 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN511 이라고 하고, α5 사슬, β2 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN521 이라고 한다. 본 발명에서 용어 라미닌은 라미닌 아형 1종의 단일 성분을 의미할 수도 있고, 또는 2종 이상의 라미닌 아형이 혼합된 라미닌 혼합물을 의미하는 것일 수 있다.

라미닌으로는, 예를 들어 포유동물에서 유래하는 라미닌을 사용할 수 있다. 포유동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 인간을 들 수 있다. 바람직하게 인간 라미닌이 사용될 수 있다. 현재 인간 라미닌에는 15 종류의 아이소폼이 알려져 있으며, 바람직하게 본 발명의 라미닌 아이소폼은 α4를 포함하는 형태일 수 있으며, 보다 구체적으로는 LN421일 수 있다.

구체적으로 상기 "LN421 단백질"은 라미닌 아형α4β2γ1로 알려져있는 폴리펩티드를 의미하는 것으로서, 당업계에 LN421로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열(아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 LN421에서 α4 사슬은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, β2 사슬은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, γ1 사슬은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 LN421에서 α4 사슬은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있고, β2 사슬은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으며, γ1 사슬은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 LN421은 이의 기능적 동등물을 포함한다. 이의 기능적 동등물에 대해서는 전술한 KRS의 기능적 동등물에 대한 설명을 준하며, 이때 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 단핵구, 대식세포 또는 호중구(neutrophil) 등등 면역세포의 특이적(선택적) 이동을 조절하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 KRS 단백질 또는 라미닌 단백질은 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 먼저 통상적인 방법에 따라 상기 KRS 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예: 서열번호 2(Genbank Accession No. D32053))을 작제한다. 또는 통상적인 방법에 따라 상기 라미닌 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예: 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9 )을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 그 후, 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양한다. 상기 핵산으로부터 발현된 폴리펩타이드(단백질)는 본원에서 제공하는 발명들의 이용 양태에 따라, 세포로부터 별도의 분리 및 회수 과정 없이 세포와 함께 제공되어 이용될 수 있고, 또는 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수하는 과정을 필요로 할 수 있다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

본 발명에서 "핵산", "DNA 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 발명에서 "KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 일례로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산서열을 암호화하는 염기(핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 핵산은 천연에서 분리되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 "라미닌을 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 일례로 LN421의 경우에 있어서 각 사슬을 이루는 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있으며, 또한 상기 염기(핵산) 서열에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 각 사슬별로 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 핵산은 천연에서 분리되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 "아날로그(analog)"라 함은 표준물질(reference molecule)과 구조적으로 유사하지만, 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 표준물질과 비교할 때, 아날로그는 당업자에 의해 예상될 수 있는 바와 같이 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성(utility)를 가진다. 향상된 성질(예: 표적 물질에 대한 더 높은 결합 친화력)을 갖는 공지의 화합물 변이체를 규명하기 위한 아날로그의 합성 및 스크리닝은 약리 화학적 분야에 공지된 방법이다.

본 발명에서 "상동체(homologues)"라 함은 단백질 및/또는 단백질 서열을 언급하는 경우에는 공통의 조상 단백질(common ancestral protein) 또는 단백질 서열에서 자연적으로 또는 인위적으로 유래된 것을 나타낸다. 유사하게 핵산 및/또는 핵산 서열은 그들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래되었을 때 상동하다.

본 발명에서 "접촉(contacting)"이라 함은 이의 일반적인 의미(normal meaning)이며, 2개 이상의 제제(예: 2개 의 폴리펩티드)를 결합(combine)시키거나, 제제와 세포(예; 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다.

본 발명에서 용어‘단백질(KRS)의 세포막으로(의) 이동’은 달리 지시되지 않는 한, 어떤 세포의 내인성 단백질(세포 내부에서 만들어진 단백질로서, 예를들어 세포질에 존재하던 것)이 동일한 세포의 세포 내(intracellular) 방향으로의 세포막으로 이동하는 것을 의미한다. 이때 KRS는 완전히 세포 내 방향으로만 존재하는 것일 수 있고, 또는 세포막사이에 끼어 있어서 일부(바람직하게 KRS의 경우 N term 일부)가 세포 외로 노출될 수 있으나, 어느 경우에도 단백질이 생성된 세포 밖으로 완전히 분리되는 것을 배제하는 것이 바람직할 수 있다. 즉, 본 발명에서 상기 세포막으로의 이동은, 달리 지시되지 않는 한, 어떤 세포에서 완전히 분리 및 분비된 단백질이 다른 세포 또는 조직의 밖(extracellular)으로부터 상호작용하는 것과 구분된다.

본 발명에서 용어‘세포막 위치’는 세포막 그 자체 및, 세포막과 매우 가까워 실질적으로 세포막과 상호작용하고 있을 것으로 인정되는 인근(부근)을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 "제제(agent)" 또는 "시험 제제(test agent)"라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다. 본 발명의 제제는, 바람직하게 구체적으로 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드(표적물질(예를 들어 KRS)에 특이적인 결합도메인을 갖는 펩티드), 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질유사체, 천연추출물 및 화합물(천연화합물 및 합성화합물)을 모두 포함한다.

보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 항체, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험 제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.

상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol.Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr.Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).

본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 KRS 전장 단백질 또는 이의 단편(단편 폴리펩타이드)이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 KRS에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. KRS의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisengerg ＆ D. C. Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). KRS의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 5, 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4^th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).

본 발명에서 "miRNA, siRNA 또는 shRNA"란, RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 siRNA 또는 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있으며, 본 발명의 목적상, KRS의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서‘siRNA’는 목적 단백질을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것일 수 있다. 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서‘안티센스 뉴클레오티드’는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙 mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

본 발명에서‘펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)’는 KRS 단백질의 결합도메인을 억제하여 KRS 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 미메틱스(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 미메틱스는 KRS 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).

본 발명에서‘ 앱타머(aptamer)’는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.

본 발명에서 'KRS 항체' 또는 'KRS에 대한 항체'는 KRS의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명 의 목적상, 상기 항체는 KRS 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직할 수 있다.

상기한 바와 같은 KRS에 대한 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 KRS 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

또한 본 발명에서 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 바람직하게 상기 단편은 모(母)항체의 KRS 결합 친화도의 적어도 50%, 60%. 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.

본 발명에 적용되는 항체는 이에 제한되지 않으나 일례로 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다.

본 발명에서 용어 "면역 세포"는 체내 면역반응에 관여하는 세포를 의미하는 것으로서, 당업계에 면역세포로 알려진 것, 특히 인체에 존재하는 면역세포로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염구, 수지상세포, 자연살해세포, 거핵구, T 세포 및 B 세포 등을 포함한다. 바람직하게 단핵구, 대식세포 또는 호중구(neutrophil)를 의미하는 것 일 수 있다. 면역세포는 KRS를 발현한다.

본 명세서에서‘치료’는 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 ‘예방’은 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 KRS가 면역세포 이동 조절 활성이 있음을 최초로 밝혔으며, 특히 면역세포의 병리학적 이동 및 침윤 현상과 관련하여 KRS가 면역세포(특히, 단핵구/대식세포)의 세포질 대비 세포막에서 그 수준이 특이적으로 높아지는 것이 중요한 병리 현상임을 최초로 규명하였다.

이에, 본 발명자들은 KRS의 발현을 저해하여 면역세포 내 (전체적)수준을 감소시키는 경우 면역세포 이동이 억제되는 것을 확인하였으며, 이동성 및 침윤성을 띠도록 활성화된 면역세포의 세포막에 증가되어있는 KRS를 세포막 위치에서 특이적으로 그 수준을 감소시키는 경우(예를들어, 엔도사이토시스 유도)에 면역세포 이동을 억제하고 실제 in vivo 상에서 염증성 질환, 섬유화 질환, 폐동맥 고혈압 등 과도한 면역세포 침윤에 의한 질환에 대하여 치료 효과를 나타내었으며, 뿐만아니라 KRS가 세포막으로 이동하는 활성을 억제하는 경우에도 면역세포 이동을 억제하여 면역세포 이동 질환의 예방 또는/ 및 치료에 이용할 수 있음을 밝혔다.

따라서 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소( Lysyl tRNA synthetase , KRS ) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기‘KRS 저해(제)’는 바람직하게 KRS의 발현 억제(제) 또는/및 활성 억제(제)를 모두 포함하는 의미이다.

상기 KRS 발현 억제는 KRS의 유전자, mRNA 및 단백질 발현 억제를 모두 포함하는 의미로서, KRS의 면역세포 내 수준을 감소시키는 방법에 대해서 후술하는 바와 같이 전사단계, 전사 후 단계, 번역 후 단계 등을 포함하여 각 단계의 발현 산물의 생성을 억제하는 것을 의미한다.

상기 KRS 활성 억제는, 바람직하게 KRS의 면역세포 이동에 관계하는 임의의 활성(신호)을 감소, 방지, 예방, 또는 차단하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 상기 KRS 활성은, 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 KRS의 세포 내 수준 또는 안정성과 연관된 활성, 특히 면역세포 이동과 연관되어 세포막 위치에서 KRS의 존재 수준(level)이 증가된 것과 관계된 활성을 포함하며, 이 경우 상기 활성에는 면역세포 세포막 특이적으로 KRS의 존재수준을 증가시키는데 원인이 되는 활성뿐만 아니라 세포막에서 KRS가 위치될 때(존재할 때) 종속적으로 발휘되는 활성을 모두 포함하는 의미이다. 일례로, 세포막에 KRS의 존재수준을 증가시키는데 원인이 되는 활성으로는 KRS의 인산화, KRS의 세포막으로의 이동 활성 등이 있을 수 있고, 세포막에 KRS가 위치될 때(존재할 때) 종속적으로 발휘되는 활성으로는, 세포막과 KRS가 상호작용하는 활성, 또는 세포막에서 KRS가 이의 결합인자(또는 리간드)와 상호작용(결합)하는 활성 등을 포함한다. 이러한 활성 억제의 구체예들에 대하여 상세한 내용은 후술하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법에 관한 설명을 참조로하여 이해된다.

가장 바람직한 구체예로서, 본 발명에서‘KRS 저해’는 하기 (i), (ii) 및 (iii)에 해당하는 것일 수 있다.

(i) KRS 발현 억제;

(ii) 세포막 위치의 KRS 수준(level) 감소; 및

(iii) KRS의 세포막으로의 이동 활성 억제.

상기 KRS 저해제는, KRS mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, miRNA, siRNA, shRNA, 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme) 및 PNA(Peptide nucleic acid) 로 이루어진 군; 또는

KRS 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질유사체, 앱타머, 항체, 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 의하면 면역세포에서 KRS의 발현을 억제시키는 경우 면역세포의 이동이 억제되므로, 본 발명은 구체적 일 양태로서, 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기에서 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자는 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA shRNA 또는 miRNA일 수 있다. 본 발명에서 상기 KRS 저해제로서의 siRNA(si-KRS)는 일례로 서열번호 13 내지 서열번호 19로 이루어지는 군에서 선택된 염기서열(핵산서열)을 포함하는 센스서열과 이에 상보적인 안티센스 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al.,Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

한편. 상기 발현벡터는 감염(infection), 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터를 이용한 유전자 전달 방법은 포유동물 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서, FDA로부터 승인받은 인간에게 사용할 수 있는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다. 상기 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한 본 발명의 적용 가능한 방법으로서, 상기 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus), 렌티바이러스(Lenti virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다(Miller, A.D., Nature, 357:455-460, 1992). FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986). 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다(Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155, 1992; Jaffe et al., Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.

또한 상기 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자(예를 들어 antisense RNA, siRNA shRNA 또는 miRNA)는 다른 방법, 예를 들면, 국소적으로, 경구(설하 적용 포함) 투여 및 비경구 투여로서 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 상기 비경구 투여는 주사법 및 점적법을 포함한다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직을 치료하기 위한 유효량으로 면역세포 이동 관련 질환의 병소 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식 기관, 폐 및 기관지 시스템과 같은 체강(body cavity)에 있는 병소의 경우에는 본 발명의 구조유전자(또는 본 발명의 구조유전자를 포함하는 발현벡터)를 함유하는 약학적 조성물을 상기 병소에 의해 영향을 받는 유강 기관(hollow organ) 내에 바늘, 도관(catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다. 이때, X-선, 소노그램(sonogram), 또는 광섬유 시스템(fiberoptic visualization system)과 같은 영상 장치가 표적조직의 위치확인과 바늘 또는 도관의 주입에 사용될 수 있다. 그 밖에, 직접적으로 도달할 수 없거나 분석학적으로 분리해낼 수 없는 병소의 경우에는 본 발명의 조성물을 혈액순환계 내로 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 구체적 일 양태로서, KRS에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 KRS 저해제로서의 항체는, 일례로 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain)로 이루어지는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 구체적 일 양태로서, KRS 저해제로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서는 KRS의 세포막으로의 이동을 저해하는 물질로서, 하기 화학식 1로 표시되는 4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산을 대표로하여, 다양한 종류의 면역세포 이동(및 침윤) 관련 질환에 대한 in vivo 질병모델에 적용하여 이의 질환 예방 및 치료 효과를 확인한 바 있다. 하기 화학식 1의 화합물은 본 명세서에서 'BC-KI-00053'으로도 명명된다.

<화학식 1>

상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 비대칭 원자를 포함하는 치환기를 가질 수 있으며, 이 경우 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 (R), (S), 또는 라세믹체(RS) 등의 광학 이성질체로 존재할 수 있다. 따라서, 달리 표기하지 않는 한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 (R), (S), 또는 라세믹체(RS) 등의 광학 이성질체를 모두 포함한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용가능한(허용되는)'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 염은 통상의 산부가염, 예를 들어 염산, 브롬산, 황산 또는 인산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한, 상기 염은 통상의 금속염 형태, 예를 들어 리튬, 소듐, 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속염; 칼슘 또는 마그네슘염과 같은 알카리 토금속염; 또는 크롬염을 포함한다. 또한 적당한 유기 리간드들로 형성된 염, 예를 들면 4차 암모늄염을 포함하며, 디사이클로헥실아민 또는 N-메틸-D-글루카민염과 아르기닌과 라이신 등으로 형성된 아미노산염을 포함한다.

본 발명에서 용어 "면역세포 이동 관련 질환"은, 당업계에 과도한 면역세포 이동(또는/및 침윤)이 주요한 발병 기전인 것으로 공지된 것이라면 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를들어 심혈관 질환, 섬유화 질환, 염증성 질환 및 알포트 증후군(Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 심혈관 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를들어 고혈압(고혈압에 의한 염증성 합병증 포함), 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화, 협심증, 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환, 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 섬유화 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 경피증(scleroderma), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 간 섬유증(hepathic fibrosis), 간경변증(liver cirrhosis), 신장 섬유증(kidney fibrosis), 사구체 경화증, 근섬유증(myofibrosis), 심장 섬유증, 간질성 섬유화증, 췌장 섬유화증, 비장 섬유화증, 종격막 섬유화증, 혈관 섬유화증, 피부 섬유화증, 눈 섬유화증, 황반 변성, 관절 섬유화증, 갑상선 섬유화증, 심내막심근 섬유화증, 복막 섬유화증, 복막후 섬유화증, 진행성 종괴성 섬유화증, 신원성 전신섬유화증, 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu), 유전성 섬유증, 감염성 섬유증, 자극성 섬유증, 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증, 외과수술의 섬유성 합병증, 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증, 당뇨성 섬유증, 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 염증성 질환은 그 종류가 특별히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 자가 면역 질환, 염증성 장 질환, 피부염(예를들어 아토피성 피부염, 습진, 건선증 등), 당뇨성 안질환(당뇨병성 망막증 등), 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중(卒中, 뇌졸중 등), 기관지염, 세기관지염, 간염(간경변, 무알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis) 등), 신장염(당뇨병성 신부전증 등), 단백뇨증, 관절염(건선성 관절염, 골관절염 등), 신경염(당뇨병성 신경병증 , 다발성 경화증 등), 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 혈관염, 루게릭병, 베게너 육아종증, 과사이토카인 혈증(hypercytokinemia), 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 또한 만성 염증질환을 포함한다.

본 발명에서 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 건선, 천식, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 다발성 경화증, 피부근염, 교원병, 혈관염, 관절염, 육아종증, 장기 특이적 자가면역병변, 궤양성 대장염 및 GvHD (이식편대 숙주 반응 질환: graft-versus-host disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 만성 염증 질환은 전술한 염증성 질환의 종류를 참조로 하여 이들이 만성(chronic)화 된 상태를 포함하는 의미이며, 이들의 바람직한 일례로는 천식, 아토피성 피부염, 습진, 건선증, 골관절염, 통풍, 건선성 관절염, 간경변, 무알콜성 지방간염, 만성폐쇄성 폐질환, 비염, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신부전증, 당뇨병성 신경병증 및 다발성 경화증 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 KRS 저해제 물질들을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태의 각종 약학적 제형으로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다. 구체적으로, 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

이와 같이 본 발명의 KRS 저해제를 포함하는 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 크게, 후술하는 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 상기 KRS 저해제 또는/및 이를 포함하는 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다.

비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함하며, 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 정맥 내, 복강 내, 뇌 내, 피하, 근육내, 안내, 동맥 내, 뇌척수 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 비강 내, 장관, 국소, 설하, 직장 내 또는 병변 내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기재된 서방성 (sustained release) 시스템에 의한 주사 또는 주입일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 일례로 상기 KRS 저해제 또는 이를 함유하는 조성물은 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명자들은 KRS가 면역세포 이동 조절 활성이 있음을 최초로 밝혔다. 따라서 본 발명은 KRS의 면역세포 이동 활성(신호) 조절을 통해 면역세포 이동을 조절하는 방법이 개시된다. 특히 면역세포의 세포막 위치에 특이적으로 KRS 수준이 증가되는 현상이 면역세포 이동 및 침윤 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 KRS(라이실 tRNA 합성효소)의 면역 세포 내 수준 조절, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절, 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법을 제공한다.

이때 상기 방법이 수행되는 개체는, 면역세포 이동의 조절이 필요한 개체라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 사람(Homo sapiens)을 포함하는 포유동물 등에서 상기 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게 상기 개체는 사람을 제외한 동물일 수 있다.

상기 KRS의 세포 내 수준 조절에 따른 면역세포 이동 조절에 대하여 이를 보다 상세히 설명하면, 라이실 tRNA 합성효소(KRS)의 면역세포 내 수준을 감소시키는 경우 면역세포 이동을 억제할 수 있으며, 라이실 tRNA 합성효소(KRS)의 면역세포 내 수준을 증가시키는 경우 면역세포의 이동을 촉진(증진, 증가) 할 수 있다.

세포내 수준의 감소 또는 증가는 상기에서 기재한 바와 더불어 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 세포내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있다.

전사 단계에서의 조절 방법으로서, 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법으로는, 예를들면, 프로모터에 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법으로는, 예를 들면 프로모터 또는 유전자 부위의 돌연변이를 유도하여 프로모터 활성 또는 단백질의 기능을 저해하는 방법, 안티센스(antisense) 유전자를 발현시키는 방법, siRNA 또는 마이크로RNA(miRNA) 방법 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

전사 후 단계에서의 조절 방법으로서, 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진 또는 저해시키기 위한 방법으로는, 예를 들면, KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진 또는 저해하는 방법, 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성을 증진 또는 저해하는 방법 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 활성을 증진 또는 저해하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 방법의 보다 구체적인 예로 1군 인트론 타입, Ml RNA 타입, 망치머리(hammerhead) 형, 또는 머리핀(hairpin) 형 또는 마이크로RNA 형 등의 전사된 mRNA에 작용하는 RNA를 암호화하는 DNA서열로 형질전환하거나, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환을 통한 동시억제(cosuppression)를 유도할 수 있다.

바람직하게는 본 발명에서 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포(면역 세포) 내 수준을 조절하는 것은, 상기 KRS 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가 또는 감소시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가 또는 감소시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시키거나, 프로모터에 KRS에 대한 안티센스 또는 siRNA 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 그 발현을 감소시킬 수 있다. 이 때 상기 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 KRS에 대한 siRNA 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 13 내지 서열번호 19로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열(핵산서열)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 KRS의 세포막 위치 특이적 존재수준 조절에 따른 면역세포 이동 조절에 대하여 이를 보다 상세히 설명하면, KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 감소시키는 경우 면역세포 이동을 억제할 수 있으며, KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 증가시키는 경우 면역세포의 이동을 촉진(증진, 증가) 할 수 있다.

세포막 위치 특이적으로 KRS의 수준 감소 또는 증가는 당업자에게 기재된 공지의 여러 방법으로 조절 될 수 있다.

세포막 위치 특이적으로 KRS의 수준 감소는, 일례로 KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 방법 또는 수단에 의하여 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 화합물(화학식 1의 BC-KI-00053)을 이용하여, 면역세포 이동이 억제됨을 확인한 바 있다. 또한 KRS에 대한 항체(anti-KRS 항체)와의 결합에 의하여 이러한 이동이 저해될 수 있을 것으로 보이며, 이러한 경우 항체의 구체적 타겟 항원성 부위에 따라서는 세포 내 침투를 위한 추가의 처리가 필요할 수 있다. 항체의 세포 내 침투를 위한 기술들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 일례로 임의의 세포 투과성 펩타이드의 부착 등의 수단을 이용할 수 있으며, 이는 US9598465B2, US20160009772A1 등의 문헌을 참조로 할 수 있다. 이외에도 항체의 세포 내 침투를 위하여 WO2017204606A1 등의 문헌을 참조로 할 수 있다.

또한 세포막 위치 특이적으로 KRS의 수준 감소는, 일례로 사후(事後)적으로 세포막 위치에 존재하는 KRS의 엔도사이토시스를 촉진시키는 방법 또는 수단에 의하여 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 본 발명의 일 실시예에서는 anti-KRS 항체가 세포막에 위치한 KRS에 대하여, 이의 세포 외로 돌출된 N-term 영역 (KRS N-말단의 1 내지 72개의 아미노산에 해당하는 영역)에 결합한 후 세포 내로 엔도사이토시스를 유발하고, 이에 의하여 면역세포 이동이 억제되었음을 확인한 바 있다.

세포막 위치 특이적으로 KRS의 수준 증가는, 일례로 KRS의 세포막으로의 이동을 촉진하는 방법 또는 수단에 의하여 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일례로, 라미닌, 특히 LN421을 처리하는 것에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 LN421을 면역세포에 처리하는 경우에 세포막 위치에서 특이적으로 KRS 수준이 증가되는 것을 확인한 바 있다. 또 다른 일례로 KRS의 인산화를 유발 또는 촉진하는 임의의 물질이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 인산화효소(kinase) 류의 물질이 사용될 수 있다.

상기 KRS의 세포막으로의 이동 조절에 따른 면역세포 이동 조절에 대하여 이를 보다 상세히 설명하면, 세포질에 존재하는 라이실 tRNA 합성효소(KRS)의 세포막으로의 이동을 감소시키는 경우 면역세포 이동을 억제할 수 있으며, 라이실 tRNA 합성효소(KRS)의 세포막으로의 이동을 증가시키는 경우 면역세포의 이동을 촉진(증진, 증가) 할 수 있다. 이는 전술한 바를 참조로 이해된다.

전술한 바와 같이, 본 발명자들은 KRS가 면역세포 이동 조절 활성이 있음을 최초로 밝혔으며, 또한 이러한 KRS의 면역세포 내 행동 양상과 관련하여 라미닌(특히, 라미닌 아형 α4β2γ1)과의 특별한 관련성을 가짐을 확인하였다. 이러한 신규한 발견을 기반으로, 본원 발명은 면역세포 이동 및 침윤에 의한 질환 치료제를 발굴하는 새로운 스크리닝 수단을 제공한다.

따라서, 본 발명은

(A) 시험물질이 KRS를 저해하는지 여부를 측정하는 단계:

(B) 면역세포에 라미닌(laminine)을 처리하는 단계; 및

(C) 상기 (A) 단계에서 KRS 저해 활성이 있는 것으로 확인된 시험물질을 (b) 단계의 면역세포에 처리하여 면역세포의 이동을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법과

상기 스크리닝 방법으로 선별된 제제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은 당업계에 공지된 다양한 생화학적 및 분자생물학적 기술이 상기 방법을 실시하는데 이용될 수 있다. 상기 기술은 다음의 문헌에 개시되어 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; and Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York(1987-1999).

먼저, 상기 시험 제제가 먼저 KRS의 발현 또는 (생물학적) 활성을 조절하는 능력이 있는지 어세이한다((A) 단계, 1차 어세이 단계). 구체적으로 1차 단계에서는 시험 제제의 존재 하에서 KRS의 발현 또는 생물학적 활성을 어세이(assay)하여, KRS의 발현 또는 생물학적 활성을 조절하는 조절 제제(modulating agent)를 규명(identify)한다.

구체적으로, 1차 어세이 단계에서, 시험 제제는 KRS의 발현 수준 조절 능력이 있는지, 예컨대, 전사 또는 번역을 조절하는 능력이 있는지에 대하여 어세이(assay)될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 어세이 과정에서 KRS 발현 수준 측정을 위한 공지의 방법이 제한없이 사용가능하다. 본 발명에서 용어‘KRS 발현 수준 측정’은 KRS 단백질 자체 또는 KRS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자 또는 mRNA 등의 전사체 포함)의 발현수준을 측정하는 것을 모두 포함하는 의미이다.

상기 단백질 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunospecific assay), 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법(면역조직화학염색 및 면역형광염색 등 포함), 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence activated cell sorter), 발광 분석(luminescence assay) 또는 단백질 칩방법 중 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드(유전자 또는 mRNA 등의 전사체 포함)유전자 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 유전자 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 PCR(polymerase chain reaction), RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting), 발광 분석(luminescence assay) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.

또한 1차 어세이 단계에서, 시험제제가 KRS의 여러 생물학적 활성에 대한 조절 능력이 있는지 어세이될 수 있다. 예컨대, 시험 제제는 KRS의 세포 내 수준 또는 안정성(예컨대 번역 후 수식(post-translational modification)에 대한 영향, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 또는 안정성에 대한 영향, KRS의 엔도사이토시스 유발 여부, KRS가 활성을 나타내는 위치로의 이동과 관련된 활성 조절 여부, 세포막으로의 이동 여부, 결합인자와의 결합여부, 세포이동을 촉진하는 시그날 조절 기능 변화 여부, 또는 세포막과 상호작용하는 활성이 있는지에 대하여 어세이될 수 있다. 상기 1차 어세이 단계에서 KRS 저해하는 제제의 선별은, 본 명세서에서‘KRS 저해’에 대해서 전술한 것을 참조로 하여 판단될 수 있다.

KRS 단백질의 활성에 영향을 주는 시험제제의 선별을 위한 상기 1차 어세이과정은, 먼저 시험제제가 KRS와 결합하는 능력이 있는지 어세이될 수 있다. KRS에 대한 시험 제제의 결합은, 예컨대, 표지된 시험관 내 단백질-단백질 결합 어세이, EMSA(electrophoretic mobility shift assays), 단백질 결합을 검출하기 위한 면역어세이, 기능적 어세이(인산화 어세이 등) 등과 같은 다양한 방법으로 어세이될 수 있다(U.S. Pat. Nos. 4,366,241:4,376,110; 4,517,288 and 4,837,168; and Bevan et al., Trends in Biotechnology, 13:115-122, 1995; Ecker et al., Bio/Technology, 13:351-360, 1995; and Hodgson, Bio/Technology, 10:973- 980, 1992). 시험 제제는 KRS와의 직접적인 결합, 예컨대, KRS에 대한 항체에 의한 KRS 폴리펩티드와의 공동-침전(co-immunoprecipitation)을 검출함으로써 확인될 수 있다. 또한 시험 제제는 KRS와 시험 제제의 결합을 나타낼 수 있는 시그널, 예컨대, 형광 퀀칭(quenching)을 검출함으로써 확인될 수 있다.

당업계에 통상적으로 실시되고 있는 다양한 어세이들이 KRS를 조절하는 제제를 규명하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 제제는 세포 기반 어세이 시스템(cell based assay system)으로 스크리닝될 수 있다. 예컨대, 스크리닝하기 위한 전형적인 세포 기반 어세이에서, 시험 제제의 존재 하에서 리포터 유전자 활성(예: 효소 활성)을 측정하고, 이를 시험 제제의 부재 하에서의 리포터 유전자의 활성과 비교한다. 상기 리포터 유전자는 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 폴리펩티드(반응 또는 리포터 폴리펩티드), 예컨대, 형광 또는 인광(phosphorescence)에 의해 검출가능한 폴리펩티드나 그것이 보유하고 있는 효소 활성에 의해 검출가능한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 검출가능한 반응 폴리펩티드(detectable reponse polypeptide)는, 예컨대, 루시퍼라제, 알파-글루쿠로니다제(glucuronidase), 알파-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질 및 인간 분비된 알칼린 인산화효소일 수 있다.

세포-기반 어세이에서, 시험 제제(예: 펩티드 또는 폴리펩티드)는 숙주세포 내에 존재하는 다른 벡터에 의해 발현될 수 있다. 어떤 방법에서는, 시험 제제의 라이브러리가 상기 벡터의 라이브러리(예: cDNA 라이브러리)에 의해 암호화된다. 상기 라이브러리는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있으며(Sambrook et al. and Ausubel et al., supra), 또는 다양한 상업적인 출처로부터 얻어질 수 있다.

상기 세포-기반 어세이 이외에, 비-세포 기반 방법에 의해서도 스크리닝될 수 있다. 상기 방법은, 예컨대, 효소면역측정법 (ELISA), 표면플라스몬공명 (surface plasmon resonance, SPR), 유세포 분석(flow-cytometry analysis) 등을 활용한 어세이, 모빌리티 쉬프트 DNA 결합 어세이(mobility shift DNA-binding assays), 메틸화 및 우라실 간섭 어세이(methylation and uracil interference assays), DNase 및 히드록시 라디칼 풋프린팅 분석(DNase and hydroxyl radical footprinting analysis), 형광 편광(fluorescence polarization) 및 UV 교차결합(crosslinking) 또는 화학적 가교제(cross-linkers)를 포함한다. 일반적인 개요는 Ausubel 등의 문헌에 개시되어 있다(Ausubel et al., supra, chapter 12, DNA-Protein Interaction). 핵산 및 DNA/RNA 결합 단백질을 포함하는 공동-결합된 단백질(co-associating protein)을 분리하는 기술은, 절단가능한 가교제 디티오비스(dithiobis)(succinimidylpropionate) 및 3,3'-디티오비스(sulfosuccinimidyl-propionate)를 포함하는 UV 교차 결합 또는 화학적 가교제를 포함한다(McLaughlin, Am. J. Hum. Genet., 59:561-569, 1996; Tang, Biochemistry, 35:8216-8225, 1996; Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:10712, 1996; and Chodosh, Mol. Cell. Biol., 6:4723-4733, 1986).

구체적으로, 경쟁 어세이(competition assays)는 KRS에 특이적으로 결합하는 시험 제제를 규명하는데 적당한 포맷(format)을 제공한다. 본 발명은 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고성능(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다. 상기 포맷에서, 시험 제제는 KRS와 결합하는 것으로 이미 공지된 화합물과의 경쟁을 통해 스크리닝된다. 공지된 결합 화합물은 합성 화합물일 수 있다. 또한 그것은 KRS를 특이적으로 인식하는 항체, 예컨대, KRS에 대한 단일클론 항체일 수 있다. 만일 시험 제제가 상기 공지된 화합물의 결합을 저해한다면, 상기 시험 제제는 KRS에도 결합한다.

다양한 종류의 경쟁 어세이들이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 고체상 직접 또는 간접적 효소 방사면역측정법(solid phase direct or indirect radioimmunoassay, RIA), 고체상 직접 또는 간접적 효소 면역측정법(EIA), 샌드위치 경쟁 어세이(Stahli et al., Methods in Enzymology, 9:242-2453, 1983); 고체상 직접 바이오틴-아비틴 EIA(Kirkland et al., J. Immunol., 137:3614-3619, 1986); 고체상 직접 표지화된 어세이, 고체상 직접 표지화된 샌드위치 어세이(Harlow and Lane, Antibodies, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988); 125I를 이용한 고체상 직접 표지 RIA(Morel et al., Mol. Immuno., 25(1);7-15, 1988; 고체상 직접 바이오틴-아비틴 EIA(Cheung et al., Virology, 176:546-552, 1990); 및 직접 표지화된 RIA(Moldenhauer et al., Sacnd. J. Immunol., 32:77-82, 1990). 일반적으로 상기 어세이들은 비표지화된 시험 제제 및 표지화된 대조 화합물을 포함하고 있는 세포 또는 고체 표면에 결합되어 있는 정제된 폴리펩티드의 이용을 포함한다. 경쟁적 저해는 시험 제제의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 경쟁 어세이에 의해 규명된 조절 제제는 대조 화합물과 동일한 에피토프에 결합하는 제제 및 입체 저해(steric hindrance)가 일어나도록 하기 위해 대조 화합물에 의해 결합된 에피토프에 충분하게 근접한 인접 에피토프와 결합하는 제제를 포함한다. 통상적으로 경쟁 저해가 과도하게 존재할 때, 일반적인 표적 폴리펩티드에 대한 대조 화합물의 특이적인 결합이 적어도 50％ 내지 75％ 저해될 것이다.

상기 어세이는 불용성 또는 용해성 포맷일 수 있다. 불용성 어세이의 일 예는 KRS 또는 이의 단편을 고체 상 매트릭스에서 고정화하는 것이다. 이후, 시험 제제가 결합하기에 충분한 시간 동안 고체상 매트릭스를 시험 제제와 접촉하여 둔다. 이후, 고체상 매트릭스로부터 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거한 후, 고체상에 결합된 제제의 존재를 확인한다. 상기 방법은 고체상 매트릭스로부터 결합된 제제를 용리하여 제제를 분리하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 양자택일적으로, KRS를 고정화시키는 다른 방법은 시험 제제를 고체상 매트릭스에 결합시킨 후, KRS를 첨가하는 것이다.

용해성 어세이는 위에 기재된 몇몇 결합 라이브러리 스크리닝 방법을 포함한다. 용해성 어세이 포맷하에서, 시험 제제나 KRS는 모두 고체 지지대에 결합하지 않는다. 시험 제제에 대한 KRS 또는 이의 단편의 결합은 예컨대, KRS 및/또는 시험 제제의 형광에 의해 측정될 수 있다. 형광은 내재적이거나(intrinsic) 형광물질(fluorophor)을 가진 성분의 표지에 의해 부여될 수 있다.

상기 어세이 과정에서, 시험물질 또는 KRS 단백질은 주어진 조건에서 이의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여 검출가능한 표지(detectable label)로 표지 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, 알파-글루쿠로니다제(glucuronidase), 알파-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³²P 및 ³⁵S), 형광 표지(예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지, 화학 발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다. 유사하게, 상기 검출가능한 그룹은 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다.

검출가능한 표지가 표지된 KRS 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, KRS 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

택일적으로, 시험물질의 KRS 단백질로의 결합 여부는 상호작용물(interactants)의 표지 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 이용하여 시험물질이 KRS 단백질에 결합하는지 여부를 분석할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS(light-addressable potentiometric sensor)를 이용하여 세포가 그의 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 산성화 속도의 변화는, 시험물질과 KRS 단백질 사이의 결합에 대한 지시자로 이용될 수 있다(McConnell et al., Science 257:1906-1912(1992)).

시험물질의 KRS 단백질과의 결합 능력은 실시간 이분자 상호작용 분석(BIA)를 이용하여 분석할 수 있다. (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem.,. 63:2338-2345(1991), 및 Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705(1995)). BIA는 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서, 상호작용물(interactants)의 표지 없이 실시할 수 있다(예컨대, BIAcore™). 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반응에 대한 지시자(indicator)로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법들은 투-하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리드 분석 방법을 적용하여 실시할 수 있다(U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; 및 W0 94/10300). 이 경우, KRS 단백질을 "베이트(bait)" 단백질로 이용할 수 있다. 이 방법에 따르면, KRS 단백질에 결합하는 물질, 특히 단백질(펩티드)을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드시스템은 분할 가능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모듈 특성에 기초한다. 간단하게는, 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대, 하나의 컨스트럭트에서, KRS-코딩 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자(예컨대, GAL4)의 DNA 결합 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서, 분석 대상의 단백질(“프레이” 또는 “시료(시험제제)”)을 코딩하는 DNA 서열을 상기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 만일, 베이트 및 프레이가 생체 내에서 상호작용하여 복합체를 형성하면, 전사인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며, 이는 리포터 유전자(예컨대, LacZ)의 전사를 촉발하게 된다. 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며, 이는 분석 대상의 단백질이 KRS 단백질과 결합할 수 있음을 나타낸다.

이렇게 KRS 단백질과 결합하는 것으로 확인된 시험제제에 대하여, 상기 시험제제가 처리된 KRS 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, KRS 단백질의 활성이 하향-조절(downregulation) 되는 것이 측정되면, 상기 시험물질은 KRS 활성 저해제로서 잠정적으로 면역세포 이동 관련 질환의 예방 및 치료제 후보(candidate)로 판정될 수 있다.

상기 1차 어세이 단계를 통하여 KRS를 저해(KRS의 발현 또는 활성 저해)하는 제제를 규명한 후, 상기 시험제제가 면역세포 이동을 억제하는 능력이 있는지를 KRS 및 라미닌(특히, LN421)의 존재 하에서 더욱 테스트한다((B) 및 (C) 단계, 2차 어세이 단계). 이때 KRS는 면역세포 내에서 항시 발현되고 있는 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 라미닌의 처리는, 별도로 분리된 라미닌 단백질을 면역세포 외부(배지 등)에 처리하는 방식을 통해 이루어질 수 있고, 또는 특별한 유전적 조작을 통해서 세포 내에서 발현되도록 처리할 수 있다. 본 발명에서는 KRS가 라미닌(특히, LN421)에 특이적인 면역세포 이동을 조절하는 능력이 있음을 신규하게 밝힌 바 있다. 2차 어세이 단계에서는 당업계에 공지된 다양한 세포 이동 어세이(cell migration assay) 방법, 또는 세포 침윤 분석법(invasion assay)이 사용될 수 있다.

위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 규명된 KRS를 저해하는 제제는 면역세포의 이동을 조절(억제)할 수 있다. 만약, 상기 1차 어세이 단계에서 규명된 시험 제제가 KRS의 세포 내 수준(예: 전사 활성의 변경에 의하여)을 조절한다면, 그것은 곧바로 면역세포의 이동을 조절할 수 있는 것으로 간주될 수 있다.

한편, 만약 시험 제제가 KRS의 세포 내 수준이 아닌 다른 활성을 조절한다면, KRS에 대한 상기 시험 제제의 조절 효과가 면역세포 이동을 실제로 조절하는지를 확인하는 것이 필요할 수 있으며, 이 경우 상기 2차 어세이 단계가 추가적으로 수행되는 것이 바람직하다. 또한 효율적인 어세이 수행을 위해 1차 및 2차 어세이의 순서가 변경될 수 있다.

또한 본 발명자들은 면역세포(단핵구/대식세포)의 세포막 위치에 특이적으로 KRS 수준이 증가되는 현상이 면역세포 이동 및 침윤 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상이며 이는 라미닌(특히, 라미닌 아형 α4β2γ1)과 특별한 연관성을 가짐을 확인한 바 있다. 이러한 신규한 발견을 기반으로, 본원 발명은 면역세포 이동 및 침윤에 의한 질환 치료제를 발굴하는 새로운 스크리닝 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은

(a) 면역세포에 라미닌 및 시험물질을 처리하고 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동을 모니터링 하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 면역세포에서 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동이 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 낮을 경우에( 감소되었을 경우에) 상기 시험물질을 면역세포 이동과 관련된 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는,

면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법과

상기 (a) 단계에서 상기 라미닌 및 시험물질은 면역세포에 동시에 처리되거나, 또는 각 물질이 순차적으로 처리될 수 있으며 이 경우 먼저 투입되는 물질에는 제한이 없다. 즉, 후자에 있어서 라미닌이 먼저 처리된 후 시험물질이 처리될 수 있고, 또는 시험물질이 처리된 후 라미닌이 처리될 수 있다.

상기 (b) 단계에서‘모니터링’이란 세포막 위치에서의 KRS 수준 변화, 또는 KRS의 세포막으로의 이동 여부 및 수준(양)을 측정하는 모든 수단을 의미한다.

상기 세포막 위치에서의 KRS (존재) 수준 변화 또는 KRS의 세포막으로의 이동 여부 및 수준(양)의 측정은, 공지의 단백질 수준 측정 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트면역전기영동, 면역염색법(면역화학염색, 면역형광염색 등), 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 발광분석(luminescence assay) 및 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것에 의하여 수행될 수 있다. 당업자라면, 사용하고자하는 단백질 수준 측정 방법의 특성에 따라, 세포막 위치 특이적인 KRS 수준 및 KRS 이동을 측정하기 위하여 임의의 처리 공정을 포함시킬 수 있는데, 일례로 웨스턴 블롯 방법을 사용하는 경우에는 대상 세포로부터 세포막(membrane) 분획과 세포기질(cytosol)분획을 별도로 제조하는 공정을 사용할 수 있다. 이와 대비적으로 면역염색법을 사용하는 경우에는, 상기와 같이 분획을 제조하지 않아도 단백질의 세포막으로 이동 행태 및 세포막에서의 단백질 수준 변화가 용이하게 관찰 가능할 수 있다.

또한 세포내에서의 단백질의 이동에 영향을 미치는 화합물을 검출하기 위하여, 본 발명에서 이용할 수 있는 세포내 과정의 관측 및 신약검색을 위한 시스템은 대한민국 등록 특허 10-0919637을 참조로 하여 수행될 수 있다.

상기‘대조군’이란 시험물질(시험제제)를 처리하지 않은 면역세포로서 (a) 단계에서 사용된 세포와 동일한 종류 면역세포이다. 상기 대조군으로 사용되는 면역세포는 라미닌(특히, LN421)이 처리된 것 또는 라미닌이 비처리된 것을 모두 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법들은 또한 ‘면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제로 판단된(또는 확인된) 시험제제를 면역세포 이동(및 침윤)과 관련된 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계’를 추가적으로 포함할 수 있다. 이때 상기 동물은 인간이 아닌 동물인 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 KRS를 제어하면 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이는 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 면역세포(단핵구/대식세포) 이동에 대한 콜라겐(Col), 파이브로넥틴(FN) 및 라미닌(LN)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 1b는 상기 도 1a 의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 2a는 면역세포(단핵구/대식세포) 이동에 대한 다양한 라미닌 아형(LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2b는 도 2a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 3은 LN421 처리에 의하여 단핵구/대식세포의 세포막에서 KRS가 증가하는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a는 LN421에 특이적인 단핵구/대식세포 이동에 있어서, KRS 발현 정도에 따른 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 4b는 도 4a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 5는 LN421의 처리에 의해 면역세포 세포막 영역에서 KRS의 수준이 높아졌던 것이, KRS의 세포막으로의 이동 저해 화합물(BC-KI-00053 화합물) 처리에 따라 현저히 낮아짐을 웨스턴블롯을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 6a는 KRS의 세포막으로의 이동 저해 화합물(BC-KI-00053 화합물) 처리에 따라 농도 의존적으로 단핵구/대식세포의 이동이 현저히 저해되는 것을 트랜스웰 세포이동 어세이로 확인한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 6b는 도 6a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 7a은 급성 염증성 반응(ear skin wound 모델)에서 BC-KI-00053 화합물 처리에 따른 단핵구, 대식세포 및 랑게르한스 세포의 침윤 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다(도면 상단부는 대조물질(vehicle) 투여군, 하단부는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군을 나타냄. 녹색으로 표시된 부분이 단핵구, 대식세포 및 랑게르한스 세포를 나타내며, 붉은색으로 표시된 부분은 CD31에 대하여 표지된 혈관을 나타냄. 흰색 원은 skin wound 위치를 나타냄).
도 7b는 도 7a의 형광 현미경 이미지에서 푸른색 원으로 표시된 skin wound 주변부위의 단핵구/대식세포 침윤정도를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 8a는 간 허혈-재관류 손상 모델 제작을 위한 Triad(bile duct, hepatic artery, hepatic vein) occlusion procedure를 도식화 한 것이다.
도 8b는 간 허혈-재관류 손상 모델에서 BC-KI-00053 화합물 처리에 따른 단핵구, 대식세포 및 쿠퍼 세포의 침윤 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다(도면 상단부는 대조물질(vehicle) 투여군, 하단부는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군을 나타냄. 녹색으로 표시된 부분이 단색구, 대식세포 및 쿠퍼 세포를 나타내며, 붉은색으로 표시된 부분은 CD31에 대하여 표지된 혈관을 나타냄).
도 8c는 도 8b의 형광 현미경 이미지에서 단핵구/대식세포 침윤정도를 허혈-재관류 손상 후 시점 별로 정량화하여 나타낸 것이다. 적색 막대는 대조물질(vehicle) 투여군, 녹색 막대는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군에서 각각 정량화한 결과이다.
도 9a는 CCl₄(사염화탄소)로 간섬유화 동물모델을 제작하고 여기에 BC-KI-00053 화합물의 치료 효과를 평가하는 실험에 대하여, 실험방법 및 일정을 도식화하여 나타내었다.
도 9b는 CCl₄(사염화탄소)에 의해 유도된 간 섬유화 동물모델에서 BC-KI-00053의 효과를 평가한 결과로서, 각 실험군에서 간 표면과 간 내부의 섬유화 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다(각 도면에서 상단부는 간 표면을 영상화한 것이며, 하단부는 간 내부를 영상화한 것임. 녹색으로 표시된 부분은 콜라겐, 붉은색으로 표시된 부분은 간세포를 나타냄).
도 10a는 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의한 우심실 수축기말 압력(right ventricular end-systolic pressure; RVESP) 변화를 나타낸다(MCT:monocrotaline 처리한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델, Tx25mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 25mg/kg 투여, Tx50mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 50mg/kg 투여).
도 10b는 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의한 좌심실 수축기말 압력(left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 변화를 나타낸다(MCT:monocrotaline 처리한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델 , Tx25mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 25mg/kg 투여, Tx50mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 50mg/kg 투여).
도 10c는 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 폐 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.

도 11a는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군의 기본 체중 및 실험기간동안의 체중변화를 나타낸다(괄호안의 숫자는 각 그룹에서 평균 데이터를 산출하는데 사용된 실험동물 수를 나타냄. 이하 동일).
도 11b는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 MAP 변화를 측정한 결과이다.
도 11c는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 단백뇨(뇨중 단백질 배설 정도) 정도 변화를 측정한 결과이다.
도 11d는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 혈장 크레아티닌 농도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11e는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 사구체 현미경 이미지(상단이미지)와 사구체경화증 정도를 평가한 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 11f는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 피질 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지)와 피질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 11g는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 수질 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지)와 수질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 11h는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 심장 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지, 우심실 삽입 지점)와 심장 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프).
도 11i는 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 신장 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
도 12a는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군의 기본 체중 및 실험기간동안의 체중변화를 나타낸다(괄호안의 숫자는 각 그룹에서 평균 데이터를 산출하는데 사용된 실험동물 수를 나타냄. 이하 동일).
도 12b는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압을 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 MAP 변화를 측정한 결과이다.
도 12c는 high salt(HS) 식이를 통해 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 단백뇨(뇨중 단백질 배설 정도) 정도 변화를 측정한 결과이다.
도 12d는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 혈장 크레아티닌 농도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 12e는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 사구체 현미경 이미지(상단이미지)와 사구체경화증 정도를 평가한 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 12f는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 피질 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지)와 피질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 12g는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 수질 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지)와 수질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프)(그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 12h는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군(control)과 BC-KI-00053 처리군(treatment)의 심장 섬유화에 대한 현미경 이미지(상단이미지, 우심실 삽입 지점)와 심장 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다(하단 그래프).
도 12i는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 신장 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
도 13은 알포트 증후군 동물모델에서 대조물질 또는 BC-KI-00053 화합물을 처리했을 때 신장에서 백혈구의 침윤 및 섬유화 정도 감소를 평가한 결과이다. 백혈구 침윤의 마커인 CD45는 녹색으로, 섬유화의 마커인 콜라겐 I은 붉은색으로 염색이 되었다. 각 군별로 2마리의 마우스 조직을 보여준다.
도 14a는 LN421에 특이적인 단핵구/대식세포 이동에 대한 anti-KRS 항체(일례로, N3 항체)의 이동 억제 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 14b는 상기 도 14a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정(정량)하여 그래프로 표시한 것이다.
도 14c는 LN421 처리에 의해 단핵구/대식세포의 세포막에서 증가된 KRS 수준이, anti-KRS 항체(일례로, N3 항체) 처리에 의하여 감소되는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 anti-KRS 항체(N3 항체)의 처리에 의하여, 세포막 영역의 KRS가 엔도사이토시스됨을 확인한 결과를 나타낸다. Alexa fluor 488 (Thermofisher) 형광 probe로 표지된 anti-KRS 항체와 대조군인 Mock IgG(Thermofisher)를 처리하고 시간에 따른 항체의 이동을 모니터링하였으며, 이때 엔도사이토시스 여부를 확인하기 위하여 lysosome 마커로서 Lysotracker(Thermofisher)를 사용하였다.
도 16은 anti-KRS 항체(N3 항체) 투여에 의한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델의 우심실 수축기말 압력(right ventricular end-systolic pressure; RVESP) 변화를 나타낸다(Mock IgG: 음성 대조군, Ab 1mpk: N3 항체 1mpk, Ab 10mpk : N3 항체 10mpk, sildenafil: 양성 대조군).
도 17은 anti-KRS 항체(N3 항체) 투여에 의한 폐동맥 고혈압(PAH) 모델의 좌심실 수축기말 압력(left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 변화를 나타낸다(Mock IgG: 음성 대조군, Ab 1mpk: N3 항체 1mpk, Ab 10mpk : N3 항체 10mpk, sildenafil: 양성 대조군).
도 18은 폐동맥 고혈압(PAH) 모델에서 anti-KRS 항체(N3 항체) 투여에 의해, 폐 조직 내 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
도 19는 급성 폐손상 마우스 모델의 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내에 증가된 총(total) 면역세포수가, anti-KRS 항체(N3 항체)의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 20은 급성 폐손상 마우스 모델의 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내에 특히 많이 증가되어있는 호중구(뉴트로필)이, anti-KRS 항체(N3 항체)의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 21a는 급성 폐손상 마우스 모델의 폐 조직 내에 증가된 대식세포(IM, CD11b+/F4/80+) 이동 및 침윤이, anti-KRS 항체(N3 항체)의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 FACS로 확인한 결과를 나타낸다.
도 21b는 상기 도 21a의 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 22는 급성 폐손상 마우스 모델의 폐 조직 내에 진행된 조직 섬유화가 anti-KRS 항체(N3 항체)의 처리에 의하여 억제됨을 보여주는 조직 이미지이다. 각 실험군 및 대조군의 조직은 Masson's trichrome 염색 처리된 후 현미경 관찰되었다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

면역세포 이동 및 침윤에 있어서, 라미닌 신호의 역할 확인

여러 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)들 중에서, 어떤 것이 면역세포, 대표적으로 단핵구/대식세포의 이동 및 침윤을 촉진하는지 확인하였다. 세포외 기질로서 콜라겐(collagen, Col), 파이브로넥틴(fibronectin, FN) 및 라미닌(laminin, LN)을 사용하여 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였으며, 구체적인 실험방법은 다음과 같다. Transwell(Corning, #3421-5mm)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅한 후 RAW 264.7 cell(1 x 10⁵cells/well)을 top chamber에 분주(seeding)하였다. Laminin(laminin mixture, Biolamina社), Fibronectin 또는 Collagen을 각각 10μg/ml씩 포함하는 Serum Free DMEM(500μl)을 bottom chamber에 넣어주었다. 24시간 뒤에 70% methanol을 30min 처리하여 고정(fix)한 후, 50% Hematoxylin으로 30 min동안 염색하였다. membrane의 위쪽에 존재하는 non-migrating 세포를 면봉으로 제거한 뒤, membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하고 정량하였다.

실험결과 도 1a 및 도 1b에서 보는 바와 같이, 여러가지 세포외 기질 중 라미닌이 가장 강하게 단핵구/대식세포의 이동을 촉진함을 확인하였다. 즉, 단핵구/대식세포의 이동(migration)은 ECM(extracellular matrix) 중 라미닌(LN) 신호에 가장 강하게 반응함을 확인하였다.

<실시예 2>

라미닌 아형(subtype)별 면역세포 이동 및 침윤 효과

면역세포 이동 및 침윤에 있어서, 라미닌 아형에 따른 효과를 평가하였다. 다양한 라미닌 아형 단백질(Biolamina로부터 구입)로서 LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521을 1μg/ml씩 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다. 상기 라미닌 아형들의 구체적 서열은 각 라미닌 아형을 이루고 있는 사슬에 따라 서열번호 4의α4 사슬, 서열번호 10의 α2 사슬, 서열번호 11의 α5 사슬, 서열번호 6의 β2사슬, 서열번호 12의 β1 사슬, 서열번호 8의 γ1 사슬을 참조로 한다.

실험결과 도 2a 및 도 2b에서 보는 바와 같이, 단핵구/대식세포는 라미닌 중에서도 α4β2γ1 아형 (LN421)에 특이적으로 반응하여 이동함을 확인하였다. 즉, 단핵구/대식세포의 이동은 라미닌 중에서도 LN421에 특이적임을 확인하였다.

<실시예 3>

면역세포에 라미닌 처리에 따른, 세포질 KRS의 세포막으로의 이동

100 파이 플레이트에 RAW 264.7 cell(2 x 10⁶cell)을 분주하고 18hr 동안 배양한 후, serum free-DMEM media에 LN421 1μg/ml 처리 후 0h, 12h, 24h에 harvest하였다. ProteoExtract　Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiotech, cat# 539790)를 사용하여, RAW 264.7 cell protein을 cytosol과 membrane fraction으로 분리하였다. 얻어진 단백질을 전기 영동한 후 PVDF membrane (Milipore)에 옮겨 3% skim milk로 blocking 하였다. 이후 웨스턴 블롯으로 KRS를 검출하였다. 구체적으로 KRS polyclonal antibody(rabbit, Neomics, Co. Ltd. #NMS-01-0005) 항체를 첨가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 항체를 제거하고, anti-rabbit 2차 항체(ThermoFisher Scientific, #31460)를 첨가하여 반응시켰다. 이차 항체를 반응시킨 후, 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다. Na+/K+ ATPase(Abcam, ab76020)와 tubulin(Santa cruz SC-5286)에 대한 항체를 각각 plasma membrane과 cytosol 마커 확인용으로 사용하였다.

도 3에서 보는 바와 같이 단핵구/대식세포에 LN421을 처리할 경우 세포질(cytosol) 영역에서 KRS 검출량이 일부 감소되는 것과 대비하여 세포막 영역에 KRS 검출량이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 단핵구/대식세포의 세포 내부에서 발현되어 일반적으로 세포질 영역에 존재하고 있는 KRS가 LN421처리에 의하여 세포막 영역으로 이동하는 것을 시사하며, 면역세포 막 영역에서 특이적으로 KRS가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것으로 사료되었다.

<실시예 4>

LN421 의존적 면역세포 이동 및 침윤에 있어서 KRS의 효과

LN421에 특이적인 면역세포(특히, 단핵구/대식세포) 이동에 있어서 KRS가 영향을 주는지 알아보기 위하여, KRS가 과발현되도록 형질전환된 대식 세포 및 KRS 발현이 억제되도록 형질전환된 대식 세포 각각에 LN421을 처리하고, 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다. 대조군으로는 KRS 유사 단백질인 leucyl-tRNA synthetase(LRS, 서열번호 3)를 사용하였다.

구체적으로, KRS 또는 LRS 과발현 대식세포는 다음과 같이 제작되었다: pCDNA3에 삽입된 KRS(서열번호 1)-Myc, LRS(서열번호 3)-Myc을 각각 Raw 264.7 cell에 Turbofect(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 트랜스펙션(48hrs)하였다. 음성대조군으로서 Ev(empty vector, pCDNA3)-Myc을 트랜스펙션한 세포를 제작하였다.

KRS 또는 LRS 발현억제 대식세포는 다음과 같이 제작되었다: Si-KRS(서열번호 13), Si-LRS(서열번호 20)를 각각 Raw 264.7 cell에 Lipofectamin(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 트랜스펙션(72hrs)하였다. 음성 대조군으로서 si-control(si-RNA duplex with medium GC content(Invitrogen, Cat No.12935-300))을 트랜스펙션한 세포를 제작하였다.

이렇게 제작된 형질전환세포들에서 각각 KRS 또는 LRS의 과발현이나 발현 억제가 제대로 수행되었는지는, 각각의 단백질에 대한 웨스턴블랏을 수행하여 확인되었다(데이터 미도시).

상기 형질전환된 각각의 대식세포에 대하여 Laminin 421을 1μg/ml 씩 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다.

실험결과 도 4a 및 도 4b에서 보는 바와 같이, KRS 과발현은 LN421 특이적인 단핵구/대식세포 이동을 효과적으로 증가시켰으며, 반대로 si-RNA를 활용한 KRS 발현 감소는 LN421 특이적인 단핵구/대식세포 이동을 효과적으로 감소시켰다. 이에 반하여 KRS 유사 단백질인 leucyl-tRNA synthetase(LRS) 발현 변화는 단핵구/대식세포 이동에 영향을 미치지 않았다. 이는 단핵구/대식세포의 LN421의존적 이동(migration)은 KRS 발현량에 강하게 영향 받는 것을 시사한다.

<실시예 5>

면역세포의 이동을 억제하는 화합물의 선별_KRS의 세포막으로의 이동 저해 화합물

상기 <실시예 3> 및 <실시예 4>의 결과로부터 단핵구/대식세포의 LN421 의존적 이동에 있어서 KRS의 발현량 뿐만아니라 KRS의 세포 내 행태가 중요하게 영향을 미치며, 특히 KRS가 세포막 쪽으로 이동하여 면역세포 막 영역에서 특이적으로 KRS가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것으로 사료되었다. 따라서 KRS의 이러한 병리 행태를 억제하는 것이 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환의 치료적 전략 중의 하나로 적용 가능함을 검증하고자 하였다. 한편, 정상적인 상태에서 KRS는 세포 내에서 단백질을 합성하는데 필요한 기관이다. 따라서 단순히 KRS의 양을 증가하거나 감소시키는 전략은 신체 정상기능에 대한 부작용에 대한 우려로 인하여 실질적인 치료전략으로서 부적절할 가능성이 크다. 이에 본 발명자들은 KRS의 다양한 측면에서의 활성, 세포 내 동태 및 발현에 영향을 주는 화합물을 스크리닝하여, 부작용 없이 단핵구/대식세포에 이동을 특이적으로 억제 가능한지 검토하였다.

특히, 본원에서 제공하는 스크리닝 방법을 이용하여, KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 화합물들을 발견하고, 이들의 면역세포 이동 관련 질환에 대한 치료 효과를 확인 및 검토하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.

먼저, 다양한 KRS 저해제 후보에 대하여 KRS의 세포막으로의 이동 억제 효과 보유 여부를 확인하기 위해서, 100 파이 플레이트에 RAW 264.7 cell(2 x 10⁶cell)을 분주하고 18시간동안 배양한 후, serum free-DMEM media에 laminin 421 1μg/ml을 처리하고, 다양한 KRS 저해제 후보 각각을 100nM 처리하여 12h 배양하였다. harvest 후에 ProteoExtract　Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiotech, cat# 539790)를 사용하여, RAW 264.7 cell protein을 cytosol fraction과 membrane fraction으로 분리하였다. 얻어진 단백질을 전기 영동한 후 PVDF membrane (Milipore) 에 옮겨 3% skim milk로 blocking 하였다. 이후 웨스턴 블롯으로 KRS를 검출하였으며, 구체적인 방법은 <실시예 3>과 동일하게 수행되었다. 각각 cytosol fraction과 membrane fraction에서의 KRS 양을 저해제 후보를 처리하기 전과 비교하여, 저해제 후보 처리 후 cytosol fraction에 상대적으로 membrane fraction에서 특이적으로 KRS 양이 감소된 경우에 상기 저해제 후보가 실제로 KRS 이동을 억제하는 것으로 잠정적으로 판단 가능하였다.

이렇게 KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 것으로 규명된 물질을 LN421을 처리한 대식세포에 처리하여, 트랜스웰 세포이동 어세이(transwell migration assay)를 수행하였다. 이를 통해 KRS의 세포막으로의 이동 저해가, LN421 특이적인 단핵구/대식세포의 이동 억제효과를 나타내는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, Transwell(Corning, #3421-5mm)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅한 후 RAW 264.7 cell(1 x 10⁵cells/well)을 top chamber에 분주(seeding)하였다. Laminin 421(LN421, Biolamina)을 1㎍/ml 포함하는 Serum Free DMEM 500μl을 bottom chamber에 넣어주었다. 그 후, Upper chamber에 DMSO, 또는 KRS 저해제 화합물 (in DMSO)을 여러 농도(각각 30nM, 100nM, 300nM, 1μM, 3μM)로 처리하였다. 24시간 뒤에 70% methanol을 30min 처리하여 고정(fix)한 후, 50% Hematoxylin으로 30 min동안 염색하였다. membrane의 위쪽에 존재하는 non-migrating 세포를 면봉으로 제거한 뒤, membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하고 정량하였다.

도 5 및 도 6은 본 발명에 따라 스크리닝된 화합물들 중, 대표적 일례로 BC-KI-00053 화합물(4-({(7-플루오로벤조[d]싸이아졸-2-일)[2-(4-메톡시페닐)에틸]아미노}메틸)벤조산; 화학식 1)을 이용한 실험결과를 나타낸다. 도 5에서 보는 바와 같이 LN421의 처리에 의해 세포막 영역에서 KRS의 수준이 높아졌던 것이, BC-KI-00053의 처리에 의하여 현저히 낮아짐을 확인하였다. 이는 라미닌(LN421)에 의해 단핵구/대식세포의 세포막으로 이동했던 KRS의 수준이 감소된 것을 뜻한다.

또한 도 6a 및 도 6b에서 보는 바와 같이, BC-KI-00053(KRS의 세포막으로의 이동저해 화합물)의 농도에 의존적으로 단핵구/대식세포의 이동이 현저히 저해되는 것이 확인되었다.

이하의, 면역세포 이동관련 질환에 대한 in vivo 실험에서는 상기 BC-KI-00053 화합물을 대표로하여 실험을 수행하였다.

<실시예 6>

in vivo 급성 염증성 반응에서, KRS의 세포막으로 이동 저해제가 단핵구/대식세포 침윤에 미치는 영향

<6-1> ear skin wound 모델

급성 염증성 반응에서, 단핵구의 침윤에 KRS의 세포막으로의 이동 저해제가 미치는 영향을 알아보기 위하여, CX3CR1-GFP 마우스(Stock no. #005582, Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA))를 이용한 ear skin wound 모델을 제작하였다. CX3R1-GFP 마우스에서 단핵구, 대식세포 및 랑게르한스 세포는 녹색으로 나타난다. 마우스에 vehicle 또는 BC-KI-00053(100 mg/kg, vehicle에 용해, 1일 1회 투여)를 영상화 2일전부터 총 4일간 경구로 투여하였다(D-2, D-1, D-0, D+1). Vehicle로는 Corn oil:Polyethylene glycol 400: Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49로 혼합한 것을 사용하였다. 31G 주사기로 귀 피부에 구멍을 내어(D-0 시점) 급성 염증반응을 유도하였다. Alexa Flour 555가 결합된 항-CD31 항체를 이용하여 혈관을 표지하였다(붉은색으로 확인 가능). 영상화 장비로는 공초점 현미경를 사용하였다.

도 7a 및 도 7b에서 보는 바와 같이, vehicle 처리된 대조군에서는 하얀색 원으로 표시한 상처 부위(귀 구멍 부위) 주변에 단핵구와 대식세포들이 모여들어 높은 수준으로 상당히 넓은 범위에 걸쳐 침윤된 것을 확인할 수 있었다(파란색 원). 이에 대하여, BC-KI-00053을 투여한 마우스에서는 단핵구와 대식세포 침윤 정도가 현저히 감소된 것으로 나타났다. 한편, 도 7a 및 도 7b에서 주요 환부(파란색 원)가 아닌 일반 조직 주위에 흩뿌려진 듯이 나타나는 녹색 점들은 resident macrophage인 Langerhans cell로서, 대조군(vehicle)과 BC-KI-00053 처리군에서 모두 Langerhans cell의 수에는 영향을 미치지 않았으므로, BC-KI-00053의 처리에 의해 migratory macrophage의 이동만이 저해된 것으로 판단되었다. 상기 결과로부터 급성염증반응으로 인한 면역세포들의 이동 및 침윤이 KRS의 세포막으로의 이동저해제(특히, BC-KI-00053) 투여에 의해 저해가 된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 상기 화합물이 전-염증성 사이토카인을 분비하는 면역세포들의 과도한 이동을 저해하여 염증성 질환에 대해 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.

<6-2> 간 허혈-재관류 손상 모델(Liver Ischemia-Reperfusion Injury Model)

허혈성 면역반응에서, 단핵구의 침윤에 KRS의 세포막으로의 이동 저해제가 미치는 영향을 알아보기 위하여, CX3CR1-GFP 마우스를 이용하여 간 허혈-재관류 손상 모델(Liver Ischemia-Reperfusion Injury Model)을 제작하였다. CX3CR1-GFP 마우스에서 단핵구, 대식세포 및 쿠퍼 세포(kupffer cell)는 녹색으로 나타난다. 마우스에 vehicle 또는 BC-KI-00053(100 mg/kg, vehicle에 용해, 1일 1회 투여)를 영상화 2일전부터 총 3일간 경구투여하였다(D-2, D-1, D-0). vehicle로는 Corn oil(Polyethylene glycol 400: Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49)을 사용하였다. 경구투여 3일째(D-0)에 6-0 봉합사(suture)를 사용하여, 도 8a에서 보는 바와 같이 Triad(bile duct, hepatic artery, hepatic vein) occlusion을 수행하였다. 급성염증 유도를 위해 Triad occlusion을 30분 동안 수행하였으며, 이때 봉합사의 양끝에는 3g의 Eppendorf tube를 매달아두었다. 봉합사를 제거하여 재관류(reperfusion) 직후(0h) 및 24h 후에 허혈성 염증부위를 관찰하였으며, 이때 반복 이미징을 위해 Alexa Flour 555가 결합된 항-CD31 항체를 이용하여 혈관을 표지하였다(붉은색으로 확인 가능). 영상화 장비로는 이광자 현미경을 사용하였다.

실험결과 도 8b 및 도 8c에서 보는 바와 같이, vehicle만 처리한 control mouse의 경우 재관류(reperfusion) 24시간 후에 많은 수의 단핵구/대식세포가 상처부위(폐색부위)로 모여들어(recruitment) 침윤된 것이 확인되었다. 반면 BC-KI-00053을 처리한 실험군에서는, 단핵구와 대식세포 침윤 정도가 현저히 감소된 것으로 나타났다. 도 8c 에서 적색 막대는 대조물질(vehicle) 투여군, 녹색 막대는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군에서 각각 정량화한 결과이다. 한편, 도 8b에서 재관류 0h에서 주로 보이는 일반 조직 주위에 흩뿌려진 듯이 나타나는 매우 밝은 녹색의 세포들은 resident macrophage인 kupffer cell로서, 재관류 24h 후에도 대조군(vehicle)과 BC-KI-00053 처리군에서 모두 kupffer cell의 수에는 영향을 미치지 않았으므로, BC-KI-00053의 처리에 의해 migratory macrophage의 이동만이 저해된 것으로 판단되었다. 즉, KRS 세포막 이동 저해제(특히, BC-KI-00053)는 허혈로 유도된 간으로 이동하는 단핵구/대식세포 침윤만을 저해하는 효과가 탁월하다.

<실시예 7>

In vivo 간 섬유화에 대한, KRS의 세포막으로의 이동 저해제 약리 효과 확인

Actin-DsRed(Stock no. #006051, Jackson Laboratory(Bar Harbor, USA)) 마우스에서 간세포(hepatocyte)는 붉은 색으로 나타난다. 상기 마우스의 간 섬유화를 유도하기 위하여 CCl₄(사염화탄소)를 콘 오일(corn oil)에 녹여 20%의 농도로 주 2회, 총 6주간, 복강내주사(Intraperitoneal injection)하였다. CCl₄ 투여 개시후 3주가 경과한 시점부터 대조물질(vehicle)과 BC-KI-00053(100 mg/kg)을 매일, 경구로, 3주간 투여하였다. Vehicle로는 Corn oil:Polyethylene glycol 400: Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49로 혼합한 것을 사용하였다. 동물군은 하기 표 1과 같이 구성하였다.

간 표면 및 내부(30 내지 50㎛ 깊이의 영역)의 섬유화 정도를 intravial imaging의 SHG (Second Harmonic Generation) 기법으로 검출하였다(Excitation : 780 nm, Detection : 390 nm).

구분		물질 처리 상태	실험 동물 마리 수
대조군	(1)	콘 오일 투여동물(정상동물) + 대조물질(vehicle) 투여	1
대조군	(2)	콘 오일 투여동물(정상동물) + BC-KI-00053 투여	1
실험군	(3)	CCl₄ 간 섬유화 동물모델 + 대조물질(vehicle) 투여	2
실험군	(4)	CCl₄ 간 섬유화 동물모델 + BC-KI-00053 투여	3

정상동물에 BC-KI-00053을 투여한 군(표 1에서 (2)번 동물)에서는 체중감소가 나타나지 않았고, 또한 간에서 다른 증상이 야기되지 않았다. 따라서 BC-KI-00053 화합물은 in vivo 상에서 무해한 것으로 사료되었다. 섬유화 동물모델에 대조물질(vehicle)을 투여한 군(표 1에서 (3)번 동물들)만 실험개시 후 4주째에 CCl₄의 독성으로 인해 조기에 폐사했다. 구체적으로 도 9a에서 보는 바와 같이 총 6주간의 실험기간 중 1마리는 24일째에, 다른 1마리는 32일째에 사망했으며, 이들은 현저한 체중 감소를 보였다. 상기 조기 폐사된 실험군은 이들이 폐사 되기 전에 각각 2주째 및 4주째에 수득한 간 표면 및 내부 섬유화 데이터를 이용하여, 모든 실험이 종료된 후의 데이터 비교에 이용하였다.

도 9b에서 보는 바와 같이, CCl₄를 2주 또는 4주간 투여한 결과 간의 표면(도 9b의 상단부(0㎛))에서 상당한 섬유화가 관찰이 되었으며, 특히 CCl₄를 4주간 투여한 군에서 간 표면 섬유화가 심화되었고 격벽(portal-portal septa)이 발견되어 심각한 섬유화가 상당히 진행된 것을 확인할 수 있었다. 또한 간 내부(도 9b의 하단부(30~48㎛))에서도 이와 유사한 섬유화 양상이 나타났으며, 또한 간세포(hepatocyte)가 심각한 수준으로 괴사(necrosis)된 것을 확인하였다. 반면 CCl₄를 6주간 투여하는 과정 중 BC-KI-00053을 3주간 처리한 동물군(표 1의 (4)번 동물군)에서는 간 표면 및 내부의의 섬유화가 CCl₄ 2주 투여군보다도 현저히 감소하여 거의 정상 개체와 유사한 양상의 capsular collagen이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 간세포 괴사도 현저히 감소된 것을 확인하였다. 도 9b에서 녹색은 콜라겐(섬유화)을, 붉은색은 간세포를 나타낸다. 이러한 실험결과는 본 발명에서 제공하는 KRS의 세포막으로의 이동 억제제(특히, BC-KI-00053)가 섬유화 억제능이 우수함을 나타낸다.

<실시예 8>

In vivo 폐동맥 고혈압(PAH)에 대한, KRS의 세포막으로의 이동 저해제 약리 효과 확인

[실험방법]

1. 폐동맥 고혈압(PAH) 모델 제작 및 시험물질 투여

6주령 암컷 SD rat(오리엔트바이오)에 PAH를 유도하기 위하여, 폐동맥의 선택적 손상을 통해 폐동맥고혈압을 유발하는 물질인 MCT(monocrotaline) 60 mg/kg를 피하주사하였다. 이후 4개의 군으로 나누고(각 군당 5마리로 실험), rat에 vehicle, sildenafil(25 mg/kg, 1일 1회 투여) 또는 BC-KI-00053(25 또는 50 mg/kg, vehicle에 용해, 1일 1회 투여)를 3주간 경구투여하였다. Vehicle로는 Corn oil:Polyethylene glycol 400: Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49로 혼합한 것을 사용하였다.

2. 혈류 및 혈압 측정

3주 후 rat를 isoflurane으로 마취하고, 동물용 초정밀공압측정시스템(MPVS Cardiovascular Pressure and Volume system, 모델명: MPVS Ultra, 제조사명: Millar Instruments)을 이용하여 혈류와 압력을 측정하였다. 우심실 수축기말 압력 (RVESP) 및 이완기말 압력, 좌심실 수축기말 압력 및 이완기말 압력은 전용 카테터(Mikro-Tipratpressurecatheter, 제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였다. 심박출량은 혈관주위(perivascular) 혈류 탐침자(TransonicFlowprobes, 제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였으며, 이에 대한 실험기법은 하기 문헌에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다:Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008;3(9):1422-34.

3. 면역조직화학염색(immunohistochemistry, IHC)

각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구/대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행하였다. 채취한 폐를 통상적인 과정에 따라 PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 수세, 탈수, 투명 과정을 거쳐 파라핀 침투시켜 포매하였다. Rat의 폐조직 파라핀 블록을 6μm 두께로 박절하고 슬라이드를 제작하였다. 그 후 다음과 같이 염색을 수행하였다. 먼저 5분간 3회 xylene 처리 후, 100% 에탄올에서 2분씩 2번, 95% 에탄올, 90% 에탄올, 70% 에탄올, DW 순으로 2분 간 처리하고 PBS로 5분간 washing하였다(2번). 0.3 % H₂O₂의 처리 후(10분), 샘플을 PBS로 5분 동안 2회 washing하였다. Microwave를 사용하여 pH 6.0의 0.01M citrate buffer에 담가 3분 30초 동안 가열 후, 10초 식히고 10초 가열을 10분간 반복(antigen retrieval) 후 상온에서 20분 cooling하였다. 이후 PBS-T(0.03% Triton-X)로 5분씩 3번 씻어냈다. 이후 30분간 4℃에서 blocking(2 % BSA & 2 % goat serum in PBS)하였다. 항-CD68 항체(1 : 200, Abcam, ab31630)를 4℃에서 overnight 처리하였다. PBS-T로 5분간 3회 세척한 후, polymer-HRP amti-mouse envision kit(DAKO)로 4℃에서 1 시간 처리하였다. PBS-T로 5분씩 3회 세척한 후, DAB substrate buffer 1ml 및 DAB chromogen 20ul 섞어 조직에 처리하고 10분 후에 발색되었을때 3차 D.W로 2분씩 두 번 씻어주었다. 염색 된 조직을 1 분간 Mayer's hematoxylin(Sigma)으로 처리 한 다음, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 순서로 각각 2분간 2회 처리하였다. 마지막으로 5분간 3회 xylene 처리한 후 Mounting solution을 이용하여 Mounting 처리하고, 광학현미경으로 관찰하였다.

[실험결과]

폐동맥 고혈압은 폐동맥이 좁아짐으로 인하여 우심실 압력이 상승하며, 결과적으로 우심실 부전을 초래한다. 또한 지속적인 고혈압으로 그 보상 기전이 파괴되면 우심실 비대에 이어 우심실 확장이 일어나게 된다. 이는 심실중격의 이동으로 인한 좌심실의 압박을 가져오게 되고 좌심실의 확장기말 용적 및 심박출량의 감소를 가져오게 된다(이우석 et al., 중증 폐동맥 고혈압 환자의 임상적 특징과 예후 예측 인자, Korean Circulation J 2007;37 :265-270). 결과적으로 폐동맥 고혈압은 주로 우심실과 관계되지만 좌심실의 기능과도 연관된다.

도 10a에서 보는 바와 같이, PAH 동물 모델에서 RVESP(우심실 수축기말 압력)가 증가되어 있는 것을 확인하였으며 이에 대하여 BC-KI-00053의 처리는 농도 의존적으로 유의하게 RVESP를 감소시켰다. 특히 BC-KI-00053 50 mg/kg 처리군에서의 RVESP 강하 효과는 기존 표준 치료제 중 하나인 sildenafil의 효과와 비슷한 수준인 것으로 나타났다.

또한 BC-KI-00053의 처리에 따른 좌심실 수축기말 압력(LVESP) 감소는 관찰되지 않았으며, 오히려 BC-KI-00053 50 mg/kg 투여 군에서는 도 10b에서 보는 바와 같이 LVESP가 증가되는 결과를 보였으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다. 이는 기존 폐동맥 고혈압의 치료제로 사용되고 있는 sildenafil의 경우 폐동맥의 확장뿐만 아니라, 전신동맥의 확장도 유발하여 전신 혈압(systemic blood pressure)을 저하시킬 위험이 있는 것과 대비되는 것이다. 즉, BC-KI-00053는 sildenafil과 비교하여 전신 동맥압(systemic artery pressure)에 미치는 영향이 낮은 경향성을 보이는 것을 확인하였으며, 이러한 효과는 임상현장에서 sildenafil 투여 시 저혈압 발생 위험을 염려하는 상황이 있음을 고려하였을 때, 치료약제의 유리한 특성이 될 것으로 사료되었다. 뿐만 아니라, 폐동맥 고혈압이 심한 경우 우심실 부전(right ventricular failure)이 발생함에 따라, 낮은 심박출량(cardiac output) 및 전신 저혈압(systemic hypotension)이 동반될 수 있다. 이에 대하여 BC-KI-00053을 더 높은 농도로 이용해 폐동맥 고혈압을 호전시키는 치료에 의해 심박출량(cardiac output)과 전신 혈압(systemic blood pressure)이 상승되는 효과를 발휘할 수 있을 수 있을 것으로 예상된다. 심박출량 및 전신 혈압이 저하되면 환자가 전신 쇠약감이나 어지러움을 호소할 수 있기 때문에, 심박출량과 전신 혈압의 호전을 통해 이러한 증상의 개선 또한 기대할 수 있다.

종합하여, 이로서 본 발명에서 제공하는 KRS의 세포막으로의 이동 저해제(특히 BC-KI-00053)의 투여는 PAH 치료 효과 및 증상 완화를 보일 뿐 아니라, 기존 치료 약물이 지니는 부작용의 발생 위험이 상대적으로 적을 수 있음을 확인하였다.

또한 도 10c에서 보는 바와 같이 각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과, 폐동맥고혈압(PAH) 마우스의 폐에는 단핵구/대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 KRS의 세포막으로의 이동 억제제(특히, BC-KI-00053)의 처리는 단핵구/대식세포의 폐 조직 침윤을 명확하게 감소시켰음을 확인하였으며, 이러한 효과는 기존에 폐동맥고혈압에 치료 효과가 있는 것으로 알려진 sildenafil 보다 현저히 우수함을 확인하였다.

<실시예 9>

in vivo 고혈압 유발성 단백뇨, 사구체 경화증, 신장 및 심장 섬유증에 대한, KRS의 세포막으로의 이동 저해제 약리 효과 확인

<9-1> 중복 고혈압(superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 , KRS의 세포막으로의 이동 저해제가 고혈압 신장손상, 심장손상 및 섬유화 발달에 미치는 영향

[실험방법]

실험은 9-12 주령의 수컷 FHH 래트(rat)를 이용하여 수행되었다. 이들 실험동물은 University of Mississippi Medical Center에서 제공받았고, American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)로부터 승인을 받았다. 모든 프로토콜(protocol)들은 Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Mississippi Medical Center의 승인을 받았다. 랫트들은 음식과 물이 자유급식되었으며, 이들 랫트들은 이유(weaning) 후에 0.4% NaCl(Dyets, Bethlehem, PA)을 함유하는 정제된 AIN-76 설치류 사료가 제공되었다. fawn-hooded hypertensive (FHH) rat은 사구체 과여과 및 단백뇨와 관련된 자발절 고혈압의 유전적 모델이다. 상기 래트에서 사구체 손상을 촉진시키기 위하여, 단일(한쪽)신장적출을 수행한 후 DOCA strip을 이식하였다.

구체적으로, FHH 래트를 isoflurane으로 마취시키고 telemetry transmitter(모델 TA11PAC40, Data Sciences International, St. Paul, MN)를 'Williams, J. M. et al. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol(2012)'에 기술된 대로 이식하였다. 간략히 설명하면, 수술은 2~3% isoflurane-O₂ 하에서 수행되었고, 장치의 카테터는 왼쪽 대퇴 동맥에 삽입되어 대동맥으로가는 상류로 향하게 되었다(guided). telemetry unit의 몸체를 왼쪽 다리의 측면 공간(lateral cavity)에 위치시키고 근육 조직으로 봉합했다. 그 후 피부를 봉합하였다. 감염을 예방하기 위해 동물에게 Baytril(10 mg/kg)을 제공하고 수술적 통증을 조절하기 위해 장시간 지속되는 진통제인 Rimadyl(5 mg/kg)을 제공하였다. 수술 후, 래트들은 12:12-h의 명암 사이클의 조용한 항온항습실(air-conditioned room) 환경인 개별 케이지에 수용되었고 수술로부터 완전히 회복하기까지 1 주일이 걸렸다. 그런 다음, 래트들을 metabolic cage에 수용하기 전에 기본 MAP(mean arterial blood pressure)와 단백뇨를 4시간(오전 10시 부터 오후 2시 까지)동안 측정하였다. 단백뇨는 Bradford 방법과 BSA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 표준으로 사용하여 측정되었다.

transmitter 삽입 1주일 후, 래트들은 Wang, X. et al. Am J Physiol Renal Physiol(2016)에 기재된 바와 같이 단일 신장 적출(uninephrectomize)되었다. 간략하게, 래트들을 2~3% isoflurane-O₂로 마취시키고, 무균 상태에서 오른쪽 옆구리를 절개했다. 우측 신장을 부드럽게 들어올리고, 신장 혈관과 요관 주위에 실을 단단히 묶었다. 신장 혈관과 요관의 말단 부분을 잘라내어 신장을 적출하였다. 절개된 부분을 연속적인 피하 스티치(stitch)로 봉합하고, 그 후 피부를 추가로 봉합하였다. 쥐의 우측 신장이 제거 된 후, DOCA 펠렛(200 mg, Innovative Research of America)을 목 부위에 피하 이식하였다.

단일 신장 적출 및 DOCA 이식 수술 후, 래트들은 3일 동안 회복시간을 가졌다. 그런 다음, 기존에 래트들에 증류수를 제공했던 것을, 1 % NaCl을 함유한 물로 전환하여 제공하고 무작위로 두 개의 실험군으로 나누었다: Group 1(n = 15)은 위장관 직접 투여(gavage)를 통해 BC-KI-00053(매일 25mg/kg)이 처리되었다; Group 2(n = 15)는 동일한 부피(하루 2.5ml/kg)의 vehicle(corn oil, polyethylene glycol 400, Tween 80 and methylcellulose)이 위장관 직접 투여되었다. 상기 실험군에서 혈압과 단백뇨를 3주 동안 매주 측정 하였다. 실험 종료 시점에서, 래트들을 isoflurane으로 마취시키고 혈액 샘플을 채취하여 크레아티닌 수치를 측정하였다. 그런 다음 래트들은 대동맥을 통해 0.9 % NaCl 50ml로 플러시되었고(flushed), 4 % 파라 포름 알데히드 20ml로 관류고정시켰다. 조직학적 평가를 위해 신장과 심장을 수집하였다.

3μm 두께로 제작된 파라핀 절편을 Masson's trichrome으로 염색하여 사구체 손상 및 신장 간질 섬유화(renal interstitial fibrosis)의 정도를 측정하였다. 이미지는 Nikon DS-Fi1 컬러 카메라(Nikon, Melville, NY) 및 NIS-Elements D 3.0 소프트웨어가 있는 Nikon Eclipse 55i 현미경을 사용하여 수득하였다. 사구체 손상의 정도는 30-40 사구체/절편에 대하여 실험자가 선입견 없이 0 내지 4+ 로 평가하였다. 0은 정상 사구체를 나타내며, 1+는 1-25% 손실을 나타내고, 2+는 26-50% 손실을 나타내며, 3+는 51-75 % 손실을 나타내고, 4+는 다발(tuft) 내의 모세혈관 손실이 75 % 이상인 것을 나타낸다. 피질 및 수질 섬유증은 파란색으로 염색 된 이미지의 백분율을 측정하기 위해 thresholding 후 NIS-Elements 자동 측정 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 또한 신장 조직에 대하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 면역조직화학염색(IHC)은 상기 실시예 8과 같은 방법으로 수행되었다.

통계: 각 데이터들은 mean±SEM으로 나타내었다. 각 그룹간의 비교는 two-tailed test에 의하여 분석되었다. P value<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

[실험결과]

Vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군(대조군 309.57 ± 4.14g, 실험군 304.7 ± 5.39 g, P> 0.05) 사이의 기본 체중에는 차이가 없었다. 연구 기간 동안 vehicle 또는 BC-KI-00053 처리한 래트들에서 체중은 약 10 % 감소했지만 두 그룹간에 통계적으로 차이는 없었다(도 11a).

대조군 및 실험군 FHH 래트에서 telemetry를 통해 측정된 MAP 데이터가 도 11b에 제시되어있다. 두 군 간의 기본 MAP에는 차이가 없었다(대조군 120.50 ± 0.91mmHg, 실험군 120.1 ± 0.62mmHg, P> 0.05). 단일신장절제술 후 DOCA 펠렛 삽입술과 함께 1% NaCl 급수로 전환 된 후에, 양 군에서 MAP가 급속히 증가 하였다. Vehicle 처리군은 BC-KI-00053 처리군에 비해 MAP가 더 큰 격차로 증가되었다. 처리 1주 후, BC-KI-00053 처리군의 MAP는 vehicle 처리군보다 통계적으로 낮았다(대조군 184.34 ± 2.46 mmHg, 실험군 174.4 ± 3.83 mmHg, P <0.05). 처리 2주 후에 vehicle 처리군에서의 MAP 결과는 첫번째 주의 결과와 비교하여 상대적으로 안정한 것으로 보였다. BC-KI-00053 투여군의 MAP는 일시적이지만 더욱 감소한 것으로 나타 났으며 두 군간에 유의 한 차이를 보였다(대조군 184.22 ± 4.21 mmHg, 실험군 168.8 ± 3.74 mmHg, P <0.05). 3 주 후, 두 그룹 간의 평균 MAP 차이가 더 벌어졌다(대조군 195.30 ± 3.68 mmHg, 실험군 176.9 ± 5.83 mmHg, P <0.05).

대조군 및 실험군 FHH 래트에서 단백뇨에 대한 데이터가 도 11c에 제시되어있다. 두 군 사이의 기본(baseline) 단백뇨 정도에는 차이가 없었다.(대조군 52.75 ± 6.99 mg/day, 실험군 51.0 ± 4.9 mg mg/day, P> 0.05). 단일신장절제술 후 DOCA 펠렛 삽입술과 함께 1 % NaCl 급수로 전환 된 후에, 양 군에서 단백뇨가 일정하게 증가하였다. 시험물질 처리 2 주 후에, BC-KI-00053 처리군에서의 단백뇨는 vehicle 처리군과 비교하여 통계적으로 낮아졌으며(대조군 472.99 ± 53.81 mg/day, 실험군 285.5 ± 47.48mg/day, P<0.05 ), 연구 종료까지 계속되었다(대조군 675.61±49.91 mg/day, 대조군 433.1±60.59 mg/day, P <0.05)

대조군 및 실험군 FHH 래트에서 혈장 크레아티닌 농도에 대한 데이터가 도 11d에 제시되어있다. Vehicle 처리군에서의 혈장 크레아티닌 농도는 BC-KI-00053 처리군보다 유의하게 높았다(대조군 0.65±0.04 mg/dL, 실험군 0.48±0.02 mg/dL, P <0.05).

FHH rat에 단일신장절제술 후 DOCA 펠렛 삽입술과 함께 1 % NaCl 급수로 전환한 것은, 형태학적으로 사구체 및 관상 손상에 상당한 영향을 주었다(도 11e, 도 11f, 도 11g). 평균 사구체 손상 점수(score)는 BC-KI-00053을 처리한 래트에서 손상 정도가 유의하게 감소되었음을 보여주었다(대조군 3.16 ± 0.04, 실험군 1.49 ± 0.05, P <0.05). 또한 vehicle 처리군에서 상당한 섬유화가 진행된 것과 달리 BC-KI-00053 처리군에서는 섬유화가 유의하게 현저히 감소되었다. 구체적으로 BC-KI-00053 처리된 래트에서 피질의 섬유화가 현저히 적은 것으로 나타났으며(대조군 19.46±1.18%, 실험군 5.79±0.48%, P <0.05), 신장 수질 섬유화 및 관상 손상에있어서 직혈관 모세혈관 손실이 현저히 감소된 것으로 나타났다(대조군 17.69±1.07%, 실험군 7.40±0.56%, P <0.05).

Sirius red로 염색한 절편시료(도 11h)에서 보는 바와 같이, 대조군 랫트는 특히 우심실 삽입 지점에서 현저한 심장 섬유증을 나타내었다. 이에 대하여 BC-KI-00053을 처리한 랫트에서는 심장 섬유화의 비율이 유의하게 감소되었다(대조군31.97±2.62%, 실험군 9.14±2.18%, P<0.05).

또한 대식세포 침윤 정도를 확인한 결과 도 11i에서 보는 바와 같이, 신장조직을 이용하여 단핵구/대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과, 대조군(vehicle 처리)의 신장조직에서는 단핵구/대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 KRS의 세포막으로의 이동 억제제(특히, BC-KI-00053) 처리는 단핵구/대식세포의 신장 조직 침윤을 현저하게 감소시킴을 확인하였다.

<9-2> Dahl SS(salt-sensitive) 래트에서 KRS의 세포막으로의 이동 저해제가 고혈압 신장손상, 심장손상 및 섬유화 발달에 미치는 영향

[실험방법]

9-12주령의 수컷 Dahl SS 래트를 이용하여 실험을 수행하였다. 이들 실험동물은 University of Mississippi Medical Center에서 제공받았고, American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)로부터 승인을 받았다. 모든 프로토콜(protocol)들은 Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Mississippi Medical Center의 승인을 받았다. 랫트들은 음식과 물이 자유급식되었으며, 이들 랫트들은 이유(weaning) 후에 0.4% NaCl(Dyets, Bethlehem, PA)을 함유하는 정제된 AIN-76 설치류 사료가 제공되었다. Dahl salt-sensitive (SS) rat는 high salt(HS) 식이를 하였을 때 심한 고혈압, 단백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 빠르게 유발하는 동물 모델이다.

Dahl SS 래트를 isoflurane으로 마취시키고 telemetry transmitters(모델 TA11PAC40, Data Sciences International, St. Paul, MN)를 전술한 바와 동일한 방법으로 무균적으로 이식하였다. 수술 후, 래트들은 12:12-h의 명암 사이클의 조용한 항온항습실(air-conditioned room) 환경인 개별 케이지에 수용되었고 수술로부터 완전히 회복하기까지 1 주일이 걸렸다. 그런 다음, 뇨단백 배설을 측정하기 위해 래트들을 metabolic cage에 수용하기 전에 기본 MAP(mean arterial blood pressure)를 측정하였다. 단백뇨는 Bradford 방법과 BSA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 표준으로 사용하여 측정되었다.

그리고나서 래트들을 무작위 두 개의 실험군으로 나누었다: Group 1(n = 15)은 위장관 직접 투여(gavage)를 통해 BC-KI-00053(매일 25mg/kg)이 처리되었다; Group 2(n = 15)는 동일한 부피(하루 2.5ml/kg)의 vehicle(corn oil, polyethylene glycol 400, Tween 80 and methylcellulose)이 위장관 직접투여되었다. 상기 물질처리와 동시에 사료를 8% NaCl을 포함하는 HS 사료(Dyets, Bethlehem, PA)로 바꾸었고, HS 사료 급여 후 7, 14 및 21일째에 혈압 및 단백뇨를 측정하였다. 실험 종료 시점에서, 래트들을 isoflurane으로 마취시키고 혈액 샘플을 채취하여 크레아티닌 수치를 측정하였다. 그런 다음 래트들은 대동맥을 통해 0.9 % NaCl 50ml로 플러시되었고(flushed), 4 % 파라포름알데히드 20ml로 관류고정시켰다. 조직학적 평가를 위해 신장과 심장을 수집하였다.

파라핀 절편 제작 및 이들로부터 사구체 손상 정도, 피질 및 수질 섬유증에 대한 평가는 전술한 바와 동일하게 수행되었다. 또한 신장 조직에 대하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 면역조직화학염색(IHC)은 상기 실시예 8과 같은 방법으로 수행되었다.

[실험결과]

Vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군 사이의 기본 체중에는 차이가 없었다(대조군 337.92±9.86 g, 실험군 350.13±9.173 g, P> 0.05). Vehicle 또는 BC-KI-00053 처리한 래트들에서 체중이 유지되거나 또는 다소 증가하였지만 전체 연구 기간동안 두 그룹간에 통계적으로 차이는 없었다(도 12a).

대조군 및 실험군 SS 래트에서 telemetry를 통해 측정된 MAP 데이터가 도 12b에 제시되어있다. 두 군 간의 기본 MAP에는 차이가 없었다 (대조군 122.13±2.31 mmHg, 실험군 123.45±2.36 mmHg, P> 0.05). Dahl SS 래트의 사료를 HS 사료로 바꾸었을 때 양 군에서 MAP가 지속적으로 증가하였다. Vehicle 처리군은 BC-KI-00053 처리군에 비해 MAP가 더 큰 격차로 증가되었다. 처리 2주 후, BC-KI-00053 처리군의 MAP가 vehicle 처리군보다 통계적으로 감소된 것을 확인하였고(대조군 178.51±3.71 mmHg, 실험군 164.43±3.00 mmHg, P <0.05), 이러한 효과는 실험이 종료될때까지 계속되었다(대조군 201.65±2.54 mmHg, 178.48±3.49 mmHg, P <0.05).

대조군 및 실험군 Dahl SS 래트에서 단백뇨에 대한 데이터가 도 12c에 제시되어있다. 두 군 사이의 기본(baseline) 단백뇨 정도에는 차이가 없었다(대조군 133.82±10.50 mg/day, 실험군 113.27±8.06 mg/day, P> 0.05). Dahl SS 래트의 사료를 HS 사료로 바꾸자 양 군에서 단백뇨가 급격하게 증가하였다. 특히 vehicle 처리군에서는 BC-KI-00053 처리군과 비교하여 단백뇨가 현저하게 높은 수준으로 증가된 것을 확인하였다. 시험물질 처리 1주일 후 BC-KI-00053 처리군에서의 단백뇨는 vehicle 처리군과 비교하여 통계적으로 낮아진 것을 확인하였다(대조군 469.08±24.82 mg/day, 실험군 302.86±29.76 mg/day, P<0.05). 시험물질 처리 2 주 후에도, BC-KI-00053 처리군과 vehicle 처리군에서의 단백뇨 수준이 여전히 명확히 차이났으며(대조군 675.61±59.67 mg/day, 실험군 510.64±42.42 mg/day, P<0.05), 연구 종료까지 계속되었다(대조군 752.97±57.80 mg/day, 대조군 524.55±44.70 mg/day, P <0.05)

대조군 및 실험군 SS 래트에서 혈장 크레아티닌 농도에 대한 데이터가 도 12d에 제시되어있다. Vehicle 처리군에서의 혈장 크레아티닌 농도는 BC-KI-00053 처리군보다 유의하게 높았다(대조군 0.60±0.02 mg/dL, 실험군 0.55±0.01 mg/dL, P <0.05).

HS diet를 제공한 것은, SS rat에 형태학적으로 사구체 및 관상 손상에 상당한 영향을 주었다(도 12e, 도 12f, 도 12g). 평균 사구체 손상 점수(score)는 BC-KI-00053을 처리한 래트에서 손상 정도가 유의하게 감소되었음을 보여주었다(대조군 2.82±0.05, 실험군 1.34±0.04, P <0.05). 또한 vehicle 처리군에서 상당한 섬유화가 진행된 것과 달리 BC-KI-00053 처리군에서는 섬유화가 유의하게 현저히 감소되었다. 구체적으로 BC-KI-00053 처리된 래트에서 피질의 섬유화가 현저히 적은 것으로 나타났으며(대조군 19.48±0.96%, 실험군 6.47±0.46%, P <0.05), 신장 수질 섬유화 및 관상 손상에 있어서 직혈관 모세혈관 손실이 현저히 감소된 것으로 나타났다(대조군 23.49±0.99%, 실험군 12.33±0.78%, P <0.05).

Sirius red로 염색한 절편시료(도 12h)에서 보는 바와 같이, 대조군 랫트는 특히 우심실 삽입 지점에서 현저한 심장 섬유증을 나타내었다. 이에 대하여 BC-KI-00053을 처리한 랫트에서는 심장 섬유화의 비율이 유의하게 감소되었다(대조군18.60±0.93%, 실험군 6.63±0.94%, P<0.05).

또한 대식세포 침윤 정도를 확인한 결과 도 12i에서 보는 바와 같이, 신장조직을 이용하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과, 대조군(vehicle 처리)의 신장조직에서는 단핵구/대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 KRS의 세포막으로의 이동 억제제(특히, BC-KI-00053) 처리는 단핵구/대식세포의 신장 조직 침윤을 현저하게 감소시킴을 확인하였다.

<실시예 10>

KRS의 세포막으로의 이동 저해제가, in vivo 알포트 증후군 동물모델에서 신장의 섬유화와 면역세포의 침윤에 미치는 영향

실험은 129 Sv/J 마우스(Boys town hospital)를 이용하여 진행하였다. 실험동물은 (i) 129 Sv/J 야생형 마우스 대조물질(0.5% 메틸셀룰로오스 현탁액) 투여군, (ii) 129 Sv/J 알포트 마우스(COL4A3 knockout mouse. Cosgrove D et al., Genes Dev. 1996 Dec 1;10(23):2981-92 참조하여 수득)에 대조물질(0.5% 메틸셀룰로오스 현탁액) 투여군 및 (iii) 129 Sv/J 알포트 마우스에 BC-KI-00053 투여군으로 구성하였다. 각각의 투여군은 두 마리로 이루어져 있다. BC-KI-00053 투여군의 경우 0.5% 메틸셀룰로오스 현탁액에 녹여 100 mg/kg의 농도로 경구 투여를 진행하였으며, 신장의 섬유화와 면역세포의 침윤을 평가하였다. 각각의 동물군은 3주령 때부터 매일 1회씩 총 4주간 대조물질 또는 약물을 처리하였다. 4주간의 약물처리 이후에, 신장 파라핀 절편을 콜라겐 I(섬유화의 마커) 및 CD45로 염색하여 백혈구의 침윤의 정도를 관찰하였다. 섬유화 및 침윤 확인은 전술한 실시예들에서 사용한 방법과 동일하게 수행되었다.

도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 알포트 마우스에 대조물질(vehicle, 0.5% 메틸셀룰로오스)을 투여한 군에서는 신장에서 백혈구의 침윤과 섬유화가 현저하게 진행된 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, BC-KI-00053을 처리한 알포트 마우스 신장에서는 정상(야생형 마우스-대조물질 투여군)수준으로 백혈구의 침윤이 줄어들고 섬유화도 감소한 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 11>

anti-KRS 항체의 면역세포 이동/침윤 제어 효과 확인

KRS에 특이적으로 결합하는 항체가, 면역세포 이동/침윤을 제어하는 효과가 있는지 확인하였다. 본 실험에서는 anti-KRS 항체로서 서열번호 21의 중쇄와 서열번호 23의 경쇄로 이루어지는 항체를 대표적으로 사용하였으며, 본 명세서에서 상기 항체를 N3 (단클론)항체로 칭하였다.

구체적인 실험방법은 다음과 같다. Transwell (Corning#3421-5mm)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅하고, 이후 RAW 264.7 cell (1 x 10⁵cells/well)을 top chamber에 분주(seeding)하였다. Laminin 421(1 μg/ml)을 포함한 Serum Free DMEM(500 μl)을 bottom chamber에 넣어주었다. anti-KRS 항체(N3 항체)를 top chamber에 100 nM 농도로 처리하였다. 24시간 뒤에 70% Methanol로 30 min동안 고정시킨 후, 50% Hematoxylin으로 30 min 동안 염색하였다. Membrane의 위쪽에 존재하는 비-이동(non-migrating) 세포를 면봉으로 제거한 뒤, membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. Membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하였고(도 14a), 수득된 이미지에서 세포수를 측정하여 그래프로 표시하였다(도 14b).

또한 RAW 264.7 cell에 Laminin 421(1 μg/ml) 및 anti-KRS 항체(100 nM)를 처리하여 24시간 배양하고 harvest하였으며, 이후 ProteoExtract　 subcellular proteom extraction kit(Calbiochem)를 사용하여 membrane과 cytosol fraction으로 나눠 샘플링 한 뒤 KRS에 대하여 western blot을 수행하였으며, 상기 western blot의 구체적인 방법은 실시예 3에서 기재한 바와 같다.

실험결과, anti-KRS 항체(N3 항체)가 특이적으로 LN421 의존적인 단핵구/대식세포 이동을 효과적으로 저해하는 것을 확인하였으며, 이를 도 14a 및 도 14b에서 보여준다. 또한 도 14c에서 보는 바와 같이, LN421 처리는 단핵구/대식세포 세포막의 KRS 수준을 증가시키며, anti-KRS 항체(N3 항체) 처리에 의해 세포막의 KRS 수준이 효과적으로 감소됨을 확인하였다. 이를 통해 anti-KRS 항체는 단핵구/대식세포와 같은 면역세포 이동이 문제되는 질환에 대한 새로운 치료제로서의 가능성을 확인하였다.

한편, 본 발명자들은 KRS가 세포질로부터 이동하여 세포막에 위치하면 세포막에 내재되기도 하여 일부 N-말단영역이 세포 외로 노출되는 것을 규명하였다( 통상 KRS(바람직하게, 서열번호 1) N-말단의 1 내지 72개의 아미노산 영역). 이에 anti-KRS 항체들 중에서도, KRS-N 말단에 결합할 수 있는 항체는 면역세포 이동 저해에 있어서 in vivo 상에서 더욱 현저한 이점을 가질 것으로 사료된다. 물론 상기 세포 외 노출 영역이 아닌 KRS의 다른 영역을 타겟하는 anti-KRS 항체라도, 이의 세포 내 침투를 위한 추가의 처리를 통해 KRS 활성 저해가 가능하므로 치료에 이용 가능함은 당업자에 자명하다.

대표적으로 상기 N3 항체는 KRS N-말단에 결합할 수 있는 항체로서, 상기 항체의 처리에 의하여 면역세포의 세포막 위치에서 특이적으로 KRS 수준이 감소되며(도 14c) 면역세포 이동 억제 효과가 나타남을 확인하였고(도 14a 및 도 14b), 도 15에서 보는 바와 같이 세포외로 노출된 KRS 영역(특히, N-말단 영역)에 항체가 결합하면 엔도사이토시스(endocytosis)가 일어나는 것을 확인하였다. 이는, KRS가 세포질에서 세포막으로 이동하는 것을 억제하는 방식 뿐만아니라 이미 세포막으로 이동해 있는 KRS를 KRS(특히, 세포 외부로 노출되어있는 N-말단 등)에 특이적으로 결합하는 물질(제제)을 이용하여 능동적으로 제거하는 방식으로 면역세포 이동을 저해 및 면역세포 이동 관련 질환을 치료할 수 있음을 시사한다.

<실시예 12>

in vivo 폐동맥 고혈압 모델에서 anti-KRS 항체의 치료 효능 확인

[실험방법]

1. 폐동맥 고혈압(PAH) 모델 제작 및 시험물질 투여

7주령 SD rat(오리엔트바이오)에 PAH를 유도하기 위하여 MCT(monocrotaline) 60 mpk를 피하주사하였다. 이후 4개의 군으로 나누고(각 군당 5마리로 실험), 각각 Mock human IgG(Thermo Fisher Scientific, 음성 대조군) 1mpk, anti-KRS 항체(N3 항체) 1mpk 또는 10mpk, sildenafil(양성 대조군) 25 mpk를 3주간 투여하였다. 모든 항체는 주 2회 iv 주사하였고 sildenafil은 매일 경구투여하였다.

2. 혈류 및 혈압 측정

3주 후 rat를 isoflurane으로 마취하고, 동물용 초정밀공압측정시스템(MPVS Cardiovascular Pressure and Volume system, 모델명: MPVS Ultra, 제조사명: Millar Instruments)을 이용하여 혈류와 압력을 측정하였다. 우심실 수축기압 (RVESP) 및 이완기압, 좌심실 수축기압 및 이완기압은 전용 카테터(Mikro-Tiprat pressure catheter,제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였다. 심박출량은 혈관주위(perivascular) 혈류 탐침자(TransonicFlowprobes,제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였으며, 이에 대한 실험기법은 하기 문헌에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다:Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008;3(9):1422-34.

3. 면역조직화학염색(immunohistochemistry, IHC)

채취한 폐를 통상적인 과정에 따라 PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 수세, 탈수, 투명 과정을 거쳐 파라핀 침투시켜 포매하였다. Rat의 폐조직 파라핀 블록을 6μm 두께로 박절하고 슬라이드를 제작하였다. 그 후 다음과 같이 염색을 수행하였다. 먼저 5분간 3회 xylene 처리 후, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 90 % 에탄올, 70 % 에탄올, DW 순으로 2분 간 처리하고 PBS로 5분간 washing하였다. 0.3 % H₂O₂의 처리 후, 샘플을 PBS로 5분 동안 2회 washing하였다. 0.01M citrate buffer에 담가 가열 후, PBS-T(0.03 % tween 20)로 세척하였다. 이후 30분간 실온에서 blocking(2 % BSA & 2 % goat serum in PBS)하였다. 항-CD68 항체(1 : 200, ED1 clone, Abcam)로 4℃에서 overnight 염색하였다. PBS-T로 5분간 3회 세척한 후, polymer-HRP amti-mouse envision kit(DAKO)로 4℃에서 1 시간 처리하였다. PBS-T로 3회 세척한 후, DAB substrate buffer 및 DAB chromogen 20을 처리하여 발색시켰다. 염색 된 조직을 1 분간 Mayer's hematoxylin(Sigma)으로 처리 한 다음, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 순서로 각각 2분간 2회 처리하였다. 마지막으로 5분간 3회 xylene 처리한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

[실험결과]

<12-1> 혈압 및 심박출량 변화 확인

면역세포의 침윤이 병리현상과 깊이 관계된 질환인 PAH 모델에 anti-KRS 항체(N3 단클론 항체)를 1mpk 또는 10 mpk로 3주간 처리한 뒤(iv, 주 2회), 우심실 수축기말 압력 (right ventricular end-systolic pressure; RVESP), 우심실 이완기말 압력 (right ventricular end-diastolic pressure; RVEDP), 좌심실 수축기말 압력 (left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 좌심실 이완기말 압력 압력 (left ventricular end-diastolic pressure; LVEDP) 및 심박출량 (cardiac output; CO)을 측정하였으며, 그 결과를 표 2에 나타낸다.

	MCT + Mock IgG (n = 4)	MCT + N3 Ab 1mpk (n = 5)	MCT + N3 Ab 10mpk (n = 5)	MCT + Sildenafil (n = 5)
RVESP (mmHg)	62.5 ± 5.7	45.0 ± 8.1	41.2 ± 7.7	48.4 ± 9.6
RVEDP (mmHg)	2.8 ± 1.5	1.4 ± 2.2	3.8 ± 1.3	2.6 ± 1.3
LVESP (mmHg)	81.5 ± 11.4	95.8 ± 4.8	93.4 ± 11.3	83.2 ± 4.7
LVEDP (mmHg)	1.0 ± 0.8	2.6 ± 1.9	4.6 ± 3.9	3.6 ± 2.3
CO (ml/min)	58 ± 4.7 (n = 4)	74.0 ± 10.9 (n = 5)	59.8 ± 12.9 (n = 5)	49.6 ± 17.7 (n = 4)

(MCT +mock IgG 처리군 1마리는 마취사. Sildenafil 처리군 1마리는 수술 중 사망하여 CO 측정하지 못함).

PAH 환자에서는 RVESP가 증가되며 이는 본 실험의 PAH 동물 모델에서도 확인되었다. 이에 대하여 도 16에서 보는 바와 같이, anti-KRS 항체(N3 항체)는 두 농도 모두에서 유의적으로 RVESP를 감소시켰으며, 특히 양성대조군 약물인 Sildenafil 보다 우수하게 RVESP를 감소시켰다.

또한 anti-KRS 항체(N3 항체) 투여에 따른 좌심실 수축기말 압력(LVESP) 감소는 관찰되지 않았으며, 오히려 본 발명의 항체를 투여한 군에서는 도 17에서 보는 바와 같이 LVESP가 유의하게 증가되는 결과를 보였다. 이는 기존 폐동맥 고혈압의 치료제로 사용되고 있는 Sildenafil의 경우 폐동맥의 확장뿐만 아니라, 전신동맥의 확장도 유발하여 전신 혈압(systemic blood pressure)을 저하시킬 위험이 있는 것과 대비되는 것이다. 즉, N3 항체는 Sildenafil과 비교하여 전신 동맥압(systemic artery pressure)에 미치는 영향이 낮은 경향성을 보이는 것을 확인하였으며, 이러한 효과는 임상현장에서 Sildenafil 투여 시 저혈압 발생 위험을 염려하는 상황이 있음을 고려하였을 때, 치료약제의 유리한 특성이 될 것으로 사료되었다. 뿐만아니라, 폐동맥고혈압이 심한 경우 수축기 우심실 부전(systolic RV failure)이 발생함에 따라, 낮은 심박출량(cardiac output) 및 전신 저혈압(systemic hypotension)이 동반될 수 있다. 이에 대하여 anti-KRS 항체(특히, N3 항체)에 의한 폐동맥고혈압을 호전시키는 치료에 의해 심박출량(cardiac output)과 전신 혈압(systemic blood pressure)이 상승되어 혈압이 정상화되는 효과가 예상된다.

종합하여, 이로서 anti-KRS 항체(N3 항체) 투여는 기존 치료 약물의 부작용 가능성을 개선하며, PAH 증상완화 및 치료 효과를 보임을 확인하였다.

<12-2> 심초음파 검사(Echocardiography)

우심실의 압력 과부하를 시사하는 D-shaped left ventricle 소견은 MCT 단독 투여 군(즉, 실험물질 비투여 PAH 모델)에서 3마리, MCT + Sildenafil 투여한 군의 3마리에서 각각 관찰되었으며, 치료항체(anti-KRS 항체)를 투여한 군에서는 관찰되지 않았다.

뿐만아니라 하기 표 3에서 보는 바와 같이, 각 군의 체중은 비슷한 정도로 증가하였으며 유의적 차이가 없었다. 즉, 치료항체 투여를 통한 비정상적 몸무게 감소를 비롯한 이상 징후를 시사하는 소견은 관찰되지 않았다.

	MCT + Mock IgG (n = 4)	MCT + Ab 1 mpk (n = 5)	MCT + Ab 10 mpk (n = 5)	MCT + Sildenafil (n = 5)
Absolute change (g)	101.4 ± 14.2	113.5 ± 14.6	104.1 ± 12.3	104.1 ± 26.4
Relative change (%)	48.8 ± 7.8	43.6 ± 5.2	40.7 ± 5.0	49.8 ± 10.5

<12-3> 단핵구/대식세포 이동 및 침윤 정도 확인

각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구/ 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행하였다. 실험 결과 도 18에서 보는 바와 같이, anti-KRS 항체(N3 항체) 처리군은 단핵구/대식세포의 폐 조직 침윤을 명확하게 감소시켰음을 확인하였으며, 이러한 효과는 sildenafil 보다 현저히 우수함을 확인하였다.

<실시예 13>

in vivo 급성 폐손상 모델에서 anti-KRS 항체 효능 확인

[실험방법]

1. LPS 유도 급성 폐손상 모델 제작 및 시험물질 투여

급성 폐손상 모델은 7주령 수컷 C57BL/6 마우스(두열바이오)에 LPS(Sigma) 2.5 mg/kg을 기관 내 주입하는 방식으로 제작되었다.

KRS 저해제의 급성 폐손상에 대한 효과를 알아보기 위하여, 먼저 C57BL/6 마우스에 N3 항체를 각각 1mg/kg 또는 10 mg/kg씩 IV 주입하고, 24시간 후 LPS 2.5 mg/kg을 기관내 주입하였다. 상기 LPS 주입 후 24시간 째에, 각 마우스들을 희생시켜 폐조직 및 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid)를 수집하고 분석하였다.

2. BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내 면역세포 수 측정

PBS로 폐를 세척하여 얻어진 BALF를 모아 800 x g에서 10 분간 4℃에서 원심하여 pellet을 수거하였다. 세포를 부유시킨 후 RBC lysis buffer(eBioscience cat.no.00-4333-57)를 이용해 red blood cell 제거하였다. 이후 PBS로 반응을 멈추고 2번 washing 한 뒤, 400 μl PBS에 부유시켜 hemocytometer로 세포수를 측정하고 Hema3 염색을 통해 neutrophil 수를 측정하였다.

3. 폐조직 내 면역세포에 대한 FACS

폐 조직을 수거하여 gentleMACS Octo Dissociator(MACS Miltenyi Biotec, Order no.130-095-937) 장비를 이용해 37℃에서 45 분간 rotation하여 조직을 으깼다. Cell strainer(40μm)를 이용해 filter한 뒤 1500 rpm에서 5분간 실온에서 원심분리를 수행하였다. Pellet을 수거하여 RBC lysis buffer(eBioscience cat.no.00-4333-57)를 이용해 red blood cell 제거하였다. 세포를 수거하여 FACS buffer (NaN3 1% 및 FBS 3%가 포함된 PBS)에 부유한 뒤 50μl를 tube에 담고, 동량의 항체 mxiture와 잘 혼합하여 4℃에서 1시간 동안 빛을 차단하여 염색하였다. 폐로 이동하는 IM (interstitial macrophage) 분석을 위해, FITC Rat Anti-CD11b (BD Pharmingen) 과 PE Rat Anti-Mouse F4/80 (BD Pharmingen) 항체를 사용하였다. FACS buffer를 이용하여 400 x g에서 5분간 2번 washing 한 뒤, Navios Flow Cytometer(Beckman) 장비로 분석하였다.

4. 폐 조직에 대한 masson's trichrome 염색

폐 조직을 통상적인 방법으로 파라핀 포매한 후, 박절하였다. 그 후 xylene을 이용하여 파라핀을 제거한 조직 슬라이드를 DW로 washing한 뒤, 56-60℃의 Bouin Fluid에 1시간 처리하였다. Weigert’s iron hematoxylin solution으로 10분 염색하였고, 그 후 washing하고, 다시 Biebrich scarlet-acid fuchsin solution으로 10-15분 염색 한 뒤 washing하였다. Phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution을 10-15 분간 처리하고, aniline blue solution으로 옮겨 5-10 분간 염색하였다. Washing 후 1% acetic acid solution에 2-5 분간 처리하였다. Washing 및 dehydration 이후 xylene 처리하여 mounting 하였다.

[실험결과]

<13-1> BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내 면역세포 이동 억제 효과 확인

도 19에서 보는 바와 같이 LPS 처리에 의하여 급성 폐손상을 유발한 마우스에서는 BALF 내 총(total) 면역세포수가 증가된 것을 확인하였으며, 이는 anti-KRS 항체(N3 항체) 처리에 의하여 농도의존적으로 감소하였다.

특히, 도 20에서 보는 바와 같이, LPS 처리로 급성 폐손상을 유발한 마우스에서 호중구(neutrophil)가 많이 증가된 것이 확인되었고, anti-KRS 항체(N3 항체) 처리는 이러한 호중구 수치를 감소시켰다. 이로서 anti-KRS 항체 처리에 의해 BALF 내 면역세포, 특히 neutrophil의 폐로의 침윤이 현저히 억제됨을 확인하였다.

<13-2> 폐 조직 내 면역세포 이동 억제 효과 확인

도 21a 및 도 21b는 급성 폐손상에 의하여 폐 조직으로 이동해온 대식세포를 FACS로 분석한 결과를 나타낸다. IM(interstitial macrophage)은 CD11b+/F4/80+ 세포로서, 폐에 상주하지는 않고 특정 상황에서 폐로 이동해 오는 대식세포(migrating macrophages)이다. LPS 처리에 의해 IM의 폐로의 침윤이 증가하였으나, anti-KRS 항체(N3 항체) 처리는 농도 의존적으로 IM의 폐로의 이동을 감소시켰다. 이를 통해 anti-KRS 항체 처리에 의해 대식세포/단핵구 등 면역세포의 폐 조직으로의 이동 및 침윤이 억제되는 것을 확인하였다.

상기 대식세포/단핵구 등 면역세포의 과도한 폐 조직으로의 이동 및 침윤은 조직 섬유화 질환에 있어서 중요한 병리 현상이다. 상기 급성 폐손상 모델에 대하여 폐조직을 Masson's trichrome 염색하여 관찰한 결과(도 22) 폐 조직 내의 섬유화가 상당히 진행된 것을 확인하였으며, 이에 대하여 anti-KRS 항체(N3 항체)의 처리는 이러한 섬유화를 억제한 것을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은, 면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 KRS 저해제(발현 또는 활성 저해제)를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, KRS의 면역 세포 내 수준 조절, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법, 및 KRS를 이용한 면역세포 이동에 의한 질환 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 본 발명에 따라 KRS를 이용하여 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이는 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용가능성이 높다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Therapeutic agent of immunocyte migration-related diseases and method for screening thereof <130> NP17-0050P <150> KR 10-2017-0076718 <151> 2017-06-16 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Lysyl-tRNA synthetase (KRS, Homo sapiens)_Genbank Accession No . NP_005539.1 <400> 1 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr Tyr Lys Ile Arg 65 70 75 80 Ser Gln Ala Ile His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu Asp Pro Tyr Pro 85 90 95 His Lys Phe His Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe Ile Gln Lys Tyr 100 105 110 Ser His Leu Gln Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile Thr Leu Lys Val 115 120 125 Ala Gly Arg Ile His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly Lys Leu Ile Phe 130 135 140 Tyr Asp Leu Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Met Ala Asn Ser 145 150 155 160 Arg Asn Tyr Lys Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile Asn Asn Lys Leu 165 170 175 Arg Arg Gly Asp Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro Gly Lys Thr Lys 180 185 190 Lys Gly Glu Leu Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Ser Pro 195 200 205 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aattgctcca 900 gaactctatc ataagatgct tgtggttggt ggcatcgacc gggtttatga aattggacgc 960 cagttccgga atgaggggat tgatttgacg cacaatcctg agttcaccac ctgtgagttc 1020 tacatggcct atgcagacta tcacgatctc atggaaatca cggagaagat ggtttcaggg 1080 atggtgaagc atattacagg cagttacaag gtcacctacc acccagatgg cccagagggc 1140 caagcctacg atgttgactt caccccaccc ttccggcgaa tcaacatggt agaagagctt 1200 gagaaagccc tggggatgaa gctgccagaa acgaacctct ttgaaactga agaaactcgc 1260 aaaattcttg atgatatctg tgtggcaaaa gctgttgaat gccctccacc tcggaccaca 1320 gccaggctcc ttgacaagct tgttggggag ttcctggaag tgacttgcat caatcctaca 1380 ttcatctgtg atcacccaca gataatgagc cctttggcta aatggcaccg ctctaaagag 1440 ggtctgactg agcgctttga gctgtttgtc atgaagaaag agatatgcaa tgcgtatact 1500 gagctgaatg atcccatgcg gcagcggcag ctttttgaag aacaggccaa ggccaaggct 1560 gcaggtgatg atgaggccat gttcatagat gaaaacttct gtactgccct ggaatatggg 1620 ctgcccccca cagctggctg gggcatgggc attgatcgag tcgccatgtt tctcacggac 1680 tccaacaaca tcaaggaagt acttctgttt cctgccatga aacccgaaga caagaaggag 1740 aatgtagcaa ccactgatac actggaaagc acaacagttg gcacttctgt ctag 1794 <210> 3 <211> 1176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LRS (Homo sapiens) <400> 3 Met Ala Glu Arg Lys Gly Thr Ala Lys Val Asp Phe Leu Lys Lys Ile 1 5 10 15 Glu Lys Glu Ile Gln Gln Lys Trp Asp Thr Glu Arg Val Phe Glu Val 20 25 30 Asn Ala Ser Asn Leu Glu Lys Gln Thr Ser Lys Gly Lys Tyr Phe Val 35 40 45 Thr Phe Pro Tyr Pro Tyr Met Asn Gly Arg Leu His Leu Gly His Thr 50 55 60 Phe Ser Leu Ser Lys Cys Glu Phe Ala Val Gly Tyr Gln Arg Leu Lys 65 70 75 80 Gly Lys Cys Cys Leu Phe Pro Phe Gly Leu His Cys Thr Gly Met Pro 85 90 95 Ile Lys Ala Cys Ala Asp Lys Leu Lys Arg Glu Ile Glu Leu Tyr Gly 100 105 110 Cys Pro Pro Asp Phe Pro Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Thr Ser 115 120 125 Val Lys Thr Glu Asp Ile Ile Ile Lys Asp Lys Ala Lys Gly Lys Lys 130 135 140 Ser Lys Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Ser Lys Tyr Gln Trp Gly Ile 145 150 155 160 Met Lys Ser Leu Gly Leu Ser Asp Glu Glu Ile Val Lys 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ctgggacctg 840 actgatgacc tgcggttagc agcgctctcc atcgaggaag gcaaatccgg ggtgctgagc 900 gtatcctctg gggccgccgc tcataggcac gtgaatgaaa tcaacgccac catctacctc 960 ctcaaaacaa aattgtcaga aagagaaaac caatacgccc taagaaagat acaaatcaac 1020 aatgctgaga acacgatgaa aagccttctg tctgacgtag aggaattagt tgaaaaggaa 1080 aatcaagcct ccagaaaagg acaacttgtt cagaaggaaa gcatggacac cattaaccac 1140 gcaagtcagc tggtagagca agcccatgat atgagggata aaatccaaga gatcaacaac 1200 aagatgctct attatgggga agagcatgaa cttagcccca aggaaatctc tgagaagctg 1260 gtgttggccc agaagatgct tgaagagatt agaagccgtc aaccattttt cacccaacgg 1320 gagctcgtgg atgaggaggc agatgaggct tacgaactac tgagccaggc tgagagctgg 1380 cagcggctgc acaatgagac ccgcactctg tttcctgtcg tcctggagca gctggatgac 1440 tacaatgcta agttgtcaga tctccaggaa gcacttgacc aggcccttaa ctatgtcagg 1500 gatgccgaag acatgaacag ggccacagca gccaggcagc gggaccatga gaaacaacag 1560 gaaagagtga gggaacaaat ggaagtggtg aacatgtctc tgagcacatc tgcggactct 1620 ctgacaacac ctcgtctaac tctttcagaa cttgatgata taataaagaa tgcgtcaggg 1680 atttatgcag aaatagatgg agccaaaagt gaactacaag taaaactatc taacctaagt 1740 aacctcagcc atgatttagt ccaagaagct attgaccatg cacaggacct tcaacaagaa 1800 gctaatgaat tgagcaggaa gttgcacagt tcagatatga acgggctggt acagaaggct 1860 ttggatgcat caaatgtcta tgaaaatatt gttaattatg ttagtgaagc caatgaaaca 1920 gcagaatttg ctttgaacac cactgaccga atttatgatg cggtgagtgg gattgatact 1980 caaatcattt accataaaga tgaaagtgag aacctcctca atcaagccag agaactgcaa 2040 gcaaaggcag agtctagcag tgatgaagca gtggctgaca ctagcaggcg tgtgggtgga 2100 gccctagcaa ggaaaagtgc ccttaaaacc agactcagtg atgccgttaa gcaactacaa 2160 gcagcagaga gaggggatgc ccagcagcgc ctggggcagt ctagactgat caccgaggaa 2220 gccaacagga cgacgatgga ggtgcagcag gccactgccc ccatggccaa caatctaacc 2280 aactggtcac agaatcttca acattttgac tcttctgctt acaacactgc agtgaactct 2340 gctagggatg cagtaagaaa tctgaccgag gttgtccctc agctcctgga tcagcttcgt 2400 acggttgagc agaagcgacc tgcaagcaac gtttctgcca gcatccagag gatccgagag 2460 ctcattgctc agaccagaag tgttgccagc aagatccaag tctccatgat gtttgatggc 2520 cagtcagctg tggaagtgca ctcgagaacc agtatggatg acttaaaggc cttcacgtct 2580 ctgagcctgt acatgaaacc ccctgtgaag cggccggaac tgaccgagac tgcagatcag 2640 tttatcctgt acctcggaag caaaaacgcc aaaaaagagt atatgggtct tgcaatcaaa 2700 aatgataatc tggtatacgt ctataatttg ggaactaaag atgtggagat tcccctggac 2760 tccaagcccg tcagttcctg gcctgcttac ttcagcattg tcaagattga aagggtggga 2820 aaacatggaa aggtgttttt aacagtcccg agtctaagta gcacagcaga ggaaaagttc 2880 attaaaaagg gggaattttc gggagatgac tctctgctgg acctggaccc tgaggacaca 2940 gtgttttatg ttggtggagt gccttccaac ttcaagctcc ctaccagctt aaacctgcct 3000 ggctttgttg gctgcctgga actggccact ttgaataatg atgtgatcag cttgtacaac 3060 tttaagcaca tctataatat ggacccctcc acatcagtgc catgtgcccg agataagctg 3120 gccttcactc agagtcgggc tgccagttac ttcttcgatg gctccggtta tgccgtggtg 3180 agagacatca caaggagagg gaaatttggt caggtgactc gctttgacat agaagttcga 3240 acaccagctg acaacggcct tattctcctg atggtcaatg gaagtatgtt tttcagactg 3300 gaaatgcgca atggttacct acatgtgttc tatgattttg gattcagcgg tggccctgtg 3360 catcttgaag atacgttaaa gaaagctcaa attaatgatg caaaatacca tgagatctca 3420 atcatttacc acaatgataa gaaaatgatc ttggtagttg acagaaggca tgtcaagagc 3480 atggataatg aaaagatgaa aatacctttt acagatatat acattggagg agctcctcca 3540 gaaatcttac aatccagggc cctcagagca caccttcccc tagatatcaa cttcagagga 3600 tgcatgaagg gcttccagtt ccaaaagaag gacttcaatt tactggagca gacagaaacc 3660 ctgggagttg gttatggatg cccagaagac tcacttatat ctcgcagagc atatttcaat 3720 ggacagagct tcattgcttc aattcagaaa atatctttct ttgatggctt tgaaggaggt 3780 tttaatttcc gaacattaca accaaatggg ttactattct attatgcttc agggtcagac 3840 gtgttctcca tctcactgga taatggtact gtcatcatgg atgtaaaggg aatcaaagtt 3900 cagtcagtag ataagcagta caatgatggg ctgtcccact tcgtcattag ctctgtctca 3960 cccacaagat atgaactgat agtagataaa agcagagttg ggagtaagaa tcctaccaaa 4020 gggaaaatag aacagacaca agcaagtgaa aagaagtttt acttcggtgg ctcaccaatc 4080 agtgctcagt atgctaattt cactggctgc ataagtaatg cctactttac cagggtggat 4140 agagatgtgg aggttgaaga tttccaacgg tatactgaaa aggtccacac ttctctttat 4200 gagtgtccca ttgagtcttc accattgttt ctcctccata aaaaaggaaa aaatttatcc 4260 aagcctaaag caagtcagaa taaaaaggga gggaaaagta aagatgcacc ttcatgggat 4320 cctgttgctc tgaaactccc agagcggaat actccaagaa actctcattg ccacctttcc 4380 aacagcccta gagcaataga gcacgcctat caatatggag gaacagccaa cagccgccaa 4440 gagtttgaac acttaaaagg agattttggt gccaaatctc agttttccat tcgtctgaga 4500 actcgttcct cccatggcat gatcttctat gtctcagatc aagaagagaa tgacttcatg 4560 actctatttt tggcccatgg ccgcttggtt tacatgttta atgttggtca caaaaaactg 4620 aagattagaa gccaggagaa atacaatgat ggcctgtggc atgatgtgat atttattcga 4680 gaaaggagca gtggccgact ggtaattgat ggtctccgag tcctagaaga aagtcttcct 4740 cctactgaag ctacctggaa aatcaagggt cccatttatt tgggaggtgt ggctcctgga 4800 aaggctgtga aaaatgttca gattaactcc atctacagtt ttagtggctg tctcagcaat 4860 ctccagctca atggggcctc catcacctct gcttctcaga cattcagtgt gaccccttgc 4920 tttgaaggcc ccatggaaac aggaacttac ttttcaacag aaggaggata cgtggttcta 4980 gatgaatctt tcaatattgg attgaagttt gaaattgcat ttgaagtccg tcccagaagc 5040 agttccggaa ccctggtcca cggccacagt gtcaatgggg agtacctaaa tgttcacatg 5100 aaaaatggac aggtcatagt gaaagtcaat aatggcatca gagatttttc cacctcagtt 5160 acacccaagc agagtctctg tgatggcaga tggcacagaa ttacagttat tagagattct 5220 aatgtggttc agttggatgt ggactctgaa gtgaaccatg tggttggacc cctgaatcca 5280 aaaccaattg atcacaggga gcctgtgttt gttggaggtg ttccagaatc tctactgaca 5340 ccacgcttgg cccccagcaa acccttcaca ggctgcatac gccactttgt gattgatgga 5400 cacccagtga gcttcagtaa agcagccctg gtcagcggcg ccgtaagcat caactcctgt 5460 ccagcagcct ga 5472 <210> 6 <211> 1798 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Laminin subunit beta-2 (Homo sapiens) <400> 6 Met Glu Leu Thr Ser Arg Glu Arg Gly Arg Gly Gln Pro Leu Pro Trp 1 5 10 15 Glu Leu Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ala Thr Leu Ala 20 25 30 Gln Ala Pro Ala Pro Asp Val Pro Gly Cys Ser Arg Gly Ser Cys Tyr 35 40 45 Pro Ala Thr Gly Asp Leu Leu Val Gly Arg Ala Asp Arg Leu Thr Ala 50 55 60 Ser Ser Thr Cys Gly Leu Asn Gly Pro Gln 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ggctgatcct gatagcattg aaatggtggc cacacgggtg 4620 ctagagctct ccatcccagc ttcagctgag cagatccagc acctggcggg tgcgattgca 4680 gagcgagtcc ggagcctggc agatgtggat gcgatcctgg cacgtactgt aggagatgtg 4740 cgtcgtgccg agcagctact gcaggatgca cggcgggcaa ggagctgggc tgaggatgag 4800 aaacagaagg cagagacagt acaggcagca ctggaggagg cccagcgggc acagggtatt 4860 gcccagggtg ccatccgggg ggcagtggct gacacacggg acacagagca gaccctgtac 4920 caggtacagg agaggatggc aggtgcagag cgggcactga gctctgcagg tgaaagggct 4980 cggcagttgg atgctctcct ggaggctctg aaattgaaac gggcaggaaa tagtctggca 5040 gcctctacag cagaagaaac ggcaggcagt gcccagggtc gtgcccagga ggctgagcag 5100 ctgctacgcg gtcctctggg tgatcagtac cagacggtga aggccctagc tgagcgcaag 5160 gcccaaggtg tgctggctgc acaggcaagg gcagaacaac tgcgggatga ggctcgggac 5220 ctgttgcaag ccgctcagga caagctgcag cggctacagg aattggaagg cacctatgag 5280 gaaaatgagc gggcactgga gagtaaggca gcccagttgg acgggttgga ggccaggatg 5340 cgcagcgtgc ttcaagccat caacttgcag gtgcagatct acaacacctg ccagtga 5397 <210> 8 <211> 1609 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Laminin subunit gamma-1 (Homo sapiens) <400> 8 Met Arg Gly Ser His Arg Ala Ala Pro Ala Leu Arg Pro Arg Gly Arg 1 5 10 15 Leu Trp Pro Val Leu Ala Val Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys 20 25 30 Ala Gln Ala Ala Met Asp Glu Cys Thr Asp Glu Gly Gly Arg Pro Gln 35 40 45 Arg Cys Met Pro Glu Phe Val Asn Ala Ala Phe Asn Val Thr Val Val 50 55 60 Ala Thr Asn Thr Cys Gly Thr Pro Pro Glu Glu Tyr Cys Val Gln Thr 65 70 75 80 Gly Val Thr Gly Val Thr Lys Ser Cys His Leu Cys Asp Ala Gly Gln 85 90 95 Pro His Leu Gln His Gly Ala Ala Phe Leu Thr Asp Tyr Asn Asn Gln 100 105 110 Ala Asp Thr Thr Trp Trp Gln Ser Gln Thr Met Leu Ala Gly Val Gln 115 120 125 Tyr Pro Ser Ser Ile Asn Leu Thr Leu His Leu Gly Lys Ala Phe Asp 130 135 140 Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe His Thr Ser Arg Pro Glu Ser Phe 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Arg Thr Arg Glu Asp Gly Pro Trp Ile Pro Tyr Gln 165 170 175 Tyr Tyr Ser Gly Ser Cys Glu Asn Thr Tyr Ser Lys Ala Asn Arg Gly 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cgccgtgatc tcagacagct actttcctcg gtacttcatt 1680 gctcctgcaa agttcttggg caagcaggtg ttgagttatg gtcagaacct ctccttctcc 1740 tttcgagtgg acaggcgaga tactcgcctc tctgcagaag accttgtgct tgagggagct 1800 ggcttaagag tatctgtacc cttgatcgct cagggcaatt cctatccaag tgagaccact 1860 gtgaagtatg tcttcaggct ccatgaagca acagattacc cttggaggcc tgctcttacc 1920 ccttttgaat ttcagaagct cctaaacaac ttgacctcta tcaagatacg tgggacatac 1980 agtgagagaa gtgctggata tttggatgat gtcaccctgg caagtgctcg tcctgggcct 2040 ggagtccctg caacttgggt ggagtcctgc acctgtcctg tgggatatgg agggcagttt 2100 tgtgagatgt gcctctcagg ttacagaaga gaaactccta atcttggacc atacagtcca 2160 tgtgtgcttt gcgcctgcaa tggacacagc gagacctgtg atcctgagac aggtgtttgt 2220 aactgcagag acaatacggc tggcccgcac tgtgagaagt gcagtgatgg gtactatgga 2280 gattcaactg caggcacctc ctccgattgc caaccctgtc cgtgtcctgg aggttcaagt 2340 tgtgctgttg ttcccaagac aaaggaggtg gtgtgcacca actgtcctac tggcaccact 2400 ggtaagagat gtgagctctg tgatgatggc tactttggag accccctggg tagaaacggc 2460 cctgtgagac tttgccgcct 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1065 1070 Trp Gln Leu Ala Ser Gly Thr Gly Cys Asp Pro Cys Asn Cys Asn Ala 1075 1080 1085 Ala His Ser Phe Gly Pro Ser Cys Asn Glu Phe Thr Gly Gln Cys Gln 1090 1095 1100 Cys Met Pro Gly Phe Gly Gly Arg Thr Cys Ser Glu Cys Gln Glu Leu 1105 1110 1115 1120 Phe Trp Gly Asp Pro Asp Val Glu Cys Arg Ala Cys Asp Cys Asp Pro 1125 1130 1135 Arg Gly Ile Glu Thr Pro Gln Cys Asp Gln Ser Thr Gly Gln Cys Val 1140 1145 1150 Cys Val Glu Gly Val Glu Gly Pro Arg Cys Asp Lys Cys Thr Arg Gly 1155 1160 1165 Tyr Ser Gly Val Phe Pro Asp Cys Thr Pro Cys His Gln Cys Phe Ala 1170 1175 1180 Leu Trp Asp Val Ile Ile Ala Glu Leu Thr Asn Arg Thr His Arg Phe 1185 1190 1195 1200 Leu Glu Lys Ala Lys Ala Leu Lys Ile Ser Gly Val Ile Gly Pro Tyr 1205 1210 1215 Arg Glu Thr Val Asp Ser Val Glu Arg Lys Val Ser Glu Ile Lys Asp 1220 1225 1230 Ile Leu Ala Gln Ser Pro Ala Ala Glu Pro Leu Lys Asn Ile Gly Asn 1235 1240 1245 Leu Phe Glu Glu Ala Glu Lys Leu Ile Lys Asp Val Thr Glu Met Met 1250 1255 1260 Ala Gln Val Glu Val Lys Leu Ser Asp Thr Thr Ser Gln Ser Asn Ser 1265 1270 1275 1280 Thr Ala Lys Glu Leu Asp Ser Leu Gln Thr Glu Ala Glu Ser Leu Asp 1285 1290 1295 Asn Thr Val Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Glu Phe Ile Lys Asn Ser 1300 1305 1310 Asp Ile Arg Gly Ala Leu Asp Ser Ile Thr Lys Tyr Phe Gln Met Ser 1315 1320 1325 Leu Glu Ala Glu Glu Arg Val Asn Ala Ser Thr Thr Glu Pro Asn Ser 1330 1335 1340 Thr Val Glu Gln Ser Ala Leu Met Arg Asp Arg Val Glu Asp Val Met 1345 1350 1355 1360 Met Glu Arg Glu Ser Gln Phe Lys Glu Lys Gln Glu Glu Gln Ala Arg 1365 1370 1375 Leu Leu Asp Glu Leu Ala Gly Lys Leu Gln Ser Leu Asp Leu Ser Ala 1380 1385 1390 Ala Ala Glu Met Thr Cys Gly Thr Pro Pro Gly Ala Ser Cys Ser Glu 1395 1400 1405 Thr Glu Cys Gly Gly Pro Asn Cys Arg Thr Asp Glu Gly Glu Arg Lys 1410 1415 1420 Cys Gly Gly Pro Gly Cys Gly Gly Leu Val Thr Val Ala His Asn Ala 1425 1430 1435 1440 Trp Gln Lys Ala Met Asp Leu Asp Gln Asp Val Leu Ser Ala Leu Ala 1445 1450 1455 Glu Val Glu Gln Leu Ser Lys Met Val Ser Glu Ala Lys Leu Arg Ala 1460 1465 1470 Asp Glu Ala Lys Gln Ser Ala Glu Asp Ile Leu Leu Lys Thr Asn Ala 1475 1480 1485 Thr Lys Glu Lys Met Asp Lys Ser Asn Glu Glu Leu Arg Asn Leu Ile 1490 1495 1500 Lys Gln Ile Arg Asn Phe Leu Thr Gln Asp Ser Ala Asp Leu Asp Ser 1505 1510 1515 1520 Ile Glu Ala Val Ala Asn Glu Val Leu Lys Met Glu Met Pro Ser Thr 1525 1530 1535 Pro Gln Gln Leu Gln Asn Leu Thr Glu Asp Ile Arg Glu Arg Val Glu 1540 1545 1550 Ser Leu Ser Gln Val Glu Val Ile Leu Gln His Ser Ala Ala Asp Ile 1555 1560 1565 Ala Arg Ala Glu Met Leu Leu Glu Glu Ala Lys Arg Ala Ser Lys Ser 1570 1575 1580 Ala Thr Asp Val Lys Val Thr Ala Asp Met Val Lys Glu Ala Leu Glu 1585 1590 1595 1600 Glu Ala Glu Lys Ala Gln Val Ala Ala Glu Lys Ala Ile Lys Gln Ala 1605 1610 1615 Asp Glu Asp Ile Gln Gly Thr Gln Asn Leu Leu Thr Ser Ile Glu Ser 1620 1625 1630 Glu Thr Ala Ala Ser Glu Glu Thr Leu Phe Asn Ala Ser Gln Arg Ile 1635 1640 1645 Ser Glu Leu Glu Arg Asn Val Glu Glu Leu Lys Arg Lys Ala Ala Gln 1650 1655 1660 Asn Ser Gly Glu Ala Glu Tyr Ile Glu Lys Val Val Tyr Thr Val Lys 1665 1670 1675 1680 Gln Ser Ala Glu Asp Val Lys Lys Thr Leu Asp Gly Glu Leu Asp Glu 1685 1690 1695 Lys Tyr Lys Lys Val Glu Asn Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Glu Ser 1700 1705 1710 Ala Asp Ala Arg Arg Lys Ala Glu Met Leu Gln Asn Glu Ala Lys Thr 1715 1720 1725 Leu Leu Ala Gln Ala Asn Ser Lys Leu Gln Leu Leu Lys Asp Leu Glu 1730 1735 1740 Arg Lys Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Tyr Leu Glu Asp Lys Ala Gln Glu 1745 1750 1755 1760 Leu Ala Arg Leu Glu Gly Glu Val Arg Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ser 1765 1770 1775 Gln Lys Val Ala Val Tyr Ser Thr Cys Leu 1780 1785 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of KRS <400> 13 agaaguuuuc aucuaugaac auggc 25 <210> 14 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of KRS <400> 14 aucucuuucu ucaugacaaa cagc 24 <210> 15 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of KRS <400> 15 uaucucuuuc uucaugacaa acagc 25 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of KRS <400> 16 gcuguuucuc acugagcucu u 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of KRS <400> 17 gaugcucagc ucacccuucu u 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of KRS <400> 18 gagguucguu ucuggcagcu u 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of KRS <400> 19 agugguugcu acauucuccu u 21 <210> 20 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequence of LRS <400> 20 ccuugcaugg aucaugauag acaaa 25 <210> 21 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of N3 IgG heavy chain <400> 21 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser 85 90 95 Ala Arg Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of N3 IgG heavy chain <400> 22 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttatg ataatggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagaatggcg 300 cttgatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagc ctccaccaag 360 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag aaccacaggt gtataccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320 tccctgtccc cgggtaaa 1338 <210> 23 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of N3 IgG light chain <400> 23 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 24 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of N3 IgG light chain <400> 24 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gataatagta atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct tcttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

Claims

세포막 위치 특이적 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase, KRS) 수준(level) 저해제; 또는 KRS의 세포막으로의 이동 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 면역세포 이동 관련 질환은
(i) 고혈압, 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화, 협심증, 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환, 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환;
(ii) 경피증(scleroderma), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 간 섬유증(hepatic fibrosis), 간경변증(liver cirrhosis), 신장 섬유증(kidney fibrosis), 사구체 경화증, 근섬유증(myofibrosis), 심장 섬유증, 간질성 섬유화증, 췌장 섬유화증, 비장 섬유화증, 종격막 섬유화증, 혈관 섬유화증, 피부 섬유화증, 눈 섬유화증, 황반 변성, 관절 섬유화증, 갑상선 섬유화증, 심내막심근 섬유화증, 복막 섬유화증, 복막후 섬유화증, 진행성 종괴성 섬유화증, 신원성 전신섬유화증, 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 유전성 섬유증, 감염성 섬유증, 자극성 섬유증, 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증, 외과수술의 섬유성 합병증, 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증, 당뇨성 섬유증, 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 섬유화 질환;
(iii) 염증성 장 질환, 피부염, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 기관지 천식, 비염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 신경염, 통풍, 척추염, 혈관염, 루게릭병, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 점액낭염, 건초염, 헤노흐-쉔라인 자반병, 다중심성 세망조직구종, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 베체트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 질환; 또는
(iv) 알포트 증후군(Alport syndrome)이며,
상기 저해제는, 세포막에 내재된 KRS mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, miRNA, siRNA, shRNA, 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme) 및 PNA(Peptide nucleic acid) 로 이루어진 군; 또는
KRS 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머, 항체, 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 조성물.
<화학식 1>

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제1항에 있어서, 상기 KRS 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 KRS mRNA는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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KRS(라이실 tRNA 합성효소)의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절, 또는 세포막으로의 이동 조절을 통해 사람을 제외한 동물의 면역세포의 이동을 조절하는 방법으로서,
상기 면역세포는 단핵구, 대식세포 및 백혈구로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것을 특징으로 하는 방법.
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제14항에 있어서, KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 감소시켜 면역세포 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 감소시키는 것은,
세포막 위치에 존재하는 KRS의 엔도사이토시스(endocytosis)를 촉진시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 감소시키는 것은,
KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
제14항에 있어서, KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 증가시켜 면역세포 이동을 촉진하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 증가시키는 것은,
KRS의 세포막으로의 이동을 촉진하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 KRS는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 면역세포에 라미닌 및 시험물질을 처리하고 세포막 위치 특이적 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동을 모니터링 하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 면역세포에서 세포막 위치 특이적 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동이 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 낮을 경우에 상기 시험물질을 면역세포 이동과 관련된 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법으로서,
상기 면역세포는 단핵구, 대식세포 및 백혈구로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것이며,
상기 면역세포 이동 관련 질환은
(i) 고혈압, 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화, 협심증, 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환, 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환;
(ii) 경피증(scleroderma), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 간 섬유증(hepatic fibrosis), 간경변증(liver cirrhosis), 신장 섬유증(kidney fibrosis), 사구체 경화증, 근섬유증(myofibrosis), 심장 섬유증, 간질성 섬유화증, 췌장 섬유화증, 비장 섬유화증, 종격막 섬유화증, 혈관 섬유화증, 피부 섬유화증, 눈 섬유화증, 황반 변성, 관절 섬유화증, 갑상선 섬유화증, 심내막심근 섬유화증, 복막 섬유화증, 복막후 섬유화증, 진행성 종괴성 섬유화증, 신원성 전신섬유화증, 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 유전성 섬유증, 감염성 섬유증, 자극성 섬유증, 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증, 외과수술의 섬유성 합병증, 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증, 당뇨성 섬유증, 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 섬유화 질환;
(iii) 염증성 장 질환, 피부염, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 기관지 천식, 비염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 신경염, 통풍, 척추염, 혈관염, 루게릭병, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 점액낭염, 건초염, 헤노흐-쉔라인 자반병, 다중심성 세망조직구종, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 베체트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 질환; 또는
(iv) 알포트 증후군(Alport syndrome)인 것을 특징으로 하는 방법.
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제24항에 있어서, 상기 라이실 tRNA 합성효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제24항에 있어서, 상기 라미닌은 라미닌 아형 α4β2γ1(LN421)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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제24항에 있어서, 상기 시험물질은 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질유사체, 천연추출물 및 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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