WO2018231025A9 - 면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법 Download PDF

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WO2018231025A9
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김건호
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for diseases caused by immune cell migration and a screening method thereof, and more particularly to a therapeutic agent for immune cell migration involving KRS (lysyl tRNA synthetase) inhibitor (expression or low activity release)
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases a method for regulating the immune cell level of KRS, a method for controlling the movement of immune cells through the regulation of the cell membrane location-specific level of KRS or the movement of KRS to the cell membrane, And a screening method of a therapeutic agent for diseases caused by immune cell migration.
  • AQPKwater channel aquaporin- (Hara ⁇ Chikuma M et al., Aquaporin-1 facilitates epithelial cell migration in kidney proximal tubule, J Am Soc Nephrol 2006 Jan; 17 (1): 39-45 ; Jiang Y, Aquaporin-1 activity of plasma membrane affects HT20 colon cancer cell migration, IUBMB Life 2009 Oct; 61 (10): 1001-9).
  • macrophage cells Teyteca D et al., Regulation of Macrophage Motility by the Water Channel Aquaporin-1: Crucial Role of M0 / M2 Phenotype Switch, PLoS One. 2015 Feb 26; 10 (2): e0117398).
  • cardiovascular disease is a disease that occurs in the heart and major arteries, including atherosclerosis and coronary artery disease (Ross R et al., 1999: 340 (2): 115-26 , Poli G et al., Redox Biol 2013; 1 (1): 125-30, Libby P et al., Circulation 2002; 5: 105 (9): 1135-43).
  • Atherosclerosis is an inflammatory disease caused by cholesterol, and is caused by atheroma composed of cholesterol deposited in the inner membrane of the artery and immune cells moving into the artery from the blood.
  • cholesterol is a site where inflammation of the oxide occurs, and the immune cells such as mononuclear cells migrate to form atheroma.
  • the inner surface of the blood vessel becomes tangled and the wall becomes thick, so that the diameter of the blood flowing inside becomes narrow and obstructs blood circulation.
  • the fibrous membrane surrounding the bacillus arose thrombosis occurs in the blood vessel, bleeding into the atheroma occurs, and the diameter of the blood vessel becomes suddenly narrowed or clogged.
  • CCL2 CCChemokine ligand 2, MCP-1
  • Pulmonary arterial hypertension is classified as Group 1 of the Pulmonary Hypertension (WHC) Clinical Classification System (ESC Guidelines, European Heart Journal 2015). Pulmonary arterial hypertension (PAH) is classified as respiratory distress, mean pulmonary artery pressure (mPAP> 25 ⁇ Hg) and right ventricular dysfunction are common clinical features.
  • pulmonary arterial hypertension is associated with various pre-existing factors such as hereditary, infectious and related diseases, it has been known that immune response from endothelial cell injury acts as a key pathological factor (Huertas et al., Circulation, 129: 1332 -1340, 2014). This phenomenon is known to be closely related to the pathology of immune cell infiltration and dysfunction.
  • inflammatory immune cells such as monocytes / macrophages, neutrophil leukocytes, eosinophils, and mast cells penetrate rapidly into the damaged area and become activated and secrete multiple cytokines, Cells and smooth muscle cells are activated to activate them into myoblast-like cells.
  • Myoblast-like cells produce and secrete a large amount of extracellular matrix proteins, ultimately resulting in a large accumulation of extracellular matrix proteins (Gurtner GC et al., Trends Cell Biol. 15: 599-607, 2005).
  • This pathological mechanism is one of the fundamental causes of the sclerotic fibrosis of tissues such as wound, skin, kidney, blood vessels, and lungs caused by skin wounds caused by wound, burns, and pressure ulcers.
  • chronic autoimmune diseases such as scleroderma, rheumatoid arthritis, Crohn 's disease Fibrosis is a major pathological feature in the disease, ulcerative colitis, myelofibrosis, and systemic lupus erythematosus.
  • myofibroblasts activated by MyoBrast-type cells in the wound-healing program are called myofibroblasts (myofibroblasts). Since myofibroblast is at the heart of all fibrosis-related disease pathologies, elimination of molecular or immunological mechanisms that induce the activity of myofibroblast is a key factor in the treatment of these diseases. It is well known that many innate immunity or adaptive immunity are important for the activation and differentiation of fibroblasts.
  • the platelet-derived growth factor (PDGF) associated with hemagglutination invokes other inflammatory opponent immune cells to the wound site and TGF- ⁇ I stimulates extracellular matrix synthesis from the local fibroblast .
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ I stimulates extracellular matrix synthesis from the local fibroblast .
  • factors related to the hemagglutination response have been reported to induce fibrosis even when they are deficient.
  • Targeting factors have been suggested to prevent the migration (and invasion) of the inverted cells, and attempts have been made to devise a therapeutic method for these diseases.
  • each of these limitations has been reported Therefore, in order to treat effective diseases, it is still an important task to find out what strategies to control the mediator in immune cell migration.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases, which comprises an inhibitor of lysyl tRNA synthetase (KRS) as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or preventing immune cell migration-related diseases, which comprises administering an effective amount of a composition comprising an inhibitor of lysyl tRNA synthetase (KRS) And to provide treatment methods.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an immunosuppressive agent, which comprises administering a KRS (lysyl tRNA synthetase)
  • the present invention provides a method for regulating the migration of immune cells through the regulation of cell membrane location-specific level of KRS or the regulation of migration of KRS to the cell membrane.
  • a further object of the present invention is to provide
  • (C) measuring immune cell migration-related diseases comprising the steps of: (A) treating the immune cells of step (B) with a test substance identified as having KRS inhibitory activity to inhibit immune cell migration; Thereby providing a screening method of a preventive or therapeutic agent.
  • a further object of the present invention is to provide
  • step (b) when the level of KRS at the cell membrane position or the migration of KRS to the cell membrane in the immune cell in the step (a) is lower than that of the control substance not treated with the test substance, And a method for screening for a preventive or therapeutic agent for diseases related to immune cell migration.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases comprising an inhibitor of lysyl tRNA synthetase (KRS) as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of a lysyl tRNA synthetase (KRS) inhibitor for preparing an agent for preventing or treating immune cell migration-related diseases.
  • the present invention provides a method for treating an immune cell, which comprises administering an effective amount of a composition comprising an inhibitor of lysyl tRNA synthetase (KRS) A method for preventing or treating movement-related diseases is provided.
  • the present invention provides a method for regulating the level of KRS (lysyl tRNA synthetase) in the immune cell, controlling the level of KRS specific cell membrane position, And the like.
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • step (C) measuring immune cell migration-related diseases comprising the steps of: (A) treating the immune cells of step (B) with a test substance identified as having KRS inhibitory activity to inhibit immune cell migration; And a screening method for a preventive or therapeutic agent.
  • the term "host cell” refers to a heterologous DNA introduced into a cell by any means (eg, electrophoretic method, calcium phosphatase precipitation method, microinjection method, transformation method, virus infection, etc.)
  • a prokaryotic or eukaryotic cell comprising a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the term regulation in the present invention is meant to include up-regulation or down-regulation. &Quot; Protein " refers to a polymer of amino acid residues, as commonly found in natural state proteins, when used interchangeably with " polypeptides ".
  • KRS protein means a polypeptide known as lysyl tRNA synthetase.
  • KRS is an enzyme that mediates aminoacylation reactions between amino acid lysine and tRNA.
  • the specific origin and sequence (amino acid sequence constitution) of KRS is not particularly limited as long as it is known in the art as a lysyltriene synthase.
  • the KRS of the present invention is derived from human Uio / sapiens NCBKGenbank) Accession no. NP_005539.1, etc., and NCBKGenbank derived from a mouse (worm).
  • sequence information may be referred to, but is not limited to: XP- 005004655.1 (guinea-pig: Cavia porcellus), XP- 021503253. Kgerbi 1, Men ones unguiculatus), XP_002711778.1 (r abb it, Oryctolagus cuniculus)
  • XP_09755768.1 (monkey, Macaca newest rina), XP_008984479.1 (marmoset, Callithrix jacchus), XP_019834275.1 (cow, Bos indicus), XP-511115.2 (chimpanzee, Pan troglodytes).
  • the KRS protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, more preferably the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession No. NP-005539.1). Also in the present invention, K S includes functional equivalents thereof.
  • the KRS protein preferably refers to an intracellular KRS or an inherent state of KRS in a cell membrane, which is distinguished from an extracellularly completely secreted KRS.
  • the intracellular KRS has two isoforms: cytoplasmic form (lysyl-tRNA synthetase, cytoplasmic) and mitochondrial form (lysyl-tRNA synthetase, mitochondrial).
  • KRS in the present invention is preferably a cytoplasmic form.
  • the functional equivalent means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the amino acid sequence (preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) constituting a known KRS protein. Homology < / RTI > (i. E. Identity).
  • Quot refers to a polypeptide exhibiting substantially the same physiological activity as the known KRS protein (preferably, a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1) that has become a womb.
  • '' substantially homogenous physiological activity '' refers to regulation of immune cell migration.
  • functional equivalents of KRS in the present invention may be those in which some of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 are the result of addition, substitution or deletion.
  • the substitution of the amino acid is preferably a conservative substitution. Examples of conservative substitutions of amino acids present in nature are as follows: (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (lie, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) (Asp, Glu), basic amino acids (Hi s, Lys. Arg, Gin, Asn) and sulfur containing amino acids (Cys, Met).
  • the functional equivalents of KRS also include variants in which a portion of the amino acid is deleted on the amino acid sequence of the KRS protein.
  • deletion or substitution of the amino acid is preferably located in a region that is not directly related to the physiological activity of KRS.
  • deletion of the amino acid is preferably located in a portion not directly involved in the physiological activity of KRS.
  • variants in which several amino acids have been added at both ends or sequences of the amino acid sequence of KRS are also included within the scope of the functional equivalents of the present invention.
  • sequence homology and homology refer to the alignment of candidate sequences with the original sequence (preferably SEQ ID NO: 1 for amino acid sequence or SEQ ID NO: 2 for nucleic acid sequence) and introducing gaps (Amino acid residues or bases) of the candidate sequence to the original sequence. If necessary, conservative substitutions as part of sequence homology are not considered to obtain maximum percent sequence homology. Also, in the case of protein sequence homology or homology judgments, the N-terminus, C-terminus or internal stretch, deletion or insertion of a KRS amino acid sequence is not interpreted as a sequence that affects homology or homology. In addition, the homology may be determined by standard methods used to compare similar portions of the amino acid sequences of the two polypeptides.
  • a computer program such as BLAST or FASTA aligns two polypeptides to optimally match each amino acid (along the full length sequence of one or two sequences or along the predicted portion of one or two sequences).
  • the program may include a PAM250C standard scoring matrix that provides a diapted opening penalty and a default penalty penalty and can be used in conjunction with a computer program; , In Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978).
  • percentage homogeneity can be calculated as: Multiply the total number of identi cal matches by 100 and then multiply the length of the longer sequence in the matched span by the number of gaps introduced into the longer sequence to align the two sequences .
  • laminin &quot in the present invention is an extracellular matrix protein having an isoform (subtype) in which the composition of the subunit chain is different.
  • laminin is a combination of five alpha chains, four beta chains and three heterotrimers of? Chains, and has about 15 kinds of isoprene.
  • the names of the laminin are determined by combining the respective numbers of the? chain (? to? 5), the? chain (? 1 to? 4) and the? chain (?
  • laminin by a combination of ⁇ , ⁇ , ⁇ , and chain is referred to as LN111,
  • laminin by combination of one chain and chain is called LN511, and laminin by combination of? 5 chain,? 2 chain, and chain is called LN521.
  • laminin may mean a single component of one laminin subtype, or may refer to a laminated laminin complex in which two or more laminin subtypes are mixed.
  • laminin for example, laminin derived from a mammal can be used.
  • the mammal include, for example, a mouse, a rat, a guinea pig, a hamster stork, a cat, a dog lamb, a pig, , Monkeys, and humans.
  • human laminin can be used.
  • isoforms known in human laminin there are 15 types of isoforms known in human laminin, and desirably, the laminin isoform of the present invention may be in the form containing? 4, more specifically LN421.
  • LN421 protein refers to a polypeptide known as a laminin subtype 4 [beta] 2 [gamma] 1, and if it is known in the art as LN421, its specific origin and sequence (amino acid sequence composition) are not particularly limited.
  • The? 4 chain may be one comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
  • the 2 chain may contain the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and the chain may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: More preferably, in the LN421, the? 4 chain may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the? 2 chain may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and the chain may be represented by SEQ ID NO: ≪ / RTI >
  • the LN421 in the present invention also includes functional equivalents thereof.
  • functional equivalents thereof reference is made to the functional equivalents of KRS described above, wherein "substantially homogenous physiological activity" means monocytes, macrophages or neutrophils, etc. (Selective) migration of immune cells.
  • the KRS protein or the laminin protein can be extracted from a natural source or can be prepared by a genetic engineering method.
  • a nucleic acid encoding the KRS or its functional equivalent e.g., SEQ ID NO: 2 (Genbank Accession No. D32053)
  • SEQ ID NO: 2 Genbank Accession No. D32053
  • nucleic acids encoding such laminin or functional equivalents thereof e.g., SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 according to conventional methods.
  • the nucleic acid can be constructed by PCR amplification using an appropriate primer.
  • DNA sequences can be synthesized by standard methods known in the art, for example, using an automated DNA synthesizer (sold by Biosearch or Applied Biosystems).
  • the constructed nucleic acid is operatively linked thereto and inserted into a vector containing one or more expression control sequences (e.g., promoters, enhancers, etc.) that control the expression of the nucleic acid,
  • the host cells are transformed with recombinant expression vectors. Thereafter, the resulting transformant is cultured under conditions and conditions suitable for expression of the nucleic acid.
  • polypeptide (protein) expressed from the nucleic acid may be used together with the cell without separate separation and recovery from the cell according to the use of the inventions provided herein, or may be obtained from the culture by the nucleic acid May require a process to recover the expressed, substantially pure polypeptide. The recovery can be carried out using methods known in the art (for example, chromatography).
  • substantially pure polypeptide as used herein is meant that the polypeptide according to the invention is substantially free of any other proteins derived from the host cell. Genetic engineering methods for the synthesis of polypeptides of the present invention can be found in the following references: Maniatis et al. , Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook et al.
  • polypeptides of the present invention can be prepared by chemical synthesis known in the art (Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles,. H. Freeman and Co., NY, 1983). Representative methods include, but are not limited to, liquid or solid phase synthesis, fractional crystallization, F-MOC or T-BOC chemistry (see Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds. CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
  • nucleic acid refers to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide in the form of a single strand or double strand.
  • the term " polynucleotide encoding KRS " in the present invention includes, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a sequence having at least 70% sequence identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: (Nucleic acid) sequence encoding an amino acid sequence having homology.
  • the nucleic acid includes all DNA, cDNA and RNA sequences.
  • the polynucleotide may have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 70% or more homology thereto, or may have a nucleotide sequence complementary thereto. And preferably comprises the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and most preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the nucleic acid may be isolated from nature or may be prepared by genetic engineering methods as described above.
  • &quot polynucleotide encoding laminin " includes, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 or a sequence homology of at least 70% May have a base sequence encoding an amino acid sequence, and may have a base sequence complementary to the base (nucleic acid) sequence.
  • the nucleic acid includes both DNA, cDNA, and RNA sequences. Preferably, it may contain the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9, and most preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: Sequence.
  • nucleic acid can be isolated from nature or can be prepared by genetic engineering methods as described above All.
  • analog refers to a substance which is structurally similar to a reference molecule but whose specific substituents of the reference substance are replaced by substitution, thereby altering the target or control method. Compared to materials, analogs can have the same or similar or improved usability as can be expected by those skilled in the art
  • homologues refers to a protein or protein sequence which is naturally or artificially derived from a common ancestral protein or protein sequence .
  • nucleic acid and / or nucleic acid sequences are homologous when they are derived naturally or artificially from a common ancestral nucleic acid or nucleic acid sequence.
  • contact ing refers to the normal meaning of the term " contact ing, " which refers to the ability to combine two or more agents (eg, two polypeptides) Cells).
  • Contact may occur in vitro.
  • two or more agents may be combined in a test tube or other container, or the test agent may be combined with the cell or cell lysate and the test agent.
  • Contact may also occur in cells or in situ.
  • two polypeptides are contacted in a cell or cell lysate by co-expressing the recombinant polynucleotide encoding the two polypeptides in the cell.
  • the term 'migration of a protein (KRS) into a cell membrane' means that an endogenous protein of a cell (a protein made in the cell, for example, present in the cytoplasm) To the cytoplasm in the direction of intracellular (intracellular).
  • the KRS may be completely intracellular, or it may be interposed between the cell membranes to partially (preferably N in KRS) term portion) may be exposed to the outside of the cell, but in any case it may be desirable to preclude the protein from being completely isolated from the resulting cell. That is, in the present invention, the migration to the cell membrane is distinguished from that in which proteins completely isolated and secreted from certain cells interact with other cells or extracellular tissues, unless otherwise indicated.
  • the term 'cell membrane position' includes both the cell membrane itself and the vicinity (near) which is considered to be substantially close to the cell membrane and substantially interacting with the cell membrane.
  • the term "agent” or “test agent 1 " refers to any substance, molecule, element, compound, But are not limited to, proteins, polytetides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, etc. Also included are natural products, , A synthetic compound or a chemical compound, or a combination of two or more substances, unless otherwise specified, the agents, substances and compounds may be used interchangeably.
  • test agent which can be screened by the screening method of the present invention, includes a peptide, an antibody, a beta, a peptide, It is also known as beta-turn mimetics, polysaccharides, phospholipids, hormones, prostaglandins, steroids, aromatics, heterocyclic compounds, benzodiazepines, and nigomeric N-substituted glycines glycines, oligocarbamates, saccharides, fatty acids, purines, pyrimidines or derivatives, structural analogs or combinations thereof.
  • test agents may be synthetic, and other tests
  • the formulation may be a natural substance.
  • the test agent may be a synthetic or natural compound library. Can be obtained from a wide variety of sources.
  • Combinatorial libraries can be produced with a variety of compounds that can be synthesized step-by-step.
  • Compounds of multiple combinatorial libraries can be prepared by the methods of encoded synthetic libraries (ESL) (WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 and WO 95/30642).
  • Peptide libraries can be prepared by the phage display method (WO91 / 18980). Libraries of natural compounds in the form of bacterial, fungal, plant and animal extracts can be obtained from commercial sources or collected in the field.
  • test agent may be a naturally occurring protein or a fragment thereof. Such test agents can be obtained from natural sources, such as cell or tissue lysates. Libraries of polypeptide preparations can be obtained, for example, by conventional methods or from commercially available cDNA libraries.
  • the test agent may be a peptide, for example, a peptide having about 5-30 amino acids, preferably about 5-20 amino acids, more preferably about 7-15 amino acids.
  • the peptide may be a naturally occurring protein, a random peptide or a cleavage of a " biased " random peptide.
  • the test agent may also be " nucleic acid ".
  • the nucleic acid test agent may be a naturally occurring nucleic acid, a random nucleic acid, or a " biased " random nucleic acid.
  • cuts of prokaryotic or eukaryotic genomes can be used similar to those described above.
  • the test agent may also be a small molecule (e.g., a molecule having a molecular weight of about 1,000 or less).
  • a high throughput assay can preferably be applied to the method for screening the modulating agent of small molecules. Many assays are useful in the above screening (Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 2409-2414, 1998; Weller, Mol.
  • test agents screened in the methods of the invention can be prepared based on structural studies of KRS full length proteins or fragments thereof (fragment polypeptides) or analogs. This structural study makes it possible to identify test agents that are likely to bind to KRS.
  • the three-dimensional structure of KRS can be studied in several ways, for example, crystal structure and molecular modeling.
  • siRNA, siRNA or shRNA refers to a nucleic acid molecule which binds to niRNA transcribed from a target gene to mediate RNA interference or gene silencing, thereby inhibiting the detoxification of the mRNA. Since the siRNA or shRNA can inhibit the expression of the target gene at the detoxification level, it can be used for efficient gene knockdown or gene therapy, and for the purpose of the present invention, it can be used to suppress the expression of KRS have.
  • 'siRNA' is a sequence consisting of a sense sequence of 15 to 30 mers selected in the nucleotide sequence of the mRNA transcribed from the gene encoding the target protein and an antisense sequence complementarily binding to the sense strand .
  • the sense sequence is not limited thereto, but is preferably composed of 25 bases.
  • 'antisense nucleotides' are bound to (complementary to) a complementary base sequence of DNA, immature mRNA or mature mRNA as defined in the Watson-click base pair It interferes with the flow of genetic information as a protein in DNA.
  • the nature of antisense nucleotides that are specific for the target sequence makes them exceptionally multifunctional.
  • antisense nucleotides are the long chain of monomeric units they can be easily synthesized against the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisense nucleotides as biochemical means to study target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81: 1539-1544, 1999).
  • the use of antisense nucleotides can be considered as a novel type of inhibitor, as there have been many advances in the field of oligonucleotide chemistry and nucleotide synthesis showing improved cell adsorption, target binding affinity and nuclease resistance.
  • 'Peptide Minetics' inhibits the activity of KS protein by inhibiting the binding domain of KS protein.
  • Peptide mimetics may be peptides or non-peptides and may be derived from amino acids linked by non-peptide bonds, such as psi bonds (Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271: 33218-33224, Lt; / RTI >
  • Peptide mimetics is structurally similar to the secondary structural features of the KRS protein and has been shown to be an antibody (Park, BW et al.
  • 'aptamer' means a nucleic acid molecule having a binding activity to a predetermined target molecule.
  • SELEX systematic evolution of 1 igands by exponential enchance
  • 'KRS antibody' or 'KRS anti-antibody' refers to a specific protein molecule directed against the antigenic site of KRS.
  • the antibody refers to an antibody that specifically binds to the KRS protein and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.
  • the heavy chain of the antibody and the amino acid sequence of the light chain are monoclonal antibodies that are groups of substantially identical antibodies.
  • Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for obtaining serum from animals by injecting said KRS protein antigen into said animal and collecting the antibody from said animal.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, small dogs, and the like.
  • Monoclonal antibodies may be obtained from the hybridoma method (see Kohler and Mi lstein (1976) European Jounal of Immunology 6: 511-519), or the phage antibody library (Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991).
  • the antibody comprises a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • the functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen binding function.
  • the fragment is at least 50%, 60% of the KRS binding affinity of the parent antibody. 70%, 80%, 90%, 95% or 100% or more.
  • it may be in the form of Fab, F (ab) 2, Fab ', F (ab') 2, Fv, diabody, scFv and the like.
  • Fab fragment ant i gen-binding
  • F (ab ') 2 is a fragment produced by hydrolyzing an antibody to pepsin, and two Fabs are linked from a heavy chain hinge to a disulfide bond.
  • Fab ' is a monomer antibody fragment in which a heavy chain hinge is added to a Fab obtained by reducing disulfide bonds of F (ab') 2 fragments.
  • Fv (variable fragment) is an antibody fragment consisting of only variable regions of heavy and light chains, respectively.
  • a single chain variable fragment is a recombinant antibody fragment in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) are linked by a flexible peptide linker.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • a diabody refers to a fragment in which VH and VL of scFv are linked by very short linkers and can not bind to each other, and form dimers by binding to VL and VH, respectively, of other scFvs of the same type. .
  • the antibody to be used in the present invention is not limited thereto , but may be selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgE and IgD, and preferably IgG antibody.
  • the term " immune cell refers to a cell involved in the immune system in the body, and is not particularly limited as long as it is known in the art as an immune cell, , Macrophages, neutrophil eosinophils, basophils, dendritic cells, natural killer cells, megakaryocytes, T cells, and B cells. Preferably monocytes, macrophages or neutrophils. Immune cells express KRS.
  • treatment &quot is intended to encompass all types of conditions, including, but not limited to, inhibiting the occurrence or recurrence of a disease, alleviating symptoms, reducing the direct or indirect pathological consequences of the disease, reducing the rate of disease progression, Or prevention.
  • the term " prevention " used in the present invention means any action that inhibits the onset of the disease or delays its progress.
  • the term " comprising " of the present invention is used in the same way as " comprising " or " characterized ", excluding any additional component elements or method steps not mentioned in the composition or method I never do that.
  • &quot consisting of " is intended to exclude additional elements, steps or components not otherwise mentioned.
  • the term in the range of is a composition or method, essential (essentially consisting of) consisting of ", described meant to include, such as” component elements or steps and deobul control component elements or steps that do not substantially affect its basic properties do.
  • the term " preparation or composition " in the present invention may be in the form of a food composition, a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, and the like, and is not particularly limited.
  • the present invention will be described in detail.
  • KRS has immune cell migration regulatory activity, and particularly in relation to the pathological migration and invasion phenomenon of immune cells, KRS inhibits the cellular level of cytoplasmic membrane of immune cells (especially mononuclear / macrophage) This specific increase is the first pathological phenomenon.
  • the present inventors have confirmed that the immune cell migration is inhibited when the level of KRS is inhibited and the level of the immune cell (total) is reduced, and the immune cell migration inhibited by KRS (Eg, endocytosis induction), and inhibits immune cell migration in vivo.
  • the immune cell infiltration such as inflammatory diseases, fibrotic diseases, pulmonary hypertension, and the like.
  • KRS can be used for prevention and / or treatment of immune cell migration diseases by inhibiting immune cell migration even when inhibiting the activity of migrating to the cell membrane.
  • the present invention provides the use of a lysyl tRNA synthetase (KRS) inhibitor for producing an agent for preventing or treating immune cell migration-related diseases.
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases comprising as an active ingredient a lysyl tRNA synthetase (KRS) inhibitor.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases comprising a lysyl tRNA synthetase (KRS) inhibitor.
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases which is essentially constituted by a lysyl tRNA synthetase (KRS) inhibitor Provide water.
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • the 'KRS inhibition (agent)' is preferably meant to include both KRS expression inhibition and / or inhibition of activity.
  • the KRS expression inhibition is meant to include all of the gene, mRNA and protein expression inhibition of KRS.
  • the method of reducing the level of KRS by the intracellular pathway may be a transcription step, a post-transcription step, a post-translational step, etc. To inhibit the production of the expression product of each step.
  • KRS activity inhibition is meant to include both reducing, preventing, preventing, or blocking any activity (signal) preferably relating to immune cell migration of KRS.
  • KRS activity includes, but is not limited to, activity related to increased intracellular levels or stability-related activities of KRS, particularly levels of the presence of KRS at cell membrane positions associated with immune cell migration In this case, the activity includes both the activity that causes the increase of the level of KRS specific to the immunocytochemical membrane, as well as the activity that is dependent on the presence (when present) of KRS in the cell membrane .
  • the presence level of KRS to the cell membrane may be such as phosphorylation of KRS, migrating activity of the of KRS membrane, when KRS is located on the cell membrane (when present) dependent
  • the activity exhibited include activities in which KRS interacts with the cell membrane or activities in which KRS interacts with (binds to) a binding partner (or ligand) thereof in the cell membrane. Details of embodiments of such inhibition of activity are understood with reference to the description of how to control the migration of immune cells described below.
  • 'KRS inhibition' in the present invention may correspond to (i), (ii) and (iii) below.
  • the KRS inhibitor is selected from the group consisting of an antisense nucleotide complementary to the KRS mRNA, a miRNA, a siRNA, a shRNA, a ribozyme, a DNAzyme and a peptide nucleic acid (PNA); or But are not limited to, compounds that specifically bind to KRS proteins, peptides, peptide mimetics, substrate analogs, aptamers, antibodies, natural extracts, and synthetic compounds. . According to the present invention, the inhibition of the expression of KRS in the immune cells inhibits the migration of immune cells.
  • the present invention provides, as a specific embodiment, an expression system comprising a promoter and a structural gene which inhibits the expression of KRS operably linked thereto
  • the present invention provides a composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases comprising a vector as an active ingredient.
  • the structural gene that inhibits the expression of KRS in this embodiment may be an antisense RNMantisense RNA), siRNA shRNA or miRNA for a polynucleotide encoding KRS.
  • the siRNA (si-KRS) as the KRS inhibitor may be, for example, a sense sequence comprising a nucleotide sequence (nucleic acid sequence) selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 19 and a complementary antisense sequence have.
  • promoter refers to a DNA sequence that controls the expression of a nucleic acid sequence operatively linked to a particular host cell.
  • operably linked means that a nucleic acid fragment is combined with another nucleic acid fragment Its function or expression is affected by other nucleic acid fragments.
  • a constitutive promoter that induces expression of a target gene at all times at any time, or an inducible promoter that induces the expression of a target gene at a specific position and time can be used. Examples thereof include SV40 promoter, CMV Promoter, CAG promoter (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108: 193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7: 24-30, 2000), CaMV 35S promoter (Odell et al.
  • a gene transfer method using a plasmid expression vector is a method for transferring plasmid DNA directly to mammalian cells, which can be used by humans approved by the FDA (Nabel, EG, et al., Science, 249: 1285-1288 , 1990). Unlike virus vectors, plasmid DNA has the advantage of being homogeneously purified.
  • mammalian expression plasmids known in the art can be used. Examples include, but are not limited to, pRK5 (European Patent No. 307,247), pSV16B (International Patent Publication No. 91/08291) and pVL1392 (PharMigen).
  • the plasmid expression vector may be prepared by methods known in the art such as, but not limited to, transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation Liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporatation (e. G. ion, a gene gun, and other known methods for introducing DNA into cells. OVu et al., J. Bio. Chem. , 267: 963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem. , 263: 14621-14624, 1988).
  • virus vectors comprising the nucleic acid, including, but not limited to, retroviruses, adenoviruses, herpes viruses, and avipoxviruses avipox virus, Lenti virus, and the like.
  • the retroviral vector is constructed such that all of the viral genes have been removed or altered so that the non-viral proteins are made in cells infected by the virus vector.
  • the main advantage of retroviral vectors for gene therapy is that they transfer large numbers of genes into cloned cells, accurately integrate the genes transferred into cellular DNA, and do not lead to subsequent infection after gene transfection (Miller, AD, Nature, 357: 455-460, 1992).
  • Non-retroviral vectors include the adenoviruses mentioned above (Rosenfeld et al., Cell, 68: 143-155, 1992; Jaffe et al., Nature Genetics, 1: 372-378, 1992; Lemarchand et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89: 6482-6486, 1992).
  • the main advantage of adenoviruses is the ability to carry large quantities of DNA fragments (36 kb genome) and to infect very high reverse non-cloned cells.
  • Herpesviruses may also be useful for human gene therapy (Wolfe, JH, et al., Nature Genetics, 1: 379-384, 1992).
  • known suitable virus vectors may be used in the present invention.
  • the structural gene for example, antisense RNA, siRNA shRNA or miRNA
  • the structural gene that inhibits the expression of KRS can be administered by other methods, for example, topically, orally (including sublingually) , Intramuscularly, subcutaneously, or by any other suitable means.
  • the above-mentioned parenteral administration includes injection and dermal administration.
  • the vector may be injected directly into the lesion of the immune cell migration related disease in an amount effective to treat the target tissue.
  • the composition containing the structural gene of the present invention (or an expression vector comprising the structural gene of the present invention)
  • the pharmaceutical composition may be injected directly into the hoi low organ affected by the lesion using a needle, catheter or other type of transport tube. Imaging devices such as X-rays, sonograms, or fiberoptic visualization systems can then be used to locate the target tissue and inject the needle or catheter.
  • the compositions of the present invention may be administered into the circulatory system.
  • the present invention also provides, as a specific embodiment, a composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases comprising an antibody against KRS as an active ingredient.
  • the antibody as the KRS inhibitor may be, for example, a heavy chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 and a light chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: have.
  • the present invention also provides, as a specific embodiment, a composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases comprising, as an active ingredient, a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as a KRS inhibitor.
  • a substance inhibiting the migration of KRS to a cell membrane is a substance that inhibits the migration of KRS to a cell membrane, wherein the substance is a 4- ( ⁇ (7-fluorobenzo [d] thiazol- Aminocaphenyl) ethyl] amino ⁇ methyl) benzoic acid as a representative of various types of immune cell migration (and infiltration) -related diseases.
  • the substance is a 4- ( ⁇ (7-fluorobenzo [d] thiazol- Aminocaphenyl) ethyl] amino ⁇ methyl) benzoic acid as a representative of various types of immune cell migration (and infiltration) -related diseases.
  • the compound of the formula (1) or a salt thereof may have a substituent including an asymmetric atom, and the compound of the formula (1) or a salt thereof may exist as an optical isomer such as (R), (S), or racemic (RS) . Accordingly, unless otherwise indicated, the compound of Formula 1 or its salt includes all optical isomers such as (R), (S), or racemic (RS).
  • the compound of formula (I) of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt. &Quot; Pharmaceutically acceptable (acceptable) " as used herein refers to a non-toxic composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to humans.
  • Such salts include the salts derived from inorganic acids such as conventional acid addition salts such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid or phosphoric acid, and organic acids such as citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, Acetic acid, benzoic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, glycolic acid, succinic acid,
  • inorganic acids such as conventional acid addition salts such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid or phosphoric acid
  • organic acids such as citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, Acetic acid, benzoic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, glycolic acid, succinic acid,
  • the salt may also be in the form of a conventional metal salt, for example, an alkali metal salt such as lithium, sodium, or potassium; Alkaline earth metal salts such as fowl or magnesium salts; Or chromium salts. Also included are salts formed with suitable organic ligands, such as quaternary ammonium salts, including dicyclohexylamine or N-methyl-D-glucamine salts and amino acid salts formed with arginine, lysine and the like.
  • a conventional metal salt for example, an alkali metal salt such as lithium, sodium, or potassium; Alkaline earth metal salts such as fowl or magnesium salts; Or chromium salts.
  • suitable organic ligands such as quaternary ammonium salts, including dicyclohexylamine or N-methyl-D-glucamine salts and amino acid salts formed with arginine, lysine and the like.
  • diseases related to immune cell migration in the present invention is not particularly limited as long as it is known in the art that excessive immune cell migration (or invasion) is a major mechanism of onset, Fibrosis disease, inflammatory disease, and Alport syndrome.
  • the specific type of the cardiovascular disease is not particularly limited, and examples thereof include hypertension (including inflammatory complications due to hypertension), pulmonary arterial hypertension, atherosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, ischemic cerebrovascular disease, arteriosclerosis, It may be chosen from a group of
  • fibrotic diseases include, but are not limited to, scleroderma, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, myelofibrosis, Pulmonary fibrosis, hepatic fibrosis, liver cirrhosis, kidney fibrosis, glomerulosclerosis, myofibrosis, cardiac fibrosis, interstitial fibrosis, pancreatic fibrosis, spleen Fibrosis, endometrial fibrosis, vascular fibrosis, dermal fibrosis, optic fibrosis, macular degeneration, arthritis ischemia, thyroid fibrosis, endocardial fibrosis, peritoneal fibrosis, peritoneal fibrosis, , Systemic fibrosis, systemic lupus erythematosus systemic lupus erythematosu, hereditary fibrosis, infectious fibrosis, irritative fibrosis,
  • the type of the inflammatory disease is not particularly limited.
  • the type of the inflammatory disease is preferably an autoimmune disease, inflammatory bowel disease, dermatitis (for example, atopic dermatitis, eczema, psoriasis, Diabetic retinopathy, etc.), peritonitis, osteomyelitis, meningitis, meningitis, encephalitis, pancreatitis, trauma shock, bronchial asthma, rhinitis, sinusitis, otitis media, pneumonia, gastritis, enteritis, cystic fibrosis, , Bronchitis, bronchiolitis, hepatitis (cirrhosis, non-alcoholic steatohepatitis, etc.), nephritis (such as diabetic renal failure), proteinuria .
  • autoimmune disease for example, atopic dermatitis, eczema, psoriasis, Diabetic retinopathy, etc.
  • Inflammatory diseases such as arthritis (psoriatic arthritis, osteoarthritis), neuritis (diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), gout, spondylitis, lighter syndrome, nodular polyarteritis, vasculitis, Lou Gehrig's disease, Wegener's granulomatosis hypercytokinemia, Arthritic rheumatism, bursitis, hay fever, tongue overgrowth (tennis elbow), Charcot's joint, hemarthrosis, arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, Hyperlipoproteinemia, hypergammaglobulinemia, hypertriglyceridemia, terminal hypertension, familial mediastinitis, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia, hypercholesterolemia, hypertrophic osteoarthritis,
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, Inflammatory bowel disease, Crohn's disease, Crohn's disease, multiple sclerosis, dermatomyositis, collagenosis, vasculitis, arthritis, granulomatosis, organ specific autoimmune lesions, ulcerative colitis, and GvHD Disease: graft-versus-host disease).
  • the chronic inflammatory diseases refer to the types of inflammatory diseases described above, Chronically infected, and preferred examples thereof include asthma athrophilic dermatitis, eczema, psoriasis, osteoarthritis, gout, psoriatic arthritis, cirrhosis, nonalcoholic fatty liver disease, chronic obstructive pulmonary disease , Rhinitis, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy and multiple sclerosis.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated into various pharmaceutical formulations containing the KRS inhibitor substances alone or together with a pharmaceutically acceptable carrier in a suitable form and may further contain excipients or diluents have.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizing agent, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a coloring matter and a perfume in the case of oral administration, Solubilizers, isotonic agents and stabilizers can be commonly used.
  • bases, excipients, lubricants and preservatives can be used.
  • the carrier for oral administration may contain lactose, starch, celluloses, magnesium stearate, stearic acid, and the like.
  • the carrier for parenteral administration may contain water, a suitable oil, a saline solution, an aqueous glucose and a glycol, and may further contain a stabilizer and a preservative.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutane.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, etc., in addition to the above components.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers and preparations can be found in the following references (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, East on, PA, 1995 ).
  • the formulation of the pharmaceutical composition comprising the KRS inhibitor of the present invention can be formulated into various forms commonly associated with pharmaceutically acceptable carriers as described above. Can be largely formulated into preparations for oral administration or parenteral administration according to the route of administration as described below.
  • compositions of the present invention may be in the form of powders, granules, tablets, Capsules, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions and the like, which are well known in the art.
  • an oral preparation can be obtained by combining the active ingredient with a solid excipient, then milling it, and adding a suitable adjuvant, followed by processing into a granular blend.
  • excipients include sugars including lactose, textolose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol and corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch
  • sugars including lactose, textolose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol and corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch
  • Cells containing starches, celluloses, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl-celluloses may be included in the cell, such as rosin, gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like.
  • crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may optionally be added as a disintegrant.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise an anti-aging agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent.
  • a preparation for parenteral administration it can be formulated by a method known in the art in the form of injection, cream, lotion, external ointment, oil, moisturizer, gel, aerosol and nasal aspirate.
  • injections it may be formulated in unit dosage ampoules or in multiple dose formulations. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, East on, PA, 1995, which is a commonly known formulary for all pharmaceutical chemistries.
  • the KRS inhibitor of the present invention and / or compositions comprising it may be administered to mammals, including humans, by any method. For example, it can be administered orally or parenterally. Oral administration also includes sublingual administration.
  • Parenteral administration includes, but is not limited to, intravenous, intraperitoneal, intracerebral, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, intramuscular, intravenous, , Sustained release system as described below, or by injection or infusion by intracerebral, intramedullary, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intranasal, enteral, topical, sublingual, rectal or intralesional routes, But is not limited to, injection or infusion.
  • the KRS inhibitor or a composition containing the KRS inhibitor may be administered systemically or locally.
  • the total effective amount of a composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose and administered by a fractorted treatment protocol administered over a prolonged period of time in multiple doses .
  • the content of the active ingredient may be varied depending on the degree of the disease.
  • the total preferred dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be from about 0.01 to 10, 000 mg, most preferably from 0.1 g to 500 mg per kilogram of patient body weight per day.
  • the dosage of the pharmaceutical composition should be determined based on various factors such as the formulation method, route of administration and frequency of treatment, as well as age, weight, health, sex, disease severity, As a matter of fact, one of ordinary skill in the art will be able to determine the appropriate effective dose of the composition of the present invention in view of this point.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to its formulation, administration route and administration method as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating immune cell migration-related diseases, which comprises administering an effective amount of a composition comprising an inhibitor of lysyl tRNA synthetase (KRS) as an active ingredient to a subject in need thereof ≪ / RTI >
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • the present invention also provides a method of preventing or treating immune cell migration-related diseases, which comprises administering an effective amount of a composition comprising a lysyl tRNA synthetase (KRS) inhibitor to a subject in need thereof.
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • the present invention also provides a method of preventing or treating immune cell migration-related diseases, which comprises administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition essentially consisting of a lysyl tRNA synthetase (KRS) inhibitor.
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • the "effective amount" of the present invention refers to an amount that, when administered to an individual, represents an improvement in immune cell migration, immune cell infiltration, or an improvement, treatment, or prevention effect of the disease caused thereby, .
  • the 'individual' may be an animal, preferably a mammal, especially an animal including a human, and may be an animal derived cell, tissue, organs, and the like.
  • the subject may be a patient who needs the effect.
  • the present inventors have for the first time revealed that KRS has immune cell migration control activity. Accordingly, the present invention discloses a method of controlling immune cell migration through regulation of immune cell migration activity (signal) of KRS. Especially, the increase of KRS level specifically in the cell membrane position of immune cells was confirmed to be an important pathological phenomenon for diseases related to immune cell migration and invasion. Accordingly, the present invention provides a method for regulating the immune cell migration by controlling the level of KRS (lysyl tRNA synthetase) in the immune cell, regulating the level of KRS specific cell membrane location, or transferring KRS to the cell membrane to provide.
  • KRS lysyl tRNA synthetase
  • the subject to which the method is performed is not particularly limited as long as it is a subject in need of regulation of immune cell migration, and the method can be used in mammals including humans (Homo sapiens).
  • the subject is an animal other than a human.
  • the regulation of immune cell migration by the regulation of intracellular levels of KRS can be explained in more detail.
  • KRS level of immature cells of lysyl tRNA synthetase
  • Increasing the level of immunosuppressed tRNA synthetase (KRS) can promote (increase, increase) immune cell migration.
  • a decrease or increase in intracellular levels may be regulated by various methods known to those skilled in the art, as described above.
  • intracellular levels can be regulated through modulation at the transcription stage or post transcription stage.
  • control method in the transcription step as a method for promoting expression of a gene known to a person skilled in the art, for example, a recombinant expression vector in which a promoter is linked to a polynucleotide encoding KRS or a functional equivalent thereto is prepared A method of enhancing the expression of the gene or a method of inserting an expression control sequence promoting the expression of the gene in the vicinity of KRS or a gene encoding the functional equivalent thereof may be used, .
  • Methods for inhibiting the expression of a gene include, for example, a method of inducing a mutation of a promoter or a gene site to inhibit promoter activity or protein function, a method of expressing an antisense gene, si RNA or microRNA (rtiiRNA) method, and the like, But is not limited thereto.
  • methods for enhancing or inhibiting protein expression include, for example, the stability of niRNA transcribed with the gene coding for KRS or its functional equivalent Enhancing or inhibiting the activity of the protein or polypeptide, enhancing or inhibiting the stability of the protein or polypeptide, or enhancing or inhibiting the activity of the protein or polypeptide.
  • More specific examples of the above method include transformation into a DNA sequence encoding an RNA that acts on transcribed mRNA such as a first-group intron type, an Ml RNA type, a hammerhead type, or a hairpin type or a microRNA type. Or can induce a cosuppression through transformation of DNA having the same or similar sequence as the target gene sequence.
  • regulating the levels of KRS or a functional equivalent thereof in a cell can be carried out by a method of increasing or decreasing the expression level of the KRS-encoding polynucleotide. Such methods of increasing or decreasing can be carried out by methods known to those skilled in the art.
  • recombinant expression vectors in which a promoter is linked to a polynucleotide encoding KRS or a functional equivalent thereto are prepared and promoted in its expression reduce or, to prepare the recombinant expression vectors or antisense connecting the siRNA polynucleotide KRS on the promoter can decrease the expression.
  • the polynucleotide encoding the KRS or its functional equivalent at this time may preferably include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the siRNA polynucleotide for KRS may include, but is not limited to, a base sequence (nucleic acid sequence) selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 19.
  • KRS is locally specific, reduction of immune cell migration can be inhibited, Increasing the level of the presence locally may promote the migration of immune cells.
  • the reduction or increase in the level of KRS by cell membrane location- Can be controlled in many ways.
  • the cell membrane location-specific reduction in KRS levels may be accomplished, for example, by a method or means that inhibits the migration of KRS to the cell membrane, but is not limited thereto.
  • a method or means that inhibits the migration of KRS to the cell membrane it has been confirmed that migration of immune cells is inhibited by using a compound (BC-KI-00053 of Chemical Formula 1) inhibiting the migration of KRS to cell membranes.
  • this transfer may be inhibited by binding to an antibody against KRS (anti-KRS antibody), additional treatment for intracellular infiltration may be required depending on the specific target antigenic site of the antibody in this case .
  • the level of KRS may be reduced by, for example, but not limited to, a method or means for promoting endocytosis of KRS present at a cell membrane position.
  • the anti-KRS antibody binds to KRS located in the cell membrane and binds to its N-terminal domain (region corresponding to 1 to 72 amino acids of KRS N-terminal) Endocytosis was induced in the cells, and immune cell migration was inhibited thereby.
  • An increase in the level of KRS in a cell membrane location-specific manner can be achieved, for example, by a method or means that promotes migration of KRS to the cell membrane, but is not limited thereto. For example, it may be by treating laminin, particularly LN421.
  • the KRS level is specifically increased at the cell membrane position when LN421 is treated to immune cells.
  • any substance that induces or promotes phosphorylation of KRS can be used, and a substance of kinase type can be used although not limited thereto.
  • the regulation of immune cell migration by the regulation of migration of KRS to the cell membrane will be described in more detail.
  • the immune cell migration is inhibited Lysyl tRNA < / RTI > Increasing the migration of synthetic enzymes (KRS) to the cell membrane can promote (increase, increase) the migration of immune cells. This is understood with reference to the foregoing description.
  • the present inventors have shown for the first time that KRS has an immune cell migration-regulating activity and also have a special relationship with laminin (in particular, laminin subtype alpha 4 beta 2 gamma 1) in relation to the behavior of immune cells in KRS Respectively.
  • laminin in particular, laminin subtype alpha 4 beta 2 gamma 1
  • the present invention provides a new screening means for extracting a therapeutic agent for diseases caused by immune cell migration and infiltration.
  • step (C) measuring immune cell migration-related diseases comprising the steps of: (a) treating the immune cells of step (b) with a test substance identified as having KRS inhibitory activity in step (A) Screening methods for preventive or therapeutic agents and
  • a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of diseases associated with inverse cell migration comprising an agent selected by the screening method as an active ingredient.
  • the screening method may be used for carrying out the method by various biochemical and molecular biological techniques known in the art. The technique is described in the following references: Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. , Second (1998) and Third (2000) Editions; and Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & , New York (1987-1999).
  • the test agent first assesses whether it is capable of modulating the expression or (biological) activity of KRS (step (A), first assay step). Specifically, in the first step, the expression or biological activity of KRS in the presence of the test agent is assayed to identify a modulating agent that modulates the expression or biological activity of KRS.
  • the test agent is assayed for its ability to modulate the expression level of KRS, e.g., its ability to regulate transcription or translation but not limited thereto.
  • KRS expression levels can be used without limitation.
  • the term " measurement of KRS expression level " is meant to include measurement of the expression level of the KRS protein itself or a polynucleotide encoding KRS (including transcripts such as gene or mRNA).
  • the measurement of the protein expression level is not particularly limited as long as it is a protein expression assay known in the art.
  • a protein expression assay known in the art.
  • Western blotting ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, Immunoprecipitation assays, complement fixation assays (FACS), fluorescence activated immunosorbent assays (FACS), immunoprecipitation assays, immunoprecipitation assays, immunoprecipitation assays, immunoprecipitation assays, A luminescence assay or a protein chip method may be used.
  • the measurement of the gene expression level of the polynucleotide is not particularly limited as long as it is performed by a gene expression assay method known in the art.
  • PCR polymerase chain reaction
  • R ase protection assay R ase protection assay
  • northern blotting southern blotting
  • luminescence assay and DNA chip.
  • DNA chip DNA chip.
  • the test agent can be used to determine the intracellular level or stability of KRS (e.g., the effect on post-transplantation modal fi caton), the effect of KRS on cell membrane site- Whether KRS is induced by endocytosis, whether the KRS activity is related to migration to a site where the KRS is active, whether it is transferred to the cell membrane, whether it binds to a binding factor, whether the signaling function is changed to promote cell migration,
  • KRS intracellular level or stability of KRS
  • KRS e.g., the effect on post-transplantation modal fi caton
  • the above primary assay procedure for screening test agents that affect the activity of the KRS protein can be first assessed if the test agent is capable of binding KRS.
  • Binding of the test agent to the test can be effected, for example, in a labeled in vitro protein-protein binding assay,
  • test agent can be identified by detecting direct binding to KRS, e. G., Co-immunoprecipitation with RS polypeptides by antibodies to KRS.
  • the test agent may also be identified by detecting a signal indicative of the binding of KRS to the test agent, such as fluorescence quenching.
  • a signal indicative of the binding of KRS to the test agent such as fluorescence quenching.
  • a variety of assays routinely practiced in the art can be used to identify agents that modulate KRS.
  • the agent can be screened with a cell based assay system.
  • the reporter gene activity e.g., enzyme activity
  • the reporter gene activity is measured in the presence of the test agent and compared to the activity of the reporter gene in the absence of the test agent.
  • the reporter gene may encode any detectable polypeptide (reaction or reporter polypeptide) known in the art, such as a polypeptide detectable by fluorescence or phosphorescence or a polypeptide detectable by the enzyme activity it possesses .
  • Detectable reponse polypeptides include, for example, luciferase, alpha-glucuronidase, alpha-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase, green fluorescent protein, Human secreted alkaline phosphatase.
  • test agents e.g., peptides or polypeptides
  • a library of test agents is encoded by a library of such vectors (e.g., a cDNA library).
  • the library can be prepared using methods known in the art (Sambrook et al. And Ausubel et al., Supra) or from a variety of commercial sources. In addition to the cell-based assays described above, .
  • the method can be used for the detection of mobility shift DNA-binding assays using, for example, enzyme immunoassay (ELISA), surface plasmon resonance (SPR), flow cytometry analysis, DNA and hydroxy radical footprint ing analysis, fluorescence polar ization, and UV cross-linking assays, as well as assays, methylation and uracil interference assays, (crosslinking) or chemical cross-linking (cross-1 inkers).
  • ELISA enzyme immunoassay
  • SPR surface plasmon resonance
  • flow cytometry analysis DNA and hydroxy radical footprint ing analysis
  • fluorescence polar ization fluorescence polar ization
  • UV cross-linking assays as well assays, methylation and uracil interference assays, (crosslinking) or chemical cross-linking (cross-1 inkers).
  • crosslinking methylation and uracil interference assays
  • cross-1 inkers cross-1 inkers.
  • competition assays provide a format suitable for identifying test agents that specifically bind to KRS.
  • the present invention can be carried out in a high throughput manner according to various binding assays known in the art.
  • the test agent is screened through competition with compounds already known to bind KRS.
  • Known binding compounds may be synthetic compounds. It may also be an antibody that specifically recognizes KRS, such as a monoclonal antibody to KRS. If the test agent inhibits the binding of the known compound, the test agent also binds to RS.
  • RIA solid phase direct or indirect radioimmunoassay
  • EIA solid phase direct or indirect enzyme immunoassay
  • sandwich competition assay Stahli et al., Methods in Enzymology, 9 : 242-2453, 1983
  • solid phase direct biotin-avidin EIA Kirkland et al. J. Immunol.
  • solid phase direct labeled assays solid phase direct labeled sandwich assays (Harlow and Lane, Antibodies, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988); solid-phase direct biotin-avidin EIA (Cheung et al., Virology, 176, 1988); solid phase direct label RIA using 1251 (Morel et al., Mol. : 546-552, 1990) and direct labeled RIA (Moldenhauer et al., Sacnd. J. Immunol., 32: 77-82,1990).
  • the assays are based on the unlabeled test agent and the labeled reference compound
  • the identified controlled agent includes an agent that binds to the same epitope as the control compound and an agent that binds to an adjacent epitope sufficiently close to the epitope bound by the control compound to allow steric hindrance to occur.
  • the specific binding of a reference compound to a common target polypeptide will be inhibited at least 50% to 75%.
  • the assay may be in an insoluble or soluble format.
  • an insoluble assay is to immobilize KRS or fragments thereof in a solid phase matrix. The solid phase matrix is then placed in contact with the test agent for a period of time sufficient for the test agent to bind. Thereafter, the unbound material is washed away from the solid phase matrix, and the presence of the agent bound to the solid phase is confirmed.
  • the method may further comprise the step of eluting the combined agent from the solid phase matrix to separate the agent.
  • another method of immobilizing KRS is to bind the test agent to a solid phase matrix and then add RS. Solubility assays include some combinatorial library screening methods described above.
  • the test agent Under the soluble assay format, neither the test agent nor KS binds to the solid support.
  • the binding of KRS or fragments thereof to the test agent can be measured, for example, by fluorescence of KS and / or the test agent. Fluorescence can be imparted by the labeling of components with intrinsic fluorophores.
  • the test substance or KRS protein may be labeled with a detectable label to facilitate identification, detection and quantification of the compound under given conditions.
  • the detectable label can be a chemical label (e.g., biotin), an enzyme label (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, perox Glucuronidase, alpha-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase,? -Galactosidase and?
  • a chemical label e.g., biotin
  • an enzyme label e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, perox Glucuronidase, alpha-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase,? -Galactosidase and?
  • -Glucosidase a radioactive label (for example, 14 C, 125 I, 32 P and 3 3 ⁇ 4), fluorescence labels (eg coumarin, fluorescein, FITC, rhodamine 6G, rhodamine B, TAMRA 6-carboxy-tetramethyl- rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAP I (4,6-di amidic acid 2-pheny 1 indole), HEX, TET, Dabsyl and FAM) A chemiluminescent label, a fluorescence resonance energy transfer (FRET) label or a metal label (e.g., gold and silver).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the detectable group may be a substrate, a cofactor, an inhibitor or an affinity ligand.
  • a detectable marker labeled KRS protein or a test substance is used, whether or not a bond between the KRS protein and the test substance occurs can be detected by detecting a signal from the label.
  • alkaline phosphatase it is possible to use bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate, And enhanced chemi fluorescence (ECF).
  • chloronaph is preferably used in combination with aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methyl acridinium nitrate), resorufin benzyl ether, Luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3, gordihydroxyphenoxaphone),
  • HYR p-pheny 1 ened i am i ne-HC 1 and pyrocatechol
  • TMB tetramethylbenzidine
  • ABTS 2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]
  • o -phenylenediamine The signal is detected using a substrate such as naphtha / pyroin.
  • the binding of the test substance to the KRS protein may be assayed without the labeling of the interactants.
  • a microphysiometer can be used to analyze whether the test substance binds to the KRS protein.
  • the microphysiometer is an analytical tool that measures the rate at which a cell acidifies its environment using a light -addressable potentiometric sensor (LAPS).
  • LAPS light -addressable potentiometric sensor
  • a change in the rate of acidification can be used as an indicator of the binding between the test substance and the KRS protein (McConnell et al., Science 257: 1906-1912 (1992)).
  • BIA bimolecular interaction assay
  • the screening methods of the present invention can also be carried out by applying a two-hybrid assay or a three-hybrid assay (US Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura Ivabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993, and TO 94 / RTI > et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924, 1993; 10300).
  • the KRS protein can be used as a " bait " protein.
  • the substance binding to KRS protein can be screened.
  • To-hybrid system is based on the modal characteristics of transcription factors composed of segmentable DNA-binding and activation domains.
  • this assay uses two DNA constructs. For example, in one construct, a KRS-coding polynucleotide is fused to a DNA binding domain-coding polynucleotide of a known transcription factor (e.g., GAL4). In other constructs, a DNA sequence encoding a protein of interest (“prey" or "sample (test preparation)" is fused to a polynucleotide encoding the activation domain of a known transcription factor.
  • the DNA-binding and activation domains of the transcription factor become contiguous, which triggers the transcription of a reporter gene (e.g., LacZ). Expression of the reporter gene can be detected, indicating that the protein to be analyzed can bind to the KRS protein.
  • a reporter gene e.g., LacZ
  • the activity of the KRS protein treated with the test agent is measured. As a result of the measurement, when it is measured that the activity of KRS protein is downregulated, the test substance may be temporarily determined as a candidate for prevention and treatment of immune cell migration-related diseases as a KRS activity inhibitor.
  • KRS may be provided in a form that is always expressed in immune cells, but is not limited thereto.
  • the treatment of laminin can also be accomplished by treating the separately isolated laminin protein ex vivo (such as the medium), or by treating it with specific genetic manipulation to express it in the cell. In the present invention, it has been newly found that KRS has an ability to regulate immune cell migration specific to laminin (particularly, LN421).
  • various cell migration assay methods known in the art, or invasion assays may be used.
  • agents that inhibit KRS identified by the methods of the present invention can modulate (inhibit) migration of immune cells.
  • the test agent identified in the primary assay stage controls the intracellular level of KRS (e.g., by altering transcriptional activity), it can be regarded as being able to directly regulate the migration of immune cells.
  • the test agent modulates an activity other than the intracellular level of KRS it may be necessary to confirm that the modulatory effect of the test agent on KRS actually regulates immune cell migration, It is preferred that the assay step be performed additionally.
  • the order of the primary and secondary assays can be changed to perform efficient assays.
  • the present inventors have found that the immune cells (monocytes / macrophages) are specific to the phenomenon of KRS levels increased in the cell membrane where an important pathologies against immune cell migration and invasion-related diseases, which laminin (especially laminin subtypes ⁇ 4 ⁇ 2 ⁇ 1). Based on these novel discoveries, the present invention provides a new screening means for discovering therapeutic agents for diseases caused by immune cell migration and invasion. Accordingly,
  • a method of screening for a preventive or therapeutic agent for diseases related to immune cell migration, and a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases related to immune cell migration comprising the agent selected by the screening method as an active ingredient.
  • the laminin and the test substance may be treated simultaneously on the immune cells, or each substance may be treated sequentially, and there is no limitation on the substance to be first introduced. That is, in the latter, the test substance may be treated after the laminin is treated first, or the laminin may be treated after the test substance is treated.
  • 'monitoring' means all means for measuring the level of KRS at the cell membrane position, or the level and amount of movement of KRS to the cell membrane.
  • the level of KRS (presence) or the level of KRS movement to the cell membrane and the level (amount) of the cell membrane can be measured by a known protein level measurement method, including but not limited to Western blotting, ELISA Immunoprecipitation assays, Immunoprecipitation assays, Complement fixation assays, luminescence assays, and Protein assays can be used to determine whether or not a protein is involved in the immune response. Chip, and the like. Those skilled in the art can include any treatment process to measure KRS level and KRS movement specific to the cell membrane location according to the characteristics of the protein level measurement method to be used.
  • the 'control group' is an immune cell that has not been treated with the test substance (test preparation) and is the same kind of immune cell as that used in the step (a).
  • the immunoreactive cells used as the control group include both treated laminin (particularly, LN421) or untreated laminin.
  • the screening methods of the present invention may also be used to treat or prevent a disease associated with immune cell migration by administering to a mammal a disease associated with immune cell migration (and invasion) Quot; a step of inspecting the paper.
  • the animal is a non-human animal.
  • Controlling K S according to the present invention can regulate the migration of immune cells, which can be very useful in the prevention, improvement and treatment of diseases related to immune cell migration.
  • FIG. 1A shows the results of a transwell migration assay comparing the effects of collagen (Col), fibronectin (FN) and laminin (LN) on the migration of immune cells (monocytes / macrophages) Microscopic images of migrating cells are shown.
  • Fig. 1b is a graph showing the number of cells in a microscopic image of Fig. 1a.
  • 2a shows the results of a transwell migration assay comparing the effects of various laminin subtypes (LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521) on the migration of immune cells (monocytes / macrophages) , which shows a microscopic image of the migrating cell.
  • laminin subtypes LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521
  • FIG. 2B is a graph showing the number of cells in a microscopic image of FIG. 2A.
  • FIG. 3 shows Western blotting of the increase in KRS in the cell membrane of monocytes / macrophages by treatment with LN421.
  • FIG. 4A shows a microscope image of migrating ing cell 1 as a result of comparing the effect of KRS expression level on LN421-specific monocyte / macrophage migration with Transwell cell migration assays.
  • FIG. 4B is a graph showing the number of cells in a microscopic image of FIG. 4A.
  • FIG. FIG. 5 shows that the increase in the level of KRS in the area of the immune cell cell membrane by treatment with LN421 was markedly lowered by the treatment with a compound inhibiting the migration of KRS to the cell membrane (BC-KI-00053 compound) .
  • FIG. 6A shows that the migration of monocytes / macrophages is remarkably inhibited in a concentration-dependent manner by treatment with a compound inhibiting migration of KRS to a cell membrane (BC-KI-00053 compound).
  • FIG. 6B is a graph showing the number of cells in a microscopic image of FIG. 6A.
  • FIG. 7a shows the results of observation of the degree of infiltration of mononuclear cells, macrophages and Langerhans cells by BC-KI-00053 compound treatment in an acute inflammatory antrum (ear skin wound model) by fluorescence microscopy e)
  • the group treated with 100 mg / kg of BC-KI-00053 and the lower part shows monocytes, macrophages and Langerhans cells in green, and the labeled blood vessels in CD31 in red.
  • White circles represent skin wound locations).
  • FIG. 7B is a graphical representation of the degree of monocyte / macrophage infiltration in a skin wound peripheral region indicated by a blue circle in the fluorescence microscope image of FIG. 7A.
  • FIG. 8A is a schematic representation of the Tr i ad (hepatic artery, hepat ic artery, hepat ve vein) occlusion procedure for the production of hepatic ischemia-reperfusion injury model.
  • Tr i ad hepatic artery, hepat ic artery, hepat ve vein
  • FIG. 8B shows fluorescence microscopic observation of the degree of infiltration of mononuclear cells, macrophages and Cooper cells with BC-KI-00053 compound treatment in a hepatic ischemia-reperfusion injury model (the upper part of the figure shows the vehicle-treated group , And the lower part represents BC-KI-00053 100 mg / kg administration group, the green part indicates monoclonal macrophages and Cooper cells, and the red part indicates the labeled blood vessel for CD31).
  • FIG. 8C is a graph showing the degree of mononuclear / macrophage infiltration in the fluorescence microscope image of FIG. 8B quantified by the time point after ischemia-reperfusion injury.
  • the red bar was the vehicle-treated group, and the green bar was the quantified value in the BC-KI-00053 100 mg / kg group.
  • FIG. 9A is a diagram illustrating an experimental method and schedule of an experiment for preparing an animal model of liver fibrosis with CCl4 (carbon tetrachloride) and evaluating the therapeutic effect of the BC-KI-00053 compound.
  • FIG. 9b shows the result of evaluating the effect of BC-KI-00053 on an animal model of liver fibrosis induced by CC1 4 (carbon tetrachloride).
  • the degree of fibrosis in the liver surface and liver was observed by fluorescence microscopy (In the upper part of each drawing, the liver surface is imaged, and the lower part is an image of the liver inside. Collagen in the green part and hepatocyte in the red part).
  • FIG 10a shows changes in right ventricular end-systolic pressure (RVESP) by administering BC-KI-00053 compounds in a pulmonary arterial hypertension (PAH) model (MCT: monocrot- ) Model, Tx25mpk: 25 mg / kg of BC-KI-00053 in a PAH model, and Tx50mpk: 50 mg / kg of BC-KI-00053 in a PAH model.
  • RVESP right ventricular end-systolic pressure
  • Figure 10b shows changes in left ventricular end-systolic pressure (LVESP) due to the administration of BC-KI-00053 compounds in a pulmonary arterial hypertension (PAH) model
  • MCT monocrotaline treated pulmonary arterial hypertension
  • Tx25mpk administration of BC-KI-00053 25 mg / kg to the PAH model
  • Tx50mpk administration of BC-KI-00053 50 mg / kg to the PAH model
  • FIG. 10C shows the result of e-staining that the immune cell migration and infiltration of lung tissue was reduced by administration of the BC-KI-00053 compound in a pulmonary arterial hypertension (PAH) model.
  • Figure lib is the result of measurement of MAP changes according to BC-KI-00053 treatment in FHH rats, which are superimposed hypertension.
  • FIG. 11C shows the results of measurement of changes in proteinuria (urinary protein excretion) by BC-KI-00053 treatment in FHH rats, which are superimposed hypertension.
  • Figure lid shows the results of measuring changes in plasma creatinine concentration following treatment with BC-KI-00053 in FHH rats with superimposed hypertension.
  • Figure lie shows the results of glomerular microscopy (upper image) and glomerular sclerosis in the vehicle-treated group and BC-KI-00053 treated group in FHH rats with superimposed hypertension
  • the bottom graph shows the number of images used to measure actual results.
  • Figure llf shows the microscopic image (upper image) and degree of cortical fibrosis of the cortical fibrosis in the vehicle-treated group (control) and BC-KI-00053 treated group in the superimposed hypertension FHH rat (The number in the graph represents the number of images used to measure the actual result).
  • Figure llg shows the results of quantification of the degree of water quality fibrosis and microscopic image (top image) on the water quality of the water-treated fibroblasts in the vehicle-treated group and BC-KI-00053 treated group in FHH rats with superimposed hypertension (Lower graph) (the number in the graph indicates the number of images used to measure the actual result).
  • Fig. Llh shows a microscopic image (top image, right ventricular insertion point) and degree of cardiac fibrosis for cardiac fibrosis in the vehicle treatment group (control) and the ⁇ - 00053 treatment group in FHH rats with superimposed hyper tension The results are quantified and shown (bottom graph).
  • Figure 11 shows the results of IHC staining that immune cell migration and infiltration of renal tissue was reduced by administration of BC-KI-00053 compound in FHH rats with superimposed hypertension.
  • Figure 12a shows the baseline body weights of the vehicle-treated and BC-K 1-00053 treated groups in Dahl salt-sensitive (SS) rats that induced hypertension, proteinuria, glomerular sclerosis and renal stromal fibrosis via high salt (HS) (The numbers in parentheses indicate the number of animals used to calculate the average data in each group, and so on.)
  • SS Dahl salt-sensitive rats
  • FIG. 12B shows the results of measurement of MAP changes according to BC-KI-00053 treatment in Dahl salt-sensitive (SS) rats that induced hypertension through a high salt (HS) diet.
  • Figure 12c shows changes in proteinuria (urinary protein excretion) following treatment with BC-KI-00053 in Dahl salt-sensitive (SS) rats that induced proteinuria, glomerular sclerosis and kidney stromal fibrosis via high salt (HS) .
  • SS Dahl salt-sensitive rats
  • Figure 12d shows the changes in plasma creatinine concentration following treatment with BC-KI-00053 in Dahl salt-sensitive (SS) rats that induced hypertension, proteinuria, glomerular sclerosis and renal stromal fibrosis through high salt (HS) .
  • SS Dahl salt-sensitive rats
  • Figure 12e shows the effect of the vehicle-treated group (control) and BC-KI-00053 treatment group (treatment) on Dahl salt-sensitive (SS) rats that induced hypertension, proteinuria, glomerular sclerosis, (Upper graph) and the degree of glomerulosclerosis (bottom graph). (Numbers in the graph indicate the number of images used in actual measurement).
  • Figure 12f shows the results of the vehicle-treated (control) and BC-KI-00053 treated (treated) groups in Dahl salt-sensitive (SS) rats that induced hypertension, proteinuria, glomerular sclerosis and renal stromal fibrosis (Upper graph) and the degree of cortical fibrosis (bottom graph). (The numbers in the graph indicate the number of images used in the actual measurement).
  • Figure 12g shows the results of the vehicle-treated (control) and BC-KI-00053 treated (treated) groups in Dahl salt-sensitive (SS) rats that induced hypertension, proteinuria, glomerular sclerosis and renal stromal fibrosis via high salt (Top image) and water quality fibrosis (bottom graph). (The figure inside the graph shows the number of images used in actual measurement).
  • Figure 12h shows the results of vehicle treatment in Dahl salt-sensitive (SS) rats that induced hypertension, proteinuria, glomerular sclerosis and nephroureteral fibrosis via high salt (HS) (upper graph, right ventricle insertion point) and the degree of cardiac fibrosis in the BC-KI-00053 treatment (control) and the treatment group (bottom graph).
  • SS Dahl salt-sensitive rats
  • HS high salt
  • FIG. 12i shows immunoreactivity of kidney tissue to kidney tissue by administration of compound BC-KI-00053 in Da salt-sensitive (SS) rats which induced hypertension, proteinuria, glomerular sclerosis and renal stromal fibrosis through high salt (HS) IHC staining confirmed that infiltration was reduced.
  • FIG. 13 shows the results of evaluating leukocyte infiltration and fibrosis reduction in the kidney when the control substance or BC-KI-00053 compound was treated in an Alport syndrome animal model.
  • CD45 a marker of white blood cell infiltration, became green and collagen I, a marker of fibrosis, became a red color.
  • Figure 14a shows the effect of inhibiting the migration of anti-KRS antibody (N3 antibody, for example) against mononuclear / macrophage migration specific to LN421, using a transwell migration assay As a result of comparison with the assay, a microscopic image of the migrating cell is shown.
  • anti-KRS antibody N3 antibody, for example
  • FIG. 14B is a graph showing the number of cells measured (quantified) in the microscopic image of FIG. 14A.
  • FIG. 14C shows Western blotting results showing that the KRS level increased in the cell membrane of monocytes / macrophages by treatment with LN421 was reduced by treatment with an anti-KRS antibody (for example, N3 antibody).
  • FIG. 15 shows the result of confirming that RS in the cell membrane region is endosatosis by treatment with anti-KRS antibody (N3 antibody).
  • the anti-KRS antibody labeled with Alexa fluor 488 (Thermof isher) fluorescent probe and the control Mock IgGCThermof isher) were treated and the antibody migration was monitored over time. Lysotracker Thermof isher) was used.
  • FIG. 1 Alexa fluor 488
  • FIG. 16 shows changes in right ventricular end-systolic pressure (RVESP) of the PAH model by administration of anti-KRS antibody (N3 antibody) (Mock IgG: negative control, Ab Impk: N3 antibody Impk, Ab lOmpk: N3 antibody lOmpk, sildenafil: positive control).
  • 17 shows changes in left ventricular end-systolic pressure (LVESP) of a pulmonary arterial hypertension (PAH) model by administration of anti-KRS antibody (N3 antibody) (Mock IgG: negative control, Ab Impk: N3 antibody Impk, Ab lOmpk: N3 antibody lOmpk, sildenafil: positive control).
  • FIG. 18 shows the results of me staining that immunocyte migration and invasion in lung tissue was reduced by administration of anti-KRS antibody (N3 antibody) in a pulmonary arterial hypertension (PAH) model.
  • FIG. 19 shows the results of confirming that the total number of immunized cells increased in the bronchial lavage fluid (BALF) of the mouse model of acute lung injury is reduced depending on the treatment concentration of the anti-KRS antibody (N3 antibody).
  • FIG. 20 shows the results of confirming that the neutrophil (neurotrophic factor) particularly increased in the bronchial lavage fluid (BALF) of the mouse model of acute lung injury is reduced depending on the treatment concentration of the anti-KRS antibody (N3 antibody).
  • FIG. 21A shows that FACS confirms that the increased macrophage (IM, CDllb + / F4 / 80 +) migration and invasion within the lung tissue of the acute lung injury mouse model is reduced dependent on the treatment concentration of anti-KRS antibody (N3 antibody) .
  • FIG. 21B is a graph showing the result of quantifying the result of FIG. 21A.
  • FIG. 22 is a tissue image showing that tissue fibrosis advanced in lung tissue of an acute lung injury mouse model is inhibited by treatment with anti-KRS antibody (N3 antibody). The tissues of each experimental group and the control group were stained with Masson's tri chrome and observed under a microscope.
  • Example 1 Identification of the role of laminin signal in immune cell migration and infiltration Among the extracellular matrix (ECM), which confirms whether it promotes migration and invasion of monocytes / macrophages, Respectively.
  • Transwel 1 migration assay was performed using collagen (Col), fibronectin (FN), and laminin (LN) as extracellular matrix. Respectively.
  • Transwell 1 (Corning, # 3421-5 ⁇ ) was coated with gelatin (0.5 mg / ml) and RAW 264.7 eel 1 (1 ⁇ 10 5 cells / well) was seeded in the top chamber.
  • Serum Free DMEM 500 l containing laminin (laminin mixture, Biolaminaittt), Fibronectin or Collagen was added to the bottom chamber containing 10 yg / ml each. Twenty-four hours later, the cells were fixed with 30% methanol in 70% methanol and stained with 50% hematoxylin for 30 min. Non-migrating cells on the top of the membrane were removed with a cotton swab, and the membrane was mounted on a slide. The migrating cells present on the underside of the membrane were observed and quantified on a high magnification microscope.
  • laminin subtype The effect of laminin subtype on immune cell migration and invasion was evaluated.
  • a transwell migration assay was performed in the same manner as in Example 1 using lyg / ml of LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511 and LN521 as various laminin subtype proteins (purchased from Biolamina) Respectively.
  • the specific sequence of the laminin subtypes is determined by the? 4 chain of SEQ ID NO: 4, the? 2 chain of SEQ ID NO: 10, the? 5 chain of SEQ ID NO: 11, the? 2 chain of SEQ ID NO: 6, Chain, refer to the chain of SEQ ID NO: 8.
  • RAW 264.7 cells (2 ⁇ 10 6 cells) were plated on 100-well plates and cultured for 18 hours. LN421 lug / ml was treated with serum free DMEM medium and harvested at Oh, 12h, 24h. Using ProteoExtract Subcellular Proteome Extract (itCCalbiotech, cat # 539790), the RAW 264.7 cell protein was separated into cytosine (l) and membrane fraction. The obtained protein was electrophoresed and transferred to a PVDF membrane (Milipore) and blocked with 3% skim mi lk. Then KRS was detected by Western blotting. Specifically, KRS polyclonal antibody (rabbit, Neomics, Co. Ltd. # NMS-01-0005) antibody was added and bound for 1 hour.
  • KRS polyclonal antibody (rabbit, Neomics, Co. Ltd. # NMS-01-0005) antibody was added and bound for 1 hour.
  • LN421-specific immune cells especially monocytes / macrophages
  • LN421 was treated with each transgenic macrophage transformed to overexpress KRS and transgenic macrophages transformed to be inhibited KRS expression, and a transwell migration assay was performed.
  • KRS-like leucyl-tRNA synthetase (LRS, SEQ ID NO: 3) was used.
  • KRS or LRS overexpressed macrophages were constructed as follows: KRS (SEQ ID NO: 1) -Myc and LRS (SEQ ID NO: 3) -Myc inserted in PCDNA3 were each subjected to Turbofect (Thermo Fisher Scientific) And transfection (48 hrs). Cells transfected with Ev (empty vector, pCDNA3) -Myc as a negative control were prepared.
  • KRS or LRS expression-inhibiting macrophages were constructed as follows: Transfection using Si-KRS (SEQ ID NO: 13) and Si-LRS (SEQ ID NO: 20) on Raw 264.7 cells using Lipofectamin Thermo Fisher Scientific) 72 hrs). As a negative control, cells transfected with si-control (si-RNA duplex with medium GC content (Invitrogen, Cat No. 12935-300)) were prepared.
  • Transwell migration assay was performed in the same manner as in Example 1 using laminin 421 at lyg / ml for each of the transformed macrophages.
  • KRS overexpression is a stylized increase LN421 specific monocyte / macrophage migration effectively
  • anti-KRS to the current reduction utilizing S iR A is LN421 specific monocyte / macrophage migration Respectively.
  • LNS leucyl ⁇ tRNA synthetase
  • LN421-dependent migration of monocytes / macrophages is strongly affected by KRS expression.
  • Example 5 Screening of compounds inhibiting migration of immune cells _ Movement inhibition of KRS to cell membrane Compound
  • the results of Examples 3 and 4 show that the KRS expression level as well as the expression level of KRS in the LN421-dependent migration of monocytes / macrophages are significantly affected.
  • the increase of KRS specifically in the immune cell membrane region was considered to be an important pathogenesis for diseases related to immune cell migration and invasion. Therefore, we tried to verify that suppression of this pathological behavior of KRS is applicable as one of the therapeutic strategies for diseases related to immune cell migration and invasion.
  • KRS is a necessary organ for the synthesis of proteins in cells.
  • the strategy of simply increasing or decreasing the amount of KRS is likely to be inadequate as a practical treatment strategy due to concerns about adverse effects on body function. Therefore, the present inventors have screened compounds that affect active keratinocyte and expression in various aspects of KS, and examined whether they can specifically inhibit migration to monocytes / macrophages without side effects. In particular, by using the screening method provided herein, compounds that inhibit the migration of KRS into cell membranes were found, and their therapeutic effect on immune cell migration-related diseases was confirmed and examined.
  • the concrete method is as follows.
  • RAW 264.7 cel 1 (2 x 10 6 cel 1) was added to 100 pliet plates and cultured for 18 hours, serum Free-DMEM medium was treated with 421 lyg / ml of l arainin, and various KRS inhibitor candidates were treated with ⁇ for 12 h.
  • the RAW 264.7 cel 1 protein was separated into cytosol and membrane fractions using ProteolExtract Subtilel Protein Extract Kit (CCalbiotech, cat # 539790). The obtained protein was electrophoresed and transferred to PVDF membrane (Mi l ipore) and blocked with 3% skim mi lk.
  • KRS was detected by Western blotting, and a specific method was performed in the same manner as in ⁇ Example 3>.
  • the amount of KRS in cytosol fracture and membrane fracture, respectively showed that when the amount of KRS specifically decreased in the membrane fracture relative to the cytosol fracture after the inhibitor candidate treatment, the inhibitor candidate In fact, it could be judged provisionally to suppress KRS movement.
  • the substance identified as inhibiting the migration of KRS to the cell membrane was designated as LN421 Treated transgenic macrophages to perform a transwell migration assay.
  • Transwell (Corning, # 3421-5 ⁇ ) was coated with gelatin (0.5 mg / ml) and seeded in a top chamber at 264.7 eel 1 (1 ⁇ 10 5 cells / well).
  • Laminin 42KLN421, Biolamina was added to the bottom chamber with 500 ⁇ l of Serum Free DMEM containing l // g / ml.
  • the DMSO or KRS inhibitor compound (in DMSO) was then treated with various concentrations (30 ⁇ M, ⁇ , 300 ⁇ M, ⁇ , 3 ⁇ M, respectively) in the upper chamber. After 24 hours, 70% methanol was fixed for 30 min and stained with 50% hematoxylin for 30 min.
  • FIGS. 5 and 6 are graphs showing the results of a comparison between the compounds BC-K 1-00053 (4 - ( ⁇ (fluorobenzo [d] thiazol- 4-methoxyphenyl) ethyl] amino ⁇ methyl) benzoic acid (Formula 1). As shown in FIG. 5, it was confirmed that the level of KRS in the cell membrane region was significantly increased by the treatment with LN421 by the treatment with BC-KI-00053.
  • a 31G syringe was used to puncture the ear skin (at time D-0) to induce acute inflammatory reaction.
  • Alexa Flour 555 conjugated anti-CD31 antibody was used to label the blood vessels (identified in red).
  • a confocal microscope was used as the imaging device.
  • FIGS. 7A and 7B in the vehicle-treated control group, it was confirmed that monocytes and macrophages were gathered around the wound area (ear hole area) marked with a white circle and infiltrated over a considerably wide range at a high level (Blue circles). In contrast, the level of monocyte and macrophage infiltration in BC-KI-00053-treated mice was significantly reduced.
  • a KRS inhibitor specifically BC-KI-00053
  • Liver Ischemia-Reperfusion Injury Model In order to investigate the effect of KRS's cell migration inhibitor on monocyte infiltration in ischemic immune response, CX3CR1-GFP mouse was used to induce hepatic ischemia-reperfusion injury The Liver Ischemia a-Reper fusion Injury Model was constructed. Monocytes, macrophages and kupffer cells in the CX3CR1-GFP mouse appear green. The mice were given either vehicle or BC-KI-00053 (100 mg / kg, dissolved in vehicle, once daily) (D-2, Dl, D-0) for 2 days from the first day of administration.
  • BC-KI-00053 100 mg / kg, dissolved in vehicle, once daily
  • Tr iad (bi-hepatic, hepatic artery, hepatic vein) occlusion was performed using a 6-0 suture as shown in FIG. Triad occlusion was performed for 30 min to induce acute inflammation, with 3 g of Eppendorf tube hanging from both ends of the suture. Immediately after reperfusion (Oh) and after 24 h, ischemic inflammation site was observed after removal of suture, and anti-CD31 antibody conjugated with Alexa Flour 555 was used for repetitive imaging (red color Can be confirmed).
  • CC1 4 carbon tetrachloride
  • the vehicle and BOKI-00053 100 mg / kg were administered daily, orally, and for 3 weeks from the time three weeks had elapsed since the start of CC1 4 administration.
  • Corn oi 1 Polyethylene glycol 400: Tween 80: Methyl celulose (1%) 20: 30: 1: 49 was used.
  • the animal groups were constructed as shown in Table 1 below.
  • the degree of fibrosis on the liver surface and inside (30-50 depth region) was detected by SHG (Excitation Ation: 780 nm, Detection: 390 nm) of intravenous imaging.
  • BC-KI-00053 In the group to which BC-KI-00053 was administered to normal animals (the animal of (2) in Table 1), no weight loss was observed and no other symptoms were caused in the liver. Therefore, the BC-KI-00053 compound was considered to be innocuous in vivo. Only animals treated with the vehicle (vehicle (3) in Table 1) in the fibrotic animal model died prematurely due to the toxicity of CC1 4 at 4 weeks after the start of the experiment. Specifically, as shown in FIG. 9A, one of the mice died on the 24th day and the other one died on the 32nd day of the 6-week experimental period, and they showed significant weight loss. The pre-terminated experimental group was used for data comparisons after completion of all experiments using the liver surface and internal fibrosis data obtained at 2 weeks and 4 weeks before each death.
  • FIG. 9B significant fibrosis was observed on the surface of the liver (upper part (0 L) of FIG. 9B) after administration of CC1 4 for 2 weeks or 4 weeks.
  • the fibrosis was intensified and the portal-portal septa was found, indicating that severe fibrosis progressed considerably.
  • similar fibrosis patterns were observed in the liver (lower end (30-48 m) of FIG. 9b), and hepatocytes were necrosis.
  • PAH Pulmonary arterial hypertension
  • IHC staining for monocyte / macrophage marker CD68 was performed using the lung tissue of each experimental group.
  • the collected lungs were fixed to paraformaldehyde (PFA) according to a conventional procedure, and then infiltrated with paraffin through water washing, dehydration and transparency.
  • the lung tissue paraffin block of Rat was cut to a thickness of 6 ⁇ and slides were made. Then, dyeing was carried out as follows. After xylene treatment for 3 minutes for 5 minutes, the cells were treated with 100% ethane twice for 2 minutes, 95% ethanol, 9OT ethanol, 70% ethanol and DW for 2 minutes and washed with PBS for 5 minutes (2 times). After treatment of 0.3% 3 ⁇ 4O 2 (10 min), the samples were washed twice with PBS for 5 min.
  • the cells were treated with 1 ml of DAB substrate buffer and 20 ⁇ l of DAB chromogen. After 10 minutes, the cells were rinsed twice with a third DW every 2 minutes. The stained tissues were treated with Mayer 's hematoxylin (Sigma) for 1 min and then treated with 70% ethanol, 90% ethane, 95% ethanol and 100% ethanol for 2 minutes each. Finally, xylene treatment was performed 3 times for 5 minutes, followed by mounting treatment using a mounting solution, and observation with an optical microscope.
  • Pulmonary arterial hypertension is caused by the narrowing of the pulmonary artery, resulting in an increase in the pressure of the right ventricle, resulting in right ventricular failure.
  • the compensatory mechanism is destroyed by persistent hypertension, right ventricular enlargement will occur following right ventricular hypertrophy.
  • the left ventricular end-diastolic volume and cardiac output decrease (Lee et al., Clinical Characteristics and Prognostic Factors of Patients with Severe Pulmonary Hypertension, Korean Circulation J 2007; 37: 265-270).
  • pulmonary hypertension is mainly related to the right ventricle, but it is also related to the function of the left ventricle. As shown in FIG.
  • RVESP right ventricular systolic pressure
  • BC-KI-00053 treatment significantly decreased RVESP concentration-dependently.
  • the RVESP-lowering effect in the BOKI-00053 50 mg / kg treated group was similar to that of sildenafil, one of the standard therapies.
  • BC-KI-00053 had a lower effect on systemic artery pressure compared to sildenafil, and this effect was associated with the risk of hypotension in sildenafil , It would be an advantageous characteristic of the therapeutic agent.
  • severe pulmonary hypertension can be accompanied by low cardiac output and systemic hypotension as right ventricular failure occurs.
  • BC-KI-00053 may be used at higher concentrations to improve cardiac output and systemic blood pressure by improving pulmonary arterial hypertension. If the cardiac output and systemic blood pressure decrease, the patient may experience general weakness or dizziness. Therefore, improvement in cardiac output and systemic blood pressure can be expected to improve these symptoms.
  • KS to the cell membrane inhibitory effect (especially BC-KI-00053) provided by the present invention not only shows the efficacy and symptom relief of PAH treatment but also the risk of occurrence of adverse side effects Of the total population.
  • IHC staining of monocyte / macrophage marker CD68 using the lung tissue of each experimental group showed that monocyte / macrophage infiltration occurred in the lung of pulmonary arterial hypertension (PAH) mice at a high level Respectively.
  • PAH pulmonary arterial hypertension
  • FHH rats were obtained from the University of Mississippi Medical Center and approved by the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). All protocols have been approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Mississippi Medical Center.
  • the rats were fed a refined AIN-76 rodent diet containing food and water at free feed and these rats containing 0.4% NaCKDyets, Bethlehem, PA after weaning.
  • Fawn-hooded hypertensive (FHH) rats are a genetic model of spontaneous hypertension associated with glomerular filtration and proteinuria. To facilitate glomerular injury in the rats, a single (unilateral) kidney extraction was performed and a DOCA strip was implanted.
  • FHH rats were anesthetized with isoflurane and a telemetry transmitter (model TA11PAC40, Data Sciences International, St. Paul, Minn.) was purchased from Williams, JM et al. Am J Physiol Regul Integr Comp Phys Phys. JO 1 (2012). Respectively. Briefly, the procedure was performed under 2 to 3% isoflurane-O 2 , and the catheter of the device was inserted into the left femoral artery and directed upstream to the aorta. The body of the telemetry unit was placed in the lateral space of the left leg lateral cavity) and closed with muscle tissue. The skin was then sutured.
  • TA11PAC40 Data Sciences International, St. Paul, Minn.
  • mice Following single kidney extraction and D0CA transplantation, the rats had a recovery time of 3 days.
  • rats were anesthetized with isoflurane and blood samples were taken to determine creatinine levels. The rats were then flushed through the aorta with 0.9% NaCl 50 ⁇ 1 and perfused with 20 ml of 4% paraformaldehyde. Kidney and heart were collected for histological evaluation.
  • the paraffin sections prepared with 3 ⁇ ⁇ ⁇ thickness were stained with Masson's trichrome to determine the degree of glomerular injury and renal interstitial fibrosis. Images were obtained using a Nikon DS-Fil color camera (Nikon, Melville, NY) and a Nikon Eclipse 55 i microscope with NIS-Elements D 3.0 software. The degree of glomerular injury was assessed by the experimenter to be 0 to 4+ for 30-40 glomeruli / slice without prejudice. 0 represents normal glomeruli, 1+ represents 1-25% loss, 2+ represents 26-50% loss, 3+ represents 51-75% loss, 4+ represents capillary blood vessels within tuft And the loss is 75% or more.
  • Cortical and aquatic fibrosis are thresholded to measure the percentage of blue-stained images, followed by NIS-Elements automated measurement software Lt; / RTI > Immunohistochemical staining (IHC) on CD68, a monocyte / macrophage marker, was also performed on the kidney tissue in the same manner as in Example 8 above.
  • the MAP of BC-KI-00053 treated group was statistically lower than that of vehicle treated group (184.34 days 2.46 mmHg in the control group, 174.4 3.83 mmHg in the test group, P ⁇ 0.05).
  • the MAP results in the vehicle-treated group after 2 weeks of treatment seemed to be relatively stable compared to the results of the first week.
  • MAP of the BC-KI-00053 treated group was shown to be transient but further decreased, showing a significant difference between the two groups (184.22 ⁇ 4.21 mmHg in the control group,
  • the cortical fibrosis was significantly less (19.46 ⁇ 1.18% in the control group, 5.79 ⁇ 0.48% in the control group, P ⁇ 0.05) (17.69 ⁇ 1, 07% in the control group, 7.40 ⁇ 0.56% in the experimental group, P ⁇ 0.05).
  • Control rats exhibited significant cardiac fibrosis, particularly at the right ventricular insertion point, as seen in the slice samples stained with Si r ius red (Fig. Llh).
  • the rate of cardiac fibrosis was significantly reduced in the BC-KI-00053 treated rats (31.97 ⁇ 2.62% in the control group, 9.14 ⁇ 2. 18% in the control group, P ⁇ 0.05).
  • IHC staining for monocyte / macrophage marker CD68 using kidney tissue showed that monocyte / monocyte / macrophage staining in the kidney tissue of the control group (vehicle treatment) It was confirmed that the infiltration of the phagocytes occurred at a high level.
  • KRS treatment with a cell-membrane-transfer inhibitor significantly reduces renal tissue infiltration of monocytes / macrophages.
  • Dahl SS rats were anesthetized with i oflurane and telemetry transmitters (model TA11PAC40, Data Sciences International, St. Paul, Minn.) Were aseptically transplanted in the same manner as described above. After the surgery, rats were housed in separate cages in a quiet, air-conditioned room environment with a 12: 12-h contrast cycle and took one week to fully recover from surgery. Then, to measure urinary protein excretion, the mean arterial blood pressure (MAP) was measured before rats were housed in a metabolic cage. Proteolysis was measured using the Bradford method and BSA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.) As a standard.
  • MAP mean arterial blood pressure
  • FIG. 12d shows data on plasma creatinine concentration in control and experimental Dahl SS rats (control group 752.97 ⁇ 57.80 mg / day, control group 524.55 ⁇ 44.70 mg / day, P ⁇ 0.05).
  • Vehicle-treated plasma creatinine levels were significantly higher in the BC-KI-00053 treated group (0.60 ⁇ 0.02 mg / dL in the control group and 0.55 ⁇ 0.01 mg / dL in the control group, P ⁇ 0.05).
  • HS diet significantly affected the glomerular and coronary lesions morphologically in Dahl SS rats ( Figures 12e, 12f, 12g).
  • the mean glomerular injury score showed a significant reduction in the degree of impairment in rats treated with BC-KI-00053 (2.82 ⁇ 0.05 in the control group, 1.34 ⁇ 0.04 in the test group, P 0.05).
  • significant fibrosis was significantly reduced in the BC-KI-00053 treated group compared to vehicle-treated group.
  • the cortical fibrosis was markedly reduced (control group 19.48 ⁇ 0.96 3 ⁇ 4), the experimental group 6.47 0. 0.46%, P ⁇ 0.05)
  • the blood vessel capillary loss was significantly reduced (23.49 ⁇ 0.99% in the control group, 12.33 ⁇ 0.78 3 ⁇ 4> in the experimental group, P ⁇ 0.05).
  • Example 10 Influence of KRS on cell membrane migration inhibitor in kidney fibrosis and immune cell infiltration in alport syndrome model in vivo
  • mice Boys town hospi tal.
  • Experimental animals were divided into (i) 129 Sv / J wild-type mouse control (0.5% methylcellulose broth), (129) Sv / J alport mouse (C0L4A3 knockout mouse. Cosgrove D et al., Genes Dev. 1996 Dec 1; 10 (23) : 2981-92 control substance (0.5% in the reference to give) methyl saelreul Lawrence's current "takaek) and treated (H i) BC-KI- 00053 treated group the 129 Sv / J mouse Alfort . Each dose group consists of two mice.
  • the KRS-specific antibody was found to be effective in controlling immune cell migration / invasion.
  • an antibody comprising the heavy chain of SEQ ID NO: 21 and the light chain of SEQ ID NO: 23 was used as the anti-KRS antibody.
  • the antibody was referred to as N3 (monoclonal) antibody.
  • the treatment of LN421 increases the KRS level of the monocyte / macrophage cell membrane and that the KRS level of the cell membrane is effectively reduced by the anti-KRS antibody (N3 antibody) treatment.
  • the anti-KRS antibody confirmed the possibility of a new therapeutic agent for diseases in which migration of immune cells such as monocytes / macrophages is problematic.
  • the present inventors have found that when RS migrates from the cytoplasm and is located in the cell membrane, some of the N-terminal region is exposed to the cell even by being embedded in the cell membrane (KRS (preferably SEQ ID NO: 1) 1 to 72 amino acid regions).
  • the antibodies capable of binding to the KS ⁇ N terminal may have a more significant advantage in vivo in inhibiting immune cell migration. It is obvious to those skilled in the art that an anti-KRS antibody that targets other regions of KRS other than the extracellularly-exposed region can inhibit KRS activity through its further intracellular penetration.
  • the N3 antibody is an antibody capable of binding to the KRS N-terminal, and the RS level is specifically reduced at the cell membrane position of the immune cell by the treatment of the antibody
  • PAH Pulmonary arterial hypertension
  • mice 60 mpk was subcutaneously injected to induce PAH at 7 weeks old SD rats (Oriental Bio). Then, the mice were divided into four groups (5 mice per group), and lmpk, anti-KRS antibody (N3 antibody) lmpk or lOmpk, si ldenaf i 1 (positive control) 25 mock human IgG (Thermo Fisher Scientific, mpk for 3 weeks. All antibodies were given iv twice a week and sildenafil daily.
  • the collected lungs were fixed in paraformaldehyde (PFA) according to a conventional procedure, and embedded in paraffin through water, dehydration, and transparency.
  • the lung tissue paraffin block of Rat was stripped to thickness of 6ym and slides were made. After that, dyeing was carried out as follows. After xylene treatment for 3 minutes for 5 minutes, 100% ethane, 95% ethane, 90% ethane, 70% ethane and DW were treated for 2 minutes and washed with PBS for 5 minutes. 0.3% after the treatment of 3 ⁇ 40 2, was washing 2 times for 5 minutes, the sample i in PBS. 0.01M citrate buffer, and then washed with PBS-T 0.03% tween 20).
  • PFA paraformaldehyde
  • the PAH model a disease in which immune cell infiltration is closely related to the pathology, was treated with anti-K S antibody (N3 monoclonal antibody) for 3 weeks at lnipk or 10 mpk (iv, twice a week)
  • the left ventricular end-systolic pressure (RVESP), left ventricular end-diastolic pressure (RVEDP), left ventricular end-systolic pressure (LVESP) -diastol ic pressure (LVEDP) and cardiac output (CO) were measured, and the results are shown in Table 2.
  • RVESP (mmHg) 62.5 5. 5.7 45.0 Sat 8.1 41.2 7. 7.7 48.4 9 9.6
  • RVEDP (mmHg) 2.8 earth 1.5 1.4 1.4 2.2 3.8 earth 1.3 2.6 1.3
  • Pulmonary arterial hypertension is caused by the narrowing of the pulmonary artery, resulting in an increase in the pressure of the right ventricle, resulting in right ventricular failure.
  • the compensatory mechanism is destroyed by persistent hypertension, right ventricular enlargement will occur following right ventricular hypertrophy.
  • the left ventricular end-diastolic volume and cardiac output decrease (Lee et al., Clinical Characteristics and Prognostic Factors of Patients with Severe Pulmonary Hypertension, Korean Circulation J 2007; 37: 265-270).
  • pulmonary hypertension is mainly related to the right ventricle, but it is also related to the function of the left ventricle.
  • RVESP was increased in PAH patients, which was also confirmed in PAH animal models of this study.
  • anti-RS antibody N3 antibody significantly decreased RVESP in both concentrations, and particularly RVESP was reduced more than Sildenafil, a positive control drug.
  • the acute lung injury model was prepared by injecting 2.5 mg / kg of LPS (Sigma) into 7 week old male C57BL / 6 mice (duodenal biopsy).
  • BALF obtained by washing lung with PBS was collected and centrifuged at 800 xg for 10 minutes at 4 ° C to collect pel let.
  • Cells were suspended and then red blood cells were removed using RBC lysis buf fer (eBioscience cat. No. 400-4333-57). After stopping the reaction with PBS and washing 2 times, the cells were suspended in 400 ⁇ l PBS, and the number of cells was measured with a hemocytometer and neutrophil count was measured by Hema3 staining.
  • the lung tissue was collected and spun at 37 ° C for 45 minutes using a gentleMACS Octo Dissociator (MACS Miltenyi Biotec, Order no. 130-095-937).
  • Cell strainer 40 iim was used to filter and centrifuged at 1500 rpm for 5 min at room temperature. The pellet was collected and red blood cells were removed using RBC lysis buffer (eBioscience cat. No. 400-4333-57).
  • FACS buffer PBS containing 1% NaN3 and 3% FBS
  • 50 ⁇ l was added to the tube and well mixed with the same amount of antibody mxiture to block light at 4 ° C for 1 hour Lt; / RTI &gt
  • FITC Rat Anti-CDllb BD Pharmingen
  • PE Rat Ant i -Mouse F4 / 80 BD Pharmingen
  • the lung tissues were paraffin embedded by conventional methods and then resected. After removing the paraffin with xylene, tissue slides were washed with DW and treated with Bouin Fluid at 56-60 ° C for 1 hour. Weigert 's iron hematoxylin solution was stained for 10 minutes, then washed, and then stained with Biebrich scarlet - acid fuchsin solution for 10-15 minutes before washing. Phosphomo lybdi c-phosphotungstic acid solution was treated for 10-15 min, transferred to aniline blue solution and stained for 5-10 min. After washing, 1% acetic acid solution was applied for 2-5 minutes. After washing and dehydration, they were mounted by xylene treatment. Experiment result
  • the number of total immune cells in BALF was increased in the mice induced by LPS treatment, and it was decreased in a dose dependent manner by treatment with anti-KRS antibody (N3 antibody). '
  • FIGS. 21A and 21B show results of FACS analysis of macrophages that have migrated into lung tissue due to acute lung injury.
  • FIG. IMC interstitial macrophages are CDllb + / F4 / 80 + cells, migrating macrophages that do not reside in the lung but migrate to the lungs under certain conditions.
  • LPS treatment increased the invasion of IM into the lungs, but treatment with anti-KRS antibody (N3 antibody) decreased the migration of IM to the lungs in a concentration-dependent manner. It was confirmed that anti-KRS antibody treatment inhibited the migration and infiltration of macrophages / mononuclear cells into lung tissue.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for diseases caused by immune cell migration and a screening method thereof, and more particularly to a therapeutic agent for immune cell migration-related diseases comprising KRS inhibitor (expression or activity inhibitor)
  • KRS inhibitor expression or activity inhibitor
  • a pharmaceutical composition for therapeutic use a method for controlling the immune cell level of KRS, a method for controlling the movement of immune cells through the regulation of the cell membrane site-specific level of KRS or the movement of KRS to the cell membrane, And a method for screening a therapeutic agent for diseases caused by migration.
  • KRS expression or activity inhibitor
  • the use of KRS can regulate the migration of immune cells, which can be very useful in prevention, improvement and treatment of diseases related to immune cell migration, and thus is highly likely to be used in industry.

Abstract

본 발명은, 면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 KRS 저해제 (발현 또는 활성 저해제)를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, KRS의 면역 세포 내 수준 조절, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 KRS의 세포막 으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법, 및 KRS를 이용한 면역 세포 이동에 의한 질환 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 본 발명에 따라 KRS를 이용하여 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이는 면역세포 이동과 관련 한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법
【기술분야】
본 발명은 면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법에 관 한 것으로， 보다 상세하게는 KRS (라이실 tRNA 합성효소) 저해제 (발현 또는 활성 저 해제)를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 적 조성물， KRS의 면역 세포 내 수준 조절， KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방 법， 및 KRS를 이용한 면역세포 이동에 의한 질환 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다.
【배경 기술】
본 출원은 2017년 6월 16일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2017-0076718 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 체내의 여러 조직에서， 각각의 세포는 그들의 유전적 특성과 환경에 따라 다 른 방식으로 이주한다. 통제되지 않은 세포 이동은 염증성 질환， 암 전이 등의 다 양한 질병 상태들과 관계되나， 각각의 세포들이 지니는 이동 시그널링 및 메커니즘 특성이 완전히 규명되지 못한 상태이다. 특히， 각각의 세포에 따라서는 동일한 인 자라도 관계하는 방식이 다른 것으로 보고되어 시그널링 과정 및 메커니즘 규명에 어려움이 더해지고 있는데， 일례로 AQPKwater channel aquaporin-1)은 상피 세포 등에서 세포의 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있으며 특히 암 전이를 촉진시키는 것으로 알려졌지.만 (Haraᅳ Chikuma M et al . , Aquaporin-1 facilitates epithelial cell migration in kidney proximal tubule, J Am Soc Nephrol . 2006 Jan; 17(1)： 39-45； Jiang Y, Aquaporin-1 activity of plasma membrane affects HT20 colon cancer cell migration, IUBMB Life. 2009 Oct ;61(10)： 1001-9) , 대식세 포의 경우 상기 AQP1를 발현함에도 불구하고 이것이 대식세포의 이동을 억제하는 것으로 보고 되었다 (Tyteca D et al . , Regulation of Macrophage Motility by the Water Channel Aquaporin-1: Crucial Role of M0/M2 Phenotype Switch, PLoS One. 2015 Feb 26; 10(2) :e0117398) . 이처럼 각 세포들은 이들의 이동에 여러 가지 방식 및 특성이 존재하기 때문에， 기존에 특정 세포의 이동을 방지하기 위해 설계된 약 물들은 상당히 제한적이고 불층분한 효능을 보이고 있다. 따라서 세포의 이동성 스 위치 (migratory switch)를 제어하고 이주 관련 질병을 치료하는 새로운 전략을 모 색하는 것이 요구되고 있는 실정이다. 한편, 면역세포는 체내의 1차 방어망이기도 하지만, 최근 과도한 면역세포의 활성화가 주요한 병리 기전중의 하나임이 보고되고 있다. 염증성 면역세포의 활성 화시 일반적으로 면역세포의 이동성 증가가 관찰되는데， 구체적으로 다음과 같은 질병들에서 이러한 면역세포 이동 및 침윤이 질병의 병리와 밀접한 관련이 있는 것 으로 보고되고 있다. 일례로， 심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 죽상동맥 경화증과 관상동맥 질환 등이 포함된다 (Ross R et al. , New Engl J Med, 1999:340(2) :115-26, Poli G et al., Redox Biol 2013； 1(1)： 125-30, Libby P et al. , Circulation 2002 ;5； 105(9)： 1135-43) . 죽상동맥경화증은 콜레스테롤에 의한 염증성 질환이고， 동맥 안쪽 막에 침착한 콜레스테롤과 혈액에서 동맥 안쪽으로 이 동한 면역세포로 구성된 죽종에 의하여 발병한다. 즉， 콜레스테를 산화물이 염증을 일으키고 있는 부위로 단핵구와 같은 면역세포가 이동하면서 죽종이 형성된다. 죽 종이 형성될 경우 혈관의 내면은 껄끄러워지고 벽은 두꺼워지면서 혈액이 흐르는 내부의 지름이 좁아져 혈액순환에 장애가 생긴다. 죽종 주위를 둘러싼 섬유성막이 터지면 혈관 안에 혈전이 발생하고， 죽종 안으로 출혈이 일어나 혈관 내경이 급격 하게 좁아지거나 막히게 된다. 주로 심장에 피를 공급하는 혈관, 뇌에 피를 공급하 는 혈관， 콩팔에 피를 공급하는 혈관 및 말초혈관에 발생하여 허혈성 심장질환， 허 혈성 뇌혈관질환 (뇌졸중), 신부전， 사지 허혈성 동맥 질환을 일으킨다. 기존에 이 러한 심혈관계 질환의 발생 및 발달에는 단핵구의 이동을 유도함으로써 염증반웅을 일으키는 CCL2(CCChemokine ligand 2， MCP-1)가 증요한 역할을 수행하는 것으로 알 려져， CCL2의 작용 및 이에 따른 단핵구의 이동을 억제함으로써 상기와 같은 심혈 관계 질환을 치료하는 방법이 새로이 제시되기도 하였다 (Gu L et al., Mol Cell, 1998；2(2) :275-81, Aiello RJ et al . , Arterioscler Thromb Vase Biol 1999； 19(6) :1518-25, Gosling Jl et al . , Clin Invest 1999; 103(6) :773-8, Harrington JR et al . , Stem Cells 2000; 18(1) :65-6， Ikeda U et al . , Clin Cardiol 2002:25(4)： 143-7) . 또한 고혈압에서도 염증성 사이토카인을 분비하는 다 양한 면역세포 등이 혈관으로 과도하게 이동하여 혈관벽이 두꺼워지고, 혈관의 탄 력성을 상실하는 병리가 관계된다. 또한 폐동맥 고혈압 (Pulmonary Arterial Hypertension, PAH)은 폐 고혈압 세 계 보건기구 (WHO) 임상 분류 시스템 (ESC Guidelines, European Heart Journal 2015)의 Group 1으로 분류되며， 호흡곤란, 평균 폐동맥압 (mean pulmonary artery pressure, mPAP)의 상승 (mPAP > 25 隱 Hg) 및 우심실 기능부전을 공통적 임상특징 으로 하는 희귀질환이다. 이러한 폐동맥 고혈압은 유전, 감염， 연관질환 등 여러 가지 선재요인이 관여하지만 혈관손상 (endothelial cell injury)에 따른 면역반응 이 핵심 병리적 요인으로 작용하는 것으로 알려졌다 (Huertas et al . , Circulation, 129:1332-1340, 2014). 이러한 현상에는 면역세포의 침윤과 기능장애 (dysfunct ion) 에 따른 일련의 과정이 병리현상과 깊게 연관되어 있는 것으로 알려졌으며， 특히 PAH에서 면역세포와 혈관내피세포 상호작용이 중요한 것으로 알려졌다. 뿐만 아니 라 최근 알포트 증후군 (Alport syndrome)에 있어서도 단핵구， 대식세포의 침윤이 상기 병의 진행을 촉진시킨다는 보고가 있었다. 한편， 섬유화 (fibrosis) 관련 질병에 있어서， 지속적인 (만성적인) 염증반응 이 상처치유 프로그램 (wound-healing program)을 활성화시키게 되는데 이것이 섬유 증 (fibrosis)으로 이어지게 된다. 조직의 손상 후 단핵구 /대식세포나 호중성 백혈 구， 호산백혈구， 비만세포 등의 염증성 면역세포가 손상 부위로 빠르게 침투 하면 서 활성화되며 여러 사이토카인을 분비하게 되고 이것들은 주위의 섬유아세포나 상 피세포， 평활근세포를 다시 활성화 시켜 이들을 미요브라스트형의 세포로 활성화시 키는데 이 미요브라스트형의 세포는 다량의 세포외 기질 단백질을 생산 분비하게 하여 궁극적으로 조직에 세포외 기질 단백질의 다량 축적을 초래하여 상처를 남기 며 또한 조직의 섬유화나 비대화를 유도하게 된다 (Gurtner GC et al . , Trends Cell Biol. 15 ： 599-607, 2005) . 이 병리 기전은 창상， 화상， 욕창등에 의한 피부 상처시 발생되는 피부 조직 내의 상흔 형성이나 간， 신장， 혈관， 폐 등의 조직의 경화성 섬유화 현상의 근본적인 원인중 하나이다. 또한 만성 자가면역 질환인 경피 증 (scleroderma), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn' s disease) , 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) , 골수 섬유증 (myelofibrosis) , 전 신성 흥반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus)에서도 섬유화는 주된 병리적 특성으로 나타난다. 아을러 아토피 질환， 천식 잘환， C0PD, 건선증， 켈로이드， 증 식성 망막증 등 에서도 염증성 면역세포의 활성화가 병리 현상에 기여한다고 알려 져 있다. 특히， 상기 상처치유 프로그램 (wound— healing program)에 있어서 미요브라 스트형의 세포로 활성화된 섬유아세포를 myofibroblast (근섬유아세포)라고 한다. myofibroblast는 섬유화 (fibrosis) 관련된 모든 질환병리의 중심에 있으므로 myofibroblast의 활성을 유도하는 분자생물학적 혹은 면역학적 기전을 제거하는 것 이 질환치료의 핵심 요소가 된다. 많은 선천적 (innate immunity) 혹은 후천적 (adaptive i醒 unity) 면역이 fibroblast의 활성과 분화에 중요하다는 사실은 널리 알려져 있으며， 이에 상처부위에서 염증반웅을 제거하는 것이 섬유화로의 tissue remodeling 을 중단시키고 정상조직형태를 유지하는 핵심적 요소가 된다. 하지만 실제적으로 염증반웅의 제거가 쉽게 이뤄지지 않으므로 선천적 후천적 면역의 기전 을 이해하여 핵심 매개체 (mediator)를 찾는 것이 섬유화를 늦추는데 중요하다. 단핵구， 대식세포 등은 wound healing에도 기여하는 부분이 있으나 reactive oxygen, nitrogen등을 분비하므로 주변 세포에 해로운 영향을 끼치게 된다. 따라서 단핵구, 대식세포의 신속한 제거가 없다면 조직 손상올 더 유발하게 되며 섬유화를 초래하게 된다. 따라서 상기 질병의 초기에 가장 먼저 반응하는 단핵구， 대식세포 들을 제한하는 것은 다양한 만성 염증 및 섬유화 관련 질환에 있어서 하나의 치료 적 전략으로 여겨진다. 상기 wound-healing 기전이 섬유화 반웅을 촉발 시킬 때， 혈구 응집에 관련 된 PDGF(platelet-derived growth factor)는 다른 염증반웅 면역세포들을 상처부위 로 불러들이고 TGF-βΙ은 국소 fibroblast로부터 세포외 기질 합성을 촉진시키는 것으로 알려졌다. 하지만 상기 혈구응집 반응에 .관련된 요소들은 이들이 결핍된 경 우에도 섬유화를 유도하는 결과를 보임이 보고되었다. 상기와 같이 과도한 면역세포 활성화가 문제되는 질환들에 있어서 기존에 면 역세포들의 이동 (및 침윤)을 막기 위한 타겟 인자 ( target factor )들이 제시되어왔 고 이들을 대상으로 질병의 치료적 방법을 고안하는 시도가 이루어지고 있지만 각 각의 한계점들이 보고되고 있는 실정이며， 이에 따라 효과적인 질병 치료를 위해 여전히 면역세포 이동에 있어서 핵심 매개체 (medi ator )가 무엇인지 이를 제어할 전 략은 무엇인지를 찾는 것이 중요한 해결 과제로서 요구되고 있는 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제]
이에 본 발명자들은 면역세포 이동 (침윤) 관련 질환의 새로운 치료적 전략을 찾고자 연구하던 중， 라이실 tRNA 합성효소 ( lysyl-tRNA synthetase , KRS)가 면역세 포 이동 조절 활성이 있으며 특히， 면역세포 (단핵구 /대식세포)의 세포막 위치에 특 이적으로 KRS 수준이 증가되는 현상이 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대 하여 중요한 병리현상이며 이는 라미닌 (특히, 라미닌 아형 α 4β 2 Υ 1)과 특별한 연 관성을 가짐을 확인하여 이를 이용한 상기 질환의 치료제 스크리닝 전략을 새롭게 고안하였으며， KRS의 발현 또는 활성을 억제하는 K S 저해제의 처리가 섬유화 질 환, 폐동맥 고혈압 등 실제 여러가지 면역세포 이동 및 침윤 관련 질환의 예방 및 치료효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은， 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료 용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은， 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 제제 를 제조하기 위한 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제의 용 도를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은， 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여 하는 것을 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하 는 것이다. 본 발명의 다른 목적은， KRS (라이실 tRNA 합성효소)의 면역 세포 내 수준 조 절， KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절， 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조 절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은,
(A) 시험물질이 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS)를 저해 하는지 여부를 측정하는 단계 :
(B) 면역세포에 라미닌 ( l aminine)을 처리하는 단계; 및
(C) 상기 (A) 단계에서 KRS 저해 활성이 있는 것으로 확인된 시험물질을 (B) 단계의 면역세포에 처리하여 면역세포의 이동을 억제하는지 측정하는 단계를 포함 하는 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하 는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은，
(a) 면역세포에 라미닌 및 시험물질을 처리하고 세포막 위치에서의 RS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동을 모니터링 하는 단계 ; 및
(b) 상기 (a) 단계의 면역세포에서 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동이 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 낮을 경우에 상 기 시험물질을 면역세포 이동과 관련된 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하 는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관 련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역세포 이동 관련 질 환의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 KRS (라이실 tRNA 합성효 소)의 면역 세포 내 수준 조절， KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 RS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법을 제공한 다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은
(A) 시험물질이 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS)를 저해 하는지 여부를 측정하는 단계 :
(B) 면역세포에 라미닌 ( laminine)을 처리하는 단계; 및
(C) 상기 (A) 단계에서 KRS 저해 활성이 있는 것으로 확인된 시험물질을 (B) 단계의 면역세포에 처리하여 면역세포의 이동을 억제하는지 측정하는 단계를 포함 하는 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한 다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은
(a) 면역세포에 라미닌 및 시험물질을 처리하고 세포막 위치에서의 RS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동을 모니터링 하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 면역세포에서 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 RS의 세포막으로의 이동이 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 낮을 경우에 상 기 시험물질을 면역세포 이동과 관련된 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하 는, 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한 다. 정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당 업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술 (skill)의 하나 를 제공한다. Singleton et al . , DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BI0L0TY(2d ed. 1994)； THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed. , 1988)； 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자 (reader) 에게 도움을 주기 위해 제공된다. 본 발명에서 "발현 (expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생 성을 의미한다. 본 발명에서 "숙주세포 (host cell)' '라 함은 임의의 수단 (예: 전기층격법, 칼 슘 포스파타제 침전법， 미세주입법， 형질전환법， 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다. 본 발명에서 용어 조절은 상향 조절 (촉진, 증가， up-regulation) 또는 하향 조절 (억제， 감소， 저해， down-regulation)를 포함하는 의미이다. 본 발명에서 "단백질'' 은 "폴리펩티드 (polypeptide)"와 호환성 있게 사용되 몌 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기 의 중합체를 말한다. 본 발명에서 "KRS 단백질 "은 라이실 tRNA 합성효소로 알려져 있는 폴리펩티 드를 의미한다. KRS는 아미노산 라이신 (lysine)과 tRNA의 아미노아실레이션 (aminoacylation) 반웅을 매개하는 효소이다. 본 발명에서 KRS는 당업계에 라이실 티알엔에이 합성 효소로 알려진 것이라면 그 구체적 기원과 서열 (아미노산 서열 구 성)이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 본 발명의 KRS는 인간 Uio/ sapiens) 유래 의 것으로서 NCBKGenbank) Accession No. NP_005539.1 등으로 공지된 것을 포함하 고， 마우스 ( ί« wusculus) 유래의 것으로서 NCBKGenbank) Accession No. NP_444322.1 등으로 공지된 것을 포함하며 , 혓 Rattus norvegicus) 유래의 것으로 서 NCBKGenbank) Accession No. XP_006255692.1 등으로 공지된 것을 포함하며, 이 외에도 하기의 서열정보를 참조로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다: XP— 005004655.1 (guinea-pig: Cavia porcellus), XP— 021503253. Kgerbi 1， Men ones unguiculatus) , XP_002711778.1 ( r abb i t， Oryctolagus cuniculus) ,
XP_536777.2(dog, Can is lupus familiar is) , XP_003126904.2 (swine, Sus scrofa) , XP_011755768.1(monkey, Macaca newest rina) , XP_008984479.1 (marmoset , Callithrix jacchus) , XP_019834275.1 (cow, Bos indicus) , XP—511115.2 (chimpanzee, Pan troglodytes) .
바람직하게 상기 KRS 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함 하는 것일 수 있고， 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다 (Genbank Accession No. NP—005539.1) . 또한 본 발명에서 상 기 K S는 이의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명에서 KRS 단백질은 바람직하게 세포내 (intracellular) KRS 또는 세포 막에 내재된 상태의 KRS를 의미하는 것으로, 이는 세포 외 (extracellular)로 완전 히 분비된 KRS와는 구별되는 의미이다.
상기 세포 내 KRS는 cytoplasmic form( lysyl-tRNA synthetase, cytoplasmic) 과 mitochondrial form( lysyl-tRNA synthetase, mitochondrial )의 두 가지 아형 (isoform)이 있다. 본 발명에서의 KRS는 바람직하게는 cytoplasmic form이다. 상기 기능적 동등물이란， 공지의 KRS 단백질을 구성하는 아미노산 서열 (바람 직한 일례로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)과 적어도 70% 이상， 바람직 하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성 (즉， 동일성 )을 갖 는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면， 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동 성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로， 모태가 된 상기 공지의 KRS 단백질 (바람 직한 일례로， 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드)과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서，' '실질적으로 동질의 생리활성' '이란 면역세 포 이동을 조절하는 것을 의미한다. 바람직하게， 본 발명에서 KRS의 기능적 동등물 은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가， 치환 또는 결실의 결과 생성된 것, 일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산 (Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산 (lie, Leu, Val), 방향족 아미노산 (Phe, Tyr, Trp) , 산성 아 미노산 (Asp , Glu) , 염기성 아미노산 (Hi s , Lys .Arg , Gin, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys , Met ) . 또한 상기 KRS의 기능적 동등물에는, KRS 단백질의 아미노산 서열상에 서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환 은 바람직하게는 KRS의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 KRS의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분 에 위치한다. 아을러 상기 KRS의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 KRS의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어， 단백질의 안정성， 저장성, 휘발 성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은， 원본 서열 (아미노산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번호 1ᅳ 또는 핵산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열번 호 2)과 후보 서열을 정렬하고 갭 (gaps)을 도입한 후， 원본 서열에 대한 후보 서열 의 동일 매칭 잔기 (아민노산 잔기 또는 염기 )의 백분율로서 정의된다. 필요한 경 우， 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한 단백질 서열 상동성 또는 동질성 판단의 경우에 있 어서， KRS 아미노산 서열의 N-말단， C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서 열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한， 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사 용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨 터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬 한다 (하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분 을 따라) . 상기 프로그램은 디필트 오프닝 페널티 (defaul t opening penal ty) 및 디 펄트 갭 페널티 (defaul t gap penal ty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되 어 사용될 수 있는 PAM250C표준 스코링 매트릭스; Dayhof f et al .， in At las of Protein Sequence and Structure , vol 5， supp 3 , 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어， 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서 열 ( ident i cal matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대웅되는 스팬 (matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭 (gaps)의 수의 합으로 나눈다. 본 발명에서 용어 "라미닌 (laminin)" 은 α , γ 사슬로 이루어지는 헤 테로 삼량체 분자로, 서브유닛 사슬의 조성이 상이한 아이소품 (isoform, 아형)이 존재하는 세포외 매트릭스 단백질이다. 구체적으로는， 라미닌은 5 종의 α 사슬, 4 종의 β 사슬 및 3 종의 γ 사슬의 헤테로 삼량체의 조합으로， 약 15 종류의 아이 소품을 갖는다. α 사슬 (αΐ ~ α5), β 사슬 ( β 1 ~ β4) 및 γ 사슬 ( γ l ~ γ 3) 의 각각의 숫자를 조합하여， 라미닌의 명칭이 정해지고 있다. 예를 들어 αΐ 사 슬， βΐ 사슬， 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN111 이라고 하고， α5 사슬,
1 사슬, 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN511 이라고 하고, α5 사슬， β2 사 슬, 사슬의 조합에 의한 라미닌을 LN521 이라고 한다. 본 발명에서 용어 라미 닌은 라미닌 아형 1종의 단일 성분을 의미할 수도 있고， 또는 2종 이상의 라미닌 아형이 흔합된 라미닌 흔합물을 의미하는 것일 수 있다.
라미닌으로는， 예를 들어 포유동물에서 유래하는 라미닌을 사용할 수 있다ᅳ 포유동물로는， 예를 들어， 마우스, 래트, 모르모트， 햄스테 토끼， 고양이， 개ᅳ 양， 돼지， 소， 말, 염소， 원숭이, 인간을 들 수 있다. 바람직하게 인간 라미닌이 사용될 수 있다. 현재 인간 라미닌에는 15 종류의 아이소폼이 알려져 있으며， 바람 직하게 본 발명의 라미닌 아이소품은 α4를 포함하는 형태일 수 있으며， 보다 구체 적으로는 LN421일 수 있다.
구체적으로 상기 "LN421 단백질" 은 라미닌 아형 α4β2γ1로 알려져있는 폴 리펩티드를 의미하는 것으로서, 당업계에 LN421로 알려진 것이라면 그 구체적 기원 과 서열 (아미노산 서열 구성)이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 상기 LN421에 서 α4 사슬은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고，
2 사슬은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며， 사슬은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람 직하게 상기 LN421에서 α4 사슬은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어 지는 것일 수 있고， β2 사슬은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어 지는 것일 수 있으며， 사슬은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어 지는 것일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 LN421은 이의 기능적 동등물을 포함한다. 이의 기능 적 동등물에 대해서는 전술한 KRS의 기능적 동등물에 대한 설명을 준하며， 이때 " 실질적으로 동질의 생리활성"이란 단핵구, 대식세포 또는 호중구 (neutrophil) 등등 면역세포의 특이적 (선택적) 이동을 조절하는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 KRS 단백질 또는 라미닌 단백질은 천연에서 추출하거나 유 전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면， 먼저 통상적인 방법에 따라 상 기 KRS 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산 (예: 서열번호 2(Genbank Accession No. D32053))을 작제한다. 또는 통상적인 방법에 따라 상기 라미닌 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산 (예: 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9 )을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이메를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대， 자동 DNA 합 성기 (Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서 열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열 (expression control sequence) (예: 프로모터， 인핸서 등)을 포함하는 백터에 삽입시키고, 이로부터 형 성된 재조합 발현 백터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 그 후， 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양한다. 상기 핵산으로부터 발현된 폴리펩타이드 (단백질)는 본원에서 제공하는 발명들의 이용 양태에 따라， 세 포로부터 별도의 분리 및 회수 과정 없이 세포와 함께 제공되어 이용될 수 있고， 또는 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된， 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회 수하는 과정을 필요로 할 수 있다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법 (예컨대， 크 로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티 드 (substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세 포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있 다: Maniatis et al . , Molecular Cloning; A laboratory Manual , Cold Spring Harbor laboratory, 1982； Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. , Second (1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymo 1 ogy , Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymo 1 ogy , Guthrie & Fink(eds . ) , Academic Press, San Diego, Calif, 1991； 및 Hitzeman et al . , J . Biol . Chem. , 255:12073-12080， 1990.
또한， 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성 (Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, . H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아 니지만 액체 또는 고체상 합성， 단편 웅축， F-M0C 또는 T-B0C 화학법이 포함된다 (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al . , Eds. , CRC Press, Boca Raton Florida, 1997； A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press , Oxford, England, 1989) . 본 발명에서 "핵산", "DNA 서열 " 또는 "폴리뉴클레오티드'' 는 단일ᅳ또는 이 중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다 른 제한이 없는 한， 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 흔성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 본 발명에서 "KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드' '는 일례로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노 산서열을 암호화하는 염기 (핵산) 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열올 모두 포함한다. 즉， 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염 기서열을 갖거나, 이에 상보적인 염기 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 서열번 호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번 호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 핵산은 천연에서 분리 되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서 "라미닌을 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 일례로 LN421의 경 우에 있어서 각 사슬을 이루는 서열번호 4， 서열번호 6 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있으며， 또한 상기 염기 (핵산) 서열에 상보적인 염 기서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 바 람직하게는 상기 각 사슬별로 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며， 가장 바람직하게는 서열번호 5， 서열번호 7 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 핵산은 천연 에서 분리되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있 다. 본 발명에서 "아날로그 (analog) ' '라 함은 표준물질 (reference molecule)과 구 조적으로 유사하지만， 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표 적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 표준물질과 비교할 때， 아날로그는 당 업자에 의해 예상될 수 있는 바와 같이 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성
(ut i l i ty)를 가진다. 향상된 성질 (예: 표적 물질에 대한 더 높은 결합 친화력)을 갖는 공지의 화합물 변이체를 규명하기 위한 아날로그의 합성 및 스크리닝은 약리 화학적 분야에 공지된 방법이다. 본 발명에서 "상동체 (homo logues) "라 함은 단백질 및 /또는 단백질 서열을 언 급하는 경우에는 공통의 조상 단백질 (co隱 on ancestral protein) 또는 단백질 서열 에서 자연적으로 또는 인위적으로 유래된 것을 나타낸다. 유사하게 핵산 및 /또는 핵산 서열은ᅳ그들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위 적으로 유래되었을 때 상동하다. 본 발명에서 "접촉 (contact ing) "이라 함은 이의 일반적인 의미 (normal meaning)이며， 2개 이상의 제제 (예: 2개 의 폴리펩티드)를 결합 (combine)시키거나， 제제와 세포 (예; 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내 ( in vi tro)에서 일어날 수 있다. 예컨대， 시험관 ( test tube) 또는 다른 컨테이너 (container )에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용 해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투 ( in si tu) 에서 일어날 수도 있다. 예컨대， 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클 레오티드를 세포 내에서 공동발현 (coexpress i on)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물 에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다. 본 발명에서 용어 '단백질 (KRS)의 세포막으로 (의) 이동' 은 달리 지시되지 않는 한， 어떤 세포의 내인성 단백질 (세포 내부에서 만들어진 단백질로서， 예를들 어 세포질에 존재하던 것)이 동일한 세포의 세포 내 ( int racel lul ar ) 방향으로의 세 포막으로 이동하는 것을 의미한다. 이때 KRS는 완전히 세포 내 방향으로만 존재하 는 것일 수 있고， 또는 세포막사이에 끼어 있어서 일부 (바람직하게 KRS의 경우 N term 일부)가 세포 외로 노출될 수 있으나， 어느 경우에도 단백질이 생성된 세포 밖으로 완전히 분리되는 것을 배제하는 것이 바람직할 수 있다. 즉， 본 발명에서 상기 세포막으로의 이동은， 달리 지시되지 않는 한， 어떤 세포에서 완전히 분리 및 분비된 단백질이 다른 세포 또는 조직의 밖 (extracellular)으로부터 상호작용하는 것과 구분된다. 본 발명에서 용어 '세포막 위치' 는 세포막 그 자체 및， 세포막과 매우 가까 워 실질적으로 세포막과 상호작용하고 있을 것으로 인정되는 인근 (부근)을 모두 포 함하는 의미이다. 본 발명에서 "제제 (agent)" 또는 "시험 제제 (test agent)1'라 함은 임의의 물 질 (substance)， 분자 (molecule)， 원소 (element ) , 화합물 (compound)， 실재물 (entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대， 이에 제한되지는 않으나， 단백질， 폴리텝티드， 소 유기 물질 (small organic molecule) , 다당류 (polysaccharide)， 폴 리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물 (natural product), 합성 화합물 또 는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한， 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게 (interchangeably) 사용할 수 있다. 본 발 명의 제제는， 바람직하게 구체적으로 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme , PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 뉴클레오티드, 항체， 앱타머， 펩티드 (표적물 질 (예를 들어 KRS)에 특이적인 결합도메인을 갖는 펩티드)， 펩티드 모방체 (peptide mimetics), 기질유사체， 천연추출물 및 화합물 (천연화합물 및 합성화합물)을 모두 포함한다. 보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제 제는， 폴리펩티드， 항체， 베타-턴 미메틱 (beta-turn mimetics), 다당류， 인지질， 호르몬, 프로스타글란딘， 스테로이드， 방향족 화합물， 헤테로사이클릭 화합물， 벤 조디아제핀 (benzodiazepines), 을리고머릭 N-치환 글리신 (ol igomeric N一 substituted glycines) , 을리고카르바메이트 (ol igocarbamates) , 당류 (saccharides), 지방산， 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체， 구조적 아날로그 또 는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질일 수 있으며， 다른 시험 제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포 함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합 (combinatorial) 라이 브러리는 스텝ᅳ바이 -스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법 (WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, W0 95/395503 및 W0 95/30642)에 의 해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법 (W091/18980)에 의 해 제조될 수 있다. 박테리아， 곰팡이， 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드 (field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적 (pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아 실화， 알킬화, 에스테르화 반웅 (esterification), 아미드화 반웅 (amidif ication)과 같은 지시되거나 (direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다. 상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처 (natural source), 예컨대， 세포 또는 조직 용해물로부 터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대， 통상적인 방법에 의 해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드， 예컨대， 약 5-30개， 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람 직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적 으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스 (biased)" 랜덤 펩티드의 절단 물일 수 있다. 또한 상기 시험 제제는 "핵산 "일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생 성되는 핵산， 랜덤 핵산, 또는 "바이어스 (biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다. 또한 상기 시험 제제는 소분자 (예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분 석 어세이 (high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리 닝에 유용하다 (Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett. , 8:2409-2414， 1998； Weller, Mol .Drivers. , 3:61-70， 1997； Fernandes , Curr. Opin. Chem. Biol .， 2:597-603， 1998； and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91， 1997). 본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 KRS 전장 단백질 또는 이의 단편 (단편 폴리펩타이드)이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조 될 수 있다. 이런 구조 연구는 KRS에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가 능하게 한다. KRS의 3차원적 구조는 여러 방법， 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모 델링 (crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정 학 (X-ray crystal lography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E. (Prent ice-Hal 1 , New Jersey 1971) , pp.221-239, and Physical Chemistry with Appl i cat ions to the Life Sciences , D. Eisengerg & D. C. Crothers (Ben jam in Cummings , Menlo Park 1979) . KRS의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 5， 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절 (neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있 다: Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J . (Prent ice-Hal 1 , New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthr ich(Wi ley-Inter science, New York 1986). 본 발명에서 "miRNA, siRNA 또는 shRNA' '란, RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 niRNA에 결합하여， 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 siRNA 또는 shRNA는 표 적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 녹다운 (knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있으며， 본 발명의 목적상, KRS의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 'siRNA' 는 목적 단백질을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머 (mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서 열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것일 수 있다. 이때， 상기 센 스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나， 25개의 염기로 구성되는 것이 바람 직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 '안티센스 뉴클레오티드' 는 왓슨 -클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라， DNA, 미성숙 mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합 (흔성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있 는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다, 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열 에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다 (Rothenberg et al. , J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착， 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로 운 형태의 억제제로 고려될 수 있다. 본 발명에서 '펩티드 미메틱스 (Peptide Minetics)' 는 K S 단백질의 결합도 메인을 억제하여 K S 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고， psi 결합 (Benkirane, N.， et al . J. Biol. Chem. , 271:33218-33224， 1996)과 같은， 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성 될 수 있다. 또한， "구조적으로 강제된 (conformational ly constrained)" 펩티드， 사이클릭 미메틱스 (cyclic mimetics), 적어도 하나의 액소사이클릭 도메인 (exocyclic domain), 결합 부분 (결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 미메틱스는 KRS 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 (Park, B. W. et al . Nat Biotechnol 18， 194-198， 2000) 또는 수 용성 수용체 (Takasaki, W. et al . Nat Biotechnol 15， 1266-1270, 1997)와 같은 거 대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며， 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용 할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다 (Wrighton, N. C. et al . Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997). 본 발명에서 '앱타머 (aptamer)' 는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖 는 핵산 분자를 의미한다. 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서， SELEX( systematic evolution of 1 igands by exponential enr i chment )라 불리는 을리고 뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득 할 수 있다 (C. Tuerand L. Gold, Science 249， 505 - 510, 2005； A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990； M. Famulok, et . al . , Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000； D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68， 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정 할 수 있는데， 예컨대， 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다. 본 발명에서 'KRS 항체' 또는 'KRS에 대한 항체' 는 KRS의 항원성 부위에 대 해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명 의 목적상， 상기 항체는 KRS 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며， 다클론 항체， 단클론 항 체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 항체의 중쇄와 경쇄의 아미 노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직할 수 있다.
상기한 바와 같은 KRS에 대한 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 KRS 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청올 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소， 토끼, 양, 원숭이， 말， 돼지， 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 (hybridoma method) (Kohl er 및 Mi lstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511一 519 참 조), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al， Nature, 352:624-628, 1991； Marks et al , J. Mol. Biol. , 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있 다.
또한 본 발명에서 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중 쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라， 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항 체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하 며， 바람직하게 상기 단편은 모 (母)항체의 KRS 결합 친화도의 적어도 50%， 60%. 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디 (diabody)， scFv 등의 형태일 수 있다. Fab( fragment ant i gen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로， 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로， 두 개의 Fab가 중쇄 경첩 (hinge)에서 이황결합 (disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. Fab'는 F(ab')2 단편의 이황결합 을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이 다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변영역 (VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디 (diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고ᅳ 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태 의 단편을 의미한다. .
본 발명에 적용되는 항체는 이에 제한되지 '않으나 일례로 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며， 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다. 본 발명에서 용어 "면역 세포" 는 체내 면역반웅에 관여하는 세포를 의미하 는 것으로서, 당업계에 면역세포로 알려진 것， 특히 인체에 존재하는 면역세포로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 단핵구, 대식세포， 호중구 호산구， 호염구, 수지상세포， 자연살해세포， 거핵구, T 세포 및 B 세포 등을 포함 한다. 바람직하게 단핵구， 대식세포 또는 호중구 (neutrophil)를 의미하는 것 일 수 있다. 면역세포는 KRS를 발현한다. 본 명세서에서 '치료' 는 질환의 발생 또는 재발 억제， 증상의 완화， 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소， 질병 진행 속도의 감소， 질병 상태의 개선， 호전， 완화, 개선된 예후 및 /또는 예방을 포함하는 개념이다. 본 발명에서 사 용되는 용어 '예방' 은 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위 를 의미한다. 본 발명의 용어 '~을 포함하는 (comprising)' 이란 '함유하는' 또는 '특징 으로 하는' 과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추 가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '〜로 구성되는 (consisting of)' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essentially consisting of)' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 '성분 요소 또는 단계와 더불 어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등 을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 '제제 또는 조성물' 은 식품 조성물, 화장료 조성물, 약학 적 조성물 등의 형태일 수 있으며， 특별히 제한되지 않는다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명자들은 KRS가 면역세포 이동 조절 활성이 있음을 최초로 밝혔으며， 특히 면역세포의 병리학적 이동 및 침윤 현상과 관련하여 KRS가 면역세포 (특히， 단 핵구 /대식세포)의 세포질 대비 세포막에서 그 수준이 특이적으로 높아지는 것이 중 요한 병리 현상임을 최초로 규명하였다.
이에， 본 발명자들은 KRS의 발현을 저해하여 면역세포 내 (전체적)수준을 감 소시키는 경우 면역세포 이동이 억제되는 것을 확인하였으며， 이동성 및 침윤성을 띠도록 활성화된 면역세포의 세포막에 증가되어있는 KRS를 세포막 위치에서 특이적 으로 그 수준을 감소시키는 경우 (예를들어, 엔도사이토시스 유도)에 면역세포 이동 을 억제하고 실제 in vi vo 상에서 염증성 질환， 섬유화 질환， 폐동맥 고혈압 등 과 도한 면역세포 침윤에 의한 질환에 대하여 치료 효과를 나타내었으며, 뿐만아니라 KRS가 세포막으로 이동하는 활성을 억제하는 경우에도 면역세포 이동을 억제하여 면역세포 이동 질환의 예방 또는 / 및 치료에 이용할 수 있음을 밝혔다. 따라서 본 발명은， 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 제제를 제 조하기 위한 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase, KRS) 저해제의 용도를 제공한다. 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase, KRS) 저해제를 유 효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 을 제공한다.
또한 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase, KRS) 저해제 로 구성되는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한 다.
또한 본 발명은 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제 로 필수적으로 구성되는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성 물을 제공한다. 본 발명에서 상기 'KRS 저해 (제) ' 는 바람직하게 KRS의 발현 억게 (제) 또는 / 및 활성 억제 (게)를 모두 포함하는 의미이다.
상기 KRS 발현 억제는 KRS의 유전자， mRNA 및 단백질 발현 억제를 모두 포함 하는 의미로서， KRS의 면역세포 내 수준을 감소시키는 방법에 대해서 후술하는 바 와 같이 전사단계， 전사 후 단계， 번역 후 단계 등을 포함하여 각 단계의 발현 산 물의 생성을 억제하는 것을 의미한다.
상기 KRS 활성 억제는， 바람직하게 KRS의 면역세포 이동에 관계하는 임의의 활성 (신호)을 감소， 방지， 예방， 또는 차단하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 상 기 KRS 활성은， 이에 제한되지 않으나， 구체적으로 KRS의 세포 내 수준 또는 안정 성과 연관된 활성， 특히 면역세포 이동과 연관되어 세포막 위치에서 KRS의 존재 수 준 (level)이 증가된 것과 관계된 활성을 포함하며， 이 경우 상기 활성에는 면역세 포 세포막 특이적으로 KRS의 존재수준을 증가시키는데 원인이 되는 활성뿐만 아니 라 세포막에서 KRS가 위치될 때 (존재할 때) 종속적으로 발휘되는 활성을 모두 포함 하는 의미이다. 일례로, 세포막에 KRS의, 존재수준을 증가시키는데 원인이 되는 활 성으로는 KRS의 인산화, KRS의 세포막으로의 이동 활성 등이 있을 수 있고， 세포막 에 KRS가 위치될 때 (존재할 때) 종속적으로 발휘되는 활성으로는， 세포막과 KRS가 상호작용하는 활성， 또는 세포막에서 KRS가 이의 결합인자 (또는 리간드)와 상호작 용 (결합)하는 활성 등을 포함한다. 이러한 활성 억제의 구체예들에 대하여 상세한 내용은 후술하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법에 관한 설명을 참조로하여 이해 된다.
가장 바람직한 구체예로서， 본 발명에서 'KRS 저해' 는 하기 (i), (ii) 및 (iii)에 해당하는 것일 수 있다.
(i) KRS 발현 억제;
(ii) 세포막 위치의 KRS수준 (level) 감소; 및
(iii) KRS의 세포막으로의 이동 활성 억제. 상기 KRS 저해제는, KRS mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티 드， miRNA, siRNA, shRNA, 리보자임 (r ibozyme) , 디엔에이자임 (DNAzyme) 및 PNA(Peptide nucleic acid) 로 이루어진 군; 또는 KRS 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물， 펩티드， 펩티드 모방체 (peptide mimetics), 기질유사체， 앱타머, 항체， 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군에 서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 의하면 면역세포에서 KRS의 발현을 억제시키는 경우 면역세포의 이동이 억제되므로， 본 발명은 구체적 일 양태로서， 프로모터 및 이와 작동가능하 게 연결된 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자를 포함하는 발현백터를 유효성분으 로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상 기에서 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자는 KRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 에 대한 안티센스 RNMantisense RNA) , siRNA shRNA 또는 miRNA일 수 있다. 본 발 명에서 상기 KRS 저해제로서의 siRNA(si-KRS)는 일례로 서열번호 13 내지 서열번호 19로 이루어지는 군에서 선택된 염기서열 (핵산서열)을 포함하는 센스서열과 이에 상보적인 안티센스 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 '프로모터 '란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며， '작동 가능하게 연결된다 (operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러， 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열， 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로. 는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (constitutive promoter) 또는 특정한 위치， 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하 는 프로모터 (inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터， CAG 프로모터 (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199， 1991； Monahan et al .， Gene Therapy, 7:24-30， 2000)， CaMV 35S 프로모터 (Odell et al..Nature 313:810-812， 1985)， Rsyn7 프로모터 (미국특허출원 제 08/991，6이호)， 라이스 액틴 (rice act in) 프로모터 (McElroy et al . , Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터 (Christensen et al ·， Plant Mol . Biol. 12:619—632, 1989)， ALS 프로모터 (미국 특허출원 제 08/409 ,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149； 제 5, 608 ,144호 거 15 ,604 ,121호 제 5， 569 ,597호 제 5, 466 ,785호, 제 5， 399， 680호 게 5 ,268， 463호 및 제 5， 608 ,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용 할 수 있다. 한편. 상기 발현백터는 감염 (infect ion), 형질감염 (transfect ion) 또는 형질 도입 (transduct ion) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 백터를 이용한 유전자 전달 방법은 포유동물 세포에 직접적 으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서， FDA로부터 승인받은 인간에게 사용할 수 있는 방법이다 (Nabel, E. G., et al. , Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스 미드 DNA는 바이러스 백터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발 명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 백터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면， 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제 307, 247호)， pSV16B(국제특허공개 제 91/08291호) 및 pVL1392(PharM igen) 등이 대표적이다. 상기 플라스미드 발현 백터 (plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법， 예를 들어 이에 한정되지는 않으나， 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사， 형질도입 (transduct ion)， 세포융합, 칼슘 포스페이트 침 전법， 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-inediated transfection), DEAE 덱스트란- 매개된 형질감염 (DEAE Dextran— mediated transfection), 폴리브렌—매개된 형질 감 염 (polybrene— mediated transfection), 전기침공법 (electroporat ion) , 유전자 종 (gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세 포 내로 도입할 수 있다 OVu et al., J. Bio. Chem. , 267:963-967， 1992； Wu and Wu, J. Bio. Chem. , 263:14621-14624, 1988).
또한 본 발명의 적용 가능한 방법으로서， 상기 핵산을 포함하는 바이러스 발 현 백터로는 이에 한정되지는 않으나， 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러 스 (adenovirus )， 허피스바이러스 (herpes virus) 및 아비폭스바이러스 (avipox virus), 렌티바이러스 (Lenti virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 백터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러 스 백터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 백터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하 고， 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며， 유전자 형질 감염 후 연속 적인 감염이 유발되지 않는 것이다 (Miller, A.D.， Nature, 357:455-460， 1992). FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 백터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키 지 세포를 이용하여 제조한 것이다 (Miller, A.D. and Buttimore, C. , Molec. Cell Biol. , 6:2895-2902, 1986) . 비-레트로바이러스 백터로는 상기에서 언급한 바와 같 은 아데노바이러스가 있다 (Rosenfeld et al. , Cell, 68 :143-155, 1992； Jaffe et al . , Nature Genetics, 1:372-378， 1992； Lemarchand et al . , Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편 (36kb 게놈)을 운반하고， 매우 높은 역가로 비 -복제세포를 감염시킬 수 있는 능력 이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사 용될 수 있다 (Wolfe, J.H., et al . , Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 이외에 도， 공지된 적절한 바이러스 백터가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한 상기 KRS의 발현을 억제하는 구조 유전자 (예를 들어 antisense RNA, siRNA shRNA 또는 miRNA)는 다른 방법， 예를 들면， 국소적으로， 경구 (설하 적용 포 함) 투여 및 비경구 투여로서 비강， 정맥， 근육 내， 피하 내 또는 다른 적절한 수 단에 의해 투여될 수 있다. 상기 비경구 투여는 주사법 및 점적법을 포함한다. 특 히, 상기 백터는 표적 조직을 치료하기 위한 유효량으로 면역세포 이동 관련 질환 의 병소 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식 기관, 폐 및 기관 지 시스템과 같은 체강 (body cavity)에 있는 병소의 경우에는 본 발명의 구조유전 자 (또는 본 발명의 구조유전자를 포함하는 발현백터)를 함유하는 약학적 조성물을 상기 병소에 의해 영향을 받는 유강 기관 (hoi low organ) 내에 바늘， 도관 (catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다. 이때， X- 선， 소노그램 (sonogram) , 또는 광섬유 시스템 (fiberoptic visualization system)과 같은 영상 장치가 표적조직의 위치확인과 바늘 또는 도관의 주입에 사용될 수 있 다. 그 밖에， 직접적으로 도달할 수 없거나 분석학적으로 분리해낼 수 없는 병소의 경우에는 본 발명의 조성물을 혈액순환계 내로 투여할 수 있다. 또한 본 발명은 구체적 일 양태로서， KRS에 대한 항체를 유효성분으로 포함 하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 서 상기 KRS 저해제로서의 항체는, 일례로 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열 을 포함하는 중쇄 (heavy chain) 및 서열번호 23로 표시되는 아미노산 서열을 포함 하는 경쇄 (light chain)로 이루어지는 것일 수 있다. 또한 본 발명은 구체적 일 양태로서， KRS 저해제로서 하기 화학식 1로 표시 되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역 세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예 에서는 KRS의 세포막으로의 이동을 저해하는 물질로서， 하기 화학식 1로 표시되는 4-( { (7-플루오로벤조 [d]싸이아졸 -2-일) [2-(4ᅳ메특시페닐)에틸]아미노 }메틸)벤조산 을 대표로하여， 다양한 종류의 면역세포 이동 (및 침윤) 관련 질환에 대한 in vivo 질병모델에 적용하여 이의 질환 예방 및 치료 효과를 확인한 바 있다. 하기 화학식
1의 화합물은 본 명세서에서 'BC-KI-00053' 으로도 명명된다.
<화학식 1>
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상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 비대칭 원자를 포함하는 치환기를 가질 수 있으며， 이 경우 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 (R) , (S) , 또는 라세 믹체 (RS) 등의 광학 이성질체로 존재할 수 있다. 따라서， 달리 표기하지 않는 한， 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 (R) , (S) , 또는 라세믹체 (RS) 등의 광학 이성질체를 모두 포함한다. 본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있 다. 상기에서 '약학적으로 허용가능한 (허용되는) '이란 생리학적으로 허용되고 인간 에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이 와 유사한 반웅을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 염은 통상의 산 부가염， 예를 들어 염산， 브롬산, 황산 또는 인산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 구연산, 초산, 젖산， 주석산, 말레인산， 푸마르산， 포름산， 프로피온산， 옥 살산， 트리플로오로아세트산， 벤조산， 글루콘산， 메탄술폰산， 글리콜산， 숙신산，
4-를루엔술폰산， 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한， 상기 염은 통상의 금속염 형태, 예를 들어 리튬， 소듐， 또는 칼륨 과 같은 알칼리 금속염; 칼슴 또는 마그네슘염과 같은 알카리 토금속염; 또는 크롬 염을 포함한다. 또한 적당한 유기 리간드들로 형성된 염， 예를 들면 4차 암모늄염 을 포함하며， 디사이클로핵실아민 또는 N-메틸 -D-글루카민염과 아르기닌과 라이신 등으로 형성된 아미노산염을 포함한다. 본 발명에서 용어 "면역세포 이동 관련 질환" 은， 당업계에 과도한 면역세포 이동 (또는 /및 침윤)이 주요한 발병 기전인 것으로 공지된 것이라면 그 구체적 종류 가 특별히 제한되지 않으나， 예를들어 심혈관 질환， 섬유화 질환， 염증성 질환 및 알포트 증후군 (Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 심혈관 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나， 예를들어 고 혈압 (고혈압에 의한 염증성 합병증 포함)， 폐동맥 고혈압， 죽상동맥경화， 협심증， 심근경색증， 허혈성 뇌혈관질환， 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선 택되는 것일 수 있다.
상기 섬유화 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 경피증 (scleroderma) , 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn' s disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증 (pulmonary fibrosis) , 간 섬유증 (hepathic fibrosis) , 간경변증 (liver cirrhosis), 신장 섬유증 (kidney fibrosis), 사구체 경화증, 근섬유증 (myofibrosis), 심장 섬유증， 간질성 섬유화증， 췌장 섬유화증， 비장 섬유화증, 종 격막 섬유화증, 혈관 섬유화증， 피부 섬유화증, 눈 섬유화증， 황반 변성， 관절 섬 유화증 갑상선 섬유화증 심내막심근 섬유화증, 복막 섬유화증， 복막후 섬유화 증， 진행성 종괴성 섬유화증， 신원성 전신섬유화증， 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu) , 유전성 섬유증, 감염성 섬유증， 자극성 섬유증， 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증， 외과수술의 섬유성 합병증， 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증， 당뇨성 섬유증， 고 혈압에 의한 섬유증 및 스텐트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선 택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 그 종류가 특별히 제한되지는 않지만， 바람 직하게는 자가 면역 질환， 염증성 장 질환， 피부염 (예를들어 아토피성 피부염， 습 진， 건선증 등)， 당뇨성 안질환 (당뇨병성 망막증 등)， 복막염， 골수염， 봉소염， 뇌 막염， 뇌염， 췌장염， 외상 유발 쇼크， 기관지 천식， 비염， 부비동염， 중이염， 폐 렴， 위염， 장염, 낭포성 섬유증， 졸증 (卒中， 뇌졸중 등)， 기관지염， 세기관지염， 간염 (간경변, 무알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis) 등), 신장염 (당 뇨병성 신부전증 등), 단백뇨증，.관절염 (건선성 관절염, 골관절염 등), 신경염 (당 뇨병성 신경병증 ， 다발성 경화증 등)， 통풍， 척추염， 라이터 증후군， 결절성 다발 동맥염， 혈관염， 루게릭병， 베게너 육아종증 과사이토카인 혈증 (hypercytokinemia), 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염， 칼슴 결정 침착 관절병증， 가성 통풍, 비—관절 류마티즘， 점액낭염， 건초염， 상과염 (테니스 엘보)， 신경병증성 관절 질환 (Charcot's joint), 출혈성관절증 (hemarthrosis)， 헤노흐—쉔 라인 자반병， 비후성 골관절병증， 다중심성 세망조직구종， 수르코일로시스 (surcoilosis), 혈색소증， 겸상 적혈구증， 고지단백혈증， 저감마글로불린혈증, 부 갑상선기능항진증， 말단거대증， 가족성 지중해열, 베하트 병， 전신성 홍반성 루푸 스， 재귀열, 건선， 다발성 경화증， 패혈증， 패혈성 쇼크， 급성 호흡곤란 증후군， 다발성 장기부전， 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease) , 급성 폐손상 (acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애 (broncho— pulmonary dysplasia) 로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며， 또한 만성 염증질환을 포함한 다.
본 발명에서 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전^! 흥반 성 낭창, 건선， 천식, 궤양성 대장염， 베체씨병， 크론씨병， 다발성 경화증， 피부근 염， 교원병， 혈관염， 관절염， 육아종증， 장기 특이적 자가면역병변, 궤양성 대장염 및 GvHD (이식편대 숙주 반웅 질환: graft-versus-host disease)으로 이루어진 군 에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 만성 염증 질환은 전술한 염증성 질환의 종류를 참조로 하여 이들이 만 성 (chroni c)화 된 상태를 포함하는 의미이며 , 이들의 바람직한 일례로는 천식 아 토피성 피부염， 습진， 건선증， 골관절염， 통풍， 건선성 관절염， 간경변， 무알콜성 지방간염, 만성폐쇄성 폐질환， 비염， 당뇨병성 망막증， 당뇨병성 신부전증， 당뇨병 성 신경병증 및 다발성 경화증 둥이 있으나， 이에 제한되지 않는다. · 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 KRS 저해제 물질들을 단독으로 함유하 거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태의 각종 약학적 제형으로 제형 화 될 수 있으며， 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대， 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여 용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제， 활탁제, 붕해제， 부형제， 가용화제， 분산제， 안정화제, 현탁화제， 색소 및 향료를 사용할 수 있으며 , 주사제의 경우에는 완층제， 보존제， 무통화제， 가용화 제， 등장제 및 안정화제를 흔합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제， 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다. 구체적으로, 경구 투여용 담체 는 락토스， 전분， 셀를로스 유도체， 마그네슘 스테아레이트， 스테아르산 등을 포함 할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한， 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일， 식염수， 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적 합한 안정화제로는 아황산수소나트륨， 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항 산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드， 메틸 -또는 프로필 -파라 벤 및 클로로부탄을이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활 제, 습윤제, 감미게， 향미제， 유화제， 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖 의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington ' s Pharmaceut i cal Sc iences , 19th ed . Mack Publ i shing Company , East on , PA, 1995) .
이와 같이 본 발명의 KRS 저해제를 포함하는 약학적 조성물의 제형은 상술 한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 흔합하여 다양한 형태로 제형화될 수 있 다. 크게， 후술하는 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말， 과립， 정제， 환제， 당 의정제， 캡술제， 액제， 겔제, 시럽게， 슬러리제， 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어， 경구용 제제는 활성성분을 고체 부 형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 흔합물로 가공 함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈， 텍스트로즈, 수크로즈， 솔비를 만니를， 자일리를， 에리스리를 및 말티를 등을 포 함하는 당류와 옥수수 전분， 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분 류， 셀를로즈,메틸 셀를로즈， 나트륨 카르복시메틸셀를로오즈 및 하이드록시프로필 메틸-셀롤로즈 등을 포함하는 셀를로즈류， 젤라틴， 폴리비닐피를리돈 등과 같은 층 전제가 포함될 수 있다. 또한 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피를리돈， 한천， 알 긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항웅집제, 윤활제， 습윤제， 향료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제， 크림제， 로션제, 외용연고제, 오일 제， 보습제， 겔제， 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형 태로 제조할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 (Remington ' s Pharmaceut i cal Sc i ence , 19th ed . , Mack Publ i shing Company , East on , PA , 1995)에 기재되어 있다. 본 발명의 상기 KRS 저해제 또는 /및 이를 포함하는 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구적으 로 투여할 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다.
비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점 적법올 포함하며， 이에 한정되지는 않으나， 예를 들어 정맥 내, 복강 내， 뇌 내， 피하， 근육내， 안내， 동맥 내， 뇌척수 내， 골수 내， 경막 내， 심장 내, 경피， 피 하， 비강 내， 장관， 국소， 설하， 직장 내 또는 병변 내 경로에 의한 주사 또는 주 입， 또는 하기 기재된 서방성 (sustained release) 시스템에 의한 주사 또는 주입 일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 일례로 상기 KRS 저해제 또는 이를 함유하는 조성물은 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (mul t iple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방 법 ( fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1kg 당 약 0.01 ig 내지 10 , 000mg , 가장 바람직하게는 0. 1//g 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학 적 조성물의 용량은 제제화 방법， 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연 령， 체중， 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로， 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 또한 본 발명은， 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제 를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것 을 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한， 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제로 구성되 는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제로 필수적 으로 구성되는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때， 면역세포 이동, 면 역세포 침윤， 또는 이로 인한 질환의 개선， 치료, 예방 효과를 나타내는 양을 말하 며， 투여 용량에 관하여 전술한 바를 참조로 하여 이해된다. 상기 '개체' 란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자 (pat i ent ) 일 수 있다. 본 발명자들은 KRS가 면역세포 이동 조절 활성이 있음을 최초로 밝혔다. 따 라서 본 발명은 KRS의 면역세포 이동 활성 (신호) 조절을 통해 면역세포 이동을 조 절하는 맣법이 개시된다. 특히 면역세포의 세포막 위치에 특이적으로 KRS 수준이 증가되는 현상이 면역세포 이동 및 침윤 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 KRS (라이실 tRNA 합성효소)의 면역 세포 내 수 준 조절, KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절， 또는 KRS의 세포막으로의 이 동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방법을 제공한다. 이때 상기 방법이 수행되는 개체는， 면역세포 이동의 조절이 필요한 개체라 면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며， 사람 (Homo sapi ens )을 포함하는 포유동물 등에서 상기 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게 상기 개체는 사람을 제외한 동물 일 수 있다. 상기 KRS의 세포 내 수준 조절에 따른 면역세포 이동 조절에 대하여 이를 보 다 상세히 설명하면, 라이실 tRNA 합성효소 (KRS)의 면역세포 내 수준을 감소시키 는 경우 면역세포 이동을 억제할 수 있으며， 라이실 tRNA 합성효소 (KRS)의 면역세 포 내 수준을 증가시키는 경우 면역세포의 이동을 촉진 (증진， 증가) 할 수 있다. 세포내 수준의 감소 또는 증가는 상기에서 기재한 바와 더불어 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있다.
전사 단계에서의 조절 방법으로서， 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진 시키기 위한 방법으로는， 예를들면， 프로모터에 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현백터를 제조하여 상기 유전 자의 발현을 증진시키는 방법， 또는 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하 는 유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하 는 방법이 사용될 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 유전자의 발현을 억제하기 위 한 방법으로는， 예를 들면 프로모터 또는 유전자 부위의 돌연변이를 유도하여 프로 모터 활성 또는 단백질의 기능을 저해하는 방법， 안티센스 (ant i sense) 유전자를 발 현시키는 방법， s i RNA 또는 마이크로 RNA(rtiiRNA) 방법 등에 의해 수행될 수 있으나， 이에 제한되지 않는다 .
전사 후 단계에서의 조절 방법으로서， 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증 진 또는 저해시키기 위한 방법으로는， 예를 들면， KRS 또는 이에 대한 기능적 동등 물을 암호화하는 유전자를 주형으로 전사된 niRNA의 안정성을 증진 또는 저해하는 방법， 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성을 증진 또는 저해하는 방법 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 활성을 증진 또는 저해하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법의 보다 구체적인 예로 1군 인트론 타입， Ml RNA 타입， 망치머리 (hammerhead) 형, 또는 머리핀 (hai rpin) 형 또는 마이크로 RNA 형 등의 전사된 mRNA 에 작용하는 RNA를 암호화하는 DNA서열로 형질전환하거나， 표적 유전자 서열과 동 일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환을 통한 동시억제 (cosuppress ion)를 유도할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포 (면역 세포) 내 수준을 조절하는 것은， 상기 KRS 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현올 증가 또는 감소시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가 또는 감소시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조 합 발현백터를 제조하여 그 발현을 증진시키거나, 프로모터에 KRS에 대한 안티센스 또는 siRNA 폴리뉴클레오티드를 연결한 재조합 발현 백터를 제조하여 그 발현을 '감 소시킬 수 있다. 이 때 상기 KRS 또는 이에 대한 기능적 동등물을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 KRS에 대한 s iRNA 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서 열번호 13 내지 서열번호 19로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열 (핵산서열)을 포함할 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 상기 KRS의 세포막 위치 특이적 존재수준 조절에 따른 면역세포 이동 조절에 대하여 이를 보다 상세히 설명하면， KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 감 소시키는 경우 면역세포 이동을 억제할 수 있으며， KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 증가시키는 경우 면역세포의 이동올 촉진 (증진， 증가) 할 수 있다. 세포막 위치 특이적으로 KRS의 수준 감소 또는 증가는 당업자에게 기재된 공 지의 여러 방법으로 조절 될 수 있다.
세포막 위치 특이적으로 KRS의 수준 감소는， 일례로 KRS의 세포막으로의 이 동을 억제하는 방법 또는 수단에 의하여 달성될 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 구체적으로， 본 발명의 일 실시예에서는 KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 화합 물 (화학식 1의 BC-KI-00053)을 이용하여， 면역세포 이동이 억제됨을 확인한 바 있 다. 또한 KRS에 대한 항체 (ant i -KRS 항체)와의 결합에 의하여 이러한 이동이 저해 될 수 있을 것으로 보이몌 이러한 경우 항체의 구체적 타겟 항원성 부위에 따라서 는 세포 내 침투를 위한 추가의 처리가 필요할 수 있다. 항체의 세포 내 침투를 위 한 기술들은 당업계에 잘 알려져 있으며， 일례로 임의의 세포 투과성 펩타이드의 부착 등의 수단을 이용할 수 있으며， 이는 US9598465B2 , US20160009772A1 등의 문 헌을 참조로 할 수 있다. 이외에도 항체의 세포 내 침투를 위하여 W02017204606A1 등의 문헌을 참조로 할 수 있다.
또한 세포막 위치 특이적으로 KRS의 수준 감소는, 일례로 사후 (事後)적으로 세포막 위치에 존재하는 KRS의 엔도사이토시스를 촉진시키는 방법 또는 수단에 의 하여 달성될 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 또한 본 발명의 일 실시예에서는 ant i -KRS 항체가 세포막에 위치한 KRS에 대하여， 이의 세포 외로 돌출된 N-term 영 역 (KRS N—말단의 1 내지 72개의 아미노산에 해당하는 영역)에 결합한 후 세포 내 로 엔도사이토시스를 유발하고, 이에 의하여 면역세포 이동이 억제되었음올 확인한 바 있다. 세포막 위치 특이적으로 KRS의 수준 증가는， 일례로 KRS의 세포막으로의 이 동을 촉진하는 방법 또는 수단에 의하여 달성될 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 일례로， 라미닌， 특히 LN421을 처리하는 것에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 LN421을 면역세포에 처리하는 경우에 세포막 위치에서 특이적으로 KRS 수준이 증가되는 것을 확인한 바 있다. 또 다른 일례로 KRS의 인산화를 유발 또는 촉진하는 임의의 물질이 사용될 수 있으며， 이에 제한되지 않으나 인산화효소 (kinase) 류의 물질이 사용될 수 있다. 상기 KRS의 세포막으로의 이동 조절에 따른 면역세포 이동 조절에 대하여 이 를 보다 상세히 설명하면， 세포질에 존재하는 라이실 tRNA 합성효소 (KRS)의 세포막 으로의 이동을 감소시키는 경우 면역세포 이동을 억제할 수 있으며， 라이실 tRNA 합성효소 (KRS)의 세포막으로의 이동을 증가시키는 경우 면역세포의 이동을 촉진 (증 진， 증가) 할 수 있다. 이는 전술한 바를 참조로 이해된다. 전술한 바와 같이， 본 발명자들은 KRS가 면역세포 이동 조절 활성이 있음을 최초로 밝혔으며, 또한 이러한 KRS의 면역세포 내 행동 양상과 관련하여 라미닌 (특 히， 라미닌 아형 α4β2γ1)과의 특별한 관련성을 가짐을 확인하였다. 이러한 신규 한 발견을 기반으로， 본원 발명은 면역세포 이동 및 침윤에 의한 질환 치료제를 발 굴하는 새로운 스크리닝 수단을 제공한다.
따라서， 본 발명은
(Α) 시험물질이 KRS를 저해하는지 여부를 측정하는 단계 :
(Β) 면역세포에 라미닌 (laminine)을 처리하는 단계; 및
(C) 상기 (A) 단계에서 KRS 저해 활성이 있는 것으로 확인된 시험물질을 (b) 단계의 면역세포에 처리하여 면역세포의 이동을 억제하는지 측정하는 단계를 포함 하는 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법과
상기 스크리닝 방법으로 선별된 제제를 유효성분으로 포함하는 ¾역세포 이 동과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 스크리닝 방법은 당업계에 공지된 다양한 생화학적 및 분자생물학적 기 술이 상기 방법을 실시하는데 이용될 수 있다. 상기 기술은 다음의 문헌에 개시되 어 있다: Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, N.Y. , Second (1998) and Third(2000) Editions; and Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons , Inc. , New York( 1987-1999). 먼저, 상기 시험 제제가 먼저 KRS의 발현 또는 (생물학적)활성을 조절하는 능력이 있는지 어세이한다 ((A) 단계， 1차 어세이 단계). 구체적으로 1차 단계에서 는 시험 제제의 존재 하에서 KRS의 발현 또는 생물학적 활성을 어세이 (assay)하여， KRS의 발현 또는 생물학적 활성을 조절하는 조절 제제 (modulating agent)를 규명 (identify)한다.
구체적으로， 1차 어세이 단계에서， 시험 제제는 KRS의 발현 수준 조절 능력 이 있는지， 예컨대， 전사 또는 번역을 조절하는 능력이 있는지에 대하여 어세이 (assay)될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 어세이 과정에서 KRS 발현 수 준 측정을 위한 공지의 방법이 제한없이 사용가능하다. 본 발명에서 용어 'KRS 발 현 수준 측정' 은 KRS 단백질 자체 또는 KRS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (유전자 또는 mRNA 등의 전사체 포함)의 발현수준을 측정하는 것을 모두 포함하는 의미이 다.
상기 단백질 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의 한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 웨스턴 블랏， EL ISA (enzyme- l inked immunospeci f i c assay) , 방사선면역분석, 방사선 면역 확산 법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동， 면역염색법 (면역조직화학염 색 및 면역형광염색 등 포함) , 면역침전 분석법， 보체 고정 분석법， FACS(Fluorescence act ivated eel 1 sorter ) , 발광 분석 ( luminescence assay) 또는 단백질 칩방법 중 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 (유전자 또는 mRNA 등의 전사체 포함)유전자 발현 수 준 측정은 당업계에 공지된 유전자 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 PCR(polymerase chain react ion) , R ase 보호 분석법， 노던 블랏팅 (northern blott ing) , 서던 블랏팅 (southern blott ing) , 발광 분석 ( luminescence assay) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이 용하는 것일 수 있다. 또한 1차 어세이 단계에서, 시험제제가 KRS의 여러 생물학적 활성에 대한 조 절 능력이 있는지 어세이될 수 있다. 예컨대， 시험 제제는 KRS의 세포 내 수준 또 는 안정성 (예컨대 번역 후 수식 (post-trans l at i onal modi f i cat i on)에 대한 영향， KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 또는 안정성에 대한 영향， KRS의 엔도사이토 시스 유발 여부， KRS가 활성을 나타내는 위치로의 이동과 관련된 활성 조절 여부， 세포막으로의 이동 여부， 결합인자와의 결합여부， 세포이동을 촉진하는 시그날 조 절 기능 변화 여부, 또는 세포막과 상호작용하는 활성이 있는지에 대하여 어세이될 수 있다. 상기 1차 어세이 단계에서 KRS를 저해하는 제제의 선별은， 본 명세서에서 'KRS 저해' 에 대해서 전술한 것을 참조로 하여 판단될 수 있다.
KRS 단백질의 활성에 영향을 주는 시험제제의 선별을 위한 상기 1차 어세이 과정은, 먼저 시험제제가 KRS와 결합하는 능력이 있는지 어세이될 수 있다. KRS에 대한 시험 제제의 결합은， 예컨대， 표지된 시험관 내 단백질-단백질 결합 어세이，
EMSA(electrophoretic mobility shift assays), 단백질 결합을 검출하기 위한 면역 어세이， 기능적 어세이 (인산화 어세이 등) 등과 같은 다양한 방법으로 어세이될 수 있다 (U.S. Pat. Nos. 4,366,241:4,376,110； 4,517,288 and 4,837,168； and Bevan et al. , Trends in Biotechnology, 13:115—122， 1995； Ecker et al . , Bio/Technology, 13:351-360, 1995； and Hodgson, Bio/Technology, 10:973- 980， 1992). 시험 제제는 KRS와의 직접적인 결합, 예컨대， KRS에 대한 항체에 의한 RS 폴리펩티드와의 공동 -침전 (co-immunoprecipitation)을 검출함으로써 확인될 수 있 다. 또한 시험 제제는 KRS와 시험 제제의 결합을 나타낼 수 있는 시그널， 예컨대， 형광 뭔칭 (quenching)을 검출함으로써 확인될 수 있다. 당업계에 통상적으로 실시되고 있는 다양한 어세이들이 KRS를 조절하는 제제 를 규명하는데 사용될 수 있다. 바람직하게， 상기 제제는 세포 기반 어세이 시스템 (cell based assay system)으로 스크리닝될 수 있다. 예컨대， 스크리닝하기 위한 전형적인 세포 기반 어세이에서， 시험 제제의 존재 하에서 리포터 유전자 활성 (예: 효소 활성)을 측정하고， 이를 시험 제제의 부재 하에서의 리포터 유전자의 활성과 비교한다. 상기 리포터 유전자는 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 폴리펩티드 (반응 또는 리포터 폴리펩티드)， 예컨대， 형광 또는 인광 (phosphorescence)에 의해 검출가능한 폴리펩티드나 그것이 보유하고 있는 효소 활성에 의해 검출가능한 폴리 펩티드를 암호화할 수 있다. 검출가능한 반응 폴리펩티드 (detectable reponse polypeptide)는， 예컨대， 루시퍼라제， 알파-글루쿠로니다제 (glucuronidase) , 알파— 갈락토시다제， 클로람페니콜 아세틸 전이효소， 녹색 형광 단백질， 강화된 녹색 형 광 단백질 및 인간 분비된 알칼린 인산화효소일 수 있다.
세포 -기반 어세이에서， 시험 제제 (예: 펩티드 또는 폴리펩티드)는 숙주세포 내에 존재하는 다른 백터에 의해 발현될 수 있다. 어떤 방법에서는, 시험 제제의 라이브러리가 상기 백터의 라이브러리 (예 : cDNA 라이브러리 )에 의해 암호화된다. 상기 라이브러리는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있으며 (Sambrook et al. and Ausubel et al . , supra) , 또는 다양한 상업적인 출처로부터 얻어질 수 있다. 상기 세포 -기반 어세이 이외에， 비 -세포 기반 방법에 의해서도 스크리닝될 수 있다. 상기 방법은， 예컨대， 효소면역측정법 (ELISA), 표면플라스몬공명 (surface plasmon resonance, SPR) , 유세포 분석 (flow_cytometry analysis) 등을 활용한 어세이， 모빌리티 쉬프트 DNA 결합 어세이 (mobility shift DNA— binding assays) , 메틸화 및 우라실 간섭 어세이 (methyl at ion and uracil interference assays), DNase 및 히드록시 라디칼 풋프린팅 분석 (DNase and hydroxy 1 radical footprint ing analysis) , 형광 편광 (fluorescence polar izat ion) 및 UV 교차결합 (crossl inking) 또는 화학적 가교제 (cross— 1 inkers)를 포함한다. 일반적인 개요는 Ausubel 등의 문헌에 개시되어 있다 (Ausubel et al . , supra, chapter 12, DNA-Protein Interaction). 핵산 및 DNA/RNA 결합 단백질을 포함하는 공동-결합된 단백질 (co-associating protein)을 분리하는 기술은， 절단가능한 가교제 디티오비 ^(dithiobis)(succinimidyl propionate) 및 3, 3'一디티오비스
(sulfosuccinimidyl-propionate)를 포함하는 UV 교차 결합 또는 화학적 가교제를 포함한다 (McLaughlin, Am. J. Hum. Genet ·， 59 :561-569, 1996； Tang, Biochemistry, 35:8216-8225， 1996； Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 93:10712， 1996； and Chodosh, Mol . Cell. Biol. , 6:4723-4733， 1986). 구체적으로， 경쟁 어세이 (competition assays)는 KRS에 특이적으로 결합하는 시험 제제를 규명하는데 적당한 포맷 (format)을 제공한다. 본 발명은 당업계에 공 지된 다양한 결합 분석 (binding assay)에 따라 고성능 (high throughput) 방식으로 실시할 수 있다. 상기 포맷에서， 시험 제제는 KRS와 결합하는 것으로 이미 공지된 화합물과의 경쟁을 통해 스크리닝된다. 공지된 결합 화합물은 합성 화합물일 수 있 다. 또한 그것은 KRS를 특이적으로 인식하는 항체， 예컨대， KRS에 대한 단일클론 항체일 수 있다. 만일 시험 제제가 상기 공지된 화합물의 결합을 저해한다면， 상기 시험 제제는 RS에도 결합한다.
다양한 종류의 경쟁 어세이들이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대， 고체상 직 접 또는 간접적 효소 방사면역측정법 (solid phase direct or indirect radioimmunoassay, RIA) , 고체상 직접 또는 간접적 효소 면역측정법 (EIA), 샌드위 치 경쟁 어세이 (Stahli et al .， Methods in Enzymology, 9:242-2453， 1983)； 고체 상 직접 바이오틴-아비틴 EIA Kirkland et al .， J. Immunol. , 137 :3614ᅳ 3619， 1986)； 고체상 직접 표지화된 어세이， 고체상 직접 표지화된 샌드위치 어세이 (Harlow and Lane, Antibodies, A laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press , 1988)； 1251를 이용한 고체상 직접 표지 RIA(Morel et al . , Mol. I隱 un으， 25(1) ;7-15， 1988； 고체상 직접 바이오틴-아비틴 EIA(Cheung et al . , Virology, 176:546-552, 1990)； 및 직접 표지화된 RIA(Moldenhauer et al., Sacnd. J. Immunol . , 32:77-82, 1990). 일반적으로 상기 어세이들은 비표지화된 시험 제제 및 표지화된 대조 화합물을 포함하고 있는 세포 또는 고체 표면에 결합되어 있는 정제 된 폴리펩티드의 이용을 포함한다. 경쟁적 저해는 시험 제제의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 경쟁 어세이쎄 의해 규명된 조절 제제는 대조 화합물과 동일한 에피토프에 결합하는 제제 및 입체 저해 (steric hindrance)가 일어나도록 하기 위해 대조 화합물에 의해 결합된 에피토프 에 충분하게 근접한 인접 에피토프와 결합하는 제제를 포함한다. 통상적으로 경쟁 저해가 과도하게 존재할 때, 일반적인 표적 폴리펩티드에 대한 대조 화합물의 특이 적인 결합이 적어도 50% 내지 75% 저해될 것이다.
상기 어세이는 불용성 또는 용해성 포맷일 수 있다. 불용성 어세이의 일 예 는 KRS 또는 이의 단편을 고체 상 매트릭스에서 고정화하는 것이다. 이후， 시험 제 제가 결합하기에 충분한 시간 동안 고체상 매트릭스를 시험 제제와 접촉하여 둔다. 이후， 고체상 매트릭스로부터 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거한 후， 고체상에 결합된 제제의 존재를 확인한다. 상기 방법은 고체상 매트릭스로부터 결합된 제제 를 용리하여 제제를 분리하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 양자택일적으로, KRS를 고정화시키는 다른 방법은 시험 제제를 고체상 매트릭스에 결합시킨 후， RS를 첨 가하는 것이다. 용해성 어세이는 위에 기재된 몇몇 결합 라이브러리 스크리닝 방법을 포함한 다. 용해성 어세이 포맷하에서, 시험 제제나 K S는 모두 고체 지지대에 결합하지 않는다. 시험 제제에 대한 KRS 또는 이의 단편의 결합은 예컨대， K S 및 /또는 시험 제제의 형광에 의해 측정될 수 있다. 형광은 내재적이거나 (intrinsic) 형광물질 (fluorophor)을 가진 성분의 표지에 의해 부여될 수 있다. 상기 어세이 과정에서， 시험물질 또는 KRS 단백질은 주어진 조건에서 이의 확인， 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여 검출가능한 표지 (detectable label)로 표지 될 수 있다. 예를 들어， 상기 검출가능한 표지는， 화학적 표지 (예컨대， 바이 오틴)， 효소 표지 (예컨대， 호스래디쉬 퍼옥시다아제， 알칼라인 포스파타아제, 퍼옥 시다아제， 루시퍼라아제， 알파-글루쿠로니다제 (glucuronidase), 알파 -갈락토시다 제 , 클로람페니콜 아세틸 전이효소， β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제)， 방 사능 표지 (예컨대， 14C, 125I, 32P 및 3¾)， 형광 표지 (예컨대, 쿠마린， 플루오레세인， FITC(f luoresein Isothiocyanate) , 로다민 (rhodamine) 6G, 로다민 B, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) , Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor , DAP I ( 4 , 6-d i am i d i ηο-2-pheny 1 i ndo 1 e ) , HEX, TET, Dabsyl 및 FAM), 발광 표지， 화학 발광 (chemi luminescent ) 표지， FRET( fluorescence resonance energy transfer) 표 지 또는 금속 표지 (예컨대 , 금 및 은)이다. 유사하게 , 상기 검출가능한 그룹은 기 질 (substrate), 보조인자 (cofactor)， 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 검출가능한 표지가 표지된 KRS 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, KRS 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 신호를 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어， 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는， 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프롤 一 ASB1一포스페이트 (naphthol— AS— Bl— phosphate) 및 ECF( enhanced chemi fluorescence) 와 같은 발색반웅 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥 시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프를， 아미노에틸카바졸， 디아미노벤지딘， D-루시페린， 루시게닌 (비스 -N-메틸아크리디늄 니트레이트)， 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀， 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸 -3，그디하이드록시페녹사진)，
HYR( p-pheny 1 ened i am i ne-HC 1 및 pyrocatechol ) , TMB(tetramethylbenzidine) , ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o_페닐렌디아민 (OPD) 및 나프를 /파이로닌과 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 택일적으로， 시험물질의 KRS 단백질로의 결합 여부는 상호작용물 (interactants)의 표지 없이 분석할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터 (microphysiometer)를 이용하여 시험물질이 KRS 단백질에 결합하는지 여부를 분석 할 수 있다. 마이크로피지오미터는 LAPS( light -addressable potent iometric sensor)를 이용하여 세포가 그의 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이 다. 산성화 속도의 변화는, 시험물질과 KRS 단백질 사이의 결합에 대한 지시자로 이용될 수 있다 (McConnell et al . , Science 257:1906-1912(1992)).
시험물질의 KRS 단백질과의 결합 능력은 실시간 이분자 상호작용 분석 (BIA) 를 이용하여 분석할 수 있다. (Sjolander & Urbaniczky, Anal . Chem. , . 63:2338-2345(1991), 및 Szabo et al . , Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705(1995)). BIA는 실시간으로 특이적 상호작용을 분석하는 기술로서， 상호 작용물 (interactants)의 표지 없이 실시할 수 있다 (예컨대， BIAcore™). 표면 플라 즈몬 공명 (SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반응에 대한 지시자 (indicator)로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법들은 투 -하이브리드 분석 또는 쓰리-하이브리 드 분석 방법을 적용하여 실시할 수 있다 (U.S. Pat. No. 5,283,317； Zervos et al., Cell 72, 223—232, 1993； Madura et al., J. Biol . Chem. 268， 12046-12054, 1993； Bartel et al., BioTechniques 14， 920-924, 1993； Ivabuchi et al. , Oncogene 8， 1693-1696, 1993； 및 TO 94/10300). 이 경우， KRS 단백질을 "베이트 (bait)" 단백질로 이용할 수 있다. 이 방법에 따르면， KRS 단백질에 결합하는 물 질， 특히 단백질 (펩티드)을 스크리닝 할 수 있다. 투-하이브리드시스템은 분할 가 능한 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된 전사인자의 모들 특성에 기초한다. 간 단하게는， 이 분석 방법은 두 가지 DNA 컨스트럭트를 이용한다. 예컨대， 하나의 컨 스트럭트에서， KRS-코딩 폴리뉴클레오타이드를 공지의 전사 인자 (예컨대， GAL4)의 DNA 결합 도메인 -코딩 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨다. 다른 컨스트럭트에서， 분 석 대상의 단백질 ( "프레이" 또는 "시료 (시험제제)" )을 코딩하는 DNA 서열을 상 기 공지의 전사인자의 활성화 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 융합시킨 다. 만일， 베이트 및 프레이가 생체 내에서 상호작용하여 복합체를 형성하면， 전사 인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인이 인접하게 되며 이는 리포터 유전자 (예컨대， LacZ)의 전사를 촉발하게 된다. 리포터 유전자의 발현을 검출할 수 있으며， 이는 분석 대상의 단백질이 KRS 단백질과 결합할 수 있음을 나타낸다. 이렇게 KRS 단백질과 결합하는 것으로 확인된 시험제제에 대하여， 상기 시험 제제가 처리된 KRS 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과， KRS 단백질의 활성이 하 향 -조절 (downregulation) 되는 것이 측정되면， 상기 시험물질은 KRS 활성 저해제로 서 잠정적으로 면역세포 이동 관련 질환의 예방 및 치료제 후보 (candidate)로 판정 될 수 있다. 상기 1차 어세이 단계를 통하여 KRS를 저해 (KRS의 발현 또는 활성 저해)하는 제제를 규명한 후， 상기 시험제제가 면역세포 이동을 억제하는 능력이 있는지를 KRS 및 라미닌 (특히， LN421)의 존재 하에서 더욱 테스트한다 ( (B) 및 (C) 단계, 2차 어세이 단계) . 이때 KRS는 면역세포 내에서 항시 발현되고 있는 형태로 제공될 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 또한 라미닌의 처리는， 별도로 분리된 라미닌 단백 질을 면역세포 외부 (배지 등)에 처리하는 방식을 통해 이루어질 수 있고， 또는 특 별한 유전적 조작을 통해서 세포 내에서 발현되도록 처리할 수 있다. 본 발명에서 는 KRS가 라미닌 (특히， LN421)에 특이적인 면역세포 이동을 조절하는 능력이 있음 을 신규하게 밝힌 바 있다. 2차 어세이 단계에서는 당업계에 공지된 다양한 세포 이동 어세이 (cel l migrat ion assay) 방법， 또는 세포 침윤 분석법 ( invas i on assay) 이 사용될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 규명된 KRS를 저해하는 제 제는 면역세포의 이동을 조절 (억제)할 수 있다. 만약, 상기 1차 어세이 단계에서 규명된 시험 제제가 KRS의 세포 내 수준 (예: 전사 활성의 변경에 의하여)을 조절한 다면， 그것은 곧바로 면역세포의 이동을 조절할 수 있는 것으로 간주될 수 있다. 한편， 만약 시험 제제가 KRS의 세포 내 수준이 아닌 다른 활성을 조절한다 면， KRS에 대한 상기 시험 제제의 조절 효과가 면역세포 이동을 실제로 조절하는지 를 확인하는 것이 필요할 수 있으며， 이 경우 상기 2차 어세이 단계가 추가적으로 수행되는 것이 바람직하다. 또한 효율적인 어세이 수행을 위해 1차 및 2차 어세이 의 순서가 변경될 수 있다. 또한 본 발명자들은 면역세포 (단핵구 /대식세포)의 세포막 위치에 특이적으로 KRS 수준이 증가되는 현상이 면역세포 이동 및 침윤 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상이며 이는 라미닌 (특히， 라미닌 아형 α 4β 2 Υ 1)과 특별한 연관성을 가짐 을 확인한 바 있다. 이러한 신규한 발견을 기반으로, 본원 발명은 면역세포 이동 및 침윤에 의한 질환 치료제를 발굴하는 새로운 스크리닝 수단을 제공한다. 따라 서, 본 발명은
(a) 면역세포에 라미닌 및 시험물질을 처리하고 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동을 모니터링 하는 단계 ; 및 (b) 상기 (a) 단계의 면역세포에서 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동이 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 낮을 경우에 (감 소되었을 경우에) 상기 시험물질을 면역세포 이동과 관련된 질환의 치료제로 판단 하는 단계를 포함하는，
면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법과 상기 스크리닝 방법으로 선별된 제제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이 동과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 (a) 단계에서 상기 라미닌 및 시험물질은 면역세포에 동시에 처리되거 나， 또는 각 물질이 순차적으로 처리될 수 있으며 이 경우 먼저 투입되는 물질에는 제한이 없다. 즉, 후자에 있어서 라미닌이 먼저 처리된 후 시험물질이 처리될 수 있고, 또는 시험물질이 처리된 후 라미닌이 처리될 수 있다. 상기 (b) 단계에서 '모니터링' 이란 세포막 위치에서의 KRS 수준 변화, 또는 KRS의 세포막으로의 이동 여부 및 수준 (양)을 측정하는 모든 수단을 의미한다. 상기 세포막 위치에서의 KRS (존재) 수준 변화 또는 KRS의 세포막으로의 이 동 여부 및 수준 (양)의 측정은， 공지의 단백질 수준 측정 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 웨스턴 블랏， ELISA , 방사선면역분석， 방사선 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트면역전기영동， 면역염색법 (면역화학염 색， 면역형광염색 등)， 면역침전 분석법， 보체 고정 분석법 발광분석 ( luminescence assay) 및 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것에 의하여 수행될 수 있다. 당업자라면， 사용하고자하는 단백질 수준 측정 방법 의 특성에 따라， 세포막 위치 특이적인 KRS 수준 및 KRS 이동을 측정하기 위하여 임의의 처리 공정을 포함시킬 수 있는데， 일례로 웨스턴 블롯 방법을 사용하는 경 우에는 대상 세포로부터 세포막 (membrane) 분획과 세포기질 (cytosol )분획을 별도로 제조하는 공정을 사용할 수 있다. 이와 대비적으로 면역염색법을 사용하는 경우에 는， 상기와 같이 분획을 제조하지 않아도 단백질의 세포막으로 이동 행태 및 세포 막에서의 단백질 수준 변화가 용이하게 관찰 가능할 수 있다.
또한 세포내에서의 단백질의 이동에 영향을 미치는 화합물을 검출하기 위하 여， 본 발명에서 이용할 수 있는 세포내 과정의 관측 및 신약검색을 위한 시스템은 대한민국 등록 특허 10-0919637을 참조로 하여 수행될 수 있다. 상기 '대조군' 이란 시험물질 (시험제제)를 처리하지 않은 면역세포로서 (a) 단계에서 사용된 세포와 동일한 종류 면역세포이다. 상기 대조군으로 사용되는 면 역세포는 라미닌 (특히, LN421)이 처리된 것 또는 라미닌이 비처리된 것을 모두 포 함한다. 본 발명의 스크리닝 방법들은 또한 '면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제로 판단된 (또는 확인된) 시험제제를 면역세포 이동 (및 침윤)과 관련된 질환을 가지고 있는 동물에 투여하여 치료효과를 나타내는지를 검사하는 단계' 를 추가적으로 포함할 수 있다. 이때 상기 동물은 인간이 아닌 동물인 것이 바람직하 다.
【발명의 효과】
본 발명에 따라 K S를 제어하면 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며， 이는 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방， 개선 및 치료 등에 있어서 매우 유용하게 사 용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 la는 면역세포 (단핵구 /대식세포) 이동에 대한 콜라겐 (Col), 파이브로넥틴 (FN) 및 라미닌 (LN)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이 (transwell migration assay)로 비교한 결과로서， migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 lb는 상기 도 la 의 현미경 이미지에서 세포수를 측정 (정량)하여 그래프 로 표시한 것이다. 도 2a는 면역세포 (단핵구 /대식세포) 이동에 대한 다양한 라미닌 아형 (LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이 (transwell migration assay)로 비교한 결과로서， migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2b는 도 2a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정 (정량)하여 그래프로 표시 한 것이다. 도 3은 LN421 처리에 의하여 단핵구 /대식세포의 세포막에서 KRS가 증가하는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 4a는 LN421에 특이적인 단핵구 /대식세포 이동에 있어서， KRS 발현 정도에 따른 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이로 비교한 결과로서， migrat ing cel l에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 4b는 도 4a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정 (정량)하여 그래프로 표시 한 것이다. 도 5는 LN421의 처리에 의해 면역세포 세포막 영역에서 KRS의 수준이 높아졌 던 것이， KRS의 세포막으로의 이동 저해 화합물 (BC-KI -00053 화합물) 처리에 따라 현저히 낮아짐을 웨스턴블롯을 통하여 확인한 결과를 나타낸다. 도 6a는 KRS의 세포막으로의 이동 저해 화합물 (BC-KI-00053 화합물) 처리에 따라 농도 의존적으로 단핵구 /대식세포의 이동이 현저히 저해되는 것을 트랜스웰 세포이동 어세이로 확인한 결과로서， migrat ing cel l에 대한 현미경 이미지를 나타 낸다.
도 6b는 도 6a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정 (정량)하여 그래프로 표시 한 것이다. 도 7a은 급성 염증성 반웅 (ear skin wound 모델)에서 BC— KI-00053 화합물 처 리에 따른 단핵구， 대식세포 및 랑게르한스 세포의 침윤 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다 (도면 상단부는 대조물질 (vehi cl e) 투여군, 하단부는 BC-KI -00053 100 mg/kg 투여군을 나타냄. 녹색으로 표시된 부분이 단핵구， 대식세 포 및 랑게르한스 세포를 나타내며， 붉은색으로 표시된 부분은 CD31에 대하여 표지 된 혈관을 나타냄. 흰색 원은 skin wound 위치를 나타냄) .
도 7b는 도 7a의 형광 현미경 이미지에서 푸른색 원으로 표시된 skin wound 주변부위의 단핵구 /대식세포 침윤정도를 정량화하여 나타낸 것이다. 도 8a는 간 허혈-재관류 손상 모델 제작을 위한 Tr i ad(bi l e duct , hepat i c artery, hepat i c vein) occ lusion procedure를 도식화 한 것이다. 도 8b는 간 허혈-재관류 손상 모델에서 BC-KI-00053 화합물 처리에 따른 단 핵구， 대식세포 및 쿠퍼 세포의 침윤 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타 낸다 (도면 상단부는 대조물질 (vehicle) 투여군， 하단부는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군을 나타냄. 녹색으로 표시된 부분이 단색구ᅳ 대식세포 및 쿠퍼 세포를 나타 내며， 붉은색으로 표시된 부분은 CD31에 대하여 표지된 혈관을 나타냄).
도 8c는 도 8b의 형광 현미경 이미지에서 단핵구 /대식세포 침윤정도를 허혈- 재관류 손상 후 시점 별로 정량화하여 나타낸 것이다. 적색 막대는 대조물질 (vehicle) 투여군, 녹색 막대는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군에서 각각 정량화한 결과이다. 도 9a는 CCl4(사염화탄소)로 간섬유화 동물모델을 제작하고 여기에 BC-KI-00053 화합물의 치료 효과를 평가하는 실험에 대하여, 실험방법 및 일정을 도식화하여 나타내었다.
도 9b는 CC14(사염화탄소)에 의해 유도된 간 섬유화 동물모델에서 BC-KI-00053의 효과를 평가한 결과로서, 각 실험군에서 간 표면과 간 내부의 섬유 화 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다 (각 도면에서 상단부는 간 표면 을 영상화한 것이며， 하단부는 간 내부를 영상화한 것임. 녹색으로 표시된 부분은 콜라겐， 붉은색으로 표시된 부분은 간세포를 나타냄). 도 10a는 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의한 우 심실 수축기말 압력 (right ventricular end-systolic pressure; RVESP) 변화를 나 타낸다 (MCT:monocrot aline 처리한 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델， Tx25mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 25mg/kg 투여， Tx50mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 50mg/kg 투여).
도 10b는 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의한 좌 심실 수축기말 압력 (left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 변화를 나타 낸다 (MCT:monocrotaline 처리한 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델 ， Tx25mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 25mg/kg 투여， Tx50mpk: PAH 모델에 BC-KI-00053 50mg/kg 투여).
도 10c는 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 폐 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 e염색으로 확인한 결과이다. 도 11a는 중복 고혈압 (super imposed hyper tens ion)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군의 기본 체중 및 실험기간동안의 체중변화를 나타낸다 (괄호안의 슷자는 각 그룹에서 평균 데이터를 산출하는데 사용된 실험동물 수를 나 타냄. 이하 동일).
도 lib는 중복 고혈압 (super imposed hyper tens ion)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 MAP 변화를 측정한 결과이다.
도 11c는 중복 고혈압 (superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 단백뇨 (뇨중 단백질 배설 정도) 정도 변화를 측정한 결과 이다.
도 lid는 중복 고혈압 (super imposed hyper tens ion)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 혈장 크레아티닌 농도 변화를 측정한 결과를 나타낸다. 도 lie는 중복 고혈압 (superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군 (control)과 BC-KI-00053 처리군 (treatment )의 사구체 현미경 이미지 (상단이 미지)와 사구체경화증 정도를 평가한 결과를 나타낸다 (하단 그래프) (그래프 내부의 슷자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 llf는 중복 고혈압 (superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군 (control)과 BC-KI-00053 처리군 (treatment )의 피질 섬유화에 대한 현미경 이미지 (상단이미지 )와 피질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다 (하 단 그래프) (그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타 냄 ).
도 llg는 중복 고혈압 (superimposed hypertension)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군 (control)과 BC-KI-00053 처리군 (treatment )의 수질 섬유화에 대한 현미경 이미지 (상단이미지)와 수질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다 (하 단 그래프) (그래프 내부의 슷자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타 냄).
도 llh는 중복 고혈압 (superimposed hyper tens ion)인 FHH 랫드에서 vehicle 처리군 (control)과 ΒΟΚΙ— 00053 처리군 (treatment )의 심장 섬유화에 대한 현미경 이미지 (상단이미지， 우심실 삽입 지점 )와 심장 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다 (하단 그래프).
도 lli는 중복 고혈압 (super imposed hypertension)인 FHH 랫드에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 신장 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음 을 IHC 염색으로 확인한 결과이다. 도 12a는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압， 단백뇨， 사구체 경화증 및 신 장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive(SS) 랫드에서 vehicle 처리군과 BC-K 1-00053 처리군의 기본 체중 및 실험기간동안의 체중변화를 나타낸다 (괄호안의 숫자는 각 그룹에서 평균 데이터를 산출하는데 사용된 실험동물 수를 나타냄. 이하 동일).
도 12b는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압을 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI— 00053 처리에 따른 MAP 변화를 측정한 결과이다.
도 12c는 high salt(HS) 식이를 통해 단백뇨， 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive(SS) 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 단백 뇨 (뇨중 단백질 배설 정도) 정도 변화를 측정한 결과이다.
도 12d는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압， 단백뇨， 사구체 경화증 및 신 장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 처리에 따른 혈장 크레아티닌 농도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 12e는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압， 단백뇨, 사구체 경화증 및 신 장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive (SS) 랫드에서 vehicle 처리군 (control)과 BC-KI-00053 처리군 (treatment)의 사구체 현미경 이미지 (상단이미지 ) 와 사구체경화증 정도를 평가한 결과를 나타낸다 (하단 그래프) (그래프 내부의 숫자 는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 12f는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압， 단백뇨， 사구체 경화증 및 신 장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive(SS) 랫드에서 vehicle 처리군 (control)과 BC-KI-00053 처리군 (treatment )의 피질 섬유화에 대한 현미경 이미지 (상단이미지)와 피질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다 (하단 그래 프) (그래프 내부의 숫자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 슷자를 나타냄).
도 12g는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압， 단백뇨, 사구체 경화증 및 신 장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive(SS) 랫드에서 vehicle 처리군 (control)과 BC-KI-00053 처리군 (treatment)의 수질 섬유화에 대한 현미경 이미지 (상단이미지)와 수질 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다 (하단 그래 프) (그래프 내부의 슷자는 실제 결과 측정에 사용한 이미지의 숫자를 나타냄).
도 12h는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압， 단백뇨, 사구체 경화증 및 신 장 간질 섬유화를 유발한 Dahl salt-sensitive(SS) 랫드에서 vehicle 처리군 (control)과 BC-KI -00053 처리군 (treatment)의 심장 섬유화에 대한 현미경 이미지 (상단이미지, 우심실 삽입 지점)와 심장 섬유화 정도를 정량화하여 나타낸 결과를 나타낸다 (하단 그래프).
도 12i는 high salt(HS) 식이를 통해 고혈압， 단백뇨， 사구체 경화증 및 신 장 간질 섬유화를 유발한 Da salt-sensitive (SS) 랫드에서 BC-KI-00053 화합물 투여에 의해 신장 조직의 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확 인한 결과이다. 도 13은 알포트 증후군 동물모델에서 대조물질 또는 BC—KI— 00053 화합물을 처리했을 때 신장에서 백혈구의 침윤 및 섬유화 정도 감소를 평가한 결과이다. 백 혈구 침윤의 마커인 CD45는 녹색으로， 섬유화의 마커인 콜라겐 I은 붉은색으로 염 색이 되었다. 각 군별로 2마리의 마우스 조직을 보여준다, 도 14a는 LN421에 특이적인 단핵구 /대식세포 이동에 대한 anti— KRS 항체 (일 례로， N3 항체)의 이동 억제 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이 (transwell migration assay)로 비교한 결과로서， migrating cell에 대한 현미경 이미지를 나 타낸다.
도 14b는 상기 도 14a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정 (정량)하여 그래프 로 표시한 것이다.
도 14c는 LN421 처리에 의해 단핵구 /대식세포의 세포막에서 증가된 KRS 수준 이， anti-KRS 항체 (일례로， N3 항체) 처리에 의하여 감소되는 것을 웨스턴 블롯으 로 확인한 결과를 나타낸다. 도 15는 anti-KRS 항체 (N3 항체)의 처리에 의하여， 세포막 영역의 RS가 엔 도사이토시스됨을 확인한 결과를 나타낸다. Alexa fluor 488 (Thermof isher) 형광 probe로 표지된 anti-KRS 항체와 대조군인 Mock IgGCThermof isher)를 처리하고 시 간에 따른 항체의 이동을 모니터링하였으며， 이때 엔도사이토시스 여부를 확인하기 위하여 lysosome 마커로서 Lysotracker (Thermof isher )를 사용하였다. 도 16은 anti-KRS 항체 (N3 항체) 투여에 의한 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델의 우 심실 수축기말 압력 (right ventricular end-systolic pressure; RVESP) 변화를 나 타낸다 (Mock IgG: 음성 대조군， Ab Impk: N3 항체 Impk, Ab lOmpk ： N3 항체 lOmpk, sildenafil: 양성 대조군). 도 17은 anti-KRS 항체 (N3 항체) 투여에 의한 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델의 좌 심실 수축기말 압력 (left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 변화를 나타 낸다 (Mock IgG: 음성 대조군， Ab Impk: N3 항체 Impk, Ab lOmpk ： N3 항체 lOmpk, sildenafil： 양성 대조군). 도 18은 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델에서 anti-KRS 항체 (N3 항체) 투여에 의해， 폐 조직 내 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 me염색으로 확인한 결과이다. 도 19는 급성 폐손상 마우스 모델의 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내 에 증가된 총 (total) 면역세포수가， anti-KRS 항체 (N3 항체)의 처리 농도 의존적으 로 감소됨을 확인한 결과를 나타낸다. 도 20은 급성 폐손상 마우스 모델의 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내 에 특히 많이 증가되어있는 호중구 (뉴트로필)이， anti-KRS 항체 (N3 항체)의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 확인한 결과를 나타낸다. 도 21a는 급성 폐손상 마우스 모델의 폐 조직 내에 증가된 대식세포 (IM, CDllb+/F4/80+) 이동 및 침윤이， anti-KRS 항체 (N3 항체)의 처리 농도 의존적으로 감소됨을 FACS로 확인한 결과를 나타낸다.
도 21b는 상기 도 21a의 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 결과이다. 도 22는 급성 폐손상 마우스 모델의 폐 조직 내에 진행된 조직 섬유화가 anti-KRS 항체 (N3 항체)의 처리에 의하여 억제됨을 보여주는 조직 이미지이다. 각 실험군 및 대조군의 조직은 Masson's tri chrome 염색 처리된 후 현미경 관찰되었 다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다. 실시예 1 ： 면역세포 이동 및 침윤에 있어서， 라미닌 신호의 역할 확인 여러 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)들 중에서， 어떤 것이 면역세 포, 대표적으로 단핵구 /대식세포의 이동 및 침윤을 촉진하는지 확인하였다. 세포외 기질로서 콜라겐 (collagen, Col), 파이브로넥틴 (fibronectin, FN) 및 라미닌 (laminin, LN)을 사용하여 트랜스웰 세포이동 어세이 (transwel 1 migration assay) 를 수행하였으며, 구체적인 실험방법은 다음과 같다. Transwel 1 (Corning, #3421-5隱)을 gelatin (0.5mg/ml )으로 코팅한 후 RAW 264.7 eel 1(1 x 105 cells/well)을 top chamber에 분주 (seeding)하였다. Laminin( laminin mixture, Biolaminaittt) , Fibronectin 또는 Collagen을 각각 10yg/ml씩 포함하는 Serum Free DMEM(500 l)을 bottom chamber에 넣어주었다. 24시간 뒤에 70% methanol을 30m in 처리하여 고정 (fix)한 후， 50% Hematoxylin으로 30 min동안 염색하였다. membrane 의 위쪽에 존재하는 non-migrating 세포를 면봉으로 제거한 뒤， membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하고 정량하였다. 실험결과 도 la 및 도 lb에서 보는 바와 같이， 여러가지 세포외 기질 중 라 미닌이 가장 강하게 단핵구 /대식세포의 이동을 촉진함을 확인하였다. 즉， 단핵구 / 대식세포의 이동 (migration)은 ECM(extracel hilar matrix) 중 라미닌 (LN) 신호에 가장 강하게 반응함을 확인하였다. 실시예 2 ： 라미닌 아형 (subtype)별 면역세포 이동 및 침윤 효과
면역세포 이동 및 침윤에 있어서， 라미닌 아형에 따른 효과를 평가하였다. 다양한 라미닌 아형 단백질 (Biolamina로부터 구입)로서 LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521을 lyg/ml씩 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 트 랜스웰 세포이동 어세이 (transwell migration assay)를 수행하였다. 상기 라미닌 아형들의 구체적 서열은 각 라미닌 아형을 이루고 있는 사슬에 따라 서열번호 4의 α4 사슬， 서열번호 10의 α2 사슬， 서열번호 11의 α5 사슬, 서열번호 6의 β2사 슬， 서열번호 12의 βΐ 사슬， 서열번호 8의 사슬을 참조로 한다. 실험결과 도 2a 및 도 2b에서 보는 바와 같이， 단핵구 /대식세포는 라미닌 증 에서도 α4β2γ1 아형 (LN421)에 특이적으로 반웅하여 이동함을 확인하였다. 즉， 단핵구 /대식세포의 이동은 라미닌 중에서도 LN421에 특이적임을 확인하였다. 실시예 3 ： 면역세포에 라미닌 처리에 따른, 세포질 KRS의 세포막으로의 이 동
100 파이 플레이트에 RAW 264.7 cell(2 x 106cell)을 분주하고 18hr 동안 배 양한 후， serum free-DMEM media에 LN421 lug/ml 처리 후 Oh, 12h, 24h에 harvest 하였다. ProteoExtract Subcellular Proteome Extract ion itCCalbiotech, cat# 539790)를 사용하여, RAW 264.7 cell protein을 cytos()l과 membrane fraction으로 분리하였다. 얻어진 단백질을 전기 영동한 후 PVDF membrane (Milipore)에 옮겨 3% skim mi lk로 blocking 하였다. 이후 웨스턴 블롯으로 KRS를 검출하였다. 구체적으 로 KRS polyclonal antibody(rabbit , Neomics, Co. Ltd. #NMS-01-0005) 항체를 첨 가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 항체를 제거하고, anti-rabbit 2차 항체 (ThermoFisher Scientific, #31460)를 첨가하여 반웅시켰다. 이차 항체를 반웅 시킨 후， 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다. Na+/K+ ATPaseC Abeam, ab76020)와 tubulin(Santa cruz SC-5286)에 대한 항체를 각각 plasma membrane과 cytosol 마커 확인용으로 사용하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 단핵구 /대식세포에 LN421을 처리할 경우 세포질 (cytosol) 영역에서 KRS 검출량이 일부 감소되는 것과 대비하여 세포막 영역에 KRS 검출량이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 단핵구 /대식세포의 세포 내부 에서 발현되어 일반적으로 세포질 영역에 존재하고 있는 KRS가 LN421처리에 의하여 세포막 영역으로 이동하는 것을 시사하며， 면역세포 막 영역쎄서 특이적으로 KRS가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상 인 것으로 사료되었다. 실시예 4 ： LN421 의존적 면역세포 이동 및 침윤에 있어서 KRS의 효과
LN421에 특이적인 면역세포 (특히, 단핵구 /대식세포) 이동에 있어서 KRS가 영 향을 주는지 알아보기 위하여， KRS가 과발현되도록 형질전환된 대식 세포 및 KRS 발현이 억제되도록 형질전환된 대식 세포 각각에 LN421을 처리하고， 트랜스웰 세포 이동 어세이 (transwell migration assay)를 수행하였다. 대조군으로는 KRS 유사 단 백질인 leucyl-tRNA synthetase(LRS, 서열번호 3)를 사용하였다.
구체적으로， KRS 또는 LRS 과발현 대식세포는 다음과 같이 제작되었다: PCDNA3에 삽입된 KRS (서열번호 1)-Myc, LRS (서열번호 3)-Myc을 각각 Raw 264.7 cell에 Turbofect (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 트랜스펙션 (48hrs)하였 다. 음성대조군으로서 Ev(empty vector, pCDNA3)-Myc을 트랜스펙션한 세포를 제작 하였다.
KRS 또는 LRS 발현억제 대식세포는 다음과 같이 제작되었다: Si-KRS (서열번 호 13)， Si-LRS (서열번호 20)를 각각 Raw 264.7 cell에 Lipofectamin Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 트랜스펙션 (72hrs)하였다. 음성 대조군으로서 s i -control (si -RNA duplex with medium GC content ( Invi t rogen , Cat No.12935-300))을 트랜스펙션한 세포를 제작하였다.
이렇게 제작된 형질전환세포들에서 각각 KRS 또는 LRS의 과발현이나 발현 억 제가 제대로 수행되었는지는， 각각의 단백질에 대한 웨스턴블랏을 수행하여 확인되 었다 (데이터 미도시).
상기 형질전환된 각각의 대식세포에 대하여 Laminin 421을 lyg/ml 씩 사용 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 트랜스웰 세포이동 어세이 (transwell migration assay)를 수행하였다. 실험결과 도 4a 및 도 4b에서 보는 바와 같이, KRS 과발현은 LN421 특이적인 단핵구 /대식세포 이동을 효과적으로 증가시켰으며， 반대로 Si-R A를 활용한 KRS 발 현 감소는 LN421 특이적인 단핵구 /대식세포 이동을 효과적으로 감소시켰다. 이에 반하여 KRS 유사 단백질인 leucylᅳ tRNA synthetase(LRS) 발현 변화는 단핵구 /대식 세포 이동에 영향을 미치지 않았다. 이는 단핵구 /대식세포의 LN421의존적 이동 (migration)은 KRS 발현량에 강하게 영향 받는 것을 시사한다. 실시예 5 ： 면역세포의 이동을 억제하는 화합물의 선별 _KRS의 세포막으로의 이동 저해 화합물 상기 <실시예 3> 및 <실시예 4>의 결과로부터 단핵구 /대식세포의 LN421 의존 적 이동에 있어서 KRS의 발현량 뿐만아니라 KRS의 세포 내 행태가 중요하게 영향을 미치며， 특히 KRS가 세포막 쪽으로 이동하여 면역세포 막 영역에서 특이적으로 KRS 가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현 상인 것으로 사료되었다. 따라서 KRS의 이러한 병리 행태를 억제하는 것이 면역세 포 이동 및 침윤과 관련된 질환의 치료적 전략 중의 하나로 적용 가능함을 검증하 고자 하였다. 한편, 정상적인 상태에서 KRS는 세포 내에서 단백질을 합성하는데 필 요한 기관이다. 따라서 단순히 KRS의 양을 증가하거나 감소시키는 전략은 신체 정 상기능에 대한 부작용에 대한 우려로 인하여 실질적인 치료전략으로서 부적절할 가 능성이 크다. 이에 본 발명자들은 K S의 다양한 측면에서의 활성 세포 내 동태 및 발현에 영향을 주는 화합물을 스크리닝하여， 부작용 없이 단핵구 /대식세포에 이동 을 특이적으로 억제 가능한지 검토하였다. 특히， 본원에서 제공하는 스크리닝 방법을 이용하여, KRS의 세포막으로의 이 동을 억제하는 화합물들을 발견하고， 이들의 면역세포 이동 관련 질환에 대한 치료 효과를 확인 및 검토 하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
먼저， 다양한 RS 저해제 후보에 대하여 KRS의 세포막으로의 이동 억제 효과 보유 여부를 확인하기 위해서， 100 파이 플레이트에 RAW 264.7 cel l (2 x 106 cel l ) 을 분주하고 18시간동안 배양한 후， serum free-DMEM medi a에 l arainin 421 l y g/ml 을 처리하고, 다양한 KRS 저해제 후보 각각을 ΙΟΟηΜ 처리하여 12h 배양하였다. harvest 후에 ProteoExtract Subcel lul ar Proteome Extract ion Ki t CCalbiotech , cat# 539790)를 사용하여， RAW 264.7 cel l protein을 cytosol fract ion과 membrane fract i on으로 분리하였다. 얻어진 단백질을 전기 영동한 후 PVDF membrane (Mi l ipore) 에 옮겨 3% skim mi lk로 blocking 하였다. 이후 웨스턴 블롯으로 KRS를 검출하였으며， 구체적인 방법은 <실시예 3>과 동일하게 수행되었다. 각각 cytosol fract ion과 membrane fract ion에서의 KRS 양을 저해제 후보를 처리하기 전과 비교 하여， 저해제 후보 처리 후 cytosol fract ion에 상대적으로 membrane fract ion에서 특이적으로 KRS 양이 감소된 경우에 상기 저해제 후보가 실제로 KRS 이동을 억제하 는 것으로 잠정적으로 판단 가능하였다. 이렇게 KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 것으로 규명된 물질을 LN421을 처리한 대식세포에 처리하여， 트랜스웰 세포이동 어세이 (transwell migration assay)를 수행하였다. 이를 통해 KRS의 세포막으로의 이동 저해가， LN421 특이적인 단핵구 /대식세포의 이동 억제효과를 나타내는지 여부를 확인하였다. 구체적으로，
Transwell (Corning, #3421—5隱)을 gelatin (0.5mg/ml )으로 코팅한 후 應 264.7 eel 1(1 X 105 cells/well)을 top chamber에 분주 (seeding)하였다. Laminin 42KLN421, Biolamina)을 l//g/ml 포함하는 Serum Free DMEM 500μ 1을 bottom chamber에 넣어주었다. 그 후, Upper chamber에 DMS0, 또는 KRS 저해제 화합물 (in DMS0)을 여러 농도 (각각 30ηΜ, ΙΟΟηΜ, 300ηΜ, ΙμΜ, 3μΜ)로 처리하였다. 24시 간 뒤에 70% methanol을 30min 처리하여 고정 (fix)한 후， 50% Hematoxylin으로 30 min동안 염색하였다. membrane의 위쪽에 존재하는 non-migrating 세포를 면봉으로 제거한 뒤, membrane을 취하여 slide에 mount ing하였다. membrane의 아랫면에 존재 하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하고 정량하였다. 도 5 및 도 6은 본 발명에 따라 스크리닝된 화합물들 중， 대표적 일례로 BC-K 1-00053 화합물 (4-({ (그플루오로벤조 [d]싸이아졸 -2—일 ) [2-(4-메록시페닐)에틸] 아미노 }메틸)벤조산; 화학식 1)을 이용한 실험결과를 나타낸다. 도 5에서 보는 바 와 같이 LN421의 처리에 의해 세포막 영역에서 KRS의 수준이 높아졌던 것이 BC-KI-00053의 처리에 의하여 현저히 낮아짐을 확인하였다. 이는 라미닌 (LN421)에 의해 단핵구 /대식세포의 세포막으로 이동했던 KRS의 수준이 감소된 것을 뜻한다. 또한 도 6a 및 도 6b에서 보는 바와 같이， BC-K 1-00053 (KRS의 세포막으로의 이동저해 화합물)의 농도에 의존적으로 단핵구 /대식세포의 이동이 현저히 저해되는 것이 확인되었다. 이하의， 면역세포 이동관련 질환에 대한 in vivo 실험에서는 상기 BC-KI-00053 화합물을 대표로하여 실험을 수행하였다. 실시예 6 ： in vivo급성 염증성 반웅에서， KRS의 세포막으로 이동 저해제가 단핵구 /대식세포 침윤에 미치는 영향
6-1. ear skin wound모델
급성 염증성 반웅에서， 단핵구의 침윤에 KRS의 세포막으로의 이동 저해제가 미치는 영향을 알아보기 위하여， CX3CR1-GFP 마우스 (Stock no . #005582 , Jackson Laboratory (Bar Harbor , USA) )를 이용한 ear skin wound 모델을 제작하였다. CX3R1-GFP 마우스에서 단핵구， 대식세포 및 랑게르한스 세포는 녹색으로 나타난다. 마우스에 vehicle 또는 BOKI— 00053( 100 mg/kg, vehicle에 용해， 1일 1회 투여)를 영상화 2일전부터 총 4일간 경구로 투여하였다 (D— 2 , D-l , D-0 , D+l) . Vehic le로는 Corn oi l Polyethylene glycol 400： Tween80 : Methyl cel lulose (1%) = 20： 30: 1： 49로 흔합한 것을 사용하였다. 31G 주사기로 귀 피부에 구멍을 내어 (D— 0 시점) 급 성 염증반웅을 유도하였다. Alexa Flour 555가 결합된 항 -CD31 항체를 이용하여 혈 관을 표지하였다 (붉은색으로 확인 가능) . 영상화 장비로는 공초점 현미경를 사용하 였다. 도 7a 및 도 7b에서 보는 바와 같이， vehi cle 처리된 대조군에서는 하얀색 원으로 표시한 상처 부위 (귀 구멍 부위 ) 주변에 단핵구와 대식세포들이 모여들어 높은 수준으로 상당히 넓은 범위에 걸쳐 침윤된 것을 확인할 수 있었다 (파란색 원) . 이에 대하여， BC-KI-00053을 투여한 마우스에서는 단핵구와 대식세포 침윤 정 도가 현저히 감소된 것으로 나타났다. 한편， 도 7a 및 도 7b에서 주요 환부 (파란색 원)가 아닌 일반 조직 주위에 흩뿌려진 듯이 나타나는 녹색 점들은 resident macrophage인 Langerhans cel l로서， 대조군 (vehicle)과 BC-KI-00053 처리군에서 모 두 Langerhans cel l의 수에는 영향을 미치지 않았으므로, BC-KI-00053의 처리에 의 해 migratory macrophage의 이동만이 저해된 것으로 판단되었다. 상기 결과로부터 급성염증반웅으로 인한 면역세포들의 이동 및 침윤이 KRS의 세포막으로의 이동저해 제 (특히, BC— KI-00053) 투여에 의해 저해가 된 것을 확인할 수 있었으며， 이는 상 기 화합물이 전-염증성 사이토카인을 분비하는 면역세포들의 과도한 이동을 저해하 여 염증성 질환에 대해 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
6-2. 간 허혈-재관류 손상 모펠 (Liver Ischemia— Reper fusion Injury Model ) 허혈성 면역반웅에서， 단핵구의 침윤에 KRS의 세포막으로의 이동 저해제가 미치는 영향을 알아보기 위하여 , CX3CR1-GFP 마우스를 이용하여 간 허혈-재관류 손 상 모델 (Liver Ischemi a-Reper fusion Injury Model )을 제작하였다. CX3CR1-GFP 마 우스에서 단핵구， 대식세포 및 쿠퍼 세포 (kupffer cel l )는 녹색으로 나타난다. 마 우스에 vehicle 또는 BC-KI-00053 (100 mg/kg, vehicle에 용해， 1일 1회 투여)를 영 상화 2일전부터 총 3일간 경구투여하였다 (D-2, D-l, D-0). vehicle로는 Corn oil (Polyethylene glycol 400： Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20 30： 1： 49) 을 사용하였다. 경구투여 3일째 (D-0)에 6-0 봉합사 (suture)를 사용하여， 도 8a에서 보는 바와 같이 Tr iad(bi le duct , hepatic artery, hepatic vein) occlusion을 수 행하였다. 급성염증 유도를 위해 Triad occlusion을 30분 동안 수행하였으며， 이때 봉합사의 양끝에는 3g의 Eppendorf tube를 매달아두었다. 봉합사를 제거하여 재관 류 (reperfusion) 직후 (Oh) 및 24h 후에 허혈성 염증부위를 관찰하였으며, 이때 반 복 이미징을 위해 Alexa Flour 555가 결합된 항 -CD31 항체를 이용하여 혈관을 표지 하였다 (붉은색으로 확인 가능). 영상화 장비로는 이광자 현미경을 사용하였다. 실험결과 도 8b 및 도 8c에서 보는 바와 같이， vehicle만 처리한 control mouse의 경우 재관류 (reperfusion) 24시간 후에 많은 수의 단핵구 /대식세포가 상처 부위 (폐색부위 )로 모여들어 (recruitment) 침윤된 것이 확인되었다. 반면 BC-KI-00053을 처리한 실험군에서는， 단핵구와 대식세포 침윤 정도가 현저히 감소 된 것으로 나타났다. 도 8c 에서 적색 막대는 대조물질 (vehicle) 투여군, 녹색 막 대는 BC-KI-00053 100 mg/kg 투여군에서 각각 정량화한 결과이다. 한편, 도 8b에 서 재관류 Oh에서 주로 보이는 일반 조직 주위에 흩뿌려진 듯이 나타나는 매우 밝 은 녹색의 세포들은 resident macrophage인 kupffer cell로서, 재관류 24h 후에도 대조군 (vehicle)과 BC-KI-00053 처리군에서 모두 kupffer cell의 수에는 영향을 미 치지 않았으므로， BC-KI-00053의 처리에 의해 migratory macrophage의 이동만이 저 해된 것으로 판단되었다. 즉， KRS 세포막 이동 저해게 (특히, BC-KI-00053)는 허혈 로 유도된 간으로 이동하는 단핵구 /대식세포 침윤만을 저해하는 효과가 탁월하다. 실시예 7 ： In vivo간 섬유화에 대한, KRS의 세포막으로의 이동 저해제 약 리 효과 확인
Act in-DsRed( Stock no. #006051, Jackson Laboratory(Bar Harbor , USA)) 마 우스에서 간세포 (hepatocyte)는 붉은 색으로 나타난다. 상기 마우스의 간 섬유화를 유도하기 위하여 CC14(사염화탄소)를 콘 오일 (corn oil)에 녹여 20%의 농도로 주 2 회， 총 6주간， 복강내주사 (Intraperitoneal injection)하였다. CC14 투여 개시후 3 주가 경과한 시점부터 대조물질 (vehicle)과 BOKI -00053 (100 mg/kg)을 매일， 경구 로, 3주간 투여하였다. Vehicle로는 Corn oi 1 Polyethylene glycol 400： Tween80： Methyl cel lulose ( 1%) = 20 : 30： 1： 49로 흔합한 것을 사용하였다. 동물군은 하기 표 1과 같이 구성하였다.
간 표면 및 내부 (30 내지 50 깊이의 영역)의 섬유화 정도를 intravi al imaging의 SHG (Second Harmoni c Generat ion) 기법으로 검출하였다 (Exc i t at ion ： 780 nm , Detect ion ： 390 nm) .
【표 1】
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정상동물에 BC-KI-00053을 투여한 군 (표 1에서 (2)번 동물)에서는 체중감소 가 나타나지 않았고， 또한 간에서 다른 증상이 야기되지 않았다. 따라서 BC-KI-00053 화합물은 in vivo상에서 무해한 것으로 사료되었다. 섬유화 동물모델 에 대조물질 (vehi c le)을 투여한 군 (표 1에서 (3)번 동물들)만 실험개시 후 4주째에 CC14의 독성으로 인해 조기에 폐사했다. 구체적으로 도 9a에서 보는 바와 같이 총 6 주간의 실험기간 중 1마리는 24일째에, 다른 1마리는 32일째에 사망했으며， 이들은 현저한 체중 감소를 보였다. 상기 조기 폐사된 실험군은 이들이 폐사 되기 전에 각 각 2주째 및 4주째에 수득한 간 표면 및 내부 섬유화 데이터를 이용하여， 모든 실 험이 종료된 후의 데이터 비교에 이용하였다.
도 9b에서 보는 바와 같이， CC14를 2주 또는 4주간 투여한 결과 간의 표면 (도 9b의 상단부 (0卿) )에서 상당한 섬유화가 관찰이 되었으며, 특히 CC14를 4주간 투여한 군에서 간 표면 섬유화가 심화되었고 격벽 (portal-portal septa)이 발견되 어 심각한 섬유화가 상당히 진행된 것을 확인할 수 있었다. 또한 간 내부 (도 9b의 하단부 (30~48 m) )에서도 이와 유사한 섬유화 양상아 나타났으며， 또한 간세포 (hepatocyte)가 심각한 수준으로 괴사 (necrosi s)된 것을 확인하였다. 반면 CC 를 6 주간 투여하는 과정 중 BC-KI-00053을 3주간 처리한 동물군 (표 1의 (4)번 동물군) 에서는 간 표면 및 내부의의 섬유화가 CC142주 투여군보다도 현저히 감소하여 거의 정상 개체와 유사한 양상의 capsular collagen이 나타나는 것을 확인할 수 있었으 며， 또한 간세포 괴사도 현저히 감소된 것을 확인하였다. 도 9b에서 녹색은 콜라겐 (섬유화)을, 붉은색은 간세포를 나타낸다. 이러한 실험결과는 본 발명에서 제공하 는 KRS의 세포막으로의 이동 억제게 (특히， BC-KI— 00053)가 섬유화 억제능이 우수함 을 나타낸다. 실시예 8 ： In vivo 폐동맥 고혈압 (PAH)에 대한， KRS의 세포막으로의 이동 저해제 약리 효과 확인
실험방법
1) 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델 제작 및 시험물질 투여
6주령 암컷 SD rat (오리엔트바이오)에 PAH를 유도하기 위하여， 폐동맥의 선 택적 손상을 통해 폐동맥고혈압을 유발하는 물질인 MCTCmonocrotaline) 60 mg/kg를 피하주사하였다ᅳ 이후 4개의 군으로 나누고 (각 군당 5마리로 실험)， rat에 vehicle, si ldenaf i 1 (25 mg/kg, 1일 1회 투여 ) 또는 B(HU— 00053(25 또는 50 mg/kg, vehicle에 용해， 1일 1회 투여)를 3주간 경구투여하였다. Vehicle로는 Corn oil Polyethylene glycol 400： Tween80: Methyl cellulose (1%) = 20: 30: 1: 49로 흔합한 것을 사용하였다.
2) 혈류 및 혈압 측정
3주 후 rat를 isoflurane으로 마취하고， 동물용 초정밀공압측정시스템 (MPVS Cardiovascular Pressure and Volume system, 모델명: MPVS Ultra, 제조사명: Millar Instruments)을 이용하여 혈류와 압력을 측정하였다. 우심실 수축기말 압력 (RVESP) 및 이완기말 압력， 좌심실 수축기말 압력 및 이완기말 압력은 전용 카테터 (Mikro-Tip ratpressurecatheter , 제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정 하였다. 심박출량은 혈관주위 (perivascular) 혈류 탐침자 (Transonic Flowprobes, 제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였으며， 이에 대한 실험기법은 하기 문헌에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다: Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats . Nat Protoc 2008；3(9)： 1422-34.
3) 면역조직화학염색 (immunohistochemistry, IHC)
각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구 /대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행하였다. 채취한 폐를 통상적인 과정에 따라 PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 수세， 탈수， 투명 과정을 거쳐 파라핀 침투시켜 포매하였다. Rat의 폐 조직 파라핀 블록을 6μιη 두께로 박절하고 슬라이드를 제작하였다. 그 후 다음과 같이 염색을 수행하였다. 먼저 5분간 3회 xylene 처리 후， 100% 에탄을에서 2분씩 2번， 95% 에탄올， 9OT 에탄올， 70% 에탄올， DW 순으로 2분 간 처리하고 PBS로 5분 간 washing하였다 (2번). 0.3 % ¾02의 처리 후 (10분)， 샘플을 PBS로 5분 동안 2회 washing하였다. Microwave를 사용하여 H 6.0의 0.01M citrate buffer에 담가 3분 30초 동안 가열 후， 10초 식히고 10초 가열을 10분간 반복 (antigen retrieval) 후 상온에서 20분 cooling하였다. 이후 PBS-T(0.03% Triton— X)로 5분씩 3번 씻어냈다. 이후 30분간 4°C에서 blocking(2 % BSA & 2 ¾； goat serum in PBS)하였다. 항 -CD68 항체 (1 ： 200, Abeam, ab31630)를 4°C에서 overnight 처리하였다. PBS—T로 5분간 3 회 세척한 후， polymer-HRP amti -mouse envision kit(DAKO)로 4°C에서 1 시간 처리 하였다. PBS-T로 5분씩 3회 세척한 후， DAB substrate buffer lml 및 DAB chromogen 20ul 섞어 조직에 처리하고 10분 후에 발색되었을때 3차 D.W로 2분씩 두 번 씻어주었다. 염색 된 조직을 1 분간 Mayer' s hematoxyl in(Sigma)으로 처리 한 다음, 70% 에탄올， 90% 에탄을, 95% 에탄올， 100% 에탄올 순서로 각각 .2분간 2회 처리하였다. 마지막으로 5분간 3회 xylene 처리한 후 Mounting solution올 이용하 여 Mounting 처리하고, 광학현미경으로 관찰하였다. 실험결과
폐동맥 고혈압은 폐동맥이 좁아짐으로 인하여 우심실 압력이 상승하며， 결과 적으로 우심실 부전을 초래한다. 또한 지속적인 고혈압으로 그 보상 기전이 파괴되 면 우심실 비대에 이어 우심실 확장이 일어나게 된다. 이는 심실중격의 이동으로 인한 좌심실의 압박을 가져오게 되고 좌심실의 확장기말 용적 및 심박출량의 감소 를 가져오게 된다 (이우석 et al. , 중증 폐동맥 고혈압 환자의 임상적 특징과 예후 예측 인자， Korean Circulation J 2007； 37： 265-270) . 결과적으로 폐동맥 고혈압은 주로 우심실과 관계되지만 좌심실의 기능과도 연관된다. 도 10a에서 보는 바와 같이， PAH 동물 모델에서 RVESP (우심실 수축기말 압 력)가 증가되어 있는 것을 확인하였으며 이에 대하여 BC-KI-00053의 처리는 농도 의존적으로 유의하게 RVESP를 감소시켰다. 특히 BOKI— 00053 50 mg/kg 처리군에서 의 RVESP 강하 효과는 기존 표준 치료제 중 하나인 sildenafil의 효과와 비슷한 수 준인 것으로 나타났다. 또한 BC-KI-00053의 처리에 따른 좌심실 수축기말 압력 (LVESP) 감소는 관찰 되지 않았으며 , 오히려 BC-KI-00053 50 mg/kg 투여 군에서는 도 10b에서 보는 바와 같이 LVESP가 증가되는 결과를 보였으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다. 이는 기존 폐동맥 고혈압의 치료제로 사용되고 있는 sildenafil의 경우 폐동맥의 확장뿐 만 아니라， 전신동맥의 확장도 유발하여 전신 혈압 (systemic blood pressure)을 저 하시킬 위험이 있는 것과 대비되는 것이다. 즉， BC-KI-00053는 sildenafil과 비교 하여 전신 동맥압 (systemic artery pressure)에 미치는 영향이 낮은 경향성을 보이 는 것을 확인하였으며， 이러한 효과는 임상현장에서 sildenafil 투여 시 저혈압 발 생 위험을 염려하는 상황이 있음을 고려하였을 때， 치료약제의 유리한 특성이 될 것으로 사료되었다. 뿐만 아니라， 폐동맥 고혈압이 심한 경우 우심실 부전 (right ventricular failure)이 발생함에 따라， 낮은 심박출량 (cardiac output) 및 전신 저혈압 (systemic hypotension)이 동반될 수 있다. 이에 대하여 BC-KI-00053을 더 높은 농도로 이용해 폐동맥 고혈압을 호전시키는 치료에 의해 심박출량 (cardiac output)과 전신 혈압 (systemic blood pressure)이 상승되는 효과를 발휘할 수 있을 수 있을 것으로 예상된다. 심박출량 및 전신 혈압이 저하되면 환자가 전신 쇠약감 이나 어지러움을 호소할 수 있기 때문에， 심박출량과 전신 혈압의 호전을 통해 이 러한 증상의 개선 또한 기대할 수 있다.
종합하여， 이로서 본 발명에서 제공하는 K S의 세포막으로의 이동 저해게 (특 히 BC-KI-00053)의 투여는 PAH 치료 효과 및 증상 완화를 보일 뿐 아니라， 기존 치 료 약물이 지니는 부작용의 발생 위험이 상대적으로 적을 수 있음을 확인하였다. 또한 도 10c에서 보는 바와 같이 각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구 / 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과， 폐동맥고혈압 (PAH) 마우스 의 폐에는 단핵구 /대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 KRS의 세포막으로의 이동 억제게 (특히， BC-KI-00053)의 처리는 단핵구 /대식세포의 폐 조직 침윤을 명확하게 감소시켰음을 확인하였으며， 이러한 효과는 기존에 폐동맥고혈압에 치료 효과가 있는 것으로 알 려진 sildenafil 보다 현저히 우수함을 확인하였다. 실시예 9 ： in vivo고혈압 유발성 단백뇨， 사구체 경화증， 신장 및 심장 섬 유증에 대한， KRS의 세포막으로의 이동 저해제 약리 효과 확인
9-1. 증복 고혈압 (super imposed hypertension)인 FHH 랫드에서, KRS의 세포 막으로의 이동 저해제가 고혈압 신장손상， 심장손상 및 섬유화 발달에 미치는 영향 실험방법
실험은 9-12 주령의 수컷 FHH 래트 (rat)를 이용하여 수행되었다, 이들 실험 동물은 University of Mississippi Medical Center에서 제공받았고， American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)로부터 승인을 받았다. 모든 프로토콜 (protocol)들은 Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Mississippi Medical Center의 승인을 받았다. ¾ 트들은 음식과 물이 자유급식되었으며， 이들 랫트들은 이유 (weaning) 후에 0.4% NaCKDyets, Bethlehem, PA)을 함유하는 정제된 AIN-76 설치류 사료가 제공되었다. fawn-hooded hypertensive (FHH) rat은 사구체 과여과 및 단백뇨와 관련된 자발절 고혈압의 유전적 모델이다. 상기 래트에서 사구체 손상을 촉진시키기 위하여， 단일 (한쪽)신장적출을 수행한 후 DOCA strip을 이식하였다.
구체적으로， FHH 래트를 isoflurane으로 마취시키고 telemetry transmitter (모델 TA11PAC40, Data Sciences International , St. Paul , MN)를 'Williams, J. M. et al . Am J Physiol Regul Integr Comp Phys JO 1(2012)' 에 기술된. 대로 이식 하였다. 간략히 설명하면， 수술은 2~3% isoflurane-02 하에서 수행되었고， 장치의 카테터는 왼쪽 대퇴 동맥에 삽입되어 대동맥으로가는 상류로 향하게 되었다 (guided), telemetry unit의 몸체를 왼쪽 다리의 측면 공간 (lateral cavity)에 위 치시키고 근육 조직으로 봉합했다. 그 후 피부를 봉합하였다. 감염을 예방하기 위 해 동물에게 Baytril(K) mg/kg)을 제공하고 수술적 통증을 조절하기 위해 장시간 지속되는 진통제인 Rimadyl(5 mg/kg)을 제공하였다. 수술 후， 래트들은 12:12-h의 명암 사이클의 조용한 항온항습실 (air-conditioned room) 환경인 개별 케이지에 수 용되었고 수술로부터 완전히 회복하기까지 1 주일이 걸렸다. 그런 다음， 래트들을 metabolic cage에 수용하기 전에 기본 MAP(mean arterial blood pressure)와 단백 뇨를 4시간 (오전 10시 부터 오후 2시 까지)동안 측정하였다. 단백뇨는 Bradford 방 법과 BSA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 표준으로 사용하여 측정되었다. transmitter 삽입 1주일 후， 래트들은 Wang, X. et al . Am J Physiol Renal ¾7s/o/(2016)에 기재된 바와 같이 단일 신장 적출 (uninephrectomize)되었다. 간략 하게， 래트들을 2~3% isofhirane-02로 마취시키고, 무균 상태에서 오른쪽 옆구리를 절개했다. 우측 신장을 부드럽게 들어올리고， 신장 혈관과 요관 주위에 실을 단단 히 묶었다。 신장 혈관과 요관의 말단 부분을 잘라내어 신장을 적출하였다. 절개된 부분을 연속적인 피하 스티치 (stitch)로 봉합하고, 그 후 피부를 추가로 봉합하였 다. 쥐의 우측 신장이 제거 된 후， D0CA 펠렛 (200 mg, Innovative Research of America)을 목 부위에 피하 이식하였다.
단일 신장 적출 및 D0CA 이식 수술 후， 래트들은 3일 동안 회복시간올 가졌 다. 그런 다음， 기존에 래트들에 증류수를 제공했던 것을， 1 % NaCl을 함유한 물로 전환하여 제공하고 무작위로 두 개의 실험군으로 나누었다: Group l(n = 15)은 위 장관 직접 투여 (gavage)를 통해 BC-KI_00053(매일 25mg/kg)이 처리되었다; Group 2(n = 15)는 동일한 부피 (하루 2.5ml/kg)의 vehicle(corn oil , polyethylene glycol 400, Tween 80 and methylcel lulose)이 위장관 직접 투여되었다. 상기 실험 군에서 혈압과 단백뇨를 3주 동안 매주 측정 하였다. 실험 종료 시점에서， 래트들 을 isoflurane으로 마취시키고 혈액 샘플을 채취하여 크레아티닌 수치를 측정하였 다. 그런 다음 래트들은 대동맥을 통해 0.9 % NaCl 50ιτι1로 플러시되었고 (flushed) , 4 % 파라 포름 알데히드 20ml로 관류고정시켰다. 조직학적 평가를 위해 신장과 심 장을 수집하였다.
3μηι 두께로 제작된 파라핀 절편을 Masson's trichrome으로 염색하여 사구체 손상 및 신장 간질 섬유화 (renal interstitial fibrosis)의 정도를 측정하였다. 이 미지는 Nikon DS-Fil 컬러 카메라 (Nikon, Melville, NY) 및 NIS-Elements D 3.0 소 프트웨어가 있는 Nikon Eclipse 55 i 현미경을 사용하여 수득하였다. 사구체 손상의 정도는 30-40 사구체 /절편에 대하여 실험자가 선입견 없이 0 내지 4+ 로 평가하였 다. 0은 정상 사구체를 나타내며， 1+는 1-25% 손실을 나타내고, 2+는 26-50% 손실 을 나타내며， 3+는 51-75 % 손실을 나타내고， 4+는 다발 (tuft) 내의 모세혈관 손실 이 75 % 이상인 것을 나타낸다. 피질 및 수질 섬유증은 파란색으로 염색 된 이미지 의 백분율을 측정하기 위해 thresholding 후 NIS-Elements 자동 측정 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 또한 신장 조직에 대하여 단핵구 / 대식세포 마커인 CD68에 대한 면역조직화학염색 (IHC)은 상기 실시예 8과 같은 방법으로 수행되었다. 통계: 각 데이터들은 mean士 SEM으로 나타내었다. 각 그룹간의 비교는 two-tailed test에 의하여 분석되었다. P value<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 실험결과
Vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군 (대조군 309.57 士 4.1½， 실험군
304.7 ± 5.39 g, P> 0.05) 사이의 기본 체중에는 차이가 없었다. 연구 기간 동안 vehicle 또는 BC-KI-00053 처리한 래트돌에서 체중은 약 10 % 감소했지만 두 그룹 간에 통계적으로 차이는 없었다 (도 11a). 대조군 및 실험군 FHH 래트에서 telemetry를 통해 측정된 MAP 데이터가 도 lib에 제시되어있다. 두 군 간의 기본 MAP에는 차이가 없었다 (대조군 120.50 士 0.91mmHg, 실험군 120.1 士 0.62mmHg, P> 0.05). 단일신장절제술 후 D0CA 펠렛 삽 입술과 함께 1% NaCl 급수로 전환 된 후에ᅳ 양 군에서 MAP가 급속히 증가 하였다. Vehicle 처리군은 BOKI-00053 처리군에 비해 MAP가 더 큰 격차로 증가되었다. 처 리 1주 후， BC-KI-00053 처리군의 MAP는 vehicle 처리군보다 통계적으로 낮았다 (대 조군 184.34 土 2.46 mmHg, 실험군 174.4 土 3.83 mmHg, P <0.05). 처리 2주 후에 vehicle 처리군에서의 MAP 결과는 첫번째 주의 결과와 비교하여 상대적으로 안정한 것으로 보였다. BC-KI-00053 투여군의 MAP는 일시적이지만 더욱 감소한 것으로 나 타 났으며 두 군간에 유의 한 차이를 보였다 (대조군 184.22 士 4.21 mmHg, 실험군
168.8 士 3.74 mmHg, P <0.05). 3 주 후, 두 그룹 간의 평균 MAP 차이가 더 벌어졌 다 (대조군 195.30 士 3.68 mmHg, 실험군 176.9 土 5.83 mmHg, P <0.05). 대조군 및 실험군 FHH 래트에서 단백뇨에 대한 데이터가 도 11c에 제시되어 있다. 두 군 사이의 기본 (baseline) 단백뇨 정도에는 차이가 없었다. (대조군 52.75 土 6.99 mg/day, 실험군 51.0 土 4.9 mg mg/day, P> 0.05). 단일신장절제술 후 D0CA 펠렛 삽입슬과 함께 1 ¾> NaCl 급수로 전환 된 후에， 양 군에서 단백뇨가 일정 하게 증가하였다. 시험물질 처리 2 주 후에， BC-KI-00053 처리군에서의 단백뇨는 vehicle 처리군과 비교하여 통계적으로 낮아졌으며 (대조군 472.99 士 53.81 mg/day, 실험군 285.5 士 47.48mg/day, PO .05 )， 연구 종료까지 계속되었다 (대조 군 675.61 ±49.91 mg/day, 대조군 433.1 ± 60.59 mg/day, P <0.05) 대조군 및 실험군 FHH 래트에서 혈장 크레아티닌 농도에 대한 데이터가 도 lid에 제시되어있다. Vehicle 처리군에서의 혈장 크레아티닌 농도는 BC—KI— 00053 처리군보다 유의하게 높았다 (대조군 0.65±0.04 mg/dL, 실험군 0.48±0.02 mg/dL , P O.05) .
FHH rat에 단일신장절제술 후 D0CA 펠렛 삽입술과 함께 1 ¾ NaCl 급수로 전 환한 것은, 형태학적으로 사구체 및 관상 손상에 상당한 영향을 주었다 (도 lie , 도 llf , 도 llg) . 평균 사구체 손상 점수 (score)는 BOKI-00053을 처리한 래트에서 손 상 정도가 유의하게 감소되었음을 보여주었다 (대조군 3. 16 土 0.04, 실험군 1.49 士 0.05， P <0.05) . 또한 vehicle 처리군에서 상당한 섬유화가 진행된 것과 달리 BC-KI -00053 처리군에서는 섬유화가 유의하게 현저히 감소되었다. 구체적으로 BC- I -00053 처리된 래트에서 피질의 섬유화가 현저히 적은 것으로 나타났으며 (대 조군 19.46± 1.18%ᅳ 실험군 5.79±0.48%， P <0.05) , 신장 수질 섬유화 및 관상 손 상에있어서 직혈관 모세혈관 손실이 현저히 감소된 것으로 나타났다 (대조군 17.69± 1 ,07%, 실험군 7.40± 0.56%, P <0.05) .
Si r ius red로 염색한 절편시료 (도 llh)에서 보는 바와 같이， 대조군 랫트는 특히 우심실 삽입 지점에서 현저한 심장 섬유증을 나타내었다. 이에 대하여 BC-KI— 00053을 처리한 랫트에서는 심장 섬유화의 비율이 유의하게 감소되었다 (대조 군 31.97±2.62%， 실험군 9.14± 2. 18%， P<0.05) . 또한 대식세포 침윤 정도를 확인한 결과 도 lli에서 보는 바와 같이， 신장조 직을 이용하여 단핵구 /대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과, 대조 군 (vehicle 처리)의 신장조직에서는 단핵구 /대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 KRS의 세포막으로의 이 동 억제제 (특히， BC-KI-00053) 처리는 단핵구 /대식세포의 신장 조직 침윤을 현저하 게 감소시킴을 확인하였다. 9-2. Dahl SS(salt-sensitive) 래트에서 KRS의 세포막으로의 이동 저해제가 고혈압신장손상， 심장손상 및 섬유화 발달에 미치는 영향
실험방법
9-12주령의 수컷 Dahl SS 래트를 이용하여 실험을 수행하였다. 이들 실험동 물은 University of Mississippi Medical Center에서 제공받았고, American Assoc i at ion for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)로부터 승인을 받았다. 모든 프로토콜 (protocol)들은 Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Mississippi Medical Center의 승인을 받았다. 랫 트들은 음식과 물이 자유급식되었으며， 이들 랫트들은 이유 (weaning) 후에 0.4% NaCKDyets, Bethlehem, PA)을 함유하는 정제된 AIN-76 설치류 사료가 제공되었다. Dahl salt-sensitive (SS) rat는 high salt(HS) 식이를 하였을 때 심한 고혈압， 단 백뇨, 사구체 경화증 및 신장 간질 섬유화를 빠르게 유발하는 동물 모델이다.
Dahl SS 래트를 i oflurane으로 마취시키고 telemetry transmitters (모델 TA11PAC40, Data Sciences Internation l, St. Paul, MN)를 전술한 바와 동일한 방 법으로 무균적으로 이식하였다. 수술 후, 래트들은 12:12-h의 명암 사이클의 조용 한 항온항습실 (air-conditioned room) 환경인 개별 케이지에 수용되었고 수술로부 터 완전히 희복하기까지 1 주일이 걸렸다. 그런 다음, 뇨단백 배설을 측정하기 위 해 래트들을 metabolic cage에 수용하기 전에 기본 MAP(mean arterial blood pressure)를 측정하였다. 단백뇨는 Bradford 방법과 BSA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 표준으로사용하여 측정되었다.
그리고나서 래트들을 무작위 두 개의 실험군으로 나누었다: GroLip Kn = 15) 은 위장관 직접 투여 (gavage)를 통해 ΒΟΚΙ-00053(매일 25mg/kg)이 처리되었다; Group 2(n = 15)는 동일한 부피 (하루 2.5ml/kg)의 vehicle(corn oil, polyethylene glycol 400, Tween 80 and methylcel lulose)이 위장관 직접투여되었다. 상기 물질 처리와 동시에 사료를 8% NaCl을 포함하는 HS 사료 (Dyets, Bethlehem, PA)로 바꾸 었고, HS 사료 급여 후 7， 14 및 21일째에 혈압 및 단백뇨를 측정하였다. 실험 종 료 시점에서, 래트들을 isoflurane으로 마취시키고 혈액 샘플을 채취하여 크레아티 닌 수치를 측정하였다. 그런 다음 래트들은 대동맥을 통해 0.9 % NaCl 50ml로 플러 시되었고 (flushed), 4 % 파라포름알데히드 20ml로 관류고정시켰다. 조직학적 평가 를 위해 신장과 심장을 수집하였다.
파라핀 절편 제작 및 이들로부터 사구체 손상 정도， 피질 및 수질 섬유증에 대한 평가는 전술한 바와 동일하게 수행되었다. 또한 신장 조직에 대하여 단핵구 / 대식세포 마커인 CD68에 대한 면역조직화학염색 (IHC)은 상기 실시예 8과 같은 방법 으로 수행되었다, 통계: 각 데이터들은 mean土 SEM으로 나타내었다. 각 그룹간의 비교는 two-tailed test에 의하여 분석되었다. P value<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 실험결과
Vehicle 처리군과 BC-KI-00053 처리군 사이의 기본 체중에는 차이가 없었다 (대조군 337.92±9.86 g, 실험군 350.13±9.173 g, P> 0.05). Vehicle 또는 BC-KI-00053 처리한 래트들에서 체중이 유지되거나 또는 다소 증가하였지만 전체 연구 기간동안 두 그룹간에 통계적으로 차이는 없었다 (도 12a). 대조군 및 실험군 Dahl SS 래트에서 telemetry를 통해 측정된 MAP 데이터가 도 12b에 제시되어있다. 두 군 간의 기본 MAP에는 차이가 없었다 (대조군 122.13±2·31· 瞧 ¾， 실험군 123.45±2.36 mmHg, P> 0.05). Dahl SS 래트의 사료를 HS 사료로 바꾸었을 때 양 군에서 MAP가 지속적으로 증가하였다. Vehicle 처리군은 BC-KI-00053 처리군에 비해 MAP가 더 큰 격차로 증가되었다. 처리 2주 후， BC-KI-00053 처리군의 MAP가 vehicle 처리군보다 통계적으로 감소된 것을 확인하였 고 (대조군 178.51±3.71 画 Hg, 실험군 164.43±3.00 mmHg, P <0.05), 이러한 효과 는 실험이 종료될때까지 계속되었다 (대조군 201.65±2.54 mmHg, 178.48±3.49 隱 Hg, P <0.05). 대조군 및 실험군 Dahl SS 래트에서 단백뇨에 대한 데이터가 도 12c에 제시 되어있다. 두 군 사이의 기본 (baseline) 단백뇨 정도에는 차이가 없었다 (대조군 133.82 ±10.50 mg/day, 실험군 113.27 ±8.06 mg/day, P> 0.05). Dahl SS 래트의 사 료를 HS 사료로 바꾸자 양 군에서 단백뇨가 급격하게 증가하였다. 특히 vehicle 처 리군에서는 BC-KI-00053 처리군과 비교하여 단백뇨가 현저하게 높은 수준으로 증가 된 것을 확인하였다. 시험물질 처리 1주일 후 BC-KI-00053 처리군에서의 단백뇨는 vehicle 처리군과 비교하여 통계적으로 낮아진 것을 확인하였다 (대조군 469.08±24.82 mg/day, 실험군 302.86±29.76 mg/day, P<0.05). 시험물질 처리 2 주 후에도， BC-KI-00053 처리군과 vehicle 처리군에서의 단백뇨 수준이 여전히 명 확히 차이났으며 (대조군 675.61 ±59.67 mg/day, 실험군 510.64 ±42.42 mg/day, P<0.05), 연구 종료까지 계속되 ¾다 (대조군 752.97±57.80 mg/day, 대조군 524.55 ±44.70 mg/day, P <0.05) 대조군 및 실험군 Dahl SS 래트에서 혈장 크레아티닌 농도에 대한 데이터가 도 12d에 제시되어있다. Vehicle 처리군에서의 혈장 크레아티닌 농도는 BC-KI-00053 처리군보다 유의하게 높았다 (대조군 0.60 ±0.02 mg/dL, 실험군 0.55±0.01 mg/dL, P <0.05).
HS diet를 제공한 것은， Dahl SS rat에 형태학적으로 사구체 및 관상 손상에 상당한 영향을 주었다 (도 12e, 도 12f, 도 12g). 평균 사구체 손상 점수 (score)는 BC— KI-00053을 처리한 래트에서 손상 정도가 유의하게 감소되었음을 보여주었다 (대 조군 2.82±0.05， 실험군 1.34±0.04， P O.05). 또한 vehicle 처리군에서 상당한 섬유화가 진행된 것과 달리 BC—KI— 00053 처리군에서는 섬유화가 유의하게 현저히 감소되었다. 구체적으로 BC-KI-00053 처리된 래트에서 피질의 섬유화가 현저히 적 은 것으로 나타났으며 (대조군 19.48±0.96¾)， 실험군 6.47土 0.46%， P <0.05) , 신장 수질 섬유화 및 관상 손상에 있어서 직혈관 모세혈관 손실이 현저히 감소된 것으로 나타났다 (대조군 23.49±0.99%， 실험군 12.33±0.78¾>， P <0.05).
Sirius red로 염색한 절편시료 (도 12h)에서 보는 바와 같이， 대조군 랫트는 특히 우심실 삽입 지점에서 현저한 심장 섬유증을 나타내었다. 이에 대하여 BC— KI-00053을 처리한 랫트에서는 심장 섬유화의 비율이 유의하게 감소되었다 (대조 군 18.60±0.93 )， 실험군 6.63±0.94%， PO.05). 또한 대식세포 침윤 정도를 확인한 결과 도 12i에서 보는 바와 같이, 신장조 직을 이용하여 단핵구 / 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행한 결과， 대 조군 (vehicle 처리)의 신장조직에서는 단핵구 /대식세포 침윤이 높은 수준으로 일어 나 있는 것을 확인하였다. 이에 대하여 본 발명에서 제공하는 RS의 세포막으로의 이동 억제제 (특히， BC-KI-00053) 처리는 단핵구 /대식세포의 신장 조직 침윤을 현저 하게 감소시킴을 확인하였다. 실시예 10 ： KRS의 세포막으로의 이동 저해제가， in vivo 알포트 증후군 동 물모델에서 신장의 섬유화와 면역세포의 침윤에 미치는 영향
실험은 129 Sv/J 마우스 (Boys town hospi tal )를 이용하여 진행하였다. 실험 동물은 ( i ) 129 Sv/J 야생형 마우스 대조물질 (0.5% 메틸셀를로오스 현탁액) 투여 군， ( Π ) 129 Sv/J 알포트 마우스 (C0L4A3 knockout mouse . Cosgrove D et al . , Genes Dev. 1996 Dec 1 ; 10(23) : 2981-92 참조하여 수득)에 대조물질 (0.5% 메틸샐를 로오스 현'탁액) 투여군 및 ( H i ) 129 Sv/J 알포트 마우스에 BC-KI-00053 투여군으 로 ^성하였다. 각각의 투여군은 두 마리로 이루어져 있다. BC-KI-00053 투여군의 경우 0.5% 메틸셀를로오스 현탁액에 녹여 100 mg/kg의 농도로 경구 투여를 진행하 였으며， 신장의 섬유화와 면역세포의 침윤을 평가하였다. 각각의 동물군은 3주령 때부터 매일 1회씩 총 4주간 대조물질 또는 약물을 처리하였다. 4주간의 약물처리 이후에， 신장 파라핀 절편을 콜라겐 1 (섬유화의 마커) 및 CD45로 염색하여 백혈구 의 침윤의 정도를 관찰하였다. 섬유화 및 침윤 확인은 전술한 실시예들에서 사용한 방법과 동일하게 수행되었다. 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 알포트 마우스에 대조물질 (vehi c l e , 0.5% 메틸셀를로오스)을 투여한 군에서는 신장에서 백혈구의 침윤과 섬유화가 현저 하게 진행된 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해， BC-KI-00053을 처리한 알포트 마 우스 신장에서는 정상 (야생형 마우스-대조물질 투여군)수준으로 백혈구의 침윤이 줄어들고 섬유화도 감소한 것을 확인할 수 있었다. 실시예 11 ： ant i-KRS 항체의 면역세포 이동 /침윤 제어 효과 확인
KRS에 특이적으로 결합하는 항체가, 면역세포 이동 /침윤을 제어하는 효과가 있는지 확인하였다. 본 실험에서는 ant i-KRS 항체로서 서열번호 21의 중쇄와 서열 번호 23의 경쇄로 이루어지는 항체를 대표적으로 사용하였으며， 본 명세서에서 상 기 항체를 N3 (단클론)항체로 칭하였다.
구체적인 실험방법은 다음과 같다. Transwel l (Corning#3421-5隱)을 gelatin (0.5mg/ml )으로 코팅하고， 이후 RAW 264.7 cell (1 x 105cel ls/wel 1 )을 top chamber에 분주 (seeding)하였다. Laminin 421(1 yg/ml)을 포함한 Serum Free DMEM(500 μΐ)을 bottom chamber에 넣어주었다. anti— KRS 항체 (N3 항체)를 top chamber에 100 nM 농도로 처리하였다. 24시간 뒤에 70% Methanol로 30 min동안 고 정시킨 후， 50% Hematoxylin으로 30 min 동안 염색하였다. Membrane의 위쪽에 존재 하는 비 -이동 (non-migrating) 세포를 면봉으로 제거한 뒤， membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. Membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하였고 (도 14a), 수득된 이미지에서 세포수를 측정하여 그래프로 표시하였다 (도 14b).
또한 RAW 264.7 cell에 Laminin 421(1 ug/ml) 및 anti— KRS 항체 (100 nM)를 처리하여 24시간 배양하고 harvest하였으며， 이후 ProteoExtract subcellular proteom extract ion ki t (Calbiochem)를 사용하여 membrane과 cytosol fraction으로 나눠 샘플링 한 뒤 KRS에 대하여 western blot을 수행하였으며， 상기 western blot 의 구체적인 방법은 실시예 3에서 기재한 바와 같다. 실험결과， anti-KRS 항체 (N3 항체)가 특이적으로 LN421 의존적인 단핵구 /대 식세포 이동을 효과적으로 저해하는 것을 확인하였으며， 이를 도 14a 및 도 14b에 서 보여준다. 또한 도 14c에서 보는 바와 같이， LN421 처리는 단핵구 /대식세포 세 포막의 KRS 수준을 증가시키며， anti-KRS 항체 (N3 항체) 처리에 의해 세포막의 KRS 수준이 효과적으로 감소됨을 확인하였다. 이를 통해 anti-KRS 항체는 단핵구 /대식 세포와 같은 면역세포 이동이 문제되는 질환에 대한 새로운 치료제로서의 가능성을 확인하였다. 한편， 본 발명자들은 RS가 세포질로부터 이동하여 세포막에 위치하면 세포 막에 내재되기도 하여 일부 N-말단영역이 세포 외로 노출되는 것을 규명하였다 ( 통 상 KRS (바람직하게, 서열번호 1) N-말단의 1 내지 72개의 아미노산 영역). 이에 anti-KRS 항체들 중에서도, K Sᅳ N 말단에 결합할 수 있는 항체는 면역세포 이동 저 해에 있어서 in vivo 상에서 더욱 현저한 이점을 가질 것으로 사료된다. 물론 상기 세포 외 노출 영역이 아닌 KRS의 다른 영역을 타겟하는 anti— KRS 항체라도， 이의 세포 내 침투를 위한 추가의 처리를 통해 KRS 활성 저해가 가능하므로 치료에 이용 가능함은 당업자에 자명하다. 대표적으로 상기 N3 항체는 KRS N-말단에 결합할 수 있는 항체로서 , 상기 항 체의 처리에 의하여 면역세포의 세포막 위치에서 특이적으로 RS 수준이 감소되며
(도 14c) 면역세포 이동 억제 효과가 나타남을 확인하였고 (도 14a 및 도 14b), 도
15에서 보는 바와 같이 세포외로 노출된 KRS 영역 (특히， N-말단 영역)에 항체가 결 합하면 엔도사이토시스 (endocytosis)가 일어나는 것을 확인하였다. 이는， KRS가 세 포질에서 세포막으로 이동하는 것을 억제하는 방식 뿐만아니라 이미 세포막으로 이 동해 있는 KRS를 KRS (특히， 세포 외부로 노출되어있는 N-말단 등)에 특이적으로 결 합하는 물질 (제게)을 이용하여 능동적으로 제거하는 방식으로 면역세포 이동을 저 해 및 면역세포 이동 관련 질환을 치료할 수 있음을 시사한다. 실시예 12: in vivo 폐동맥 고혈압 모델에서 anti-KRS 항체의 치료 효능 확 인
실험방법
1) 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델 제작 및 시험물질 투여
7주령 SD rat (오리엔트바이오)에 PAH를 유도하기 위하여 MCT monocrotal ine) 60 mpk를 피하주사하였다. 이후 4개의 군으로 나누고 (각 군당 5마리로 실험)， 각각 Mock human IgG(Thermo Fisher Scientific, 음성 대조군) lmpk, anti-KRS 항체 (N3 항체) lmpk 또는 lOmpk, si ldenaf i 1 (양성 대조군) 25 mpk를 3주간 투여하였다. 모 든 항체는 주 2회 iv 주사하였고 sildenafil은 매일 경구투여하였다.
2) 혈류 및 혈압 측정
3주 후 rat를 isoflurane으로 마취하고， 동물용 초정밀공압측정시스템 (MPVS Cardiovascular Pressure and Volume system, 모델명: MPVS Ultra, 제조사명: Millar Instruments)을 이용하여 혈류와 압력을 측정하였다. 우심실 수축기압 (RVESP) 및 이완기압， 좌심실 수축기압 및 이완기압은 전용 카테터 (Mikro-Tip rat pressure catheter，제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였다. 심박출 량은 혈관주위 (perivascular) 혈류 탐침자 (Transonic Flowprobes，제조사명: Millar Instruments)를 이용하여 측정하였으며， 이에 대한 실험기법은 하기 문헌에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다: Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008 ;3(9)： 1422-34. 3) 면역조직화학염색 (i瞧 unohistochemistry, IHC)
채취한 폐를 통상적인 과정에 따라 PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 수 세， 탈수, 투명 과정을 거쳐 파라핀 침투시켜 포매하였다. Rat의 폐조직 파라핀 블 록을 6ym 두께로 박절하고 슬라이드를 제작하였다. 그 후 다음과 같이 염색을 수 행하였다. 먼저 5분간 3회 xylene 처리 후， 100 % 에탄을， 95 % 에탄을, 90 % 에탄 을， 70 % 에탄을， DW 순으로 2분 간 처리하고 PBS로 5분간 washing하였다. 0.3 % ¾02의 처리 후, 샘플을 PBS로 5분ᅵ동안 2회 washing하였다. 0.01M citrate buffer 에 담가 가열 후， PBS-T 0.03 % tween 20)로 세척하였다. 이후 30분간 실온에서 blocking(2 % BSA & 2 % goat serum in PBS)하였다. 항 -CD68 항체 (1 ： 200, ED1 clone, Abeam)로 4°C에서 overnight 염색하였다. PBS-T로 5분간 3회 세척한 후， polymer-HRP amti -mouse envision kit(DAKO)로 4°C에서 1 시간 처리하였다. PBS-T 로 3회 세척한 후， DAB substrate buffer 및 DAB chromogen 20을 처리하여 발색시 켰다. 염색 된 조직을 1 분간 Mayer' s hematoxyl in(Sigma)으로 처리 한 다음， 70% 에탄을， 90% 에탄올, 95% 에탄올， 10OT 에탄올 순서로 각각 2분간 2회 처리하였 다. 마지막으로 5분간 3회 xylene 처리한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 실험결과
12-1. 혈압 및 심박출량 ¾화 확인
면역세포의 침윤이 병리현상과 깊이 관계된 질환인 PAH 모델에 anti-K S 항 체 (N3 단클론 항체)를 lnipk 또는 10 mpk로 3주간 처리한 뒤 (iv, 주 2회)， 우심실 수축기말 압력 (right ventricular end-systolic pressure; RVESP)， 우심실 이완기 말 압력 (right ventricular end-diastol ic pressure; RVEDP) , 좌심실 수축기말 압 력 (left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 좌심실 이완기말 압력 압력 (left ventricular end-diastol ic pressure; LVEDP) 및 심박줄량 (cardiac out ut； CO)을 측정하였으며， 그 결과를 표 2에 나타낸다.
【표 2】 MCT MCT
MCT + Mock IgG MCT + Sildenafil
+ N3 Ab lmpk + N3 Ab lOmpk
(n = 4) (n = 5)
(n = 5) (n = 5)
RVESP (mmHg) 62.5 士 5.7 45.0 土 8.1 41.2 士 7.7 48.4 士 9.6
RVEDP (mmHg) 2.8 土 1.5 1.4 士 2.2 3.8 土 1.3 2.6 士 1.3
LVESP (mmHg) 81.5 士 11.4 95.8 土 4.8 93.4 土 11.3 83.2 士 4.7
LVEDP (mmHg) 1.0 士 0.8 2.6 ± 1.9 4.6 土 3.9 3.6 士 2.3
58 士 4.7 74.0 士 10.9 59.8 士 12.9 49.6 土 17.7
CO (ml/min)
(n = 4) (n = 5) (n = 5) (n = 4)
(MCT +mock IgG 처리군 1마리는 마취사. Sildenafil 처리군 1마리는 수술 중 사망하여 CO 측정하지 못함). 폐동맥 고혈압은 폐동맥이 좁아짐으로 인하여 우심실 압력이 상승하며, 결과 적으로 우심실 부전을 초래한다. 또한 지속적인 고혈압으로 그 보상 기전이 파괴되 면 우심실 비대에 이어 우심실 확장이 일어나게 된다. 이는 심실중격의 이동으로 인한 좌심실의 압박을 가져오게 되고 좌심실의 확장기말 용적 및 심박출량의 감소 를 가져오게 된다 (이우석 et al., 중증 폐동맥 고혈압 환자의 임상적 특징과 예후 예측 인자， Korean Circulation J 2007； 37： 265-270) . 결과적으로 폐동맥 고혈압은 주로 우심실과 관계되지만 좌심실의 기능과도 연관된다.
PAH 환자에서는 RVESP가 증가되며 이는 본 실험의 PAH 동물 모델에서도 확인 되었다. 이에 대하여 도 16에서 보는 바와 같이， anti- RS 항체 (N3 항체)는 두 농 도 모두에서 유의적으로 RVESP를 감소시켰으며， 특히 양성대조군 약물인 Sildenafil 보다 우수하게 RVESP를 감소시켰다.
또한 anti-KRS 항체 (N3 항체) 투여에 따른 좌심실 수축기말 압력 (LVESP) 감 소는 관찰되지 않았으며， 오히려 본 발명의 항체를 투여한 군에서는 도 17에서 보 는 바와 같이 LVESP가 유의하게 증가되는 결과를 보였다. 이는 기존 폐동맥 고혈압 의 치료제로 사용되고 있는 Sildenafil의 경우 폐동맥의 확장뿐만 아니라， 전신동 맥의 확장도 유발하여 전신 혈압 (systemic blood pressure)을 저하시킬 위험이 있 는 것과 대비되는 것이다. 즉, N3 항체는 Sildenafil과 비교하여 전신 동맥압 (systemic artery pressure)에 미치는 영향이 낮은 경향성을 보이는 것을 확인하였 으며, 이러한 효과는 임상현장에서 Sildenafil 투여 시 저혈압 발생 위험올 염려하 는 상황이 있음을 고려하였을 때， 치료약제의 유리한 특성이 될 것으로 사료되었 다. 뿐만아니라， 폐동맥고혈압이 심한 경우 수축기 우심실 부전 (systolic RV failure)이 발생함에 따라， 낮은 심박출량 (cardiac output) 및 전신 저혈압 (systemic hypotension)이 동반될 수 있다. 이에 대하여 anti-KRS 항체 (특히， N3 항체)에 의한 폐동맥고혈압을 호전시키는 치료에 의해 심박출량 (cardiac output)과 전신 혈압 (systemic blood pressure)이 상승되어 혈압이 정상화되는 효과가 예상된 다.
종합하여， 이로서 anti-KRS 항체 (N3 항체) 투여는 기존 치료 약물의 부작용 가능성을 개선하며， PAH 증상완화 및 차료 효과를 보임을 확인하였다.
12-2. 심초음파 검사 (Echocardiography)
우심실의 압력 과부하를 시사하는 D-shaped left ventricle 소견은 MCT 단독 투여 군 (즉， 실험물질 비투여 PAH 모델)에서 3마리， MCT + Sildenafil 투여한 군의 3마리에서 각각 관찰되었으며， 치료항체 (anti-KRS 항체)를 투여한 군에서는 관찰되 지 않았다.
뿐만아니라 하기 표 3에서 보는 바와 같이， 각 군의 체중은 비슷한 정도로 증가하였으며 유의적 차이가 없었다. 즉, 치료항체 투여를 통한 비정상적 몸무게 감소를 비롯한 이상 징후를 시사하는 소견은 관찰되지 않았다.
【표 3】
Figure imgf000076_0001
12-3. 단핵구 /대식세포 이동 및 침윤 정도 확인 각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구 / 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행하였다. 실험 결과 도 18에서 보는 바와 같이， anti-KRS 항체 (N3 항 체) 처리군은 단핵구 /대식세포의 폐 조직 침윤을 명확하게 감소시켰음을 확인하였 으며， 이러한 효과는 sildenafil 보다 현저히 우수함을 확인하였다. 실시예 13 ： in vivo급성 폐손상 모델에서 anti-KRS 항체 효능 확인 실험방법
1) LPS 유도 급성 폐손상 모델 제작 및 시험물질 투여
급성 폐손상 모델은 7주령 수컷 C57BL/6 마우스 (두열바이오)에 LPS(Sigma) 2.5 mg/kg을 기관 내 주입하는 방식으로 제작되었다.
KRS 저해제의 급성 폐손상에 대한 효과를 알아보기 위하여， 먼저 C57BL/6 마 우스에 N3 항체를 각각 lmg/kg 또는 10 mg/kg씩 IV 주입하고， 24시간 후 LPS 2.5 mg/kg을 기관내 주입하였다. 상기 LPS 주입 후 24시간 째에， 각 마우스들을 희생시 켜 폐조직 및 BALF(Bronchoalveolar lavage fluid)를 수집하고 분석하였다.
2) BALF(Bronchoalveolar lavage fluid) 내 면역세포 수 측정
PBS로 폐를 세척하여 얻어진 BALF를 모아 800 x g에서 10 분간 4°C에서 원심 하여 pel let을 수거하였다. 세포를 부유시킨 후 RBC lysis buf fer(eBioscience cat. no.00-4333-57)를 이용해 red blood cell 제거하였다. 이후 PBS로 반응을 멈추 고 2번 washing 한 뒤， 400 μΐ PBS에 부유시켜 hemocytometer로 세포수를 측정하고 Hema3 염색을 통해 neutrophil 수를 측정하였다.
3) 폐조직 내 면역세포에 대한 FACS
폐 조직을 수거하여 gentleMACS Octo Dissociator(MACS Miltenyi Biotec, Order no.130-095-937) 장비를 이용해 37°C에서 45 분간 rotation하여 조직을 으깼 다. Cell strainer(40iim)를 이용해 filter한 뒤 1500 rpm에서 5분간 실온에서 원 심분리를 수행하였다. Pellet을 수거하여 RBC lysis buffer (eBioscience cat. no.00-4333-57)를 이용해 red blood cell 제거하였다. 세포를 수거하여 FACS buffer (NaN3 1% 및 FBS 3%가 포함된 PBS)에 부유한 뒤 50μ 1를 tube에 담고， 동 량의 항체 mxiture와 잘 흔합하여 4°C에서 1시간 동안 빛을 차단하여 염색하였다. 폐로 이동하는 IM (interstitial macrophage) 분석을 위해， FITC Rat Anti-CDllb (BD Pharmingen) 과 PE Rat Ant i -Mouse F4/80 (BD Pharmingen) 항체를 사용하였다. FACS buffer를 이용하여 400 x g에서 5분간 2번 washing 한 뒤, Navios Flow Cytometer(Beckman) 장비로 분석하였다.
4) 폐 조직어 1 대한 masson' s trichrome 염색
폐 조직을 통상적인 방법으로 파라핀 포매한 후, 박절하였다. 그 후 xylene 을 이용하여 파라핀을 제거한 조직 슬라이드를 DW로 washing한 뒤， 56— 60°C의 Bouin Fluid에 1시간 처리하였다. Weigert' s iron hematoxylin solution으로 10분 염색하였고, 그 후 washing하고， 다시 Biebr ich scarlet-acid fuchsin solution으 로 10-15분 염색 한 뒤 washing하였다. Phosphomo lybdi c-phosphotungst i c acid solution을 10-15 분간 처리하고， aniline blue solution으로 옮겨 5—10 분간 염색 하였다. Washing 후 1% acetic acid solution에 2-5 분간 처리하였다. Washing 및 dehydration 이후 xylene 처리하여 mounting하였다. 실험결과
13-1. BALFCBronchoalveolar lavage fluid) 내 면역세포 이동 억제 효과 확 인
도 19에서 보는 바와 같이 LPS 처리에 의하여 급성 폐손상을 유발한 마우스 에서는 BALF 내 총 (total) 면역세포수가 증가된 것을 확인하였으며, 이는 anti_KRS 항체 (N3 항체) 처리에 의하여 농도의존적으로 감소하였다. '
특히, 도 20에서 보는 바와 같이， LPS 처리로 급성 폐손상을 유발한 마우스 에서 호중구 (neutrophil)가 많이 증가된 것이 확인되었고, anti— KRS 항체 (N3 항체) 처리는 이러한 호중구 수치를 감소시켰다. 이로서 anti-KRS 항체 처리에 의해 BALF 내 면역세포， 특히 neutrophil의 폐로의 침윤이 현저히 억제됨을 확인하였다,
13-2. 폐 조직 내 면역세포 이동 억제 효과 확인
도 21a 및 도 21b는 급성 폐손상에 의하여 폐 조직으로 이동해온 대식세포를 FACS로 분석한 결과를 나타낸다. IMC interstitial macrophage)은 CDllb+/F4/80+ 세 포로서， 폐에 상주하지는 않고 특정 상황에서 폐로 이동해 오는 대식세포 (migrating macrophages)이다. LPS 처리에 의해 IM의 폐로의 침윤이 증가하였으나， anti-KRS 항체 (N3 항체) 처리는 농도의존적으로 IM의 폐로의 이동을 감소시켰다. 이를 통해 anti-KRS 항체 처리에 의해 대식세포 /단핵구 등 면역세포의 폐 조직으로 의 이동 및 침윤이 억제되는 것을 확인하였다.
상기 대식세포 /단핵구 등 면역세포의 과도한 폐 조직으로의 이동 및 침윤은 조직 섬유화 질환에 있어서 중요한 병리 현상이다. 상기 급성 폐손상 모델에 대하 여 폐조직을 Masson's trichrome 염색하여 관찰한 결과 (도 22) 폐 조직 내의 섬유 화가 상당히 진행된 것을 확인하였으며， 이에 대하여 anti-KRS 항체 (N3 항체)의 처 리는 이러한 섬유화를 억제한 것을 확인하였다.
【산업상 이용가능성】
이상 살펴본 바와 같이 , 본 발명은， 면역세포 이동에 의한 질환의 치료제 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로， 보다 상세하게는 KRS 저해제 (발현 또는 활성 저해제)를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약 학적 조성물, KRS의 면역 세포 내 수준 조절， KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이동을 조절하는 방 법， 및 KRS를 이용한 면역세포 이동에 의한 질환 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 본 발명에 따라 KRS를 이용하여 면역세포의 이동을 조절할 수 있으며, 이 는 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방, 개선 및 치료 등에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase, KRS) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
거 U항에 있어서， 상기 KRS 저해제는 KRS 발현 억제제 또는 활성 억제제인 것 을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 KRS 저해는
(i) KRS 발현 억제;
(ii) 세포막 위치의 KRS 수준 (level) 감소; 및
(iii) KRS의 세포막으로의 이동 활성 억제
로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
.제1항에 있어서, 상기 저해제는
KRS mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， miRNA, siRNA, shRNA, 리보자임 (ribozyme), 디엔에이자임 (DNAzyme) 및 PNA(Peptide nucleic acid) 로 이루어진 군; 또는
KRS 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물， 펩티드, 펩티드 모방체 (peptide mimetics), 기질유사체， 앱타머， 항체， 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군 에서 선택되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5]
게 4항에 있어서, 상기 KRS 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
제 4항에 있어서， 상기 KRS mRNA는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 포함 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 7】
제 4항에 있어서， 상기 s iRNA는 서열번호 13 내지 서열번호 19로
군에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8】
제 4항에 있어서， 상기 화합물은 하기 화학식 1의 화합물 또」 이의 약학적으 로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 조성물.
<화학식 1>
Figure imgf000082_0001
【청구항 9】
제 1항에 있어서, 상기 면역세포 이동과 관련된 질환은 심혈관 질환, 섬 질환， 염증성 질환 및 알포트 증후군 (Alport syndrome)으로 이루어진 군에서 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10]
제 9항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 고혈압， 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화， 협심증， 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환， 세동맥 경화 및 중막 경화로 이루어진 군 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 111
거 19항에 있어서， 상기 섬유화 질환은 경피증 (scleroderma), 류마티스 관절 염 (rheumatoid arthritis), 크론 병 (Crohn' s disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) , 골수 섬유증 (myelofibrosis) , 폐 섬유증 (pulmonary fibrosis), 간 섬유증 (hepathic fibrosis), 간경변증 (liver cirrhosis), 신장 섬유 증 (kidney fibrosis), 사구체 경화증， 근섬유증 (myofibrosis)， 심장 섬유증, 간질 성 섬유화증， 췌장 섬유화증， 비장 섬유화증， 종격막 섬유화증， 혈관 섬유화증， 피 부 섬유화증， 눈 섬유화증， 황반 변성 관절 섬유화증， 갑상선 섬유화증， 심내막 심근 섬유화증， 복막 섬유화증， 복막후 섬유화증, 진행성 종괴성 섬유화증， 신원성 전신섬유화증， 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu) , 유전성 섬유 증， 감염성 섬유증， 자극성 섬유증， 만성 자가면역에 의한 섬유증， 장기이식시 항 원부적합에 의한 섬유증， 외과수술의 섬유성 합병증, 고지혈증에 의한 섬유증， 비 만에 의한 섬유증， 당뇨성 섬유증， 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐트삽입시 섬유화 로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12]
게 9항에 있어서， 상기 염증성 질환숀 자가 면역 질환， 염증성 장 질환， 피부 염 아토피성 피부염, 습진， 건선증， 당뇨성 안질환， 당뇨병성 망막증, 복막염， 골 수염， 봉소염， 뇌막염， 뇌염, 췌장염， 외상 유발 쇼크, 기관지 천식， 비염, 부비동 염， 중이염， 폐렴， 위염， 장염， 낭포성 섬유증， 졸증， 기관지염， 세기관지염， 간 염， 간경변， 무알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis) , 신장염 , 단백뇨 증， 당뇨병성 신부전증， 관절염, 건선성 관절염， 신경염， 당뇨병성 신경병증, 다발 성 경화증， 통풍， 척추염， 라이터 증후군， 결절성 다발동맥염， 혈관염, 루게릭병, 베게너 육아종증， 과사이토카인 혈증 (hypercytokinemia), 류마티스성 다발성근육 통， 관절 세포 동맥염， 칼슘 결정 침착 관절병증， 가성 통풍, 비 -관절 류마티즘, 점액낭염， 건초염， 상과염， 신경병증성 관절 질환 (Charcot's joint), 출혈성관절증 (hemarthrosi s) , 헤노흐-쉔라인 자반병， 비후성 골관절병증， 다중심성 세망조직구 종， 수르코일로시스 (surcoi los i s) , 혈색소증， 겸상 적혈구증， 고지단백혈증， 저감 마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증， 말단거대증， 가족성 지중해열， 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스， 재귀열， 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군， 다발성 장기부전， 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstruct ive pulmonary di sease) , 급성 폐손상 (acute lung inj ury) 및 기관지 폐 형성장애 (broncho-pulmonary dyspl as i a)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 13]
제 12항에 있어서， 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증， 전신 흥반성 낭창， 건선， 천식, 궤양성 대장염， 베체씨병, 크론씨병, 다발성 경화 증, 피부근염， 교원병， 혈관염, 관절염， 육아종증， 장기 특이적 자가면역병변， 궤 양성 대장염 및 이식편대 숙주 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 14】
KRS (라이실 tRNA 합성효소)의 면역 세포 내 수준 조절， KRS의 세포막 위치 특이적 존재 수준 조절， 또는 KRS의 세포막으로의 이동 조절을 통해 면역세포의 이 동을 조절하는 방법 .
【청구항 15】
제 14항에 있어서， 상기 면역세포는 단핵구， 대식세포, 호중구， 호산구， 호염 구， 수지상세포， 자연살해세포， 거핵구， T 세포 및 B 세포로 이루어진 군에서 선택 되는 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
【청구항 16】
제 14항에 있어서， KRS의 면역세포 내 수준을 감소시켜 면역세포 이동을 억제 하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
【청구항 17] 제 14항에 있어서， KRS의 면역세포 내 수준을 증가시켜 면역세포의 이동을 촉 진하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
【청구항 18]
제 14항에 있어서， KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준올 감소시켜 면역 세포 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
【청구항 19】
제 18항에 있어서, 상기 KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 감소시키 는 것은，
세포막 위치에 존재하는 KRS의 엔도사이토시스 (endocytos i s )를 촉진시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
【청구항 20】
제 18항에 있어서， 상기 KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 감소시키 는 것은，
KRS의 세포막으로의 이동을 억제하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 면 역세포의 이동을 조절하는 방법 .
【청구항 21】
제 14항에 있어서， K S를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 증가시켜 면역 세포 이동을 촉진하는 것을 특징으로 하는 면역세포의 이동을 조절하는 방법.
【청구항 22】
제 21항에 있어서， 상기 KRS를 세포막 위치 특이적으로 존재 수준을 증가시키 는 것은，
KRS의 세포막으로의 이동을 촉진하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 면 역세포의 이동을 조절하는 방법.
【청구항 23]
제 14항에 있어서， 상기 KRS는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함 하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 24】
(A) 시험물질이 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase, KRS)를 저해 하는지 여부를 측정하는 단계 :
(B) 면역세포에 라미닌 (laminine)을 처리하는 단계; 및
(C) 상기 (A) 단계에서 KRS 저해 활성이 있는 것으로 확인된 시험물질을 (B) 단계의 면역세포에 처리하여 면역세포의 이동을 억제하는지 측정하는 단계를 포함 하는 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
【청구항 25]
제 24항에 있어서, 상기 KRS 저해는 KRS 단백질의 발현 저해 또는 활성 저해 인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
【청구항 26】
제 24항에 있어서， 상기 KRS 저해는
(i) KRS 발현 억제;
(ii) 세포막 위치의 KRS수준 (level) 감소; 및
(iii) KRS의 세포막으로의 이동 활성 억제
로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
【청구항 27】
제 24항에 있어서， 상기 라이실 tRNA합성효소는 서열번호 1로 표시되는 아미 노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 28】
제 24항에 있어서， 상기 라미닌은 라미닌 아형 α4β2γ 1CLN421)인 것을 특징 으로 하는 방법 .
【청구항 29]
제 24항에 있어서, 상기 면역세포는 단핵구， 대식세포, 호중구, 호산구, 호염 구， 수지상세포， 자연살해세포， 거핵구, T 세포 및 B 세포로 이루어진 군에서 선택 되는 하나 이상의 것인 스크리닝 방법 .
【청구항 30]
제 24항에 있어서， 상기 면역세포 이동과 관련된 질환은 심혈관 질환， 섬유화 질환， 염증성 질환 및 알포트 증후군 (Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선택 되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
【청구항 31】
제 24항에 있어서， 상기 제제는 s iRNA , shRNA , miRNA, r ibozyme , DNAzyme , PNA(pept ide nuc lei c ac id) , 안티센스 뉴클레오티드， 항체， 앱타머， 펩티드, 펩티 드 모방체 (pept ide mimet i cs) , 기질유사체， 천연추출물 및 화합물로 이루어진 군에 서 선택된 것올 특징으로 하는 스크리닝 방법.
【청구항 32】
(a) 면역세포에 라미닌 및 시험물질을 처리하고 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동을 모니터링 하는 단계 ; 및
(b) 상기 (a) 단계의 면역세포에서 세포막 위치에서의 KRS 수준 또는 KRS의 세포막으로의 이동이 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 낮을 경우에 상 기 시험물질을 면역세포 이동과 관련된 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하 면역세포 이동과 관련된 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
【청구항 33]
면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제의 용도.
【청구항 34]
라이실 tRNA 합성효소 (Lysyl tRNA synthetase , KRS) 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료방법 .
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