KR20060128019A

KR20060128019A - 자외선 유도 세포자멸사의 억제 방법

Info

Publication number: KR20060128019A
Application number: KR1020067019341A
Authority: KR
Inventors: 치카 가타기리; 도시히코 히비노
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2006-12-13
Also published as: US20070160545A1; WO2005089801A1; TW200602084A; EP1733738A1; CN1925872A; JP2005272343A

Abstract

본 발명은 표피 세포의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 항진시킴으로써 표피 세포의 자외선 조사 유도 세포자멸사를 억제하여, 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애의 발증에 대한 저항력을 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애에 대한 저항력을 평가하는 피부 검사 방법으로서, 표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 측정하고, 표피 세포에 있어서의 발현에 비하여 저하되고 있는 경우, 표피의 UV 저항력이 약하다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애에 대한 저항력을 높이는 약제를 스크리닝하는 방법으로서, SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 항진시키는 약제를 UV 저항 강화제로서 선정하는 것을 특징으로 하는 방법을 더 제공한다.

Description

자외선 유도 세포자멸사의 억제 방법{METHOD OF PREVENTING ULTRAVIOLET RAY-INDUCED APOPTOSIS}

본 발명은 편평상피세포암 관련 항원(SCCA-1 및 SCCA-2)의 발현의 항진에 의해 피부의 자외선(UV) 방어 메커니즘을 강화하는 수단을 제공한다.

표피는 자외선(UV) 조사에 의해 여러 가지 장애를 받는 것으로 알려져 있다. 피부에 자외선이 조사되면 색소 침착이 생기지만, 계속적으로 반복 조사되면 표피는 비후화하여 탄력성을 잃는다. 표피의 자외선 장애의 증상으로서 염증, 피부 거칠음, 주름, 처짐, 색소 침착, 얼룩의 착색, 토색화(土色化), 흑자, 자반병의 발증, 모세관 확장 등이 알려져 있는 것에 더하여, 이들은 악성종양의 발증으로 이어지는 경우도 있다. 자외선 장애는 일반적으로 안면, 목덜미, 수족 등, 일광에 습관적으로 노출되는 피부에서 왕왕 발생한다. 특히, 오존층의 파괴에 의해 자외선 조사에 의한 피부 장애는 문제시되고 있다.

표피의 생리학적인 UV 방어 메커니즘에 관한 지견은 기저층의 멜라노사이트가 생성되는 멜라닌에 관한 연구나, 항산화 물질의 탐색·개발이 중심이 되고 있다. 또한, 방사선·자외선 조사가 세포자멸사를 유도하는 것도 알려져(미우라 마사유키, 야마다 다케시 편집: 실험의학 별책 「용어 라이브러리 세포자멸사」 1996), 기저세포에 있어서의 항 세포자멸사 단백질 bcl-2에 대한 연구도 이루어지고 있다(Fang et al., J. Immunol. 1994, 153, 4388-4398; Takahashi et al., Photochem. Photobio1. 2001, 74(4) 579-586). bcl-2는 세포자멸사를 차단 또는 지연시킴으로써 UV 방어 기능을 발휘하는 것으로 생각되고 있다. 그러나, 표피 상층에서의 내존성 UV 방어 단백질 등에 관한 해명은 거의 이루어지고 있지 않다.

발명의 개시

본 발명은 새로운 표피 특이적 UV 방어 메커니즘을 해명하여, 신규하면서 유효한 UV 방어수단을 제공하는 것을 과제로 한다.

피부병의 하나로, 표피 세포의 증식·분화 이상과 염증 세포 침윤을 특징으로 하는 만성, 재발성의 염증성 부전 각화증인 건선이 있다(Hopso-Havu et al. British Journal of Dermatology(1983) 109, 77-85). 건선은 유전적 소인에 여러 가지 환경 인자가 더해져 발증하는 것으로 생각된다. 건선이 발증한 표피와 정상 표피를 비교하면, 건선 표피의 상층에서 편평상피암 관련 항원(Squamous Cell Carcinoma Antigen, 이하 「SCCA」라 약칭함)의 발현의 항진이 확인되는 것이 알려져 있다(Takeda A. et al., J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154). SCCA는 자궁 경부 편평상피암 세포로부터 발견된 항원으로서, 자궁 경부, 폐, 식도, 피부의 편평상피암에서 높은 혈중 농도를 나타내고, 편평상피암의 진단이나 치료 효과의 판정에 자주 이용되고 있다. SCCA는 피부 편평상피암의 진단에도 이용되지만, 본 발명자의 연구에서는 피부에 있어서의 편평상피암에 있어서 SCCA 발현은 높지 않은 것이 확인되었다. SCCA는 염색체 18q21.3 상에 일렬로 배열되어 있는 2개의 유전자 SCCA-1 및 SCCA-2에 의해 코딩된다. SCCA-1 및 SCCA-2 모두 분자량 약 45,000의 단백질로서, 매우 상동성이 높지만, 반응 부위의 아미노산 배열이 달라, 상이한 기능을 갖고 있다고 생각되고 있다(Schick et al. J. Bio1. Chem.(1997)27213, 1849-55).

본 발명자는 SCCA-1 및 SCCA-2에 주목하여 피부 UV 방어 메커니즘의 검토를 행하였다. 면역 조직적 방법이나 현장(in situ) 하이브리다이제이션 결과, 노광 부위 피부의 SCCA의 발현은 비노광 부위에 비하여 현저히 항진하고 있는 것이 명백해졌다. 또한, 인간 피부로의 UV 조사에 의해 유극층(有棘層) 및 과립층에서 SCCA의 발현이 강력하게 항진되는 것이 명백해졌다. 기저층에서의 단백질 발현은 확인되지 않았다. 또한, 3차원 피부 모델, 배양 인간 각화 세포에서도 마찬가지로 UV 조사에 의한 SCCA 발현의 항진은 확인되었다.

본 발명자는 다음에 SCCA 발현이 확인되지 않은 3T3 세포에 인간 SCCA-1 및 SCAA-2 유전자를 도입하여 안정 발현계를 확립하였다. 아넥신(Annexin) V-FITC 및 프로피듐 요오드(PI)를 세포자멸사 지표에 FACS(형광 활성화 세포 분류)로 해석한 결과, 어느 쪽 SCCA 안정 발현계에서도 UV 조사에 의한 세포자멸사가 유의하게 감소되는 것이 명백해졌다.

또한, SCCA를 고발현시키는 HaCat 세포에 pSilencer 벡터에 의해 항상적으로 siRNA를 발현시키는 RNA 간섭법에 의해 SCCA-1 및 SCCA-2의 녹다운(siSCCA) 세포주를 수립하였다. 정량적 PCR에 의해 siSCCA 세포주에 있어서의 SCCA 발현이 90% 이상 억제되고 있는 것이 확인되었다. 75 mJ/㎠의 UV 조사를 행한 결과, 대조군 주에서는 38%의 세포가 세포자멸사를 일으키는 데 반하여, siSCCA 세포주에서는 약 80%의 세포가 세포자멸사를 일으키는 것이 명백해졌다.

이상의 결과를 정리하면, SCCA가 UV 방어 메커니즘을 담당하는 주요 단백질인 것이 분명하다.

본 발명은 상기한 지견에 기초하여 완성된 것으로서, 그 제1 관점에 있어서, 표피 세포의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 항진시킴으로써 표피 세포의 세포자멸사를 억제하는 방법을 제공한다. 적합한 태양에 있어서, 세포자멸사는 자외선 조사에 의해 유도되는 세포자멸사이며, 따라서, 이 방법에 의해 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애의 발증에 대한 저항력을 높일 수 있다. 표피 세포에는 각화 세포, 과립 세포, 유극 세포 등이 포함된다.

다른 관점에 있어서, 본 발명은 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애에 대한 저항력(이하, 「UV 저항력」이라 칭하는 경우도 있음)을 평가하는 피부 검사 방법을 제공한다. 이 방법은 표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현이 표피 세포의 발현에 비하여 저하되고 있는 경우, 표피의 UV 저항력이 약하다고 판단하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현의 항진은 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 양을 측정함으로써 결정한다. 이러한 측정은 예컨대 SCCA-1 및/또는 SCCA-2에 특이적인 항체를 이용하는 ELISA법 또는 RIA법에 의해 실시할 수 있다. 이외에 표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현의 항진은 표피 세포로부터 추출된 SCCA-1 및/또는 SCCA-2를 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정하여도 좋다. 이러한 mRNA의 측정은 폴리머라아제 연쇄 반응법(PCR), 바람직하게는 리얼 타임 PCR에 의해 행할 수 있다.

또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애에 대한 저항력을 높이는 약제(이하, 「UV 저항 강화제」라고 칭하는 경우가 있음)를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 항진시키는 약제를 UV 저항 강화제로서 선정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의해 피부의 UV 저항력을 높이는 방법, 피부의 UV 저항력을 검사하는 방법이나, 신규 UV 저항 강화제의 제공이 가능해진다.

도 1은 노광 및 비노광 부위의 표피에 있어서의 SCCA의 발현을 도시한 도면.

도 2는 UV 조사에 의한 표피에 있어서의 SCCA의 발현의 변동을 도시한 도면.

도 3은 배양 인간 각화 세포에 있어서의 SSCA 발현에 대한 UV 조사의 영향을 도시한 도면.

도 4는 SCCA 고발현 세포와 SCCA 비발현 세포와의 UV 조사에 의해 유도되는 세포자멸사율의 비교를 도시한 도면.

도 5는 SSCA 녹다운 세포주의 수립을 도시한 도면.

도 6은 SCCA 녹다운 세포와 대조군 세포와의 UV 조사에 의해 유도되는 세포자멸사율의 비교를 도시한 도면.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

전술한 바와 같이, SCCA와 자외선 조사 사이에서의 관계의 존재를 시사하는 보고는 없으며, SCCA가 자외선 유도 세포자멸사를 억제할 수 있는 것은 본 발명자가 처음으로 발견한 놀랄만한 사실이다.

본 발명은, 제1 관점에 있어서, 표피 세포의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 항진시킴으로써 표피 세포의 세포자멸사, 바람직하게는 자외선 조사에 의해 유도되는 세포자멸사를 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법에 의해 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애의 발증에 대한 저항력을 높일 수 있다.

SCCA는 전술한 바와 같이 자궁 등의 편평상피암세포나 건선 표피에 존재하는 분자량 약 45,000의 단백질이다. SCCA-1 및 SCCA-2의 아미노산 배열 및 이들을 코딩하는 핵산 배열은 문헌[Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154(2002)(전술)]에 기재되어 있다. 표피 세포의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현의 항진은 예컨대 그 발현을 항진시키는 약제를 적용함으로써 달성할 수 있다. 약제로서는 SCCA-1 및/또는 SCCA-2 자체를 사용하여도 좋다.

피검체에 있어서의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2를 코딩하는 유전자가 불활성 상태 또는 침묵 상태에 있고, 그 결과 세포가 SCCA-1 및/또는 SCCA-2 결손 상태에 있을 때에는 SCCA-1 및/또는 SCCA-2 유전자 자체를 표피 세포에 도입함으로써, 혹은 SCCA-1 및/또는 SCCA-2 유전자의 발현을 항진시키는 조절 배열, 예컨대 촉진자나 증강 인자를 이들 유전자에 대하여 작용 가능한 위치에 배치함으로써 달성할 수도 있다.

SCCA-1 및/또는 SCCA-2를 코딩하는 유전자를 세포 내에 도입하는 방법으로서 는 바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입 방법, 혹은 비바이러스성 유전자 도입 방법[닛케이 사이언스, 1994년 4월호, 20∼45 페이지, 실험의학 증간, 12(15)(1994), 실험의학 별책 「유전자 치료의 기초 기술」, 요도샤(1996)] 중 어느 방법이나 적용할 수 있다. 바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 방법으로서는 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의 DNA 바이러스, 또는 RNA 바이러스에, SCCA-1 및/또는 SCCA-2를 코딩하는 DNA를 삽입하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아바이러스를 이용한 방법이 특히 바람직하다. 비바이러스성 유전자 도입 방법으로서는 발현 플러스미드를 직접 근육 내에 투여하는 방법(DNA 백신법), 리포좀법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 백신법, 리포좀법이 바람직하다. 또한, 상기 유전자를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해서는 DNA를 직접 체내에 도입하는 생체내(in vivo)법 및 인간으로부터 어떤 종류의 세포를 빼내어 체외에서 DNA를 그 세포에 도입하고, 그 세포를 체내로 되돌리는 생체외(ex vivo)법이 있다[닛케이 사이언스, 1994년 4월호, 20∼45 페이지, 월간약사, 36(1), 23-48(1994), 실험의학 증간, 12(15) (1994)]. 생체내법이 보다 바람직하다. 생체내법에 의해 투여되는 경우는, 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예컨대, 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육내 등에 투여할 수 있다. 생체내법에 의해 투여하는 경우는, 일반적으로는 주사제 등이 되고, 필요에 따라 관용의 담체를 첨가하여도 좋다. 또한, 리포좀 또는 막융합 리포좀(센다이바이러스(HVJ)-리포좀 등)의 형태로 한 경우는, 현탁제, 동결제, 원심 분리 농축 동결제 등의 리포좀 제제로 할 수 있다.

제2 관점에 있어서, 본 발명은 피부의 UV 저항력을 평가하는 피부 검사 방법을 제공한다. 이 방법은 표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현이 표피 세포의 발현에 비하여 저하되고 있는 경우, 표피의 UV 저항력이 약하다고 판단하는 것을 특징으로 한다.

그 평가 기준으로서, 예컨대 표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현이 대조군값에 비하여 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 50% 이상, 또는 70% 이상, 또는 100% 저하되고 있다면 「피부의 UV 저항력이 약하다」고 판단하여도 좋다. 대조군값으로서는 예컨대 통계학적으로 유의한 수(예컨대 10인분 이상, 바람직하게는 100인분 이상)의 건강한 성인의 대응하는 부위에 있어서의 표피 세포의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현량의 평균치라도 좋다.

표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 항진은 예컨대 표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 양을 직접 측정함으로써 결정할 수 있다. 바람직하게는 이 측정은 SCCA-1 및/또는 SCCA-2에 특이적인 항체를 이용하고, 당업계에 있어서 주지의 방법, 예컨대 형광 물질, 색소, 효소 등을 이용하는 면역 염색법, 웨스턴 블롯법, 면역 측정 방법, 예컨대 ELISA법, RIA법 등의 여러 가지 방법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 피부로부터 RNA를 추출하여 SCCA-1 및/또는 SCCA-2를 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정할 수도 있다. mRNA의 추출, 그 양의 측정도 당업계에 있어서 주지이며, 예컨대 RNA의 정량은 정량 폴리머라아제 연쇄 반응법(PCR)에 의해 행해진다. 이상의 것 이외에, SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 기지의 생물 활성을 측정함으로써 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현량을 측정할 수도 있다. 이외에, SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현은 현장 하이브리다이제이션법이나 그 생물 활성의 측정을 통하여 결정할 수 있다.

본 발명은 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애에 대한 저항력을 높이는 UV 저항 강화제를 스크리닝하는 방법을 더 제공한다. 이 방법은 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 항진시키는 약제를 UV 저항 강화제로서 선정하는 것을 특징으로 한다. SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현의 항진은 전술한 바와 같이 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 양의 측정, 표피 세포로부터 추출된 SCCA-1 및/또는 SCCA-2를 코딩하는 mRNA의 양의 측정 등에 의해 실시할 수 있다.

적합한 형태에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 상기 항진 능력을 갖는 후보 약제를 모델 동물, 바람직하게는 SCCA-1 및/또는 SCCA-2 결손 동물에게 적용하여 UV 저항력을 강화하는 후보 약제를 선정하는 것을 더 포함하여 이루어진다.

표피 세포의 UV 저항력의 평가는 예컨대 표피 세포에 자외선을 조사함으로써 유도되는 세포자멸사를 억제하는 활성을 검토함으로써 행할 수 있다. 세포자멸사 평가는 당업자 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 예컨대, 세포자멸사 평가는 FACS COULTER(EPIX XL-MCL, Beckman Coulter)를 이용하여 아넥신 V-FITC 및 프로피듐 요오드(PI) 이중 염색법(Annexin V-FITC kit, Immunotech)을 지표로 하는 FACS(형광 활성화 세포 분류) 해석에 의해 행할 수 있다. 그 평가 기준으로서 예컨대 표피 세포의 세포자멸사를 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게 는 70% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 억제하였다면, 「피부의 UV 저항력을 높인다」라고 판단하여도 좋다.

이하, 구체예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 또한, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않는다.

실시예

면역 조직 화학적 검사

표피 생검을 AMeX 순서[Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435(1986)]에 따라 냉각 아세톤으로 고정하고 나서 파라핀 속에 포매(包埋)하였다. 절편을 크실렌으로 탈 파라핀 처리하고, 아세톤, 계속해서 PBS로 세정하였다. 다음에 그 절편의 비특이적 결합 부위를 10% 정상 염소 혈청(Histofine, Tokyo, Japan)으로 블로킹하였다.

표피 절편을 항-SCCA-1 모노크로날 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(1:500으로 희석), 항-SCCA-2 모노크로날 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(1:500으로 희석) 또는 항-SCCA 폴리크로날 항체[Takeda A. et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154(2002)에 기재된 바와 같이 하여 정제]의 각각과 배양하였다. PBS로 세정한 후, 절편을 헤마톡실린으로 카운터 염색하고, DAKO Envision System(DAKO Corp., CA, USA)으로 관찰을 행하였다.

도 1은 표피 검체로서 비노광 부위인 상완부(인간 24세), 둔부(인간 46세), 대퇴부(인간 75세) 유래의 표피 및 노광 부위인 볼부(인간 20세, 76세), 눈꺼풀(인간 82세) 유래의 표피를 채취하고, 항체로서 SCCA-1 및 SCCA-2의 양쪽에 결합하는 항-SCCA 폴리크로날 항체를 이용하여 현미경 관찰한 결과이다. 도 1로부터, 비노광 부위에 비하여 노광 부위의 표피 상층에서 SCCA가 현저히 항진하고 있는 것을 알 수 있다. 그러나, 노광 부위라도 기저층에서는 SCCA의 발현의 항진은 확인되지 않았다.

도 2는 표피 검체로서 UV 조사(트랜스 루미네이터 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)을 이용하여 2MED(Minimum Erythema Dose)의 조사량으로 조사)를 행한 인간 표피 및 조사를 행하지 않은 대조군 표피에 있어서의 SCCA-1 및 SCCA-2의 각각의 발현의 현미경 관찰 결과이다. 항체로서 항-SCCA-1 모노크로날 항체및 항-SCCA-2 모노크로날 항체 각각을 사용하였다. 도 2로부터, SCCA-1 및 SCCA-2 모두 인간 표피에 UV를 조사함으로써 발현이 항진되는 것이 명백해졌다. 또한, 발현의 항진은 표피 유극층 및 과립층에서 현저하였다.

이상에 의해, 표피에 UV가 조사되면, 표피, 특히 그 유극층 및 과립층에서 SCCA-1 및 SCCA-2의 발현이 항진되는 것이 명백해졌다.

정량 PCR 실험

다음에, 표피에서의 SCCA-1 및 SCCA-2의 발현이 UV 조사에 의해 항진되는 것을 유전자 레벨에서 확인하는 실험을 행하였다.

인간 각화 세포를 케라티노사이트 SFM 배지(GIBC0, Invitrogen) 중, L-글루타민 및 상피세포 성장 인자의 존재 하에서 고습, CO₂ 5%의 분위기에 있어서, 37℃에서 배양하였다. 최밀도 60∼70%의 세포에 UVB를 0∼48시간에 걸쳐 조사하였다. UVB 조사는 트랜스 루미네이터 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)을 이용하여 30 mJ/㎠의 강도로 행하였다. 대조군 세포에는 UVB 조사를 행하지 않았다.

상기 배양 세포로부터 총 RNA를, Isogen(Nippon Gene)을 이용하여 첨부한 설명서에 따라 단리 정제하였다. SCCA-1 및 SCCA-2 각각의 발현 레벨을 정량 리얼타임·폴리머라아제 연쇄 반응법(PCR)에 의해 결정하였다. 간단하게는, 총 RNA를 Superscript II(캐나다 칼스배드 소재의 Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 변환시켰다. 그 시료를 ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(캐나다 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)을 이용하여 2-스텝 PCR을 40 사이클 행하여 증폭시켰다. 내부 표준으로서 G3PDH(글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나아제)를 이용하였다.

사용한 프라이머는 다음과 같다.

SCCA-1:

순방향 프라이머

5'-GTGCTATCTGGAGTCCT-3'(배열 번호 1)

역방향 프라이머

5'-CTGTTGTTGCCAGCAA-3'(배열 번호 2)

Taq Man 프로브

5'-CATCACCTACTTCAACT-3'(배열 번호 3)

SCCA-2:

순방향 프라이머

5'-CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3'(배열 번호 4)

역방향 프라이머

5'-TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3'(배열 번호 5)

Taq Man 프로브

5'-AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3'(배열 번호 6)

G3PDH:

순방향 프라이머

5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(배열 번호 7)

역방향 프라이머

5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(배열 번호 8)

Taq Man 프로브

5'-AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3'(배열 번호 9)

리포터 색소(6-카르복시-플루오레세인)를 Taq Man 프로브 배열의 5' 말단에 결합시키고, 그리고 억제제 색소(6-카르복시-테트라메틸-로다민)를 그 3' 말단에 삽입시켰다.

도 3에 배양 인간 각화 세포에 있어서의 SCCA의 발현에 대한 UVB 조사의 영향의 결과를 도시한다. SCCA-1, SCCA-2 모두 UV 조사에 의해 발현이 항진되는 것이 명백해졌다. 따라서, 표피 세포는 UV 조사에 의해 유전자 레벨에서 SCCA-1, SCCA-2의 발현이 항진되는 것이 명백해졌다.

UV 조사에 있어서의 SCCA의 역할의 검토

이상에 의해, 표피 세포에서는, UV 조사를 받음으로써 SCCA-1 및 SCCA-2의 발현이 항진되는 것이 해명되었다. 다음에, SCCA-1 및 SCCA-2가 UV 조사를 받은 표피 세포에 있어서 어떠한 역할을 담당하고 있는지를 검토하였다.

SCCA-1 및 2 고발현 세포의 수립

3T3 세포(ATCC로부터 입수)는 SCCA-1 및 2를 발현시키지 않는 마우스 태아 유래의 세포이다. 이 세포에 하기와 같이 SCCA-1 또는 2를 코딩하는 유전자를 도입하였다.

SCCA-1 및 SCCA-2의 cDNA[Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154(2002)]를 Bam HI 및 Kpn I로 이중 소화(消化)하였다. 이들을 pTarget 벡터 중에 서브클로닝하고, 계속해서 Lipofectamine Plus(GIBC0, Invitrogen Corp.)를 이용하여 3T3 세포에 도입하였다. 간단히 설명하면, 무혈청 DMEM 배지(Invitrogen Corp.) 675 ㎕ 중의 cDNA 20 ㎍을 75 ㎕의 Plus 시약과 혼합하여 25℃에서 15분 방치하였다. Lipofectamine(100 ㎕)을 650 ㎕의 무혈청 DMEM 배지에 첨가하고, 계속해서 그것을 상기 cDNA-Plus 혼합물에 첨가하여 25℃에서 15분 방치하였다. 이 cDNA 혼합물을 10 ㎖의 무혈청 DMEM 배지에 첨가하여 3T3 세포를 그 속에서 37℃에서 4시간, 5%의 CO₂분위기 하에서 배양하였다. 그 배지를 10%의 FCS(Invitrogen Corp.) 함유의 DMEM 배지와 교환하여 밤새 배양하였다. 다음날, G418(Calbiochem)을 최종 농도 500 μg/㎖가 되도록 첨가하였다. G418은 배양 기간 중 이 농도로 유 지해 두었다. 배지는 2∼3일 마다 교환하였다. 배양 4주일 후, 몇 개의 G418 내성 콜로니를 단리할 수 있어 SCCA-1 및 SCCA-2 발현 세포계가 수립되었다.

SCCA-1을 코딩하는 cDNA가 도입된 세포(SCCA-1 도입 세포)는 SCCA-1을 특이적이면서 안정적으로 발현시키고, 그리고 SCCA-2를 코딩하는 cDNA가 도입된 세포(SCCA-2 도입 세포)는 SCCA-2를 특이적이면서 안정적으로 발현시키는 것이 확인되었다. 또한, 동일한 조작으로 비특이적인 배열이 도입된 3T3 세포(대조군 세포)는 SCCA-1, SCCA-2 모두 발현되지 않았다.

상기 SCCA-1 도입 세포, SCCA-2 도입 세포 및 대조군 세포를 이용하여 UV 조사를 부여했을 때의 SCCA-1, SCCA-2가 수행하는 역할에 대해서 검토하였다. 상세하게는, 표피 세포에 있어서의 UV 유도 세포자멸사에 대한 SCCA-1, SCCA-2의 역할에 대해서 검토하였다.

상기 각종 세포를 10%의 FCS를 함유하는 DMEM 배지 중에서 고습, CO₂ 5%의 분위기 하에 37℃에서 배양하였다. 밀집도 60∼70%의 세포에 UVB를 0∼48시간에 걸쳐 조사하였다. UVB 조사는 트랜스 루미네이터 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)을 이용하여 30 mJ/㎠의 강도로 행하였다.

이들 세포에 대한 세포자멸사 평가는 FACS COULTER(EPIX XL-MCL, Becjman Coulter)를 이용하여 아넥신 V-FITC 및 프로피듐 요오드(PI) 이중 염색법(Annexin V-FITC kit, Immunotech)을 지표로 하는 FACS(형광 활성화 세포 분류) 해석에 의해 행하였다.

그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4로부터 밝혀진 바와 같이, SCCA-1 및 SCCA-2 도입 세포 모두 UV 조사에 의한 세포자멸사가 유의하게 감소되는 것이 확인되었다. 따라서, SCCA-1 및 SCCA-2 모두 UV에 의해 유도되는 세포자멸사를 억제할 수 있는 것으로 추정되었다.

이것을 확인하기 위해서, 본 발명자는 다음에 SCCA-1 및 SCCA-2 녹다운 세포주를 RNA 간섭법에 의해 수립하여, UV 조사에 있어서의 표피 세포 내에서의 SCCA-1 및 SCCA-2의 역할에 대해서 더 검토하였다.

SCCA 녹다운 세포의 수립

HaCat 세포[H. Hans. et al. Experimental Cell Research 239, 399-410(1998)]는 SCCA를 고발현시키는 인간 각화 세포이다. 이 세포에 RNA 간섭법에 따라 pSilencer 벡터(Ambion)에 의해 항상적으로 siRNA(short interference RNA)를 발현시킴으로써, SCCA-1 및 2의 녹다운 세포주를 수립하였다.

siRNA는 pSilencer 벡터를 이용하여 첨부한 설명서에 따라 구축하였다. 상세하게는, SCCA를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66 위치에 상보성의 21mer의 올리고뉴클레오티드(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T: 배열 번호 10)를 함유하는 65mer의 센스 올리고뉴클레오티드(배열 번호 11)와, 뉴클레오티드 번호 46∼66 위치에 상동의 21mer의 올리고뉴클레오티드(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T; 배열 번호 12)를 함유하는 65mer의 안티센스 올리고뉴클레오티드(배열 번호 13)로 이루어진 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 pSilencer 벡터의 Hind III 부위 및 Bam HI 부위에 클로닝하였다. HaCat 세포로의 트랜스펙션은 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하 여 첨부한 설명서에 따라 행하였다. 대조군 세포는 포유 동물의 유전자 배열과 유의한 상동성, 상보성을 갖지 않는 2중 올리고뉴클레오티드로 이루어진 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제작하였다. 안정된 세포계는 트랜스펙션 세포를 하이그로마이신-B 선택 배지 중에서 4∼6주간 배양하여 선택을 행함으로써 획득하였다. SCCA의 발현이 억제되고 있는 것을 확인하기 위해서 전술한 바와 같이 하여, 리얼 타임 PCR에 의해 SCCA-1 및 SCCA-2의 발현을 측정하였다.

센스 올리고뉴클레오티드(배열 번호 11)

GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGA ACATGAACTTGGTGTTGGCTTTTTTGGAAA

(밑줄 친 부분이 상동 영역)

안티센스 올리고뉴클레오티드(배열 번호 13)

AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGT TCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG

(밑줄 친 부분이 상보성 영역)

그 결과를 도 5에 나타낸다. 상기 siRNA가 도입된 세포에서는, 대조군에 비하여 SCCA-1 및 2 모두 발현이 90% 이상 억제(녹다운)되어 있는 것이 확인되었다.

상기 녹다운 세포 및 대조군 세포를 이용하여 표피 세포에 있어서의 UV 유도 세포자멸사에 대한 SCCA-1, 2의 역할에 대해서 검토하였다.

상기 각종 세포를 케라티노사이트 SFM 배지(GIBCO, Invitrogen) 중, L-글루타민 및 상피세포 성장 인자의 존재 하에서 고습, CO₂ 5%의 분위기 하에 37℃에서 배양하였다. 밀집도 60∼70%의 세포에 UVB를 조사하였다. UVB 조사는 트랜스 루미 네이터 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)을 이용하여 75 mJ/㎠c의 강도로 행하였다.

이들 세포에 대한 세포자멸사 평가를 FACS COULTER를 이용하여 아넥신 V-FITC 및 프로피듐 요오드(PI) 이중 염색법을 지표로 하는 FACS(형광 활성화 세포 분류) 해석에 의해 행하였다.

그 결과를 도 6에 나타낸다. 녹다운 세포에 UV 조사를 행한 결과, 대조군 세포에서는 38%의 세포가 세포자멸사를 일으키는 데 반하여, 녹다운 세포에서는 약 80% 가량의 세포가 세포자멸사를 일으키는 것이 명백해졌다. 따라서, SCCA는 UV 조사에 의해 유도되는 표피 세포의 세포자멸사를 유의하게 억제하는 것을 알 수 있었다. 따라서, SCCA는 표피 세포의 UV 방어 기구를 담당하는 것으로 생각된다.

SEQUENCE LISTING <110> SHISEIDO CO. LTD. <120> Method for Reducing Ultraviolet Light Induced Apoptosis <130> 1034468 <140> JP 2004-087051 <141> 2004-03-24 <160> 13 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 1 gtgctatctg gagtcct 17 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 2 ctgttgttgc cagcaa 16 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Taq Man Probe <400> 3 catcacctac ttcaact 17 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 4 ctctgcttcc tctaggaac acag 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 5 tgttggcgat cttcagctca 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Taq Man Probe <400> 6 agttccagat cacatcgagt t 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 7 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 8 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Taq Man Probe <400> 9 aggctgagaa cgggaagctt gt 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> SiRNA Target Sequence <400> 10 acatgaactt ggtgttggct t 21 <210> 11 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Sense Oligonucleotide for SiRNA <400> 11 gatcccggcc aacaccaagt tcatgtttca agagaacatg aacttggtgt tggctttttt 60 ggaaa 65 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> SiRNA Target Sequence <400> 12 aagccaacac caagttcatg t 21 <210> 13 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Antisense Oligonucleotide for SiRNA <400> 13 agcttttcca aaaaagccaa caccaagttc atgttctctt gaaacatgaa cttggtgttg 60 gccgg 65

Claims

표피 세포의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 항진시킴으로써 표피 세포의 세포자멸사를 억제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포자멸사가 자외선 조사에 의해 유도되고, 그리고 상기 방법에 의해 피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애의 발증에 대한 저항력이 높아지는 것인 방법.
피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애에 대한 저항력을 평가하는 피부 검사 방법으로서, 표피 세포 중의 SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 측정하여 표피 세포에 있어서의 발현에 비하여 저하되고 있는 경우, 표피의 UV 저항력이 약하다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을, SCCA-1 및 SCCA-2의 각각에 특이적인 항체를 이용하는 ELISA법 또는 RIA법에 의해 측정하는 것인 검사 방법.
제3항에 있어서, SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을, 표피 세포로부터 추출된 SCCA-1 및/또는 SCCA-2를 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 측정하는 것인 검사 방법.
피부의 자외선 조사에 의한 피부 장애에 대한 저항력을 높이는 약제를 스크리닝하는 방법으로서, SCCA-1 및/또는 SCCA-2의 발현을 항진시키는 약제를 UV 저항 강화제로서 선정하는 것을 특징으로 하는 방법.