JP2005272343A - 紫外線誘導アポトーシスの抑制方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は、新たな表皮特異的UV防御メカニズムを解明し、新規かつ有効なUV防御手段を提供することを課題とする。
【解決手段】 本発明は、表皮細胞のSCCA−1及び/−2の発現を亢進させることで、表皮細胞の紫外線照射誘導アポトーシスを抑制し、肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力を高める方法を提供する。さらに、本発明は肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を評価する肌検査方法であって、表皮細胞中のSCCA−1及び/又は−2の発現を測定し、表皮細胞における発現と比べて低下している場合、表皮のUV抵抗力が弱いと判断することを特徴とする方法を提供する。さらに、本発明は肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高める薬剤をスクリーニングする方法であって、SCCA−1及び/又は−2の発現を亢進する薬剤をUV抵抗強化剤として選定することを特徴とする方法を提供する。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明は、表皮細胞のSCCA−1及び/−2の発現を亢進させることで、表皮細胞の紫外線照射誘導アポトーシスを抑制し、肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力を高める方法を提供する。さらに、本発明は肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を評価する肌検査方法であって、表皮細胞中のSCCA−1及び/又は−2の発現を測定し、表皮細胞における発現と比べて低下している場合、表皮のUV抵抗力が弱いと判断することを特徴とする方法を提供する。さらに、本発明は肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高める薬剤をスクリーニングする方法であって、SCCA−1及び/又は−2の発現を亢進する薬剤をUV抵抗強化剤として選定することを特徴とする方法を提供する。
【選択図】 なし
Description
本発明は、扁平上皮細胞癌関連抗原(SCCA−1及びSCCA−2)の発現の亢進により肌の紫外線(UV)防御メカニズムを強化する手段を提供する。
表皮は紫外線(UV)照射により様々な障害を受けることで知られる。皮膚に紫外線が照射されると色素沈着が生じるが、継続的に反復照射されると表皮は肥厚化し、弾力性を失う。表皮の紫外線障害の症状として、炎症、肌荒れ、しわ、たるみ、色素沈着、斑の着色、土色化、ほくろ、紫斑病の発症、毛細管拡張などが知られているのに加え、それらは悪性腫瘍の発症につながることもある。紫外線障害は、一般に顔面、首筋、手足など、日光に習慣的に曝される皮膚にて往々にして起こる。特にオゾン層の破壊により、紫外線照射による皮膚障害は問題視されている。
表皮の生理学的なUV防御メカニズムに関する知見は基底層のメラノサイトが産生するメラニンに関する研究や、抗酸化物質の探索・開発が中心となっている。また、放射線・紫外線照射がアポトーシスを誘導することも知られ(三浦正幸、山田武編:実験医学別冊「用語ライブラリーアポトーシス」1996)、基底細胞における抗アポトーシスタンパク質bcl−2についての研究もなされている(Fangら、J. Immunol. 1994, 153, 4388-4398; Takahashiら、Photochem. Photobiol. 2001, 74(4) 579-586)。bcl−2はアポトーシスを遮断又は遅延させることでUV防御機能を発揮するものと考えられている。しかしながら、表皮上層における内存性UV防御タンパク質などに関する解明はほとんどなされていない。
三浦正幸他編:実験医学別冊「用語ライブラリーアポトーシス」19996
J. Immunol. 1994, 153, 4388-4398
Photochem. Photobiol. 2001, 74(4) 579-586
British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85
J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)
J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55
本発明は、新たな表皮特異的UV防御メカニズムを解明し、新規かつ有効なUV防御手段を提供することを課題とする。
皮膚病の一つに、表皮細胞の増殖・分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性、再発性の炎症性不全角化症である乾癬がある(Hopso-Havu et al. British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85)。乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が加わって発症すると考えられる。乾癬の発症した表皮と正常表皮とを比較すると、乾癬表皮の上層において扁平上皮癌関連抗原(Squamous Cell Carcinoma Antigen、以下「SCCA」と称す)の発現の亢進が認められることが知られる(Takeda A.ら、 J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154)。SCCAは子宮頚部扁平上皮癌細胞から見出された抗原であり、子宮頚部、肺、食道、皮膚の扁平上皮癌で高い血中濃度を示し、扁平上皮癌の診断や治療効果の判定によく利用されている。SCCAは皮膚扁平上皮癌の診断にも利用されるが、本発明者の研究においては、皮膚における扁平上皮癌においてSCCA発現は高くないことが認められた。SCCAは染色体18q21.3上にタンデムに並んでいる二つの遺伝子SCCA−1及びSCCA−2によりコードされる。SCCA−1及びSCCA−2共に分子量約45,000のタンパク質であり、非常に相同性が高いが、反応部位のアミノ酸配列が異なり、異なる機能を有していると考えられている(Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55)。
本発明者はSCCA−1及びSCCA−2に注目して皮膚UV防御メカニズムの検討を行った。免疫組織的方法や、in situ ハイブリダイゼーションの結果、露光部位皮膚のSCCAの発現は非露光部位と比較して顕著に亢進していることが明らかとなった。さらに、ヒト皮膚へのUV照射により有棘層及び顆粒層においてSCCAの発現が強力に亢進することが明らかになった。基底層におけるタンパク質発現は認められなかった。また、三次元皮膚モデル、培養ヒト角化細胞でも同様にUV照射によるSCCA発現の亢進は確認された。
本発明者は次にSCCA発現の認められない3T3細胞にヒトSCCA−1及びSCAA−2遺伝子を導入し、安定発現系を確立した。アネキシン(Annexin)V−FITC及びプロピジウムイオダイン(PI)をアポトーシス指標にFACS(蛍光活性化セルソーティング)で解析した結果、いずれのSCCA安定発現系においてもUV照射によるアポトーシスが有意に減少することが明らかになった。
さらに、SCCAを高発現するHaCat細胞にpSilencerベクターで恒常的にsiRNAを発現させるRNA干渉法によりSCCA−1及びSCCA−2のノックダウン(siSCCA)細胞株を樹立した。定量的PCRによりsiSCCA細胞株におけるSCCA発現が90%以上抑制されていることが確認された。50mJ/cm2のUV照射をした結果、コントロール株では38%の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、siSCCA細胞株では約80%の細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかとなった。
以上の結果をまとめると、SCCAがUV防御メカニズムを担う主要タンパク質であることが明らかである。
本発明者は次にSCCA発現の認められない3T3細胞にヒトSCCA−1及びSCAA−2遺伝子を導入し、安定発現系を確立した。アネキシン(Annexin)V−FITC及びプロピジウムイオダイン(PI)をアポトーシス指標にFACS(蛍光活性化セルソーティング)で解析した結果、いずれのSCCA安定発現系においてもUV照射によるアポトーシスが有意に減少することが明らかになった。
さらに、SCCAを高発現するHaCat細胞にpSilencerベクターで恒常的にsiRNAを発現させるRNA干渉法によりSCCA−1及びSCCA−2のノックダウン(siSCCA)細胞株を樹立した。定量的PCRによりsiSCCA細胞株におけるSCCA発現が90%以上抑制されていることが確認された。50mJ/cm2のUV照射をした結果、コントロール株では38%の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、siSCCA細胞株では約80%の細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかとなった。
以上の結果をまとめると、SCCAがUV防御メカニズムを担う主要タンパク質であることが明らかである。
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたものであり、その第一の観点において、表皮細胞のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現を亢進させることで、表皮細胞のアポトーシスを抑制する方法を提供する。好適な態様において、アポトーシスは紫外線照射により誘導されるアポトーシスであり、従って、当該方法により、肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力を高めることができる。表皮細胞には、角化細胞、顆粒細胞、有棘細胞等が含まれる。
別の観点において、本発明は肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力(以下、「UV抵抗力」と称する場合もある)を評価する肌検査方法を提供する。この方法は、表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現が表皮細胞の発現と比べて低下している場合、表皮のUV抵抗力が弱いと判断することを特徴とする。
好ましくは、表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現の亢進は、細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の量を測定することにより決定する。かかる測定は、例えばSCCA−1及び/又はSCCA−2に特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法により実施することができる。他に、表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現の亢進は、表皮細胞から抽出されたSCCA−1及び/又はSCCA−2をコードするmRNAの量を測定することにより決定してよい。かかるmRNAの測定はポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、好ましくはリアルタイムPCRにより行うことができる。
更なる別の観点において、本発明は、肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高める薬剤(以下、「UV抵抗強化剤」と称する場合がある)をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、SCCA−1及び/又はSCCA−2の発現を亢進する薬剤をUV抵抗強化剤として選定することを特徴とする。
本発明により、肌のUV抵抗力を高める方法、肌のUV抵抗力を検査する方法や、新規UV抵抗強化剤の提供が可能となる。
前述のとおり、SCCAと紫外線照射との間での関係の存在を示唆する報告はなく、SCCAが紫外線誘導アポトーシスを抑制できることは本発明者がはじめて見出した驚くべき事実である。
本発明は、第一の観点において、表皮細胞のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現を亢進させることで、表皮細胞のアポトーシス、好ましくは紫外線照射により誘導されるアポトーシスを抑制する方法を提供する。当該方法により、肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力を高めることができる。
SCCAは上述のとおり扁平上皮癌細胞や乾癬表皮に存在する分子量約45,000のタンパク質である。SCCA−1及びSCCA−2のアミノ酸配列及びそれらをコードする核酸配列はTakeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)(前掲)に記載されている。表皮細胞のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現の亢進は、例えばその発現を亢進させる薬剤を適用することにより達成できる。薬剤としては、SCCA−1及び/又はSCCA−2自体を使用してもよい。
被験体におけるSCCA−1及び/又はSCCA−2をコードする遺伝子が不活性状態又は沈黙状態にあり、その結果細胞がSCCA−1及び/又はSCCA−2欠損状態にあるときは、SCCA−1及び/又はSCCA−2遺伝子自体を表皮細胞に導入することで、あるいはSCCA−1及び/又はSCCA−2遺伝子の発現を亢進させる調節配列、例えばプロモーターやエンハンサーをそれらの遺伝子に対し作用可能な位置に配置することにより達成することもできる。
SCCA−1及び/又はSCCA−2をコードする遺伝子を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法(日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、実験医学増刊、12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療 の基礎技術」、羊土社(1996))のいずれの方法も適用することができる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス、又はRNAウイルスに、SCCA−1及び/又はSCCA−2をコードするDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。また、上記遺伝子を実際に医薬として作用させるには、DNAを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でDNAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある(日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、月刊薬事、36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊、12(15)(1994))。in vivo法がより好ましい。in vivo法により投与される場合は、疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、一般的には注射剤等とされ、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルス(HVJ)−リポソーム等)の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
第二の観点において、本発明は肌のUV抵抗力を評価する肌検査方法を提供する。この方法は、表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現が表皮細胞の発現と比べて低下している場合、表皮のUV抵抗力が弱いと判断することを特徴とする。
その評価基準として、例えば表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現がコントロール値と比べ10%以上、又は20%以上、又は30%以上、又は50%以上、又は70%以上、又は100%低下していたなら「肌のUV抵抗力が弱い」と判断する、としてよい。コントロール値としては、例えば統計学的に有意な数(例えば10人分以上、好ましくは100人分以上)の健常人の対応の部位における表皮細胞のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現量の平均値であってよい。
その評価基準として、例えば表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現がコントロール値と比べ10%以上、又は20%以上、又は30%以上、又は50%以上、又は70%以上、又は100%低下していたなら「肌のUV抵抗力が弱い」と判断する、としてよい。コントロール値としては、例えば統計学的に有意な数(例えば10人分以上、好ましくは100人分以上)の健常人の対応の部位における表皮細胞のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現量の平均値であってよい。
表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の亢進は、例えば表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の量を直接測定することにより決定することができる。好ましくは、この測定はSCCA−1及び/又はSCCA−2に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばELISA法、RIA法など、様々な方法により実施できる。また、皮膚からRNAを抽出し、SCCA−1及び/又はSCCA−2をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により行われる。以上の他、SCCA−1及び/又はSCCA−2の既知の生物活性を測定することによりSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現量を測定することもできる。他に、SCCA−1及び/又はSCCA−2の発現はin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて決定することができる。
本発明はさらに、肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高めるUV抵抗強化剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、SCCA−1及び/又はSCCA−2の発現を亢進する薬剤をUV抵抗強化剤として選定することを特徴とする。SCCA−1及び/又はSCCA−2の発現の亢進は、上述のとおり、細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の量の測定、表皮細胞から抽出されたSCCA−1及び/又はSCCA−2をコードするmRNAの量の測定などにより実施することができる。
好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記亢進能力を有する候補薬剤をモデル動物、好ましくはSCCA−1及び/又はSCCA−2欠損動物に適用し、UV抵抗力を強化する候補薬剤を選定することを含んで成る。
表皮細胞のUV抵抗力の評価は、例えば表皮細胞に紫外線を照射することにより誘導されるアポトーシスを抑制する活性を検討することで行うことができる。アポトーシス評価は、当業者周知の方法により実施することができる。例えば、アポトーシス評価はFACS COULTER(EPIX XL-MCL, Beckman Coulter)を用い、アネキシンV−FITC及びプロピジウムイオダイン(PI)二重染色法(Annexin V-FITC kit, Immunotech)を指標とするFACS(蛍光活性化セルソータ)解析により行うことができる。その評価基準として、例えば表皮細胞のアポトーシスを30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、最も好ましくは90%以上抑制したなら、「肌のUV抵抗力を高める」と判断する、としてよい。
表皮細胞のUV抵抗力の評価は、例えば表皮細胞に紫外線を照射することにより誘導されるアポトーシスを抑制する活性を検討することで行うことができる。アポトーシス評価は、当業者周知の方法により実施することができる。例えば、アポトーシス評価はFACS COULTER(EPIX XL-MCL, Beckman Coulter)を用い、アネキシンV−FITC及びプロピジウムイオダイン(PI)二重染色法(Annexin V-FITC kit, Immunotech)を指標とするFACS(蛍光活性化セルソータ)解析により行うことができる。その評価基準として、例えば表皮細胞のアポトーシスを30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、最も好ましくは90%以上抑制したなら、「肌のUV抵抗力を高める」と判断する、としてよい。
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
免疫組織化学的検査
表皮生検をAMeX手順(Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435(1986))に従い、冷却アセトンで固定してからパラフィンの中に包埋した。切片をキシレンで脱パラフィン処理し、アセトン、次いでPBSで洗浄した。次にその切片の非特異的結合部位を10%正常ウサギ血清(Histofine, Tokyo, Japan)でブロックした。
表皮切片を抗−SCCA−1モノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(1:500に希釈)、抗−SCCA−2モノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(1:500に希釈)又は抗−SCCAポリクローナル抗体(Takeda A. et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)に記載のとおりにして精製)のそれぞれとインキュベーションした。PBSで洗浄後、切片をヘマトキシリンでカウンター染色し、DAKO Envision System(DAKO Corp., CA, USA)で観察を行った。
表皮生検をAMeX手順(Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435(1986))に従い、冷却アセトンで固定してからパラフィンの中に包埋した。切片をキシレンで脱パラフィン処理し、アセトン、次いでPBSで洗浄した。次にその切片の非特異的結合部位を10%正常ウサギ血清(Histofine, Tokyo, Japan)でブロックした。
表皮切片を抗−SCCA−1モノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(1:500に希釈)、抗−SCCA−2モノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(1:500に希釈)又は抗−SCCAポリクローナル抗体(Takeda A. et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)に記載のとおりにして精製)のそれぞれとインキュベーションした。PBSで洗浄後、切片をヘマトキシリンでカウンター染色し、DAKO Envision System(DAKO Corp., CA, USA)で観察を行った。
図1は、表皮検体として、非露光部位である上腕部(ヒト24歳)、臀部(ヒト46歳)、太腿部(ヒト75歳)由来の表皮、及び露光部位である頬部(ヒト20歳、76歳)、目瞼(ヒト82歳)由来の表皮を採取し、抗体としてSCCA−1及びSCCA−2の両者に結合する抗−SCCAポリクローナル抗体を用い、顕微鏡観察した結果である。図1から、非露光部位と比べ、露光部位の表皮上層でSCCAが顕著に亢進していることがわかる。しかしながら、露光部位でも、基底層ではSCCAの発現の亢進は認められなかった。
図2は、表皮検体として、UV照射(トランスルミネーターTOREX FL205−E−30/DMR(Toshiba Medical Supply)を用い、2MED(Minimum Erythema Dose)の照射量にて照射)を施したヒト表皮及び照射を施していないコントロール表皮におけるSCCA−1及びSCCA−2のそれぞれの発現の顕微鏡観察結果である。抗体として、抗−SCCA−1モノクローナル抗体及び抗−SCCA−2モノクローナル抗体それぞれを使用した。図2から、SCCA−1及びSCCA−2共に、ヒト表皮にUVを照射することで発現が亢進されることが明らかとなった。また、発現の亢進は皮膚有棘層及び顆粒層において顕著であった。
以上により、表皮にUVが照射されると、表皮、特にその有棘層及び顆粒層においてSCCA−1及びSCCA−2の発現が亢進されることが明らかとなった。
定量PCR実験
次に、表皮におけるSCCA−1及びSCCA−2の発現がUV照射により亢進されることを遺伝子レベルで確認する実験を行った。
ヒト角化細胞をケラチノサイト−SFM培地(GIBCO, Invitrogen)中、L−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、CO25%の雰囲気において、37℃にて培養した。集密度60〜70%の細胞にUVBを0〜48時間にわたり、照射した。UVB照射はトランスルミネーターTOREX FL205−E−30/DMR(Toshiba Medical Supply)を用い、50mJ/cm2の強度で行った。コントロール細胞にはUVB照射を施さなかった。
次に、表皮におけるSCCA−1及びSCCA−2の発現がUV照射により亢進されることを遺伝子レベルで確認する実験を行った。
ヒト角化細胞をケラチノサイト−SFM培地(GIBCO, Invitrogen)中、L−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、CO25%の雰囲気において、37℃にて培養した。集密度60〜70%の細胞にUVBを0〜48時間にわたり、照射した。UVB照射はトランスルミネーターTOREX FL205−E−30/DMR(Toshiba Medical Supply)を用い、50mJ/cm2の強度で行った。コントロール細胞にはUVB照射を施さなかった。
上記培養細胞から総RNAを、Isogen(Nippon Gene)を用い、添付の説明書に従い、単離精製した。SCCA−1及びSCCA−2それぞれの発現レベルを定量リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により決定した。簡単には、総RNAをSuperscript II(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用い、cDNAへと変換させた。その試料をABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、2−ステップPCRを40サイクル行い、増幅させた。内部標準としてGAPDH(グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ)を用いた。
使用したプライマーは下記のとおりである。
SCCA−1:
順方向プライマー
5'-GTGCTATCTGGAGTCCT-3'(配列番号1)
逆方向プライマー
5'-CTGTTGTTGCCAGCAA-3'(配列番号2)
Taq Man プローブ
5'-CATCACCTACTTCAACT-3'(配列番号3)
SCCA−1:
順方向プライマー
5'-GTGCTATCTGGAGTCCT-3'(配列番号1)
逆方向プライマー
5'-CTGTTGTTGCCAGCAA-3'(配列番号2)
Taq Man プローブ
5'-CATCACCTACTTCAACT-3'(配列番号3)
SCCA−2:
順方向プライマー
5'-CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3'(配列番号4)
逆方向プライマー
5'-TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3'(配列番号5)
Taq Man プローブ
5'-AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3'(配列番号6)
順方向プライマー
5'-CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3'(配列番号4)
逆方向プライマー
5'-TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3'(配列番号5)
Taq Man プローブ
5'-AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3'(配列番号6)
GAPDH:
順方向プライマー
5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(配列番号7)
逆方向プライマー
5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(配列番号8)
Taq Man プローブ
5'-AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3'(配列番号9)
順方向プライマー
5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(配列番号7)
逆方向プライマー
5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(配列番号8)
Taq Man プローブ
5'-AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3'(配列番号9)
リポーター色素(6−カルボキシ−フルオレセイン)をTaq Manプローブ配列の5’末端に結合させ、そしてクエンチャー色素(6−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン)をその3’末端に組み込ませた。
図3に培養ヒト角化細胞におけるSCCAの発現についてのUVB照射の影響の結果を示す。SCCA−1、SCCA−2、共にUV照射により発現が亢進されることが明らかとなった。従って、表皮細胞はUV照射により、遺伝子レベルでSCCA−1、SCCA−2の発現が亢進されることが明らかとなった。
UV照射におけるSCCAの役割の検討
以上により、表皮細胞では、UV照射を受けることでSCCA−1及びSCCA−2の発現が亢進することが解明された。次に、SCCA−1及びSCCA−2がUV照射を受けた表皮細胞においてどのような役割を担っているかを検討した。
以上により、表皮細胞では、UV照射を受けることでSCCA−1及びSCCA−2の発現が亢進することが解明された。次に、SCCA−1及びSCCA−2がUV照射を受けた表皮細胞においてどのような役割を担っているかを検討した。
SCCA−1及び2高発現細胞の樹立
3T3細胞(ATCCより入手)はSCCA−1及び2を発現しないマウス胎児由来の細胞である。この細胞に、下記のとおりにしてSCCA−1又は2をコードする遺伝子を導入した。
SCCA−1及びSCCA−2のcDNA(Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002))をBam HI及びKpn Iで二重消化した。それらをpTarget ベクターの中にサブクローニングし、次いでLipofectamine Plus(GIBCO, Invitrogen Corp.)を用い、3T3細胞に導入した。簡単に述べると、無血清DMEM培地(Invitrogen Corp.) 675μl中のcDNA 20μgを75μlのPlus試薬と混合し、25℃にて15分放置した。Lipofectamine(100μl)を650μlの無血清DMEM培地に添加し、次いでそれを上記cDNA−Plus混合物に加え、そして25℃にて15分放置した。このcDNA混合物を10mlの無血清DMEM培地に添加し、そして3T3細胞をその中で37℃にて4時間、5%のCO2雰囲気下でインキュベーションした。その培地を10%のFCS(Invitrogen Corp.)含有のDMEM培地と交換し、そして一晩インキュベーションした。翌日、G418(Calbiochem)を最終濃度500μg/mlとなるように添加した。G418は培養期間中この濃度に保っておいた。培地は2〜3日ごとに交換した。培養4週間後、いくつかのG418耐性コロニーを単離することができ、SCCA−1及びSCCA−2発現細胞系が樹立された。
3T3細胞(ATCCより入手)はSCCA−1及び2を発現しないマウス胎児由来の細胞である。この細胞に、下記のとおりにしてSCCA−1又は2をコードする遺伝子を導入した。
SCCA−1及びSCCA−2のcDNA(Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002))をBam HI及びKpn Iで二重消化した。それらをpTarget ベクターの中にサブクローニングし、次いでLipofectamine Plus(GIBCO, Invitrogen Corp.)を用い、3T3細胞に導入した。簡単に述べると、無血清DMEM培地(Invitrogen Corp.) 675μl中のcDNA 20μgを75μlのPlus試薬と混合し、25℃にて15分放置した。Lipofectamine(100μl)を650μlの無血清DMEM培地に添加し、次いでそれを上記cDNA−Plus混合物に加え、そして25℃にて15分放置した。このcDNA混合物を10mlの無血清DMEM培地に添加し、そして3T3細胞をその中で37℃にて4時間、5%のCO2雰囲気下でインキュベーションした。その培地を10%のFCS(Invitrogen Corp.)含有のDMEM培地と交換し、そして一晩インキュベーションした。翌日、G418(Calbiochem)を最終濃度500μg/mlとなるように添加した。G418は培養期間中この濃度に保っておいた。培地は2〜3日ごとに交換した。培養4週間後、いくつかのG418耐性コロニーを単離することができ、SCCA−1及びSCCA−2発現細胞系が樹立された。
SCCA−1をコードするcDNAが導入された細胞(SCCA−1導入細胞)はSCCA−1を特異的且つ安定的に発現し、そしてSCCA−2をコードするcDNAが導入された細胞(SCCA−2導入細胞)はSCCA−2を特異的且つ安定的に発現することが確認された。また、同様の操作で非特異的な配列の導入された3T3細胞(コントロール細胞)はSCCA−1、SCCA−2のいずれも発現しなかった。
上記SCCA−1導入細胞、SCCA−2導入細胞及びコントロール細胞を用い、UV照射を与えたときのSCCA−1、SCCA−2が果たす役割について検討した。詳しくは、表皮細胞におけるUV誘導アポトーシスに対するSCCA−1、SCCA−2の役割について検討した。
上記各種細胞を10%のFCSを含むDMEM培地中で高湿、CO25%の雰囲気において、37℃にて培養した。集密度60〜70%の細胞にUVBを0〜48時間にわたり、照射した。UVB照射はトランスルミネーターTOREX FL205−E−30/DMR(Toshiba Medical Supply)を用い、50mJ/cm2の強度で行った。
これらの細胞についてのアポトーシス評価はFACS COULTER(EPIX XL-MCL, Becjman Coulter)を用い、アネキシンV−FITC及びプロピジウムイオダイン(PI)二重染色法(Annexin V-FITC kit, Immunotech)を指標とするFACS(蛍光活性化セルソータ)解析により行った。
その結果を図4に示す。図4から明らかなとおり、SCCA−1及びSCCA−2導入細胞のいずれもUV照射によるアポトーシスが有意に減少することが認められた。従って、SCCA−1及びSCCA−2共に、UVによる誘導されるアポトーシスを抑制できるものと推定された。
このことを確認するため、本発明者は次にSCCA−1及びSCCA−2ノックダウン細胞株をRNA干渉法により樹立し、UV照射における表皮細胞内でのSCCA−1及びSCCA−2の役割についてさらに検討した。
このことを確認するため、本発明者は次にSCCA−1及びSCCA−2ノックダウン細胞株をRNA干渉法により樹立し、UV照射における表皮細胞内でのSCCA−1及びSCCA−2の役割についてさらに検討した。
SCCAノックダウン細胞の樹立
HaCat細胞(H. Hans. et al. Experimental Cell Research 239, 399-410 (1998))はSCCAを高発現するヒト角化細胞である。この細胞に、RNA干渉法に従い、pSilencerベクター(Ambion)で恒常的にsiRNA(short interference RNA)を発現させることにより、SCCA−1及び2のノックダウン細胞株を樹立した。
siRNAはpSilencerベクターを用い、添付の説明書に従い、構築した。詳しくは、SCCAをコードする遺伝子のヌクレオチド番号46〜66位に相補性な21merのオリゴヌクレオチド(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T:配列番号10)を含む65merのセンスオリゴヌクレオチド(配列番号11)と、ヌクレオチド番号46〜66位に相同な21merのオリゴヌクレオチド(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T;配列番号12)を含む65merのアンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号13)とから成る二本鎖オリゴヌクレオチドをpSilencerベクターのHind III部位及びBam HI部位にクローニングした。HaCat細胞へのトランスフェクションはLipofectamine 2000(Invitrogen)を用い、添付の説明書に従って行った。コントロール細胞は、哺乳動物の遺伝子配列と有意な相同性、相補性をもたない二本のオリゴヌクレオチドから成る二本鎖オリゴヌクレオチドを用い、作製した。安定な細胞系はトランスフェクション細胞をハイグロマイシン−B選択培地の中で4〜6週間培養して選択を行うことにより獲得した。SCCAの発現が抑制されていることを確認するため、上述のとおりにして、リアルタイムPCRによりSCCA−1及びSCCA−2の発現を測定した。
センスオリゴヌクレオチド(配列番号11)
GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGA ACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA
(下線部が相同領域)
アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号13)
AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGT TCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG
(下線部が相補性領域)
HaCat細胞(H. Hans. et al. Experimental Cell Research 239, 399-410 (1998))はSCCAを高発現するヒト角化細胞である。この細胞に、RNA干渉法に従い、pSilencerベクター(Ambion)で恒常的にsiRNA(short interference RNA)を発現させることにより、SCCA−1及び2のノックダウン細胞株を樹立した。
siRNAはpSilencerベクターを用い、添付の説明書に従い、構築した。詳しくは、SCCAをコードする遺伝子のヌクレオチド番号46〜66位に相補性な21merのオリゴヌクレオチド(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T:配列番号10)を含む65merのセンスオリゴヌクレオチド(配列番号11)と、ヌクレオチド番号46〜66位に相同な21merのオリゴヌクレオチド(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T;配列番号12)を含む65merのアンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号13)とから成る二本鎖オリゴヌクレオチドをpSilencerベクターのHind III部位及びBam HI部位にクローニングした。HaCat細胞へのトランスフェクションはLipofectamine 2000(Invitrogen)を用い、添付の説明書に従って行った。コントロール細胞は、哺乳動物の遺伝子配列と有意な相同性、相補性をもたない二本のオリゴヌクレオチドから成る二本鎖オリゴヌクレオチドを用い、作製した。安定な細胞系はトランスフェクション細胞をハイグロマイシン−B選択培地の中で4〜6週間培養して選択を行うことにより獲得した。SCCAの発現が抑制されていることを確認するため、上述のとおりにして、リアルタイムPCRによりSCCA−1及びSCCA−2の発現を測定した。
センスオリゴヌクレオチド(配列番号11)
GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGA ACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA
(下線部が相同領域)
アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号13)
AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGT TCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG
(下線部が相補性領域)
その結果を図5に示す。上記siRNAの導入された細胞では、コントロールに比べ、SCCA−1及び2ともに発現が90%以上抑制(ノックダウン)されていることが確認された。
上記ノックダウン細胞及びコントロール細胞を用い、表皮細胞におけるUV誘導アポトーシスに対するSCCA−1、2の役割について検討した。
上記各種細胞をケラチノサイト−SFM培地(GIBCO, Invitrogen)中、L−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、CO25%の雰囲気において、37℃にて培養した。集密度60〜70%の細胞にUVBを照射した。UVB照射はトランスルミネーターTOREX FL205−E−30/DMR(Toshiba Medical Supply)を用い、50mJ/cm2の強度で行った。
上記各種細胞をケラチノサイト−SFM培地(GIBCO, Invitrogen)中、L−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、CO25%の雰囲気において、37℃にて培養した。集密度60〜70%の細胞にUVBを照射した。UVB照射はトランスルミネーターTOREX FL205−E−30/DMR(Toshiba Medical Supply)を用い、50mJ/cm2の強度で行った。
これらの細胞についてのアポトーシス評価をFACS COULTERを用い、アネキシンV−FITC及びプロピジウムイオダイン(PI)二重染色法を指標とするFACS(蛍光活性化セルソータ)解析により行った。
その結果を図6に示す。ノックダウン細胞にUV照射を行った結果、コントロール細胞では38%の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、ノックダウン細胞では約80%もの細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。従って、SCCAはUV照射により誘導される表皮細胞のアポトーシスを有意に抑制することがわかった。よって、SCCAは表皮細胞のUV防御機構を担うものと考えられる。
その結果を図6に示す。ノックダウン細胞にUV照射を行った結果、コントロール細胞では38%の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、ノックダウン細胞では約80%もの細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。従って、SCCAはUV照射により誘導される表皮細胞のアポトーシスを有意に抑制することがわかった。よって、SCCAは表皮細胞のUV防御機構を担うものと考えられる。
Claims (6)
- 表皮細胞のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現を亢進させることで、表皮細胞のアポトーシスを抑制する方法。
- 前記アポトーシスが紫外線照射により誘導され、そして前記方法により肌の紫外線照射による皮膚障害の発症に対する抵抗力が高まる、請求項1記載の方法。
- 肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を評価する肌検査方法であって、表皮細胞中のSCCA−1及び/又はSCCA−2の発現を測定し、表皮細胞における発現と比べて低下している場合、表皮のUV抵抗力が弱いと判断することを特徴とする方法。
- SCCA−1及び/又はSCCA−2の発現をSCCA−1及びSCCA−2のそれぞれに特異的な抗体を利用するELISA法又はRIA法により測定する、請求項3記載の検査方法。
- SCCA−1及び/又はSCCA−2の発現を、表皮細胞から抽出されたSCCA−1及び/又はSCCA−2をコードするmRNAの量を測定することにより測定する、請求項3記載の検査方法。
- 肌の紫外線照射による皮膚障害に対する抵抗力を高める薬剤をスクリーニングする方法であって、SCCA−1及び/又はSCCA−2の発現を亢進する薬剤をUV抵抗強化剤として選定することを特徴とする方法。
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