JP2020535448A - Ｒａｎタンパク質の検出のための免役アッセイ - Google Patents

Abstract

本開示の側面は、対象（例として、ＲＡＮタンパク質翻訳に関連する疾患、たとえば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および／または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、または脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、またはポリ（ＰＲ）、ポリ（ＧＲ）、またはポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質を生成する他の疾患を有するかまたは有することを疑われる対象）における、繰り返し関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）タンパク質を検出するための方法および組成物（例として、キット）に関する。いくつかの態様において、本開示によって記載される方法は、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体を使用する電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイによって、対象から得られる生体試料中の１以上のＲＡＮタンパク質を検出することを、備える。いくつかの態様において、本開示は、１以上の抗ＲＡＮ抗体および電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイプレートおよび／または試薬を備えるキットに、関する。

Description

関連出願
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）のもと、「ＲＡＮタンパク質の検出のための免役アッセイ」を標題とする２０１８年９月２５日出願の米国仮出願番号第６２／５６３，００９の利益を主張し、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
背景
ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のイントロンの中のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド配列の伸長は、ヒトの筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭型認知症と関連する。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、急速に進行する衰弱、筋萎縮症、筋痙直、言語障害（構音障害）、嚥下困難（嚥下障害）、および呼吸困難（呼吸窮迫）によって特徴づけられる、多様な原因を伴う消耗性疾患である。症状の順序および割合が人により変化するにもかかわらず、最終的に、ほとんどの対象は、歩くことができないか、単独でベッドから出られないか、または、それらの手および腕を使用できない。ＡＬＳを伴うほとんどの対象は、通常症状の発現から３〜５年以内に、最終的に呼吸不全から亡くなるだろう。ＡＬＳに現在利用できる処置は、制限されている。

前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、脳の前頭および側頭葉の萎縮または収縮から生じる障害の、壊滅的な群でもある。この収縮または萎縮は、重篤な行動変化に結果としてなる。ＦＴＤのための治癒およびＦＴＤの症状を管理するための限られた薬物投与が、現在ない。ＡＬＳおよび／またはＦＴＤを診断し処置するための新しい方法は、ＡＬＳおよびＦＴＤの対象に大いに恩恵があるだろう。

概要
本開示の側面は、ゲノムヌクレオチド伸長に関連する（たとえば、１以上の疾患症状と関連する、たとえば神経学的疾患または状態と関連する）一定のバイオマーカーを検出するための方法およびキットに、関する。いくつかの態様において、免役アッセイ（たとえば、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイ）は、対象から得られた血液試料の非ＡＴＧ翻訳タンパク質に関連した１以上の繰り返しのレベルを検出または測定するために使用される。いくつかの態様において、方法およびキットは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および／または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）または脊髄小脳失調タイプ３６（ＳＣＡ３６）と関連する一定のバイオマーカー（例として、薬力学的バイオマーカー、薬動力学的バイオマーカーなど）を検出することおよびそれらの基づくこのような疾患を処置する方法のために、提供される。本開示は、対象、たとえば、ＡＬＳ／ＦＴＤを有するか有すると疑われる対象、またはＳＣＡ３６を有するか有すると疑われる対象の細胞または組織からの、非ＡＴＧ翻訳タンパク質（ＲＡＮタンパク質としても言及される）に関連する１以上の繰り返しのレベルを、鋭敏に測定することができる免役アッセイに、部分において、基づく。

いくつかの側面において、本開示により記載された方法は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、またはＳＣＡ３６等の、ＲＡＮタンパク質発現に関連する疾患または障害の処置のための１以上の治療剤が投与されたまたは投与される対象における、１以上のＲＡＮタンパク質のレベルをモニターする（たとえば、長手方向に測定する）ために、有用である。

いくつかの側面において、本開示は、対象から得られた生体試料（たとえば、血液試料）において、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して１以上のＲＡＮタンパク質を検出することを備える方法を、提供する。いくつかの態様において、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＳＤ）アッセイである。

いくつかの態様において、生体試料は、血液試料または組織試料である。
いくつかの態様において、組織試料は、ＣＮＳ組織試料である。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物の対象である。いくつかの態様において、対象は、ヒトまたはマウスである。いくつかの態様において、対象は、Ｃ９−ＢＡＣマウスである。

いくつかの態様において、対象は、以下によって特徴づけられる：Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のＧＧＧＧＣＣ（Ｇ_４Ｃ_２）ヘキサヌクレオチド配列の繰り返し伸長；またはＳＣＡ３６遺伝子のＴＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド配列の繰り返し伸長；またはポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、またはポリ（ＰＲ）タンパク質を発現する他の神経学的疾患。いくつかの態様において、ヘキサヌクレオチド配列の繰り返し伸長は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または、少なくとも５０００のＧ_４Ｃ_２の繰り返し伸長、または、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００または、少なくとも５０００のＴＧＧＧＣＣの繰り返し伸長を備える。いくつかの態様において、核酸配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００または、少なくとも５０００のポリマーユニットのＲＡＮタンパク質（たとえば、ホモポリマー性ＲＡＮタンパク質、ジアミノ酸の繰り返しを含有するＲＡＮタンパク質等々）をコードする繰り返し伸長において備えられる。

いくつかの態様において、試料（例として、生体試料）中で検出される１以上のＲＡＮタンパク質は、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、およびポリ（ＰＡ）から選択される。いくつかの態様において、２つ、３つまたは、４つのＲＡＮタンパク質が、試料中で検出される。
いくつかの態様において、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイは、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体を試料に接触するステップを備える。いくつかの態様において、１以上の抗ＲＡＮ抗体は、抗ポリ（ＧＰ）抗体、抗ポリ（ＧＲ）抗体、抗ポリ（ＰＲ）抗体、および抗ポリ（ＰＡ）抗体から選択される。
いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、ＲＡＮタンパク質のジアミノ酸繰り返し領域、たとえば、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、またはポリ（ＰＡ）ジアミノ酸繰り返し領域に、結合する。

いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、ＲＡＮタンパク質のＣ末端部分、たとえば、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、またはポリ（ＰＡ）ジアミノ酸繰り返し領域を備えるＲＡＮタンパク質のＣ末端領域に、結合する。
いくつかの態様において、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの態様において、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体は、モノクローナル抗体である。

いくつかの態様において、本開示の方法は、コントロール試料（例として、それらのＣ９ＯＲＦ７２遺伝子において、繰り返し伸長を有しない対象から得られた生体試料）中で検出されるＲＡＮタンパク質のレベルと比較して、生体試料中で検出されるＲＡＮタンパク質のレベルが上昇している場合、対象に治療剤を投与することを、さらに備える。

いくつかの態様において、本開示の方法は、治療剤の投与の後に対象から第２の生体試料を得て、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して該試料の１以上のＲＡＮタンパク質を検出することを、さらに備える。

いくつかの側面において、本開示は、ＲＡＮタンパク質発現の薬動力学的変化を測定するための方法を提供し、該方法は、以下を備える：電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、対象から得られた第１の生体試料（例として、血液試料）中で、１以上のＲＡＮタンパク質を検出すること；電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、対象から得られた第２の生体試料（例として、血液試料）中で、１以上のＲＡＮタンパク質を検出すること、ここで、第２の生体試料は、対象に治療剤を投与後に、得られる；および、第２の生体試料中で検出されるＲＡＮタンパク質の量が、第１の生体試料中で検出されるＲＡＮタンパク質の量未満である場合、対象への治療剤の投与は、対象における１以上のＲＡＮタンパク質のレベルの変化（例として、減少または阻害）に結果としてなることを決定すること。

いくつかの側面において、本開示は、以下を備えるキットを提供する：１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体；および、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイプレートおよび／または試薬。
いくつかの態様において、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体は、抗ポリ（ＧＰ）抗体、抗ポリ（ＧＲ）抗体、抗ポリ（ＰＲ）抗体、および抗ポリ（ＰＡ）抗体から選択される。いくつかの態様において、抗ＲＡＮタンパク質抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
いくつかの態様において、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイプレートおよび／または試薬は、ＭＳＤアッセイプレートおよび／またはＭＳＤアッセイ試薬である。

図１Ａ−１Ｄは、メソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイを使用するＲＡＮタンパク質の検出のための、標準曲線を示す。図１Ａは、ポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質の検出のための、標準曲線を示す。図１Ｂは、ポリ（ＧＲ）ＲＡＮタンパク質の検出のための、標準曲線を示す。 図１Ｃは、ポリ（ＰＲ）ＲＡＮタンパク質の検出のための、標準曲線を示す。図１Ｄは、ポリ（ＰＡ）ＲＡＮタンパク質の検出のための、標準曲線を示す。 図２Ａ−２Ｂは、ＭＳＤを使用するポリ（ＧＰ）定量分析を示す。図２Ａは、ＡＬＳ／ＦＴＤのＣ９Ｏｒｆ７２マウスモデル（例として、Ｃ９−ＢＡＣマウスモデル）から得られた脳組織可溶性分画から、ポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質のレベルを測定するＭＳＤアッセイからのデータを示す。ＦＣＸ＝前頭皮質；ＣＥ＝小脳；エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す；Ｃ９（＋）に関してｎ＝７、ＷＴに関して３。 図２Ｂは、トランスフェクトされそしてコントロールのＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた、可溶性分画のポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質レベルを示す。エラーバーは、ＳＤを表す；各群に関してｎ＝３。

図３Ａ−３Ｂは、ＭＳＤアッセイが、Ｃ９−ＢＡＣマウスにおけるポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質の薬動力学的減少を検出することを、示す。図３Ａは、ＡＡＶ−ＥＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＫＲ（Ｋ２９６Ｒ）発現コンストラクトの模型的な描写を、示す。図３Ｂは、タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）経路を標的として、ＲＡＮ翻訳をブロックする薬物で処置されたマウスのポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質における薬動力学的減少を指すデータを示す。 図４は、トランスフェクトされたまたはコントロールの細胞から得られた、可溶性分画におけるＣ９ＲＡＮタンパク質レベルの、ＭＳＤアッセイの検出を示す。ＧＲ＝ポリ（ＧＲ）ＲＡＮタンパク質、ＰＲ＝ポリ（ＰＲ）ＲＡＮタンパク質；ＰＡ＝ポリ（ＰＡ）ＲＡＮタンパク質。エラーバーは、３回の技術的な再現からのＳＤを表す。 図５は、Ｃ９ＯＲＦ７２ＡＬＳ患者からの血液試料中のポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質のメソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイを、示す。ポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質の相対的なレベルは、ポリクローナル抗ポリ（ＧＰ）抗体を使用するＭＳＤアッセイによって、定量された。ポリ（ＧＰ）タンパク質の有意により高いレベルは、７つの独立したコントロールの対象と比較して、Ｃ９ＯＲＦ７２繰り返し伸長に関して陽性である２の検討対象において、観察された。 図６Ａ−６Ｃは、種々の処理時間および温度での、血液試料に遂行したメソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイに関する代表的なデータを、示す。図６Ａは、２４時間以内に収集処理される血液と比較した、１、２、または３日間、室温（ＲＴ）または４℃に保たれた血液における、インキュベーション時間にわたる、ＭＳＤによって検出されるバックグラウンドシグナルの増加を指すデータを、示す。 図６Ｂは、２４時間以内に収集処理される血液と比較した、室温（ＲＴ）での、インキュベーション時間（例として、１、２、または３日）にわたる、ＭＳＤによって検出されるバックグラウンドシグナルの増加を指すデータを、示す。より高いバックグラウンドは、Ｃ９（＋）およびＣ９（−）コントロール試料の両方において観察された；Ｃ９（＋）およびＣ９（−）の試料は、ＲＴに保たれた試料中で、識別されることができなかった。 図６Ｃは、２４時間以内に収集処理される血液と比較した、４℃での、インキュベーション時間（例として、１、２、または３日）にわたる、ＭＳＤによって検出されるバックグラウンドシグナルの増加を指すデータを、示す。より高いバックグラウンドは、Ｃ９（＋）およびＣ９（−）コントロール試料の両方において観察された；Ｃ９（＋）試料は、４℃で最大２日間のインキュベーションで、Ｃ９（−）コントロール試料と識別されることができた。この図において記載されたすべてのＭＳＤアッセイにおいて、抗ＧＰ抗体は、ＲＡＮタンパク質の検出のために使用された。

詳細な記載
本開示の側面は、対象から得られた、生体試料中の繰り返し関連非ＡＴＧタンパク質（例として、ＲＡＮタンパク質）を検出するために有用な方法および組成物に、関する。本開示は、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用する生体試料中の１以上のＲＡＮタンパク質レベルの長手方向の検出（例として、定義された時間経過にわたる検出）に、部分において、基づく。いくつかの態様において、本開示によって記載された方法は、ＲＡＮタンパク質発現および／またはＲＡＮタンパク質翻訳を阻害する治療剤の有効性を指すために、たとえば対象に１以上の治療剤の投与の後にＲＡＮタンパク質レベルの減少を指すことによって、有用である。
生体試料
いくつかの側面において、本開示は、対象から得られた生体試料の１以上のＲＡＮタンパク質を検出する（例として、１以上のＲＡＮタンパク質のレベルを検出する）方法に、関する。

「ＡＬＳおよび／またはＦＴＤを有する、または、疑われる対象」は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の３０より多いＧＧＧＧＣＣ繰り返しを有することが公知であるかまたは決定されている対象であることができ、または、ＡＬＳ／ＦＴＤの兆候および症状を呈する対象は、運動障害（例として、痙直）、筋萎縮症、および／または精神神経性の出現（例として「強迫性行動、アパシー、不安」）を含むがこれに限定されない。

「ＳＣＡ３６を有する、または、疑われる対象」は、ＳＣＡ３６遺伝子の３０より多いＴＧＧＧＣＣ繰り返しを有することが公知であるかまたは決定されている対象であることができ、または、ＳＣＡ３６の兆候および症状を呈する対象は、運動失調、筋萎縮症、反射亢進、構音障害、線維束性収縮および／または眼球異常（たとえば、眼振、サッケード、眼球運動失行、眼瞼下垂等々）を含むがこれに限定されない。

「ハンチントン病を有する、または、疑われる対象」は、ＨＴＴ遺伝子の３５より多いＣＡＧ繰り返しを有することが公知であるかまたは決定されている対象であることができ、または、ＨＤの兆候および症状を呈する対象は、運動障害（例として、舞踏病）、減弱した実行機能（例として、認知柔軟性および抽象思考）、および／または精神神経性の出現（例として、強迫性行動、アパシー、不安）を含むがこれに限定されない。一般に、ＨＤを有する、または、疑われる対象の疾患の状況は、対象のＨＴＴ遺伝子に存在する（例として、検出される）ＣＡＧ繰り返しの数によって、分類される。典型的に、３６未満のトリヌクレオチド（ＣＡＧ）繰り返しを有するＨＴＴ遺伝子は、非病原性細胞質のＨｕｎｔｉｎｇｔｉｎタンパク質を生成する。３６および３９の間のトリヌクレオチド繰り返しを有する対象は、完全に病原性の形より短い変異体Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎタンパク質を生成し、そして疾患を進展させうるか進展させえない。４０より多いトリヌクレオチド繰り返しを有する対象は、完全に浸透するＨＤを有するとして分類され、最終的に、ＨＤ（また、成人発症型ＨＤとして言及される）を進展させる。多い（＞１００）繰り返しによって特徴づけられる、完全に浸透するＨＤの一定の症例において、対象は、無動−筋固縮またはＷｅｓｔｐｈａｌバリアントＨＤとも言及される、若年発症ＨＤを進展させ得る。いくつかの態様において、対象は、成人発症型ＨＤを有するかまたは有することを疑われる。いくつかの態様において、対象は、若年発症ＨＤを有するかまたは有することを疑われる。

「ＲＡＮタンパク質（繰り返し関連非ＡＴＧ翻訳タンパク質）」は、ＡＵＧ開始コドンの非存在下で、ヌクレオチド伸長を坦持するメッセンジャーＲＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドである。一般に、ＲＡＮタンパク質は、ポリアミノ酸繰り返しと呼ばれる、１以上のアミノ酸の伸長繰り返し（例として、ジアミノ酸繰り返し）を備える。たとえば、ＡＬＳ／ＦＴＤ（Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のヘキサヌクレオチド配列ＧＧＧＧＣＣの繰り返し伸長から生じる）の文脈において、以下のジアミノ酸繰り返しを含有するＲＡＮタンパク質が、同定された：それぞれ、ポリ（ＧＡ）、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＡ）およびポリ（ＰＲ）としても言及される、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、ポリ（Ｐｒｏ−Ａｌａ）、またはポリ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ）。ＡＬＳ／ＲＡＮタンパク質は、たとえば２０１４年３月１０日に出願され、ＷＯ２０１４／１５９２４７として公開された、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２６７０、および２０１５年９月１１日に出願され、ＵＳ２０１６／００２５７４７として公開された米国出願１４／７７５，２７８中に、一般に記載されており、それらのそれぞれの全体の内容が、本明細書中に参照により組み込まれる。ＳＣＡ３６（ＳＣＡ３６遺伝子のヘキサヌクレオチド配列ＴＧＧＧＣＣの繰り返し伸長から生じる）の文脈において、以下のジアミノ酸繰り返しを含有するＲＡＮタンパク質が、同定された：ポリ（ＧＰ）およびポリ（ＰＲ）。ハンチントン病（ＨＤ）の文脈において、ＲＡＮタンパク質翻訳は、Ｈｔｔ遺伝子のＣＡＧ・ＣＴＧ伸長によって引き起こされ、それは、ポリグルタミン（ｐｏｌｙＧｌｎまたはｐｏｌｙＱ）に加えて、ＲＡＮタンパク質ポリアラニン、ポリセリン、ポリロイシン、およびポリシステイン（ｐｏｌｙＡｌａ、ｐｏｌｙＳｅｒ、ｐｏｌｙＬｅｕ、およびｐｏｌｙＣｙｓ）の翻訳に、結果としてなる。

いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、脊髄球性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２型（ＳＣＡ１２）または脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜ジストロフィー（例としてＣＴＧ１８１）と関連する遺伝子によって、コードされる。

対象は、哺乳動物（例として、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、またはブタ）であることができる。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物の対象である。いくつかの態様において、対象は、ヒトまたはマウスである。いくつかの態様において、対象は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子（例として、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、またはヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子に対応するマウス遺伝子などの遺伝子）のＧＧＧＧＣＣ（例として、Ｇ_４Ｃ_２）ヘキサヌクレオチド配列繰り返し伸長によって、特徴づけられる。

いくつかの態様において、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＭ＿１４５００５．６、ＮＭ＿０１８３２５．４、およびＮＭ＿００１２５６０５４．２のいずれか一つに規定される配列を、備えるかまたはそれから成る。いくつかの態様において、ヒトＳＣＡ３６遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＭ＿００６３９２．３、ＮＲ＿０２７７００．２、およびＮＲ＿１４５４２８．１のいずれか一つに規定される配列を、備えるかまたはそれから成る。いくつかの態様において、対象は、遺伝子のアッセイ（例として、ＤＮＡに基づくアッセイ、たとえば塩基配列決定法アッセイ）によって、ヘキサヌクレオチド配列繰り返し伸長（たとえば、Ｃ９ＯＲＦ７２のＧＧＧＧＣＣ（たとえば、Ｇ_４Ｃ_２）繰り返し伸長またはＳＣＡ３６のＴＧＧＧＣＣ繰り返し伸長）を有するために、決定される。

いくつかの態様において、対象は、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または、少なくとも５０００のＧＧＧＧＣＣ繰り返し伸長（例として、Ｃ９ＯＲＦ７２の繰り返し伸長）を、備える。いくつかの態様において、対象は、ＳＣＡ３６遺伝子（例として、ヒトＳＣＡ３６遺伝子、またはヒトＳＣＡ３６遺伝子に対応するマウス遺伝子などの遺伝子）のＴＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド配列繰り返し伸長によって、特徴づけられる。いくつかの態様において、対象は、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または、少なくとも５０００のＴＧＧＧＣＣ繰り返し伸長（例として、ＳＣＡ３６の繰り返し伸長）を、備える。

本開示の方法は、ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患または障害の動物モデルにおける治療剤（例として、治療剤候補）の効力を調べるために、いくつかの態様において有用である。「治療剤候補」は、細胞または対象のＲＡＮタンパク質翻訳を減少させるかまたは阻害させる能力に関して試験されている剤（例として、小分子、干渉ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド等々）を、一般に指す。
このように、いくつかの態様において、対象は、Ｃ９−ＢＡＣマウスである。

ＡＬＳのＣ９−ＢＡＣマウスモデルは、たとえば２０１４年３月１０日に出願され、ＷＯ２０１４／１５９２４７として公開された、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２６７０、およびＬｉｕら（２０１６）Ｎｅｕｒｏｎ ９０（３）：５２１−３４中に、記載されており、それらのそれぞれの全体の内容が、本明細書中に参照により組み込まれる。

一般に、生体試料は、血液、血清（例として、凝固タンパク質が取り除かれた血漿）、または脳脊髄液（ＣＳＦ）であることができる。しかしながら、当業者は、組織（例として、脳組織、脊椎組織等々）および細胞（例として、脳細胞、神経細胞、皮膚細胞等々）などの、他の好適な生体試料を認識するだろう。いくつかの態様において、生体試料は、血液試料または組織試料である。いくつかの態様において、血液試料は、全血の試料、血漿試料、または血清試料である。いくつかの態様において、組織試料は、ＣＮＳ組織試料である。いくつかの態様において、血液試料は、試料のバフィーコートなどの白血球細胞（white blood cell）（例として、白血球（leukocyte））を取り除くために処置される。

本開示は、部分において、対象から得られる血液試料の１以上のＲＡＮタンパク質を検出するために、一定の免役アッセイ（たとえば、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイ）が使用されることができるという驚くべき発見に、基づく。例においてさらに記載されているように、血液試料処理時間および条件（例として、インキュベーション時間およびインキュベーション温度）が、与えられた血液試料において観察されるバックグラウンドシグナルの量に影響を及ぼすとことが、観察された。血液試料が対象から得られた後に、室温で２４時間以上インキュベートされる（例として、保つかまたは保存される）場合、試料中のＲＡＮタンパク質のレベルは、高いバックグラウンドシグナルのため、コントロール試料と区別ができないことが、観察された。同様に、試料が対象から得られた後に、４℃で２日間以上保存される場合、試料のＲＡＮタンパク質のレベルは、高いバックグラウンドシグナルのため、コントロール試料と区別ができないことが、観察された。

いくつかの態様において、免役アッセイ（例として、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイ）は、ことの２日以内に対象から得られる生体試料（たとえば、血液試料）に、遂行される。いくつかの態様において、免役アッセイ（例として、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイ）は、対象から得られた後に、約１分と約４８時間の間に、生体試料（例として、血液試料）に、遂行される。
いくつかの態様において、免役アッセイ（例として、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイ）は、対象から得られた後に、約６０分と約２４時間の間に、生体試料（例として、血液試料）に、遂行される。

いくつかの態様において、対象から得られる生体試料は、−８０℃と約２３℃（例として、室温）の間の温度で、保存される。いくつかの態様において、対象から得られる生体試料は、０℃と約２３℃の間の温度（例として、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３℃）で、保存される。

いくつかの態様において、対象から得られる生体試料は、２０℃と約２５℃の間の温度（例として、約２０、２１、２２、２３、２４、または２５℃）で、保存される。免役アッセイ（例として、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイ）に付される前に、生体試料（例として、血液試料）は、操作されてもまたは処理されてもよい。たとえば、いくつかの態様において、生体試料は、免役アッセイにおいて使用される前に、抗原賦活化プロセスに付される。本明細書に使用されているように、「抗原賦活化」（また、エピトープ賦活化または抗原アンマスキングとして言及される）は、プロセスの前に検出剤（例として、抗体、アプタマー、および他の結合分子）にあらかじめ到達できない抗原（例として、エピトープ）を暴露する条件の下で、生体試料（例として、血液、血清、ＣＳＦ等々）が処置されるプロセスを指す。一般に、抗原賦活化方法は、加熱、加圧処理、酵素消化、還元剤による処置、酸化剤による処置、架橋剤による処置、変性剤（例として、界面活性剤、エタノール、酸）による処置、またはｐＨの変化、または前述のいずれかの組み合わせを含むがこれらに限定されないステップを備える。

いくつかの抗原賦活化方法は、プロテアーゼによって誘発されるエピトープ賦活化（ＰＩＥＲ）および熱によって誘発されるエピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）を含むがこれらに限定されず、従来技術において公知である。いくつかの態様において、抗原賦活化手順は、バックグラウンドを減少させ、検出技法（例として、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイ、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫ブロット（Western Blotなどの）、ＥＬＩＳＡ等々）の感度を増大させる。

ＲＡＮタンパク質検出アッセイ
いくつかの側面において、本開示は、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体および電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを備えるキットを、提供する。一般に、「電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイ」は、生体試料中の被検体（例として、１以上のＲＡＮタンパク質）に対する捕捉抗体（例として、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体）の結合が、電気化学発光ラベル（例として、適切な化学環境における（例として、トリプロピルアミン（ＴＰｒＡ）の存在下における）電気によって刺激される場合に、光を発する検出可能な部分）を使用して検出されるバイオアッセイを、指す。電気化学発光ラベルは、たとえばMuzyka(2014)Biosens Bioelectron 15(54):393-407により、記載されている。

いくつかの態様において、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＳＤ）アッセイである。本明細書に使用されているように、用語「メソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイ」は、たとえば Moxness et al. (2005) Clin. Chem. 51(10):1983-5、および米国特許第７，００８，７９６（それらは、ＭＳＤアッセイステップの記載に関して参照として組み込まれる）に記載されているように、（例として電気化学的刺激により光を発するＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ラベル（例として、１以上のルテニウム錯体を備えるを標識）などの１以上の検出可能な試薬使用して）電気化学ルミネセンスによる被検体の検出のために使用される免役アッセイを、指す。

一般に、ＭＳＤアッセイは、生体試料に存在するＲＡＮタンパク質が、１以上の捕捉抗体に結合し錯体を形成する条件の下で、固形基質、たとえば基質に付着された１以上の捕捉抗体（例として、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体）を備えるマルチウェルアッセイプレートを、生体試料（例として、対象から得られた血液試料）と接触させること、そして、続いて該複合体を、検出可能な試薬に接合される１以上の二次抗体（例として、複合体のＲＡＮタンパク質部分に結合する抗体、または、抗マウス抗体、抗ラビット抗体などの、捕捉抗体に結合する抗体等々）と接触させることを備える。いくつかの態様において、検出可能な試薬は、たとえば米国特許第５，３１０，６８７号に記載されているように、電気化学発光部分を備え、それはこのような電気化学発光部分に関する開示に関して、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、検出可能な試薬は、ルテニウム複合体、たとえばルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン）（また［Ｒｕ（Ｂｐｙ）_３］^＋２として言及される）またはその塩を、備える。

検出可能な試薬（例として、検出可能部分、たとえばＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）などのルテニウム複合体）は、一次抗体（例として、抗ＲＡＮタンパク質抗体などの捕捉抗体）または二次抗体（例として、ＲＡＮタンパク質に結合する抗体または捕捉抗体に結合する抗体などの検出抗体）に接合されてもよい。

いくつかの側面において、本開示は、（例として、本明細書中に記載されたキットを使用して）試料中の１以上のＲＡＮタンパク質を測定する方法を提供し、該方法は、以下を備える：対象から得られた生体試料（例として、血液試料、ＣＮＳ組織試料等々）中で、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、１以上のＲＡＮタンパク質を検出すること。いくつかの態様において、対象は、生体試料中の１以上のＲＡＮタンパク質の検出に基づいて、ＡＬＳおよび／またはＦＴＤを進展させることの危険を有するかまたはそのような状態にあるとして、診断される。いくつかの態様において、対象は、生体試料中の１以上のＲＡＮタンパク質の検出に基づいて、ＳＣＡ３６を進展させることの危険を有するかまたはそのような状態にあるとして、診断される。いくつかの態様において、対象は、遺伝子検査（例として、対象のＣ９ＯＲＦ７２またはＳＣＡ３６の繰り返し伸長の存在を同定するＰＣＲに基づく試験などの、核酸に基づく試験）に基づくＡＬＳ、ＦＴＤ、またはＳＣＡ３６を有するとして、（例として、医師などの医療専門家によって診断され）あらかじめ決定された。

いくつかの態様において、試料中で検出される１以上のＲＡＮタンパク質は、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、およびポリ（ＰＡ）から選択される。いくつかの態様において、２つ、３つ、または４つのＲＡＮタンパク質が、試料中で検出される（例として、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、およびポリ（ＰＡ）、またはそれらのいずれかの組み合わせ）。

いくつかの態様において、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイは、１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体を試料に接触するステップを備える。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、抗ポリ（ＧＰ）抗体、抗ポリ（ＧＲ）抗体、抗ポリ（ＰＲ）抗体、および抗ポリ（ＰＡ）抗体から選択される。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、たとえばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／１７６８１３に記載されているように、ポリアラニン、ポリロイシン、ポリセリン、またはポリシステインを標的とする。

いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、ＲＡＮタンパク質のジアミノ酸繰り返し領域に結合するかまたはＲＡＮタンパク質のＣ末端部分に結合する。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、ホモポリマー性アミノ酸繰り返し領域またはＨｔｔ遺伝子から翻訳されるＲＡＮタンパク質のＣ末端を標的とする。

いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、ポリアミノ酸繰り返しを備えないＲＡＮタンパク質のいずれかの部分を標的としてもよい。ＲＡＮタンパク質のＣ末端を標的とする抗ＲＡＮ抗体の例は、たとえば、米国公開番号２０１３／０１１５６０３において開示され、その全体の内容が、本明細書に参照として組み込まれる。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体（例として、抗ポリ（ＧＰ）、抗ポリ（ＰＲ）、抗ポリ（ＰＡ）、および抗ポリ（ＧＲ）から選択される２以上の抗ＲＡＮ抗体の組み合わせ）のセット（または組み合わせ）は、生体試料中の１以上のＲＡＮタンパク質を検出するために、使用される。

抗ＲＡＮ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることができる。典型的には、ポリクローナル抗体は、マウス、ラビット、またはヤギなどの、好適な哺乳動物の接種によって、生成される。収集されることができる血清の量がより大きいために、より大きい哺乳動物が、しばしば好ましい。抗原は、哺乳動物に注入される。これはＢリンパ球を誘発して、抗原に特異的なＩｇＧイムノグロブリンを生成する。このポリクローナルＩｇＧは、哺乳動物の血清から精製される。モノクローナル抗体は、単一の細胞株（例として、ハイブリドーマ細胞株）によって、一般に生成される。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、（例として、血清から単離されて）精製される。

数々の方法が、抗ＲＡＮ抗体を得るために使用されてもよい。たとえば、抗体は、組み換えＤＮＡ方法を使用して、生成されることができる。モノクローナル抗体はまた、公知の方法に従ってハイブリドーマ（例としてKohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499を参照）の発生によって、生成されてもよい。

このように形成されるハイブリドーマは、指定された抗原と特異的に結合する抗体を生成する１以上のハイブリドーマを同定するために、次いで酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（例として、ＯＣＴＥＴまたはＢＩＡＣＯＲＥ）分析などの、標準的な方法を使用してスクリーニングされる。特定された抗原（例として、ＲＡＮタンパク質）のいかなる形も、免疫原、例として、組み換え抗原、天然に生じる形、それらのいずれかのバリアントまたはフラグメントとして、使用されてもよい。抗体を作成する１つの例示的な方法は、抗体またはそれらのフラグメント（例として、ｓｃＦｖ）を発現するタンパク質発現ライブラリ、例として、ファージまたはリボソーム提示ライブラリをスクリーニングすることを含む。ファージ提示は、たとえば、Ladner et al., U.S. Pat. No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597WO92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690;およびWO 90/02809中に記載されている。

提示ライブラリの使用に加えて、特定された抗原（例として、１以上のＲＡＮタンパク質）が、非ヒト動物、例として、齧歯類、例として、マウス、ハムスター、またはラットを免疫化するために、使用されることができる。
一態様において、非ヒト動物は、マウスである。

別の態様において、モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得られ、そして、次いで当該技術分野において公知の組み換えＤＮＡ技法を使用して、修飾され、例として、キメラを作成する。キメラ抗体を作成する様々なアプローチが、記載されてきた。例としてMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567; Boss et al., U.S. Pat. No. 4,816,397; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP171496; European Patent Publication 0173494, United Kingdom Patent GB 2177096B参照。

抗体は、当該技術分野において公知の方法によって、ヒト化されることもできる。たとえば、所望の結合特異性を伴うモノクローナル抗体は、商業的にヒト化されることができる（Scotgene、Scotland；そして、Oxford Molecular、Palo Alto、Calif.）。トランスジェニック動物において発現するものなどの、完全なヒト化抗体は、本発明の範囲内である（例として、Green et al. (1994) Nature Genetics 7, 13；米国特許第５，５４５，８０６および５，５６９，８２５参照）。

追加の抗体生産技術に関して、A Laboratory Manual, Second Edition. Edited by Edward A. Greenfield, Dana-Farber Cancer Institute、（著作権）２０１４を参照されたい。本開示は、必ずしもいずれかの特定の供給源、生産の方法、または抗体の他の特別な特徴に、限定されない。

いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、（例として、血清から単離されて）精製される。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、標識される（例として、蛍光標識、発光標識、放射標識、酵素標識、または他のいずれかの検出可能標識、等々を備える）。

いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、低いマイクロモル（１０^−６）からナノモル（１０^ー７〜１０^−９）の範囲にあるＫｄ値（抗体とＲＡＮ抗原の間の平衡解離定数）を有する。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、低いナノモルの範囲（１０^−９）にあるＫｄ値を有する。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、ピコモルの範囲（１０^−１２）にあるＫｄ値を有する。

従って、いくつかの態様において、開示によって記載される方法およびキットは、特定された時間にわたって対象のＲＡＮタンパク質のレベルを測定することが可能であり（例として、処置のコースを通じて長手方向に）、一定のＡＬＳ／ＦＴＤまたはＳＣＡ３６処置（たとえば、ＡＬＳ／ＦＴＤまたはＳＣＡ３６を処置するための治療剤）の治療成績の評価をそれによって提供する。いかなる理論によっても拘束されることを望まずに、ＡＬＳ／ＦＴＤまたはＳＣＡ３６の処置のための治療剤の投与の後、対象の１以上のＲＡＮタンパク質の減少したレベルを測定することは（例として、投与の前に対象において測定されるＲＡＮタンパク質のレベルと比較して）、ＡＬＳ／ＦＴＤまたはＳＣＡ３６に関する対象を効果的に処置する治療剤を暗示する。

いくつかの側面において、本開示は、ＲＡＮタンパク質発現における薬動力学的変化を測定する方法を提供し、該方法は、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、対象から得られた第１の生体試料（例として、血液試料）において１以上のＲＡＮタンパク質を検出すること；電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、対象から得られた第２の生体試料（例として、血液試料）において１以上のＲＡＮタンパク質を検出することを備え、ここで、第２の生体試料は、対象への治療剤の投与の後得られ；および、第２の生体試料中で検出されるＲＡＮタンパク質の量が、第１の生体試料中で検出されるＲＡＮタンパク質の量未満である場合、対象への治療剤の投与が、対象における１以上のＲＡＮタンパク質のレベルの変化（例として、上昇または減少）に結果としてなることを決定する。

本明細書に使用されているように、「上昇した」は、１以上のジアミノ酸繰り返し含有タンパク質またはヘキサヌクレオチド繰り返し含有ＲＮＡのレベルが、所定の閾値、または、コントロール試料中の１以上のジアミノ酸繰り返し含有タンパク質またはヘキサヌクレオチド繰り返し含有ＲＮＡのレベルなどの、コントロールレベルを上回ることを、意味する。コントロールおよびコントロールレベルは、ＡＬＳ／ＦＴＤまたはＳＣＡ３６を有さないかまたは有すと疑われない対象（たとえば、ＧＧＧＧＣＣ伸長またはＴＧＧＧＣＣ伸長の３０以下の繰り返しを有する対象）から得られる（例として、検出される）ＲＡＮタンパク質レベルを、含む。上昇したレベルは、たとえば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはコントロールレベルを上回ってより上のレベルを含む。上昇したレベルは、また、ゼロ状態（例として、全くないまたは検出不可能なジアミノ酸繰り返し含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチド繰り返し含有ＲＮＡ発現）からゼロでない状態（例として、多少あるまたは検出可能なジアミノ酸繰り返し含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチド繰り返し含有ＲＮＡ）への現象を増加させることを、含む。

本明細書に使用されているように、「減少した」は、１以上のジアミノ酸繰り返し含有タンパク質またはヘキサヌクレオチド繰り返し含有ＲＮＡレベルが、所定の閾値、または、コントロール試料中の１以上のジアミノ酸繰り返し含有タンパク質またはヘキサヌクレオチド繰り返し含有ＲＮＡのレベルなどの、コントロールレベルを下回ることを、意味する。コントロールおよびコントロールレベルは、ＡＬＳ／ＦＴＤまたはＳＣＡ３６を有さないかまたは有すと疑われない対象（たとえば、ＧＧＧＧＣＣ伸長またはＴＧＧＧＣＣ伸長の３０以下の繰り返しを有する対象）から得られる（例として、検出される）ＲＡＮタンパク質レベルを、含む。減少したレベルは、たとえば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはコントロールレベル下回ってより下のレベルを含む。減少したレベルは、また、ゼロでない状態（例として、多少あるまたは検出可能なジアミノ酸繰り返し含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチド繰り返し含有ＲＮＡ）からゼロ状態（例として、全くないまたは検出不可能なジアミノ酸繰り返し含有タンパク質発現またはヘキサヌクレオチド繰り返し含有ＲＮＡ発現）への現象を減少させることを、含む。いくつかの態様において、減少（例として、コントロールまたは従来の試料と比較して、試料の１以上のＲＡＮタンパク質のレベルにおける減少）は、治療剤の治療有効性（例として、試料が得られた対象における治療有効性）を、暗示することができる。

第１の生体試料および第２の生体試料が得られる時間は、変化してもよい。いくつかの態様において、第１の生体試料は、治療剤の投与（例として、治療剤の第１の投与）の前、１週と１分の間に、得られる。いくつかの態様において、第１の生体試料は、治療剤の投与（例として、治療剤の第１の投与）の前、１日（例として、２４時間）と１分の間に、得られる。いくつかの態様において、第２の生体試料は、治療剤の投与（例として、治療剤の第１の投与）の後、１分と６ヵ月の間に、対象から得られる。いくつかの態様において、第２の生体試料は、治療剤の投与（例として、治療剤の第１の投与）の後、１日と１週の間に、対象から得られる。いくつかの態様において、第２の生体試料は、治療剤の投与（例として、最も最近または最後の治療剤の投与）の後、１日と１週の間に、対象から得られる。

いくつかの態様において、第２の生体試料は、治療剤の投与の後、約１時間、５時間、１０時間、２４時間（例として、１日）、４８時間（例として、２日）、１２０時間（例として、５日）、３０日、４５日、または６ヵ月に収集されてもよい。いくつかの態様において、いくつかの生体試料（例として、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはより多くの生体試料）は、たとえば、特定された時間枠（例として、治療コースの間）にわたり、対象から得られ、そして、１以上のＲＡＮタンパク質が、検出される。

ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患および障害を処置する方法
本開示は、いくつかの側面において、ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患、たとえばＡＬＳ／ＦＴＤ、ＳＣＡ３６、ＨＤ等々のための治療処置コースをモニターする方法に、関する。いくつかの側面において、本開示は、電気化学発光免役アッセイで測定されるように、増加したＲＡＮタンパク質翻訳（例として、ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患または障害を有さない対象と比較して）を提示するために決定された対象に、治療剤の有効量を投与することを備えるＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患を処置する方法を、提供する。いくつかの態様において、対象は、治療剤をあらかじめ（例として、決定する前に）、投与された。いくつかの態様において、対象に投与される治療剤は、あらかじめ投与された治療剤と異なる。いくつかの態様において、対象は、電気化学発光免役アッセイで測定されるように、生体試料中のＲＡＮタンパク質の上昇したまたは減少したレベルの検出に基づいて、治療剤の増加したまたは減少した用量を投与される。

いくつかの態様において、コントロール試料において検出されるＲＡＮタンパク質のレベルと比較して、生体試料において検出されるＲＡＮタンパク質のレベルが上昇している場合、本開示によって記載されている方法は、対象に治療剤（例として、ＡＬＳ／ＦＴＤの処置のための剤またはＳＣＡ３６の処置のための剤）を投与するステップを備える。

コントロールおよびコントロールレベルは、ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患または障害、たとえばＡＬＳ／ＦＴＤまたはＳＣＡ３６を有さないかまたは有すると疑われない対象（たとえば、ＧＧＧＧＣＣ伸長またはＴＧＧＧＣＣ伸長の３０以下の繰り返しを有する対象）から得られる（例として、検出される）ＲＡＮタンパク質レベルを、含む。いくつかの態様において、コントロール試料は、対象への治療剤の投与の前に、ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患を有するか有すると疑われる対象から得られた試料を、指す。

本明細書に使用されているように、「処置する」または「処置」は、以下を指す（ａ）ＲＡＮタンパク質翻訳に関連する疾患または障害の発症を防御するかまたは遅延させること；（ｂ）ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患または障害の重症度を減少させること；（ｃ）ＲＡＮタンパク質翻訳に関連する疾患または障害に特徴的な症状の進行を減少させるかまたは防御すること；（ｄ）ＲＡＮタンパク質翻訳に関連する疾患または障害に特徴的な症状の悪化を防御すること；および／または（ｅ）ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患または障害に関してあらかじめ前兆がある対象における症状の再発を減少させるかまたは防御すること。

たとえば、ＡＬＳ／ＦＴＤの文脈において、「処置する」または「処置」は、以下を指す（ａ）ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ、またはＳＣＡ３６の発症を防御するかまたは遅延させること；（ｂ）ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ、またはＳＣＡ３６の重症度を減少させること；（ｃ）ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ、またはＳＣＡ３６に特徴的な症状の進行を減少させるかまたは防御すること；（ｄ）ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ、またはＳＣＡ３６に特徴的な症状の悪化を防御すること；および／または（ｅ）ＡＬＳおよび／またはＦＴＤ、またはＳＣＡ３６に関してあらかじめ前兆がある対象におけるＡＬＳおよび／またはＦＴＤ、またはＳＣＡ３６の症状の再発を減少させるか防御すること。ＡＬＳ／ＦＴＤの処置のための治療剤の例は、リルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、トラゾドン（Ｄｅｓｙｒｅｌ、Ｏｌｅｐｔｒｏ）、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、バクロフェン、ジアゼパム、フェニトイン、トリヘキシフェニジル、アミトリプチリン、抗ＲＡＮ抗体等々を含むが、これに限定されない。

別の例において、「ＨＤを処置する」は、以下を指す（ａ）ＨＤの発症を防御するかまたは遅延させること；（ｂ）ＨＤの重症度を減少させること；（ｃ）ＨＤで特徴的な症状の進行を減少させるかまたは防御すること；（ｄ）ＨＤで特徴的な症状の悪化を防御すること；および／または（ｅ）ＨＤに関するあらかじめ前兆がある対象のＨＤ症状の再発を減少させるかまたは防御すること。テトラベナジン、ハロペリドール、クロルプロマジン、リスペリドン、クエチアピン、アマンタジン、レベチラセタム、クロナゼパム、シタロプラム、フルオキセチン、セルトラリン、オランザピン、アロプロアート、カルバマゼピン、ラモトリジン、システアミン、ＰＢＴ２、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤、プリドピジン、ラキニモド、抗ＲＡＮ抗体等々の処置のための治療剤の例。

対象は、１以上の治療剤の治療有効量を投与されてもよい。本明細書に使用されているように、「有効量」は、ＲＡＮタンパク質翻訳または蓄積（例として、神経変性疾患）と関連する疾患または障害によって引き起こされる１以上の兆候または症状の処置または改善などの、医学的に所望の結果を提供するのに十分な治療剤の投与量である。有効量は、処置される対象の年齢および体調、対象における疾患または障害の重症度（例として、ＲＡＮタンパク質蓄積の量またはこのような蓄積によって引き起こされる細胞毒性）、処置の期間、いずれかの併用療法の性質、具体的な投与経路および、保険医の知識および専門性の範囲の要因などに伴い、変化するだろう。

一般に、治療剤は、小分子（例として、メトホルミンまたはメトホルミン誘導体）、干渉ＲＮＡ（例として、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ、アプタマー等々）、タンパク質またはそれらのフラグメント、ペプチド、抗体等々であることができる。いくつかの態様において、治療剤は、たとえば、タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）経路、ＥＩＦ２経路、またはＥＩＦ３経路などの、ＲＡＮタンパク質発現を制御する経路を調整することにより、ＲＡＮタンパク質発現を調整する。いくつかの態様において、治療剤は、ウイルスのベクター、たとえばレンチウイルスのベクター、レトロウイルスのベクター、アデノウイルスのベクター、またはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって送達される。

適切な追加の治療剤の同定および選択は、当業者の能力の範囲内であり、対象が被害を被っている疾患に依存するだろう。たとえば、いくつかの態様において、ハンチントン病（例として、テトラベナジン、アマンタジン、クロルプロマジン等々）、脆弱Ｘ症候群（例として、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、カルバマゼピン、メチルフェニデート、トラゾドン等々）、脊髄小脳失調症（例として、バクロフェン、リルゾール、アマンタジン、バレニクリン等々）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（例として、リルゾール等々）、筋強直性ジストロフィー１型（チデグルシブ、メキシレチン等々）のための１以上の治療剤が、対象に投与される。

処置の投与は、当該技術分野において公知のいずれかの方法（例として、Harrison's Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Incを参照）によって、達成されてもよい。投与は、局所でも、または全身でもよい。投与は、非経口（例として、静脈内、皮下、または、皮内）、または経口でもよい。種々の投与経路のための組成物は、当該技術分野において周知である（例として、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinを参照）。投与量は、対象および投与経路に依存するであろう。投与量は、当業者によって決定されることができる。

いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まずに、生体試料の検出（例として、ＲＡＮタンパク質の定量化）は、治療剤の有効性、または、試料が得られる対象におけるのレジメを決定するために使用されることができる。

キット
いくつかの側面において、本開示は、１以上の抗ＲＡＮ抗体を含有する第１の容器、および１以上の検出可能な試薬を含有する第２の容器を備えるキットを、提供する。いくつかの態様において、１以上の抗ＲＡＮ抗体は、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、およびポリ（ＰＡ）から選択される１以上のＲＡＮタンパク質に、結合する。いくつかの態様において、１以上の抗ＲＡＮ抗体は、標的のポリアラニン、ポリロイシン、ポリセリン、またはポリシステインから選択される１以上のＲＡＮタンパク質に、結合する。いくつかの態様において、１以上の検出可能な試薬は、ルテニウム複合体、たとえばルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン）（また［Ｒｕ（Ｂｐｙ）_３］^＋２として言及される）またはその塩を、備える。いくつかの態様において、キットは、コントロール試料を含有する第３の容器を、備える。コントロール試料は、ネガティブコントロール試料（例として、１以上のＲＡＮタンパク質を含有しないかまたは欠如するコントロール試料）またはポジティブコントロール試料（例として、１以上のＲＡＮタンパク質を備えるコントロール試料、任意にここで、試料中の１以上のＲＡＮタンパク質の量が、既知である）でもよい。

例
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子からのＲＡＮタンパク質翻訳の検出のためのメソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイの使用を、調査した。図１Ａ−１Ｄは、メソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイを使用したＲＡＮタンパク質（図１Ａ中のポリ（ＧＰ）、図１Ｂ中のポリ（ＧＲ）、図１Ｃ中のポリ（ＰＲ）、および図１Ｄ中のポリ（ＰＡ））の検出のための標準曲線を示す。この例で試験した抗ＲＡＮタンパク質抗体の各々は、それぞれのＲＡＮタンパク質のジアミノ酸繰り返し領域に結合するポリクローナル抗体であった。

ＭＳＤアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの、および哺乳動物の対象から得た生体試料の、ポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質の検出のために、試験した。図２Ａは、ＡＬＳ／ＦＴＤのＣ９Ｏｒｆ７２マウスモデル（例として、Ｃ９−ＢＡＣマウスモデル、「Ｃ９（＋）」）から得た脳組織可溶性分画から、ポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質のレベルを測定するＭＳＤアッセイからのデータを示す。データは、ＭＳＤによる野生型（ＷＴ）マウスと比較して、Ｃ９（＋）の前頭皮質（ＦＣＸ）および小脳（ＣＥ）の両方における増加したポリ（ＧＰ）タンパク質の検出を、指し示す。増加したポリ（ＧＰ）タンパク質の発現は、トランスフェクトしなかったＨＥＫ２９３細胞と比較して、ポリ（ＧＰ）発現コンストラクトによってトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のＭＳＤによっても、検出した（図２Ｂ）。

治療剤の投与後のＡＬＳ／ＦＴＤ（例として、Ｃ９−ＢＡＣマウス）のマウスモデルのＲＡＮ翻訳は、ＭＳＤアッセイによっても調査した。簡潔には、Ｃ９（＋）またはＣ９（−）コントロールマウスに、ＥＧＦＰ（コントロール）または治療剤タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）バリアントＫ２９６Ｒを発現するために構成されるｒＡＡＶを投与し、それはＲＡＮ翻訳を阻害するために観察されるＰＫＲのドミナントネガティブバリアントである。図３Ａは、ＡＡＶ−ＥＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＫＲ（Ｋ２９６Ｒ）発現コンストラクトの模型的な描写を、示す。ＭＳＤデータは、ＥＧＦＰコンストラクトを投与されたコントロールマウスと比較して、ＰＫＲ Ｋ２９６Ｒで処置したＣ９（＋）マウスにおけるポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質の薬動力学的減少を示す。

追加のＲＡＮタンパク質を標的とする抗体は、ＭＳＤアッセイシステムにおいても試験した。ＨＥＫ２９３セルは、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）およびポリ（ＰＡ）ＲＡＮタンパク質をコードする発現コンストラクトでトランスフェクトした。ＭＳＤアッセイを遂行し、そして、トランスフェクトされた細胞のＲＡＮタンパク質発現レベルを、トランスフェクトされなかったコントロール細胞と比較した。図４は、トランスフェクトされたかまたはコントロール細胞から得た、可溶性分画中のＣ９ＲＡＮタンパク質レベル（ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、ポリ（ＰＡ）；左から右に）のＭＳＤアッセイ検出を、示す。増加したＲＡＮタンパク質レベルは、コントロール細胞と比較してそれぞれのトランスフェクトされた細胞試料におけるＭＳＤアッセイによって、検出した。

ヒトの対象から得られる生体試料のＲＡＮタンパク質のレベルを検出するためのＭＳＤアッセイの能力を、調査した。図５は、Ｃ９ＯＲＦ７２ ＡＬＳ患者から得た血液試料中のポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質のメソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイを、示す。ポリ（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質の相対的なレベルは、ポリクローナル抗ポリ（ＧＰ）抗体を使用するＭＳＤアッセイによって、定量した。７つの独立したコントロールの対象（例として、Ｃ９ＯＲＦ７２繰り返し伸長を有さない対象）と比較して、ポリ（ＧＰ）タンパク質の有意に高いレベルを、Ｃ９ＯＲＦ７２繰り返し伸長に関して陽性である、２つの検討対象において、観察した。

対象から得た生体試料のための処理条件を、調査した。図６Ａ−６Ｃは、種々の処理時間および温度での対象から得た血液試料に遂行したメソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイに関する代表的なデータを、示す。抗ポリ（ＧＰ）抗体を、この検討において使用した。一般に、データは、収集の２４時間以内に処理される血液と比較して、１、２、または３日間の、室温（ＲＴ）または４℃に保つ血液のインキュベーション時間にわたる、ＭＳＤによって検出する、バックグラウンドシグナルにおける増加を、指し示す（図６Ａ）。２４時間以内に収集処理した血液と比較して、インキュベーション時間（例として、１、２、または３日）にわたる、ＭＳＤによって検出されるバックグラウンドシグナルの増加を、室温（ＲＴ）で、観察した。より高いバックグラウンドを、Ｃ９（＋）およびＣ９（−）コントロール試料の両方において、観察した。実際に、Ｃ９（＋）およびＣ９（−）試料は、室温で１、２、または３日間保った試料において、区別することができなかった。類似であるが、より有意でない傾向を、４℃（図６Ｃ）で観察した。しかしながら、４℃で、より高いバックグラウンドを、Ｃ９（＋）およびＣ９（−）コントロール試料の両方において観察したにもかかわらず、Ｃ９（＋）試料は、最高２日間のインキュベーションで、Ｃ９（−）コントロール試料から区別することが可能だった。

Claims (25)

1. 電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、対象から得られた生体試料（例として、血液試料）中で、１以上のＲＡＮタンパク質を検出することを備える、方法。
2. 生体試料が、血液試料、または組織試料であり、任意にここで、前記組織試料が、ＣＮＳ組織試料である、請求項１に記載の方法。
3. 対象が、哺乳動物の対象であり、任意にここで、前記対象が、ヒトまたはマウスである。請求項１または２に記載の方法、
4. 対象が、
   （ｉ）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子中のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド配列繰り返し伸長、任意にここで、対象は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００のＧＧＧＧＣＣ繰り返し伸長を備える、
   または
   （ｉｉ）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子中のＴＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド配列繰り返し伸長、任意にここで、対象は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００のＴＧＧＧＣＣ繰り返し伸長を備える、
   により特徴づけられる、請求項３に記載の方法。
5. 対象が、Ｃ９−ＢＡＣマウスである、請求項３に記載の方法。
6. 試料中に検出される１以上のＲＡＮタンパク質が、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、およびポリ（ＰＡ）から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ２、３、または４つのＲＡＮタンパク質が、試料中に検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイが、試料を１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体に接触させるステップを備え、任意にここで、前記抗ＲＡＮ抗体が、抗ポリ（ＧＰ）抗体、抗ポリ（ＧＲ）抗体、抗ポリ（ＰＲ）抗体、および抗ポリ（ＰＡ）抗体から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 抗ＲＡＮ抗体が、ＲＡＮタンパク質のジアミノ酸繰り返し領域に結合し、任意にここで、ジアミノ酸繰り返し領域が、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、またはポリ（ＰＡ）である。請求項８に記載の方法。
10. 抗ＲＡＮ抗体が、ＲＡＮタンパク質のＣ末端部分に結合し、任意にここで、ＲＡＮタンパク質が、ポリ（ＧＰ）、ポリ（ＧＲ）、ポリ（ＰＲ）、またはポリ（ＰＡ）ジアミノ酸繰り返し領域を備える、請求項８に記載の方法。
11. １以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. １以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体が、モノクローナル抗体である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイが、メソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. コントロール試料中に検出されるＲＡＮタンパク質のレベルと比較して、生体試料中に検出されるＲＡＮタンパク質のレベルが上昇している場合に、対象に治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 治療剤の投与の後に、対象から第２の生体試料を得て、電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、該試料の１以上のＲＡＮタンパク質を検出するステップを備える、請求項１４に記載の方法。
16. 電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイが、生体試料が対象から得られる２日以内に遂行される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
17. 電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイが、生体試料が対象から得られる２４時間以内に遂行される、請求項１６に記載の方法。
18. 電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを遂行する前に、生体試料が、２３℃未満の温度で保存され、任意にここで、生体試料が、４℃以下の温度で保存される、請求項１６または１７に記載の方法。
19. （ｉ）電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、対象から得られた第１の生体試料（例として、血液試料）中で、１以上のＲＡＮタンパク質を検出すること、
    （ｉｉ）電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイを使用して、対象から得られた第２の生体試料（例として、血液試料）中で、１以上のＲＡＮタンパク質を検出すること、ここで、第２の生体試料は、対象に治療剤を投与後に、得られる、
    および
    （ｉｉｉ）第２の生体試料中で検出されるＲＡＮタンパク質の量が、第１の生体試料中で検出されるＲＡＮタンパク質の量未満である場合、対象への治療剤の投与が、対象における１以上のＲＡＮタンパク質のレベルの変化に結果としてなることを決定すること、
    を備える、ＲＡＮタンパク質発現における薬動力学的変化を測定するための方法。
20. 第１の生体試料が、治療剤の投与の前、１週と１分の間に得られる、請求項１９に記載の方法。
21. 第２の生体試料が、治療剤の投与の後、１時間と１週の間に得られる、請求項１９または２０に記載の方法。
22. （ｉ）１以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体、
    および
    （ｉｉ）電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイプレートおよび／または試薬、
    を備えるキット。
23. １以上の抗ＲＡＮタンパク質抗体が、抗ポリ（ＧＰ）抗体、抗ポリ（ＧＲ）抗体、抗ポリ（ＰＲ）抗体、および抗ポリ（ＰＡ）抗体から選択される、請求項２２に記載のキット。
24. 抗ＲＡＮタンパク質抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項２２または２３に記載のキット。
25. 電気化学ルミネセンスに基づく免役アッセイプレートおよび／または試薬が、ＭＳＤアッセイプレートおよび／またはＭＳＤアッセイ試薬である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のキット。