JP6240919B2 - 加齢または筋萎縮の診断用バイオマーカー - Google Patents

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Description

本発明は、加齢または筋萎縮の診断用バイオマーカーに関する。
超高齢社会を背景に、運動機能低下と筋萎縮を起因とする要介護の状態を予防するために有効なバイオマーカーが求められているが、決定的なものは未だ存在しない。特に、筋萎縮が進むと治療不可能であるため、早期診断・治療を可能にするバイオマーカーが必要である。また、筋萎縮に至る神経筋難病についても有効な治療法、治療薬を開発するためバイオマーカーが必要とされている。
しかしながら、現在のところ、介護予防や臨床の現場では、筋力、筋量、運動能力の測定、聞き取りによる日常活動のスコアーで診断を行っている。これらの方法は筋萎縮が進行する前の早期診断に対しては有効性が乏しいため、筋の変化を早期に診断して筋萎縮の予防・治療を可能にするバイオマーカーを開発する必要がある。
例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の診断は特徴的な臨床症状によるが、加えて針筋電図検査、経頭蓋磁気刺激法（transcranial magnetic stimulation；ＴＭＳ）、神経画像診断などの検査が、診断の裏づけに有用であることが示されている。また、バイオマーカーはＡＬＳの早期診断とともに臨床試験における被験者数の縮小、期間短縮、さらに薬効の客観的判定に有用と考えられ、ＡＬＳ患者の脳脊髄液や血漿を用いた同定が検討されてきたが、現在のところ、本疾患に有用であることが証明されたバイオマーカーはない（非特許文献１）。
重症筋無力症の確定診断には自己抗体が使われるが、治療の有効性又は副作用の判定、重症度の評価には有用ではなく、また単一筋線維筋電図法(single-fiber electromyography)は測定時の病態を診断するには良い指標となるが、治療による予後判定には有用ではない。そのため、重症筋無力症のモデル動物と患者で共通に測定することができ、治療効果を客観的に評価することができるバイオマーカーが必要とされている（非特許文献２）。
サルコペニア（加齢性筋肉減少症）のバイオマーカーとしてＴＮＦ−αやＩＬ−６などの炎症性マーカーが報告されている（非特許文献３−６）。しかし、特異性に乏しく筋萎縮の早期診断・治療を目的として利用することは困難である。
Costa J, Gomes C, de Carvalho M, CNS Neurol Disord Drug Targets. 2010; 9: 764-778 Kaminski H, Kusner L, Wolfe G, et al., Ann N Y Acad Sci 2012; 1275(1): 101-106. Visser M, Pahor M, Taaffe DR, et al., J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2002; 57: M326-332. Payette H, Roubenoff R, Jacques PF, et al., J Am Geriatr Soc 2003; 51: 1237-1243. Schaap LA, Pluijm SM, Deeg DJ, et al., Am J Med 2006; 119: 526 e529-517. Schaap, LA, Pluijm SM, Deeg DJ, et al., J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2009; 64: 1183-1189. Jorgensen, LH, et al., Am J Pathol, 2007; 171(5): 1599-1607
このような現状下、本発明の課題は、新規の加齢または筋萎縮の診断用バイオマーカーを提供し、それに基づく、加齢または筋萎縮の状態を把握する方法、加齢または筋萎縮に対する治療または予防効果の有効性を判定する方法、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニング方法を提供することにある。
神経筋シナプス（神経筋接合部）の筋側（後膜）に発現するチロシンキナーゼである受容体型ＭｕＳＫ（muscle-specific kinase）タンパク質は、神経筋シナプスの形成に必須のタンパク質であり、また、神経筋シナプスの機能維持にも重要な役割を果たしていることが知られている。本発明者は、受容体型ＭｕＳＫタンパク質の膜結合ドメインより上流のエキソンでスプライシングシグナルの配列を超えて転写されることにより生じる分泌型ＭｕＳＫタンパク質が、骨格筋で発現していることを見出し、この分泌型ＭｕＳＫをマウスに免疫することにより、重症筋無力症を発症することを報告している（詳細は後述する）が、これまで、分泌型ＭｕＳＫの生体内での機能は不明であった。
本発明者は、マウス骨格筋における分泌型ＭｕＳＫ及び受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量の測定（実施例３）と、マウス血清中の遊離の状態で存在するＭｕＳＫのタンパク質量の測定（実施例４）を行うことにより、加齢により分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量と血中タンパク質量が増加すること、神経筋シナプスの形態縮小・機能低下が進行中のマウス（運動神経を切断したマウス、あるいは、ギブス固定したマウス）において、分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量、受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量と、血中タンパク質量が増加していることを確認した。また、本発明者は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）発症モデルマウス及び重症筋無力症（ＭＧ）発症モデルマウスにおいて、前者（ＡＬＳマウス）では、発症前から血清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量の上昇が認められ、病気の進行に従って、更なる上昇が認められること（実施例６）、後者（ＭＧマウス）では、発症に伴い、血清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量の上昇が認められること（実施例７）を確認した。これらの知見から、分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ、受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ、あるいは、血中の遊離のＭｕＳＫのタンパク質が加齢のバイオマーカー、または神経筋シナプスの機能を示す指標もしくは筋萎縮の早期診断を可能とするバイオマーカーとして利用できることを見出した。
また、本発明者は、アセチルコリン受容体（神経筋シナプスの筋側に発現している神経伝達分子の受容体）に対する自己抗体により筋力低下と、軽度もしくは中程度の筋萎縮を発症した重症筋無力症の患者と、筋萎縮が高度に進行した筋萎縮性側索硬化症の患者の血清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量の測定（実施例５）を行うことにより、運動神経細胞死の結果、神経筋シナプスが消失して筋萎縮が発症した筋萎縮性側索硬化症患者の血中では、健常者と比較しても遊離のＭｕＳＫタンパク質量が著しく低下している（ほぼ消失する）ことを確認し、血中の遊離のＭｕＳＫが重度の筋萎縮のバイオマーカーとして利用できることを見出した。
更に、本発明者は、ＡＬＳ発症マウスの血清（実施例８）と、マウス培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の培養上清（実施例９）から、遊離のＭｕＳＫタンパク質の中に、受容体型ＭｕＳＫタンパク質がプロテアーゼにより切断されて培養上清中に放出された遊離のＭｕＳＫタンパク質（切断型ＭｕＳＫタンパク質）が含まれていることを確認した。また、本発明者は、マウス培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の培養上清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量が、培養液中にＡＤＡＭ阻害剤ＧＭ６００１を添加することにより、減少することを確認し（実施例１０）、モデル動物の試料中、又は、細胞株の培養上清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質又はｍＲＮＡの量を測定することにより、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニングが可能であることを見出した。更に、本発明者は、前記ＡＤＡＭ阻害剤ＧＭ６００１は、マウスＣ２Ｃ１２筋管細胞に対して、神経シナプス形成の指標の一つである、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）凝集の増加作用を示すことを確認し（実施例１１）、前記スクリーニング系で選択されたスクリーニング結果物が、実際に神経シナプス形成の促進作用を示し、従って、加齢または筋萎縮の治療または予防剤の候補物質となり得ることを確認した。
本発明は、これらの知見に基づくものである。
本発明は、
［１］被験者由来の試料中の分泌型ＭｕＳＫタンパク質又はｍＲＮＡを測定する、加齢または筋萎縮の状態を把握する方法、
［２］前記の分泌型ＭｕＳＫタンパク質が、遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質である、［１］の方法、
［３］遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質が、非受容体型ＭｕＳＫタンパク質、及び／又は、切断型ＭｕＳＫタンパク質である、［２］の方法、
［４］分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを測定する、［１］の方法、
［５］加齢または筋萎縮の状態の把握が、加齢の程度の判定、筋萎縮の早期診断、又は重度の筋萎縮の検出である、［１］〜［４］のいずれかの方法、
［６］分泌型ＭｕＳＫタンパク質又はｍＲＮＡからなる、加齢または筋萎縮の状態を把握するためのバイオマーカー、
［７］前記の分泌型ＭｕＳＫタンパク質が、遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質である、［６］のバイオマーカー、
［８］遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質が、非受容体型ＭｕＳＫタンパク質、及び／又は、切断型ＭｕＳＫタンパク質である、［７］のバイオマーカー、
［９］分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡからなる、［６］のバイオマーカー、
［１０］加齢または筋萎縮の状態の把握が、加齢の程度の判定、筋萎縮の早期診断、又は重度の筋萎縮の検出である、［６］〜［９］のいずれかのバイオマーカー、
［１１］治療患者由来の試料中の分泌型ＭｕＳＫタンパク質又はｍＲＮＡを測定する、加齢または筋萎縮に対する治療または予防効果の有効性を判定する方法、
［１２］加齢または筋萎縮モデル動物、又はその細胞株に試験物質を投与する工程、
前記モデル動物由来の試料中、又は前記細胞株の培養上清中の遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質又はｍＲＮＡを測定する工程、
を含む、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニング方法、
［１３］加齢または筋萎縮モデル動物、又はその細胞株に試験物質を投与する工程、
前記細胞株におけるアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を分析する工程、
を含む、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニング方法、
［１４］加齢または筋萎縮モデル動物、又はその細胞株を含む、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニングキット、
［１５］遊離のＭｕＳＫタンパク質量、もしくは分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させる物質、又はアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を増加させる物質を有効成分として含む、加齢または筋萎縮の治療または予防剤、
［１６］前記有効成分が、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、もしくは分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させ、且つ、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を増加させる物質である、［１５］の治療または予防剤、
［１７］前記有効成分が、受容体型ＭｕＳＫタンパク質の切断を阻害する物質、又は受容体型ＭｕＳＫタンパク質に対するプロテアーゼの活性化もしくはプロテアーゼの発現量増加を阻害する物質である、［１５］又は［１６］の加齢または筋萎縮の治療または予防剤、
［１８］前記有効成分がＡＤＡＭ阻害剤である、［１７］の治療または予防剤、
［１９］以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるタンパク質：
（ａ）配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、分泌型ＭｕＳＫタンパク質活性を有するタンパク質、及び
（ｃ）配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、分泌型ＭｕＳＫタンパク質活性を有するタンパク質、
［２０］前記［１９］のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
［２１］前記［２０］のポリヌクレオチドを含むベクター、
［２２］前記［２１］のベクターで形質転換された細胞、
［２３］前記［２２］の細胞を含む、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニングキット、
に関する。
また、本発明は、
［１ａ］分泌型ＭｕＳＫタンパク質に対する抗体、及び／又は、分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを分析可能なプローブ及び／又はプライマーを含む、加齢または筋萎縮の状態を把握するためのキット、
［２ａ］前記の分泌型ＭｕＳＫタンパク質が、遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質である、［１ａ］のキット、
［３ａ］遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質が、非受容体型ＭｕＳＫタンパク質、及び／又は、切断型ＭｕＳＫタンパク質である、［２ａ］のキット、
［４ａ］分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを分析可能なプローブ及び／又はプライマーを含む、［１ａ］のキット、
［５ａ］加齢または筋萎縮の状態の把握が、加齢の程度の判定、筋萎縮の早期診断、又は重度の筋萎縮の検出である、［１ａ］〜［４ａ］のいずれかのキット、
［１１ａ］分泌型ＭｕＳＫタンパク質に対する抗体、及び／又は、分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを分析可能なプローブ及び／又はプライマーを含む、加齢または筋萎縮に対する治療または予防効果の有効性を判定するためのキット、
に関する。
また、本発明は、
［１５ａ］加齢または筋萎縮の治療または予防の必要がある対象に、その有効量で、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、もしくは分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させる物質、又はアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を増加させる物質を投与することを含む、加齢または筋萎縮の治療または予防方法、
［１５ｂ］遊離のＭｕＳＫタンパク質量、もしくは分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させる物質、又はアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を増加させる物質の、加齢または筋萎縮の治療または予防剤の製造への使用、
［１５ｃ］加齢または筋萎縮の治療または予防用である、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、もしくは分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させる物質、又はアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を増加させる物質、
に関する。
本明細書において、用語「筋萎縮」には、例えば、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、重症筋無力症（抗ＭｕＳＫ抗体陽性重症筋無力症、抗アセチルコリン（ＡＣｈＲ）抗体陽性重症筋無力症、抗ＬＲＰ４（low-density lipoprotein receptor (ＬＤＬＲ) related protein 4）抗体陽性重症筋無力症、既知自己抗体陰性重症筋無力症を含む）、神経筋難病、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型又はII型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、外傷又は外科治療後の筋組織再建が含まれる。
サルコペニアは、加齢により筋力低下、運動能力の低下、筋萎縮に至る病態であり原因は不明だが、病態が進む過程で神経と筋のつなぎ目である神経筋シナプスの機能低下と形態縮小がおきる。カロリー制限や運動により、神経筋シナプスの形態が改善することが老化マウスの実験で示されている（Valdez G, Tapia JC, Kang H, et al. PNAS 2010;107:14863-14868.）。
重症筋無力症は、神経筋シナプスに対する自己抗体により、シナプスの形態縮小と神経伝達が低下して筋力低下や筋萎縮を発症する。これまで原因となる自己抗原としてアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、ＭｕＳＫ、ＬＲＰ４が発見されているが、原因不明の重症筋無力症が未だ存在する。
神経筋難病は、運動神経細胞病（筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症を含む）、多発筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチーを含む。これらの筋萎縮を発症する疾患の原因はそれぞれ異なるが、筋萎縮に至る過程において神経筋シナプスの機能・形態縮小により神経伝達が減弱して筋力低下と筋萎縮が悪化する。
廃用性筋萎縮は、長期の病床療養あるいはギプス固定などで発症する、シナプスの機能減少・形態縮小を伴った筋萎縮である。神経筋シナプスは、筋と運動神経終末からの相互伝達シグナルにより維持されることが明らかにされている（Yumoto N, Kim N, Burden SJ. Nature 2012;489:438-442.）。健常者ではシナプスの可塑性が保たれており、またシナプスの再生能を有し機能・形態を修復することができる。健常ラットを使い運動不足によりシナプス形態の縮小が誘導されることが示されている（Deschenes MR, Tenny KA, Wilson MH. Neuroscience 2006;137:1277-1283.）。
本明細書において、軽度または中程度の筋萎縮とは、神経筋シナプスの機能低下（例えば、シグナル伝達の低下）が認められるが、骨格筋の反応性（例えば、神経筋シナプスの再生・維持）が保たれていることを意味する。
また、重度の筋萎縮とは、神経筋シナプスの機能を喪失しており、且つ、骨格筋の反応性が消失していることを意味する。
本発明によれば、新規の加齢または筋萎縮の診断用バイオマーカーを提供することができる。
本発明のバイオマーカーによれば、加齢または筋萎縮の状態を把握する方法、加齢または筋萎縮に対する治療または予防効果（例えば、投薬療法、運動療法、栄養療法）の有効性を判定する方法、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニング方法を提供することができる。
６か月齢のＣ５７ＢＬ６マウス、ギプス固定して１１日後の６か月齢マウス、座骨神経を切断して１１日後の６か月齢マウス、２９か月齢の高齢マウスにおいて、マウス骨格筋における分泌型ＭｕＳＫ及び受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。 ８か月齢（コントロール）マウス、２０か月齢、２７か月齢、３２か月齢の各加齢マウス、座骨神経を切断して１１日後の６か月齢マウスにおいて、マウス血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量を測定した結果を示すグラフである。 筋萎縮性側索硬化症患者（ＡＬＳ，Ｎ＝８）、重症筋無力症患者（ＭＧ，Ｎ＝３）において、患者血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量を測定した結果を示すグラフである。 野生型マウス（コントロール）、ＡＬＳ発症モデルマウス（Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１）において、発症前（４週齢、６週齢、８週齢、１０週齢）における、血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量を測定した結果を示すグラフである。 野生型マウス（コントロール）、ＡＬＳ発症モデルマウス（Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１）において、１０週齢、１４週齢、１８週齢、死亡時における、血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量を測定した結果を示すグラフである。 野生型マウス（コントロール）、重症筋無力症（ＭＧ）発症モデルマウス（ＥＡＭＧ）において、６〜８か月齢における、血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量を測定した結果を示すグラフである。 ＡＬＳ発症モデルマウスの血清を用いて硫安分画を行った後、マウス抗ＭｕＳＫ細胞外ドメインモノクローナル抗体で免疫沈降を行い、得られた免疫沈降物のウエスタンブロッティング（ウサギ抗マウスＭｕＳＫモノクローナル抗体）の結果を示す、図面に代わる写真である。 マウス培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の培養上清を用いて硫安分画を行った後、抗マウスＭｕＳＫ抗体カラムで精製し、得られた精製画分のウエスタンブロッティング（ウサギ抗マウスＭｕＳＫモノクローナル抗体）の結果を示す、図面に代わる写真である。 マウス培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の培養上清を用いて硫安分画を行った後、抗マウスＭｕＳＫ抗体カラムで精製し、得られた精製画分のＣＢＢ染色の結果を示す、図面に代わる写真である。 図９に示すバンド１〜５（８５ｋＤａ〜５０ｋＤａの領域）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析し、マウス受容体型ＭｕＳＫタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１）と比較した結果を示す、説明図である。 マウス培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２をＡＤＡＭ阻害剤ＧＭ６００１の存在下で培養した後、培養上清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量を測定した結果を示す、グラフである。 マウス培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２をＡＤＡＭ阻害剤ＧＭ６００１の存在下で培養した後、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）凝集を染色し、その結果を示す、グラフである。
（１）本発明のバイオマーカー、並びに加齢または筋萎縮の状態を把握する方法、及び加齢または筋萎縮に対する治療または予防効果の有効性を判定する方法
本発明では、バイオマーカーとして、分泌型ＭｕＳＫ（muscle-specific kinase）タンパク質又はその遺伝子産物（ｍＲＮＡ）を使用する。ＭｕＳＫタンパク質には、その機能がよく解析されている受容体型ＭｕＳＫタンパク質と、生体内での機能が不明な分泌型ＭｕＳＫタンパク質とが存在し、本発明では分泌型ＭｕＳＫタンパク質、あるいは、血中等の体液中に遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質を使用する。
受容体型ＭｕＳＫタンパク質は、神経筋シナプスの筋側（後膜）に発現するチロシンキナーゼであり（Valenzuela DM, Stitt TN, DiStefano PS, et al. Neuron 1995;15:573-84.、Ganju P, Walls E, Brennan J, Reith AD. Oncogene 1995;11:281-90.）、神経筋シナプスの形成に必須の機能タンパク質である（DeChiara TM, Bowen DC, Valenzuela DM, et al. Cell 1996;85:501-12.）。運動神経終末から分泌されるヘパリン硫酸プロテオグリカンのアグリン（agrin）は、シナプス後膜に発現しているＬｒｐ４（low-density lipoprotein receptor (LDLR) related protein 4）と結合してＭｕＳＫを活性化する（Zhang B, Luo S, Wang Q, Suzuki T, Xiong WC, Mei L. Neuron 2008;60:285-97.）。アグリン−Ｌｒｐ４−ＭｕＳＫのシグナルは神経筋シナプスの維持にも重要な役割を果たしている。
一方、分泌型ＭｕＳＫタンパク質は、膜結合ドメインより上流のエキソンでスプライシングシグナルの配列を超えて転写されることにより生じるチロシンキナーゼである。マウスの分泌型ＭｕＳＫのｃＤＮＡ配列（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）は本発明者及びその共同研究者により報告されている（GenBank: AY360453.1）が、ヒトの分泌型ＭｕＳＫのｃＤＮＡ配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２、配列番号１２）は、今回初めて見出されたものである。分泌型ＭｕＳＫの生体内での機能は不明であるが、本発明者及びその共同研究者は、マウス分泌型ＭｕＳＫをマウスに免疫することにより、重症筋無力症を発症することを報告している（Shigemoto K, Kubo S, Maruyama N, et al. J Clin Invest 2006;116:1016-24.）。
本明細書において「分泌型ＭｕＳＫタンパク質」とは、狭義の意味として、膜結合ドメインより上流のエキソンでスプライシングシグナルの配列を超えて転写されることにより生じる非受容体型のＭｕＳＫタンパク質を意味し、広義の意味として、体液（例えば、血液、脳脊髄液、リンパ液、尿、腹水、胸水等、特に血液）中に遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質を意味する。体液中に遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質としては、例えば、狭義の分泌型ＭｕＳＫタンパク質や、受容体型ＭｕＳＫタンパク質が生体内の機序（例えば、生体内酵素による切断）により細胞外ドメインと膜結合ドメインとに切断させることにより生じる細胞外ドメイン部分（又はその部分断片）からなるタンパク質（切断型ＭｕＳＫ）を挙げることができる。本発明においては、或る態様として、狭義の分泌型ＭｕＳＫタンパク質をバイオマーカーとして使用し、他の態様として、広義の分泌型ＭｕＳＫタンパク質をバイオマーカーとして使用することができる。また、狭義の分泌型ＭｕＳＫタンパク質を、単に分泌型ＭｕＳＫタンパク質と称することがあり、広義の分泌型ＭｕＳＫタンパク質を、遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質、あるいは、単に遊離のＭｕＳＫタンパク質と称することがある。
狭義の分泌型ＭｕＳＫタンパク質は、例えば、受容体型ＭｕＳＫタンパク質には存在せず、分泌型ＭｕＳＫタンパク質に特有のＣ末端側の部分配列（例えば、配列番号２（ヒト）における第４５２〜４６４番、配列番号１２（ヒト）における第３７４〜３８６番、配列番号４（マウス）における第４５２〜４６４番）を認識する抗体を用いることにより、分析することができる。
一方、広義の分泌型ＭｕＳＫタンパク質は、例えば、細胞外ドメインの内、受容体型ＭｕＳＫタンパク質と分泌型ＭｕＳＫタンパク質とに共通する配列、例えば、配列番号２（ヒト）における第１〜４５１番、配列番号１２（ヒト）における第１〜３７３番、配列番号４（マウス）における第１〜４５１番）を認識する抗体を用いることにより、分析することができる。
本発明のバイオマーカーは、加齢または筋萎縮の状態を把握するためのバイオマーカーとして使用することができる。本明細書において、「加齢または筋萎縮の状態の把握」には、例えば、加齢の程度の判定、筋萎縮の早期診断、重度の筋萎縮の検出、自己抗原（分泌型ＭｕＳＫ又は受容体型ＭｕＳＫ、特に分泌型ＭｕＳＫ）産生量の定量、特定疾患の鑑別（例えば、筋萎縮性側索硬化症と重症筋無力症との鑑別）等が含まれる。
本発明においては、後述する実施例３に示すように、骨格筋において受容体型ＭｕＳＫと分泌型ＭｕＳＫの各ｍＲＮＡが発現しており、受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現が加齢により変化しないのに対して、分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現は加齢により増強し、分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡは、加齢のバイオマーカーとして使用することができる。また、同実施例に示すように、神経切断またはギブス固定による初期の筋萎縮では、骨格筋において受容体型ＭｕＳＫと分泌型ＭｕＳＫの両ｍＲＮＡの発現が増強し、いずれも筋萎縮の早期診断用のバイオマーカーとして使用することができる。
また、実施例４に示すように、血中において分泌型ＭｕＳＫタンパク質、すなわち、遊離のＭｕＳＫが発現しており、分泌型ＭｕＳＫのタンパク質量は加齢により増加し、分泌型ＭｕＳＫタンパク質は、加齢のバイオマーカーとして使用することができる。また、同実施例に示すように、神経切断による初期の筋萎縮では、血中において分泌型ＭｕＳＫのタンパク質量が増加し、筋萎縮の早期診断用のバイオマーカーとして使用することができる。
すなわち、本発明においては、分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、または分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ（すなわち、非受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ；以下、特に断らない限り、同じ）発現量が、健常者または健常時と比較して高値である場合、加齢が進行している、神経筋シナプスの機能低下が進行している、筋萎縮が進行している、と判定することができる。
また、加齢または筋萎縮の予防または治療（例えば、投薬療法、運動療法、栄養療法）を行った後、分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、または分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量が、前記予防または治療前と比較して低下した場合、その予防または治療効果は有効である（投薬の場合には、その薬が有効である）と判定することができる。
具体的には、筋萎縮等の進行が疑われる被験者に対して、各種条件（例えば、人種、性別、年齢、体格（特に骨格筋量）、運動歴、既往歴など）が近似する健常者の母集団から取得した測定値から平均値や閾値を予め決定しておき、被験者の測定値と前記閾値とを比較することにより、前記判定を行うことができる。
あるいは、筋萎縮等の進行が疑われる被験者に対して、その被験者の青年〜壮年期あるいは任意の年齢期の健常時（または筋萎縮等の早期段階）における測定値を予め取得しておき、その後定期的に、所望の間隔（例えば、２週間〜１年間の間隔）で経時的に測定を行い、健常時における測定値と比較することにより、前記判定を行うことができる。
例えば、健常者の平均値に対して、あるいは、被検者の健常時（または筋萎縮等の早期段階）の測定値に対して、判定時の被験者の測定値が、例えば、その１．２倍以上、ある態様ではその１．４倍以上、別の態様ではその１．５倍以上の場合に、高値であると判定することができる。
更に、本発明においては、分泌型ＭｕＳＫタンパク質、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを重度の筋萎縮（例えば、筋萎縮性側索硬化症、特にヒトにおける発症末期）のバイオマーカーとして使用することができる。
具体的には、分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、または分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量が、健常者または健常時（または筋萎縮等の早期段階）と比較して、著しく低値であるか、あるいは、所望の間隔（例えば、２週間〜１年間の間隔）で経時的に測定しても全く上昇しない場合、重度の筋萎縮まで進行している、と判定することができる。
また、重度の筋萎縮である患者に対して筋萎縮の予防（進行防止）または治療を行った後、分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、または分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量が、前記予防または治療前と比較して上昇した場合、その予防または治療効果は有効である（投薬の場合には、その薬が有効である）と判定することができる。
例えば、健常者の平均値に対して、あるいは、被験者の健常時（または筋萎縮等の早期段階）の測定値に対して、判定時の被検者の測定値が、例えば、その１／２以下、ある態様ではその１／４以下、別の態様ではその１／６、更に別の態様ではその１／１０以下の場合に、著しく低値であると判定することができる。
あるいは、ヒト血清中の分泌型ＭｕＳＫタンパク質（すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質）濃度として、例えば、１ｎｇ／ｍＬ以下、ある態様では０．５ｎｇ／ｍＬ以下、別の態様では０．１ｎｇ／ｍＬ以下、更に別の態様では０．０５ｎｇ／ｍＬ以下の場合に、著しく低値であると判定することができる。
更に、本発明においては、分泌型ＭｕＳＫタンパク質、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを測定することで抗ＭｕＳＫ抗体陽性重症筋無力症の血中あるいは骨格筋内の自己抗原産生量を定量することができる。既に抗ＭｕＳＫ抗体陽性重症筋無力症を発症している患者に対しては自己抗原産生量を検出することで治療法の有効性を判定することができる。また、将来抗ＭｕＳＫ抗体陽性重症筋無力症を発症するリスクが高いと予想される被験者、あるいは他の自己免疫疾患の患者に対して、血中あるいは骨格筋内のＭｕＳＫ発現量を測定することで抗ＭｕＳＫ抗体陽性重症筋無力症の発症の予防法あるいは治療法の有効性を判定することができる。
更に、本発明においては、分泌型ＭｕＳＫタンパク質、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを筋萎縮性側索硬化症と重症筋無力症との鑑別用のバイオマーカーとして使用することができる。
具体的には、分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、または分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量が、健常者または健常時と比較して著しく低値である場合、筋萎縮性側索硬化症と判定することができ、健常者または健常時と比較して高値である場合、重症筋無力症（特には、抗アセチルコリン（ＡＣｈＲ）抗体陽性重症筋無力症）と判定することができる。
血中の分泌型ＭｕＳＫタンパク質、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量の量は、公知のタンパク質分析方法、例えば、抗体を用いる免疫学的分析方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ウエスタンブロット法）、電気泳動等の生化学的分析方法、質量分析方法等により測定することができ、臨床検査用の自動分析機を使用することもできる。血液試料としては、例えば、血清、血漿、全血などを用いることができる。
骨格筋中の分泌型ＭｕＳＫ ｍＲＮＡの量は、公知のｍＲＮＡ分析方法、例えば、ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法）、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンブロット法）等により測定することができる。骨格筋試料としては、例えば、筋生検試料などを用いることができる。
これまで述べたとおり、本発明は、筋萎縮の初期段階、又は軽度若しくは中程度の段階では分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量が、健常者または健常時（特に青年〜壮年期）あるいは筋萎縮等が開始する前と比較して上昇する一方、筋萎縮が重度に進行した段階（例えば、筋萎縮性側索硬化症、特にヒトにおける発症末期）では分泌型ＭｕＳＫタンパク質量又はｍＲＮＡ発現量が、健常者または健常時あるいは筋萎縮等の早期段階のレベルよりも著しく低くなる（ほぼ消失する）との一見すると相反する新規知見に基づくものである。
分泌型ＭｕＳＫタンパク質、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質が神経筋シナプスの機能もしくは筋萎縮の早期診断用バイオマーカーとして、また、重度の筋萎縮の診断用バイオマーカーとして利用できる理由について、本発明者は以下の作用機序を考えている。すなわち、受容体型ＭｕＳＫタンパク質が神経筋シナプスの筋側（後膜）の形成および機能維持に必須であるのに対して、分泌型ＭｕＳＫタンパク質は逆行性シグナルとして神経筋シナプスの神経側（前膜）の形成および機能維持を担うタンパク質と推測している。この推測によれば、健常時においても、神経筋シナプスの機能維持のために、骨格筋量に応じて必要量の分泌型ＭｕＳＫタンパク質が発現（構成的発現）しているものと考えられる。一方、神経筋シナプスの機能低下が生じた場合、神経筋シナプスの非活動の程度に応じて生じた骨格筋の量、機能を補うために、分泌型ＭｕＳＫタンパク質が上昇（代償的な誘導発現）するものと考えられる。すなわち、筋萎縮の進行時には、神経筋シナプスの機能維持のために、逆行性シグナルとしての分泌型ＭｕＳＫタンパク質の発現量が上昇するため、加齢のバイオマーカー、筋萎縮の早期診断用バイオマーカーとして使用することができるものと考えられる。また、運動神経細胞が消失して筋萎縮が重度に進行した段階（例えば、筋萎縮性側索硬化症）では、重症筋無力症とは異なり、構成的発現と代償的な誘導発現の両方が消失するために、血中の分泌型ＭｕＳＫタンパク質が著しく低下するものと考えられる。
なお、前記作用機序は現段階での本発明者の推測であり、本発明はこの作用機序に限定されるものではない。
（２）加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニング方法
本発明のバイオマーカーは、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニングに用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、
加齢または筋萎縮モデル動物、又はその細胞株に試験物質を投与する工程（投与工程）、
前記モデル動物由来の試料中、又は前記細胞株の培養上清中の分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を測定する工程（測定工程）、
候補物質を選択する工程（選択工程）
を含み、所望により、
選択した候補物質について、別の評価系を用いて、加齢または筋萎縮の治療または予防効果を確認する工程（確認工程）
を更に含むことができる。
本発明のスクリーニング方法は、前記測定工程に代えて、試験物質を投与した後の前記細胞株におけるアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を分析する工程（分析工程）を含むことができる。なお、本発明のスクリーニング方法では、前記測定工程と前記分析工程の両方を行い、総合的判断により候補物質を選択することもできる。
また、前記の分析工程は、確認工程における評価系として用いることもできる。
投与工程に用いるモデル動物としては、例えば、自然に加齢したモデル動物、若しくは人為的に加齢状態にしたモデル動物、又は筋萎縮を発症させたモデル動物を用いることができる。これらのモデル動物としては、例えば、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、重症筋無力症（抗ＭｕＳＫ抗体陽性重症筋無力症、抗アセチルコリン（ＡＣｈＲ）抗体陽性重症筋無力症、抗ＬＲＰ４抗体陽性重症筋無力症、既知自己抗体陰性重症筋無力症を含む）、神経筋難病（運動神経細胞病（筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症を含む）、多発筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー）、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型又はII型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、外傷又は外科治療後の筋組織再建を含む。
投与工程に用いるモデル動物の細胞株としては、例えば、前記モデル動物から分離した初代培養細胞、それを継代した継代培養細胞、更に不死化した株化培養細胞等を用いることができる。特に、不死化した筋幹細胞又は筋芽細胞であれば、実験ごとにモデル動物から筋幹細胞又は筋芽細胞の分離が不要になり、本発明のスクリーニング方法を迅速に、効率的に実施することができる。
筋幹細胞（サテライト細胞）は筋芽細胞へと分化し、更に筋管細胞（筋線維細胞）へと分化させることができる。筋幹細胞及び筋芽細胞は増殖可能な細胞であり、筋管細胞（筋線維細胞）は多数の筋芽細胞が融合した多核細胞である。
不死化した筋幹細胞は、例えば、モデルマウスと、ＩＦＮ−γで誘導されるＨ−２Ｋｂ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ及び温度感受性ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原を有するＩｍｍｏｒｔｍｏｕｓｅとの交配によって、作成することができる。Ｉｍｍｏｒｔｍｏｕｓｅは、ＩＦＮ−γによりＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原が発現し、細胞の不死化を誘導することができる。
より具体的には、モデルマウスとＩｍｍｏｒｔｍｏｕｓｅとを交配させて、産仔を取得し、得られた産仔から、筋幹細胞を分離する。分離した筋幹細胞を、３３℃、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下で培養することにより、不死化の誘導を行う。得られた細胞を、３７℃で培養することにより、温度感受性ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原を分解し、不死化筋幹細胞を取得することができる。
筋幹細胞から筋芽細胞、筋管細胞への分化誘導は、限定されるものでないが、例えば、以下の実施例に示すように、分化を誘導することができる。具体的には、細胞培養液に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えて筋幹細胞を継代維持培養して、分化誘導時にはＦＣＳの代わりに２．５％ウマ血清（ＨＳ）を加えて培養することで、筋芽細胞への分化を誘導する。更に、同条件で継代して培養することで筋管細胞（筋線維細胞）へ分化を誘導することができる。
本発明で用いることのできる細胞株としては、筋芽細胞から筋管細胞へ分化誘導が可能な細胞株として、例えば、マウス由来のＣ２Ｃ１２筋芽細胞株，ラット由来のＬ６筋芽細胞株を挙げることができ、また、患者由来の骨格筋から採取した初代培養筋芽細胞、あるいは間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた筋芽細胞株を用いることができる。
前記モデル動物の内、加齢モデル動物、又は軽度若しくは中程度の筋萎縮を発症させたモデル動物、又はその細胞株では、分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量が上昇していること、あるいは、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集が減少していることが予想される。測定工程および選択工程では、試験物質を投与したモデル動物由来の試料中、又は細胞株の培養上清中の分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を測定し、試験物質投与前（あるいは、試験物質未投与のコントロール）と比較して、分泌型ＭｕＳＫタンパク質量、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量が低下した試験物質を、加齢または筋萎縮の治療または予防剤の候補物質として選択する。また、分析工程および選択工程では、試験物質を投与した細胞株におけるＡＣｈＲの凝集を分析し、試験物質投与前（あるいは、試験物質未投与のコントロール）と比較して、ＡＣｈＲ凝集が増加した試験物質を、加齢または筋萎縮の治療または予防剤の候補物質として選択する。
選択された候補物質は、所望により実施することのできる確認工程において、別の評価系、例えば、先述のモデル動物の内、前記投与工程で使用しなかったもの、あるいは、よりヒトに近い評価系を用いて、加齢または筋萎縮の治療または予防効果を確認した後、有望な候補物質については、更に次の開発ステージに送られる。
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
（３）加齢または筋萎縮の治療または予防用医薬組成物
本発明のスクリーニング方法で選択された候補物質、すなわち、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させる物質、あるいは、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を増加させる物質は、本発明の加齢または筋萎縮の治療または予防用医薬組成物（治療又は予防剤）の有効成分として用いることができる。
本発明の治療又は予防用医薬組成物の有効成分である、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させる物質としては、本発明のスクリーニング方法で選択された物質であるか否かを問わず、例えば、受容体型ＭｕＳＫタンパク質の切断を阻害する物質、分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させる物質、受容体型ＭｕＳＫタンパク質に対するプロテアーゼの活性化または発現量の増加を阻害する物質を挙げることができる。
本発明の治療または予防用医薬組成物の有効成分としては、遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させ、且つ、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を増加させる物質であることが好ましい。
受容体型ＭｕＳＫタンパク質の切断を阻害する物質としては、ＡＤＡＭ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）（例えば、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１９、特にはＡＤＡＭ１２）に対する阻害剤を挙げることができる。
ＡＤＡＭの阻害剤としてはＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１｛Ｎ−（Ｒ）−（２−（Ｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ）−４−Ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ−Ｌ−Ｎａｌ−Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｄｅ（Ｌ−Ｎａｌ：Ｌ−３−（２’−Ｎａｐｈｔｈｙｌ）ａｌａｎｉｎｅ）｝、ＴＡＰＩ−２｛Ｎ−（Ｒ）−（２−（Ｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ）−４−Ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ−Ｌ−ｔ−Ｂｕｔｙｌ−Ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｄｅ｝などを挙げることができる。
分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量を低下させる物質としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡメチル化酵素やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などのエピジェネティクス制御剤などを挙げることができる。
受容体型ＭｕＳＫタンパク質に対するプロテアーゼの活性化または発現量の増加を阻害する物質としては、前記プロテアーゼの発現量を低下させる物質、あるいは、前記プロテアーゼの酵素活性を低下させる物質を挙げることができる。
アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）の凝集を増加させる物質は、ＡＣｈＲ凝集を指標とする本発明のスクリーニング方法により取得することができる。
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
（４）本発明のタンパク質及びポリヌクレオチド
本発明のタンパク質である分泌型ＭｕＳＫタンパク質には、
（ａ）配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（好ましくは、配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）、
（ｂ）配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、分泌型ＭｕＳＫタンパク質活性を有するタンパク質（以下、機能的等価改変体と称する）、及び
（ｃ）配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、分泌型ＭｕＳＫタンパク質活性を有するタンパク質（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
「機能的等価改変体」において置換、欠失、及び／又は挿入可能なアミノ酸数は、１〜数個であるが、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個である。
本明細書において、分泌型ＭｕＳＫタンパク質活性とは、逆行性シグナルとして神経筋シナプスの神経側（前膜）の形成および機能維持を行う活性を意味する。
「相同ポリペプチド」は、「配列番号２又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、分泌型ＭｕＳＫタンパク質活性を有するタンパク質」であるが、該同一性が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、前記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ全長であっても、翻訳領域のみからなるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。
また、本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。
本発明の形質転換細胞は、本発明のベクターにより、適当な宿主細胞、例えば、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。本発明の形質転換細胞は、本発明のポリペプチドを製造するのに用いることができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：マウス及びヒト分泌型ＭｕＳＫ遺伝子のクローニング》
マウスの培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーをlambda ZapIIベクター（Stratagene社）に入れて作成した。スクリーニングに使うヒトＭｕＳＫ ｃＤＮＡ遺伝子のプローブは、ヒト筋肉由来の全ＲＮＡ（Stratagene社）から、下記プライマー：
５’−ＧＴＴＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴＴＣＧＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号５）
５’−ＣＣＧＴＧＣＡＧＣＧＣＡＧＴＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号６）
を使ってＲＴ−ＰＣＲで増幅した。
得られたヒトＭｕＳＫ ｃＤＮＡ遺伝子プローブをアイソトープで標識して、先に作成したｃＤＮＡライブラリーからマウスＭｕＳＫ ｃＤＮＡを複数単離して遺伝子配列を解析した。単離したＭｕＳＫ ｃＤＮＡには、膜結合配列を含むエキソンとチロシンキナーゼをコードする細胞内領域のエキソンを含むマウス受容体型ＭｕＳＫ ｃＤＮＡの他に、膜結合領域のあるエキソンの一つ前で、スプライシングすることなく翻訳枠がストップコドンで終わるＭｕＳＫ ｃＤＮＡクローン（マウス分泌型ＭｕＳＫ ｃＤＮＡ：配列番号３）を得た。
さらに、ヒトのゲノム配列を解析したところ、同じスプライシングアイソフォームが存在することが予想されたので、ヒト筋由来ｍＲＮＡから下記のプライマー：
５’−ＧＧＡＴＴＡＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号７）
５’−ＧＴＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣ−３’（配列番号８）
を使ってＲＴ−ＰＣＲ法で増幅して、ヒト分泌型ＭｕＳＫ ｃＤＮＡ（配列番号１）をクローニングした。
《実施例２：分泌型ＭｕＳＫタンパク質の発現》
クローニングしたマウス及びヒトの分泌型ＭｕＳＫ遺伝子を発現ベクターpCDNA3.1-myc-hisに挿入して、２９３Ｔ細胞にＦｕｇｅｎｅ６（ロシュ）を使って遺伝子導入した。導入後２日目の培養上清を８％のＳＤＳアクリルアミドゲルに泳動したのち、ＰＶＤＦ膜に転写して、一次抗体に抗ｍｙｃ抗体を使い、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体で標識した二次抗体で検出した（ピアース社）。
ヒト分泌型ＭｕＳＫタンパク質（配列番号２）は６８ｋＤａと６６ｋＤａの位置に、マウス分泌型ＭｕＳＫタンパク質（配列番号４）は５８ｋＤａの位置に検出した。
《実施例３：リアルタイムＰＣＲによるマウスひらめ筋の分泌型及び受容体型ＭｕＳＫ遺伝子の発現量解析》
６か月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスのひらめ筋、同月齢マウスの両側を伸展位でギプス固定して１１日後のひらめ筋、同月齢マウスの座骨神経を切断して１１日後のひらめ筋、２９か月齢の高齢マウスのひらめ筋を、それぞれ採取してｍＲＮＡを抽出精製した。分泌型ＭｕＳＫと受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡの比較定量をＴａｑｍａｎ法（ＡＢＩ社）を使いリアルタイムＰＣＲで行った。
分泌型ＭｕＳＫの特異的配列プライマーは
５’側配列：５’−ＴＧＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＴＡＧＧＴ−３’（配列番号９）
を使用し、
３’側配列：５’−ＣＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＴＡＡ−３’（配列番号１０）
のＴａｑｍａｎプローブを使った（カスタムオーダー、ＡＢＩ社）。
受容体型ＭｕＳＫの細胞外ドメインは４番目と５番目の間のエキソンを挟むＴａｑｍａｎプローブ（Ｍｍ００４４８００６＿ｍ１，ＡＢＩ社）および受容体型細胞内領域の１３番目と１４番目のエキソンを挟むＴａｑｍａｎプライマー（Ｍｍ０１３４６９２６＿ｍ１）を用いた。
結果を図１に示す。分泌型ＭｕＳＫのｍＲＮＡは、正常６か月齢のマウスと比べて、神経切断、ギプス固定拘束（廃用性）、高齢マウスの萎縮筋で発現が増強した。一方、受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡは高齢マウスでは増強しなかった。
《実施例４：ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるマウス血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量の測定》
測定対象マウスとして、８か月齢（コントロール）マウス、２０か月齢、２７か月齢、３２か月齢の各加齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、座骨神経を切断して１１日後の６か月齢マウス（Ａ／ＷｙＳｎＪ）を用意し、各血清試料（１０％血清）を以下の測定に使用した。
マウス由来のリコンビナントＭｕＳＫ細胞外ドメインの分泌タンパク質をマウスに免疫してモノクローナル抗体を作成した。２種類のモノクローナル抗体（ＲＭ−２４、ＭＨ−３０）を使ってＡｌｐｈａＬＩＳＡ法（パーキンエルマー社）によるアッセイ系を確立した。アクセプタービーズにＭＨ−３０（ＩｇＧ２ａκ）を吸着し、ＲＭ−２４（ＩｇＧ２ａκ）をビオチンで標識した。標準抗原用希釈液で標準抗原（リコンビナント マウスＭｕＳＫタンパク質）を１００ｎｇ／ｍＬから公比で１２段階の希釈系列を調製した（１２段階目はブランク）。９６ウェルプレートを使い、１ウェル当たり抗原液（標準抗原または５％血清）５μＬと５０μｇ／ｍＬアクセプタービーズ液１０μＬを室温で２時間反応させた後、１５ｎｍｏｌ／Ｌビオチン化抗体１０μＬを加えてさらに１時間反応させた。その後、８０μｇ／ｍＬストレプトアビジン吸着ドナービーズを２５μＬ加え、３０分後にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社の測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で測定した。
結果を図２に示す。血清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量は、正常８か月齢のマウスと比べて、加齢マウス及び神経切断マウスの血清中で含有量が増加した。
《実施例５：ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるヒト血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量の測定》
測定対象者として、２０１２年９月から２０１３年１０月までに東京都健康長寿医療センター研究所と協力病院の倫理委員会の承認を得て、文書によるインフォームドコンセントを取得した後、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者８名（男性４名、女性４名、３２才〜７８才）と抗アセチルコリン（ＡＣｈＲ）抗体陽性重症筋無力症（ＭＧ）患者３名（男性２名、女性１名、２３〜７９才）から採血を行った。
ヒト由来のリコンビナントＭｕＳＫ細胞外ドメインの分泌タンパク質をマウスに免疫してモノクローナル抗体を作成した。２種類のモノクローナル抗体（ＭＨ−５８、ＭＨ−６４）を使ってＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるアッセイ系を確立した。アクセプタービーズにＭＨ−６４（ＩｇＧ２ａκ）を吸着し，ＭＨ−５８（ＩｇＧ２ａκ）をビオチンで標識した。標準抗原用希釈液で標準抗原（リコンビナント マウスＭｕＳＫタンパク質）を１０ｎｇ／ｍＬから公比で１１段階の希釈系列を調製した（１１段階目はブランク）。９６ウェルプレートを使い、１ウェル当たり抗原液（標準抗原または１００％血清）５μＬと５０μｇ／ｍＬアクセプタービーズ液１０μＬを室温で２時間反応させた後、１５ｎｍｏｌ／Ｌビオチン化抗体１０μＬを加えてさらに１時間反応させた。その後、８０μｇ／ｍＬストレプトアビジン吸着ドナービーズを２５μＬ加え、３０分後にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社の測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で測定した。
結果を図３に示す。神経筋シナプスが消失し、重度の筋萎縮を発症した筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者では、血清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量が著しく低下していた（ほぼ消失していた）。
《実施例６：ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）発症マウス血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量の測定》
測定対象マウスとして、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）と、ＡＬＳ発症モデルマウス（Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１）とを用意し、４週齢、６週齢、８週齢、１０週齢（以上、発症前）、１４週齢（発症初期）、１８週齢（発症末期）、死亡時の各血清試料（５％血清）を、実施例４に記載の手順に従って測定した。結果を図４、図５に示す。
野生型マウスでは、血清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量に変化は認められなかったが、ＡＬＳ発症モデルマウスでは、発症前から血清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量の上昇が認められ、病気の進行に従って、更なる上昇が認められた。なお、前記モデルマウスは発症から死に至る経過が非常に早く、ヒトにおける発症末期（すなわち、重度の筋萎縮を示す状態）を迎える前に死亡することから、実施例５におけるヒトＡＬＳ患者の結果と矛盾するものではないと考える。
《実施例７：ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による重症筋無力症（ＭＧ）発症マウス血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質量の測定》
測定対象マウスとして、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）とＭＧ発症モデルマウス（ＥＡＭＧ）とを用意し、６〜８か月齢の各血清試料（５％血清）を、実施例４に記載の手順に従って測定した。結果を図６に示す。
ＭＧ発症モデルマウスでは、発症に伴い、血清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量の上昇が認められた。
《実施例８：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）発症マウス血清中の遊離ＭｕＳＫタンパク質の検出》
１８〜２４週齢のＡＬＳ発症モデルマウス（Ｇ９３Ａ−ＳＯＤ１）から血清を採取し、その血清７．７ｍＬを用いて硫安分画（８０％飽和）を行い、上清６．５ｍＬを取得した。遠心式フィルターユニット（アミコン（登録商標）ウルトラ、１０ＫＤａフィルター；メルクミリポア）を用いて１．２ｍＬまで濃縮した後、実施例４で作成したマウスモノクローナル抗体（ＲＭ−２４、ＭＨ−３０）を用いて免疫沈降を行った。得られた沈殿（以下、免疫沈降物と称する）をＳＤＳ緩衝液１５μＬに溶解し、その全量（１５μＬ）をウエスタンブロッティング（ウサギ抗マウスＭｕＳＫモノクローナル抗体Ｎｏ．２−６）で分析した。
比較のために、実施例４で使用した、マウス由来のリコンビナントＭｕＳＫ細胞外ドメインの分泌タンパク質（リコンビナント マウスＭｕＳＫタンパク質、１００ｎｇ）を同時にウエスタンブロッティングに使用した。
結果を図７に示す。図７において、レーン１は、マウス由来リコンビナントＭｕＳＫ細胞外ドメインの分泌タンパク質の免疫沈降物（１００ｎｇ）であり、レーン２は、ＡＬＳ発症マウス血清の免疫沈降物であり、レーン３は、マウス由来リコンビナントＭｕＳＫ細胞外ドメインの分泌タンパク質（１００ｎｇ）である。
《実施例９：マウス培養筋芽細胞株の培養上清中に分泌される遊離ＭｕＳＫタンパク質の同定》
マウスの培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を１０ｃｍシャーレ８枚に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭ培地にて３日間前培養した。培地を、分化培地（２．５％ウマ血清（ＨＳ）含有ＤＭＥＭ培地）に置き換え、筋管細胞への分化誘導の開始後１日目、２日目、３日目、５日目に新鮮な培地に置き換えることにより、各培養上清を回収した。
回収した培養上清３００ｍＬを硫安分画（８０％飽和）にかけ、上清３０ｍＬを取得した。得られた上清を抗マウスＭｕＳＫ抗体カラムにかけて精製し、最後に遠心式フィルターユニット（アミコン（登録商標）ウルトラ、１０ＫＤａフィルター；メルクミリポア）を用いて濃縮した。
得られた精製画分のウエスタンブロッティング（ウサギ抗マウスＭｕＳＫモノクローナル抗体Ｎｏ．２−６）の結果を図８に示す。図８において、レーン１は、マウス培養筋芽細胞株の培養上清由来の抗体カラムに通した後の精製画分であり、レーン２は、マウス由来リコンビナントＭｕＳＫ細胞外ドメインの分泌タンパク質（比較用）である。
また、得られた精製画分（及びマウス由来リコンビナントＭｕＳＫ細胞外ドメインの分泌タンパク質（比較用））のＣＢＢ染色の結果を図９に示す。図９に示すように、電気泳動後の８５ｋＤａ〜５０ｋＤａの領域のゲルを５分割して（図９におけるバンド１〜５）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析したところ、図１０に示すように、バンド２〜５において、マウス受容体型ＭｕＳＫタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１）が検出され、遊離のＭｕＳＫタンパク質（受容体型ＭｕＳＫタンパク質がプロテアーゼにより切断されて培養上清中に放出された遊離のＭｕＳＫタンパク質）であることが確認された。
《実施例１０：マウス培養筋芽細胞株の培養上清中に分泌されるＭｕＳＫタンパク質量のＡＤＡＭ阻害剤による減少》
マウスの培養筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２をシャーレに播種し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地にて３日間前培養した後、培地を分化培地（２．５％ＨＳ含有ＤＭＥＭ培地）に置き換え、ＡＤＡＭ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）阻害剤ＧＭ６００１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，＃３６４２０６）を所定量添加した後、更に２２時間培養した。培養後、実施例４に記載の手順に従って、培養上清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量を測定した。
結果を図１１に示す。ＧＭ６００１の添加により、培養上清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質量の減少が確認された。この結果は、培養上清中の遊離のＭｕＳＫタンパク質の少なくとも一部が、プロテアーゼにより切断されて培養上清中に放出された受容体型ＭｕＳＫタンパク質に由来することを示している。
《実施例１１：ＡＤＡＭ阻害剤によるマウス培養筋細胞株におけるアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）凝集の増加》
ＤＭＳＯで溶解したＧＭ６００１を分化培地（２．５％ＨＳ含有ＤＭＥＭ培地）で希釈調製し、２４−ｗｅｌｌプレートで３日間分化させたマウスＣ２Ｃ１２筋管細胞に０．４ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加して培養した。２２時間後に培養上清を回収し、４０ｎＭ Ａｌｅｘａ４８８標識ａｌｐｈａ−ブンガロトキシン含有分化培地で１時間培養してＡＣｈＲ凝集を染色した。
結果を図１２に示す。ＡＣｈＲの凝集は、神経シナプス形成の指標の一つであり、ＡＤＡＭ阻害剤により神経シナプス形成が促進されることが示された。
本発明のバイオマーカーは、加齢または筋萎縮の診断に利用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
配列表の配列番号５〜１０の配列で表される塩基配列は、プライマー配列である。

Claims (9)

  1. 加齢または筋萎縮の状態を把握するために、被験者由来の試料中の遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質、又は非受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを測定する方法。
  2. 遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質が、非受容体型ＭｕＳＫタンパク質、及び／又は、切断型ＭｕＳＫタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 加齢または筋萎縮の状態の把握が、加齢の程度の判定、筋萎縮の早期診断、又は重度の筋萎縮の検出である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質、又は非受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡからなる、加齢または筋萎縮の状態を把握するためのバイオマーカー。
  5. 遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質が、非受容体型ＭｕＳＫタンパク質、及び／又は、切断型ＭｕＳＫタンパク質である、請求項４に記載のバイオマーカー。
  6. 加齢または筋萎縮の状態の把握が、加齢の程度の判定、筋萎縮の早期診断、又は重度の筋萎縮の検出である、請求項４又は５に記載のバイオマーカー。
  7. 加齢または筋萎縮に対する治療または予防効果の有効性を判定するために、治療患者由来の試料中の遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質、又は非受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを測定する方法。
  8. 加齢または筋萎縮モデル動物、又はその細胞株に試験物質を投与する工程、
    前記モデル動物由来の試料中、又は前記細胞株の培養上清中の遊離の状態で存在するＭｕＳＫタンパク質、又は非受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡを測定する工程、
    遊離のＭｕＳＫタンパク質量、又は非受容体型ＭｕＳＫのｍＲＮＡ発現量が低下した試験物質を、加齢または筋萎縮の治療または予防剤の候補物質として選択する工程
    を含む、加齢または筋萎縮の治療または予防剤のスクリーニング方法。
  9. 前記選択工程が、ＡＤＡＭに対する阻害剤を加齢または筋萎縮の治療または予防剤の候補物質として選択する工程である、請求項８に記載のスクリーニング方法。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019141627A1 (en) * 2018-01-17 2019-07-25 University Of Southampton Methods to predict risk of and to stratify sarcopenia and nad deficiency
WO2020184660A1 (ja) * 2019-03-13 2020-09-17 味の素株式会社 サルコペニアの評価方法、算出方法、評価装置、算出装置、評価プログラム、算出プログラム、記録媒体、評価システム、及び端末装置
JP2022551970A (ja) * 2019-10-16 2022-12-14 ブラウン ユニバーシティ 筋再生および筋成長

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6413740B1 (en) * 1995-12-15 2002-07-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tyrosine kinase receptors and ligands
US5814478A (en) * 1995-12-15 1998-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tyrosine kinase receptors and ligands
GB0014878D0 (en) * 2000-06-16 2000-08-09 Isis Innovation Neurotransmission disorders
JP5339246B2 (ja) * 2006-06-07 2013-11-13 国立大学法人 東京医科歯科大学 筋特異的チロシンキナーゼの活性を制御するポリペプチドをコードするｄｎａ
JP2009189268A (ja) * 2008-02-13 2009-08-27 St Marianna Univ School Of Medicine 神経原性筋萎縮症モデルマウスおよび神経原性筋萎縮症の治療薬のスクリーニング方法
KR101604877B1 (ko) * 2008-02-14 2016-03-18 가부시키가이샤 진 테크노 사이언스 항ａｄａｍ－１５항체 및 그의 이용
EP2295068A1 (en) * 2009-09-04 2011-03-16 Neurotune AG Modified agrin-fragment capable of restoring muscle strength for use as a medicament
WO2011036297A2 (de) * 2009-09-27 2011-03-31 Ruhr-Universität-Bochum Verfahren zur therapie und diagnose von morbus alzheimer
JP2011173793A (ja) * 2010-02-23 2011-09-08 Kanazawa Univ アセチルコリン受容体クラスター形成阻害活性を有するアグリンを特異的に認識する抗体並びに該抗体を含むアセチルコリン受容体クラスター形成能促進剤及び該抗体を充填したアセチルコリン受容体クラスター形成能を阻害するアグリン除去カラム
WO2013058229A1 (ja) * 2011-10-17 2013-04-25 花王株式会社 筋量増加剤
JP6153232B2 (ja) * 2012-01-17 2017-06-28 国立大学法人京都大学 筋萎縮性側索硬化症の予防および治療薬とそのスクリーニング方法

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