KR20230081950A - 갑상선 안병증의 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

갑상선 안병증의 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갑상선 안병증의 진단을 위한 단백질 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 갑상선 안병증 또는 저산소증에 의해 유도되는 갑상선 안병증의 중증도와 관련된 바이오마커, 갑상선 안병증 진단용 조성물, 키트, 이를 이용한 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

Description

갑상선 안병증의 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도 {BIOMARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF THYROID OPHTHALMOPATHY AND USES THEREOF}
본 발명은 갑상선 안병증의 진단을 위한 단백질 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 갑상선 안병증의 발병 및 중증도와 관련된 바이오마커, 갑상선 안병증 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
그레이브스병 (Graves' disease)은 잘 알려진 갑상선 자가면역질환이다. 갑상선여포의 내피세포에 존재하는 갑상선자극호르몬 수용체에 결합하는 자가항체가 병인이며, 갑상선의 기능을 활성화시켜 갑상선호르몬의 과다형성, 분비를 유발한다. 그레이브스병 환자의 약 50%에서 눈에 증상이 발생하며, 이를 그레이브스 안병증 (Graves' orbitopathy), 갑상선안병증 (Thyroid associated orbitopathy)이라고 일컫는다. 갑상선안병증의 가장 흔한 증상으로는 윗눈꺼풀뒤당김, 안와주변조직의 부종, 붉어짐과 안구돌출 등이 있다. 이렇게 안병증에 이환된 환자 중에서 약 3-5%에서는 심한 통증과 염증, 복시, 그리고 시력을 위협하는 압박성시신경병증이 유발되며 실명까지 가능하다.
갑상선안병증의 병리기전에 대해서는 명확히 밝혀지지는 않았다. 갑상선자극호르몬 수용체에 대한 자가항체가 갑상선안병증에서도 주요 병인 중 하나로 알려져 있지만 10%의 갑상선안병증 환자에서는 갑상선기능이 정상이어도 갑상선안병증이 진행된다는 보고가 있다. 현재까지 밝혀진 병리기전을 정리해보면 크게 염증, 히알루론산의 축적, 지방화로 나누어 볼 수 있다. 심한 활성기의 갑상선안병증 환자에서는 안와를 구성하는 뼈조직 내에 존재하는 결체/지방조직이 증가한다. 이러한 조직의 확장부에는 면역세포인 T-림프구, B-림프구 및 비만세포의 뚜렷한 침윤뿐만 아니라, 친수성의 글루코스아미노글리칸 (glucosaminoglycans), 특히 히알루론산(hyaluronan)의 축적이 특징적으로 나타난다. 또한 안와 내에는 지방세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 전구 세포들도 정상보다 높은 비율로 포함되어 있는데 이들은 지방분화를 촉진시킴으로써 지방부피가 증가하여 안구가 앞으로 밀려 돌출되면서 미관상 및 시각기능상 문제를 유발하게 된다.
갑상선안병증은 안구가 돌출되기 때문에 갑상선안병증 질환을 가진 환자에게 미관상 좋지 않은 외형을 유발할 수 있다. 또한 만성적 질환으로 한번 외형상 변형이 발생하면 변형된 외관을 치료하기도 쉽지 않다. 따라서 갑상선안병증 질환자의 경우 외모로 인한 자신감 결여 등으로 인해 사회생활에 어려움을 겪기도 한다.
심한 활성기의 안병증에 대한 치료방법으로 고용량의 글루코코티코이드(Glucocorticoids)가 지난 수십 년 동안 사용되어 왔으며, 항염증과 면역억제 효과가 있어 여전히 갑상선안병증의 첫 번째 치료방법으로 적용되고 있다. 그러나, 갑상선안병증의 활성도가 높지 않은 환자에서, 스테로이드 치료의 적응증이 아닐 경우, 현재까지 질병의 진행을 막거나, 호전시킬 수 있는 약물은 아직까지 밝혀진 바 없으며, 또한 스테로이드 치료를 시행하게 될 경우 고용량의 주기적 사용이 필요하게 되어 이로 인한 다양한 전신 부작용이 흔히 발생하는 문제가 있다. 현재, 갑상선 안병증의 식별은 안구 변화의 유무를 통해 의심하여 진단하게 되는데아직까지 갑상선 안병증의 조기 진단이 어렵고 질환의 진행 및 예후를 예측할 수 있는 방법이 개발되지 않은 상태이다. 따라서, 임상적으로 갑상선 안병증을 조기에 진단하고 질환의 진행 여부를 예측할 수 있는 바이오 마커 개발의 필요성이 요구되는 상황이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 갑상선 안병증을 진단할 수 있는 단백질 바이오마커 를 선별 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 갑상선 안병증을 진단과 진행을 예측하기 위한 단백질 바이오마커, 이를 이용하여 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물, 키트, 정보제공방법 및 갑상선 안병증의 중증도 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위한 제1 양태로, 본 발명은 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질 및 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 바이오마커 조성물을 이용한 갑상선 안병증의 진단은 저산소 자극에 의해 발생되는 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자를 통해 갑상선 안병증의 중증도를 판단하는 것이며, 상기 저산소 자극은 안와구조물의 변화 즉, 조직의 확장 및 지방세포화를 통해 발생하는 것으로 생각되며 흡연에 의해 악화될 것으로 예상된다.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 실시간 PCR (RT-PCR) 키트, 마이크로어레이 키트 또는 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트일 수 있다.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 갑상선 안병증으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한 임상적으로 이미 갑상선 안병증이 진단되어 있는 경우 불량한 예후를 예상할 수 있어 적극적인 치료 대상으로 간주할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 (a) 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분 석, 또는 이들의 조합으로 수행하거나(및/또는) 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행할 수 있다.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 갑상선 안병증의 중증도를 평가하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계 및
(c) 상기 측정된 발현 수준을 갑상선 안병증 중증도 점수로 환산하여 갑상성안병증의 중증도를 평가하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, (a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 HIF-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질을 포함하는 바이오마커 조성물은 갑상선 안병증을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 갑상선 안병증의 중증도를 진단하는 것이 가능하고 질환의 진해을 예측할 수 있어, 이에 따라 환자 맞춤별 치료방법을 제공함으로써 감상선 안병증을 조기에 발견하고 진행을 차단하는 적극적인 치료를 수행함으로써 갑상선 안병증에 의한 다양한 증상의 발현을 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1, 2는 갑상선안병증 환자에서 추출 분리된 안와 섬유모세포와 비갑상선안병증 환자의 안와섬유모세표를 저산소 상태와 정상 산소상태에 노출시켰을 때 HIF-1α의 발현 양상을 확인한 이미지이다. 도 1을 참조하면, 비갑상선안병증 환자로부터 유래된 안와섬유모세포에서는 HIF-1α발현이 거의 나타나지 않으며 저산소 상태에서도 단백질 발현의 증가 양상이 관찰되지 않는데 비해 갑상선안병증 환자로부터 유래된 안와섬유모세포에서는 정상 산소상태와 저산소 상태에서 모두 HIF-1α발현을 확인할 수 있으며 특히, 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현이 유의미하게 증가됨을 알 수 있다.
도 3은 정상 산소 및 저산소 상태에서 지방 형성 표현형(Adipogenic Phenotype) 변화를 관찰한 이미지이다. 해당 실험에서는 표현형으로 14일 동안 지방생성 배지에서 배양된 TAO OF는 지방생성 분화를 나타내었다. 도 3에 따르면, 저산소 조건에서 정상 산소 조건보다 더 높은 ORO 염색이 관찰되었다.
도 4는 갑상선 안질환(TAO) 환자(각각 112, 144 및 172 환자의 1차 세포)에서, 산소(O2) 함량에 따른 지방 생성 마커(HIF-1α, PPARγ 및 CEBP)의 발현 양상을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 4는 정상 산소 상태에서 TOA 112(A), 144(C), 172(E), 저산소 상태에서 TA0 112(B), 144(D), 172(F)의 결과이다. 도 4에서 ß-ACTIN은 내부 대조군이며, 데이터 값은 ±SD, n = 4 이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따라 Orbital fibroblast의 단백질 용해물을 사용하여 58개 아디포카인의 상대적 발현 수준을 동시에 검출한 결과이며, orbital fibroblast를 인큐베이터(5% CO2가 있는 37℃) 및 인큐베이터 챔버(1% O2, 5% CO2, 94% N2 및 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한 후 관찰한 것이다. 도 6을 해당 값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 O2 함량에 따른 사이토카인의 변화를 확인한 것으로, 갑상선 안병증(TAO)에서 PAPP-A의 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
상술한 바와 같이, 갑상선 안병증의 식별은 안구 변화의 유무의 측정에 따라 나뉘어지고 있으며, 저산소 자극에 의한 갑상선 안병증을 조기 진단하거나 갑상선 안병증의 중증도를 진단할 수 있는 단백질 바이오마커를 발굴하고 치료 경과 판단에 활용하고자 연구는 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 갑상선 안병증, 특히 저산소 자극에 의한 갑상선 안병증을 진단할 수 있는 단백질 바이오마커를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 바이오마커 조성물은 갑상선 안병증의 조기 진단 또는 중증도를 진단하는 것이 가능하여, 갑상선 안병증의 원인을 보다 세밀하고 정확하게 진단할 수 있고, 이에 따라 환자 맞춤별 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 갑상선 관련 질환(갑상선 안병증)이 나타나는지 확인할 수 있는 단백질 또는 갑상선 안병증 치료 후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다. 이 용어는 바이오 마커 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 제1 양태는 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 갑상선 안병증의 발명 여부 또는 중등도를 모니터링할 수 있는 단백질 바이오마커를 식별하기 위하여, 갑상선 관련 안병증(TAO) 환자의 수술을 통해 안와 섬유아세포 획득하고, 정상인의 안와 섬유아세포에서의 중요 단백질 변화를 관찰하였다. 갑상선 안병증 환자의 안와 섬유아세포 샘플을 수집하여 분석한 결과, 면역체계 활성화로 인해 자극을 받은 안와 섬유모세포의 변화(expanded orbital tissue)는 조직의 저산소 상태를 유발하여 HIF-1α 과발현을 유발하고, 갑상선 안병증을 더욱 악화시키는 악순환이 유도되며 질환의 진행 즉 지방세포분화 및 증식 유발하게 됨을 확인하였다.
본 발명에서, 저산소증 유도인자 (HIF-1(hypoxia-inducible factor-1))는 저산소 관련 반응을 매개하는 이종성 이중의 전사인자로, 산소 농도에 따라 조절되는 α 소단위(HIF-1α 또는 HIF-2α) 및 항상 발현되는 β 소단위(HIF-1β)로 구성되어 있으며, HIF-1α는 저산소 환경에서는 안정화된다. HIF-1α는 내피세포의 마스터 조절인자인 VEGF를 직접적으로 조절함으로써 병리생리학적으로 혈관을 생성시킨다.
본 명세서에서 저산소증 유도인자-1α는 HIF-1α, hypoxia-inducible factor-1α로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 3091의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 본원 발명의 바이오마커 조성물은 HIF-1α 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, PAPP-A는, 임신 연관 혈장 단백-A(Pregnancy-associated plasma protein A)이라 지칭되며, 임신 초기 영양막의 바깥층에서 생산되다가 이후 성장된 태반에서 생성되는 단백질로 알려져 있다. 본 발명의 PAPP-1A는, 인간에서 Gene ID: 5069의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 본원 발명의 바이오마커 조성물은 PAPP-A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면 PAPP-A단백질은 안와의 저산소 미세환경에서 발현이 증가하여, 갑상선 안병증의 진단에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, HIF-1α는 안와의 저산소 미세환경 노출 예측용 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 갑상선안병증 환자 유래 안와섬유모세포에서 HIF-1α 단백질의 발현 및 저산소증에 대한 단백질발현의 뚜렷한 증가(변화)와 지방세포 분화를 통해 저산소 미세환경 노출은 갑상선 안병증의 발병 및 악화와 연관되어 있음을 확인하였다. 본 발명에서 설정한저산소 미세환경은 임상적으로 잘 알려진 갑상선안병증의 위험 요인인 흡연에 발생 가능성이 높고 질환의 발생 중 쉽게 발생하는 제한된 구조(뼈로 둘러싸인 안와 구조) 내에서의 과도한 조직의 팽창과 지방세포화/증식에 의해 쉽게 발생할 수 있다는 점에서 질환의 발생 및 악화에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명에서는 HIF-1α 단백질 바이오마커 및 지방세포분화와 관련된 단백질과 아디포카인의 발현량을 측정하여, 저산소 미세환경 노출에 따른 갑상선 안병증의 발병 여부 또는 갑상선 안병증의 중증도(심각도)와 예휴를 예측하는데 도움이 되는 결과를 보일 수 있었다.
본 발명의 제2 양태는 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 압타머인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 단백질의 단편은 면역원성 단편일 수 있다. 상기 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단편일 수 있다.
상기 "단백질의 발현 수준 측정"은 대상체의 시료에서 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 존재 여부와 발현정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있다. 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 확인 가능한 것일 수 있다.
일 양태로서 단백질의 발현 수준 측정은 상기 단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 압타머를 이용하여 단백질을 확인할 수 있다.
단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 다른 양태의 분석방법으로는 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 질량 분석법(Mass Spectrometry), 유세포 분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 일 양상에 따른 항체의 형태는 특별히 한정되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있으며, 나아가, 인간화 항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다. 일 양상에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.
상기 "유전자의 발현 수준"은 해당 유전자의 mRNA의 발현 수준 또는 해당 유전자에 의해 코딩 되는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 확인 가능한 것일 수 있다. 일 양태로서, 발현 수준에 차이가 나는 유전자는 마커로 활용될 수 있으며, 구체적으로, 해당 유전자의 발현 수준에 따라 갑상선 안병증의 유무 및/또는 갑상선 안병증의 중증도(심각도) 등이 판단되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미할 수 있다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RTPCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: Rnase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질을 암호화하는 mRNA 발현양을 측정하는 제제는 일 양태에 따르면 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드이며, 상기 유전자의 핵산 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 mRAN에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기 쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 유전자의 mRNA의 센스 및 안티센스 프라 이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"란 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다.
본 발명에서 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등과 같은 하전되지 않은 연결체 또는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등과 같은 하전된 연결체로의 변형이 있다.
본 발명의 제3 양태는 본 발명에 따른 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물을 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)과 같은 실시간 PCR (RT-PCR) 키트, 마이크로어레이 키트 또는 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, miRNA 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 DNA, RNA 또는 miRNA에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에는 체액, 세포 또는 조직으로부터 단백질 또는 핵산(예를 들면, total RNA)을 추출하기 위한 키트, 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 단백질 또는 핵산이, 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 갑상선 안병증마커 측정을 위한 디바이스이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱이다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등이다.
본 발명의 키트는 상기 단백질의 적어도 1개와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함할 수 있다.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질 단편 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질 단편 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 용어 "개체"는 갑상선 안병증이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치 류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 갑상선 안병증에 특이적인 단백질을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있다.
본 발명의 정보제공방법은 공지된 다양한 시험방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 혼성화법, 면역분석(immunoassay) 방법 또는 유전자 증폭방법을 이용하여 실시할 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 바이오 마커 HIF-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질의 존재를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 전기영동, 질량 분석법, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RTPCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 정상 대조구란 갑상선 안병증 진단을 받지 않은 정상인이며, 이들 로부터 채취한 시료와 갑상선 안병증의 존재 또는 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 단백질 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 갑상선 안병증의 발병여부 또는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명의 제1 양태와 관련된 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 갑상선 안병증으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료에서의 발현 수준보다 200% 이상일 경우 갑상선안병증 진단에 도움이 될 것으로 생각되며 300% 이상(바람직하게는 300% 내지 400%) 상향조절 되어 있는 경우, 중증의 갑상선 안병증으로 진행 위험성이 높다고 판단할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 HIF-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질 바이오마커의 발현양 변화를 확인하고 이를 임상활동점수(clinical activity score, CAS)로 환산하여 갑상선 안병증의 여부 및/또는 감상선 안병증의 중증도를 평가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 분석하고자 하는 대상체의 샘플에서 바이오마커를 질량 분석법에 의해 정량하고 임상활동점수(clinical activity score, CAS) 기준에 따라 갑상선 안병증의 여부 및/또는 갑상선 안병증의 중증도를 평가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나, 본 발명의 기술적 특징은 HIF-1α 단백질 바이오마커가 CAS 지표와 유의한 상관관계가 있음을 최초로 규명한 것인바, 본 발명은 상기 바이오마커에 대한 항체 반응 등 종래 알려진 단백질 발현를 측정하는 다양한 기술을 통하여 단백질을 정량화하고 그에 상응하는 CAS 점수 기준표를 작성하여 상기 바이오마커를 이용한 다양한 방식으로 CAS 지표를 평가할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
환자의 선발 및 시료의 준비
안와 섬유아세포는 가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원 안과에서 얻었다. 안병증 섬유아세포는 환자의 감압 수술에서 획득되었다. 비 안병증 섬유아세포는 눈꺼풀 안검 성형술을 통해 얻었으며 면역, 염증, 갑상선 질환의 병력이 없었다. 섬유아세포의 1차 배양은 10% 소태아혈청(FBS, GIBCO BRL), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Bio Whittaker Inc., Walkersville, MD)이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle 배지(GIBCO BRL, Grand Island, NY)에서 배양하였다. 세포는 인큐베이터에서 5% CO2로 37℃에서 배양되었다. 저산소 세포(2% O2)를 인큐베이터 챔버(Baker ruskinn, Brigend, UK)에서 48시간 동안 37℃로 배양하였다. 섬유아세포는 초기 배양에서 계대번호 10을 넘어서 사용하지 않았다. 모든 실험은 서울성모병원 규정에 따라 진행되었다.
Oil Red O Staining 실험
안와 섬유아세포를 6 well 플레이트에 5 x 103 세포/well로 배양하였다. Isobutylmethylxanthine (IBMX, 0·1 mM, 시그마) 및 dexamethasone (1 μM, 시그마)이 첨가된 무혈청 DMEM/Ham's F-12 배지 (thermo fisher science)로 구성된 지방 생성 배지에서 4일 동안 배양되었다. 4일 후 배지를 제거 후, pantothenic acid (17 μM, sigma), biotin (33 μM, sigma), tri-iodothyronine (T3)(0·2 nM, sigma), carbaprostacyclin (0·2 μM, 산타크루즈), 트랜스페린(10 μg/ml)이 첨가된 무혈청 DMEM/Ham's F-12 배지로 교체하였다. 14일 후, 배지를 웰에서 제거하고 PBS에서 3회 세척하였다. 각 웰을 10분 동안 10% 포름알데히드로 고정하였다. 그런 다음 섬유아세포를 증류수로 세척한 후에 각 웰을 증류수와 이소프로판올에 녹인 0.3% Oil Red O 용액으로 20분간 염색하고 60% 이소프로판올과 증류수로 세척하였다. 그 후, 각 웰을 클린 벤치에서 밤새 건조시켰다. 마지막으로 400X 배율에서 현미경(Nikon TS-100F)을 사용하여 시각화하였다.
도 3는 실시예 2에 따른 결과를 확인한 이미지이다. 도 3에 따르면, 저산소 조건에서 정상 산소 조건보다 더 높은 ORO 염색이 관찰되었다.
Western blot
안와 섬유아세포를 PBS로 3회 세척하고 프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 RIPA 용해 완충액에서 용해시켜 사용하였다. BSA 표준을 사용하는 BCA 방법, 샘플에 50ug 단백질이 포함된 샘플을 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 전기영동하고 멤브레인(Millipore, Bedford, MA)으로 옮겼습니다. 멤브레인은 0.2% Tween 20(Bio-Rad) 및 1차 항체가 포함된 PBS 중 5% 탈지유 및 5% 소 혈청 알부민으로 밤새 블러킹하였다. 그런 다음 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 이차 항체와 함께 인큐베이션했다. 그리고 SuperSignalTM West Pico PLUS 화학발광 기질(Thermo ScientificTM)을 사용한 처리 후 단백질 검출 확인은 ChemiDoc MP(Bio-Rad)로 수행되었다. 도 1을 참조하면, 비갑상선안병증 환자로부터 유래된 안와섬유모세포에서는 HIF-1α발현이 거의 나타나지 않으며 저산소 상태에서도 단백질 발현의 증가 양상이 관찰되지 않았지만, 갑상선안병증 환자로부터 유래된 안와섬유모세포에서는 정상 산소상태와 저산소 상태에서 모두 HIF-1α발현을 확인할 수 있다.
Proteome Profiler adipokine array 분석
Proteome Profiler Human Adipokine Array Kits는 안와 섬유아세포에서 58개의 adipokine의 상대적인 발현 수준을 동시에 검출하는 데 사용되었다. 안와 섬유아세포는 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 및 인큐베이터 챔버(1% O2, 5% CO2, 94% N2 및 37℃)에서 48시간 동안 배양되었다. 세포 배양 상층액을 Detection Antibody Cocktail과 함께 rocking platform 쉐이커에서 4℃로 밤새 배양시켰다. 그리고 각각의 이미지를 ChemiDoc MP(Bio-Rad)으로 캡처하였다. 밴드 분석은 ImageJ 소프트웨어에 사용하였다.
도 5 및 6은 본 실시예에 따른 Proteome Profiler adipokine array 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5 및 6을 참조하면 저산소증(Hypoxia) 상태에서 아디포카인(adipokine)들의 발현이 변화하는 것을 확인할 수 있으며, 이에 따라 저산소 상태에서 안와 섬유아세포 내 아디포카인의 발현은 변화함을 알 수 있다. 변화한 몇몇의 아디포카인 중에 PAPP-A의 변화가 확연히 나타났다.
효소 면역 분석법
Papp-α는 이중 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)으로 측정하였다. Orbital fibroblasts 세포 상층액은 인큐베이터에서 48시간 동안 5% CO2, 37℃로 배양하였고, 저산소 세포(1% O2, 5% CO2, 94% N2, 및 37℃)는 37℃의 인큐베이터 챔버에서 48 시간 배양하였다. 세포 상층액에서 Papp-α의 레벨을 사용 가능한 ELISA 키트(BD biosciences)로 정량화되었다. 상층액과 스탠다드는 이중으로 반복 실험하였다. 상층액은 96 well 플레이트에 코팅된 항체와 함께 배양하였다. 세척 후, 검출을 위해 2차 항체를 첨가하였다. 20분에 접합된 poly-horseradish peroxidase (HRP) 및 substrate (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 붙여주었다. 그후 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서의 흡광도 판독을 하였다.
실시예 5에 따른 결과는 도 7에 나타내었으며, 도 7을 참조하면 갑상선 안병증 환자의 저산소 상태에서 PAPP-A의 발현이 206 내지 252% 증가하는 것을 알 수 있다.
저산소 상태는 갑상선 안병증의 발생 및 진행에 중추적인 역할을 할 수 있다. 상기 서술된 내용 및 실시예를 참고로 하면, 갑상선 안병증 질환자의 저산소증 상태에서는 HIF-1α의 발현이 증가하여 지방세포 분화가 유도되고 아디포카인의 발현이 증가하는 것이 관찰되었고 따라서, HIF-1α의 발현 정도에 따라 갑상선 안병증의 발병 여부 및 중증도를 판단할 수 있음을 알 수 있다. 이는 임상적으로 흡연이 체내 저산소 상태를 유발하고, 갑상선의 안병증을 악화시킬 수 있는 잘 알려진 위험인자인 점을 고려하였을 때, 본원 발명은 흡연에 의해 유도된 저산소 상태 및 이에 따른 갑상선 안병증의 중증도를 HIF-1α의 발현 정도에 따라 진단하는데 도움이 될 것으로 기대할 수 있다. 특히 아디포카인 중 PAPP-a는 갑상선 안병증과 관련된 기존 연구에서 제시된 바가 없어 저산소증에 대한 PAPP의 변화를 갑상선 안병증의 새로운 마커로써 사용하는 것이 가능할 것으로 예상된다.

Claims (12)

  1. 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질 및 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 바이오마커 조성물.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 진단은 저산소 자극에 의한 갑상선 안병증의 중증도를 판단하는 것인, 바이오마커 조성물.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 저산소 자극은 흡연에 의한 것인, 바이오마커 조성물.
  4. 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질 또는 PAPP-A단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 각각의 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물을 포함하는 것인, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물.
  6. 제4 항 또는 제5 항의 조성물을 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 키트.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 키트는 실시간 PCR (RT-PCR) 키트, 마이크로어레이 키트 또는 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트인, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 키트.
  8. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 또는 이들의 조합인, 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법.
  10. 제8 항에 있어서,
    (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조구 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 갑상선 안병증으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법.
  11. 제8 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분 석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는
    상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법.
  12. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 측정된 발현 수준을 갑상선 안병증 중증도 점수로 환산하여 갑상성안병증의 중증도를 평가하는 단계를 포함하는, 갑상선 안병증의 중증도를 평가하기 위한 정보 제공 방법.
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