KR20190074567A - 그레이브스병과 그레이브스 안구병증 식별용 지질 마커 - Google Patents

그레이브스병과 그레이브스 안구병증 식별용 지질 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO) 식별용 지질 마커 및 상기 지질 마커를 이용하여 그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 선별된 지질 마커를 생체시료에서 빠른 시간 안에 선택적으로 검출하여, 그레이브스 안구병증(GO) 질환자의 안구에 외적인 변화가 나타나기 전에 그레이브스병(GD)병과 그레이브스 안구병증(GO) 질환을 보다 빨리 식별할 수 있다.

Description

그레이브스병과 그레이브스 안구병증 식별용 지질 마커{Lipid marker for identifying Graves’ disease and Graves’ disease with ophthalmopathy}
본 발명은 그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO) 식별용 지질 마커 및 상기 지질 마커를 이용하여 그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
갑상선 항진증인 그레이브스 병(Graves’ disease, GD)은 자가면역질환(autoimmune)으로 갑상샘 자극면역글로불린이 갑상선 수용체(receptor)를 활성화시켜 갑상선 호르몬이 과다 분비되는 질환이다. 약 50%의 GD 질환자들의 경우 안와지방과 결합조직이 증가하여 안구가 돌출되는 그레이브스 안구병증(Graves’ disease with ophthalmopathy, Graves ophthalmopathy, GO)으로 분류된다.
그레이브스 병(GD)의 진단은 갑상선호르몬 분비기능을 촉진하는 역할에 관여하는 혈액 내 갑상샘 자극호르몬(thyroid-stimulating hormones)의 농도를 측정하여 정상치보다 낮고, 갑상선 호르몬인 T3(트리요오드티로닌, triiodothyronine)와 T4(티록신, tryroxine)가 정상치보다 높은 것을 확인하여 이루어진다.
안구 변화 증상까지 나타나는 그레이브스 안구병증(GO)의 경우도 호르몬 농도는 GD와 다르지 않기 때문에, 그레이브스 병(GD)과 같은 방법으로 진단이 이루어진다.
현재, 그레이브스 병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO)의 식별은 안구 변화의 유무의 측정에 따라 나뉘어지므로, 그레이브스 안구병증(GO)의 조기 진단이 어렵다는 문제를 가진다.
따라서, 그레이브스 병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 새로운 방법을 필요로 한다.
1. 원저 : 갑상선질환 및 비갑상선질환에서 TSH 측정의 진단적 의의, Korean Journal of Medicine(구 대한내과학회지), 40권 3호, pp. 358-364, 1991
본 발명은 그레이브스 병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO)의 식별을 위한 지질 마커를 확립하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서는 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 식별용 마커를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 대상체로부터 분리된 생물학적 시료에서 지질 성분의 농도를 측정하는 단계; 및
상기 측정된 지질 성분의 농도 및 정상군으로부터 분리된 지질 성분의 농도를 비교하여 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 여부를 판단하는 단계를 포함하며,
상기 지질 성분은 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)의 식별 방법을 제공한다.
본 발명에서는 초고성능 액체크로마토그래피-전기분무이온화-질량분석법(nLC-ESI-MS/MS)을 사용하여, 검출한계가 펨토몰(fmol/㎕) 수준으로 미량으로 존재하거나 질량분석기의 검출세기가 낮은 각종 지질종의 검출 및 구조분석이 가능하다. 특히, 상기 분석 방법은 혈장과 뇨 시료에서 각각 단지 100 ㎕와 1 mL의 적은 양으로도 지질의 분석이 가능하다는 장점을 가진다.
또한, 본 발명에서는 선별된 지질 마커를 생체시료에서 빠른 시간 안에 선택적으로 검출하여, 그레이브스 안구병증(GO) 질환자의 안구에 외적인 변화가 나타나기 전에 그레이브스병(GD)병과 그레이브스 안구병증(GO) 질환을 보다 빨리 식별할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 기술은 마커만 선택적으로 간단하게 검출하여 진단하는 미래형 진단법으로 발전할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 폴츠 변형 추출법(Folch modified with MTBE/CH3OH 추출법)을 사용하여 지질을 확보하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 초고성능 액체크로마토그래피-전기분무이온화-질량분석기(nLC-ESI-MS/MS) 시스템을 나타내는 모식도이다.
도 3은 각종 이온화 매개체별 이온화 효율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 S1P를 a) 양이온 모드와 b) 음이온 모드에서 분석한 S1P의 CID 스펙트라 그래프이다.
도 5는 a) 혈장과 b) 뇨 시료에서 통계적으로 의미있게 변한 지질들의 PCA를 나타내는 그래프이다.
도 6은 a) 혈장 시료와 b) 뇨 시료에서 선별된 GD와 GO 식별용 지질 마커의 변화(정상군 대조)를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 언급되는 지질은 하기 표 1과 같다.
지질명 지질명
리소포스파티딜콜린
(lysophosphatidylcholine)		 LPC 스핑고신-1-포스페이트
(sphingosine-1-phosphate)		 S1P
포스파티딜콜린
(phosphatidylcholine)		 PC 리소스핑고마이엘린
(Lysosphingomyelin)		 LSM
리소포스파티딜에탄올아민
(lysophosphatidylethanolamine)		 LPE 스핑고마이엘린
(Sphingomyelin)		 SM
(포스파티딜에탄올아민)
phosphatidylethanolamine		 PE 세라마이드
(Ceramide)		 Cer
PE 플라스마로겐
(PE plasmalogan)		 Pep 모노헥소실세라마이드
(Monohexosylceramide)		 MHC
리소포스파티딜글리세롤
(lysophosphatidylglycerol)		 LPG 디헥소실세라마이드
(Dihexosylceramide)		 DHC
포스파티딜글리세롤
(phosphatidylglycerol)		 PG 트리헥소실세라마이드
(Trihexosylceramide)		 THC
리소포스파티딜이노시톨
(lysophosphatidylinositol)		 LPI 디아실글리세롤
(diacylglycerol)		 DG
포스파티딜이노시톨
(phosphatidylinositol)		 PI 트리아실글리세롤
(triacylglycerol)		 TG
포스파티딘 산
(phosphatidic acid)		 PA
본 발명에서 사용되는 지질명과 함께 기재되는 숫자는 상기 지질 중의 탄소의 개수 및 다중결합의 개수를 나타낸다. 예를 들어, "16:1-LPC"는 16개의 탄소와 1개의 다중결합을 가지는 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)을 가리킨다. 이하, 달리 정의하지 않는 한, 본 발명 중의 다른 지질에서도 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명에서 "그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO) 식별"이란 그레이브스병(GD) 환자와 그레이브스 안구병증(GO) 환자를 구분하는 것뿐만 아니라, 정상인과 그레이브스병(GD) 환자 및 그레이브스 안구병증(GO) 환자를 구분하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 정상인과 그레이브스 안구병증(GO) 환자를 구분하는 것을 포함할 수 있다.
이때, 정상인 또는 정상군은 임상적으로 갑상선 기능 항진증을 시사하는 증상 및 징후, 및 갑상선 안구병증의 증상 및 징후가 없으며, 혈액 검사에서 갑상선 이상이 없는 사람을 의미한다.
본 발명은 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 식별용 마커에 관한 것이다.
본 발명에서는 리소포스파티딜콜린(LPC)은 16:1-LPC 및 18:1-LPC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 트리아실글리세롤(TG)은 44:2-TG, 54:7-TG, 60:13-TG, 46:2-TG, 48:1-TG, 50:1-TG, 50:2-TG 및 52:0-TG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명자들은 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)의 식별을 위한 마커를 찾기 위해 환자들의 생체시료, 즉 혈액(혈장) 또는 뇨로부터 샘플을 채취하여 지질을 추출하고, 초고성능 액체크로마토그래피-전기분무이온화-질량분석기(nLC-ESI-MS/MS)을 이용하여 그레이브스병(GD) 환자들과 그레이브스 안구병증(GO) 환자들의 지질 프로파일 차이를 비교 분석하고, 이 차이를 이용하여 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)를 식별하고 나이가 그레이브스 안구병증(GO) 환자들을 진단할 수 있는 마커 발굴 연구를 수행하였다.
이를 위해 총 281종의 지질을 동정하였다. nLC-ESI-MS/MS 분석시 얻어지는 CID 질량분석 스펙트럼으로부터 분자구조를 식별한 뒤, 정상군, GD 질환자 및 GO 질환자의 혈장 시료에서 각 분자들에 대한 개별 정량을 진행한 결과 44:2-TG가 정상군과 대조시 GD 질환자에서 2.06 배로 증가하는 반면 GO 질환자 혈장에서는 2.99배로 증가하여 두 그룹간의 차이는 1.45배로 통계적으로 의미 있게 변화하는 것을 발견하였다. 54:7-TG는 정상군과 대조시 GD군 혈장에서는 1.85배 증가하는 반면 GO군에서는 2.63배로 증가하여 두 질환군의 차이(1.42배)가 뚜렷히 나타났으며, 60:13-TG에서도 두 질환군의 차이는 1.43배의 증감의 차이가 나타났다.
또한, 정상군, GD 질환자와 GO 질환자의 뇨 시료에서 총 191종의 지질을 nLC-ESI-MS/MS를 이용하여 SRM 방식으로 개별 정량하였다. 결과, 정상군과 비교시 16:1-LPC가 GD군에서는 3.65배, GO군에서는 6.12배로 증가하여 GD군과 GO군의 뚜렷한 차이(1.68배)가 나타났으며, 18:1-LPC의 경우도 GD군과 GO군에서 각각 7.30배 및 9.99배 증가하여 두 그룹간의 뚜렷한 차이(1.37배)가 나타났다. 또한, 두 그룹간 46:2-TG는 0.70배, 48:1-TG는 0.66배, 50:1-TG는 0.63배, 50:2-TG는 0.68배 및 52:0-TG는 0.70배의 통계적으로 의미있는 차이가 발견되었다.
한편, d18:1-S1P은 혈장 시료에서 정상군 대비 GD 군에서 1.30배, GO 군에서 1.98배 증가하여, 두 그룹간은 1.53배의 차이가 있었고, 뇨 시료에서도 GD군에서는 1.24배, GO군에서는 1.88배 증가하여 두 그룹간은 1.52배의 차이가 있는 것으로 나타났다.
상기 결과들을 토대로, 혈장 시료 및 뇨 시료에서 GD와 GO를 식별할 수 있는 지질을 마커로 선별하었다.
상기 마커들은 갑상선 항진증인 그레이브스병(GD)의 마커이면서, 특히 GD 질환자의 약 50%에서 나타나는 안와지방과 결합조직이 증가하여 안구가 돌출되는 그레이브스 안구병증(GO)에 특이성을 나타낸다. 즉, 상기 마커를 통해 그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO) 질환의 식별이 가능하다.
따라서, 본 발명에서는 전술한 마커를 사용하여, 생체시료에서 빠른 시간 안에 선택적으로 검출함으로써 그레이브스 안구병증(GO) 질환자의 안구에 외적인 변화가 나타나기 전에 그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO) 질환을 보다 빨리 식별할 수 있으며, GO의 조기 진단이 가능하다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭 스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
또한, 본 발명은 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)의 식별 방법에 관한 것이다.
상기 식별 방법은 대상체로부터 분리된 생물학적 시료에서 지질 성분의 농도를 측정하는 단계; 및
상기 측정된 지질 성분의 농도 및 정상군으로부터 분리된 지질 성분의 농도를 비교하여 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 여부를 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
이때, 지질 성분은 전술한 마커일 수 있다. 또한, 대상군 또는 대상체는 환자군 또는 예비 환자군으로서 GO 또는 GD와 관련된 증상, 구체적으로 임상적으로 갑상선 기능 항진증을 시사하는 증상 및 징후(갑상선종, 신경과민, 열 과민증, 체중감소, 심부정맥 등), 및 갑상선 안구병증의 증상 및 징후(안구 돌출, 복시, 안와주위 부종, 눈꺼풀 뒤 당김 등)를 가지는 군을 의미한다. 또한, 정상군은 전술한 임상적으로 갑상선 기능 항진증을 시사하는 증상 및 징후, 및 갑상선 안구병증의 증상 및 징후가 없으며, 혈액 검사에서 갑상선 이상이 없는 군을 의미한다.
일 구체예에서 생물학적 시료로는 조직, 혈액 또는 뇨를 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 혈액 또는 뇨를 사용할 수 있다. 혈액은 혈장을 사용할 수 있다.
본 발명에서 지질 성분은 종래 당업계에서 사용되는 방법을 통해 대상체로부터 얻을 수 있다.
지질 추출방법을 통해 완전한 지질을 확보하는 과정은 데이터에 대한 신뢰성을 확보하기 위해 반드시 필요하다. 다양한 지질 종류별로 효율적인 지질 추출방법을 적용하지 못한다면, 목표하는 지질을 추출하지 못할 뿐만 아니라 지질 외에 각종 단백질, 무기질, 이온 등의 매트릭스(matrix)가 지질이 이온화 하는 데 방해요인이 될 우려가 있다. 따라서, 지질 분석의 감도와 선택성을 떨어뜨리게 된다. 그러므로 여러 가지 지질 추출방법 중에서 분석하려는 지질의 종류나 실험의 목적에 따라서 적합한 방법을 선택해야 한다.
일반적인 지질 추출법으로 가장 널리 사용되는 폴츠법(Folch method)은 클로로포름(chloroform)을 이용하는 방법으로서, 독성이 강하며 수용액과 섞었을 때 하층액을 차지하므로, 층 경계에 있는 지질 외의 물질을 회수하지 않고 회수하는 것이 힘들다는 단점을 가진다.
따라서, 본 발명에서는 폴츠법을 변형하여 클로로포름 대신 상기 클로로포름 보다 독성이 약한 메틸 삼차 부틸 에테르(methyl tert-butyl ether, MTBE)를 사용하여 지질을 추출할 수 있다. 본 발명에서는 상기 방법을 폴츠 변형 추출법(Folch modified with MTBE/CH3OH 추출법)이라 할 수 있다. 폴츠 변형 추출법은 MTBE와 메탄올을 혼합한 용매를 사용하며, 수용액 층과 유기용매 층이 분리될 때 MTBE의 상대적으로 낮은 밀도로 인하여 유기용매 층이 위층에 있게 된다는 장점이 있다. 또한 폴츠 변형 추출법은 상대적으로 극성이 강한 라이소지질 및 S1P부터 비극성이 강한 TG까지 높은 회수율로 지질 성분들을 추출할 수 있다.
본 발명에서는 추출된 지질 성분의 농도를 크로마토그래피/질량분석기를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명에서 크로마토그래피는 당업계에서 통상적으로 사용되는 정량용 액체크로마토그래피를 사용할 수 있으며, 구체적으로 모세관 액체크로마토그래피(capillary LC), 초고성능 액체크로마토그래피(UPLC) 또는 초고성능 액체크로마토그래피(nUPLC 또는 nLC) 등을 사용할 수 있다. 또한, 질량분석기는 당업계에서 통상적으로 사용되는 전기분무이온화(ESI) 방식의 질량분석기 중에서 탠덤질량분석을 수행할 수 있는 질량분석기를 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 질량분석기로 이온트랩 질량분석기(ion trap MS), 삼중 사중극자 질량분석기(triple quadrupole MS), Q-TOF 또는 오비트랩 MS 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 초고성능 액체크로마토그래피-전기분무이온화-질량분석기(nLC-ESI-MS/MS)를 이용하여 지질을 측정할 수 있다.
상기 초고성능 액체크로마토그래피-전기분무이온화-질량분석기를 이용하여 약 30분 이내에 생체시료 내 지질을 분석하고 비교하여 GD 및 GO의 두 질환을 식별할 수 있다.
본 발명에서는 측정된 지질 성분의 농도를 정상군으로부터 분리된 지질 성분의 농도와 비교하여 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 여부를 식별하거나, 그레이브스 안구병증(GO)을 진단할 수 있다.
본 발명에서는 상기 GD 및 GO의 두 질환의 식별을 위한 지질 성분, 즉 마커로 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 이때, 리소포스파티딜콜린(LPC)은 16:1-LPC 및 18:1-LPC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이고, 트리아실글리세롤(TG)은 44:2-TG, 54:7-TG, 60:13-TG, 46:2-TG, 48:1-TG, 50:1-TG, 50:2-TG 및 52:0-TG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 생물학적 시료가 혈액, 구체적으로 혈장일 경우, 지질 성분은 트리아실글리세롤(TG)일 수 있다. 이때, 트리아실글리세롤(TG)은 44:2-TG, 54:7-TG 및 60:13-TG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 혈액 시료에서, 하기 조건 중 두 개 이상의 조건을 만족하면 그레이브스병(GD)으로 판단할 수 있다. 이때의 그레이브스병(GD)은 그레이브스 안구병증(GO)을 포함한다.
(1) 44:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 1.5 배 이상
(2) 54:7-TG의 농도가 정상군의 농도보다 1.5 배 이상
(3) 60:13-TG의 농도가 정상군의 농도보다 1.5 배 이상
또한, 혈액 시료에서 하기 조건 중 두 개 이상의 조건을 만족하면 그레이브스병(GD)과 구분되는 그레이브스 안구병증(GO)으로 판단할 수 있다.
(1) 44:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 2.5 배 이상
(2) 54:7-TG의 농도가 정상군의 농도보다 2.2 배 이상
(3) 60:13-TG의 농도가 정상군의 농도보다 2.5 배 이상
즉, 혈액 시료에서 44:2-TG, 54:7-TG 및 60:13-TG는 정상군과 비교하여 1.5배 이상의 상이한 농도 차이를 가지므로, 정산인과 그레이브스병(GD) 환자를 구분하기 위한 마커로서 사용된다. 더욱이, 상기 마커들은 그레이브스병(GD)일 경우와 그레이브스 안구병증(GO)일 경우 30% 이상의 농도 차이를 가지고 또한 동일한 농도의 증가/감소 경향을 가지므로, 그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO) 환자의 구분을 위한 마커의 역할을 수행한다. 이에 따라, 상기 마커를 통해 정상인과 그레이브스병(GD) 환자 및 그레이브스 안구병증(GO) 환자의 구분이 가능하며, 나아가 대상체로부터 그레이브스 안구병증(GO)을 판단할 수 있다.
한편, 일 구체예에서, 생물학적 시료가 뇨일 경우, 지질 성분은 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 이때, 리소포스파티딜콜린(LPC)은 16:1-LPC 및 18:1-LPC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이고, 트리아실글리세롤(TG)은 46:2-TG, 48:1-TG, 50:1-TG, 50:2-TG 및 52:0-TG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 뇨 시료에서, 하기 조건 중 두 개 이상의 조건을 만족하면 그레이브스병(GD)으로 판단할 수 있다. 이때의 그레이브스병(GD)은 그레이브스 안구병증(GO)을 포함한다.
(1) 16:1-LPC의 농도가 정상군의 농도보다 1.5 배 이상
(2) 18:1-LPC의 농도가 정상군의 농도보다 1.5 배 이상
(3) 46:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.67 배 이하
(4) 48:1-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.67 배 이하
(5) 50:1-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.67 배 이하
(6) 50:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.67 배 이하
(7) 52:0-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.67 배 이하
또한, 뇨 시료에서, 하기 조건 중 두 개 이상의 조건을 만족하면 그레이브스 안구병증(GO)으로 판단할 수 있다.
(1) 16:1-LPC의 농도가 정상군의 농도보다 4.5 배 이상
(2) 18:1-LPC의 농도가 정상군의 농도보다 5.8 배 이상
(3) 46:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.55 배 이하
(4) 48:1-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.55 배 이하
(5) 50:1-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.45 배 이하
(6) 50:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.45 배 이하
(7) 52:0-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.55 배 이하
즉, 뇨에서 16:1-LPC, 18:1-LPC, 46:2-TG, 48:1-TG, 50:1-TG, 50:2-TG 및 52:0-TG는 정상군과 비교하여 1.5 배 이상 또는 0.67 배 이하의 상이한 농도차이를 가지므로, 정산인과 그레이브스병(GD) 환자를 구분하기 위한 마커로서 사용된다. 더욱이, 상기 마커들은 그레이브스병(GD)일 경우와 그레이브스 안구병증(GO)일 경우 30% 이상의 농도 차이를 가지고 또한 동일한 농도의 증가/감소 경향을 가지므로, 그레이브스병(GD)과 그레이브스 안구병증(GO) 환자의 구분을 위한 마커의 역할을 수행한다. 이에 따라, 상기 마커를 통해 정상인과 그레이브스병(GD) 환자 및 그레이브스 안구병증(GO) 환자의 구분이 가능하며, 나아가 대상군으로부터 그레이브스 안구병증(GO)을 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 마커에 대한 정량장치를 포함하는 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 식별용 진단 키트에 관한 것이다.
상기 정량장치는 초고성능 액체크로마토그래피-전기분무이온화-질량분석기(nLC-ESI-MS/MS)일 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 지질 확보
본 발명에서는 클로로포름 보다 독성이 덜한 메틸 삼차 부틸 에테르 (methyl tert-butyl ether, MTBE)를 사용하는 폴츠 변형 추출법(Folch modified with MTBE/CH3OH 추출법)을 이용하였다.
상기 추출법은 MTBE와 메탄올을 혼합한 용매를 사용하며 수용액 층과 유기용매 층이 분리될 때 MTBE의 상대적으로 낮은 밀도 때문에 유기용매 층이 위층에 있게 된다는 장점이 있다. 또한, 상기 추출법은 상대적으로 극성이 강한 라이소지질 및 S1P부터 비극성이 강한 TG까지 높은 회수율로 추출할 수 있다.
상기 추출에 사용되는 MTBE, CH3OH 및 H2O는 HPLC-grade로 Avantor™ Performance Materials (Center Valley, PA)에서 구입하였다.
폴츠 변형 추출법을 이용한 지질은 추출은 도 1의 모식도의 방법으로 추출하였다.
구체적으로, 혈장 시료의 경우 100 ㎕에서, 뇨 시료의 경우는 1 ml에서 지질을 추출하였다. 먼저 300 ㎕의 CH3OH를 첨가한 후 짧게 섞어준 후 아이스 배스(ice bath)에 시료를 10 분 동안 넣어두었다. 그 후, 1000 ㎕의 MTBE를 첨가한 후 1 시간동안 볼텍싱(vortexing)하고 250 ㎕의 H2O를 첨가한 후 10 분간 다시 볼텍싱(vortexing)하였다. 수용액층과 유기층 분리를 위해 1000 X g 에서 원심분리를 한 후, 위층에 존재하는 유기층을 취했다. 유기층을 취한 후 다시 수용액층에 300 ㎕의 CH3OH를 첨가한 후 10 분간 볼텍싱(vortexing)하고 1000 X g 에서 원심분리를 한 후 위층에 존재하는 유기층을 취하여 앞서 취한 유기층과 합쳐서 동결건조기롤 통해 건조시켰다. 건조시킨 지질은 클로로포름 CHCl3:CH3OH (3:7, v/v)에 녹였고 CH3OH:H2O (9:1, v/v)에 희석하여 분석하였다.
2. 지질 성분 농도 측정을 통한 마커 선별
100 ㎕ 혈장과 1 mL 뇨 시료에서 추출한 지질을 도 2에 따른 초고성능 액체크로마토그래피-전기분무이온화-질량분석기를 이용하여 지질의 정성 및 정량분석을 진행하였다. Polymicro Technology, LLC(Phoenix, AZ)에서 구입한 100 ㎛의 내경을 갖는 캐피라리(capillary)에는 1.7 ㎛의 크기를 갖는 Waters(Milford, MA)의 BEH(ethylene bridged hybrid bead) 충진물을 질소 가스를 이용하여 직접 패킹(packing)하여 제작하였다. 펌프(Pump)와 컬럼의 연결은 모두 50 ㎛의 내경을 갖는 캐피라리(capillary)를 이용하였고 나노플로우(nanoflow)를 위해 유속을 스플릿(split)하는 밸브(valve)에는 20 ㎛의 내경을 갖는 캐피러리(capillary)를 연결하여 분리 흐름(split flow)을 조절하였다.
정성분석에는 써모피셔사이언티픽(Waltham, MA)의 Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 RSLCnano System을 LTQ velos ion trap 질량분석기에 직접 연결하여 연구를 진행하였고, 정성분석에서 확인된 지질을 정량하는 정량분석에서는 Waters의 nanoACQUITY UPLC를 TSQ Vantage triple-stage quadrupole 질량분석기에 연결하여 사용하였다.
분리에 사용되는 이동상은 기울기용리(gradient elution) 방법을 이용하여 극성이 높은 물질부터 순서대로 분리하였다. 이동상 A는 H2O와 CH3CN이 9:1의 부피비로 섞인 용매를 사용하고, 이동상 B는 CH3OH:CH3CN:이소프로파놀(isopropanol,IPA)이 2:2:6의 비율로 섞인 이동상을 사용하였다. 이동상 A는 B에 비해 극성이 매우 높은 용매로서 비극성인 지질분자가 오토샘플러(autosampler)를 통해 컬럼에 주입 될 시 이동상에 의해 컬럼 밖으로 빠지지 않고 컬럼과 지질분자가 효과적으로 바인딩(binding) 해 주는 역할을 해 준다. 시료가 컬럼으로 주입 될 시 이동상 A로만 이동하며 스플릿 밸브(split valve)를 닫은 상태에서 진행하였다. 이동상 B의 조성은 비극성이 높은 IPA의 비율을 높여주어 컬럼에 바인딩(binding) 된 비극성인 지질분자들이 효율적으로 분리되도록 해 주었다. 하지만 IPA의 비율이 너무 높을수록 이동상 A와 B가 혼합될 시 발생하는 압력이 높아지기 때문에 사용가능한 이동상 B에 점도가 가장 낮은 CH3CN을 첨가해 주고, 이온화 매개체를 효율적으로 유기용매에 녹이기 위해 CH3OH 또한 첨가해 주었다. 이동상 B의 비율을 천천히 높여주어 지질을 분리할 때 스플릿 밸브(split valve)의 위치를 바꿔서 펌프에서 흐르는 유속 중 300 nL/min만 분석컬럼으로 흘러가도록 하며 남은 유속은 스플릿 밸브(split valve)로 빠져나가게하여 이동상 용매 변화를 빠르게 적용시키며 dwell time을 최소화시켰다.
정성과 정량 분석에 최적화된 다른 종류의 기울기용리법이 사용되었다. 정성분석(LTQ Velos ion trap)의 경우 시료가 분석컬럼에 충분히 바인딩(binding) 할 수 있도록 600 nL/min으로 13분간 흘러주었다. 그 후 스플릿 밸브(split valve)를 열고 6 μL/min으로 유속을 높여준 후 2분간 이동상 B를 75%로, 9 분간 80%로, 다음 9분간 95%로, 다음 9분간 99%로 그리고 99%를 10분간 유지하여 지질을 분리 및 분석하였다. 정량분석(TSQ Vantage triple-quadrupole)의 경우 이동상 A를 1 μL/min으로 10분간 흘러주어 시료를 컬럼에 바인딩(binding)한 후 스플릿 밸브(split valve)를 열고 이동상 B를 20 μL/min의 유속으로 1분간 50%로, 다음 3분간 80%로, 다음 9분간 100%로, 그리고 8분간 100%를 유지하여 단 30분안에 지질을 정량하였다.
1 mM Ammonium formate(AF)와 0.1% formic acid (FA), 1 mM AF와 1% FA, 5 mM AF와 1% FA, 1 mM AF가 첨가된 이동상 용매를 이용하여 지질을 분석한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 FA가 1% 이상으로 첨가되어야만 S1P가 검출되는 점을 발견하였다. AF의 경우 5 mM보다 낮은 1 mM이 첨가된 경우 이온화 효율이 증가하였음이 검증되었기 때문에 다양한 종류의 지질을 한 번에 분석하기 위해, 1 mM AF와 1% FA가 혼합된 이온화 매개체를 최종적으로 선택하였다. AF와 FA는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였고 이동상 조성에 사용된 모든 용매는 HPLC-grade로 Avantor™ Performance Materials (Center Valley, PA)에서 각각 구입하였다.
지질분석에 최적화된 이온화 매개체와 기울기용리법을 이용하여 정상군, GD군, GO군의 혈장 내 지질 5 ㎍과 뇨 시료 내 지질 15 ㎍을 주입하여 분석을 진행하였다.
정성분석의 경우 시료를 정상군, GD군, GO군 별로 풀링(pooling)하여 분석을 진행하였으며 도 4에 나타난 바와 같이 충돌-유도 해리(collision-induced dissociation, CID) 스펙트라를 사용하여 지질 구조를 확인하였다.
S1P의 경우, 양이온 모드에서는 [M+H]+ 형태에서 검출되었으며 H2O가 잘려 검출된 조각이온(m/z 362.4), 인산기가 잘려나간 조각이온(m/z 282.4), 인산기에서 H2O이 추가로 잘려 검출된 조각이온(m/z 264.4)이 검출되어 S1P의 구조를 확인하였다. 음이온 모드에서는 [M-H]- 형태에서 검출되어 인산기 이온(m/z 97)과 H2O가 추가로 잘린 이온(m/z 79)이 나타나 음이온 모드에서도 구조분석이 가능하지만 양이온 모드의 검출 세기가 훨씬 높은 관계로 S1P의 경우 양이온 모드에서 분석하였다. 이와 같은 방법으로 혈액 시료에서 총 389종, 뇨 시료에서 273종의 지질 구조를 분석하였다(표 2).
150개 이상의 시료로부터 수백개의 지질을 개별 정량하는 경우 많은 시간이 소요되므로, 분석시간을 단축하고자 풀링된 시료로 1차 정량을 진행하였다. 정량분석은 전구체(precursor) 값과 product ion을 정하여 선택적인 지질만 분석하는 선택적 반응 모니터링(selected reaction monitoring, SRM) 모드에서 진행하였으며, 1차 정량분석을 진행한 지질의 수는 혈장 지질 281종과 뇨 지질 191종이었다(표 2).
Classes Plamsa Urine 　 Classes Plamsa Urine 　 Classes Plamsa Urine
LPC 16 7 LPI 2 1 SM 23 21
PC 39 26 PI 20 16 CER 13 8
LPE 7 3 LPS 0 1 MHC 9 7
PE 20 13 PS 0 10 DHC 4 5
PEp 13 7 PA 5 5 THC 4 4
LPG 6 3 S1P 1 1 DG 23 10
PG 22 11 LSM 4 4 TG 50/158 28/110
　 　 　 　 　 TOTAL 281/389 191/273
TG의 경우 다른종류의 지질과 다르게 지방산의 위치가 식별이 가능하지 않으며, 3개의 지방산으로 이루어져있어 같은 종류의 지방산이 다른 조합으로 다르게 존재한다. 예를 들어 46:0-TG의 경우, 탄소길이는 46개이며 CID 스펙트라에서 지방산은 14:0, 16:0, 18:0이 검출되었으며 세 지방산 중 두 지방산 조합으로는 28:0, 30:0, 32:0이 검출되었다. 이로 46:0-TG가 14:0,16:0,16:0-TG와 14:0,14:0,18:0-TG으로 존재한다는 점이 분석되었으나 정량분석시 TG의 지방산 길이로 product ion을 설정하므로 해당 길이의 지방산을 가지고있는 모든 TG isomers는 함께 분석되었다. 이러한 이유에서 정성 분석에서 검출된 TG 수에 비해 정량분석에서 검출되는 TG는 상대적으로 감소하였다. 1차 정량분석에서 표준편차를 포함하여 1.5배 이상의 증감의 차이를 보인 지질만 시료별 개별 정량을 진행하여 분석시간을 단축하였다.
표 3 내지 5는 개별 시료 정량 분석결과에서 정상군(C), GD군, GO군을 비교하여 1.5배 이상과 p<0.01의 차이를 나타낸 지질(bold)만 정리한 결과이다. 또한, 도 5에서는 각 지질의 피크 면적을 계산하여 정상군과 비교한 GD/C, GO/C와 GD군과 GO군을 비교한 GO/GD로 나타내었다. 이온화 변화를 보정하기위해 각 시료에 첨가한 지질 내부표준물질의 피크 면적을 계산하여 모든 지질의 피크 면적을 보정하였다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
상기 표 3 내지 5에 정리된 지질들을 주성분분석(principal component analysis, PCA)로 그려 나타내었다(도 5).
각각의 포인트는 개별 시료를 나타내며 정상군의 경우는 검은색 동그라미, GD군은 하얀색 동그라미, GO군은 별 모양으로 나타내어 개별 시료에 대한 지질 분자의 변화를 살펴보았다. 그룹별로 집단화(clustering)가 되어있다는 점은 그룹안에서 분포가 잘 이루어졌다는 걸 알 수 있으며, 뇨 시료보다 혈액 시료에서 GD군과 GO군이 겹쳐지지 않고 뚜렷한 차이가 있었음을 판단할 수 있었다.
도 6은 정상군에 대한 GD군과 GO군의 특정 지질 분자의 변화를 그린 그림이다.
혈장에서는 총 5종의 지질, 뇨 시료에서는 총 9종이 지질이 GD군과 GO군시, 1.5배 이상의 증감과 함께 통계적으로 의미(p<0.01)있게 변하는 것을 견주어 볼 수 있었다.
특히 GO군의 d18:1-S1P가 혈장과 뇨 시료에서 각각 통계적으로 의미있게 증가하는 점을 발견하였다. 혈장 시료에서는 16:0p/20:2-PEp가 GO군에서 증가하는 반면 GD군에서 크게 변하지않았고 58:7-TG는 GD군에서 증가하는 반면 GO군에서 크게 변하지 않거나 다소 감소하였다. d18:1-S1P와 (16:1,18:0)-DG는 GD군과 GO군에서 증가하였지만 GO군에서 현저히 크게 증가하여 통계적으로 의미있는 차이가 나타났다. 뇨 시료에서는 16:0/22:5-PE, 18:0/20:4-PE, 18:1/18:2-PE, 18:1/20:4-PE가 정상군과 대조시 GD군에서의 감소가 GO군에서의 감소의 폭보다 컸으며 48:1-과 50:1-TG의 경우, 반대로 GO군에서의 감소가 더 큰 것으로 나타났다. 16:1-LPC와 d18:1-S1P은 GD군보다 GO군에서 보다 급격히 증가하였으며 16:1-LPC의 경우 GD군에서는 약 3배, GO군에서는 약 6배로 증가하여 혈액이나 뇨 시료 내 다른 어떤 지질보다 눈에 띄게 증가한 점을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 식별용 마커.
  2. 제 1 항에 있어서,
    리소포스파티딜콜린(LPC)은 16:1-LPC 및 18:1-LPC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이고, 트리아실글리세롤(TG)은 44:2-TG, 54:7-TG, 60:13-TG, 46:2-TG, 48:1-TG, 50:1-TG, 50:2-TG 및 52:0-TG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 식별용 마커.
  3. 대상체로부터 분리된 생물학적 시료에서 지질 성분의 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 지질 성분의 농도 및 정상군으로부터 분리된 지질 성분의 농도를 비교하여 그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO) 여부를 판단하는 단계를 포함하며,
    상기 지질 성분은 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    지질 성분의 농도 측정은 크로마토그래피/질량분석기를 이용하는
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    리소포스파티딜콜린(LPC)은 16:1-LPC 및 18:1-LPC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이고, 트리아실글리세롤(TG)은 44:2-TG, 54:7-TG, 60:13-TG, 46:2-TG, 48:1-TG, 50:1-TG, 50:2-TG 및 52:0-TG 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    생물학적 시료는 조직, 혈액 또는 뇨인
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    생물학적 시료가 혈액일 경우, 지질 성분은 트리아실글리세롤(TG) 이고,
    상기 트리아실글리세롤(TG)은 44:2-TG, 54:7-TG 및 60:13-TG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    하기 조건 중 두 개 이상의 조건을 만족하면 그레이브스 안구병증(GO)으로 판단하는
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법:
    (1) 44:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 2.5 배 이상
    (2) 54:7-TG의 농도가 정상군의 농도보다 2.2 배 이상
    (3) 60:13-TG의 농도가 정상군의 농도보다 2.5 배 이상
  9. 제 6 항에 있어서,
    생물학적 시료가 뇨일 경우, 지질 성분은 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 트리아실글리세롤(TG)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이고,
    상기 리소포스파티딜콜린(LPC)은 16:1-LPC 및 18:1-LPC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이고, 트리아실글리세롤(TG)은 46:2-TG, 48:1-TG, 50:1-TG, 50:2-TG 및 52:0-TG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    하기 조건 중 두 개 이상의 조건을 만족하면 그레이브스 안구병증(GO)으로 판단하는
    그레이브스병(GD) 및 그레이브스 안구병증(GO)을 식별하기 위한 정보 제공 방법:
    (1) 16:1-LPC의 농도가 정상군의 농도보다 4.5 배 이상
    (2) 18:1-LPC의 농도가 정상군의 농도보다 5.8 배 이상
    (3) 46:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.55 배 이하
    (4) 48:1-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.55 배 이하
    (5) 50:1-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.45 배 이하
    (6) 50:2-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.45 배 이하
    (7) 52:0-TG의 농도가 정상군의 농도보다 0.55 배 이하
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