KR20240050145A - 지방세포 유래 복막섬유증의 예측 방법 및 복막섬유증 약물 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지방세포 유래 복막섬유증 예측용 조성물, 키트 및 복막섬유증 예측을 위한 정보제공방법, 그리고 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법에 관한 기술이다. 본 발명은 직접적으로 질환의 발병 및 진행 수준을 확인하기 어려운 복막섬유증에 대하여 바이오마커를 통해 질환을 보다 효과적으로 예측할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명은 트랜스웰 시스템을 통해 복막 EMT 상태를 유도하여 다수의 치료 후보물질 중 복막섬유증 치료에 효과적인 물질을 손쉽게 확인할 수 있도록 한다.
Description
본 발명은 지방세포 유래 복막섬유증 예측용 조성물, 키트 및 복막섬유증 예측을 위한 정보제공방법, 그리고 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법에 관한 기술이다.
복막 투석(PD, Peritoneal Dialysis)은 혈액투석 및 신장이식과 함께 신부전의 치료법으로 사용된다. 그러나, 장기간 복막투석을 하는 환자들 중 일부는 복막손상으로 인해 더 이상 복막투석을 할 수 없게 된다. 복막손상의 대표적인 예로는, 복막섬유증(PF, Peritoneal Fibrosis)과 혈관병증 등의 구조적인 변화를 들 수 있다.
상기 복막섬유증과 혈관병증은 서로 밀접한 관계가 있다. 신생혈관형성이 복막섬유증의 증상으로 나타나기도 하는 반면에, 복막섬유증이 신생혈관을 안정시키기도 한다. 또한, 복막섬유증과 동반된 혈관병증은 한외여과부전의 원인이 되어 복막의 기능부전을 초래하고, 복막섬유증이 극단적으로 진행될 경우에는 피막화 복막경화증이 발생하기도 한다.
이에 따라, 복막섬유증의 예측은 복막투석을 지속할지 여부를 판단하는 측면에 있어 매우 중요한 문제로 인식되고 있다.
한편, 복막 중피세포에서의 EMT(Epithelial-to-Mesenchymal Transition)는 복막섬유증의 개시에 중요한 역할을 한다. 이러한 EMT는 E-cadherin 및 ZO-1의 발현 감소와 de novo α-smooth muscle actin(α-SMA)의 발현 증가를 특징으로 하고 있으며, 가역적인 과정에 해당한다. 복막 가까이에 위치한 복강내 지방세포는 복막투석과 관련된 만성 염증의 주요 부위로서, 복막 EMT가 일어날 때 각종 사이토카인의 방출을 통해 복막 중피세포에 영향을 미칠 가능성이 크다.
그러나, 복강내 지방세포와 복막 중피세포 간의 상호작용에 대하여 진행된 연구는 많지 않다. 이에 본 발명자는 복막 중피세포와 복강내 지방세포 간의 상호작용시 발현하는 인자들의 변화를 확인함으로써 복막섬유증에 대한 예측 방법 및 치료제 스크리닝 방법에 대한 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 지방세포 유래 adiponectin, PAI-1, VEGF, MCP-1/CCL2, NGAL 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 복막섬유증 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 adiponectin, PAI-1, VEGF, MCP-1/CCL2, NGAL 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 복막섬유증 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 복막섬유증이 의심되는 피검체에서 분리된 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우, 복막섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 복막섬유증이 의심되는 피검체에서 분리된 복강내 지방세포의 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의 i) VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2 및 PAI-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우; 또는 ii) adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 저감되는 경우, 복막섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 복막 중피세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복강내 지방세포를 트랜스웰 상단에 접종하여 트랜스웰 시스템에서 공동배양하는 단계; (b) 상기 트랜스웰 시스템에 시험물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질이 처리된 트랜스웰 시스템으로부터 분리된 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 저감되는 경우, 시험물질을 복막섬유증 치료를 위한 약물로 선별하는 단계;를 포함하는 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 복막 중피세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복강내 지방세포를 트랜스웰 상단에 접종하여 트랜스웰 시스템에서 공동배양 하는 단계; (b) 상기 트랜스웰 시스템에 시험물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질이 처리된 트랜스웰 시스템으로부터 분리된 복강내 지방세포의 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 복강내 지방세포의 i) VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2 및 PAI-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 저감되는 경우; 또는 ii) adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 증대되는 경우, 시험물질을 복막섬유증 치료물질로 선별하는 단계;를 포함하는 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트랜스웰 및 이를 포함하는 지지체; 트랜스웰 하단에 접종된 복막 중피세포; 및 트랜스웰 상단에 접종된 복강내 지방세포를 포함하는 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
하기에서는 중복되는 내용의 혼잡을 방지하기 위하여, 중복되는 내용의 기재를 생략하고자 한다. 즉, 하기의 내용만으로 발명의 내용이 한정되는 것은 아니고, 전체적인 발명의 내용에 따라 발명의 내용이 해석되어야 할 것이다.
본 발명은 복막섬유증 예측용 조성물, 키트 및 복막섬유증 예측을 위한 정보제공방법을 제공하고, 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법에 관한 기술을 제공하고자 한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, adiponectin, PAI-1, VEGF, MCP-1/CCL2, NGAL 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 복막섬유증 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 “adiponectin”은 지방세포에서 분비되는 단백질의 일종으로, 인슐린 저항성을 개선시키는 데 결정적 요소로 작용하며, 비만과 당뇨병 치료에 효과가 있다고 알려져 있다.
본 발명에서 용어 “PAI-1”(Plasminogen Activator Inhibitor-1)은 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 제제의 억제제로서, 섬유소용해와 혈관 작용을 조절하는 역할을 한다고 알려져 있다.
본 발명에서 용어 “VEGF”(Vascular Endothelial Growth Factor)는 혈관형성을 자극하는 많은 세포에서 생성되는 신호 단백질로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 “MCP-1/CCL2”(Monocyte chemoattractant protein-1)는 세포역학을 엄격하게 조절하고, 단핵구, 기억 T세포 및 수지상 세포를 조직 손상 또는 감염에 의해 생성된 염증부위로 모으는 역할을 하는 사이토카인이다.
본 발명에서 용어 “NGAL”(Neurtrophil Gelatinase Associated Lipocalin)은 LCN2 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 철분을 격리하고 박테리아에 의한 사용을 방지함으로써 선천적 면역에 관여하여 성장을 제한하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 “resistin”은 지방에서 추출한 시스테인이 풍부한 펩타이드 호르몬으로, 인슐린의 신호전달을 막아 당의 세포내 유입을 막음으로써 인슐린 저항성(insulin resistance)을 유발하는 기능을 갖는 사이토카인으로 알려져 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 복막섬유증이 유발되거나 이와 관련된 질환이 심해지는 경우 복막 중피세포에서 adiponectin, PAI-1, VEGF 및/또는 MCP-1/CCL2의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 복막섬유증이 유발되거나 이와 관련된 질환이 심해지는 경우 복막 지방세포에서 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL-2 및/또는 PAI-1의 단백질 또는 핵산의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 복막섬유증이 유발되거나 이와 관련된 질환이 심해지는 경우 복막 지방세포에서 adiponectin 및/또는 resistin의 단백질 또는 핵산의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
보다 구체적인 실시양태에 따르면, 상기 adiponectin, PAI-1, VEGF 및/또는 MCP-1/CCL2의 단백질 또는 핵산은 복막 중피세포에서 분비 또는 발현되는 것이고, 이의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적인 실시양태에 따르면, VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및/또는 resistin의 단백질 또는 핵산은 복강내 지방세포에서 분비 또는 발현되는 것이고, 이의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적인 실시양태에 따르면, 복막 중피세포 및/또는 복강내 지방세포에서 앞서 언급된 임의의 마커의 발현 수준을 측정함으로써 질환의 발병, 심각도 수준을 확인할 수 있다.
이에 따라, 본 발명에서 규명된 상술한 기전을 이용하여 복막섬유증을 진단하는 것이 가능하다.
본 발명에서 용어 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 복막섬유증이 진행되기 전, 진행 중 또는 진행 후, 또는 예후 예측을 위하여 복막섬유증에 의한 손상 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 단백질 및 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제는, 복막섬유증 상태와 정상군에서 생물학적 시료의 검체에서 발현 수준을 측정할 수 있는 인자를 의미한다. 구체적으로, 감소되거나 증가하는 마커에 대한 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.
생물학적 시료에서 단백질 및 핵산을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 할 수 있으며, 상기 단백질 및 핵산의 발현 수준은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정될 수 있다.
구체적으로 상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정하는 것일 수 있다.
상기 “항체”는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하며, 본 발명의 목적상 항체는 본 발명의 adiponectin, PAI-1, VEGF, MCP-1/CCL2, NGAL 및 resistin 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 모두 포함할 수 있다. 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태를 비롯하여, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab”), F(ab”) 2 및 Fv 등이 될 수 있다. 상기 항체는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것이라면 모두 사용할 수 있다.
이를 이용하여, 면역분석(immunoassay, 예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석)를 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다.
본 발명에서 상기 제제는 상기 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다.
즉, 핵산의 검출은 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화 되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 프라이머를 이용한 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 상기 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 스트레스 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 핵산과 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 복막섬유증 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
이러한 프라이머 또는 프로브는 공지된 서열을 바탕으로 당업자가 적절히 디자인할 수 있다.
예컨대, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, adiponectin, PAI-1, VEGF, MCP-1/CCL2, NGAL 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 복막섬유증 예측용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는, 담체, 세정버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 및 사용법을 교시하는 설명서 중 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것일 수 있다. 상기한 재료 이 외 복막섬유증 진단 키트로 사용되기에 적합하도록 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 더 포함될 수 있다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당해 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는 마이크로어레이로 구성되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체가 다수의 단백질이 고정될 수 있는 단백질 칩에 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있다.
바람직하게는, 대상은 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상은 인간일 수 있다. 또한 복막섬유증이 유발된 것으로 의심되는 인간일 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, (a) 복막섬유증이 의심되는 피검체에서 분리된 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우, 복막섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, (a) 복막섬유증이 의심되는 피검체에서 분리된 복강내 지방세포의 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의 i) VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2 및 PAI-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우; 또는 ii) adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 저감되는 경우, 복막섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "증대(고발현)"는 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 높은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.
본 명세서에서 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저감(저발현)"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.
상기 정상 대조군은 복막섬유증이 발생하지 않은 정상의 피검체로부터 회수한 생물학적 시료 또는 생체 외에서 손상되지 않은 세포를 의미할 수 있다.
상기 “단백질 수준을 측정하기 위한 방법”은, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 이러한 방식은 공지된 것으로써 그 기재를 생략한다.
또한, 상기에서 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 “핵산 수준을 측정하기 위한 방법”은, 서던 블랏, PCR, RT-PCR 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 역시도 이러한 방식은 공지된 것으로써 그 기재를 생략한다.
상기 방법에 관한 사항은 키트 및 조성물에 대해서도 적용 가능하다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군의 단백질 또는 핵산의 양과 복막섬유증이 진행된 경우의 단백질 또는 핵산의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 정상 대조군과 비교함으로써 복막섬유증을 예측할 수 있다.
본 발명은 (a) 복막 중피세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복강내 지방세포를 트랜스웰 상단에 접종하여 트랜스웰 시스템에서 공동배양 하는 단계; (b) 상기 트랜스웰 시스템에 시험물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질이 처리된 트랜스웰 시스템으로부터 분리된 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 저감되는 경우, 시험물질을 복막섬유증 치료를 위한 약물로 선별하는 단계;를 포함하는 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 복막 중피세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복강내 지방세포를 트랜스웰 상단에 접종하여 트랜스웰 시스템에서 공동배양 하는 단계; (b) 상기 트랜스웰 시스템에 시험물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질이 처리된 트랜스웰 시스템으로부터 분리된 복강내 지방세포의 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 복강내 지방세포의 i) VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2 및 PAI-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 저감되는 경우; 또는 ii) adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 증대되는 경우, 시험물질을 복막섬유증 치료물질로 선별하는 단계;를 포함하는 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 “시험물질”이란 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질 또는 핵산의 발현 또는 활성에 영향을 미침으로써 질환의 예방 및 치료에 효능을 나타낼 수 있는 미지의 후보물질을 의미한다.
보다 구체적으로, 복막 섬유증에 대하여 치료 또는 예방 효능을 나타낼 가능성이 있거나 나타낼 것으로 기대되는 각종 천연물, 화합물 라이브러리, 유전자 또는 단백질 라이브러리 등일 수 있다.
본 발명의 약물 스크리닝 방법은 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 트랜스웰 및 이를 포함하는 지지체; 트랜스웰 하단에 접종된 복막 중피세포; 및 트랜스웰 상단에 접종된 복강내 지방세포를 포함하는 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명은 직접적으로 질환의 발병 및 진행 수준을 확인하기 어려운 복막섬유증에 대하여 바이오마커를 통해 질환을 보다 효과적으로 예측할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명은 트랜스웰 시스템을 통해 복막 EMT 상태를 유도하여 다수의 치료 후보물질 중 복막섬유증 치료에 효과적인 물질을 손쉽게 확인할 수 있도록 한다.
도 1은 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 성숙한 복강내 지방세포로의 분화 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1와 성숙한 복강내 지방세포를 형태적인 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 복막 중피세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복강내 지방세포를 트랜스웰 상단에 접종한 트랜스웰 시스템을 나타낸 도이고, 도 3b는 복강내 지방세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복막 중피세포를 트랜스웰 상단에 접종한 트랜스웰 시스템을 나타낸 도이다.
도 4는 트랜스웰 시스템을 이용하여 공동배양을 실시했을 때 나타나는 복막 중피세포의 형태 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 트랜스웰 시스템을 이용하여 공동배양을 실시했을 때 나타나는 복막 중피세포를 Western blotting을 통해 관찰한 EMT 마커의 발현 변화를 이미지로 나타낸 도이다.
도 6은 Western blotting을 통해 관찰한 EMT 마커의 발현 변화를 그래프로 나타낸 도이다.
도 7은 복막 중피세포에서 공동배양 전/후에 일어난 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2의 발현 변화를 array kit로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 복강내 지방세포에서 공동배양 전/후에 일어난 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin의 발현 변화를 array kit로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 Adipokine(adiponectin, PAI-1, VEGF 및 Leptin) 발현 변화를 RNA 수준에서 확인하여, 복막 중피세포와 공동배양한 복막 중피세포에서의 발현 변화를 그래프로 나타낸 도이다.
도 10은 Adipokine(adiponectin, PAI-1, VEGF, MCP-1/CCL2 및 Leptin) 발현 변화를 단백질 수준에서 확인하여, 복막 중피세포와 공동배양한 복막 중피세포에서의 EMT 마커의 발현 변화를 비교하여 이미지로 나타낸 도이다.
도 11은 복막 중피세포와 siRNA를 처리한 복강내 지방세포를 공동배양한 트랜스웰 시스템을 나타낸 도이다
도 12는 siRNA를 처리함으로써 발생하는 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하여 이미지로 나타낸 도이다.
도 13은 siRNA를 처리함으로써 발생하는 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하여 그래프로 나타낸 도이다.
도 14는 복막 중피세포에 adipokine을 처리하였을 때 발생하는 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하여 이미지로 나타낸 도이다.
도 15는 복막 중피세포에 adipokine을 처리하였을 때 발생하는 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하여 그래프로 나타낸 도이다.
도 2는 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1와 성숙한 복강내 지방세포를 형태적인 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 복막 중피세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복강내 지방세포를 트랜스웰 상단에 접종한 트랜스웰 시스템을 나타낸 도이고, 도 3b는 복강내 지방세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복막 중피세포를 트랜스웰 상단에 접종한 트랜스웰 시스템을 나타낸 도이다.
도 4는 트랜스웰 시스템을 이용하여 공동배양을 실시했을 때 나타나는 복막 중피세포의 형태 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 트랜스웰 시스템을 이용하여 공동배양을 실시했을 때 나타나는 복막 중피세포를 Western blotting을 통해 관찰한 EMT 마커의 발현 변화를 이미지로 나타낸 도이다.
도 6은 Western blotting을 통해 관찰한 EMT 마커의 발현 변화를 그래프로 나타낸 도이다.
도 7은 복막 중피세포에서 공동배양 전/후에 일어난 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2의 발현 변화를 array kit로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 복강내 지방세포에서 공동배양 전/후에 일어난 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin의 발현 변화를 array kit로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 Adipokine(adiponectin, PAI-1, VEGF 및 Leptin) 발현 변화를 RNA 수준에서 확인하여, 복막 중피세포와 공동배양한 복막 중피세포에서의 발현 변화를 그래프로 나타낸 도이다.
도 10은 Adipokine(adiponectin, PAI-1, VEGF, MCP-1/CCL2 및 Leptin) 발현 변화를 단백질 수준에서 확인하여, 복막 중피세포와 공동배양한 복막 중피세포에서의 EMT 마커의 발현 변화를 비교하여 이미지로 나타낸 도이다.
도 11은 복막 중피세포와 siRNA를 처리한 복강내 지방세포를 공동배양한 트랜스웰 시스템을 나타낸 도이다
도 12는 siRNA를 처리함으로써 발생하는 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하여 이미지로 나타낸 도이다.
도 13은 siRNA를 처리함으로써 발생하는 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하여 그래프로 나타낸 도이다.
도 14는 복막 중피세포에 adipokine을 처리하였을 때 발생하는 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하여 이미지로 나타낸 도이다.
도 15는 복막 중피세포에 adipokine을 처리하였을 때 발생하는 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하여 그래프로 나타낸 도이다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 복막 중피세포와 복강내 지방세포의 공동배양
마우스에서 유래한 지방전구세포 3T3-L1을 5일 동안 성숙한 복강내 지방세포로 분화시켰다. 구체적으로, DMEM(high glucose), 10% FBS 및 1% P/S로 구성된 배지에 지방세포 분화 유도제인 MDI(insulin 10μg/ml, dexamethasone 1μM, IBMX 0.5mM)를 첨가하여 분화를 개시하고, 3일차와 5일차에 각각 insulin 10μg/ml를 첨가함으로써 분화를 유도하였다. 상기 분화과정은 도 1에 나타내었으며, 분화 전/후의 세포 형태를 비교한 결과는 도 2에 나타내었다.
3T3-L1을 분화시키는 동안 인간의 복막 중피세포를 준비하였다. 6well plate에 각각의 웰(well)마다 2X105개의 복막 중피세포를 시딩하고, 트랜스웰 인서트(transwell insert)에는 성숙한 복강내 지방세포를 시딩하였다.
다음날, 아래쪽에는 복막 중피세포, 위쪽에는 성숙한 복강내 지방세포가 위치하도록 도 3a와 같이 배치한 트랜스웰 시스템을 통해 공동배양(co-culture)을 실시하였다. 이때, 배양 배지로는 DMEM(low glucose), 10% FBS 및 1%P/S로 구성된 배지를 사용하였다.
또한, 상기 과정과 동일하되 복막 중피세포와 성숙한 복강내 지방세포의 위치를 바꾸어 도 3b처럼 배치한 트랜스웰 시스템을 통해 공동배양(co-culture(up))을 실시하였다.
<실시예 2> 복막 중피세포의 EMT 유도
실시예 1과 같이 복강내 지방세포와 공동배양(co-culture 및 co-culture(up))을 실시한 복막 중피세포를 관찰한 결과, 해당 세포의 형태가 상피세포의 모습에서 길쭉한 모양으로 변한 것을 도 4에서 확인하였다.
또한, 상피세포 마커인 E-cadherin이 감소하고, 중간엽 세포 마커인 α-SMA의 발현이 증가하였음을 Western blotting을 이용해 도 5 및 도 6과 같이 확인하였다.
위 결과를 통해, 복막 중피세포와 복강내 지방세포를 공동배양(co-culture 및 co-culture(up))함으로써 복막 중피세포의 EMT가 유도되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3a처럼 배치한 트랜스웰 시스템에서 보다 뚜렷한 변화를 관찰할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 이하 실시예에서는 도 3a와 같이 배치한 트랜스웰 시스템을 통해 공동배양(co-culture)함으로써 얻은 실험 결과를 기재한다.
<실시예 3> 공동배양 전/후의 adipokine 발현 변화 비교
공동배양을 실시하고 48시간 경과 후, 세포를 PBS로 세척하고 RIPA 완충용액을 사용하여 단백질을 분리시켰다. 해당 단백질의 발현 수준은 array kit를 통해 확인하였다.
공동배양하기 전에 복막 중피세포 용해물에서 측정한 adipokine의 발현 수준과, 복강내 지방세포와 공동배양된 복막 중피세포에서 측정한 adipokine의 발현 수준을 비교하여 도 7에 나타내었다. 이때, 도 7의 화소 밀도(pixel density)를 수치화하여 나타낸 값은 아래와 같이 확인할 수 있었다.
상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 공동배양 과정을 거친 복막 중피세포에서는 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2의 발현이 크게 증가하였다.
한편, 공동배양하기 전에 복강내 지방세포 용해물에서 측정한 adipokine의 발현 수준과, 복막 중피세포와 공동배양된 복강내 지방세포에서 측정한 adipokine의 발현 수준을 비교하여 도 8에 나타내었다. 이때, 도 8의 화소 밀도(pixel density)를 수치화하여 나타낸 값은 아래와 같이 확인할 수 있었다.
상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 공동배양 과정을 거친 복강내 지방세포에서는 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2 및 PAI-1의 발현은 증가한 반면에, adiponectin 및 resistin의 발현은 감소하였다.
정리하자면, 공동배양을 통해 EMT가 유도될 경우, 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2의 발현 수준과 복강내 지방세포의 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2 및 PAI-1의 발현은 증가하지만, 복강내 지방세포의 adiponectin 및 resistin의 발현은 감소함을 확인할 수 있었다.
위 결과를 토대로 선별한 adipokine의 발현 변화를 RNA 수준 및 단백질 수준에서 확인하여 복막 EMT와 연관성이 있음을 분명히 하였다(도 9 및 도 10 참고).
이러한 결과로부터, 복막 중피세포 및 복강내 지방세포의 adipokine의 발현 변화를 통해 복막섬유증을 진단할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 4> EMT 유도에 관여하는 adipokine 확인
치료 약물에 대한 스크리닝 가능성을 확인하기 위하여, 복막 중피세포와 세포내 Leptin의 발현을 감소시키는 siLeptin을 처리한 복강내 지방세포를 공동배양한 시스템과, PAI-1의 발현을 감소시키는 siPAI-1을 처리하여 공동배양한 시스템을 준비하였다(도 11 및 도 12 참고).
각각의 시스템에서 EMT 마커의 발현 변화를 Western blotting으로 살펴본 결과, 대조군(siControl)에 비하여 E-cadherin의 발현은 증가하고 α-SMA의 발현은 감소함을 확인하였다. 이를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
정리하자면, 복막 중피세포와 복강내 지방세포를 공동 배양함으로써 유도되는 EMT 현상이 siRNA 처리를 통해 완화되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 PAI-1이, EMT 유도에 있어 Leptin만큼이나 중요한 역할을 함을 의미한다. 또한, 치료 약물 후보물질의 처리를 통해 관련 인자의 발현 변화를 확인함으로써 약물 스크리닝 용도로의 활용 가능성이 있음을 함께 확인하였다.
위 활용 가능성을 보다 구체적으로 확인하기 위하여, 실시예 3을 통해 선별한 adipokine을 복막 중피세포에 처리하였을 때 EMT에 어떤 변화가 나타나는지 확인하였다. 도 14 및 도 15에 확인할 수 있듯이, 대조군(Control)에 비하여 E-cadherin의 발현은 감소하고 α-SMA의 발현은 증가하였다. 즉, 각각의 선별된 adipokine이 TGF-β 및 IL-6와 마찬가지로 EMT를 유도하는 역할을 함을 확인할 수 있었다.
이러한 결과로부터, 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝에 adipokine을 활용할 수 있음을 확인하였다.
Claims (14)
- Adiponectin, PAI-1, VEGF, MCP-1/CCL2, NGAL 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 복막섬유증 예측용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2의 단백질 또는 핵산은 복막 중피세포에서 분비 또는 발현되는 것을 특징으로 하는, 복막섬유증 예측용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin의 단백질 또는 핵산은 복강내 지방세포에서 분비 또는 발현되는 것을 특징으로 하는, 복막섬유증 예측용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 제제는 상기 하나 이상의 단백질 또는 상기 하나 이상의 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 복막섬유증 예측용 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 복막섬유증 예측용 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 복막섬유증 예측용 키트.
- (a) 복막섬유증이 의심되는 피검체에서 분리된 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우, 복막섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법. - (a) 복막섬유증이 의심되는 피검체에서 분리된 복강내 지방세포의 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정한 결과, 상응하는 정상 대조군의
i) VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2 및 PAI-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 증대되는 경우; 또는
ii) adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상과 비교하여 발현이 저감되는 경우, 복막섬유증이 발생한 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 복막섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법. - 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 (a)단계의 단백질 수준을 측정하기 위한 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 복막섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 (a)단계의 핵산 수준을 측정하기 위한 방법으로는 서던 블랏, PCR, RT-PCR 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 복막섬유증을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
- (a) 복막 중피세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복강내 지방세포를 트랜스웰 상단에 접종하여 트랜스웰 시스템에서 공동배양 하는 단계;
(b) 상기 트랜스웰 시스템에 시험물질을 처리하는 단계;
(c) 상기 시험물질이 처리된 트랜스웰 시스템으로부터 분리된 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 복막 중피세포의 adiponectin, PAI-1, VEGF 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 저감되는 경우, 시험물질을 복막섬유증 치료를 위한 약물로 선별하는 단계;를 포함하는 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법. - (a) 복막 중피세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 복강내 지방세포를 트랜스웰 상단에 접종하여 트랜스웰 시스템에서 공동배양 하는 단계;
(b) 상기 트랜스웰 시스템에 시험물질을 처리하는 단계;
(c) 상기 시험물질이 처리된 트랜스웰 시스템으로부터 분리된 복강내 지방세포의 VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2, PAI-1, adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 복강내 지방세포의
i) VEGF, NGAL, MCP-1/CCL2 및 PAI-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 저감되는 경우; 또는
ii) adiponectin 및 resistin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 핵산의 발현이 증대되는 경우, 시험물질을 복막섬유증 치료물질로 선별하는 단계;를 포함하는 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 (c)단계의 단백질 수준을 측정하기 위한 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 (c)단계의 핵산 수준을 측정하기 위한 방법으로는 서던 블랏, PCR, RT-PCR 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 복막섬유증 치료를 위한 약물 스크리닝 방법.
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