KR102443101B1 - 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측용 바이오마커 mGlur5(Metabotropic glutamate receptor 5) 및 GLT-1(glutamate transporter 1)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오마커 mGlur5 및 GLT-1은 저농도 카드뮴에 노출로 인해 신경 발달 장애가 발생한 자손 개체에서 과발현되는 것을 확인하였다. 이는 mGlur5 및 GLT-1의 발현 측정을 통해 신경 발달 장애의 발병을 예측할 수 있음을 의미하는 바, 본 발명의 mGlur5 및 GLT-1는 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측을 위한 바이오마커, 특히 신경 발달이 활발한 태아 및 영유아에서의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측을 위한 바이오마커로 다양하게 활용될 수 있다.

Description

신경 발달 장애의 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for predicting of neurodevelopmental disorders}

본 발명은 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측용 바이오마커 mGlur5(Metabotropic glutamate receptor 5) 및 GLT-1(glutamate transporter 1)에 관한 것이다.

카드뮴은 중금속으로서 10 내지 30년의 긴 반감기를 가지고 있으며, 뼈와 장기에 축적되어 배출이 어렵다. 뼈와 장기에 축적된 카드뮴은 골연화증, 골다공증을 포함한 각종 염증을 발생시키며 1군 발암물질로도 지정되어 있다(Kim, Kim et al. 2015; Mezynskaand Brzoska, 2018).

카드뮴은 농도 의존적으로 독성이 다르게 나타나며(Lopez, Figueroa et al. 2003), 과거 산업발전이 급격하게 이루어지던 시기에는 작업환경에서의 고농도의 카드뮴 노출이 발생하였지만 카드뮴에 대한 독성이 밝혀짐에 따라 규제가 강화되었다. 따라서 근래에는 일반 인구집단에서의 식이섭취 또는 흡연을 통한 만성적인 저농도 노출이 이루어지고 있다(Rahimzadeh, Rahimzadeh et al. 2017). 또한, 카드뮴은 태반과 모유를 통한 노출이 가능하기 때문에 태아 및 영유아에게 영향을 미치며(Espart, Artimeet al. 2018), 태아 및 영유아는 뇌혈관장벽이 미성숙하기 때문에 카드뮴에 더욱 취약하고, 성인에 비해 더 강한 독성이 나타날 수 있다(Wang and Du 2013). 따라서 저농도의 카드뮴이 태아 및 영유아의 신경발달에 미치는 영향에 대한 연구의 필요성이 있지만, 이와 관련된 연구는 불충분하다.

기존에는 카드뮴 독성 메커니즘을 통한 신경퇴화작용 위주로 연구가 많이 진행되어왔으며, 신경발달과 관련된 연구는 혈중 및 요중 카드뮴 농도를 통한 임상연구와 동물행동실험을 통한 연구가 대부분이다. 연구결과에 따르면 카드뮴의 혈중 및 요중 농도와 주의력과잉행동결핍장애(ADHD)와 밀접한 연관성이 나타났으며(T Ciesielski et al. 2012; MJ Lee et al., 2018; Ws Kim et al.,2020), 또한 카드뮴의 농도와 신생아의 저신장, 저체중과 연관성이 나타났다(Taylor, Golding et al. 2016; Luo, McCullough et al. 2017) 이에 더하여 동물행동실험 결과에서는 학습능력 및 기억능력이 손상되었다고 보고되었다(Zhao, Gao et al. 2018). 또한 신경생성은 뇌의 학습 및 기억능력에 중요한 역할을 한다(Mohapel, Leanza et al. 2005). 기존에 보고된 연구는 성체 설치류의 뇌 해마 치상회 영역에서 카드뮴에 의해 신경세포로의 분화가 손상되는 것을 보았기 때문에(Wang, Abel, Storm, & Xia, 2019) 카드뮴이 발달기의 뇌 해마 신경세포에서 어떻게 영향을 미치는지에 대한 연구는 아직 불충분하다.

이에 본 발명자들은 산전 기간 및 수유기에 저농도 카드뮴에 노출된 자손 마우스에서 신경 발달 지연이 발생하며, 신경 발달 지연이 발생한 개체에서 글루타메이트 관련 인자인 mGlur5 및 GLT-1이 과발현된 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, mGlur5(Metabotropic glutamate receptor 5) 또는 GLT-1(glutamate transporter 1)을 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물을 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 생물학적 시료에서 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측에 대한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 mGlur5(Metabotropic glutamate receptor 5) 또는 GLT-1(glutamate transporter 1)을 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물을 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 생물학적 시료에서 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 바이오마커 mGlur5 및 GLT-1은 저농도 카드뮴에 노출로 인해 신경 발달 장애가 발생한 자손 개체에서 과발현되는 것을 확인하였다. 이는 mGlur5 및 GLT-1의 발현 측정을 통해 신경 발달 장애의 발병을 예측할 수 있음을 의미하는 바, 본 발명의 mGlur5 및 GLT-1는 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측을 위한 바이오마커, 특히 신경 발달이 활발한 태아 및 영유아에서의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측을 위한 바이오마커로 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 카드뮴 노출에 따른 마우스의 체중 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 카드뮴 노출에 따른 마우스의 음수량 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 카드뮴 노출에 따른 마우스의 혈액 내 카드뮴 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다(*** 0.001<p, **** 0.0001<p).
도 4는 카드뮴 노출에 따른 마우스의 뇌 내 카드뮴 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다(** 0.01<p, **** 0.0001<p).
도 5는 면역세포화학 염색을 통해 카드뮴이 신경세포의 발달에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다(* 0.05<p, ** 0.01<p).
도 6은 Cresyl violet 염색을 통해 카드뮴 노출이 신경세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 상기 Cresyl violet 염색 결과에 기초하여 작성한 그래프를 나타낸 도이다(* 0.05<p *** 0.001<p).
도 8은 Fluoro jade B 염색을 통해 카드뮴 노출이 신경세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 BrdU 염색을 통해 카드뮴 노출이 신경세포의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 상기 BrdU 염색 결과에 기초하여 작성한 그래프를 나타낸 도이다(* 0.05<p, ** 0.01<p).
도 11은 BrdU 염색을 통해 저농도 카드뮴이 발달기 해마의 신경세포 증식에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 면역 염색을 통해 카드뮴 노출이 치상회 성상세포증의 유발에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 qPCR-array를 통해 카드뮴 노출이 해마의 유전자 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 mGlur5(Metabotropic glutamate receptor 5) 또는 GLT-1(glutamate transporter 1)을 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, mGlur5는 Grm5 유전자로 코딩되며, mGluR 그룹 I의 서브타입이다. 상기 mGlur5는 Gq 단백질을 통해 포스포리파아제(phospholipase)에 결합한다. mGlur5는 뇌 기능의 대부분의 측면에 관여하는 글루타메이트성 신경 전달에 관여하며, 시냅스 가소성과, 학습 및 기억과 관련이 있다고 알려져 있다.

본 발명에 있어서, GLT-1은 slc1a2 유전자로 코딩되며, 성상세포에서 glutamate를 재흡수하는 수송체이다. GLT-1은 뇌의 주요 수송체이며, 전체 뇌 단백질의 1%를 차지한다. 또한 GLT-1 단백질은 아교질에서 고발현되고, 성상세포와 관련성이 있다고 보고되었다.

본 발명에 있어서, 신경 발달 장애는 뇌를 포함한 중추신경계의 기능 이상과 관련되어 나타나는 모든 발달장애를 말하며, 정신과적 문제, 언어장애 또는 비언어장애, 학습장애, 기억장애 등의 다양한 증상으로 나타난다. 신경 발달 중 신경돌기 성장의 조절은 신경 가소성(neural plasticity)과 기억 기능(memory function)에 중요하며, 대부분의 신경 발달 장애에서 신경돌기 발생 장애가 공통적으로 나타난다.

본 발명의 구체예에서, 상기 신경 발달 장애는 카드뮴 노출에 의한 신경 발달 장애인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 카드뮴 노출은 0.1 내지 50 ppm 농도의 저농도 카드뮴 노출인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 카드뮴의 농도가 1 내지 30 ppm, 가장 바람직하게는 10 ppm일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 카드뮴 노출은 산전 기간 또는 수유기에 카드뮴에 노출되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 산전 기간 및 수유기에 카드뮴에 노출되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 신경 발달 장애는 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애인 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 신경 발달 장애는 성상세포증, 자폐증, 정신지체, 발달성 언어장애, 뇌성마비, 특수감각기능 장애, 주의력결핍 과잉행동장애, 학습장애, 취약 X 증후군 및 다운 증후군으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 바이오마커는 진단, 질병의 발병 위험도 예측 등 다양한 목적으로 쓰일 수 있으며, 생물학적 시료에서 신경 발달 장애의 발병 위험도를 예측할 수 있는 물질로, 정상 시료에 비하여 신경 발달 장애 발병 위험도가 높은 개체에서 채취한 시료에서 발현 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 mGlur5 또는 GLT-1은 신경 발달 장애 발병 위험도가 높은 개체에서 과발현되는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시예에서, 건강한 정상대조군에 비하여 mGlur5 또는 GLT-1이 과발현된 개체는 신경 발달 장애가 발병할 것으로 예측할 수 있음을 확인한바, 본 발명의 바이오마커 조성물은 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측을 위해 다양하게 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제는 상기와 같이 생물학적 시료에서 발현이 증가하는 마커인 mGlur5 또는 GLT-1와, 이를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하여, 이의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 발현을 측정하는 제제는 상기 mGlur5 또는 GLT-1에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 항체는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 mGlur5 또는 GLT-1에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 발현을 측정하는 제제는 상기 mGlur5 또는 GLT-1을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있다.

본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 구체적으로, mGlur5 또는 GLT-1의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 신경 발달 장애 발병 위험도를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로브는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물을 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인

상기 키트에는 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 앞서 설명한 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물을 더 포함할 수 있으며, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생물학적 시료에서 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 신경 발달 장애 발병 위험도 예측에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 발병 위험도에 대한 정보는 개체에서 바이오마커인 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현에 대한 측정 정보이고, 본 발명의 목적상, 상기 바이오마커의 발현이 증가된 것으로 측정되는 경우 신경 발달 장애 발병 위험도가 높다는 것을 제시하며, 이를 기반으로 본 발명은 개체의 신경 발달 장애 발병 위험도에 대한 정보를 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 방법은 생물학적 시료에서 mGlur5 또는 GLT-1; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증가한 경우 신경 발달 장애의 발병 위험도가 높을 것으로 예측하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, mGlur5 또는 GLT-1의 발현을 측정하는 것은 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측을 위하여 생물학적 시료에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 분자를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것이다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, mGlur5 또는 GLT-1을 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 것은 신경 발달 장애의 발병 위험도를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측용 바이오마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액 또는 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 동물 실험

7~8주령된 암컷 C57BL/6 마우스를 대상으로 짝짓기 일주일 후부터 10 ppm 카드뮴 음용수에 노출시켰다. 음수 방법을 통한 10 ppm 카드뮴 노출은 신경세포에 대한 카드뮴의 영향을 알아보기 위하여 흔히 사용된다. 카드뮴은 수유기(생후 28일; postnatal day 28; PND28)까지 노출시켰으며(pregnancy+Lactation 군), 산전노출군(pregnancy 군)은 출산 후에 일반 수돗물로 교체하였다. 신경세포의 일차배양을 위해서 생후 1일 마우스 해마를 채취하였다. 또한 혈액과 뇌의 카드뮴 농도 분석 및 조직 염색을 위하여, 생후 28일 마우스의 뇌조직을 채취하였다.

실험예 2. 뇌 해마 신경세포의 일차배양

해마 신경세포의 일차배양을 위해 대조군과 카드뮴 산전 노출군의 태어난지 1-2일된 C57/BL6 마우스에서 뇌 해마 신경세포를 얻었다. 먼저 마우스들을 에탄올로 마취하고 마우스에서 해마조직을 Ca²⁺과 Mg²⁺이 없는 HEPES-buffered Hanks’saly solution(HHSS)(pH 7.45)에서 절개하였다. 분리한 해마조직을 0.25% Trypsin에서 30분씩 3회 뒤집어가며, 37°C에서 배양하였다. 배양된 해마조직을 3회 세척한 후 flame-narrowed Pasteur Pipett으로 분쇄하였고, 원심분리하여 펠릿을 수득하였다. 상기 펠릿에 2% B27 supplement, 0.25% Glutamax I 및 penicillin/streptomycin/amphotericin B(각각 100U/mL, 100ug/mL, 0.025 ug/mL)이 포함된 Neurobasal-A medium(without L-glutamate)을 배양액으로 넣어 주었다. 분리된 해마 신경세포는 Matrigen(0.2mg/ml; BD Bioscience)으로 코팅된 18mm round cover glass에 110,000 cells/glass씩 분주하였다. 분주된 신경세포를 세포 배양기(10% CO₂, pH 7.4, 37°C)에서 배양하였고, 3, 7 및 10일에 배양액의 75%를 교체하였다.

실험예 3. 면역세포화학(Immunocytochemistry) 염색

상기 일차 배양된 신경세포(배양 시작 11일 후)를 면역세포화학 염색하였다. 먼저 세포를 phosphate-buffered saline(PBS)로 세척하고, -20℃에 보관된 저온의 메탄올을 넣어 고정시켰다. 이후 메탄올을 씻어내기 위해 PBS로 3회 세척하고, 0.3% Triton X-100에서 5분 동안 투과화(permeabilization)하였다. 다시 PBS로 3회 세척 후 10% bovine serum albumin(BSA)로 상온에서 한 시간 동안 블로킹(blocking)하였다.

블로킹 후 1차 항체를 처리한 후 4°C에서 16시간 동안 반응시켰다. 사용된 항체는 신경세포의 형태적 변화를 확인하기 위해 mouse anti-MAP2 (sigma-aldrich)를 사용하였고, 시냅스 접점을 확인하기 위해 rabbit anti-PSD95 (Abcam)를 사용하였다. 면역염색된 신경세포들을 시각화하기 위해 2차 항체인 Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG(invitrogen) 및 Alexa Fluor 555 anti-mouse IgG(invitrogen)을 처리하고, 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 3회 세척하고, 커버슬립을 VECTASHIELD Mounting Medium(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)을 사용해 봉입하였다. 세포관찰을 위하여, Alexa Fluor 488(excitation, 488nm; emission, >519 nm) 및 Alexa Fluor 555(excitation, 555nm; emission, >565 nm)로 염색된 신경세포를 공초점 현미경을 사용해 관찰하였다.

실험예 4. 조직 가공

모든 동물들은 에틸에테르(ethyl ether)로 마취를 시킨 뒤 심장으로 식염수를 관류시켜 뇌의 혈액을 제거하고 4% paraformaldehyde(PFA)로 전고정을 시켰다. 전고정 후 뇌를 분리해 PFA에 담아 후고정시켰다. 후고정 과정을 마친 뇌를30% sucrose(in PBS)에 보관한 후 액체 질소를 사용해 뇌를 급속냉동시켰다. 냉동된 뇌조직은 cryocut microtome을 사용해 관상면으로 두께 25 μm로 잘라 뇌 조직 절편을 얻었다.

실험예 5. Cresyl violet 염색

뇌 조직은 사용하기 전 날에 젤라틴이 코팅된 슬라이드에 붙인 후 상온에 보관하였다. 이 후 뇌 조직을 미리 워밍업 시킨 0.3% Cresyl violet 용액에서 20분 동안 상온에서 배양하였다. 배양된 뇌 조직을 수돗물로 세척한 후 0.3% acetic acid glacial을 처리하여 5분 동안 배양하였다. 배양된 뇌 조직은 100% 에탄올에 넣은 후 바로 100% 자일렌을 이용해 탈수시켰다. 탈수된 뇌 조직을 DPX(Di-N- butyl phthalate in xylene)로 봉입하였다.

실험예 6. Fluoro Jade-B 염색

뇌 조직은 사용하기 전 날에 젤라틴이 코팅된 슬라이드에 붙인 후 상온에 보관하였다. 뇌 조직에 0.06% potassium permanganate(KMnO₄)를 처리한 후 10분 동안 상온에서 배양하였다. 배양된 뇌 조직을 수돗물로 세척한 후 0.0004% Fluoro-Jade B을 처리하였고, 15분 동안 상온에서 배양하였다. 배양된 조직을 3x Distilled Water로 세척한 후 DPX(Di-N- butyl phthalate in xylene)로 봉입하였다.

실험예 7. BrdU(Bromodeoxyuridine) 주입

신경세포의 분화를 알아보기 위하여, 생후 14일에 Bromodeoxyuridine을 복강 내에 주사하였다. 상기 Bromodeoxyuridine은 kg당 100 mg씩, 2시간 간격으로 2회 투여하였다.

세포의 증식을 알아보기 위하여, 생후 28일인 마우스에 Bromodeoxyuridine을 복강 내에 주사하였다. 상기 Bromodeoxyuridine은 체중 kg당 100 mg씩 희생 2시간 전에 투여하였다.

실험예 8. BrdU 면역조직화학 염색(Immunohistochemistry)

조직을 2X SSC 버퍼(Saline Sodium Citrate buffer)로 5분간 2회 세척하였다. 세척된 조직을 50% formamide 및 2% SSC buffer가 혼합된 용액을 처리한 후 65℃에서 2시간 동안 배양하였다. 또한 배양된 조직을 1N HCl에 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후에 0.1M boric acid로 10분 동안 중화한 후 5% BSA 및 0.1% triton X-100이 포함된 용액에 담가 블로킹(blocking)하였다. 그 후에 Rat anti bromodeoxyuridine(1:200; abcam), rabbit anti doublecortin(1:200; abcam) 및 mouse anti-glial fibrillary acidic protein(1:500; Millipore)을 표적하는 1차 항체를 처리하여 4℃에서 16 내지 20시간 동안 배양하였다. 배양된 조직을 세척한 후 2차 항체인 Alexa Fluor 488 anti-rat IgG(1:500; Life Technologies), Alexa Fluor 555 anti-rabbit IgG(1:500; Life Technologies) 및 Alexa Fluor 647 anti-mouse IgG(1:500; invitrogen)를 처리한 후 상온에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 봉입 과정은 VECTASHIELD Mounting Medium(Vector Laboratories) 이용하였다. 또한 Alexa Fluor 488(excitation, 488nm; emission, >519 nm), Alexa Fluor 555(excitation, 555nm; emission, >565 nm) 및 Alexa Fluor 647(excitation, 652nm; emission, > 668)로 염색된 신경세포를 공초점 현미경으로 관찰하였다.

실험예 9. 공초점 현미경 관찰

봉입된 신경세포와 조직들을 공초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Germany)의 재물대로 옮겼다. 신경세포는 20 배율(numerical aperture, 0.75) 및 63 배율의 대물렌즈(numerical aperture, 1)를 통해 관찰하였고, 뇌 조직은 20배율(numerical aperture, 0.6) 및 20배율(numerical aperture, 2)의 대물렌즈를 통해 관찰하였다. z-stack imaging기법을 사용하여 최종 이미지를 얻었다. 구체적으로 신경세포의 z-axis를 1 μm 간격으로 총 8개의 단면을 촬영한 후 얻은 이미지를 하나로 합쳐 하나의 최종 이미지를 얻었고, 뇌 조직은 25개의 단면을 촬영한 후 얻은 이미지를 하나로 합쳐 하나의 최종 이미지를 얻었다.

실험예 10. 총 RNA 추출 및 cDNA 합성

제조업체의 프로토콜에 따라 AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 마우스 해마 조직에서 총 RNA를 분리하였다. 최종 RNA는 40 μL의 DNase/RNase-배제 워터(DNase/RNase-Free water)로 용출하였다. 게놈(genomice) DNA는 DNase-Free-DNase Set(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 제거했다. RNA 농도는 260 nm에서 분광 광도계로 평가되었고 각각 나노드랍 2000(Nanodrop 2000 (Thermo science, Waltham, MA))을 사용하여 OD 260 nm/280 nm 및 OD 260 nm/230 nm 비율을 결정하여 순도를 확인했다. RNA 품질은 5200 프래그먼트 분석기(Fragment Analyzer (Agilent, California, USA))를 사용해 평가했다. cDNA는 제조사의 프로토콜에 따라 MyGenie 96 Gradient Thermal Block(Bioneer, Daejeon, Korea)에서 AccuPower® RocketScript Cycle RT PreMix(Bioneer, Daejeon, Korea)로 용출된 RNA 1 μg으로부터 합성되었다. 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)은 하기의 열 순환 조건하에서 수행되었다 : 37 ℃에서 30 초, 48 ℃에서 4 분, 55 ℃에서 30 초 동안 12 사이클(cycle) 수행한 후 95 ℃에서 10 분 동안 1 사이클.

실험예 11. 정량 PCR(Quantitative PCR) 및 데이터 분석

실시간 PCR 어레이(Real-time PCR array)는 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (Bioneer, Daejeon, Korea)에서 싸이클링 파라미터(cycling parameters(95 for 5 sec (40 사이클), 58℃에서 25초 및 72℃에서 30초))로 수행되었다. 데이터 분석은 상대적인 정량적 방법을 기반으로 ΔΔCT 값을 사용하여 발현의 상대적인 배수 차이(fold change)를 결정하였다. 모든 데이터는 참고 유전자(reference gene)인 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 발현 수준으로 정규화하였다.

실시예 1. 카드뮴 노출 후 마우스의 체중 및 음수량 변화 관찰

카드뮴 노출에 따른 마우스의 체중 및 음수량 변화를 관찰하였다. 본 실시예의 실험군은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 산전 기간에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 그룹(pregnancy); 산전 기간 및 수유기에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 그룹(pregnancy+lactation); 및 카드뮴에 노출되지 않은 그룹(control);이다. 마우스의 체중 및 음수량 변화를 관찰한 결과는 도 1 및 2에 각각 나타내었다. 도 1 및 2의 G는 임신기를 의미하며, P는 생후기를 의미한다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 마우스의 체중 변화는 실험군 간에 유의한 차이가 없는 것을 확인하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 마우스의 음수량 변화는 실험군 간에 유의한 차이가 없는 것을 확인하였다. 이는 마우스에 카드뮴 노출이 의도한 바와 같이 이루어졌음을 의미한다.

실시예 2. 카드뮴 노출로 인한 혈액 및 뇌의 카드뮴 농도 변화 관찰

카드뮴 노출에 따른 모체 마우스 및 생후 28일된 마우스(PND28)의 혈액 및 뇌의 카드뮴 농도를 측정하였다. 본 실험의 실험군은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 산전 기간에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 그룹(pregnancy); 산전 기간 및 수유기에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 그룹(pregnancy+lactation); 및 카드뮴에 노출되지 않은 그룹(control);이다. 마우스의 혈액 및 뇌의 카드뮴 농도를 측정한 결과는 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 카드뮴에 노출된 모든 마우스는 혈액 내 카드뮴 농도가 대조군(control)에 비해 증가된 것을 확인하였다. 특히 산전 기간 및 수유기에 카드뮴에 노출된 마우스는 모두 혈액 내 카드뮴의 농도가 대조군에 비해 약 3배 증가한 것을 확인하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 산전 기간 및 수유기에 카드뮴에 노출된 모체 마우스 및 생후 28일된 마우스는 대조군에 비해 뇌 내 카드뮴 농도가 유의하게 높은 것을 확인하였다.

상기 결과는 음수법을 통해 제공한 카드뮴이 마우스의 체내에 정상적으로 축적되었음을 의미한다.

실시예 3. 카드뮴 노출에 의한 신경세포의 발달에 미치는 영향 확인

카드뮴 노출이 해마의 신경세포의 발달에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 산전 기간에 카드뮴에 노출된 생후 1일차 마우스의 해마를 분리하였다. 분리된 해마를 배양한 후 면역세포화학 염색하였고, 공초점 현미경을 사용하여 세포를 관찰하였다. 상기 세포 관찰은 흥분성 시냅스 접점을 확인하였고, 신경세포의 신경돌기 길이, 세포체 크기 및 가지의 수를 확인하였다. 세포를 관찰한 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 면역세포화학 염색 결과(A)를 분석한 결과, 산전 기간에 카드뮴에 노출된 생후 1일차 마우스(Cd 10 ppm)는 흥분성 시냅스 접점을 의미하는 PSD-95가 대조군에 비해 유의하게 감소한 것을 확인하였다(B). 또한 상기 마우스는 신경돌기의 길이(C), 세포체의 크기(B) 및 가지의 수(C)가 대조군에 비해 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과는 산전 기간 카드뮴에 노출되는 것이, 자손 마우스의 신경세포의 형태학적 발달을 지연시킨다는 것을 의미한다.

실시예 4. 카드뮴 노출이 해마 신경세포의 증식에 미치는 영향 확인

Cresyl violet 염색 및 Fluor jade B 염색을 통해 저농도 카드뮴이 발달기 해마의 신경세포에 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 상기 Cresyl violet 염색은 살아있는 신경세포를 염색할 수 있고, Fluor jade B 염색은 죽거나 죽어가는 신경세포를 염색할 수 있다.

Cresyl violet 염색 결과는 도 6에 나타내었으며, 이를 그래프화한 것은 도 7에 나타내었다.

도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 산전 기간 및 수유기 노출군(pregnancy +lactation)은 해마 CA1, CA3 및 Hilus 영역의 신경세포의 수가 대조군(control) 및 산전 기간 노출군(pregnancy)에 비해 유의하게 감소된 것을 확인하였다.

Fluoro jade B 염색 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군에서 Fluoro jade B 염색에 양성인 세포가 관찰되지 않았다.

상기 결과는 저농도 카드뮴이 세포 독성은 나타내지 않으면서, 해마의 신경 발달을 지연시킨다는 것을 의미한다.

실시예 5. 카드뮴 노출이 해마 치상회(dentate gyrus)의 신경세포 분화에 미치는 영향 확인

저농도 카드뮴이 해마 치상회의 신경세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 마우스 뇌 절편을 BrdU 염색하여 해마 치상회의 신경세포 분화를 확인하였다. 본 실험의 실험군은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 산전 기간에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 그룹(pregnancy); 산전 기간 및 수유기에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 생후 28일된 자손 마우스 그룹(pregnancy+lactation); 및 카드뮴에 노출되지 않은 그룹(control);이다. 마우스 뇌 절편을 BrdU 염색한 결과는 도 9에 나타내었고, 이를 그래프화한 것은 도 10에 나타내었다.

도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 카드뮴에 노출된 마우스는 해마 치상회에서 신경세포로 분화하는 비율이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이는 저농도 카드뮴이 세포 독성은 나타내지 않으면서, 해마 치상회의 신경세포 분화를 억제한다는 것을 의미한다.

실시예 6. 카드뮴 노출이 해마 치상회의 세포의 증식에 미치는 영향 확인

BrdU 염색을 통해 저농도 카드뮴이 발달기 해마의 신경세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 본 실험의 실험군은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 산전 기간에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 그룹(pregnancy); 산전 기간 및 수유기에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 생후 28일된 자손 마우스 그룹(pregnancy+lactation); 및 카드뮴에 노출되지 않은 그룹(control);이다. 저농도 카드뮴이 해마 세포의 증식에 미치는 영향을 조사한 결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 카드뮴에 노출된 마우스는 대조군에 비해 세포 증식이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 산전 기간 및 수유기 노출군(pregnancy+lactation)에서 유의하게 증가하였다. 상기 결과는 저농도 카드뮴이 세포의 비정상적인 증식을 유도한다는 것을 의미한다. 또한 상기 세포의 비정상적인 증식은 (i) 저농도 카드뮴에 의한 분화 지연; 및 (ii) 세포 손상으로 인해 유도된 보상 현상;에 의한 것으로 사료된다.

실시예 7. 카드뮴 노출에 의한 치상회의 성상세포증 유발 여부 확인

저농도 카드뮴이 해마의 치상회에서 성상세포증을 유발하는지 확인하였다. 구체적으로, 마우스의 해마 조직을 이용하여 동결 절편을 제조하였고, 이를 면역염색하였다. 본 실험의 실험군은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 산전 기간에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 그룹(pregnancy); 산전 기간 및 수유기에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 생후 28일된 자손 마우스 그룹(pregnancy+lactation); 및 카드뮴에 노출되지 않은 그룹(control);이다. 면역 염색을 통해 성상세포증 유발 여부를 확인한 결과는 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 산전 기간 및 수유기 노출군(pregnancy+lactation)은 성상세포를 표지하는 GFAP의 면역반응성이 대조군 및 산전 노출군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인하였다. 이는 저농도 카드뮴이 세포 독성은 나타내지 않으면서, 성상세포증을 유발한다는 것을 의미한다.

실시예 8. 카드뮴 노출이 해마의 유전자 발현에 미치는 영향 분석

qPCR array를 통해 저농도 카드뮴 노출이 해마의 신경발달에 영향을 미치는 인자를 분석하였다. 본 실험의 실험군은 산전 기간에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 그룹(pregnancy); 산전 기간 및 수유기에 10 ppm의 카드뮴에 노출된 생후 28일된 자손 마우스 그룹(pregnancy+lactation); 및 카드뮴에 노출되지 않은 그룹(control);이다. qPCR-array 결과는 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 산전 기간 및 수유기 노출군은 glutamate 관련 인자인 Grm5 및 slc1a2의 발현이 대조군 및 산전 노출군에 비해 과발현되는 것을 확인하였다. 상기 Grm5는 metabolic glutamate receptor 5(mGlur5)를 코딩하는 유전자로, 뇌 기능의 대부분의 측면에 관여하는 글루타메이트성 신경 전달에 관여한다. 또한 상기 slc1a2는 성상세포에서 glutamate를 재흡수하는 수송체인 GLT-1을 코딩하는 유전자이다.

종합적으로 본 발명자들은 산전 기간 및 수유기에 저농도 카드뮴에 노출된 자손 마우스에서 신경 발달 지연이 발생하며, 신경 발달 지연이 발생한 개체에서 글루타메이트 관련 인자인 mGlur5 및 GLT-1이 과발현된 것을 확인하였다. 이는 mGlur5 및 GLT-1의 발현 측정을 통해 신경 발달 장애의 발병을 예측할 수 있음을 의미하는 바, 본 발명의 mGlur5 및 GLT-1는 신경 발달 장애의 발병 위험도 예측을 위한 바이오마커, 특히 신경 발달이 활발한 태아 및 영유아에서의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측을 위한 바이오마커로 다양하게 활용될 수 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

1. mGlur5(Metabotropic glutamate receptor 5)를 포함하는 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 카드뮴 노출은 0.1 내지 50 ppm 농도의 저농도 카드뮴 노출인, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 카드뮴 노출은 산전 기간 또는 수유기에 노출되는 것인, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애는 성상세포증, 자폐증, 정신지체, 발달성 언어장애, 뇌성마비, 특수감각기능 장애, 주의력결핍 과잉행동장애, 학습장애, 취약 X 증후군 및 다운 증후군으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 mGlur5는 신경 발달 장애가 발병한 개체에서 과발현되는 것인, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 바이오마커 조성물.
8. mGlur5; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 제제를 포함하는, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 발현을 측정하는 제제는 상기 mGlur5에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물.
10. 제8항에 있어서,
    상기 발현을 측정하는 제제는 상기 mGlur5를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 조성물.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 키트.
12. 제11항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측용 키트.
13. 생물학적 시료에서 mGlur5; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측에 대한 정보 제공 방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 방법은 생물학적 시료에서 mGlur5; 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현이 증가한 경우 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애의 발병 위험도가 높을 것으로 예측하는 것인, 카드뮴 노출에 의한 태아 또는 영유아의 신경 발달 장애 발병 위험도 예측에 대한 정보 제공 방법.

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