KR101781200B1 - 비만 진단용 마커 tm4sf19 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

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Abstract

TM4SF19에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 비만 진단용 조성물 및 키트, 이를 이용한 비만을 진단하는 방법을 이용하면 비만을 효율적으로 진단할 수 있다. 또한, TM4SF19를 저해하는 비만 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법에 의하면 비만을 치료할 수 있는 후보물질을 효율적으로 선별할 수 있다.

Description

비만 진단용 마커 TM4SF19 및 이를 이용한 방법{TM4SF19, a marker for diagnosing obesity, and methods using thereof}
TM4SF19에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 비만 진단용 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 비만을 진단하는 방법, 및 TM4SF19를 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
비만 (obesity)은 체지방이 건강에 유해한 영향을 미칠 정도로 과도하게 축적된 의학적 상태를 말한다. 비만은 각종 성인병의 발병과 매우 깊은 관련이 있어, 비만도가 높아질수록 당뇨병, 담석증, 고혈압, 심장 질환 및 뇌졸증을 포함하는 다양한 질병의 유병율이 증가한다.
비만은 유전적, 문화적, 환경적 요인 등 복합적 원인에 의해 발생한다. 특히 현대에 들어서는 과다한 열량 섭취 또는 고지방 식이에 의한 비만의 유병률이 증가하고 있는 추세이다.
비만은 체질량 지수(body mass index: BMI), 체지방률, 및 허리둘레 등 다양한 척도에 의한 진단이 가능하다. 그러나, 이러한 진단 방법은 한정된 신체적 특성에만 의존하는 진단 방법이기 때문에 이들 척도만으로는 비만을 정확히 진단하는데 어려움이 있다. 따라서, 비만을 일으키는 생물학적 메커니즘을 기반으로 하여, 비만의 진단에 사용될 수 있는 바이오 마커를 발굴하고 이를 이용하여 정확도가 높게 비만을 진단할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다.
일 양상은 TM4SF19에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 비만 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
다른 양상은 개체의 비만을 진단하기 위한 TM4SF19의 발현양을 측정하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 TM4SF19를 저해하는 비만 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 막 관통 4L 6 패밀리 멤버 19(transmembrane 4 L six family member: TM4SF19)의 발현양을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 비만 진단용 조성물을 제공한다.
상기 TM4SF19 단백질은 인간(Homo sapiens) 또는 마우스(Mus musculus) 유래의 단백질이나, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물에서도 동일한 단백질이 발현될 수 있으며, 인간 유래의 TM4SF19는 3종 이상의 이성체를 가질 수 있다. 상기 TM4SF19는 각각 GenBank Accession No. NM_001204897.1 (서열번호 1), NM_001204898.1 (서열번호 2), NM_138461.3 (서열번호 3), NM_001160402.1 (서열번호 4)을 포함하는 mRNA로부터 각각 NP_001191826.1 (서열번호 5), NP_001191827.1 (서열번호 6), NP_612470.2 (서열번호 7), NP_001153874.1 (서열번호 8)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 4의 mRNA와 서열번호 5 내지 8의 단백질과 일부 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 TM4SF19의 mRNA 또는 TM4SF19 단백질로 간주될 수 있다.
상기 TM4SF19를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나와 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 TM4SF19를 코딩하는 뉴클레오티드는 상기 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기 서열에서 1개 이상의 염기, 2개 이상의 염기, 3개 이상의 염기, 4개 이상의 염기, 5개 이상의 염기, 6개 이상의 염기 또는 7개 이상의 염기가 상이한 서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 TM4SF19 단백질은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나와 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 TM4SF19 단백질은 상기 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 염기 서열에서 1개 이상의 염기, 2개 이상의 염기, 3개 이상의 염기, 4개 이상의 염기, 5개 이상의 염기, 6개 이상의 염기 또는 7개 이상의 염기가 변화된 서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다.
용어 "비만 (obesity)"은 건강에 악영향을 미칠 만큼 체지방이 과도하게 축적된 상태를 의미할 수 있다. 개체의 BMI 지수, 허리둘레, 체지방율 또는 개체의 TM4SF19의 발현양을 측정하여, 상기 수치가 대조군에 비하여 높을 경우 비만에 걸린 것으로 판단할 수 있다. 비만은 과식 또는 고지방 식이 등의 식습관, 유전적 요인, 다른 질병, 감염, 운동 부족, 또는 사회적 요소 등의 다양한 요인에 의한 것일 수 있다.
상기 TM4SF19의 발현양을 측정할 수 있는 물질은 TM4SF19 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "항체"란 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 비만 진단 마커인 TM4SF19에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, TM4SF19 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 TM4SF19 유전자에 의해 코딩되는 TM4SF19 단백질을 얻고, 얻어진 TM4SF19 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함한다.
상기 TM4SF19의 발현양을 측정할 수 있는 물질은 TM4SF19를 코딩하는 핵산서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.
TM4SF19 유전자의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 서열에 대해 특이적으로 결합하는 프라미머 또는 프로브를 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 디자인할 수 있다.
용어 "프로브"란 mRNA 등의 뉴클레오티드과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 뉴클레오티드 단편을 의미하며, 방사성 원소 등으로 표지되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 함량(발현양)을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중 가닥 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 비만 마커인 TM4SF19 유전자의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현양을 측정함으로써 비만 여부 및 정도를 측정할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 뉴클레오티드 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 뉴클레오티드 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제/중합 효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 마커 TM4SF19의 mRNA의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 TM4SF19 단백질의 발현양의 측정을 통해 비만을 진단할 수 있다. PCR 조건, 및 프라이머 세트의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 나타내며, 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체 및 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체를 포함할 수 있다.
상기 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드는 포스포르아미디트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고함), 10 내지 90 nt, 10 내지 80 nt, 10 내지 70 nt, 10 내지 60 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 40 nt, 10 내지 30 nt, 10 내지 25 nt, 20 내지 100 nt, 30 내지 90 nt, 40 내지 80 nt, 50 내지 70 nt, 20 내지 60 nt, 20 내지 50 nt, 30 내지 40 nt, 20 내지 30 nt, 또는 20 내지 25 nt인 것일 수 있다.
상기 TM4SF19 단백질 또는 그 유전자의 mRNA 발현양은 비만 마우스 지방조직 및 지방전구세포에서 특이적으로 증가하므로, 상기 본 발명에 따른 비만 진단용 조성물은 비만이 의심되는 환자의 지방세포 또는 지방전구세포에서의 TM4SF19 유전자 발현양을 측정하여 비만을 진단하는 것에 이용될 수 있다.
다른 양상은, TM4SF19의 발현양을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 비만 진단용 키트를 제공한다.
상기 비만 진단용 키트는 비만 진단 마커인 TM4SF19 단백질의 발현양을 그 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현양의 측정을 통해 측정함으로써 비만을 진단할 수 있다. 상기 비만 진단용 키트는 앞서 설명한 TM4SF19 단백질의 발현양을 측정할 수 있는 물질, 즉 TM4SF19 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 또는 단백질, TM4SF19 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 TM4SF19 단백질 발현양을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 비만 진단용 키트는 TM4SF19 단백질의 mRNA의 발현양을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명의 비만 진단용 키트는 TM4SF19 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 또는 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸 벤지딘(TMB) 등이 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 키트는 단백질 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현양을 측정할 수 있는, 비만 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 비만 진단용 마이크로어레이는 상기 본 발명의 마커를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 일 구체예에 따르면 상기 TM4SF19 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 마이크로어레이일 수 있다.
상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 개체의 비만을 진단하기 위한 TM4SF19의 발현양을 측정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 시료와 TM4SF19에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 형성된 복합체의 양을 측정하여, TM4SF19의 발현양을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 진단의 대상이 되는 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스(mouse), 쥐(rat), 소, 염소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 시료는 개체의 지방전구세포 또는 지방세포를 포함할 수 있다.
상기 TM4SF19 발현양의 측정은 TM4SF19 단백질의 발현양을 측정하거나 TM4SF19의 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 TM4SF19의 단백질의 발현양 측정은, 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드 또는 단백질을 이용하여 단백질의 발현양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay: RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
상기 TM4SF19의 mRNA의 발현양은 상기 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
상기 방법에 따르면, 개체의 시료 및 정상 대조군의 TM4SF19 단백질의 발현양을 비교함으로써 비만을 진단할 수 있다. 구체적으로는, 비만이 의심되는 환자의 시료와 정상 대조군의 TM4SF19 단백질의 발현양을 측정하고 비교하여, 개체의 시료에서 TM4SF19 단백질의 발현양이 더 증가하는 정도에 따라 비만 여부 및 그 정도를 측정할 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물 및 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 조성물 및 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 TM4SF19를 저해하는 비만 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따르면, TM4SF19 단백질이 비만에 관여하는 것으로 공지되어 있는 Grp78와 결합하고, 이에 의해 지방전구세포의 분화 및 지방 축적을 촉진하는 것을 확인하였으므로, 지방전구세포 또는 지방세포에서 TM4SF19의 발현을 저해하는 물질 또는 TM4SF19의 활성을 저해하는 물질은 비만의 치료에 효과적인 후보물질이 될 수 있다.
상기 Grp78은 마우스(Mus musculus) 유래의 단백질이나, 인간, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물에서도 동일한 단백질이 발현될 수 있다. 상기 Grp78은 Uniprot 참조번호 P20029로 나타나는 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 서열과 일부 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 Grp78 단백질로 간주될 수 있다.
상기 TM4SF19의 발현을 저해하는 물질은 TM4SF19의 프로모터 서열에 특이적으로 결합하여 전사를 저해하는 물질 또는 TM4SF19의 mRNA와 결합하여 번역을 저해하는 항체, 폴리펩티드, 단백질 또는 뉴클레오티드 등의 물질일 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 TM4SF19의 프로모터 핵산서열을 포함하는 시료에 시험물질을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 시료는 포유류로부터 분리된 세포, 지방세포 또는 지방전구세포일 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 상기 시험물질이 첨가된 시료에서 TM4SF19의 프로모터의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 TM4SF19의 프로모터 서열은 TM4SF19의 프로모터 -3000 내에 있는 SREBP 또는 PPARγ 전사인자 결합부위일 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 상기 시료에서 TM4SF19의 프로모터의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프로모터의 활성 측정은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 TM4SF19 프로모터에 표지 유전자를 연결하고, 연결된 표지 유전자의 발현을 측정하는 것으로 측정할 수 있다.
상기 TM4SF19의 프로모터의 활성이 대조군에 비해 감소되는 경우, 시료에 첨가된 시험물질은 비만 치료용 후보물질로 판단할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 TM4SF19 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 시료에 시험물질을 가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 시료는 포유류로부터 분리된 세포, 지방세포 또는 지방전구세포일 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 상기 시험물질이 첨가된 시료에서 TM4SF19 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 핵산서열과 복합체를 형성하는 시험물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 복합체의 검출은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
또한, 상기 TM4SF19의 활성을 저해하는 물질은 TM4SF19와 Grp78의 결합을 저해하는 물질일 수 있다. 상기 TM4SF19와 Grp78의 결합을 저해하는 물질은 항체, 폴리펩티드, 단백질 또는 뉴클레오티드 등의 물질일 수 있다. 상기 물질은 TM4SF19와 Grp78의 결합 부위 또는 TM4SF19의 막 관통 도메인 d 및/또는 이의 링커 부분에 결합하는 물질일 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물, 키트 및 진단 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 청구된 조성물, 키트 및 진단 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 TM4SF19를 저해하는 비만 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, TM4SF19 단백질이 비만에 관여하는 것으로 공지되어 있는 Grp78와 결합하고, 이에 의해 지방전구세포의 분화 및 지방 축적을 촉진하는 것을 확인하였으므로, 지방전구세포 또는 지방세포에서 TM4SF19의 발현을 저해하는 물질 또는 TM4SF19의 활성을 저해하는 물질은 비만의 예방 및 치료에 효과적임을 알 수 있다.
상기 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물, 키트, 진단 방법 및 스크리닝 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 조성물, 키트, 진단 방법 및 스크리닝 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 TM4SF19에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 비만 진단용 조성물 및 키트는 비만을 진단하는데 효율적으로 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 비만을 진단하기 위한 TM4SF19의 발현양을 측정하는 방법은 비만을 진단하는데 효율적으로 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 TM4SF19를 저해하는 비만 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법에 의하면 비만을 치료할 수 있는 후보물질을 효율적으로 선별할 수 있다.
도 1A는 식이에 따른 TM4SF19 mRNA 발현양을 mRNA 시퀀싱 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 1B는 식이에 따른 TM4SF19 mRNA 발현양을 RT-PCR로 증폭하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 지방전구세포의 배양 및 분화 모델을 나타내는 모식도이다.
도 3은 지방세포 분화시 TM4SF19의 발현양이 증가하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 4A는 TM4SF19 과발현 지방 전구세포주와 대조군의 시간에 따른 지방 축적을 비교한 것을 나타내는 이미지이고, 도 4B는 TM4SF19 과발현 지방 전구세포주와 대조군의 시간에 따른 지방 축적을 OD420의 광학밀도를 측정하여 정량한 것을 나타낸다.
도 5A는 TM4SF19의 과발현이 지방 분화 마커인 C/EBPα mRNA의 발현을 증가시킨 것을 나타내는 그래프이고, 도 5B는 TM4SF19의 과발현이 지방 분화 마커인 PPARγ mRNA의 발현을 증가시킨 것을 나타내는 그래프이다.
도 6은 TM4SF19 과발현 세포주의 지방세포 분화 마커의 발현양을 단백질 수준에서 측정한 것을 나타내는 도면이다.
도 7은 지방전구세포의 분화 전과 후에서 TM4SF19와 결합하는 단백질을 면역 침강 반응시킨 것을 나타내는 도면이다.
도 8A, 및 8B는 각각 식이에 따른 TM4SF19 mRNA 또는 Grp78 mRNA의 상대적인 발현양을 나타내는 그래프이다.
도 9A는 지방세포 분화 전과 후의 TM4SF19 및 Grp78의 세포 내 결합을 나타내는 도면이고, 도 9B는 293T 세포에서 과발현된 TM4SF19 및 Grp78의 결합을 나타내는 도면이다.
도 10은 TM4SF19의 결실 컨스트럭트를 나타내는 모식도이다.
도 11는 TM4SF19의 결실 돌연변이들과 Grp78의 결합 유무를 나타내는 도이다.
도 12은 TM4SF19 과발현 세포주에서 Grp78의 발현을 억제한 경우, 지방세포 분화 마커의 발현이 감소한 것을 나타내는 도이다.
도 13는 TM4SF19 프로모터 부위의 결실 컨스트럭트를 나타내는 모식도이다.
도 14는 TM4SF19의 결실 프로모터 컨스트럭트들을 제조하여 이의 프로모터 활성을 측정한 것을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 비만 마커로서의 TM4SF19의 확인
1-1. 전통 천연물을 이용한 비만 마커로서의 TM4SF19 발굴
비만에 치료 효과가 있다고 알려진 전통 천연물을 투여한 식이유도 비만 동물 모델의 부고환 백색지방의 전사체 RNA 시퀀싱 분석을 통하여, 전통 천연물에 특이적으로 반응하는 비만 마커를 발굴하였다.
구체적으로, 정상 식이 또는 고지방 식이 C57BL/6J 마우스에 태음조위탕, 녹차, 또는 방풍통선산을 첨가한 사료를 먹인 동물 모델을 고안하였다. 상기 마우스들의 부고환 백색지방 조직을 수득하고 조직 0.1 g 당 1 mL의 TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY)을 첨가하여 녹인 후 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 수득된 상층액에 클로로포름 200 μL를 첨가하여 20분간 원심 분리하고 상층액을 취하였다. 수득된 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가한 후 10분간 원심 분리하여 RNA 펠렛을 얻었다. 상기 RNA 펠렛을 75%(v/v) 에탄올로 세척하고 RNA 펠렛을 드라이 시킨 후, 디에틸피로카르보네이트(diethylpyrocarbonate: DEPC) 수에 녹여 시료를 준비하였다. 준비된 시료는 ㈜테라젠에 의뢰하여 mRNA 시퀀싱 분석을 진행하였다.
도 1A는 정상 식이 (ND), 고지방 식이에 높게 반응하는 군 (HF-OP), 고지방 식이에 적게 반응하는 군 (HF-OR), 고지방 식이+태음조위탕 (HFD+T), 고지방 식이+방풍통성산(HFD+B), 또는 고지방 식이+녹차(HFD+G)를 먹인 마우스의 부고환 백색지방에서의 FPKM(fragment per kb exon model)에 따른 TM4SF19의 유전자 발현을 나타낸다. mRNA 시퀀싱 분석 결과, TM4SF19 mRNA는 정상 식이에 의해서는 거의 발현이 되지 않지만, 고지방 식이에 의해 그 발현양이 매우 증가하며, 전통 천연물에 의해 그 발현이 억제됨을 알 수 있었다.
1-2. 식이에 따른 TM4SF19 mRNA 의 발현양 확인
추가적으로, 각 개체별 TM4SF19 mRNA 양을 PCR로 증폭하여 재검증하였다. 도 1B에서 볼 수 있듯이, RNA 시퀀싱 결과와 동일하게 TM4SF19 mRNA의 양이 고지방 식이에 의해 증가하고 태음조위탕에 의해 감소됨을 확인할 수 있었다. 상기 PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.
마우스 TM4SF19 정방향 프라이머 GGCTGTGATTTGCTTTGTCA (서열번호 9)
마우스 TM4SF19 역방향 프라이머 AGCTGGAGGAGGCTGATACA (서열번호 10)
실시예 2. 지방세포의 분화에 따른 TM4SF19 의 발현양 확인
지방전구세포인 3T3-L1을 이용하여 TM4SF19가 지방세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다.
도 2는 지방전구세포의 배양 및 분화 모델의 모식도를 나타낸다. 지방전구세포인 3T3-L1를 10% 우태아혈청(bovine calf serum: BCS), 100 유닛/mL의 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포의 분화를 유도하기 위하여, 세포를 10%(v/v) FBS가 함유된 DMEM 배양액에 분화 유도제 DMI (덱사메타손, 이소부틸-메틸크산틴(isobutyl-methylxantine: IBMX), 및 인슐린)의 존재하에서 2일간 배양하였다. 2일 후 세포 배양액을 인슐린만 첨가된 배양액으로 교환하였다. 다시 2일 후, 세포 배양액을 10%(v/v) FBS만 첨가된 배양액으로 2일 마다 배지를 교환하고, 지방세포를 수득하였다. 이후 수득된 지방 세포로부터 실시예 1과 같은 방법을 이용하여 RNA를 수득하였다. 상기 표 1에 나타난 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR 방법으로 TM4SF19의 발현양을 확인하였다.
DMI를 첨가한 후 0, 2, 4, 및 8일에서 TM4SF19의 발현양을 확인해 본 결과, 도 3과 같이 지방세포 분화가 진행됨에 따라 TM4SF19 mRNA 양이 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 3. TM4SF19 과발현이 지방세포 분화에 미치는 영향 확인
3-1. TM4SF19 과발현 세포주의 제조
TM4SF19가 지방세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 TM4SF19 과발현을 유도한 3T3-L1 세포주를 확립하였다.
바이러스 벡터인 LPCX(Laboratory of Cell Regulation and Carcinogenesis, NIH)에 N-말단에 3개의 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 에피토프가 붙어있는 3HA-TM4SF19를 클로닝해서 넣은 후, 제조된 바이러스 벡터를 3T3-L1 세포에 감염시켜 TM4SF19의 과발현 세포주를 확립하였다. TM4SF19 mRNA의 과발현 정도는 RT-PCR로 확인하였다. 상기 PCR에서 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타나있다.
인간 TM4SF19 정방향 프라이머 TATCCTGGGACTGAGCCTTG (서열번호 11)
인간 TM4SF19 역방향 프라이머 CTTCGACAGAGCCCACTCTT (서열번호 12)
3-2. 지방세포의 지방 축적 확인
DMI로 3T3-L1 세포의 분화를 유도 한 후 오일 레드 오 염색법으로 지방세포 의 지방 방울 형성 정도 및 지방 축적 정도를 확인하였다. 도 4A는 오일 레드 오 염색법으로 염색된 지방세포의 지방 형성 정도를 나타내는 이미지이고 도 4B는 지방세포의 지방축적정도를 나타내는 것으로, 염색된 지방세포에 이소프로판올을 첨가한 후 상온에서 인큐베이션 한 후 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트에 옮긴 후 OD420으로 광학 밀도를 측정하여 정량한 값을 나타낸다.
도 4A, 및 4B와 같이, TM4SF19 과발현 지방전구세포의 지방세포로의 분화가 진행될수록, 대조군에 비하여 세포의 지방 축적이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.
3-3. 지방세포의 지방 분화 마커 발현양 확인
다음으로, 지방세포 분화를 유도한 후 지방 분화 마커인 C/EBPα와 PPARγ의 mRNA 양을 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응 (real time quantitative PCR)을 통해 확인하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.
C/EBPα 정방향 프라이머 GTGTGCACGTCTATGCTAAACCA (서열번호 13)
C/EBPα 역방향 프라이머 GCCGTTAGTGAAGAGTCTCAGTTTG (서열번호 14)
PPARγ 정방향 프라이머 CGCTGATGCACTGCCTATGA (서열번호 15)
PPARγ 역방향 프라이머 AGAGGTCCACAGAGCTGATTCC (서열번호 16)
그 결과, 도 5A 및 5B에서와 같이, TM4SF19 과발현된 세포에서 C/EBPα와 PPARγ의 mRNA 양이 대조군의 C/EBPα와 PPARγ 발현양에 비해 현저하게 증가되었음이 관찰되었다.
또한 단백질 수준에서의 지방세포 분화 마커의 발현양을 비교하였다. 대조군 LPCX 과 TM4SF19 과발현 세포주에 RIPA 버퍼를 가하고 원심분리하여 상층액을 얻었다. 얻은 상층액으로부터 단백질을 분리하여 SDS-PAGE 겔로 전기영동을 한 후 PVDF로 단백질을 옮긴 후 지방세포 분화 마커들의 항체를 붙여 발현양을 확인하였다. 3HA가 표지된 TM4SF19은 HA (Y-11 Santa Cruz Biotech)로, 마커 유전자들은 지방세포분화 마커 항체 샘플 키트 (adipogenesis marker antibody sampler kit, #12589, Cell Signaling)로 확인하였다. 도 6은 TM4SF19 과발현 세포주의 지방세포 분화 마커의 발현량을 단백질 수준에서 측정한 것을 나타낸다.
그 결과, 도 6에서와 같이 에디포넥틴(adiponectin), C/EBPα와 PPARγ, 지방산결합단백질4 (FABP4), 지방산 합성제 (fatty acid synthase), 아세틸코에이 카르복실레이즈 및 지방 방울막 형성에 작용하는 페릴리핀(perilipin)의 발현양이 대조군에 비해 TM4SF19 과발현 세포주에서 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로부터, TM4SF19이 지방세포 분화에 관여하는 주요 시그널에 작용한다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. Tm4f19 과 결합하는 단백질 Grp78 의 발굴
TM4SF19의 역할이나 작용기작에 대해 기존에 알려진 바가 없으므로, 지방 세포 분화시 TM4SF19와 결합하는 단백질을 발굴하기 위하여 분화 전 (preadipocyte) 과 분화 8일 후 (D8)에 이와 결합하는 단백질을 면역 침강 반응으로 확인하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 결합 가능성을 보이는 밴드가 확인되었다.
이후 추가적인 분석을 위해, TM4SF19 과발현 세포양을 늘려 충분한 양의 단백질이 지방 세포 분화 8일 뒤에 얻어질 수 있도록 하였다. 이후 포름알데하이드 교차 결합을 시키고(formaldehyde cross-linkng) 면역 침강 반응을 수행하였다. 면역 침강된 단백질은 코마시 블루로 염색하고 SDS-PAGE 겔에 내려 분리하였다. 분리된 단백질 밴드를 잘라 질량 분석법 (Mass-Spectrometry)에 의한 단백질 분석을 하였다. 분석된 여러 후보 단백질들 중, 비만에 관여하는 것으로 알려진 Grp78(uniprot-MOUSE, P20029)을 선정하여, 식이에 따른 Grp78발현의 차이를 확인하는 추가 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 8A 및 8B에서와 같이, TM4SF19과 Grp78 유전자 발현은 고지방 식이 (HF)에서 정상식이 (ND) 보다 증가하고 고지방 식이+태음조위탕 (HFD-T)에 의해 감소됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5. TM4SF19 과 Grp78 의 결합 확인
지방세포 분화 전 (D0)과 지방세포 분화 후 (D7)의 TM4SF19과 Grp78의 세포내 (endogenous) 결합을 확인하였다.
구체적으로, 세포 내 TM4SF19과 Grp78의 결합을 확인하기 위하여 TM4SF19 과발현 세포의 단백질을 분화 전과 후로 나누어 분리한 후 HA로 면역 침강 반응을 수행하였다. 수득된 단백질은 Grp78 항체(N-20, Santa Cruz Biotech)를 사용하여 면역 블롯팅하였다. TM4SF19와 Grp78의 In vitro 결합을 확인하기 위하여 3HA-TM4SF19과 flag-Grp78을 293T 세포(ATCC)에 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine: PEI)을 전달체로 이용하여 형질주입(transfection)하였다. 이후 항-Flag 항체(M2, Sigma)를 이용하여 면역 침강하고, 그 수득물을 항-HA 항체(Y-11 Santa Cruz Biotech)로 확인하였다.
그 결과, 도 9A에서 보이는 바와 같이 세포 분화 후에 두 단백질의 결합이 확인되었다. 또한, 도 9B에서 보이는 바와 같이 두 단백질을 293T에 과발현시킨 후에 in vitro 결합을 확인한 결과 두 단백질이 결합함을 알 수 있었다.
실시예 6. TM4SF19 과 Grp78 의 결합 부위 확인
TM4SF19은 4개의 막 관통 도메인(transmbrane domain)으로 구성되어 있고, 아직 달리 알려진 도메인은 없다. 이를 기준으로 TM4SF19과 Grp78의 결합 부위를 확인하기 위하여, 도 10과 같이 N-말단에 GST가 표지된 4종(A, B, C 및 D)의 TM4SF19 도메인 결실 돌연변이를 제조하였다.
구체적으로, 3HA-TM4SF19를 템플레이트로 하여 하기 표 4의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 원하는 TM4SF19 도메인 결실 돌연변이를 제조하였다. N-말단에는 GST가 표지된 벡터(pGEX-2T, Smith and Johnson, Gene 67:31, (1988))에 적절한 효소로 잘라 붙여서 클로닝하였다.
　 　 서열 제한효소
인간 TM4SF19 전장 정방향 GATCGGATCCGTGTCCTCTCCCTGCACGCA (서열번호 17) BamHI
　 역방향 GATCGCGGCCGCTCACTTCTCGCAGAGGCTGC (서열번호 18) NotI
인간 TM4SF19 D1 정방향 GATCGGATCCGTGTCCTCTCCCTGCACGCA (서열번호 19) BamHI
　 역방향 GATCGCGGCCGCCTACCTCAACAGGTAGGTGACA (서열번호 20) NotI
인간 TM4SF19 D2 정방향 GATCGGATCCGTGTCCTCTCCCTGCACGCA (서열번호 21) BamHI
　 역방향 GATCGCGGCCGCCTAACTGAAGCAGCCGTATCTC (서열번호 22) NotI
인간 TM4SF19 D3 정방향 GATCGGATCCATGAAGAGTGGGCTCTGTCGAAG (서열번호 23) BamHI
　 역방향 GATCGCGGCCGCTCACTTCTCGCAGAGGCTGC (서열번호 24) NotI
인간 TM4SF19 D4 정방향 GATCGGATCCATGCTGTATGACCGTTCGCTCTG (서열번호 25) BamHI
　 역방향 GATCGCGGCCGCTCACTTCTCGCAGAGGCTGC (서열번호 26) NotI
그 결과, 도 11과 같이 TM4SF19 야생형, C 및 D 돌연변이가 Grp78과 결합하는 것이 관찰되었다. 따라서, 막 관통 도메인 d 및 이의 링커 지역이 상기 TM4SF19 및 Grp78 두 단백질의 결합에 필요한 부분임을 확인할 수 있었다.
실시예 7. Grp78 을 통한 TM4SF19 의 지방세포 분화 확인
TM4SF19 과발현이 지방세포 분화를 증가시키는 메커니즘을 확인하기 위하여 TM4SF19이 과발현된 세포주에 하기 표 5에 나타난 마우스 siRNA를 첨가하여 RNA 간섭(RNA interference)을 유발함으로써 Grp78의 발현을 억제시켰다.
구체적으로, GRP78 siRNA와 형질주입을 용이하게 해주는 용액인 Invitrogene사의 Lipofectamine RNAiMAX를 판매사에서 제시하는 방식대로 반응시켜 결합체를 형성시키고, 이를 TM4SF19 과발현 NIH-3T3 L1세포주에 처리하여 siRNA에 의한 GRP78의 발현 억제를 유도하였다. Grp78의 발현 억제 정도는 실시간 qPCR로 확인하였다.
GRP78-siRNA-1 CCGTACATTCAAGTTGATATT (서열번호 27)
AATATCAACTTGAATGTACGG (서열번호 28)
GRP78-siRNA-2 CCCTTACACTTGGTATTGAAA (서열번호 29)
TTTCAATACCAAGTGTAAGGG (서열번호 30)
상기 세포주의 지방세포 분화 능력을 확인한 결과, 도 12와 같이 대조군에 비해 지방세포 분화 능력이 감소함을 알 수 있었다. 따라서, TM4SF19이 Grp78을 통하여 지방세포 분화를 증가시키는 것임을 알 수 있었다.
실시예 8. TM4SF19 프로모터 전사인자 결합부위의 확인
TM4SF19 의 프로모터 -1964 에는 지방세포 분화에 중요한 3개의 SREBP 결합 부위가 있다. 도 13과 같은 TM4SF19의 결실 프로모터 컨스터럭트를 제조하기 위해 NIH-3T3 L1 지방전구세포에서 유전체 DNA(gDNA)를 키트를 이용하여 추출하였다. 하기 표 6에 명기된 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 원하는 TM4SF19의 결실 프로모터들의 양을 증폭시켰다. 증폭시킨 TM4SF19 결실 프로모터의 끝 부위에 프로모터 분석에 많이 활용되고 발광효소(luciferease)를 가진 pGL3-basic 벡터(Promega)를 적절한 제한효소로 잘라 붙여서 클로닝하였다. 프로모터 분석을 위해 클로닝된 TM4SF19의 결실 포로모터 컨스트럭트들을 NIH-3T3 L1 세포에 PEI를 이용하여 주입하고, NIH-3T3 L1 세포의 지방분화를 유도하였다. 지방 분화가 끝난 후 세포를 용해시키고 발광효소에 반응하는 기질을 넣어 발광효소의 활성을 측정함으로써 TM4SF19 결실 프로모터의 활성을 측정하였다.
프로모터 지역 　 서열 제한효소
마우스TM4SF19 -1964~+397 정방향 GATCAGATCTGGACCCAGCACTCTCCTG (서열번호 31) BglII
역방향 GATCAAGCTTAGGAGAACAAGAAAGTGGAG(서열번호 32) HindIII
마우스TM4SF19 -802~+397 정방향 GATCAGATCTCACTCCACTTCCAGAATTTGTGA(서열번호 33) BglII
역방향 GATCAAGCTTAGGAGAACAAGAAAGTGGAG(서열번호 34) HindIII
마우스TM4SF19 -350~+397 정방향 GATCAGATCTAGAAATTCTCGGGTATTAGT(서열번호 35) BglII
역방향 GATCAAGCTTAGGAGAACAAGAAAGTGGAG(서열번호 36) HindIII
마우스TM4SF19 +173~+397 정방향 GATCAGATCTTCGCCTGGGACAGAATGATT(서열번호 37) BglII
역방향 GATCAAGCTTAGGAGAACAAGAAAGTGGAG (서열번호 38) HindIII
마우스TM4SF19 +273~+397 정방향 GATCAGATCTGCAGGACCTTCCCGACCCTG(서열번호 39) BglII
역방향 GATCAAGCTTAGGAGAACAAGAAAGTGGAG(서열번호 40) HindIII
그 결과, 도 14에서와 같이 -1964와 -802 부위의 유무에 따라 프로모터의 활성도가 큰 차이를 나타내는 것을 확인함으로써 그 프로모터 부위가 지방 분화시 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 부위에 주요하게 작용하는 전사인자를 분석해 본 결과, 지방 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 SREBP가 결합하는 부위임을 확인하였다.
따라서 상기 TM4SF19 프로모터 -1964 및 -802 사이에 결합하는 물질을 스크리닝하여 비만 치료제의 후보물질을 발굴할 수 있음을 확인하였다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> TM4SF19, a marker for diagnosing obesity, and methods using thereof <130> PN110364 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1073 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 acgtatatac agagcctccc tggccctcct ggaaagagtc ctggaaagac aaccttcagg 60 tccagccctg gagctggagg agtggagccc cactctgaag acgcagcctt tctccaggtt 120 ctgtctctcc cattctgatt cttgacacca gatgcaggat ggtgtcctct ccctgcacgc 180 aggcaagctc acggacttgc tcccgtatcc tgggactgag ccttgggact gcagccctgt 240 ttgctgctgg ggccaacgtg gcactcctcc ttcctaactg ggatgtcacc tacctgttga 300 ggggcctcct tggcaggcat gccatgctgg gaactgggct ctggggagga ggcctcatgg 360 tactcactgc agctatcctc atctccttga tgggctggag atacggctgc ttcagtaaga 420 gtgggctctg tcgaagcgtg cttactgctc tgttgtcagg tggcctggct ttacttggag 480 ccctgatttg ctttgtcact tctggagttg ctctgaaaga tggtcctttt tgcatgtttg 540 atgtttcatc cttcaatcag acacaagctt ggaaatatgg ttacccattc aaagacctgc 600 atagaattat ctgtatgacc gttcgctctg gaactccgtc tgcctggagc cctctgcagc 660 tgttgtctgg cacgtgtccc tcttctccgc ccttctgtgc atcagcctgc tccagcttct 720 cctggtggtc gttcatgtca tcaacagcct cctgggcctt ttctgcagcc tctgcgagaa 780 gtgacaggca gaaccttcac ttgcaagcat gggtgttttc atcatcggct gtcttgaatc 840 ctttctacaa ggagtgggta cgaattataa acaaacttcc cctttaggta tccctggagt 900 aataatgaca acaaaattca ctgcaggtcg gtggaatgat agaatgcatt ttaaatcaca 960 ttgtaaactt ccaggtgatc catggatagg ataaataact aagttattat aattgtttag 1020 gaatttatag tccataaaat atcctccagc cagggaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1073 <210> 2 <211> 999 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 acgtatatac agagcctccc tggccctcct ggaaagagtc ctggaaagac aaccttcagg 60 tccagccctg gagctggagg agtggagccc cactctgaag acgcagcctt tctccaggtt 120 ctgtctctcc cattctgatt cttgacacca gatgcaggat ggtgtcctct ccctgcacgc 180 aggcaagctc acggacttgc tcccgtatcc tgggactgag ccttgggact gcagccctgt 240 ttgctgctgg ggccaacgtg gcactcctcc ttcctaactg ggatgtcacc tacctgttga 300 ggggcctcct tggcaggcat gccatgctgg gaactgggct ctggggagga ggcctcatgg 360 tgcttactgc tctgttgtca ggtggcctgg ctttacttgg agccctgatt tgctttgtca 420 cttctggagt tgctctgaaa gatggtcctt tttgcatgtt tgatgtttca tccttcaatc 480 agacacaagc ttggaaatat ggttacccat tcaaagacct gcatagtagg aattatctgt 540 atgaccgttc gctctggaac tccgtctgcc tggagccctc tgcagctgtt gtctggcacg 600 tgtccctctt ctccgccctt ctgtgcatca gcctgctcca gcttctcctg gtggtcgttc 660 atgtcatcaa cagcctcctg ggccttttct gcagcctctg cgagaagtga caggcagaac 720 cttcacttgc aagcatgggt gttttcatca tcggctgtct tgaatccttt ctacaaggag 780 tgggtacgaa ttataaacaa acttcccctt taggtatccc tggagtaata atgacaacaa 840 aattcactgc aggtcggtgg aatgatagaa tgcattttaa atcacattgt aaacttccag 900 gtgatccatg gataggataa ataactaagt tattataatt gtttaggaat ttatagtcca 960 taaaatatcc tccagccagg gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 999 <210> 3 <211> 1077 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 acgtatatac agagcctccc tggccctcct ggaaagagtc ctggaaagac aaccttcagg 60 tccagccctg gagctggagg agtggagccc cactctgaag acgcagcctt tctccaggtt 120 ctgtctctcc cattctgatt cttgacacca gatgcaggat ggtgtcctct ccctgcacgc 180 aggcaagctc acggacttgc tcccgtatcc tgggactgag ccttgggact gcagccctgt 240 ttgctgctgg ggccaacgtg gcactcctcc ttcctaactg ggatgtcacc tacctgttga 300 ggggcctcct tggcaggcat gccatgctgg gaactgggct ctggggagga ggcctcatgg 360 tactcactgc agctatcctc atctccttga tgggctggag atacggctgc ttcagtaaga 420 gtgggctctg tcgaagcgtg cttactgctc tgttgtcagg tggcctggct ttacttggag 480 ccctgatttg ctttgtcact tctggagttg ctctgaaaga tggtcctttt tgcatgtttg 540 atgtttcatc cttcaatcag acacaagctt ggaaatatgg ttacccattc aaagacctgc 600 atagtaggaa ttatctgtat gaccgttcgc tctggaactc cgtctgcctg gagccctctg 660 cagctgttgt ctggcacgtg tccctcttct ccgcccttct gtgcatcagc ctgctccagc 720 ttctcctggt ggtcgttcat gtcatcaaca gcctcctggg ccttttctgc agcctctgcg 780 agaagtgaca ggcagaacct tcacttgcaa gcatgggtgt tttcatcatc ggctgtcttg 840 aatcctttct acaaggagtg ggtacgaatt ataaacaaac ttccccttta ggtatccctg 900 gagtaataat gacaacaaaa ttcactgcag gtcggtggaa tgatagaatg cattttaaat 960 cacattgtaa acttccaggt gatccatgga taggataaat aactaagtta ttataattgt 1020 ttaggaattt atagtccata aaatatcctc cagccaggga aaaaaaaaaa aaaaaaa 1077 <210> 4 <211> 1257 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 4 gagcccagat ggtacaagga aggatgacac agccggatgg agcagctgat gtggaaaggg 60 cgctggtggc agaggaggct gagggactgc tcctgggtgc atcagtgact cactaagacc 120 gttgagcttg tgagtccatg tgtccttcct tggaatcaca tgaaagtgag cagagaatga 180 gtgggtcacg agcacaggct tcgcctggga cagaatgatt tttcagtgga ggcccgtggg 240 cagctgtgga cacccacgcc cactcgagtt cacatgaata cccaggcaac cgctacatat 300 gcaggacctt cccgaccctg caagcctagc cggctggggc tgcccgaggg gccaaggtcc 360 attttgaaga gtgtctcctc cactttcttg ttctcctatc ctgattcttg ccatcacaaa 420 caggatgctg tccttttccc gtgtggtgaa ctgctcacgg acctgttctc gcttcctggg 480 actgagtctg gggaccgcat ccctgtgtgc tgctggtgcc aacatcgcgc tcctctttcc 540 taactgggat gtgacctacc tgatgagggg cctcattggc aagcatgcca tgctgggctc 600 tgggctctgg ggaggaggcc tcatggttct cctggcagcc accctcatct ccatgacagg 660 cagcttcagt aagagtgcac cctgcctgca ggtgctcatt gctcttttgt caagtggcct 720 ggctctgctt ggggctgtga tttgctttgt cacttctgga gtagccttga aagatggtcc 780 cttttgcatg tttgatgtct catccttcaa tcagacacaa gcttggaaat tcggctatcc 840 ctttaaagat ctacacaaca ggaattatct gtatgaccgt tcactttgga cctccgtttg 900 cctggagccc tctaaggctg tggtttggca cgtggccttc ttctccatcc tcctgtgtat 960 cagcctcctc cagcttctct tggtggccat ccatcttgtc aatagcatcc tcggcctgtt 1020 ctgcagcttc tgtgagaagc actaggtaac ggatgccctc tcgtgaattg gcgcgctcag 1080 gacaagcttc ccccaacctt ttctgcaaga ataggctgtg aatccccttt agaccttctt 1140 ataggatgac agggctgcct tgctcacagc aacaaagtca tgctgctgta taaatgatct 1200 cagttcaacc ccttaaaaac ctcataaaag ggctggagga atggctcaga ggttgag 1257 <210> 5 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Val Ser Ser Pro Cys Thr Gln Ala Ser Ser Arg Thr Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ile Leu Gly Leu Ser Leu Gly Thr Ala Ala Leu Phe Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Asn Val Ala Leu Leu Leu Pro Asn Trp Asp Val Thr Tyr Leu Leu Arg 35 40 45 Gly Leu Leu Gly Arg His Ala Met Leu Gly Thr Gly Leu Trp Gly Gly 50 55 60 Gly Leu Met Val Leu Thr Ala Ala Ile Leu Ile Ser Leu Met Gly Trp 65 70 75 80 Arg Tyr Gly Cys Phe Ser Lys Ser Gly Leu Cys Arg Ser Val Leu Thr 85 90 95 Ala Leu Leu Ser Gly Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu Ile Cys Phe 100 105 110 Val Thr Ser Gly Val Ala Leu Lys Asp Gly Pro Phe Cys Met Phe Asp 115 120 125 Val Ser Ser Phe Asn Gln Thr Gln Ala Trp Lys Tyr Gly Tyr Pro Phe 130 135 140 Lys Asp Leu His Arg Ile Ile Cys Met Thr Val Arg Ser Gly Thr Pro 145 150 155 160 Ser Ala Trp Ser Pro Leu Gln Leu Leu Ser Gly Thr Cys Pro Ser Ser 165 170 175 Pro Pro Phe Cys Ala Ser Ala Cys Ser Ser Phe Ser Trp Trp Ser Phe 180 185 190 Met Ser Ser Thr Ala Ser Trp Ala Phe Ser Ala Ala Ser Ala Arg Ser 195 200 205 Asp Arg Gln Asn Leu His Leu Gln Ala Trp Val Phe Ser Ser Ser Ala 210 215 220 Val Leu Asn Pro Phe Tyr Lys Glu Trp Val Arg Ile Ile Asn Lys Leu 225 230 235 240 Pro Leu <210> 6 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Val Ser Ser Pro Cys Thr Gln Ala Ser Ser Arg Thr Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ile Leu Gly Leu Ser Leu Gly Thr Ala Ala Leu Phe Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Asn Val Ala Leu Leu Leu Pro Asn Trp Asp Val Thr Tyr Leu Leu Arg 35 40 45 Gly Leu Leu Gly Arg His Ala Met Leu Gly Thr Gly Leu Trp Gly Gly 50 55 60 Gly Leu Met Val Leu Thr Ala Leu Leu Ser Gly Gly Leu Ala Leu Leu 65 70 75 80 Gly Ala Leu Ile Cys Phe Val Thr Ser Gly Val Ala Leu Lys Asp Gly 85 90 95 Pro Phe Cys Met Phe Asp Val Ser Ser Phe Asn Gln Thr Gln Ala Trp 100 105 110 Lys Tyr Gly Tyr Pro Phe Lys Asp Leu His Ser Arg Asn Tyr Leu Tyr 115 120 125 Asp Arg Ser Leu Trp Asn Ser Val Cys Leu Glu Pro Ser Ala Ala Val 130 135 140 Val Trp His Val Ser Leu Phe Ser Ala Leu Leu Cys Ile Ser Leu Leu 145 150 155 160 Gln Leu Leu Leu Val Val Val His Val Ile Asn Ser Leu Leu Gly Leu 165 170 175 Phe Cys Ser Leu Cys Glu Lys 180 <210> 7 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Val Ser Ser Pro Cys Thr Gln Ala Ser Ser Arg Thr Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ile Leu Gly Leu Ser Leu Gly Thr Ala Ala Leu Phe Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Asn Val Ala Leu Leu Leu Pro Asn Trp Asp Val Thr Tyr Leu Leu Arg 35 40 45 Gly Leu Leu Gly Arg His Ala Met Leu Gly Thr Gly Leu Trp Gly Gly 50 55 60 Gly Leu Met Val Leu Thr Ala Ala Ile Leu Ile Ser Leu Met Gly Trp 65 70 75 80 Arg Tyr Gly Cys Phe Ser Lys Ser Gly Leu Cys Arg Ser Val Leu Thr 85 90 95 Ala Leu Leu Ser Gly Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu Ile Cys Phe 100 105 110 Val Thr Ser Gly Val Ala Leu Lys Asp Gly Pro Phe Cys Met Phe Asp 115 120 125 Val Ser Ser Phe Asn Gln Thr Gln Ala Trp Lys Tyr Gly Tyr Pro Phe 130 135 140 Lys Asp Leu His Ser Arg Asn Tyr Leu Tyr Asp Arg Ser Leu Trp Asn 145 150 155 160 Ser Val Cys Leu Glu Pro Ser Ala Ala Val Val Trp His Val Ser Leu 165 170 175 Phe Ser Ala Leu Leu Cys Ile Ser Leu Leu Gln Leu Leu Leu Val Val 180 185 190 Val His Val Ile Asn Ser Leu Leu Gly Leu Phe Cys Ser Leu Cys Glu 195 200 205 Lys <210> 8 <211> 206 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Leu Ser Phe Ser Arg Val Val Asn Cys Ser Arg Thr Cys Ser Arg 1 5 10 15 Phe Leu Gly Leu Ser Leu Gly Thr Ala Ser Leu Cys Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Asn Ile Ala Leu Leu Phe Pro Asn Trp Asp Val Thr Tyr Leu Met Arg 35 40 45 Gly Leu Ile Gly Lys His Ala Met Leu Gly Ser Gly Leu Trp Gly Gly 50 55 60 Gly Leu Met Val Leu Leu Ala Ala Thr Leu Ile Ser Met Thr Gly Ser 65 70 75 80 Phe Ser Lys Ser Ala Pro Cys Leu Gln Val Leu Ile Ala Leu Leu Ser 85 90 95 Ser Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Val Ile Cys Phe Val Thr Ser Gly 100 105 110 Val Ala Leu Lys Asp Gly Pro Phe Cys Met Phe Asp Val Ser Ser Phe 115 120 125 Asn Gln Thr Gln Ala Trp Lys Phe Gly Tyr Pro Phe Lys Asp Leu His 130 135 140 Asn Arg Asn Tyr Leu Tyr Asp Arg Ser Leu Trp Thr Ser Val Cys Leu 145 150 155 160 Glu Pro Ser Lys Ala Val Val Trp His Val Ala Phe Phe Ser Ile Leu 165 170 175 Leu Cys Ile Ser Leu Leu Gln Leu Leu Leu Val Ala Ile His Leu Val 180 185 190 Asn Ser Ile Leu Gly Leu Phe Cys Ser Phe Cys Glu Lys His 195 200 205 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 forward primer <400> 9 ggctgtgatt tgctttgtca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 reverse primer <400> 10 agctggagga ggctgataca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 forward primer <400> 11 tatcctggga ctgagccttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 reverse primer <400> 12 cttcgacaga gcccactctt 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBP alpha forward primer <400> 13 gtgtgcacgt ctatgctaaa cca 23 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBP alpha reverse primer <400> 14 gccgttagtg aagagtctca gtttg 25 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma forward primer <400> 15 cgctgatgca ctgcctatga 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma reverse primer <400> 16 agaggtccac agagctgatt cc 22 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 full forward primer <400> 17 gatcggatcc gtgtcctctc cctgcacgca 30 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 full reverse primer <400> 18 gatcgcggcc gctcacttct cgcagaggct gc 32 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 D1 forward primer <400> 19 gatcggatcc gtgtcctctc cctgcacgca 30 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 D1 reverse primer <400> 20 gatcgcggcc gcctacctca acaggtaggt gaca 34 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 D2 forward primer <400> 21 gatcggatcc gtgtcctctc cctgcacgca 30 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 D2 reverse primer <400> 22 gatcgcggcc gcctaactga agcagccgta tctc 34 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 D3 forward primer <400> 23 gatcggatcc atgaagagtg ggctctgtcg aag 33 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 D3 reverse primer <400> 24 gatcgcggcc gctcacttct cgcagaggct gc 32 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 D4 forward primer <400> 25 gatcggatcc atgctgtatg accgttcgct ctg 33 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human TM4SF19 D4 reverse primer <400> 26 gatcgcggcc gctcacttct cgcagaggct gc 32 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78-siRNA-1 <400> 27 ccgtacattc aagttgatat t 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78-siRNA-1 <400> 28 aatatcaact tgaatgtacg g 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78-siRNA-2 <400> 29 cccttacact tggtattgaa a 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78-siRNA-2 <400> 30 tttcaatacc aagtgtaagg g 21 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter forward primer -1964~+397 <400> 31 gatcagatct ggacccagca ctctcctg 28 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter reverse primer -1964~+397 <400> 32 gatcaagctt aggagaacaa gaaagtggag 30 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter forward primer -802~+397 <400> 33 gatcagatct cactccactt ccagaatttg tga 33 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter reverse primer -802~+397 <400> 34 gatcaagctt aggagaacaa gaaagtggag 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter forward primer -350~+397 <400> 35 gatcagatct agaaattctc gggtattagt 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter reverse primer -350~+397 <400> 36 gatcaagctt aggagaacaa gaaagtggag 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter forward primer +173~+397 <400> 37 gatcagatct tcgcctggga cagaatgatt 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter reverse primer +173~+397 <400> 38 gatcaagctt aggagaacaa gaaagtggag 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter forward primer +273~+397 <400> 39 gatcagatct gcaggacctt cccgaccctg 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TM4SF19 promoter reverse primer +273~+397 <400> 40 gatcaagctt aggagaacaa gaaagtggag 30

Claims (14)

  1. TM4SF19 단백질의 막 관통 도메인 d 또는 이의 링커 지역에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드를 포함하는 비만 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 TM4SF19 단백질은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  3. 삭제
  4. 청구항 1 또는 2의 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 비만 진단용 키트.
  5. 개체로부터 분리된 시료와 TM4SF19 단백질의 막 관통 도메인 d 또는 이의 링커 지역에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 TM4SF19의 발현양을 측정하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 발현양의 측정은 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅, 및 DNA 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 발현양의 측정은 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 또는 단백질 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 시료는 개체의 지방전구세포 또는 지방세포를 포함하는 것인 방법.
  9. TM4SF19의 프로모터 핵산서열을 포함하는 시료에 시험물질을 가하는 단계;
    상기 시료에서 TM4SF19의 프로모터의 활성을 측정하는 단계; 및
    상기 TM4SF19의 프로모터의 활성이 대조군에 비해 감소하는 시험물질을 선택하는 단계를 포함하는 비만 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 프로모터 핵산서열은 TM4SF19 단백질을 코딩하는 서열의 5' 말단으로부터 -802 내지 -1964 서열인 것인 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. TM4SF19 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 시료에 시험물질을 가하는 단계;
    상기 시료에서 TM4SF19 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 핵산서열과 복합체를 형성하여 TM4SF19 단백질의 기능을 저해하거나 TM4SF19 단백질의 발현을 저해하는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 시험물질은 TM4SF19의 막 관통 도메인 d 또는 이의 링커 지역에 결합하는 것인 방법.
  13. TM4SF19 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 시료에 시험물질을 가하는 단계;
    상기 시료에서 TM4SF19 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 핵산서열과 복합체를 형성하여 TM4SF19 단백질의 기능을 저해하거나 TM4SF19 단백질의 발현을 저해하는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 시험물질은 TM4SF19 단백질과 Grp78 단백질의 결합을 저해하는 것인 방법.
  14. TM4SF19 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 시료에 시험물질을 가하는 단계;
    상기 시료에서 TM4SF19 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 핵산서열과 복합체를 형성하여 TM4SF19 단백질의 기능을 저해하거나 TM4SF19 단백질의 발현을 저해하는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 시험물질은 지방전구세포의 분화를 저해하는 것인 방법.
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