KR101587227B1 - 근위축증 진단용 바이오마커, 그 마커의 발현수준 측정에 의한 근위축증 진단용 약학 조성물, 및 그 마커를 이용한 근위축증 치료용 후보약물을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 근위축증 진단용 바이오마커, 그 바이오마커의 발현수준을 측정하기 위한 근위축증 진단용 약학 조성물, 그 조성물을 포함하는 키트, 근위축증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 바이오마커의 발현수준을 측정하는 방법, 및 상기 바이오마커의 발현수준 측정을 통해 근위축증 치료용 후보약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

근위축증 진단용 바이오마커, 그 마커의 발현수준 측정에 의한 근위축증 진단용 약학 조성물, 및 그 마커를 이용한 근위축증 치료용 후보약물을 스크리닝하는 방법{A biomarker for diagnosing muscular dystrophies, a pharmaceutical composition for diagnosing muscular dystrophies by measuring the expression level of the biomarker, and a method for screening candidates for treating muscular dystrophies using the marker}

본 발명은 근위축증 진단용 바이오마커, 그 바이오마커를 이용한 근위축증 진단용 약학 조성물 및 근위축증 치료용 약물의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 근위축증 발생 시 그 발현이 변화하여 근위축증 여부를 확인할 수 있는 바이오마커, 그 바이오마커의 발현을 측정할 수 있는 근위축증 진단용 약학 조성물, 그 조성물을 포함한 근위축증 진단용 키트, 그 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하는 근위축증 진단방법, 및 그 바이오마커의 발현을 억제하는 후보약물을 선택하는 근위축증 치료용 약물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

근육줄기세포(muscle satellite cells)는 근다발(muscle bundle)에 붙어서 존재하고 있으며, 근육의 손상이 발생했을 경우 손상된 부위로 이동, 분화하여 손상을 복구하는 것으로 알려져 있다. 현재 휴지상태 근육줄기세포(quiescent satellite cells)의 증식 및 활성은 손상된 근육에서 발생되는 여러 가지의 성장인자(growth factor)들에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 근육 손상부위로 이동된 근육줄기세포는 근아세포(myoblast)로 분화하고, 근아세포는 순차적으로 근세포, 근섬유로 분화하는 것으로 알려져 있으며, 도 1에 이러한 과정의 흐름도를 나타내었다.

근육줄기세포의 분화시 발현되는 단백질은 미오게닌(myogenin)이 가장 대표적이다. 미오게닌은 근육줄기세포에서는 발현되지 않으며 분화시 근섬유(myotube) 상태가 되었을 때 발현된다. 따라서, 미오게닌은 근육줄기세포의 분화 마커로 사용되고 있다.

그러나, 근육의 위축 증세(muscle atrophy)가 시작되면 미오게닌이 과잉발현되기 시작한다. 미오게닌의 과잉발현으로 인해서 E3 리가제(E3 ligase)의 일종인 MuRF-1과 atrogin-1의 발현이 증가하여 근육의 미오신 헤비체인(Myosin heavy chain)을 분해시킴으로써 근육의 크기가 줄어드는 근육위축증이 발생하게 되는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1).

따라서, 미오게닌, MuRF-1, 및 atrogin-1의 과잉발현은 근육위축증을 대변하게 되므로, 이러한 단백질의 발현을 촉진시키는 조절자는 근위축증 진단의 바이오마커로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 미오게닌 증가에 의한 근위축증 치료 약물을 탐색하기 위한 타겟이 될 수 있을 것으로 보인다. 이러한 마커의 개발은 근위축증을 진단하고 질병 치료를 위한 약물의 개발을 위해 매우 중요하다.

1. Clarke BA, Drujan D, Willis MS, Murphy LO, Corpina RA, Burova E, Rakhilin SV, Stitt TN, Patterson C, Latres E, Glass DJ.The E3 Ligase MuRF1 degrades myosin heavy chain protein in dexamethasone-treated skeletal muscle. Cell Metab. 2007,6:376-85.

본 발명의 목적은 근위축증 진단에 사용될 수 있는 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 근위축증의 진단에 사용될 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 근위축증의 진단에 사용될 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 근위축증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 바이오마커의 발현수준을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오마커의 발현수준 측정을 이용한 근위축증 치료용 후보약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면은

정상인에 비해 근아세포에서 발현이 증가하는 것으로서, Fbxw7 베타를 포함하는 근위축증 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 측면은

Fbxw7 베타 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 Fbxw7 베타 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 상기 Fbxw7 베타의 발현수준 측정에 의한 근위축증 진단용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은

상기 근위축증 진단용 약학 조성물을 포함하는 근위축증 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은

근위축증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 근아세포로부터 Fbxw7 베타의 발현수준을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은

근아세포를 시료로 처리하는 단계;

상기 처리된 근아세포 중의 Fbxw7 베타의 발현수준을 측정하는 단계; 및

상기 Fbxw7 베타의 발현수준이 대조군의 Fbxw7 베타의 발현수준에 비해 감소하는 시료를 선택하는 단계를 포함하는

근위축증 치료용 후보약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명자들은 근위축증의 진단 등을 예측할 수 있는 바이오마커의 개발을 위해 연구하였다. 그 결과, 근육줄기세포의 정상적인 분화 시에는 초기 분화단계에서 Fbxw7 베타의 발현양이 증가하여 소량 존재하다가, 분화가 진행됨에 따라 Fbxw7 베타의 발현양이 줄어들다가 완전히 사라지는 것을 확인하였다(실시예 1). 이에 반해, 근아세포에서 Fbxw7 베타가 과잉 발현 시, 근위축증에서 증가하는 것으로 공지되어 있는 미오게닌이 증가하고, 순차적으로 atrogin-1 및 MuRF-1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 2 및 3). 또한, Fbxw7 베타가 과잉 발현된 근아세포를 배양한 결과, 근아세포의 분화력이 현저히 감소하여 다핵세포를 못이루는 현상을 보여주어, 실제로 근위축증의 현상이 나타나는 것으로 확인되었다(실시예 4). 이러한 결과로부터, 도 7에 나타낸 바와 같이, 근육줄기세포 분화 시 정상인 Fbxw7의 발현이 이루어지지 않고 근아세포 단계에서 비정상적인 Fbxw7 베타의 과잉발현이 이루어질 경우, 근위축증에서 증가하는 미오게닌, atrogin-1 및 MuRF-1의 발현이 증가하고 실제로 근아세포의 분화가 이루어지지 않아, 근육위축증이 나타나는 것으로 밝혀졌다.

즉, 본 발명자들은 Fbxw7 베타는 근위축증 진단의 바이오마커로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 미오게닌 증가를 수반하는 근위축증 치료의 타겟 유전자로서 사용될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, 정상인에 비해 근아세포에서 발현이 증가하는 것으로서, Fbxw7 베타의 근위축증을 진단하기 위한 바이오마커로서의 용도를 제공한다.

용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것이다. 본 발명에서의 진단은 근위축증의 여부 및/또는 그 정도를 확인하는 것이다.

용어 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 시험군을 정상 대조군의 조직과 비교하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비해 환자군에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서의 근위축증을 진단하기 위한 마커는 정상 대조군의 근아세포 조직에 비하여, 근위축증 환자의 조직에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 Fbxw7 베타(F-box/WD repeat-containing protein 7 β) 및 이를 코딩하는 유전자이다.

용어 "근위축증"은 미오게닌, atrogin-1, 및 MuRF-1이 과잉발현되는 것으로 공지된 임의의 근위축증을 포함하며, 구체적으로는 노화 (aging), 탈신경화 (denervation), 당뇨 또는 암과 같은 여러 가지 질병에 의해 발생하는 근위축증에서 미오게닌, atrogin-1, 및 MuRF-1등이 증가하는 것으로 보고되어 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

Fbxw7 베타 단백질은 인간 및 마우스의 Fbxw7 베타 단백질을 포괄하는 의미이며, 그 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnical Information)에 등록되어 있다[마우스 Gene ID: NM_080428.3(SEQ ID NO: 1), NP_536353.2(SEQ ID NO: 2); 인간 Gene ID: NM_018315(SEQ ID NO: 3), NP_060785.2(SEQ ID NO: 4)].

상기 근위축증 시 정상인에 비해 발현의 정도가 증가하는 Fbxw7 베타 단백질 마커의 발현수준을 측정함으로써 근위축증 발병 여부 및 정도를 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 측면에 있어서,

Fbxw7 베타의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근위축증 진단용 약학 조성물을 제공한다.

용어 "Fbxw7 베타의 발현수준을 측정하는 제제"란 근위축증 환자에서 증가하는 마커인 Fbxw7 베타 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출 및/또는 정량에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 일 구현예에 따르면 마커에 특이적인 항체, 그 항체의 항원결합단편, 프라이머, 또는 프로브를 의미한다.

Fbxw7 베타 단백질의 발현 수준은 Fbxw7 베타 단백질의 발현양 또는 Fbxw7 베타 유전자의 mRNA 발현양을 측정함으로서 알 수 있다.

상기 단백질의 발현양을 측정하는 제제는 일 구현예에 따르면, 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그 항체의 항원결합단편 이다.

용어 "단백질 발현양 측정"이란 근위축증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 근위축증 진단 유전자에서 발현된 단백질의 발현양을 확인하는 과정으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원결합단편을 이용하여 단백질의 발현량을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.

용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 근위축증 진단 마커인 Fbxw7 베타에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, Fbxw7 베타 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 Fbxw7 베타 유전자에 의해 코딩되는 Fbxw7 베타 단백질을 얻고, 얻어진 Fbxw7 베타 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

용어 "항체의 항원결합단편"이란 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편을 의미하며, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다. 상기 항원결합단편은 최소한 7개 이상의 아미노산, 바람직하게는 9 개 이상의 아미노산, 보다 바람직하는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.

Fbxw7 베타 유전자의 mRNA 발현양을 측정하는 제제는 일 구현에에 따르면 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, Fbxw7 베타 유전자의 핵산 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라미어 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

용어 "mRNA 발현양 측정"이란 근위축증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 근위축증 마커 유전자의 mRNA 발현정도를 확인하는 과정으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.

용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 마커 Fbxw7 베타의 mRNA의 센스 및 안티센스 파라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 근위축증을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

용어 "프로브"란 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 함량(발현량)을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 근위축증 마커인 Fbxw7 베타 유전자의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현양을 측정함으로써 근위축증 여부 및 정도를 측정할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

상기 Fbxw7 베타 단백질 및 그 유전자의 mRNA 발현량은 근위축증 환자의 근아세포에서 특이적으로 증가하므로, 상기 본 발명에 따른 근위축증 진단용 조성물은 근위축증이 의심되는 환자의 근아세포에서의 Fbxw7 베타 단백질 발현 수준을 측정하는데 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 근위축증 진단용 약학 조성물을 포함하는, 근위축증 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 근위축증 진단용 키트는 근위축증 진단 마커인 Fbxw7 베타 단백질의 발현수준을 그 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현양을 측정함으로써 근위축증을 진단할 수 있다. 본 발명의 근위축증 진단용 키트는 앞서 설명한 Fbxw7 베타 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제, 즉 Fbxw7 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항체의 면역결합단편, Fbxw7 베타 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 이들의 조합을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 Fbxw7 베타 단백질 발현수준을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발명의 근위축증 진단용 키트는 Fbxw7 베타 단백질의 mRNA의 발현양을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

다른 구현예에 따르면, 본 발명의 근위축증 진단용 키트는 Fbxw7 베타 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 단백질 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현양을 측정할 수 있는, 근위축증 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 근위축증 진단용 마이크로어레이는 상기 본 발명의 마커를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 일 구현예에 따르면 상기 Fbxw7 베타 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서,

근위축증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 근아세포를 포함한 시료로부터 Fbxw7 베타의 발현수준을 측정하는 방법을 제공한다.

용어 "환자"는 근위축증이 의심되는 개체를 의미하고, 근위축증에 의해 Fbxw7 베타 단백질의 발현이 변화하는 임의의 개체를 포함하며, 바람직하게는 인간, 또는 마우스를 포함한 설치류일 수 있다.

용어 "환자의 근아세포를 포함한 시료"란 근아세포를 포함한 임의의 조직 또는 세포와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 Fbxw7 베타 단백질의 발현수준은 Fbxw7 베타 단백질의 발현양 또는 Fbxw7 베타 유전자의 mRNA 발현양을 측정함으로서 알 수 있다. 환자의 시료로부터 단백질 또는 mRNA를 분리하는 것은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 적절히 수행할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 환자의 근육 조직을 단백질 추출용 버퍼 또는 핵산 추출용 버퍼로 균질화한 다음 원심분리후 얻어진 상등액을 환자의 시료로서 사용할 수 있다.

상기 근위축증 진단을 위한 방법에 따르면, 환자의 시료 및 정상 대조군의 Fbxw7 베타 단백질의 발현양을 비교함으로써, 근위축증을 진단할 수 있다. 구체적으로는, 근위축증이 의심되는 환자의 시료에서 Fbxw7 베타 단백질의 발현수준을 측정하고, 정상 대조군의 Fbxw7 베타 단백질의 발현수준을 측정하고 비교하여 환자의 시료에서 Fbxw7 베타 단백질의 발현수준이 더 증가하는 정도에 따라 근위축증 여부 및 그 정도를 측정할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 근아세포에서 Fbxw7 베타가 과잉 발현 시, 근위축증에서 증가하는 것으로 공지되어 있는 미오게닌, 아트로진-1, 및 MuRF-1의 발현이 증가하고 근위축증이 실제로 나타나는 것을 확인하였으므로, 근아세포에서 Fbxw7 베타의 발현을 억제하는 물질은 근위축증의 치료에 효과적인 후보약물이 될 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 그러므로, 미지의 물질들 중에서 Fbxw7 베타의 발현 수준을 억제하는 물질을 선택함으로써 근위축증 후보약물을 선별할 수 있다

따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서,

근아세포에 시료를 처리하는 단계;

상기 처리된 근아세포 중의 Fbxw7 베타의 발현수준을 측정하는 단계; 및

상기 Fbxw7 베타의 함량이 대조군의 Fbxw7 베타의 함량에 비해 감소하는 후보약물을 선택하는 단계를 포함하는

근위축증 치료용 후보약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 Fbxw7 베타의 발현수준은 앞서 언급한 바와 같이 Fbxw7 베타의 발현양 또는 Fbxw7 베타의 유전자의 mRNA 발현양을 측정함으로써 수행할 수 있으며, 상기 본 명세서에 기재된 Fbxw7 베타의 발현양 또는 Fbxw7 베타의 유전자의 mRNA 발현양 측정에 사용하는 방법이 그대로 적용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 근위축증을 진단할 수 있는 바이오마커를 발견하였으므로, 근위축증의 우려가 있는 환자의 근위축증을 효과적으로 진단할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 바이오마커는 근위축증에서 증가하는 현상을 나타내므로, 근위축증 치료용 후보약물의 스크리닝을 위한 타겟 유전자로서 사용될 수 있어, 근위축증 치료용 후보약물의 개발에 기여할 수 있다.

도 1은 근육손상부위 이동된 근육줄기세포가 근아세포(myoblast), 근세포, 근섬유의 순서로 분화하는 과정의 흐름도이다.
도 2는 근아세포의 분화시간에 상태에 따른 Fbxw7 베타의 유전적 발현을 PCR로 확인한 사진이다.
도 3은 Fbxw7이 과잉발현된 근아세포에서의 미오게닌의 유전적 발현을 PCR로 확인한 사진이다.
도 4는 Fbxw7이 과잉발현된 근아세포에서의 미오게닌 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.
도 5는 Fbxw7이 과잉발현된 근아세포에서의 미오게닌, 아트로진-1, 및 MuRF-1의 유전적 발현을 PCR로 확인한 사진이다.
도 6은 Fbxw7 베타가 과잉발현된 근육줄기세포를 분화배지에서 배양한 후, 분화 마커인 embyonic myosin heavy chain 항체로 면역형광염색으로 염색한 다음, 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도7은 Fbxw7 베타에 의해 조절되는 근육줄기세포 분화 메커니즘 설명한 사진이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 근육줄기세포의 분화 유도 및 Fbxw7 베타 발현 RT-PCR

마우스의 근육으로부터 전경골근 (tibialis anterior) 및 장딴지근(gastrocnemius) 부위를 획득하여 분쇄배지 (DMEM/250 unit/ml 콜라게나제 타입 II)와 섞은 후 37 ℃에서 45분 동안 배양하였다. 배양 후 끝을 부러뜨린 유리 파이펫을 사용하여 근육을 잘게 분쇄하며, 분쇄된 근육에서 잘게 잘려나온 근다발 (muscle fiber)을 수거하여 PBS (phosphate buffered saline)로 2번 세척하였다. 근다발에는 근육줄기세포 (satellite cells)들이 달려 있으므로 근다발을 성장배지 (Ham's F10/20% Horse serum/1% Penicillin-streptomycin/ 5 ng/ml basic FGF)에 섞어 매트리젤이 도장되어 있는 배양접시에서 배양하였다 (배양조건 37 ℃, 5% CO₂).

다음날 근다발로부터 분리되어져 나온 근육줄기세포를 계속 배양함으로써 근아세포(myoblast)를 수득하였다. 이러한 근아세포를 분화배지(DMEM/3% horse serum/1% Penicillin-streptomycin)에 배양한 후 1, 6, 12, 및 48 시간동안에 분화된 세포를 얻어 Fbxw7 베타의 발현을 확인하였다. 구체적으로는, 각각의 상기 분화된 세포를 트리졸(TRIzol, Invitrogen)로 용해시킨 다음, 4℃, 12000 rpm에서 20분 동안 원심분리시킨 후, RNA 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 상층액과 동량의 이소프로판올을 첨가한 후 다시 4℃, 12000 rpm에서 20분 동안 원심분리시켰다. 상층액은 버리고, 침전된 RNA에 70% 에탄올을 첨가한 후 같은 조건으로 다시 원심분리한 후 에탄올을 제거하였다. 추출된 RNA를 상온에서 건조시킨 후 DEPC water에 녹여 농도를 측정하였다. 각각의 RNA를 Takara PrimeScript를 이용하여 cDNA 합성 후, SEQ ID NO: 5 및 6의 프라이머로 PCR을 수행하여 도 2에 나타내었다.

도 2는 근아세포의 분화시간에 따른 Fbxw7 베타의 유전적 발현을 PCR로 확인한 사진이다.

도 2에서 보여지는 것과 같이 Fbxw7은 분화 1 시간째 증가하였다가 그 후 차츰 감소하여 분화가 끝난 48시간 후에는 완전히 사라지는 것을 확인하였다. 이로부터 근아세포의 분화시간에 따른 Fbxw7의 발현 정도를 확인할 수 있었다.

실시예 2: Fbxw7 베타 과잉발현에 따른 미오게닌의 발현 RT-PCR과 웨스턴블랏

Fbxw7에 의해 근아세포에서 어떤 유전자가 유도되어지는 알아보기 위해 Fbxw7 아데노바이러스를 37℃, 1시간 30 분동안 근아세포에 감염시켜 인위적으로 과잉발현 시켰다. 과잉발현된 근아세포를 실시예 1에서의 방법과 같이 mRNA를 추출하여 근아세포의 분화를 조절하는 미오게닌의 발현을 확인해 보았다. 추출한 mRNA를 Takara PrimeScript를 이용하여 cDNA 합성 후, SEQ ID NO: 7 및 8의 프라이머로 PCR을 수행하여 도 3에 나타내었다.

도 3은 Fbxw7이 과잉발현된 근아세포에서의 미오게닌의 유전적 발현을 PCR로 확인한 사진이다.

미오게닌 단백질 발현을 확인해 보기 위해 Fbxw7 과잉발현된 근아세포를 Proprep(Intron)으로 용해시켜 얼음에 20분간 방치 한 뒤, 4℃, 12000 rpm으로 원심분리하여 단백질 상층액을 얻었다. 미오게닌의 단백질 발현은 항-미오게닌 항체 (BD Pharmingen)로 검출하여 도 4에 나타내었다.

도 4는 Fbxw7이 과잉발현된 근아세포에서의 미오게닌 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.

상기 도 3 및 도 4에 따르면, 근육아세포에서의 Fbxw7의 과잉발현 시, 미오게닌의 mRNA와 단백질의 발현이 확연히 증가하는 것으로 나타났다.

실시예 3: Fbxw7 베타 과잉발현에 따른 아트로진-1, MuRF-1의 발현 RT-PCR

실시예 2에서의 근아세포이 미오게닌의 증가에 따라 하위 유전자의 발현이 어떻게 변화하는지에 대해서도 실험하였다. 아트로진-1과 MuRF-1은 근육의 위축증을 유발하는 중심유전자로서 미오게닌에 의해 유도되어진다는 것이 알려져 있다. 본 실시예 3에서는 Fbxw7에 의해 유도된 미오게닌이 아트로진-1 및 MuRF-1의 발현을 조절할 수 있는지를 확인하기 위해, 상기 실시예 2에서의 Fbxw7 베타가 과잉발현되는 근아세포로부터 실시예 1에서의 방법과 같이 mRNA를 추출하여 아트로진-1 및 MuRF-1 각각의 발현의 발현을 확인해 보았다. 추출한 아트로진-1 mRNA를 Takara PrimeScript를 이용하여 cDNA 합성 후, SEQ ID NO: 9 및 10의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 또한, 추출한 MuRF-1 mRNA를 Takara PrimeScript를 이용하여 cDNA 합성 후, SEQ ID NO: 11 및 12의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 Fbxw7이 과잉발현된 근아세포에서의 미오게닌, 아트로진-1, 및 MuRF-1의 유전적 발현을 PCR로 확인한 사진이다.

실시예 4: Fbxw7 베타 과잉발현에 따른 근아세포의 분화 억제 확인

Fbxw7 베타의 과잉발현이 미오게닌, 아트로진-1, 및 MuRF-1 유전자의 발현 조절을 통해 근아세포의 분화를 억제할 수 있는 지를 확인하기 위하여, Fbxw7 베타가 과잉발현된 근아세포를 분화배지 (DMEM/3% horse serum/1% penicillin-streptomycin)에서 72 시간 동안 배양하였다. 배양물에 대해 분화마커인 embyonic myosin heavy chain 항체로 면역형광염색으로 염색한 다음, 형광현미경으로 관찰한 사진을 도 6에 나타내었다.

도 6은 Fbxw7 베타가 과잉발현된 근육줄기세포를 분화배지에서 배양한 후, 분화 마커인 embyonic myosin heavy chain 항체로 면역형광염색으로 염색한 다음, 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 6에 따르면, Fbxw7 베타가 과잉발현된 근아세포는 분화배지에서 분화력이 현저히 줄어들어 다핵세포를 이루는 못하는 현상을 확인할 수 있다. 따라서, Fbxw7 베타가 과잉발현된 근아세포는 분화가 이루어지지 못하고, 근위축증의 병리학적 증세를 유발할 것임을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Biomarkers for predicting heart or lung damage caused by radiation exposure and a diagnosing method thereof <130> pn098217 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3728 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (163)..(2049) <400> 1 accctggact gcaccattct gtgttcaagg gaagatgtaa tctgatccct ctgctgctga 60 gggaggaatc tgttcagtca aggctttgac agggcatagt ctcctccaat aatcttgtgg 120 gttctcgctc attattcccc gagttctcct cagtggagct gc atg cgt gtg 171 Met Arg Val 1 tgc gtc ccg agc agc gtt ctg gtt ctg agc tgc gtc tgc tgg tgc tgg 219 Cys Val Pro Ser Ser Val Leu Val Leu Ser Cys Val Cys Trp Cys Trp 5 10 15 gga gtt ttg ctg ccg gtt ccg ctg cct aat ctt cct ttt ctg gcg tgc 267 Gly Val Leu Leu Pro Val Pro Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Ala Cys 20 25 30 35 ctg agc atg tcc acg tta gaa tct gtg aca tac cta cct gaa aag ggg 315 Leu Ser Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys Gly 40 45 50 tta tat tgt cag aga ctg cca agc agc cgg aca cac ggg ggc aca gaa 363 Leu Tyr Cys Gln Arg Leu Pro Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr Glu 55 60 65 tcc ctg aag ggg aaa aat aca gaa aat atg ggt ttc tac ggc aca tta 411 Ser Leu Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr Leu 70 75 80 aaa atg att ttt tac aaa atg aaa aga aag ttg gac cat ggt tct gaa 459 Lys Met Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser Glu 85 90 95 gtt cgt tcc ttt tct ttg gga aag aaa cca tgc aaa gtc tca gat tat 507 Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Asp Tyr 100 105 110 115 acc agt acc act ggc ctt gta cca tgt tca gca aca cca aca act ttt 555 Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr Phe 120 125 130 ggg gac ctg aga gca gcc aat ggg caa ggg cag cag cgg cgg agg att 603 Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg Ile 135 140 145 aca tct gtc caa cca ccc aca ggc ctt caa gag tgg ctg aaa atg ttt 651 Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met Phe 150 155 160 cag agc tgg agc gga cca gag aag ttg ctg gct tta gat gag ctc att 699 Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu Ile 165 170 175 gac agc tgt gaa cca aca caa gtg aag cat atg atg caa gtg ata gag 747 Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile Glu 180 185 190 195 ccc cag ttc cag cga gac ttc atc tcc ttg ctt cct aaa gag ttg gca 795 Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu Ala 200 205 210 ctc tat gtg ctt tca ttc ctg gaa ccc aaa gac ctg ctg caa gcg gct 843 Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ala 215 220 225 cag act tgt cga tac tgg aga att ttg gct gag gat aac ctt ctc tgg 891 Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu Trp 230 235 240 aga gag aaa tgt aaa gaa gag ggg att gat gaa ccg ttg cac atc aag 939 Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile Lys 245 250 255 aga aga aaa ata ata aaa cca ggt ttc ata cac agc cca tgg aag agt 987 Arg Arg Lys Ile Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys Ser 260 265 270 275 gcg tat atc aga cag cac aga att gat aca aac tgg aga cga gga gaa 1035 Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly Glu 280 285 290 ctc aaa tct cct aag gtg ctg aaa ggg cat gat gac cat gtg atc aca 1083 Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile Thr 295 300 305 tgc cta cag ttt tgt ggc aac cgc ata gtt agt ggt tct gat gac aac 1131 Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Asn 310 315 320 act tta aaa gtt tgg tca gcg gtc acg ggc aag tgt ctg aga acg tta 1179 Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr Leu 325 330 335 gtg gga cat aca ggt gga gtg tgg tca tca cag atg aga gac aat atc 1227 Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn Ile 340 345 350 355 atc atc agt gga tcg act gac cgg act ctc aaa gtg tgg aat gct gaa 1275 Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala Glu 360 365 370 act gga gag tgt ata cat act tta tat ggg cac act tct act gta cgg 1323 Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val Arg 375 380 385 tgt atg cat ctc cat gaa aaa agg gtt gta agc ggt tct cga gat gcc 1371 Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp Ala 390 395 400 act ctc agg gtt tgg gat att gag acc ggc cag tgt tta cac gtc ctg 1419 Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val Leu 405 410 415 atg ggt cac gta gca gcg gtc cgc tgc gtt cag tat gat ggc agg agg 1467 Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg Arg 420 425 430 435 gtt gtt agt gga gct tat gat ttt atg gtg aag gtg tgg gat cca gag 1515 Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro Glu 440 445 450 act gag acc tgt cta cac acg tta cag gga cac act aat aga gtc tat 1563 Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val Tyr 455 460 465 tca tta cag ttt gat ggc atc cat gtg gtg agt gga tct ctt gat aca 1611 Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp Thr 470 475 480 tca atc cga gtc tgg gat gtg gag aca ggg aat tgt att cac acg cta 1659 Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr Leu 485 490 495 aca gga cac cag tca tta acg agt gga atg gaa ctc aaa gac aat att 1707 Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn Ile 500 505 510 515 ctt gtc tct ggg aat gca gat tct aca gtt aag atc tgg gat atc aaa 1755 Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile Lys 520 525 530 aca gga cag tgt tta caa act ttg caa ggt ccc agc aag cat cag agc 1803 Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Ser Lys His Gln Ser 535 540 545 gct gtg acc tgc tta cag ttc aac aag aac ttc gta att acc agc tca 1851 Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser Ser 550 555 560 gac gac gga acg gtc aaa ctc tgg gac ttg aaa acg ggt gaa ttt atc 1899 Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe Ile 565 570 575 cga aac ctc gtc aca ttg gag agt ggg ggg agc ggg gga gtt gtg tgg 1947 Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Trp 580 585 590 595 cgg atc agg gcc tca aac aca aag ctg gtg tgt gca gtc ggg agt cgg 1995 Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser Arg 600 605 610 aat gga act gag gaa acc aag ctc ctg gtg ctg gac ttt gat gtg gac 2043 Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val Asp 615 620 625 atg aaa t gaaaagcaga catgatgaat tttgtccaac tgtgtagaca atatactccc 2100 Met Lys tacccttccc cctgcgcaaa aaacaaaaac aaacaaacaa aaaaatgaaa aaaaaaaaca 2160 gaaaaaaaaa aagagaaaaa agaaaaggaa aaaaatccct tgtactcagt ggtgcaggat 2220 gttggcttgg gacaacagac tgaaaagacc tacagactaa gaaggcaaga agagacaaga 2280 gaccgtaact gacaggaggc ggcagctgtc gcatctcgca aaggcctcac ttgtgactga 2340 ggggcagctt ggcaagacga ctctctaaat ccaaccaggt gcaattattc tttgttttct 2400 tctccagtgg tcattgagca gagctacatc agcgttgtta ccgtcaccta gaaaggagtg 2460 gcagtaatat ccaaacacgg gctgcttatc ttctaatcag agcatctgca acaaaccgtc 2520 atttttctga agtggaaaag cttaaaacaa ttactgtgaa ttgtttttgt acagttatca 2580 tgaagctttc ttttttctct ttttcctgtt tctcttcttt tcttttttct tttttttttt 2640 tgccaaccat tgccaatgtc aatcaatcac agtattagcc tctgttaatc tatctcttta 2700 ctgttgcttc tactcttcaa tgcatatgtt gctcaaaggt ggcaagttgt cctgggttgt 2760 gtgagtcctg agatggatat aattcttgat gctggtgcta gaagtaggtc ttcaaatccg 2820 gggtcgttgt cccacccctg tactgtactc ccagtggcca aacttattta tgctgctaaa 2880 tgaaagaaag aaaaagcaaa ttattttttt tttatttttt ttctgctgtg acgttttagt 2940 cccagactga attccaaatt tgctctagtt tggttacaga aaaaaaagac ttttttgcca 3000 ctgaaacttg agccatctgt gcctctaaga ggctgagaat ggaaaagttt cagataataa 3060 agagtgaagt ttgcctgcaa ataaagaatt gagagtgtgt gcaaagctta ttttctttta 3120 tctgggcaaa aattaaaaca cattccttgg gacagagcct gaggtgcctg ttctgtggag 3180 aaacttcttt ttgagggctg tggtgaatgg aagaacatac atagcaaaac tgacaagata 3240 ttttaaagat atataaaaca caaaggaaaa ggaggttgct ggtcagtcgt agcatcttac 3300 agtattgggg aaaacaactg ttacagtttc attgctctga gtgactgacg tgagaggaat 3360 tcgctctgca gtgacgctgt ctgtcactcg cctaccagct cgacgagcaa gagagcggga 3420 gtcagatggt ccgcctcatt caccaggagc cgtaactcaa gctgaactgt gaaagtggtt 3480 aacactgtat cctaggccgt cttttttttc ctcctcctgt ttattttttg tttgttttat 3540 ttatagtctg atttaaaaca atcagattca agttggttaa ttttagttat gtaacaacct 3600 gacgtgatgg aggaaacaac ctgtaaaggg attgtgtcta tggtttgatt cacttagaaa 3660 ttttattttc ttataactta agtgcaataa aatgtgtttt ttcatgttaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaa 3728 <210> 3 <211> 3751 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (229)..(2109) <400> 3 cttacgggtt ccctggagcg gatcaccata taattgatgt gcagtctgca ttgctgaatc 60 ctggactgca ccattctgtg ttcaagggaa gatgtaatct gatccctctg ctgctgaggg 120 aggaatctgt tcagtcaagg ctttgacagg gcatagtctc ctccaataat cttctccgtt 180 ctctctcatt attccctcga gttcttctca gtcaagctgc atgtatgt atg tgt gtc 237 Met Cys Val 1 ccg aga agc ggt ttg ata ctg agc tgc att tgc ctt tac tgt gga gtt 285 Pro Arg Ser Gly Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Leu Tyr Cys Gly Val 5 10 15 ttg ttg ccg gtt ctg ctc cct aat ctt cct ttt ctg acg tgc ctg agc 333 Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Thr Cys Leu Ser 20 25 30 35 atg tcc aca tta gaa tct gtg aca tac cta cct gaa aaa ggt tta tat 381 Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys Gly Leu Tyr 40 45 50 tgt cag aga ctg cca agc agc cgg aca cac ggg ggc aca gaa tca ctg 429 Cys Gln Arg Leu Pro Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr Glu Ser Leu 55 60 65 aag ggg aaa aat aca gaa aat atg ggt ttc tac ggc aca tta aaa atg 477 Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr Leu Lys Met 70 75 80 att ttt tac aaa atg aaa aga aag ttg gac cat ggt tct gag gtc cgc 525 Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser Glu Val Arg 85 90 95 tct ttt tct ttg gga aag aaa cca tgc aaa gtc tca gaa tat aca agt 573 Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu Tyr Thr Ser 100 105 110 115 acc act ggg ctt gta cca tgt tca gca aca cca aca act ttt ggg gac 621 Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr Phe Gly Asp 120 125 130 ctc aga gca gcc aat ggc caa ggg caa caa cga cgc cga att aca tct 669 Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg Ile Thr Ser 135 140 145 gtc cag cca cct aca ggc ctc cag gaa tgg cta aaa atg ttt cag agc 717 Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met Phe Gln Ser 150 155 160 tgg agt gga cca gag aaa ttg ctt gct tta gat gaa ctc att gat agt 765 Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu Ile Asp Ser 165 170 175 tgt gaa cca aca caa gta aaa cat atg atg caa gtg ata gaa ccc cag 813 Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile Glu Pro Gln 180 185 190 195 ttt caa cga gac ttc att tca ttg ctc cct aaa gag ttg gca ctc tat 861 Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu Ala Leu Tyr 200 205 210 gtg ctt tca ttc ctg gaa ccc aaa gac ctg cta caa gca gct cag aca 909 Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ala Gln Thr 215 220 225 tgt cgc tac tgg aga att ttg gct gaa gac aac ctt ctc tgg aga gag 957 Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu Trp Arg Glu 230 235 240 aaa tgc aaa gaa gag ggg att gat gaa cca ttg cac atc aag aga aga 1005 Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile Lys Arg Arg 245 250 255 aaa gta ata aaa cca ggt ttc ata cac agt cca tgg aaa agt gca tac 1053 Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys Ser Ala Tyr 260 265 270 275 atc aga cag cac aga att gat act aac tgg agg cga gga gaa ctc aaa 1101 Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly Glu Leu Lys 280 285 290 tct cct aag gtg ctg aaa gga cat gat gat cat gtg atc aca tgc tta 1149 Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile Thr Cys Leu 295 300 305 cag ttt tgt ggt aac cga ata gtt agt ggt tct gat gac aac act tta 1197 Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Asn Thr Leu 310 315 320 aaa gtt tgg tca gca gtc aca ggc aaa tgt ctg aga aca tta gtg gga 1245 Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr Leu Val Gly 325 330 335 cat aca ggt gga gta tgg tca tca caa atg aga gac aac atc atc att 1293 His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn Ile Ile Ile 340 345 350 355 agt gga tct aca gat cgg aca ctc aaa gtg tgg aat gca gag act gga 1341 Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala Glu Thr Gly 360 365 370 gaa tgt ata cac acc tta tat ggg cat act tcc act gtg cgt tgt atg 1389 Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val Arg Cys Met 375 380 385 cat ctt cat gaa aaa aga gtt gtt agc ggt tct cga gat gcc act ctt 1437 His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp Ala Thr Leu 390 395 400 agg gtt tgg gat att gag aca ggc cag tgt tta cat gtt ttg atg ggt 1485 Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val Leu Met Gly 405 410 415 cat gtt gca gca gtc cgc tgt gtt caa tat gat ggc agg agg gtt gtt 1533 His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg Arg Val Val 420 425 430 435 agt gga gca tat gat ttt atg gta aag gtg tgg gat cca gag act gaa 1581 Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro Glu Thr Glu 440 445 450 acc tgt cta cac acg ttg cag ggg cat act aat aga gtc tat tca tta 1629 Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val Tyr Ser Leu 455 460 465 cag ttt gat ggt atc cat gtg gtg agt gga tct ctt gat aca tca atc 1677 Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp Thr Ser Ile 470 475 480 cgt gtt tgg gat gtg gag aca ggg aat tgc att cac acg tta aca ggg 1725 Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr Leu Thr Gly 485 490 495 cac cag tcg tta aca agt gga atg gaa ctc aaa gac aat att ctt gtc 1773 His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn Ile Leu Val 500 505 510 515 tct ggg aat gca gat tct aca gtt aaa atc tgg gat atc aaa aca gga 1821 Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile Lys Thr Gly 520 525 530 cag tgt tta caa aca ttg caa ggt ccc aac aag cat cag agt gct gtg 1869 Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln Ser Ala Val 535 540 545 acc tgt tta cag ttc aac aag aac ttt gta att acc agc tca gat gat 1917 Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser Ser Asp Asp 550 555 560 gga act gta aaa cta tgg gac ttg aaa acg ggt gaa ttt att cga aac 1965 Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe Ile Arg Asn 565 570 575 cta gtc aca ttg gag agt ggg ggg agt ggg gga gtt gtg tgg cgg atc 2013 Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val Trp Arg Ile 580 585 590 595 aga gcc tca aac aca aag ctg gtg tgt gca gtt ggg agt cgg aat ggg 2061 Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser Arg Asn Gly 600 605 610 act gaa gaa acc aag ctg ctg gtg ctg gac ttt gat gtg gac atg aag t 2110 Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val Asp Met Lys 615 620 625 gaagagcaga aaagatgaat ttgtccaatt gtgtagacga tatactccct gcccttcccc 2170 ctgcaaaaag aaaaaaagaa aagaaaaaga aaaaaatccc ttgttctcag tggtgcagga 2230 tgttggcttg gggcaacaga ttgaaaagac ctacagacta agaaggaaaa gaagaagaga 2290 tgacaaacca taactgacaa gagaggcgtc tgctgtctca tcacataaaa ggcttcactt 2350 ttgactgagg gcagctttgc aaaatgagac tttctaaatc aaaccaggtg caattatttc 2410 tttattttct tctccagtgg tcattgggca gtgttaatgc tgaaacatca ttacagattc 2470 tgctagcctg ttcttttacc actgacagct agacacctag aaaggaactg caataatatc 2530 aaaacaagta ctggttgact ttctaattag agagcatctg caacaaaaag tcatttttct 2590 ggagtggaaa agcttaaaaa aattactgtg aattgttttt gtacagttat catgaaaagc 2650 tttttttttt ttttttttgc caaccattgc caatgtcaat caatcacagt attagcctct 2710 gttaatctat ttactgttgc ttccatatac attcttcaat gcatatgttg ctcaaaggtg 2770 gcaagttgtc ctgggttctg tgagtcctga gatggattta attcttgatg ctggtgctag 2830 aagtaggtct tcaaatatgg gattgttgtc ccaaccctgt actgtactcc cagtggccaa 2890 acttatttat gctgctaaat gaaagaaaga aaaaagcaaa ttattttttt ttattttttt 2950 tctgctgtga cgttttagtc ccagactgaa ttccaaattt gctctagttt ggttatggaa 3010 aaaagacttt ttgccactga aacttgagcc atctgtgcct ctaagaggct gagaatggaa 3070 gagtttcaga taataaagag tgaagtttgc ctgcaagtaa agaattgaga gtgtgtgcaa 3130 agcttatttt cttttatctg ggcaaaaatt aaaacacatt ccttggaaca gagctattac 3190 ttgcctgttc tgtggagaaa cttttctttt tgagggctgt ggtgaatgga tgaacgtaca 3250 tcgtaaaact gacaaaatat tttaaaaata tataaaacac aaaattaaaa taaagttgct 3310 ggtcagtctt agtgttttac agtatttggg aaaacaactg ttacagtttt attgctctga 3370 gtaactgaca aagcagaaac tattcagttt ttgtagtaaa ggcgtcacat gcaaacaaac 3430 aaaatgaatg aaacagtcaa atggtttgcc tcattctcca agagccacaa ctcaagctga 3490 actgtgaaag tggtttaaca ctgtatccta ggcgatcttt tttcctcctt ctgtttattt 3550 ttttgtttgt tttatttata gtctgattta aaacaatcag attcaagttg gttaatttta 3610 gttatgtaac aacctgacat gatggaggaa aacaaccttt aaagggattg tgtctatggt 3670 ttgattcact tagaaatttt attttcttat aacttaagtg caataaaatg tgttttttca 3730 tgttaaaaaa aaaaaaaaaa a 3751 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fbxw7 beta forward primer <400> 5 ttgtcagaga ctgccaagca g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fbxw7 beta reverse primer <400> 6 gactttgcat ggtttctttc cc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myogenin forward primer <400> 7 tgagggagaa gcgcaggctc aag 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myogenin reverse primer <400> 8 atgctgtcca cgatggacgt aagg 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 forward primer <400> 9 gtccagagag tcggcaagtc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 reverse primer <400> 10 gtagccggtc ttcactgagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuRF forward primer <400> 11 gagaacctgg agaagcagct 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuRF reverse primer <400> 12 ccgcggttgg tccagtag 18

Claims (13)

1. 정상인에 비해 근아세포에서 발현이 증가하는 것으로서, Fbxw7 베타를 포함하는 근위축증 진단용 바이오마커 조성물.
2. Fbxw7 베타 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 Fbxw7 베타 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 상기 Fbxw7 베타의 발현수준 측정에 의한 근위축증 진단용 약학 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab', 또는 이들의 조합인 약학 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 약학 조성물.
5. 제2항에 있어서, 근아세포로부터 상기 Fbxw7 베타의 발현수준을 측정하는 것인 약학 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근위축증은 노화 (aging), 탈신경화 (denervation), 당뇨 또는 암에 의해 유발된 근위축증인 조성물.
7. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 근위축증 진단용 키트.
8. 제7항에 있어서, 상기 Fbxw7 베타 단백질의 발현양 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현양을 측정할 수 있는 마이크로어레이인 근위축증 진단용 키트.
9. 근위축증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 근아세포로부터 Fbxw7 베타의 발현수준을 검출하는 방법.
10. 근아세포를 시료로 처리하는 단계;
    상기 처리된 근아세포 중의 Fbxw7 베타의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 Fbxw7 베타의 발현수준이 대조군의 Fbxw7 베타의 발현수준에 비해 감소하는 시료를 선택하는 단계를 포함하는
    근위축증 치료용 후보약물을 스크리닝하는 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 Fbxw7 베타의 발현수준은 Fbxw7 베타 단백질 발현양 또는 Fbxw7 베타의 유전자의 mRNA 발현양을 측정하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 단백질 발현양의 측정은 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, ELISA, 및 질량분석기에서 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 mRNA 발현양의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 및 DNA 칩에서 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 방법.

Images