KR102232200B1 - 알츠하이머치매 진단 바이오마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 NTM(neurotrimin), PAM(peptidyl glycine alpha amidating monooxygenase) 및 PTPRN2(receptor type tyrosine protein phosphatase N2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머성 치매의 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트; 및 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하고, 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 알츠하이머성 치매 진단용 조성물은 3종의 단백질(NTM, PAM 및 PTPRN2의 발현량을 측정하여, 정상 대조군과 비교함으로써, 높은 민감도 및 특이도로 알츠하이머성 치매의 진단이 가능하다.
본 발명의 알츠하이머성 치매 진단용 조성물은 3종의 단백질(NTM, PAM 및 PTPRN2의 발현량을 측정하여, 정상 대조군과 비교함으로써, 높은 민감도 및 특이도로 알츠하이머성 치매의 진단이 가능하다.
Description
본 발명은 알츠하이머성 치매의 진단용 마커 조성물 및 이를 이용하는 알츠하이머성 치매 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
전세계적으로 초고령화 현상으로 인한 치매 환자의 증가는 현재 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 2014년 국회예산정책저에 따르면 65세 이상의 치매 유병률은 2020년에 84만명, 2050년에 217만명으로 늘어날 것으로 예상되며, 이에 따라 치매로 인한 사회적 비용의 규모 역시 2013년 11조7000억원에서, 2030년 23조 1000억원, 2040년 34조 2000억원, 2050년 43조 2000억원으로 급격히 늘어날 것으로 예상된다고 한다.
현재, 알츠하이머성 치매 진단을 위해서 사용되고 있는 진단 방법에는 유전자 검사, 신경심리검사 및 인지기능 검사, 뇌척수액 검사, 뇌영상 검사(MRI, PET)가 있다. 유전자 검사는 ApoE4라는 알츠하이머성 치매 특이적 유전자에 대한 검사를 통해 알츠하이머성 치매 위험성을 감지하는 검사이다. 그러나, ApoE4라는 유전자는 치매 발명의 위험률을 높일 수는 있으나, 결정적인 인자가 아니기 때문에, 해당 검사만으로는 알츠하이머성 치매 진단이 어렵다. 또한, 신경심리검사 및 인지기능 검사는 설문지를 통해 환자의 인지장애 정도를 측정하는 방법으로, 간이 정신상태검사(MMSE), 몬트리올 인지검사(MoCA), SNSB 등이 있다. 이는 설문지 형태의 진단 방법으로서, 비용이 적게 들고 진단시 물리적 고통이 없다는 장점이 있으나, 반복된 검사로 인해 학습, 나이 및 학력 차이 등에 의한 결과 변화, 주관성 개입 등으로 인해 정확성에 문제가 생길 수 있으며, 결정적으로 해당 인지장애가 알츠하이머성 치매의 주요 인자인 베타-아밀로이드에 의한 인지장애인지, 다른 종류의 질환에 의한 것인지 확인할 수 없다는 문제가 있다. 또한, 뇌척수액을 통한 검사는 뇌척수액을 추출하여 알츠하이머 유발인자로 알려진 베타-아밀로이드 또는 타우 단백질을 정량 진단하는 방법으로서, 진단의 정확성은 높으나, 뇌척수액을 얻기 위한 척주 천자 방법은 환자에게 큰 고통을 줄 수 있어 거부감을 일으킬 수 있다. 또한, 시술에 있어서 전문성이 높지 않은 일반 병원에서는 이용하기 힘들며, 비용적인 한계도 존재한다. 뇌영상 검사(MRI, PET)는 MRI 또는 PET 영상촬영을 통해 뇌손상 정도 및 알츠하이머 유발인자인 베타-아밀로이드와 타우 단백질을 뇌에서 분석하는 방법이다. 진단에 대한 높은 정확성을 가지고 있으나, 알츠하이머성 치매 진단시 고가의 장비와 영상촬영에 대한 전문성을 요구하므로, 유통의 한계가 있고, 높은 진단 비용을 요구한다는 문제가 있다. 이와 같이, 현재 알츠하이머성 치매 진단을 위한 다양한 기술이 존재하나, 각각의 기술은 정확성 문제, 비용적 문제, 시간적 문제 및 육체적 고통의 수반 등 다양한 한계점이 존재한다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 3종의 단백질의 발현량이 정상 대조군과 비교하여 알츠하이성 치매 환자에서 유의적인 발현량 차이가 나타남을 확인하였다. 3종의 단백질, NTM(neurotrimin), PAM(peptidyl glycine alpha amidating monooxygenase) 또는 PTPRN2(receptor type tyrosine protein phosphatase N2) 수준의 비교를 통해 알츠하이머성 치매의 진단 또는 예후 예측과 관련된 정보를 보다 정확히 획득할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 NTM(neurotrimin), PAM(peptidyl glycine alpha amidating monooxygenase) 및 PTPRN2(receptor type tyrosine protein phosphatase N2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머성 치매의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 알츠하이머성 치매의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서, NTM, PAM 및 PTPRN2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 양태는 NTM(neurotrimin), PAM(peptidyl glycine alpha amidating monooxygenase) 및 PTPRN2(receptor type tyrosine protein phosphatase N2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머성 치매의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 3종의 유전자 중 1종의 유전자 또는 2종, 또는 3종의 유전자 조합을 포함할 수 있으며, 또한 상기 유전자에 LY6H 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 유전자는 알츠하이머성 치매 환자에서 정상 개체와 비교하여 상기 유전자의 유의적인 발현 차이가 나타남을 이용하여 알츠하이머성 치매의 진단 또는 예후 예측을 위한 유용한 정보를 획득할 수 있는 것이다. 이는 지금까지 알려진 바 없으며, 본 발명에 의해 최초로 밝혀진 것으로, 높은 민감도 및 특이도로 알츠하이머성 치매의 진단 또는 예후 예측이 가능한 점에서 그 의의가 크다.
본 발명의 용어, “NTM(Neurotrimin)” 유전자는, Neurotrimin 단백질을 코딩하는 유전자로써, 신경돌기의 생장, 신경 세포의 세포간 연결 기능 및 특이항체 메커니즘에 의한 접착과 밀접하게 연결되어 있다고 알려져 있다. 본 발명의 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “PAM(Peptidylglycine-α-amidating monooxygenase)” 유전자는, Peptidylglycine-α-amidating monooxygenase를 암호화 하는 유전자로써, 시냅스의 기능 증강, C-terminal amidation을 통한 긴경생물학적 기능 조절 및 생체 내에서 비활성 단백질이 활성을 가지기 위해 카르복실기 말단을 α-아미드화 시키는 효소로 알려져 있다. 본 발명의 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “PTPRN2(receptor type tyrosine protein phosphatase N2)” 유전자는, Islet cell autoantigen-related protein (ICAAR) 또는 Phogrin으로도 알려져 있으며, receptor type tyrosine protein phosphatase N2 효소를 코딩하는 유전자이다. 상기 유전자는 소포체를 통한 신경분비 물질 배출과 단백질의 인산화 조절 및 신경세포 골격 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “LY6H” 유전자는, 신규의 뇌특이적 단백질인 LY6H 단백질을 코딩하는 420의 오픈리딩프레임(open reading frame; ORF)을 포함하는 cDNA이며, 전체길이(全長)가 854개의 염기로 이루어져 있다고 알려져 있으며, 인지 기능에 중요한 역할을 하는 아세틸콜린 수용체의 발현 및 기능을 조절한다고 알려져 있다. 본 발명의 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 4종의 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 각 서열번호 1 내지 4로 구성된 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 각 아미노산 서열과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있으나, 상동성을 결정할 수 있는 프로그램이라면 제한 없이 이용할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 3종의 유전자와 관련하여, 본 발명의 일 실시예에서는, 정상 개체와 알츠하이머성 치매 환자의 뇌척수액을 대상으로 고효율 단백체 분석을 통해(도 1), 유의적으로 발현량 차이가 나타나는 3종의 단백질(NTM, PAM 및 PTPRN2)를 동정하였다(도 2). 이를 통해, 상기 3종 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하여, 알츠하이머성 치매의 진단에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인하였다(도 3 내지 4).
본 발명의 용어, "mRNA의 수준을 측정하는 제제"는 시료에 포함된 본 발명의 3종의 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 상기 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 구체적으로 상기 제제는 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
구체적으로, 상기 3종의 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 방법에 사용되는 각각의 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
유전자 | 염기서열 |
NTM (neurotrimin) UniProt ID: Q9P121 Gene ID: 50863 |
Forward:CCCTACGTCTCAATTCATCATAAG(서열번호5) Backward:TACGATACTGTTGATTACTAAAGC(서열번호6) |
PAM (Peptidylglycine-α-amidating monooxygenase) UniProt ID: P19021 Gene ID: 5066 |
Forward: CCCTATCCCAGCCCTATC(서열번호7) Backward: GTGATGCCCAGGCTGAGATC(서열번호8) |
PTPRN2 (receptor type tyrosine protein phosphatase N2) UniProt ID: Q92932 Gene ID: 5799 |
Forward: CTGGTCTGCCCCTCTCCT(서열번호9) Backward: TTCAGGAGATTTTCATCCTTCC(서열번호10) |
LY6H (lymphocyte antigen 6H) UniProt ID: O94772 Gene ID: 4062 |
Forward:CTGCTGGCCGTCCTGCTGTGC(서열번호11) Backward:CCAACTTACTGCTGCTGGGATCC(서열번호12) |
한편, 상기 "프로브"는 상기 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "단백질의 수준을 측정하는 제제"는 시료에 포함된 본 발명의 3종의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 제제는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법에 사용되는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함 될 수 있다. 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
상기 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 앱타머는 상기 3종의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대하여 사용될 수 있다. 상기 단백질에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명의 용어 “알츠하이머성 치매”는 알츠하이머 질환에 의하여 유발된 치매 증상을 의미한다. 상기 알츠하이머성 질환은 독일의 알츠하이머 박사에 의하 여 최초로 보고된, 치매를 유발하는 가장 일반적인 퇴행성 뇌질환을 의미하는데, 상기 알츠하이머 질환이 진행됨에 따라 기억력을 포함하는 전체적인 인지기능이 점진적으로 약화된다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다. 본 발명의 목적상, 진단은 알츠하이머성 치매의 발병 여부 또는 알츠하이머성 치매의 발병 단계를 확인하는 것이다.
본 발명의 다른 양태로서 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머성 치매 진단용 키트을 제공한다. 상기 용어 "알츠하이머성 치매", "진단" 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는 알츠하이머성 치매의 진단하기 위하여, 상기 NTM, PAM 및 PTPRN2 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 또는, 상기 키트는 LY6H 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 추가 측정 할 수 있다.
본 발명의 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 알츠하이머성 치매의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서, NTM, PAM 및 PTPRN2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 용어 "알츠하이머성 치매", "진단" 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다. 또한, 상기 (a) 단계는 LY6H 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 추가로 측정 할 수 있다.
본 발명의 용어, "개체"는 알츠하이머성 치매을 진단하거나 알츠하이머성치매의 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미한다. 이때, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼, 닭, 오리, 거위 등의 알츠하이머성 치매가 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 용어, "시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 알츠하이머성 치매 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장 외에도, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하며, 구체적으로는, 뇌척수액을 의미할 수 있다.
본 발명의 용어, "정상 개체"란 알츠하이머성 치매로 진단되지 않은 개체를 의미하며, 정상 개체로부터 분리된 시료와 알츠하이머성 치매의 진단 또는 예후를 예측하고자 하는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 비교함으로써, 알츠하이머성 치매 발병이 의심되는 개체의 알츠하이머성 치매 발병 여부 또는 알츠하이머성 치매의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 알츠하이머성 치매의 진단 또는 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay) 등이 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 알츠하이머성 치매의 진단 또는 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 본 발명의 5종의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 알츠하이머성 치매의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, 알츠하이머성 치매 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정한 결과, 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정되는 수준 보다 유의적으로 높거나 낮은 경우, 알츠하이머성 치매의 발병 위험이 높거나, 그 예후가 나쁘다고 판정될 수 있다.
본 발명의 알츠하이머성 치매 진단용 조성물은 3종의 단백질(NTM, PAM 또는 PTPRN2)의 발현량을 측정하여, 정상 대조군과 비교함으로써, 높은 민감도 및 특이도로 알츠하이머성 치매의 진단이 가능하다.
도 1은 뇌척수액을 대상으로 4종의 단백질(NTM, PAM, PTPRN2 및 LY6H)을 분석할 수 있는 고효율 단백체 분석 과정의 모식도이다.
도 2는 알츠하이머병으로 인한 치매 환자와 비슷한 연령대의 정상 대조군 사이에서 4종의 단백질(NTM, PAM, PTPRN2 및 LY6H) 차이를 보여주는 그래프이다.
도 3은 단백질 발현 농도와 알츠하이머병으로 인한 인지기능 장애를 평가할 수 있는 mini-mental state examination(MMSE) 수치와의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 4는 단백질 발현 농도와 치매의 심한 정도를 임상적으로 평가하는 clinical dementia rating-sum of box(CDR-SOB) 수치와의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 2는 알츠하이머병으로 인한 치매 환자와 비슷한 연령대의 정상 대조군 사이에서 4종의 단백질(NTM, PAM, PTPRN2 및 LY6H) 차이를 보여주는 그래프이다.
도 3은 단백질 발현 농도와 알츠하이머병으로 인한 인지기능 장애를 평가할 수 있는 mini-mental state examination(MMSE) 수치와의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 4는 단백질 발현 농도와 치매의 심한 정도를 임상적으로 평가하는 clinical dementia rating-sum of box(CDR-SOB) 수치와의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 실험 재료의 준비 및 분석 방법
실시예 1-1: 대상 검체 및 이의 특징
알츠하이머성 치매 환자(AD) 및 정상 대조군(Control)으로부터 수득된 뇌척수액의 정확한 단백체 분석을 수행하기 위해 각 조건에 맞게 채취하였다(Park SA 등, J Clin Neurol 2015). 이들 검체는 단백체 분석 전까지 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 이후, 드라이아이스가 포함된 용기에 넣어 단백체 분석 전문 업체로 이동시키고, 해동 후 분석에 활용하였다. 검체 제공자의 임상적 특징은 하기 표 2에 나타내었다(값은 평균 ± 표준편차로 표시함, p-값은 변수의 특성에 따라 독립표본 t-검증 또는 카이-제곱 검정(Chi-squared test)을 통해 결정됨, 약어에 대한 설명: AD, 알츠하이머성 치매; AOPE, 아포지단백 E; CDR-SOB, 임상 치매 등급 평가 합계(clinical dementia rating scale sum of box); CSF, 뇌척수액; MMSE, 간이 정신상태 검사(mini-mental state examination)).
알츠하이머성 치매의 진단은 임상적 증상뿐만 아니라, 뇌척수액 내의 베타-아밀로이드 단백질 1-42, 총 타우 단백질, 인산화 타우 단백질의 농도를 측정하여, 알츠하이머성 치매로 진단되는 경우를 알츠하이머성 치매 환자로 분류하여, 매우 정확한 진단 방법에 근거하였다. 즉, 상기와 같은 알츠하이머성 치매 진단에 이용된 방법은 2018년도 NIA-AA 연구 구조(research framework)에 따른 알츠하이머병 진단의 AT(N) 바이오마커 모두를 충족하는 조건이다(Jack Jr CR, 등 Alzheimer's & Dementia 2018).
실시예 1-2: 단백체 분석 방법
정상 대조군 및 알츠하이머성 치매 환자군에서 뇌척수액을 수집하여, 이들을 비-편향(non-biased) 비-표지(label-free) 단백체 분석을 시행하였다. 단백체 분석 방법 중에서도, 정량의 정확도 및 민감도가 높고, '비표적 단백체 분석'이 가능한 SWATH(Sequential Window Acquisition of all THeoretical fragment-ion spectra)-MS(mass spectroscopy, 질량 분광학) 방법을 이용하였다. SWATH-MS 단백체 분석의 방법의 장점은 선행문헌에 의해 기술된 바 있다(Gillet LC et al, Mol Cell Proteomics 2012).
도 1에서 보듯, 분석 준비 단계는 2개의 뇌척수액(CSF) 검액(pooled sample) 100μl을 이용하여 단백질을 변성시키고, 전처리 과정을 거치게 하면서 펩티드로 분해시켰다. 펩티드로 잘려진 시료 전체를 각 분획별로 동정하고, 정량을 위한 스펙트럼 라이브러리 확보하였다. 1% FDR조건으로 필터링 후, 총 360개의 동정 단백질을 확보하였다(시퀀스 특이적 펩티드는 총 2,691개, 시퀀스 특이적 스펙트럼은 총 5,366개 확인). 검출되는 모든 단백질의 종류에 대하여 SWATH-MS 정량 분석을 할 수 있는 라이브러리를 확보하였다.
검체의 본격적인 분석단계는 81개의 뇌척수액(CSF) 검체에 대해 각각 100μl을 얻어, 상기 준비단계와 동일한 처리 단계를 거쳐 Triple-TOFTM 5600+(AB Sciex, Concord, Canada)를 이용하여 단백체 분석을 실시하였다. 기계에 연결된 Eksigent NanoLC-2D 및 nanoFlex cHiPLC 시스템(0.075 mm x 75μm column)을 이용하여 단백질을 찾아 정량하였다. SWATH-MS 분석은 Triple-Tof 5600+ 및 20 Da/매스 윈도우(mass windows)를 이용하여 루프 프로덕트 이온 모드(looped product ion mode)로 시행하였다. 각 SWATH 윈도우는 400-1000Da 범위에서 1Da 오버랩을 가지면서 반복 측정하였다(예를 들어, 실험 1은 400~420Da, 실험 2는 419~440Da, 이후 실험 31는 979~1000Da 범위까지 특정함). 얻어진 값에 대해서 ProteinPilotTM을 이용하여 단백질들의 스펙트럼을 찾고, ProteoWizard 및 Skyline 소프트웨어를 이용하여 해당 단백질 및 이의 정량 값을 얻었다. 마지막으로, 개별 라이브러리 스펙트럼과 SWATH 스펙트럼을 확인하여 최종적으로 단백질의 종류와 정량값을 검증하였다.
<실시예 2> 알츠하이머성 치매 진단의 바이오 마커로서, 3종의 단백질(NTM, PAM 및 PTPRN2) 선별
42명의 알츠하이머성 치매 환자와 39명의 동일 연령대의 정상대조군의 뇌척수액을 SWATH-MS 방법을 이용하여 모든 시료에서 수행하였다. 미리 2개의 검액(약 6개의 뇌척수액 시료를 합쳐서 1개의 검액을 제조함)을 이용한 예비 실험을 통해서 SWATH-MS 방법으로, 사람의 뇌척수액에서 정확히 찾아낼 수 있는 단백질들의 종류 및 데이터 처리방법을 미리 파악하였다. 그 후, 본 실험으로 81개의 모든 시료에 대해 개별적으로 SWATH-MS 단백체 분석 방법을 시행하여, 274종류의 단백질이 모든 검체에서 공통적으로 검출됨을 확인하고, 이들의 발현량을 얻었다.
SWATH-MS 분석 및 데이터 처리 과정은 모든 검체에서 동일한 조건으로 시행하였다. 274개 단백질의 발현량은 단백체 분석 스펙트럼에서 해당 단백질 피크의 면적값(AUC: area under the curve)으로 얻을 수 있는데, 이 값은 어떤 농도의 특정 단위로 표현할 수 있는 개념은 아니지만, 동시에 분석된 단백질들의 농도를 상대적 비교가 정확히 가능하므로, 통상적으로 사용되는 단백질 발현량의 검출 방법이다. 따라서 상기 실시예 1에 기재된 SWATH-MS 분석의 스펙트럼상의 각 단백질에 해당되는 피크를 형성하는 면적값(AUC)들을 알츠하이머성 치매 환자 42명과 정상 대조군 39명간의 비교를 수행하였다.
그 결과, 도 2에서 보듯이, 274개의 단백질들 중 25개의 단백질들의 AUC 값이 독립 표본 t-검정을 통해서 p-값이 0.05 미만으로 측정되어, 유의적임을 확인하였다. 이 중 NTM, PAM, PTPRN2 또는 LY6H은 알츠하이머성 치매 환자와 정상 대조군 비교에서 의미있는 차이를 보이며 t-Test 상 p-값은 각각 0.0162, 0.0185, 0.0252 및 0.0235였고, 274개 동시 비교라는 다중분석에 따를 수 있는 에러 교정 후에도 FDR < 0.2으로 유의한 차이를 보였다.
이를 통해, NTM, PAM 또는 PTPRN2를 포함한, 총 3개의 단백질이 알츠하이머성 치매 환자와 비슷한 연령대의 정상 대조군 사이에서 통계적으로 유의적인 농도 변화가 있음을 확인하고 알츠하이머성 치매 진단 마커로서 선별하였다.
<실시예 3> 간이정신상태 검사(mini-mental state examination, MMSE)
알츠하이머병으로 인한 인지기능 장애를 평가할 수 있는 치매 선별 검사인 간이정신상태 검사(mini-mental state examination, MMSE)를 실시하여 상기 마커와의 상관관계를 분석하였다.
보다 구체적으로, 간이정신상태 검사(mini-mental state examination, MMSE) 점수와 상기 단백질들의 뇌척수액내 발현 농도의 log2 배수 변화 수치를 Spearman’s rank correlation 분석을 통해 상관관계를 규명하였다. MMSE 점수는 인지기능 장애가 심할수록 점수가 낮아진다.
그 결과, 도 3에서 보듯이, LY6H 단백질의 뇌척수액 농도는 MMSE 점수와 상관계수 0.31 (p-값, 0.009), NTM은 상관계수 0.32 (p-값, 0.007), PAM은 상관계수 0.31 (p-값, 0.009), 그리고 PTPRN2는 상관계수 0.30 (p-값, 0.011)으로 모두 각 단백질 농도가 감소할수록 인지기능이 저하되는 유의한 상관성을 보였다.
이를 통해, 상기 단백질들의 뇌척수액내 발현 농도가 감소하는 양상과 치매 환자의 인지기능 장애 정도의 중증도 양상이 유의한 상관관계를 보이는 것을 확인하였다.
<실시예 4> clinical dementia rating-sum of box(CDR-SOB) 분석
치매환자의 중증도를 임상적으로 평가할 수 있는 clinical dementia rating-sum of box(CDR-SOB)를 실시하여 상기 마커와의 상관관계를 분석하였다.
보다 구체적으로, clinical dementia rating-sum of box(CDR-SOB) 점수와, 상기 단백질들의 뇌척수액내 발현 농도의 log2 배수 변화 수치를 Spearman’s rank correlation 분석을 통해 상관관계를 규명하였다. CDR-SOB는 기억력, 지남력, 판단력/문제해결 능력, 사회활동, 집안생활과 취미, 위생 및 몸치장이라는 5가지 항목에 대하여 각각 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5점을 부여 할 수 있다. CDR-SOB는 이들 수치의 합계를 의미하며, 치매가 심할수록 점수가 높아진다.
그 결과, 도 4에서 보듯이, LY6H 단백질의 뇌척수액 농도는 MMSE 점수와 상관계수 ?0.56 (p-값, < 0.001), NTM은 상관계수 ?0.27 (p-값, 0.023), PAM은 상관계수 ?0.455 (p-값, < 0.001), 그리고 PTPRN2는 상관계수 ?0.34 (p-값, 0.003)으로 모두 단백질의 농도가 감소할수록 치매 정도가 심해지면서 유의한 상관성을 보였다.
이를 통해, 상기 단백질들의 뇌척수액내 발현 농도가 감소하는 양상과 치매 환자의 중증도 양상이 유의한 상관관계를 보이는 것을 확인하였다.
이상의 내용을 종합하면, 본 발명에서는 정상 대조군과 비교하여 알츠하이머성 치매 환자에서 공통적으로 검출되는 274종의 단백질들 중에서도, 4종의 단백질들(NTM, PAM, PTPRN2 또는 LY6H)의 발현량이 유의적으로 차이가 있고, 또한 상기 단백질들의 발현 변화 양상이 치매 환자의 인지기능 장애 정도 및 중증도 양상과 유의한 상관관계를 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 최종적으로 NTM, PAM, PTPRN2 또는 LY6H를 포함한, 총 4개의 단백질이 알츠하이머성 치매를 진단하거나, 그 중증도를 예측하는데 유용한 바이오마커가 될 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant protein
<400> 1
Met Gly Val Cys Gly Tyr Leu Phe Leu Pro Trp Lys Cys Leu Val Val
1 5 10 15
Val Ser Leu Arg Leu Leu Phe Leu Val Pro Thr Gly Val Pro Val Arg
20 25 30
Ser Gly Asp Ala Thr Phe Pro Lys Ala Met Asp Asn Val Thr Val Arg
35 40 45
Gln Gly Glu Ser Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Asp Asn Arg Val Thr
50 55 60
Arg Val Ala Trp Leu Asn Arg Ser Thr Ile Leu Tyr Ala Gly Asn Asp
65 70 75 80
Lys Trp Cys Leu Asp Pro Arg Val Val Leu Leu Ser Asn Thr Gln Thr
85 90 95
Gln Tyr Ser Ile Glu Ile Gln Asn Val Asp Val Tyr Asp Glu Gly Pro
100 105 110
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225 230 235 240
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Asn Ala Ser Ile Met Leu Phe Gly Pro Gly Ala Val Ser Glu Val Ser
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<210> 2
<211> 973
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant protein
<400> 2
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785 790 795 800
Asn Thr Val Trp Lys Phe Thr Leu Thr Glu Lys Leu Glu His Arg Ser
805 810 815
Val Lys Lys Ala Gly Ile Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Ala Glu Ala
820 825 830
Val Val Glu Thr Lys Met Glu Asn Lys Pro Thr Ser Ser Glu Leu Gln
835 840 845
Lys Met Gln Glu Lys Gln Lys Leu Ile Lys Glu Pro Gly Ser Gly Val
850 855 860
Pro Val Val Leu Ile Thr Thr Leu Leu Val Ile Pro Val Val Val Leu
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Leu Ala Ile Ala Ile Phe Ile Arg Trp Lys Lys Ser Arg Ala Phe Gly
885 890 895
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900 905 910
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Gly Ser Asp Gln Glu Lys Glu Asp Asp Gly Ser Glu Ser Glu Glu Glu
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<211> 1015
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant protein
<400> 3
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Pro Arg Val Leu Pro Ala Ala Pro Ser Ser Val Pro Arg Gly Arg Gln
20 25 30
Leu Pro Gly Arg Leu Gly Cys Leu Leu Glu Glu Gly Leu Cys Gly Ala
35 40 45
Ser Glu Ala Cys Val Asn Asp Gly Val Phe Gly Arg Cys Gln Lys Val
50 55 60
Pro Ala Met Asp Phe Tyr Arg Tyr Glu Val Ser Pro Val Ala Leu Gln
65 70 75 80
Arg Leu Arg Val Ala Leu Gln Lys Leu Ser Gly Thr Gly Phe Thr Trp
85 90 95
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165 170 175
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
Ser Arg Met Pro Arg Pro Leu Leu Ala Pro Ala Ala Pro Gln Lys Trp
275 280 285
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305 310 315 320
Val Arg Gly Leu Ser Gly Leu Glu Leu Asp Gly Met Ala Glu Leu Met
325 330 335
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340 345 350
Gly Arg Ala Ala Leu Gly Glu Ser Gly Glu Gln Ala Asp Gly Pro Lys
355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Ser Lys Glu Glu Gln Ser Leu Pro Ala Gly Ala Gln Glu Ala Leu Ser
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Ala Asp Val Glu Val Leu Gly Pro Ala Val Thr Phe Lys Val Ser Ala
545 550 555 560
Asn Val Gln Asn Val Thr Thr Glu Asp Val Glu Lys Ala Thr Val Asp
565 570 575
Asn Lys Asp Lys Leu Glu Glu Thr Ser Gly Leu Lys Ile Leu Gln Thr
580 585 590
Gly Val Gly Ser Lys Ser Lys Leu Lys Phe Leu Pro Pro Gln Ala Glu
595 600 605
Gln Glu Asp Ser Thr Lys Phe Ile Ala Leu Thr Leu Val Ser Leu Ala
610 615 620
Cys Ile Leu Gly Val Leu Leu Ala Ser Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Arg
625 630 635 640
His Ser Ser Gln His Arg Leu Lys Glu Lys Leu Ser Gly Leu Gly Gly
645 650 655
Asp Pro Gly Ala Asp Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Glu Leu Cys Arg Gln
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770 775 780
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785 790 795 800
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820 825 830
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835 840 845
Ala Glu Asn Gly Val Arg Gln Cys Tyr His Tyr Trp Pro Asp Glu Gly
850 855 860
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1010 1015
<210> 4
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant protein
<400> 4
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ccaacttact gctgctggga tcc 23
Claims (12)
- NTM(neurotrimin) 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것인, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함하는 것인, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자는 LY6H(lymphocyte antigen 6H), PAM(peptidyl glycine alpha amidating monooxygenase), 및 PTPRN2(receptor type tyrosine protein phosphatase N2) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 알츠하이머성 치매 진단용 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 알츠하이머성 치매 진단용 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인, 알츠하이머성 치매 진단용 키트.
- (a) 알츠하이머성 치매의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서, NTM 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머성 치매의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 시료는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 또는 뇌척수액인 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA칩 분석법(DNA chip technology assay)에 의하여 측정되는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 단백질의 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 방법.
- 삭제
- 제7항에 있어서, 상기 유전자는 LY6H, PAM, 및 PTPRN2 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제7항 내지 제9항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 정상 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하여, 알츠하이머성 치매의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 NTM 유전자의 mRNA 또는 단백질의 수준이 낮은 경우, 알츠하이머성 치매의 발병 위험이 높다고 판정하는 것인, 방법.
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---|---|---|---|---|
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