KR101576179B1 - 근육 노화 탐지 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 근육 노화 탐지 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 CSQ2(calsequestrin 2) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육 노화 근육 노화 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 근육 노화 진단용 키트, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법, 및 근육 노화 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 근육 노화를 판단할 수 있는 마커들을 제공함으로써, 근육 노화 상태를 판단하는 것에 있어 유용한 자료를 제공한다. 또한, 상기 마커들은 분화 조절 물질의 스크리닝 및 근육 노화를 조절하는 데 있어 유용하게 이용될 수 있다.

Description

근육 노화 탐지 마커 및 이의 용도{Detection marker of muscle aging and use thereof}

본 발명은 근육 노화 탐지 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 CSQ2(calsequestrin 2) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육 노화 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 근육 노화 진단용 키트, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법, 및 근육 노화 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

근육감소증이라 부르는, 노화와 관련된 골격근 용적 및 수축력의 상실은 균형감각 장애, 빈번한 넘어짐, 및 운동성 장애 등을 유발한다. 속근(II 형) 및 지근(I 형) 섬유에서 일어나는 근육 조성의 변화 및 단백질 합성 속도의 저하는 노화가 진행됨에 따라 관찰된다. 산화적 스트레스로 야기될 수 있는 미토콘드리아 기능장애는 해당 효소(glycolytic enzymes) 활성의 감소와 더불어 노화된 골격근에서의 에너지 생산 저하를 일으킬 수 있다. 노화를 방지하는 운동 프로그램 및 균형있는 영양 공급이 노화된 개인에서 근육 소모 작용을 부분적으로는 대응하지만, 노화에 의존적인 퇴행성 변화를 완전히 뒤집을 수는 없다.

mRNA의 차등한 발현 프로파일(differential expression profile)이 노화에 대한 중요한 정보를 제공하고, 그러한 근육 노화의 유전체 발현 프로파일이 연구되어 왔지만, 근육 노화 과정의 필수적인 분자적 메커니즘의 보다 나은 이해를 위해 단백질에 대한 발현 프로파일 분석이 필요하다. DIGE 및 2DE를 포함하는 단백체 기술은 노화가 진행되는 동안 골격근에서 발현하는 카탈로그 단백질에 이용되어 왔다.

현재 근육 노화가 노령층의 삶의 질에 미치는 악영향은 사회적 비용을 제외하더라도 막대한 측면이 있다. 또한 근육 노화가 상당 시간 진행된 후에는 운동, 식이요법, 및 물리적 또는 약물적 치료를 병행한다 할지라도 그 예후가 좋지 않으므로, 조기에 근육 노화를 진단하고 대응하는 것이 가장 효과적인 방법일 것이다. 따라서 근육 노화의 증상들이 나타나기 전에 분자생물학적 변화를 검출하기 위한 새로운 마커의 확립은 시급한 과제라 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 젊은 마우스와 노화된 마우스의 골격근에서 발현의 차이를 보이는 단백질을 mTRAQ를 이용한 단백질체 발현 프로파일 방법으로 확인하고, 진단 마커로서 가능성 있는 유전자를 최종 선별하여, 인간 검체에서도 마커로 사용될 수 있음을 검증하며, 이들을 통해 근육 노화를 조기에 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 CSQ2(calsequestrin 2) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육 노화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 근육 노화 진단용 조성물 포함하는 근육 노화 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CSQ2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 근육 노화 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 CSQ2 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 상기 CSQ2 유전자의 mRNA 수준을 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CSQ2 유전자에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 근육 노화 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 CSQ2 유전자의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 상기 CSQ2 유전자의 단백질 수준을 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 근육세포에 근육 노화 치료제를 처리하는 단계; 및 CSQ2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는, 근육 노화 치료제를 스크리닝하는 방법를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 근육세포 내에 CSQ2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 증가 또는 감소시키는 단계를 포함하는, 근육 노화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 CSQ2(calsequestrin 2) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육 노화 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 바람직하게는, FABP3(fatty acid binding protein 3), HADHA(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA thiolase/enoyl-CoA hydratase, alpha subunit), 및 CSQ1(calsequestrin 1)로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "근육 노화"란 30세 이후 근육의 밀도와 기능이 점차적으로 약화되는 것을 의미하는데, 노화로 인한 근육 감소를 노화성 근육감소증(age-related sarcopenia)이라고도 한다. 신체적 운동을 즐기지 않을 경우 30세 이후 매 10년 마다 3 내지 5% 정도의 근육감소가 유발되며, 운동을 지속한다고 하더라도 노화에 따른 근육 손실은 회피하기 어렵다. 근육감소증을 측정할 수 있는 표준검사는 현재까지 제안된 바 없으며, 65세 내지 85세에 증상이 나타나고, 75세 이후에 증상이 빠른 속도로 심화하게 된다. 근육 노화를 경험하는 사람들은 낙상이나 골절이 쉽게 일어나는 것이 일반적이다. 근육 노화의 일반적인 원인으로는 신체 노화에 수반되는 신경세포의 노화, 성장 호르몬 및 남성 호르몬의 감소, 체내 단백질 합성 능력의 저하, 근육 밀도를 유지할 수 있도록 하는 관련 단백질 또는 칼로리 흡수 능력의 약화 등이 있다. 일차적으로 근육 노화를 치료하는 방법은 근력강화를 중점에 둔 운동이 어느 정도 도움이 되지만 근육 노화를 완전히 차단할 수는 없으며, 유로코르틴Ⅱ(urocortinⅡ)를 이용하는 방법, 호르몬 대체 치료법(hormone replacement therapy) 등이 있으나, 현재 몇 가지 부작용이 보고되어 있어 근육 노화에 대한 근본적인 치료로서는 부족한 측면이 있다.

본 발명에서 용어, "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기에서 확인하는 내용에는 병명, 병인, 병형, 경중, 및 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 예후 등이다. 이들 판단의 기초적인 자료를 얻기 위하여 주증세를 제일의 실마리로 하고, 발병에서 현재에 이르기까지의 병의 경과를 상세하게 문진하여 조사한다. 그런 다음, 현재의 신체의 상태를 모든 각도에서 검사한다.

본 발명에서 용어, "CSQ1(calsequestrin 1)" 또는 "CSQ2(calsequestrin 2)"란 근소포체의 칼슘 결합 단백질이다. 상기 단백질은 근육 수축시에 근소포체의 시스터나(cisterna)에서 칼슘을 붙잡아 두는 역할을 한다. 또한, 근소포체 내의 칼슘을 축적하기도 하는데, CSQ1 또는 2 단백질 분자 하나는 18 내지 50 개의 칼슘 이온을 결합하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 심근 형태인 CSQ2는 심근 내지는 지근 골격근 섬유에 존재하며, 골격근 형태인 CSQ1은 속근 골격근 섬유에 존재한다. 본 발명에서 근육 노화 마커로서, CSQ는 바람직하게는 CSQ1 또는 CSQ2일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 CSQ2일 수 있다.

본 발명에서 "FABP3(fatty acid binding protein 3)"란 포유류 유래의 성장 저해제(mammary-derived growth inhibitor)로도 알려져 있는 hFABP3(Heart-type fatty acid binding protein 3)이다. 상기 단백질은 15 kDa의 크기를 갖는 세포질 단백질로서, 심장에 허혈 증상이 일어나면 심근세포에서 분비되는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 FABP3는 미토콘드리아의 산화과정에서 지방산 수송과 관련된 지방산 대사과정에 관계되어 있다고 알려져 있다. 또한, 심혈관 질환, 및 퇴행성 신경질환에도 관련되어 있다고 보고되고 있다.

본 발명에서 "HADHA(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA thiolase/enoyl-CoA hydratase, alpha subunit)"는 장쇄 에노일-CoA 수화효소(Long-chain enoyl-CoA hydratase) 및 장쇄 3-하이드록시아실-CoA 탈수소효소(Long chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase) 도메인을 갖는 78 kDa의 단백질이다. 미토콘드리아 내에 존재하며, 지질 대사 및 지방산 베타-산화에 관련되어 있다. 특히, HADHA는 장쇄 3-하이드록시아실-CoA 탈수소효소 장애라는 질병과 관련되어 있는데, 상기 질병은 장쇄 지방산 대사를 수행하지 못함으로써, 에너지 생산을 원활하게 하지 못하며, 간, 심장, 망막, 및 근육에 손상을 유발한다.

본 발명에서 사용되는 상기 유전자는 미국국립보건원의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 CSQ2(NM_001232.3, NP_001223.2), FABP3(NM_004102.3, NP_004093.1), HADHA(NM_000182.4, NP_000173.2), 및 CSQ1(NM_001231.4, NP_001222.3)로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어,“mRNA 수준 측정”이란 지방유래줄기세포의 근육 노화를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 근육 노화를 나타내는 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, CSQ2, FABP3, HADHA, 및 CSQ1 유전자의 핵산 서열은 각각 NM_001232.3, NM_004102.3, NM_000182.4, 및 NM_001231.4에 밝혀져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개의 염기 내지는 수백 개의 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링이 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 CSQ2, FABP3, HADHA, 및 CSQ1 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해근육 노화를 알 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자 및 바이오틴 등이 있다.

본 발명에서 용어,“단백질 수준 측정”이란 근육노화를 탐지하기 위하여 생물학적 시료에서 근육노화를 나타내는 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어,“항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 구체적으로는 본 발명의 마커 유전자인 CSQ2, FABP3, HADHA, 또는 CSQ1가 코딩하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 scFv 등이 있다. 단백질 수준의 측정 방법으로는 웨스턴 블롯(Western blot), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 블롯을 이용하여 상기 유전자 단백질의 수준을 측정하였다 (실시예 7).

다른 하나의 양태로서, 본 발명의 근육 노화 진단용 조성물 포함하는 근육 노화 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 근육 노화 진단용 키트에는 근육 노화에 따라서 발현이 증가 또는 감소하는 마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구 및 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소의 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 근육 노화 진단용 키트는 바람직하게는 RT-PCR 키트, DNA 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩에 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체가 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있어 근육 노화 탐지에 있어 보다 유리하다.

상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있으며, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

상기 단백질 칩 키트는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 키트일 수 있다. 단백질 칩을 이용하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인할 수 있다.

또 하나의 양태로서, (a) CSQ2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 근육 노화 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 CSQ2 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 CSQ2 유전자의 mRNA 수준을 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 노화에 따라 근육량 감소, 근육 수축력 상실 등의 노화성 근육 감소증의 증세를 나타내거나 나타낼 수 있는 모든 인간을 포함한 쥐, 개, 고양이, 소, 기타 가축 등을 포함하는 모든 동물을 포함한다.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 마커 유전자의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이제 제한되지 않는다. 본 발명에서 바람직하게는 골격근 조직일 수 있다.

본 발명에서 "정상 대조구"란 근육량 감소, 근육 수축력 상실 등이 일어나지 않은 젊은 개체를 의미한다.

본 발명에서 바람직하게는, 상기 (b) 단계에서 근육 노화 의심 개체의 CSQ2 유전자의 mRNA 수준이 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가할 경우, 근육 노화 개체로 판단하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명에서 바람직하게는, FABP3, HADHA, 및 CSQ1로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자 mRNA를 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, (a) CSQ2 유전자에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 근육 노화 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 CSQ2 유전자의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 CSQ2 유전자의 단백질 수준을 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명에서 바람직하게는, 상기 (b) 단계에서 근육 노화 의심 개체의 CSQ2 유전자의 단백질 수준이 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 단백질 수준에 비하여 증가할 경우, 근육 노화 개체로 판단하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명에서 바람직하게는, FABP3, HADHA, 및 CSQ1로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자 단백질을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 마우스 검체의 경우, CSQ2, FABP3, HADHA, 및 CSQ1의 단백질 수준이 젊은 개체의 근육에 비해 노화된 개체의 근육에서 증가되어 있는 것을 확인하였다(도 2a). 또한, 인간 검체의 경우, CSQ2의 단백질 수준이 젊은 개체의 근육에 비해 노화된 개체의 근육에서 증가되어 있는 것을 확인하였다(도 3).

또 하나의 양태로서, 근육세포에 근육 노화 치료제를 처리하는 단계; 및 CSQ2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는, 근육 노화 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 바람직하게는, FABP3, HADHA, 및 CSQ1로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "근육 노화 치료제"는 근육 노화에 따라 유의하게 일어나는 유전자 발현량의 변화를 간접적 또는 직접적으로 억제 또는 유도하는 물질을 의미한다. 근육 노화 조절 물질은 노화된 근육에서 발현이 증가되어 있는 CSQ2, FABP3, HADHA, 및 CSQ1의 단백질의 발현을 감소시킴으로써, 근육노화를 억제하도록 조절할 수 있다. 따라서, 근육 노화 조절 물질의 존재 및 부재 하에서의 근육 노화 검출 마커 유전자의 발현량의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 근육 노화를 조절할 수 있고, 나아가 분화 조절 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 근육세포 내에 CSQ2 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 증가 또는 감소시키는 단계를 포함하는, 근육 노화를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 바람직하게는, FABP3, HADHA, 및 CSQ1로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질을 증가 또는 감소시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

상기 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준은 세포 내에서 유전자 발현율을 높일 수 있는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 유전자들을 포함하는 벡터를 제작하고, 이들을 세포에 형질도입시켜 이들 유전자의 발현율을 높일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 근섬유의 크기 및 수량의 감소와 관계되어 있는 것으로 알려진 NFAT의 발현 감소를 C2C12 근아세포에서 형질감염으로 실험하였다(실시예 8). CSQ2가 과발현 하는 경우 NFAT가 현저히 감소하였으므로, CSQ2가 근육노화 조절에 관계되어 있음을 확인하였다(도 2c).

본 발명은 근육 노화를 판단할 수 있는 마커들을 제공함으로써, 근육 노화 상태를 판단하는 것에 있어 유용한 자료를 제공한다. 또한, 상기 마커들은 분화 조절 물질의 스크리닝 및 근육 노화를 조절하는 데 있어 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 근육 노화와 관련된 단백질을 찾기 위해, mTRAQ를 기반으로 하는 정량화 방법을 설명하는 개략도이다.
도 2a는 면역블롯 분석 전기영동 사진이다.
도 2b는 면역블롯 분석에서 유의한 차이를 나타내는 단백질들에 대한 정량 데이터이다.
도 2c는 루시퍼라제 실험을 통한 CSQ2의 과발현 효과를 나타낸다.
도 3는 인간 시료에서 면역블롯 분석을 이용한 CSQ2의 발현을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 동물 및 시료

마우스는 Biomedical Mouse Resource Center (KRIBB)에서 입수하였다. 마우스는 경추 탈골법으로 희생하여, 근육조직을 즉시 분리한 후, 무게를 측정하고, 액체질소로 동결하였다. 상기에서 수득한 근육조직들은 실험진행시까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 2: 단백질 추출

근육조직 시료는 개체별로 독립적으로 나누어 실험을 진행하였다. 상기에서 수득된 시료는 가용성 완충액(6 M 요소, 5 mM EDTA, 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0)에서 균질화하고, 초음파 처리(20% 진폭; Sonics & Materials Inc., Newtown, CT)하였다. 그런 다음, 상기의 처리된 시료를 12,000rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하여 분획된 상층액만을 수득하여 실험에 이용하였다.

실시예 3: 단백질 소화 및 mTRAQ 표지

상기 실시예에서 수득한, 단백질 100 ㎍을 함유하는 용해물을 50 mM 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀으로 37℃에서 1 시간 동안 배양함으로써 환원하였고, 200 mM 메틸 메탄-티오설폰산으로 25℃에서 10 분간 처리하였으며, 50 mM 트리스(pH 8.0)에 10배 희석하였다. 트립신 2.5 ㎍(시퀀싱 등급; Promega, Madison, WI)을 첨가하고, 단백질의 소화를 위해 시료를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 트립신 소화물은 제조사의 프로토콜에 따라 mTRAQ(AB Sciex, Foster City, CA)로 표지하였다. 노화 근육 시료는 가벼운 mTRAQ(Δ0)로 표지하였고, 젊은 근육 시료는 무거운 mTRAQ(Δ4)로 표지하였다. 표지 반응 후에, 두 개의 표지된 시료를 결합하였다.

실시예 4: 오프겔 분획법( OFFGEL fractionation ) 및 강한 양이온-교환( strong cation - exchange , SCX ) 분획법

상기 실시예 3에서 수득한 mTAQ 표지된 단백질을 분획하기 위하여, 두 개의 다른 분획법을 이용하였다: 등전점 분획법 및 SCX 분획법. 샘플의 일부는 12-웰에 여러 pH로 준비(pH 3-10)하였고, 3100 오프겔 장치(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 분석하였다. 펩타이드 등전점 분획법은 최대 전류 50 mA 및 최대 전력 50 kVh에서 200 mW로 수행하였다. 잔여 시료는 SCX 스핀 컬럼(VS-1X01SH24; Sartorius, Goettingen, Germany)을 이용하여 SCX 분획법으로 실험하였다. 0.1% TFA에 용해된 mTRAQ로 표지된 펩타이드 시료는 pH 3.0인 25% 아세토니트릴에 녹인 5 mM 암모니움 포름산염으로 사전에 평형화시킨(pre-equilibrated) 스핀 컬럼 위에 로딩하였다. 30, 80, 200, 400, 600, 및 800 mM의 암모니움 포름산염으로 용출하여 여섯 개의 분획을 수득하였다.

실시예 5: LC - MS / MS

상기의 실시예 4에서 분획된 시료를 0.4% 아세트산에 복원하고, 분주된 시료(~1 mg)를 Eksigent HPLC 시스템 상의 역상 Magic 18aq 컬럼(15 cm × 75 mm)에 유속 300 nL/분으로 주입하였다. 컬럼은 95% 완충액 A(H₂O에 0.1%로 녹인 포름산)에 더하여 5% 완충액 B(아세토니트릴에 0.1%로 녹인 포름산)로 사용 전에 평형화하였다. 펩타이드는 10% 내지 40% 완충액 B의 선형 구배로 80분 이상 용출하였다. HPLC 시스템은 LTQ XL-Orbitrap 질량 분석계(Thermo Scientific, San Jose, CA)와 함께 이용하였다. 분무 전압은 1.9 kV로 조정했다. 조사 전장-스캔 MS 스펙트럼(Survey full-scan MS spectra, m/z 300-2000)은 오비트랩(Orbitrap)에서 해상도 100,000으로 구했고, 사전 조사 스캔으로부터 가장 강한 다섯 개의 이온 MS/MS 스펙트럼을 이온-트랩 내에서, 다음의 조건에 따라 획득하였다; 10 ppm; 정규화 충돌 에너지, 35%; 동적 배제 시간, 30 s. 데이터는 Xcalibur software v2.0.7을 이용해 구하였다.

실시예 6: 후보 유전자 발굴

MS/MS 스펙트럼은 International Protein Index mouse database (IPI mouse, version 3.58, European Bioinformatics Institute)에 대응하여 SEQUEST(TurboSequest version 27, revision 12)을 이용하여 알려진 오염물들과 마찬가지로, 분해 효소인 '트립신' 옵션, MS/MS에 대한 질량 허용오차 ±0.5 Da , MS에 대한 질량 허용오차 ±15 ppm, 펩타이드 N-말단 및 Lys 잔기 상에서 고정 변경(fixed modification) 140.095 Da에 더해 가변 변경(variable modification) +4.0071 Da으로 검색하였다. 추가로, 메티오닌 산화의 가변 변경(+15.9949 Da) 및 Cys 잔기 상(MMTS)에서 고정 변경 45.9877 Da을 허용하였다.

펩타이드 배치는 Trans-Proteomics Pipeline(TPP, version 4.0)을 이용하여 수행하였다. 에러율 5% 미만에 부합하는, 0.25 이상의 확률을 갖는 펩타이드를 뒤 이은 단백질-예측 분석(protein-prophetanalysis)에 포함하였다. 0.9 이상의 확률을 갖는 단백질을 모아, Quadquant 알고리즘을 이용하여 가벼운 mTRAQ-펩타이드 대비 무거운 mTRAQ-펩타이드의 강도 비율을 측정하였다.

단백질 데이터베이스(IPI mouse, version 3.58)에서 단백질 서열(4,189 펩타이드)과 MS/MS 데이터(총 52,886 스펙트럼)를 매칭한 결과, 총 240 개의 단백질을 식별하였고, 충분한 정량화 정보가 부족한 트립신 인위요소(artifacts)와 세 가지의 다른 단백질(에놀라제 2, 열 충격 동원 71 kDa 단백질[heat shock cognate 71 kDa protein], 및 71 kDa 단백질)을 포함하는 네 개의 오염물은 목록에서 제거하였다. 그 결과, 젊은 마우스와 늙은 마우스의 골격근으로부터 233 개의 단백질에 대한 상대적 정량 데이터를 확보하였다.

젊은 근육과 노화된 근육 시료 사이의 단백질 발현 비율은 Quad-Quant 알고리즘을 이용하여 계산하였다. 모든 가벼운 단백질/무거운 단백질(L/H) 비율의 로그값은 약 0에서 최대값을 나타냈으며, 이는 젊은 마우스 근육과 노화된 마우스 근육 모두에서 동량의 단백질이 실험에 이용되었다는 것을 암시한다. 그러나, 53 개의 단백질은 젊은 근육과 노화된 근육에서 차등하게 발현(1.5배 이상)했는데, 이들 중에서, 33 개의 단백질은 노화된 근육에서 증가된 발현을 나타내었고, 20 개의 단백질은 감소된 발현을 나타내었다.

실시예 7: 면역블롯 분석

mTRAQ 기반의 안정한 동위원소-표지 질량분석법에서 발견된 것들의 추가적인 확인를 위하여, 9개의 단백질에 대해 면역블롯 분석을 수행하였다. 면역블롯은 실시예 2에서 설명한 바와 같이 수행하였는데, 동결된 근육을 균질화하고, 용해 완충액(50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 10% 글리세롤, 1 mg/ml 아프로티닌, 1 mg 류펩틴, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF) 하에서 초음파 처리하였다. β-에놀라제(β-enolase), Fabp3(fatty acid-binding protein 3), 및 β-액틴(β-actin)에 대응하는 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA)에서 구매하였다. 항-Ldha(lactate dehydrogenase A) 항체는 Signaling Technology Inc.(Danvers, MA)에서 구매하였다. 항-비멘틴(vimentin) 항체는 Abcam(Cambridge, UK)에서 구매하였다. 항-Hadha(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA thiolase/enoyl-CoA hydratase, alpha subunit) 항체는 Sigma-Aldrich Inc.(St. Louis, MO)에서 구매하였다. 항-Fbxo22(F-box protein 22) 항체는 ProteinTech Group, Inc.(Chicago, IL)에서 구매하였다. 항-CSQ(calsequestrin) 항체는 본 발명자들에 의해 개발되었으며, 항-퍼옥시레독신2(peroxiredoxin 2) 항체는 채호준 박사(전남대학교, 대한민국)에게 증여받았다.

면역블롯 실험 결과, Fbxo22 및 β-에놀라제는 특이적 항체로 노화된 골격근에서 감소했음을 명백하게 확인하였다. Fabp3, CSQ, 및 Hadha는 노화된 근육에서 유의적으로 증가하였다. Ldha, 비멘틴, 및 퍼옥시레독신2는 젊은 근육과 노화된 근육 간에 유의적인 차이를 보이지 않았다(도 2a 내지 도 2b).

실시예 8: 세포 배양 및 루시퍼라제 분석

마우스 C2C12 근아세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)에서 구입하여, 10% FBS, 20 mM HEPES, 및 항생제(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)를 포함하는 DMEM으로 5% CO₂를 함유한 습윤한 공기에서 37℃로 배양하였다. 활성화된 T 세포 핵 인자(nuclear factor of activated T cells, NFAT) 루시퍼라제 리포터 벡터(pNFAT-Luc, Stratagene, La Jolla, CA)를 CSQ2(NM_001232.3) cDNA를 수반하는 C-말단 노란색 형광 단백질(YFP)이 융합된 pLenti M1.4-MCMV 또는 pLenti M1.4-MCMV-YFP과 함께 리포펙타민(Life Technologies)을 이용하여 공형질감염하였다. 세포 자극은 탑시가르긴(thapsigargin, Sigma)을 이용하여 수행하였으며, 루시퍼라제 분석은 제조사(Promega, Fitchburg, WI)의 지시에 따라 진행하였다.

NFAT는 골격근에서 잘 알려진 Ca^{2 +}-의존적 유전자 발현의 활성인자이며, NFATc2 및 -c3가 없는 마우스는 근섬유 크기 및 수량이 각각 감소한다. 흥미롭게도, CSQ2 과발현은 C2C12 근아세포에서 Ca^{2 +}에 의해 유발된 NFAT-의존적 전사 활성을 차단하며, 이는 노화된 근육에서 CSQ2 증가가 근섬유 형성에 필수적인 NFAT 활성을 저해하여, 근육에 장애를 야기할 수 있다는 것을 시사한다(도 2c).

실시예 9: 인간 시료에서 CSQ2 발현 면역블롯 분석

인간 골격근 시료는 연령의 차이가 나는 젊은 남자(25, 33, 및 41세) 및 노령의 남자(67, 68, 및 70세)에서 획득하였다. 각각의 시료는 분리 즉시 무게를 측정하고 액체질소에서 동결하였으며, 실험이 진행될 때까지 -80℃에서 동결 보관하였다. 면역블롯 분석을 위한 단백질 추출방법은 상기 실시예 2에 전술한 것과 동일한 과정으로 수행하였다. 또한, 항-CSQ 항체의 경우에도 실시예 8에 전술된 것과 동일하게, 본 발명자들이 개발한 항체를 이용하였다.

인간 근육 노화의 진단 마커로서의 용도를 입증하기 위해, 마우스 시료를 이용한 면역블롯 분석의 결과 유의하게 증가한 것으로 확인된 단백질인 CSQ2에 대하여 실험한 결과, CSQ 2가 노화에 따라 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

상기 결과들을 종합하면, Fabp3, Hadha, 및 CSQ이 마우스 골격근 시료에서 노화에 따라 유의한 발현의 차이가 나타남을 확인하였고, 상기 단백질들 중에서, CSQ2를 인간 근육 노화를 진단 마커로서 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.

이상의 본 발명의 상기에 기술된 실시예에 의해 한정되지 않고, 당업자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

Claims (14)

1. CSQ2(calsequestrin 2) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육 노화 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 FABP3(fatty acid binding protein 3), HADHA(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA thiolase/enoyl-CoA hydratase, alpha subunit), 및 CSQ1(calsequestrin 1)로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는, 근육 노화 진단용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 유전자 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
   
5. 제1항의 조성물을 포함하는 근육 노화 진단용 키트.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인, 키트.
   
7. (a) CSQ2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 근육 노화 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 CSQ2 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 CSQ2 유전자의 mRNA 수준을 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 근육 노화 의심 개체의 CSQ2 유전자의 mRNA 수준이 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 mRNA 수준에 비하여 증가할 경우, 근육 노화 개체로 판단하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법.
   
9. 제7항에 있어서, FABP3, HADHA, 및 CSQ1로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자 mRNA를 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법.
   
10. (a) CSQ2 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 근육 노화 의심 개체의 분리된 생물학적 시료로부터 CSQ2 유전자의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 CSQ2 유전자의 단백질 수준을 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 근육 노화 의심 개체의 CSQ2 유전자의 단백질 수준이 정상 대조구 시료의 CSQ2 유전자의 단백질 수준에 비하여 증가할 경우, 근육 노화 개체로 판단하는 단계를 포함하는, 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법.
    
12. 제9항에 있어서, FABP3, HADHA, 및 CSQ1로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자 단백질을 추가로 측정 및 비교하는 단계를 포함하는 근육 노화 진단을 위한 정보의 제공 방법.
    
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