KR100902282B1 - 당뇨병 진단용 조성물, 이를 포함하는 당뇨병 진단 키트 및당뇨병 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GPx3(Glutathion peroxidase 3)가 당뇨병 진단의 마커가 될 수 있음을 확인하고, 이를 당뇨병 마커로 사용하여 당뇨병을 진단하는 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.

GPx3, 당뇨병, 진단마커

Description

당뇨병 진단용 조성물, 이를 포함하는 당뇨병 진단 키트 및 당뇨병 진단방법{A diagnostic composition for diabetes , a diagnostic kit comprising it and diagnostic methods of diabetes}

도 1은 동물세포주 HEK-293에서 발현시킨 재조합 단백질 GPx3을 정제하여 SDS-PAGE 법을 수행한 후 Coomasie 염색한 사진이다.

도 2는 재조합 단백질 GPx3에 특이적인 다클론 항체(래비트)를 사용하여 GPx3에 대해 웨스턴 블롯 시험한 그래프이다.

도 3은 재조합 단백질 GPx3에 특이적인 다클론 항체(래비트)를 사용하여 재조합 단백질과 직접적 ELISA를 시험한 그래프이다.

도 4는 재조합 단백질 GPx3에 특이적인 다클론 항체로 표준액을 이용하여 샌드위치 ELISA 시험한 그래프이다.

도 5는 당뇨병(DM) 그룹, 정상내당능(NGT) 그룹 및 내당능장애(IGT) 그룹의 혈장 GPx3 농도를 나타낸 그래프이다.

도6은 동물세포주에서 재조합 GPx3 단백질의 발현을 위해 기존의 pCEP 벡터를 분비신호가 포함되도록 변형시켜 제작한 pCP4PL 벡터의 모식도이다.

도7은 재조합 인간 GPx3 단백질 제조를 위한 주형 DNA로 사용하기 위하여 GPx3 유전자의 염기서열 중 정지코돈 부위를 시스테인으로 치환한 것을 나타내는 도면이다.

최근 식생활의 서구화와 스트레스, 운동부족 등으로 인하여 동맥경화, 고혈압 및 당뇨병 등의 만성생활습관성 성인병이 증가하고 있다. 특히 국내 당뇨병의 유병률은 1970년 인구 1% 미만이었으나 1980년대 말 약 3%, 1990년대 5~8%로 보고되고 있고, 2003년도 성균관의대 강북성심병원 종합검진센터의 수진자 59,174명을 분석한 결과 20대 4.3%, 30대 15.9%, 40대 21.7%, 50대 26.0%, 60대 28.1%, 70대 31.3%가 당뇨병 전단계 판정을 받음으로써 혈당관리가 요구되는 인구수가 급증하고 있는 추세에 있다.

당뇨병은 인슐린(insulin)을 비롯한 글루카곤(glucagon), 글루코코티코이드(glucocorticoid) 등의 호르몬 불균형으로 탄수화물을 비롯한 단백질, 지질 및 전해질 대사 등 생리적 대사 조절 기능의 이상이 발생하여 고혈당, 당뇨 등의 특징적인 증세를 나타내며 이러한 심각한 만성적 합병증을 가져오게 된다.

현재 사용되고 있는 당뇨병의 진단방법 중 가장 확실한 진단법은 혈당측정기를 이용하여 하는 혈당검사이고, 혈당이 정상 범위도 아니면서 또 당뇨병이라고 할 만큼 높지 않은 경우(내당능장애)와 같이, 당뇨병의 진단이 모호한 경우 경구당부하검사를 하게 된다. 또한, 소변에서 혈당치를 측정하는 요당검사가 있고, 혈당이 높아지면 포도당의 일부가 혈색소(헤모글로빈)에 결합하여 형성한 당화혈색소를 측정하여 당뇨병을 진단하는 방법이 있다.

그러나 당뇨병에 있어서, 아직 유전자 진단의 이용은 활발히 이루어지지 못하고 있으며, 또한, 현재까지 많은 종류의 당뇨병 치료제가 개발되어 있고 개발이 진행 중이나 만족할 만한 치료방법이나 약물은 개발되지 못하였다.

현재 당뇨병과 관련된 것으로 알려진 유전자는 PTPN1, NRF1, PCK1, SLCI2A3 등이 있으나, 당뇨병 진단마커로 GPx3가 보고된 바는 없다.

GPx(Glutathione peroxidases; GPx)는 환원된 글루타치온의 존재하에서 과산화 수소를 제거하는 항산화효소로, 5가지 isoform이 알려져 있고, 각 isoform은 다른 기질 특이성과 조직분포를 가지고 있다(Brigelius-Flohe, R. (1999) Free Radic.Biol.Med. 27, 951-965; Takebe, G., Yarimizu, J., Saito, Y., Hayashi, T., Nakamura, H., Yodoi, J., Nagasawa, S., and Takahashi, K. (2002) J.Biol.Chem. 277, 41254-41258). GPx 패밀리는 셀레노시스테인 잔기(selenocysteine residue)와 결합된 셀레늄 원자를 포함하는 셀레늄 의존 효소이며(Kryukov, G. V., Castellano, S., Novoselov, S. V., Lobanov, A. V., Zehtab, O., Guigo, R., and Gladyshev, V. N. (2003) Science 300, 1439-1443), 이 중 GPx3는 과산화물뿐만 아니라 유기 과산화물과 지질과산화물을 촉매하는 세포외 효소로 혈장 GPx(plasma GPx)라고도 불린다 (Yamamoto, Y. and Takahashi, K. (1993) Arch.Biochem.Biophys. 305, 541-545; Maddipati, K. R. and Marnett, L. J. (1987) J.Biol.Chem. 262, 17398-17403). GPx3는 신장에서 과발현되나 GPx3 mRNA는 폐, 심장, 간 또는 눈에서도 발견된다(Yoshimura, S., Watanabe, K., Suemizu, H., Onozawa, T., Mizoguchi, J., Tsuda, K., Hatta, H., and Moriuchi, T. (1991) J.Biochem.(Tokyo) 109, 918-923; Chu, F. F., Esworthy, R. S., Doroshow, J. H., Doan, K., and Liu, X. F. (1992) Blood 79, 3233-3238; Maser, R. L., Magenheimer, B. S., and Calvet, J. P. (1994) J.Biol.Chem. 269, 27066-27073). GPx3의 발현수준은 콩팥기능이상에 의하여 감소되고(Yoshimura, S., Suemizu, H., Nomoto, Y., Sakai, H., Katsuoka, Y., Kawamura, N., and Moriuchi, T. (1996) Nephron 73, 207-211), GPx3발현의 감소는 허혈성 심장병 환자(ischaemic heart disease patients)의 동맥혈전(arterial thrombosis)과 관련되어 있다고 알려져 있다(Porter, M., Pearson, D. J., Suarez-Mendez, V. J., and Blann, A. D. (1992) Clin.Sci.(Lond) 83, 343-345). 그러나, 당뇨병 진단 마커로서 GPx3가 보고된 바는 없다.

본 발명자는 GPx3가 당뇨병 환자의 조직에서 발현이 감소하는 것을 발견하고, 동물세포에서 GPx3 재조합 단백질을 발현시켜 GPx3 특이적 다클론 항체를 제조 하였으며, 이로써 GPx3를 진단마커로 하여 당뇨병을 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 GPx3(Glutahione peroxidase 3) 유전자의 수준을 측정하는 물질 또는 GPx3 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 당뇨병 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 당뇨병 진단용 조성물을 포함하는 당뇨병 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 당뇨병 진단용 조성물 또는 이를 포함하는 진단키트를 이용하여 당뇨병을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 GPx3(Glutahione peroxidase 3)의 핵산 또는 단백질을 포함하는 새로운 당뇨병 진단 마커에 관한 것이다.

본 발명에서, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 당뇨병 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 당뇨병의 발병여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis

marker)"란 당뇨병 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하고, 정상 세포에 비하여 당뇨병을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 당뇨병 진단 마커는 정상 세포에 비해 당뇨병을 가진 세포에서 감소하는 GPx3 유전자와 단백질이다.

본 발명에서 "GPx3(Glutahione peroxidase 3)" 는 셀레늄 의존 항산화 효소인 글루타치온 퍼옥시다제 패밀리 중 하나로 세포외액과 혈장에서 발견된다. GPx3는 환원형 글루타치온을 이용해 과산화물, 유기과산화물 또는 지질과산화물을 제거하는 것으로 알려져 있다. 인간GPx3는 NCBI ACCESSION number; NM_002084 이며, 당뇨병 진단 마커로서 GPx3가 알려진 바는 없다.

본 발명에서는 제 2 당뇨병(diabetes mellitus, DM), 정상내당능(normal glucose tolerance, NGT) 군 및 내당능장애(impaired glucose tolerance, IGT) 군의 조직과 체액에서 GPx3의 혈청 등 체액에서의 항원 단백질 수준이 감소하는 것을 확인하여 GPx3를 당뇨병 진단 마커로 사용할 수 있음을 보였다.

따라서, 본 발명의 일 양태에서는, GPx3 단백질 또는 이를 암호화하는 유전

자의 발현 수준을 측정할 수 있는 핵산물질을 포함하는 당뇨병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 GPx3를 암호화하는 유전자의 발현 수준, 바람직하게는 GPx3 유전자의 mRNA 수준을 측정할 수 있는 물질은 GPx3 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함한다. GPx3 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하여 GPx3의 발현을 mRNA 수준에서 효과적으로 검출할 수 있다. 당업자는 알려진 서열, 특히 GPx3 유전자의 경우 NM_002084(NCBI)에 의해 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 "프라이머"란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl

group)를 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 GPx3 유전자에 특이적인 프라이머로, 바람직하게 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스(전향) 및 안티센스(후향) 핵산으로 구성될 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은, 필요한 경우 분광학적,

광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다. 본 발명에서 프라이머 쌍은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다.

본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 것이다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법,

또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연 결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

표적 유전자 서열을 이미 밝혔으므로, 당해 분야의 전문가는 기존의 데이터베이스를 토대로 표적 유전자 내 서열간의 혼성화 정도 등의 변수를 고려하여, 특이성 및 민감성이 높은 다양한 프라이머 쌍의 조합을 쉽게 결정할 수 있다.

본 발명에서, 상기 GPx3 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 GPx3 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 포함하며, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적 단편도 포함한다. 항체 분자의 "기능적 단편"이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편으로서, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기한 바와 같이 당뇨병 진단 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "다클론 항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서, 다양한 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 결정기(에피토프)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 단클 론 항체와는 달리, 다클론 항체는 항원 상의 다양한 결정기에 대해서 지시된다. 본 발명에 따른 다클론 항체는 GPx3 단백질의 면역원을 동물에 주사하여 면역화한 후, 면역화된 동물로부터 채혈하여 혈청 및 혈장 내에서 GPx3의 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 선별하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 다클론 항체의 제작은 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 재조합된 GPx3 단백질의 면역원을 토끼에 면역화시킨 후, 면역화된 토끼로부터 채취한 혈액의 혈청 및 혈장 내에서 GPx3의 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 선별하여 이로부터 GPx3에 특이적인 다클론 항체를 제조하였다.

"단클론 항체"는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법((hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, GPx3 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 당뇨병 진단용 조성물을 포함하는 당뇨병 진단키트 또는 진단시스템을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 진단키트 또는 진단 시스템은, 이에 한정되는 것은 아 니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립, 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스, RT-PCR 키트 및 DNA 칩 키트 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 ELISA 키트 또는 면역크로마토그래피를 이용한 딥-스틱 형태이다.

본 발명의 진단 키트는, 상기한 바와 같은 GPx3 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 진단용 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

상기 진단키트가 ELISA 키트인 경우, 바람직하게 마커 단백질에 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특 이적인 항체를 포함할 수 있다.

상기 키트가 RT-PCR 키트인 경우, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 표소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있으며, 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 바람직하게, 상기 진단키트가 DNA칩 키트인 경우, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA나 올리고 염기가 부착되어 있는 기판을 포함할 수 있다.

본원 실시예에서는 본 발명에 따라 제조한 인간 GPx3 ELISA kit를 이용하여 당뇨병 환자의 혈장을 분석하여 GPx3 항원 발현이 당뇨병 환자에서 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, GPx3 유전자의 발현수준 또는 GPx3 단백질 수준을 측정하여 당뇨병을 진단하는 방법 및 상기의 방법으로 당뇨병의 진행단계 또는 예후를 측정하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은,

(a) 본 발명에 따른 상기 진단용 조성물을 당뇨병 발생에 의해 GPx3 유전자의 발현 수준이 차이날 수 있는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 시료의 GPx3 유전자의 수준 또는 GPx3 단백질의 수준을 대조시료의 수준과 비교하는 단계를 포함하는 당뇨병의 진단 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란, 당뇨병 발생에 의해 GPx3 유전자 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

GPx3 유전자의 발현 수준 측정을 위해 바람직하게 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 경우, 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR , 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여 대조군에서의 mRNA 발현량과 당뇨병 환자 또는 당뇨병 의심 환자의 생물학적 시료 내의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량의 정도를 비교함으로써 당뇨병 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.

한편, GPx3 단백질의 수준을 측정하는 경우에는, 바람직하게 GPx3에 특이적인 항체 등을 이용하여, 상기 항체와 생물학적 시료 내의 GPx3 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 GPx3의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당 업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광 학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적, 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 목적상, 항원-항체 복합체의 검출 방법으로, 바람직하게는 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역형광법, 색체입자결합법, 화학발광물질결합법 등이 이용될 수 있으며, 특히 바람직한 방법은 샌드위치 엘라이자(Sandwich ELISA) 방법이다.

ELISA 검출 방법을 이용하는 경우, GPx3 단백질을 포함할 것으로 의심되는 생물학적 시료 샘플은 고체 지지체, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 또는 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 다클론 항체와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 다클론 항체로 코팅하고 점유되지 않은(nonoccupied) 결합 부위를 예를 들어 BSA로 차단한 후, 코팅된 플레이트의 웰을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다.

항원-항체 복합체의 존재는 항원-항체 복합체의 항원에 대해 특이적인 항체, 예를 들어 GPx3 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체를 사용하거나 또는 GPx3 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 항체들은 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출 표지를 갖지 않는 경우에는 이들 항체 를 검출할 수 있는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, GPx3 단백질과 본 발명에 따라 제조된 다클론 항체 간의 항원-항체 복합체를 검출하기 위하여, 상기 복합체의 항원에 결합하는 제2항체로서, GPx3에 특이적으로 결합하는 다클론 항체에 바이오틴을 결합시킨 항체를 사용하였다. 다른 예로는, 상기 복합체에 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지를 갖는 항체를 첨가하여, 이로부터 검출 표지 신호를 측정하여 GPx3를 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에서 항원-항체 복합체의 검출에 특히 바람직한 또다른 방법으로는 다클론 항체를 콜로이드상 금 입자와 결합시키는 금 입자 결합법을 들 수 있다.

이와 같이, 항원-항체 복합체의 검출은 직접 또는 간접적으로 표지된 항체의 사용을 수반하는데, 이들 사용 가능한 검출 표지로는, 상기한 바와 같은 바이오틴-스트렙트아비딘 결합체 외에도, 형광 염료(예: 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광 단백질 등), 방사성표지물(예: 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예: HRP, 알칼라인 포스파타제 및 기타 ELISA에서 일반적으로 사용되는 것들), 및 색채표지물, 예를 들어 콜로이드상 금 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다. 이러한 표지물의 사용을 기술하고 있는 문헌[U.S. Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; and 4,366,241; Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene Oreg.)]을 참조하 라.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군과 당뇨병 의심 환자에서의 유전자 발현 수준을 비교함으로써 당뇨병 환자여부를 진단할 수 있고, 당뇨병의 진행 단계 또는 예후를 예측할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간 GPx3 ELISA 키트의 제조

실시예 1-1) PCR , 클로닝 및 재조합 단백질 제조

동물세포 HEK293-EBNA에서 GPx3 재조합 단백질 발현을 위한 플라스미드의 구축을 위해 프라이머, 즉 전방향 프라이머-1(5' -gcc caa gct tga tta caa gga tga cga tga caa gca gag ccg ggg aca aga gaa g- 3')(서열번호 1) 및 역방향 프라이머-1(5' -ccc gct cga ggg atc ctt act tcc tct tga ccc cca g- 3')(서열번호 2)를 분비신호서열을 제외하고 모든 부분이 포함되도록 디자인하였으며, Invitogene 사의 pCEP 벡터를 분비신호가 포함되도록 변형시켜 제작한 pCP4PL 벡터의 특성에 따라 스톱 코돈을 포함시켰다(도6 및 도7 참조). 또한, 클로닝을 위해 전방향 프라 이머에는 HindIII, 역방향 프라이머에는 XhoI 제한효소 부위를 첨가하였다.

PCR은 전체 볼륨을 50ul로 하였으며, 중간 부분의 스톱 코돈이 시스틴 아미노산으로 대체된 주형 DNA(도7 참조)(서열번호3, cgtggccagctactgcggcctgacgggc 서울대 박경수 교수 실험실 제공) 10ng, 10× Pfu 반응완충액(Stratagene) 5ul, 클로닝된 Pfu 폴리머라제(Stratagene) 1U, 0.2mM dNTP, 및 각각 10pmol 의 프라이머를 배합하여 PCR하였다. PCR은 PTC-150(MJ Research)을 사용하여 30 사이클 동안 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 2분의 조건으로 하였다.

PCR 완료 후, PCR 산물을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 이용해서 정제하였다. 정제된 DNA는 클로닝을 위해 NEB 완충액 2(New England Biolabs)에서 제한효소 HindIII와 XhoI(New England Biolabs)을 처리했다. 제한효소 처리 후 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고, QIAquick 겔 추출 키트(QIAquick gel extraction kit, Qiagen)를 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 삽입 DNA를 HindIII와 XhoI으로 처리한 pCP4PL 벡터와 T4 DNA 리가아제(ligase) 완충액에서 T4 DNA 리가아제(NEB)로 결합하여 대장균 균주 DH10b에 전기충격주입(electroporation)하였다. 클로닝 여부는 플라스미드 정제 키트(Genenmed)로 소량 정제하여 확인하였다.

동물세포주 HEK293-EBNA(Invitrogen)에서의 발현을 위해, 클로닝된 벡터를 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000; Invitrogen)으로 DMEM, 10% FBS, 250μg/ml G418, 및 100U-μg/ml 페니실린-스트렙토마이신이 든 배양배지에서 자라는 HEK293-EBNA 세포주에 트랜스펙션(transfection)시킨 후, 하이그로마이신(hygromycin; invitrogne) 200μg/ml 농도 하에서 자라는 세포를 1개월간 선별하였다. 선별된 세 포주를 대량으로 증식시킨 후 그 세포 배양액을 수거하고 초여과 키트(Ultrafilteration kit; Millipore)를 이용하여 10~20배 농축시켰다. TBS(2.42g Tris base, 8g NaCl, pH 7.6) 완충액으로 완충된 항-FLAG M2 아가로스 컬럼(anti-FLAG M2 agarose column)에 농축된 배양액을 통과시키고, TBS 완충액으로 20배 컬럼 부피로 컬럼을 세척하여 비특이적인 단백질들을 제거한 후, 100mM 글리신(glycine), pH 3.0 완충액으로 컬럼(column)에 결합된 특이적인 재조합 단백질 GPx3을 용출시켰다. 용출된 단백질을 TBS에서 투석시켜 최종적으로 단백질을 얻었다. 얻어진 단백질을 SDS-PAGE 및 쿠마시(Coomasie) 염색법을 통해 확인하였다(도 1).

실시예 1-2) 웨스턴 블롯 시험

재조합 단백질을 1X 브릴란트 블루 R(brilliant blue R) 염료를 사용한 샘플 완충액에 100ng/10ul 의 농도로 조정한 후, 잘 혼합하여 5분 동안 끊는 물에 중탕하여 각 웰당 10ul 씩 12% 설페이트-폴리아크릴레이트 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 젤에 로딩하였다. 전기영동이 완료된 후, 4℃에서 18시간 NC(니트로셀룰로스) 막에 단백질을 전이시켰다. 전이된 NC 막을 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS (PBS/T) 용액으로 세척하였다. 상온에서 1시간 동안 5% 탈지 우유로 비특이성 반응을 차단한 후, PBS/T 용액으로 세척하였다. 니트로셀룰로스 막을 상온에서 1시간 동안 5% 탈지 우유에 GPx3 항체를 1:4,000배 의 양으로 희석한 후 반응시켰다. 그 후 PBS/T 용액으로 5회 세척하였다. 그 후 니트로셀룰로스 막을 상온에서 1시간 동안 HRP-결 합된 항-래비트 항체(5% 탈지 우유로 1:10,000으로 희석) 10 ㎖에 담그었다. PBS/T용액으로 5회 세척하였다. SuperSignalⓡ WestPico Chemiluminescent Substrate(PIERCE 키트)를 사용하여 발광시키고 화학발광계로 발광을 측정하였다. 웨스턴 블롯 결과 30-kDa 내외의 분자량을 확인 할 수 있었다(도 2).

실시예 1-3) 다클론 항체를 사용한 ELISA 시험

상기 실시예 1-1) 및 1-2)에서 정제된 단백질로 인간 GPx3 단백질에 대한 다클론 항체를 제조하고, 제조된 항체를 이용하여 재조합 단백질과의 항원 항체 반응 즉, ELISA를 수행하였다. 이들 항체가 재조합된 단백질과 다클론 항체 반응을 직접적 ELISA 분석 결과, 흡광도 2.54 (1: 8.000배 희석) 이상의 항체 역가를 얻을 수 있었다(도 3).

실시예 1-4) GPx3 검출을 위한 Sandwich ELISA 키트 제조

GPx3 단백질을 검출하기 위한 ELISA 검정 키트를 제조하기 위해, GPx3에 특이적인 다클론 항체와 상기 다클론 항체에 바이오틴이 결합된 다클론 항체를 이용하여, 구체적으로 다음과 같이 수행하였다.

포획 항체로서 정제한 다클론 항체를 50mM 탄산염 완충용액(pH 9.6)에 5μg/ml로 희석하여 100μl씩 96 웰 플레이트(0.5μg/well)에 분주하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 버리고 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 플레이트의 빈 공간을 차단하기 위해 0.05% Tween 20과 1% BSA가 포함된 PBS 200ul 를 각 웰에 넣고 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 다시 3번 세척하였다.

샘플은 사람으로부터 채취한 샘플을 각 웰에 100ul씩 가하였다. 이때 실험의 유효성을 평가하기 위해 양성 대조군과 음성 대조군을 같이 실시하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 버리고, 3번 세척하였다. 2차 항체로서 바이오틴이 결합된 다클론 항체를 0.1% BSA가 포함된 PBS에 1ug/ml로 희석하여 각 웰에 100ul씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 반응이 끝난 후 3번 세척하였다.

흡광도를 측정하여, 표준액에 표준 곡선을 선택하여 혈청에서의 정량 값을 계산하였다(도 4).

농도를 알고 있는 8개의 시료를 intra-assay 정밀성(precision)을 평가하기 위해 하나의 플레이트에서 12번 테스트하였고, inter-Assay 정밀성(precision)을 평가하기 위하여 농도를 알고 있는 8개의 시료를 분리된 플레이트에서 8번 테스트하였다. 사람 혈청에서 Sandwich ELISA kit를 이용하여 intra-Assay한 표에서 CV 값을 환산하여 이를 표1에 나타내었고, inter-Assay한 표에서 CV 값을 환산하여 표2에 나타내었다. 또한, Sandwich ELISA kit에서 다른 단백질과의 교차 반응성을 표3에 나타내었다.

[표 1]은 Intra-Assay (precision within an assay)에 관한 것이다.

[표 2]은 Inter-Assay (precision within an assay)에 관한 것이다.

[표 3]은 다른 단백질과의 교차반응성에 관한 것이다.

N. R.: 교차반응 없음(No Cross-reactivity)

실시예 2: 당뇨병 환자에서 GPx3 발현감소 확인

제 2 당뇨병(diabetes mellitus, DM, n=49), 정상내당능(normal glucose tolerance, NGT, n=57) 및 내당능장애(impaired glucose tolerance, IGT, n=48)를 가진 사람을 실험 대상으로 하였다. NGT, IGT 및 DM은 미국 당뇨병 학회(American Diabetes Association)의 진단기준에 따른 75g 경구 당부하검사(oral glucose tolerance test; OGTT)로 결정하였다. 제 2 당뇨병의 모든 실험대상(DM)은 당뇨병 치료를 받은 적이 없는 환자로 택하였다. 57명의 NGT 중 1명, 48명의 IGT 중 5명 및 49 명의 DM 중 10명은 항고혈압 치료를 받은 적이 있으며, 57명의 NGT 중 2명, 48명의 IGT 중 5명, 및 49명의 DM 중 2명은 지질 저하제(lipid lowering agent)를 투여 받은 적이 있었다.

서울대학교병원의 기관윤리심의위원회(The Institutional Review Board of the Clinical Research Institute in Seoul National University Hospital)에서 연구 프로토콜을 승인 받았으며, 각 실험대상 환자로부터 동의서를 받았다. 실험대상의 혈압, 키, 몸무게 및 허리와 엉덩이 둘레를 측정하고, 혈장 포도당 수준은 포도당 산화효소 방법(glucose oxidase method, YSI 2300 STAT; Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH)에 의하여 측정하였다. 총 콜레스테롤, 중성지방(triglyceride) 및 HDL-콜레스테롤 농도는 자동분석기(Hitachi 747, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 효소법으로 측정하였다. HbA1c는 바이오-래드 배리언트 Ⅱ 시스템(Bio-Rad Variant Ⅱ System, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의하여 측정하였고, 혈장 인슐린 농도는 방사능면역측정법(radioimmunoassay, BioSource S.A., Nivelles, Belgium)으로 측정하였다. 전체 지방량(total fat mass)은 생물전기 저항 분석(bioelectrical impedance analysis, Inbody 2.0; Biospace, Seoul, South Korea)으로 측정하였다. 인슐린 저항성 및 베타세포 기능에 대한 항상성 모델 평가(homeostasis model assessment for insulin resistance, HOMA-IR; homeostasis model assessment for beta cell function, HOMA-B)는 [글루코스 (mmol/l) x 인슐린 (μIU/ml)]/22.5 및 20×fasting insulin (μU/mL)/fasting glucose (mmol/L) ― 3.5 로 각각 계산하였다.

참고문헌: D.R. Matthews, J.P. Hosker and A.S. Rudenski et al., Homeostasis model assessment: insulin resistance and B-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man, Diabetologia 28 (1985), pp. 412―419

실험 대상의 병적인 특징(clinical characteristics)은 표 4에 나타내었다.

실시예 1에서 제조한 인간 GPx3 ELISA kit를 이용하여 상기 실험대상의 혈장을 분석하였다. 통계적 분석에 있어서 정상분포를 가지고 있는 모든 연속변수는 평균±표준편차로 나타내었으며, 비대칭 분포를 가지고 있는 변수들은 그 범위의 중앙값으로 나타내었다. Studen't t-tests, ANOVA, 피어슨 상관분석(pearson's correlation analyses), 다중선형회귀분석(multiple linear regression analyses)을 SPSS 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL)를 이용하여 수행하였다. 0.05 이하의 P 값이 통계적으로 의미 있는 것으로 고려되었다.

성별과 관계없이 당뇨병(DM) 그룹의 혈장 GPx3 농도가 정상 내당능군(NGT) 이나 내당능장애군(IGT) 보다 현저히 낮게 나타났다(도 5).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 당뇨병 진단에 유용한 마커로서 GPx3 유전자 및 단백질을 제공하였으며, 이를 이용하여 당뇨병을 보다 신속하고 정확하게 진단할 수 있도록 하였다.

<110> Adipogen, Inc seoul national university industry foundation <120> A diagnostic composition for diabetes, a diagnostic kit comprising it and diagnostic methods of diabetes <130> PA9702-0121 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GPx3 recombinant protein expression plasmid <400> 1 gcccaagctt gattacaagg atgacgatga caagcagagc cggggacaag agaag 55 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GPx3 recombinant protein expression plasmid <400> 2 cccgctcgag ggatccttac ttcctcttga cccccag 37 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A template DNA for PCR in which the stop codon in the middle is substituted with the codon for amino acid residue of cystein <400> 3 cgtggccagc tactgcggcc tgacgggc 28

Claims (13)

1. GPx3(Glutahione peroxidase 3) 유전자의 수준을 측정하는 물질 또는 GPx3 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하되, 상기 GPx3 유전자의 수준을 측정하는 물질은 GPx3 유전자의 mRNA에 상보적인 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 GPx3 유전자의 mRNA에 상보적인 프로브이고, 상기 GPx3 단백질의 수준을 측정하는 물질은 GPx3 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병 진단용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 항체가 GPx3 단백질을 특이적으로 인식하는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제5항에 있어서, GPx3 단백질에 특이적인 다클론 항체에 표지가 결합된 제 2 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 표지가 바이오틴인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물을 포함하는 당뇨병 진단키트.
9. 제8항에 있어서, 상기 진단키트가 ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립, 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스, RT-PCR 키트 및 DNA 칩 키트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
10. 제9항에 있어서, 상기 진단키트는 GPx3 단백질에 특이적인 항체가 고정된 ELISA(Enzyme-linked Immnosorbent assay) 플레이트를 포함하는 것을 특징으로 하 는 키트.
11. 제9항에 있어서, 상기 진단키트는 면역크로마토그래피법을 이용하는 딥-스틱 디바이스인 것을 특징으로 하는 키트.
12. 제2형 당뇨병의 진단을 위하여,

    (a) 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및

    (b) 상기 시료 내 GPx3 유전자의 수준 또는 GPx3 단백질의 수준이 대조시료에 비해 낮은 것을 확인하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병 마커 GPx3의 검출 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 당뇨병 발생에 의해 GPx3 유전자 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 구성되는 군으로부터 선택되는 시료인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

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