KR102547531B1

KR102547531B1 - 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 바이오마커

Info

Publication number: KR102547531B1
Application number: KR1020210121319A
Authority: KR
Inventors: 김은영; 안용민; 김경곤; 안희성
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단; 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2023-06-26
Also published as: KR102547504B1; KR20220034708A; KR20220034707A; KR102547505B1; KR20220034709A

Abstract

본 발명은 MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 항우울제 투여에 대한 반응을 결정하는 MADRS 평가를 대체하여 우울증 환자에 대한 약물의 치료 반응성을 객관적으로 확인할 수 있는 장점이 있다.

Description

주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 바이오마커 {Biomarkers for evaluating treatment responsiveness of major depressive disorder}

본 발명은 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 바이오마커에 관한 것으로, 더 상세하게는 MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 바이오마커에 관한 것이다.

주요 우울 장애(Major depressive disorder, MDD)는 지속적인 우울감과 활동력 저하를 특징으로 하는 우울증 상태가 지속적 또는 반복적으로 나타나는 정신장애로, 모든 연령과 인종에서 나타나는 질환이다. 증상으로는 우울감과 절망감, 흥미나 쾌락의 현저한 저하, 저하되거나 증가된 식욕과 체중, 수면양의 감소나 증가, 신체적 초조 또는 활동 속도의 지체, 성욕의 상실이나 피로감, 부적절한 죄책감과 책임감, 무가치감, 집중력의 저하 또는 우유부단함, 죽음이나 자살에 대한 생각 등이 있다. 이와 같은 증상이 사회생활은 물론 일상생활에 문제를 일으키는 심각한 수준으로 2주 이상 지속되는 경우, 주요 우울장애로 진단될 수 있다. 주요 우울 장애는 사회적·직업적 생활에 여러 장애를 일으키며, 전체 회복율이 20%에 불과하고 회복된 환자의 80%가 일생 동안 적어도 한 번 이상의 재발을 경험하는 재발률이 매우 높은 질환이다.

주요 우울 장애의 치료를 위해서는 주로 항우울제를 처방받게 되는데, 항우울제 중 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)는 가장 대표적인 항우울제이다.

이러한 항우울제 투여에 대한 반응을 결정하는 표준 기준으로는 MADRS 평가가 있다. 주요 우울 장애의 관찰자 평가척도로서 현재까지 가장 널리 사용되고 있는 것은 Hamilton 우울증 평가 척도(Hamilton Depression Rating Scale, 이하, 'HAM.D'라고 지칭함)이었으나, Montgomery와 Asberg는 HAM.D가 치료에 따른 우울 증상의 변화를 민감하게 탐지하기 보다는 진단적 측면을 더 반영한다고 비판하면서, 이러한 점을 개선한 척도로 Montgomery-Asberg Depression Rating Scale(이하, 'MADRS'라고 지칭함)을 개발하였다. 이들은 65개 항목으로 이루어진 전반적 정신병리 척도인 Comprehensive Psychopathological Rating Scale (이하 CPRS)로부터 우울증과 관련된 17개의 항목을 1차 선별한다. 그리고 그 중 4주간의 치료 효과와 상관성이 가장 높았던 10개, 즉 겉으로 드러나는 슬픔(Apparent sadness), 스스로 보고하는 슬픔(Reported sadness), 내적 긴장감(Inner tension), 수면저하(Reduced sleep), 식욕저하(Reduced appetite), 집중의 어려움(Concentration difficulty), 권태(Lassitude), 느낌의 상실(Inability to feel), 비관적 사고(Pessimistic thoughts), 자살 사고(Suicidal thoughts) 항목을 추려 MADRS를 구성하였다. 각 항목별로 간략한 정의와 표준화된 질문이 제시되어 있고, 0점에서 6점까지의 일곱 단계로 평가하되 0, 2, 4, 6점에는 조작적으로 정의된 응답점(anchor point)이 붙어 있고, 1, 3, 5점은 아래·위 점수의 중간에 해당할 때 주도록 되어 있다. MADRS는 HAM.D에 비해 항목의 수가 적어 평가 시간이 짧고 우울증의 감정적, 인지적 측면이 강조되어 평가자의 관찰보다는 피검자의 주관적인 보고에 근거해 평가하는 항목의 비율이 높다. 따라서 MADRS는 HAM.D보다 평가자 훈련이 수월하여 항우울제의 치료 반응을 평가하는 대규모 연구에서 편리함과 아울러 경제적인 이점을 가질 수 있다.

그러나, MADRS를 우울증 지표로 활용하는 경우에도 피검자의 주관적인 보고에 근거해 평가하기 때문에 평가 결과의 객관성이 담보될 수 없고, 설문에 응답할 수 없는 피검자에 대해서는 MADRS 평가가 어려우며, 외국에서 제작된 척도를 기반으로 한 MADRS의 설문이 국내 환자를 대상으로 한 우울증 지표로서 신뢰할 수 있는지에 대해서도 검증이 필요하다.

한편, 프로테오믹스(proteomics)란 샘플에서 발현되는 모든 단백질을 정량 분석하는 기술로, 새로운 분자 바이오마커를 식별하기 위한 강력한 도구 중 하나이며, 주요 우울 장애 환자의 치료에 대한 반응에 있어서도 여러 생물학적 경로를 반영하는 분자 검출이 가능하다(Martins-de-Souza, D. et al., Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 2010, 260, 499-506). 혈장 및 혈청과 같은 말초 체액의 단백질체 분석은 임상 치료에 대한 반응을 예측하고 특히 임상 초기 단계에서 약물 활성을 모니터링하는 데 도움이 된다. 그러나 현재까지 항우울제 치료에 대한 반응을 예측할 수 있는 말초혈액 검체의 단백질체 분석은 거의 없는 실정이며, 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(LC-MS/MS) 에서는 여러 혈장 단백질이 6주 치료 기간 동안 항우울제 반응을 예측하는 잠재적 바이오마커가 될 수 있음을 확인하였고, 면역, 내분비 및 대사 기전과 관련된 최대 258개의 혈액 기반 마커에 대한 다중 면역 분석 테스트에서 9개의 마커가 항우울제 치료 반응과 관련된 잠재적인 치료 전 바이오마커가 될 수 있음을 확인하였다 (Turck, C.W. et al., Front. Mol. Neurosci. 2017, 10, 272; Chan, M.K. et al., J. Psychiatr. Res. 2016, 83, 249-259).

종단 데이터(longitudinal data)는 일반적으로 생물의학 연구에 사용되는데, 통계 분석에는 혼합 효과 모델(mixed-effect models, MEMs)과 일반화 추정 방정식(generalized estimating equations, GEEs)이 널리 적용된다. 이 중 MEM은 전체 가능성 방법(full-likelihood method)을 기반으로 하는 대상체 수준 접근 방식(subject-level approach)으로, 동일한 통계 단위에서 반복측정이 이루어지거나 관련 통계 단위의 클러스터에서 측정이 이루어지는 설정에서 특히 유용하다. 누락된 값을 처리하는 데 있어 장점이 있기 때문에 혼합 효과 모델은 분산에 대한 반복적인 측정 해석과 같은 보다 전통적인 접근 방식보다 선호된다. 반대로 GEE는 부분 우도 함수(partial-likelihood function)에 의존하는 모집단 수준 모델(population-level model)이다. 프로테오믹스 연구에서는 MEM 방법이 GEE 방법보다 널리 사용되는데, 이는 원하는 효과를 고정한 후 실제 MS로 기술적 또는 생물학적 반복 측정의 무작위 효과를 측정하여 추정할 수 있기 때문이다. 또한 2회 이상의 MS 후 동일한 샘플의 반복 측정에 대한 임의의 영향의 변화(variance of any effect)를 반영하는 것이 기술적으로 더 쉽다. 대조적으로, GEE는 준우도(quasi likelihood)를 이용한 상관 구조의 설정 오류가 강건하여 표본에 대한 수정된 분산 추정 방법이 많이 개발된 바 있다.

본 발명자들은 우울증 환자에 대한 약물의 치료 반응성을 객관적으로 확인할 수 있는 방법을 모색하던 중, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제를 투여시 약물에 민감하게 반응하는 우울증 환자 (이하, '반응자'로 지칭됨)와 약물에 민감하게 반응하지 않는 우울증 환자 (이하, '무반응자'로 지칭됨) 사이에서 일부 단백질의 발현 양상이 유의하게 차이가 나고, 이들 중 mRNA 발현 양상에서도 유사한 패턴으로 반응자와 무반응자 사이에 유의하게 차이가 나는 단백질을 추가로 검증함으로써, 이들 바이오마커를 주요 우울 장애 치료 반응성을 확인할 수 있는 바이오마커로 활용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

Martins-de-Souza, D. et al., Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 2010, 260, 499-506 Turck, C.W. et al., Front. Mol. Neurosci. 2017, 10, 272 Chan, M.K. et al., J. Psychiatr. Res. 2016, 83, 249-259

본 발명의 목적 주요 우울 장애 치료에 대한 반응성을 객관적으로 평가할 수 있는 바이오마커를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 바이오마커를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 치료 반응성은 선택적 세로토닌 재흡수 억제제에 대한 치료 반응성인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 에스시탈로프람인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 치료 반응성은 인플릭시맙에 대한 치료 반응성인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 압타머인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는, 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 주요 우울 장애 치료 반응성 평가를 위한 정보 제공 방법을 제공한다:

(a) 주요 우울 장애 치료제가 투여된 대상체에서 분리된 샘플에서 MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 측정된 발현 수준을 대조군 발현수준과 비교하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 주요 우울 장애 치료제는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 주요 우울 장애 치료제는 인플릭시맙인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 항우울제 투여에 대한 반응을 결정하는 MADRS 평가를 대체하여 우울증 환자에 대한 약물의 치료 반응성을 객관적으로 확인할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 약물 투여에 따라 차등 발현되는 단백질의 변화를 식별하기 위한 혈장 단백질체 분석 결과 및 이들 단백질 기능을 도시한 것으로, 도 1A는 약물 반응자(Responders)와 약물 무반응자(Non-responders)에서 약물 투여의 시작점과 비교하여 차등적으로 발현 양상이 변화하는 단백질(diffrentially abundant proteins)을 약물 투여 1주, 4주, 10주에 확인한 결과이고, 도 1B는 T₀와 비교하여 T₁, T₄, T₁₀에서 차등 발현되는 단백질을 벤 다이어그램으로 표시한 결과이며, 도 1C는 T₀와 비교하여 T₁, T₄, T₁₀에서 반응자와 무반응자 간 차등적으로 발현 양상이 변화하는 단백질들의 유전자 온톨로지(gene ontology)를 나타낸다.
도 2는 선형 혼합 모델(LMM)의 반응/시간 상호 작용에서 크게 상이한 것으로 확인된 37개 단백질의 친화성 전파 클러스터링, 프로파일 분석 및 데이터베이스 검색 결과를 나타낸 것이다. 도 2A는 t-SNE 기반 친화성 전파 클러스터링 (t-SNE-based affinity propagation clustering)으로 7개의 단백질 클러스터를 식별한 결과이고, 도 2B는 시간 경과에 따른 반응자와 무반응자 사이의 단백질 양의 변화를 확인한 결과이며, 도 2C는 PsyGeNet에서 확인된 정신 질환과 연관된 14개 단백질을 나타낸 결과이고, 도 2D는 Enrichr의 DrugMatrix 범주에서 발견된 10개의 단백질이 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI)에 대한 쥐 조직 및 세포의 반응과의 연관성이 있음을 보여주는 결과이다.
도 3은 선형 혼합 모델에서 확인된 반응자와 무반응자 사이에서 유의한 발현 차이를 보이는 6개 단백질의 기준일(투약 전)에 대한 투약후 1주, 4주, 10주에 정량값 변화를 나타낸 결과이다.
도 4는 선형 혼합 모델에서 확인된 반응자와 무반응자 사이에서 유의한 발현 차이를 보이는 MYH9, PCSK9 및 PLEK 단백질의 혈액내 정량 변화 및 GEO 데이터 세트(GSE146446)를 이용하여 외부 검증한 결과이다. 도 4A는 반응군(파란색) 및 무반응군(빨간색)에서 MYH9, PCSK9 및 PLEK의 3개 바이오마커와 관련하여 투약 전과 투약 후 4주, 10주에서의 혈액 내 단백질의 로그2 폴드-차이를 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준오차를 나타낸다. 도 4B는 항우울제와 위약을 투여하기 전과 투여 후 8주 후의 MYH9, PCSK9 및 PLEK의 3개 유전자에서 mRNA 발현이 정량적으로 변화한다는 것을 GSE146446 데이터 세트에서 확인한 결과이다. 오차 막대는 평균의 표준오차를 나타낸다.
도 5는 선형 혼합 모델에서 확인된 반응자와 무반응자 사이에서 유의한 발현 차이를 보이는 CALU, CTSD 및 SH3BGRL3 단백질의 혈액내 정량 변화 및 GEO 데이터 세트(GSE45468)를 이용하여 외부 검증한 결과이다. 도 5A는 반응군(꽉찬 동그라미) 및 무반응군(텅빈 동그라미)에서 약물 투약 전, 투약 후 1주, 4주의 CALU, CTSD 및 SH3BGRL3의 혈액 내 단백질 정량 값을 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준오차를 나타낸다. 도 5B는 인플릭시맙 투여 전과 6시간, 24시간 및 2주 후 환자에서 3개의 유전자인 CALU, CTSD 및 SH3BGRL3에 대한 mRNA 발현 수준을 GSE45468 데이터 세트에서 확인한 결과이다. 반응자는 꽉찬 동그라미, 무반응자는 텅빈 동그라미 모형으로 표시되었다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 중 하나인 에스시탈로프람을 주요 우울 장애 환자에 투여하고, 약물 효능이 발휘되는 반응자와 약물 효능이 발휘되지 않는 무반응자에서 기준일(baseline) 및 치료 후 후속 방문을 통해 시간에 따른 대리 혈장 단백질(surrogate plasma protein)의 변화를 측정한 후, 선형 혼합 모델(linear mixed model, LMM) 분석 결과를 중심으로 단백질 변화의 생물학적 의미를 파악하였으며, 동일한 데이터를 GEE로 분석한 후 결과를 비교하였다.

이후, 항우울제 에스시탈로프람 투여 전후에 초기(0-1주), 중간(1-4주) 또는 후기(4-10주) 반응을 모니터링할 수 있는 후보 혈액 기반 단백질 바이오마커를 식별하기 위하여 LC-MS/MS 프로파일링이 수행하였다. 또한, 본 발명에서는 항우울제 치료 후 혈장 단백질 농도의 변화가 우울 증상의 중증도 변화와 관련이 있는지 여부를 평가하였다. 에스시탈로프람을 복용하고 있는 우울증 환자 10명(반응자 5명, 무반응자 5명)을 대상으로 10주간 치료하는 동안 4개의 시점에서 혈액 샘플을 수집하였으며, 두 그룹 간의 단백질 풍부도(protein abundance)의 차이가 나는 37개의 혈장 단백질이 프로파일링되었다.

이후, 이들 37개 혈장 단백질을 두 개의 GEO 데이터 세트(GSE146446 [Belzeaux, R. et al. Nat. Commun. 2020, 11, 1635] 및 GSE45468 [Mehta, D. et al. Brain Behav. Immun. 2013, 31, 205-215])와 비교 검증한 결과, MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3가 각각 선택적 세로토닌 재흡수 억제제에 대하여 반응성/시간에 대한 정량적 유의미한 차이를 나타낸다는 것이 확인되었다 (P ＜０.05） (표 3).

따라서, 본 발명은 일 관점에서 MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 바이오마커에 관한 것이다.

MYH9은 myosin heavy chain 9으로 BDPLT6, DFNA17, EPSTS, FTNS, MATINS, MHA, NMHC-II-A, NMMHC-IIA, NMMHCA로도 표시될 수 있으며, 인간에서Gene ID: 4627의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 MYH9단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. P35579, GeneBank Accession No. NM_002473.6, NP_002464.1 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 MYH9 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

PCSK9는 proprotein convertase subtilisin/kexin type 9로 FH3, FHCL3, HCHOLA3, LDLCQ1, NARC-1, NARC1, PC9로도 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 255738의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 PCSK9 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. Q8NBP7, GeneBank Accession No. NM_174936.4, NP_777596.2 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 PCSK9 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

PLEK는 pleckstrin로 P47로도 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 5341의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 PLEK 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. P08567, GeneBank Accession No. NM_002664.3, NP_002655.2 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 PLEK 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

CALU는 calumenin으로 인간에서 Gene ID: 813의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 CALU 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. O43852-3, GeneBank Accession No. NM_001130674.3, NP_001124146.1, NM_001199671.2, NP_001186600.1, NM_001199672.2, NP_001186601.1, NM_001199673.2, NP_001186602.1, NM_001219.5, NP_001210.1 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 CALU 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

CTSD는 cathepsin D로 CLN10, CPSD, HEL-S-130P으로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 1509의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 CTSD 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. P07339, GeneBank Accession No. NM_001909.5, NP_001900.1 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 CTSD 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

SH3BGRL3는 SH3 domain binding glutamate rich protein like 3 또는 SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 3로, HEL-S-297, SH3BP-1, TIP-B1로도 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 83442의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 SH3BGRL3 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. Q9H299, GeneBank Accession No. NM_031286.4, NP_112576.1 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 SH3BGRL3 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 6로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

[MYH9 서열정보]

<서열번호 1> UniProtKB Sequence: P35579 (1960 aa)

MAQQAADKYLYVDKNFINNPLAQADWAAKKLVWVPSDKSGFEPASLKEEVGEEAIVELVENGKKVKVNKDDIQKMNPPKFSKVEDMAELTCLNEASVLHNLKERYYSGLIYTYSGLFCVVINPYKNLPIYSEEIVEMYKGKKRHEMPPHIYAITDTAYRSMMQDREDQSILCTGESGAGKTENTKKVIQYLAYVASSHKSKKDQGELERQLLQANPILEAFGNAKTVKNDNSSRFGKFIRINFDVNGYIVGANIETYLLEKSRAIRQAKEERTFHIFYYLLSGAGEHLKTDLLLEPYNKYRFLSNGHVTIPGQQDKDMFQETMEAMRIMGIPEEEQMGLLRVISGVLQLGNIVFKKERNTDQASMPDNTAAQKVSHLLGINVTDFTRGILTPRIKVGRDYVQKAQTKEQADFAIEALAKATYERMFRWLVLRINKALDKTKRQGASFIGILDIAGFEIFDLNSFEQLCINYTNEKLQQLFNHTMFILEQEEYQREGIEWNFIDFGLDLQPCIDLIEKPAGPPGILALLDEECWFPKATDKSFVEKVMQEQGTHPKFQKPKQLKDKADFCIIHYAGKVDYKADEWLMKNMDPLNDNIATLLHQSSDKFVSELWKDVDRIIGLDQVAGMSETALPGAFKTRKGMFRTVGQLYKEQLAKLMATLRNTNPNFVRCIIPNHEKKAGKLDPHLVLDQLRCNGVLEGIRICRQGFPNRVVFQEFRQRYEILTPNSIPKGFMDGKQACVLMIKALELDSNLYRIGQSKVFFRAGVLAHLEEERDLKITDVIIGFQACCRGYLARKAFAKRQQQLTAMKVLQRNCAAYLKLRNWQWWRLFTKVKPLLQVSRQEEEMMAKEEELVKVREKQLAAENRLTEMETLQSQLMAEKLQLQEQLQAETELCAEAEELRARLTAKKQELEEICHDLEARVEEEEERCQHLQAEKKKMQQNIQELEEQLEEEESARQKLQLEKVTTEAKLKKLEEEQIILEDQNCKLAKEKKLLEDRIAEFTTNLTEEEEKSKSLAKLKNKHEAMITDLEERLRREEKQRQELEKTRRKLEGDSTDLSDQIAELQAQIAELKMQLAKKEEELQAALARVEEEAAQKNMALKKIRELESQISELQEDLESERASRNKAEKQKRDLGEELEALKTELEDTLDSTAAQQELRSKREQEVNILKKTLEEEAKTHEAQIQEMRQKHSQAVEELAEQLEQTKRVKANLEKAKQTLENERGELANEVKVLLQGKGDSEHKRKKVEAQLQELQVKFNEGERVRTELADKVTKLQVELDNVTGLLSQSDSKSSKLTKDFSALESQLQDTQELLQEENRQKLSLSTKLKQVEDEKNSFREQLEEEEEAKHNLEKQIATLHAQVADMKKKMEDSVGCLETAEEVKRKLQKDLEGLSQRHEEKVAAYDKLEKTKTRLQQELDDLLVDLDHQRQSACNLEKKQKKFDQLLAEEKTISAKYAEERDRAEAEAREKETKALSLARALEEAMEQKAELERLNKQFRTEMEDLMSSKDDVGKSVHELEKSKRALEQQVEEMKTQLEELEDELQATEDAKLRLEVNLQAMKAQFERDLQGRDEQSEEKKKQLVRQVREMEAELEDERKQRSMAVAARKKLEMDLKDLEAHIDSANKNRDEAIKQLRKLQAQMKDCMRELDDTRASREEILAQAKENEKKLKSMEAEMIQLQEELAAAERAKRQAQQERDELADEIANSSGKGALALEEKRRLEARIAQLEEELEEEQGNTELINDRLKKANLQIDQINTDLNLERSHAQKNENARQQLERQNKELKVKLQEMEGTVKSKYKASITALEAKIAQLEEQLDNETKERQAACKQVRRTEKKLKDVLLQVDDERRNAEQYKDQADKASTRLKQLKRQLEEAEEEAQRANASRRKLQRELEDATETADAMNREVSSLKNKLRRGDLPFVVPRRMARKGAGDGSDEEVDGKADGAEAKPAE

[PCSK9 서열정보]

<서열번호 2> UniProtKB Sequence: Q8NBP7 (692 aa)

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ

[PLEK 서열정보]

<서열번호 3> UniProtKB Sequence: P08567 (350 aa)

MEPKRIREGYLVKKGSVFNTWKPMWVVLLEDGIEFYKKKSDNSPKGMIPLKGSTLTSPCQDFGKRMFVFKITTTKQQDHFFQAAFLEERDAWVRDIKKAIKCIEGGQKFARKSTRRSIRLPETIDLGALYLSMKDTEKGIKELNLEKDKKIFNHCFTGNCVIDWLVSNQSVRNRQEGLMIASSLLNEGYLQPAGDMSKSAVDGTAENPFLDNPDAFYYFPDSGFFCEENSSDDDVILKEEFRGVIIKQGCLLKQGHRRKNWKVRKFILREDPAYLHYYDPAGAEDPLGAIHLRGCVVTSVESNSNGRKSEEENLFEIITADEVHYFLQAATPKERTEWIRAIQMASRTGK

[CALU 서열정보]

<서열번호 4> UniProtKB Sequence: O43852-3 (323 aa)

MKETDLIIMDLRQFLMCLSLCTAFALSKPTEKKDRVHHEPQLSDKVHNDAQSFDYDHDAFLGAEEAKTFDQLTPEESKERLGKIVSKIDGDKDGFVTVDELKDWIKFAQKRWIYEDVERQWKGHDLNEDGLVSWEEYKNATYGYVLDDPDPDDGFNYKQMMVRDERRFKMADKDGDLIATKEEFTAFLHPEEYDYMKDIVVQETMEDIDKNADGFIDLEEYIGDMYSHDGNTDEPEWVKTEREQFVEFRDKNRDGKMDKEETKDWILPSDYDHAEAEARHLVYESDQNKDGKLTKEEIVDKYDLFVGSQATDFGEALVRHDEF

[CTSD 서열정보]

<서열번호 5> UniProtKB Sequence: P07339 (412 aa)

MQPSSLLPLALCLLAAPASALVRIPLHKFTSIRRTMSEVGGSVEDLIAKGPVSKYSQAVPAVTEGPIPEVLKNYMDAQYYGEIGIGTPPQCFTVVFDTGSSNLWVPSIHCKLLDIACWIHHKYNSDKSSTYVKNGTSFDIHYGSGSLSGYLSQDTVSVPCQSASSASALGGVKVERQVFGEATKQPGITFIAAKFDGILGMAYPRISVNNVLPVFDNLMQQKLVDQNIFSFYLSRDPDAQPGGELMLGGTDSKYYKGSLSYLNVTRKAYWQVHLDQVEVASGLTLCKEGCEAIVDTGTSLMVGPVDEVRELQKAIGAVPLIQGEYMIPCEKVSTLPAITLKLGGKGYKLSPEDYTLKVSQAGKTLCLSGFMGMDIPPPSGPLWILGDVFIGRYYTVFDRDNNRVGFAEAARL

[SH3BGRL3 서열정보]

<서열번호 6> UniProtKB Sequence: Q9H299 (93 aa)

MSGLRVYSTSVTGSREIKSQQSEVTRILDGKRIQYQLVDISQDNALRDEMRALAGNPKATPPQIVNGDQYCGDYELFVEAVEQNTLQEFLKLA

본 발명에 있어서, 상기 치료 반응성은 선택적 세로토닌 재흡수 억제제에 대한 치료 반응성인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 에스시탈로프람인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 치료반응성은 인플릭시맙에 대한 치료 반응성인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "바이오마커"는 항우울제 투여에 따른 반응성을 구분할 수 있는 물질로, 항우울제 투여에 따른 반응군과 무반응군에서 발현 양상의 차이를 보이기 때문에, 예컨대 mRNA 또는 단백질 수준에서의 발현 수준이 반응군과 무반응군에서 서로 상이하기 때문에, 그 발현 수준을 평가함으로써 항우울제 투여에 대한 반응성을 판단하거나 평가할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명에서 평가란, 항우울제 투여에 의해 치료 효과가 발휘되는지 여부를 판단하거나 결정하거나 진단하는 것을 의미하며, 예후를 판단, 결정, 진단하거나 치료 효과를 예측한다는 의미를 모두 포함한다.

본 발명에 있어서, 바이오마커 종류에 따라 상기 평가는 항우울제(선택적 세로토닌 재흡수 억제제) 투여 전, 예컨대 기준일에 진행될 수 있고, 항우울제(선택적 세로토닌 재흡수 억제제) 투여 후 반응성을 확인하고자 하는 임의의 시점에서 진행될 수 있으며, 예컨대, 항우울제 투여 후 3 시간 내지 6개월 내 임의의 시점, 예를 들어, 항우울제 투여 후, 3시간, 6시간, 12시간 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 18주, 19주, 20주, 21주, 22주, 23주, 24주 후 진행될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

다른 관점에서, 본 발명은 MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 바이오마커 단백질의 단편은 면역원성 단편일 수 있다. 즉, 상기 바이오마커 단백질의 단편은 상기 바이오마커 단백질이 항체에 의해 인식될 수 있도록 하는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단편일 수 있다.

본 발명에서, 상기 "단백질의 발현 수준 측정"은 대상체의 시료에서 바이오마커 단백질의 존재 여부와 발현정도를 확인하는 과정으로, 바이오마커 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있다. 또는 바이오마커 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 확인 가능한 것일 수 있다.

일 양태로서 바이오마커 단백질의 발현 수준 측정은 상기 바이오마커 단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 압타머를 이용하여 단백질을 확인할 수 있다.

바이오마커 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 다른 양태의 분석방법으로는 웨스턴블랏팅, 질량분석 (Mass Spectrometry), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포 분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 일 양상에 따른 항체의 형태는 특별히 한정되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 포함되고 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있으며, 나아가, 인간화 항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다. 일 양태에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개 의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, scFv 등일 수 있다.

상기 "유전자의 발현 수준"은 해당 유전자의 mRNA의 발현 수준 또는 해당 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 확인 가능한 것일 수 있다. 일 양태로서, 발현 수준에 차이가 나는 유전자를 바이오마커로 활용할 수 있으며, 구체적으로는, 해당 유전자의 발현 수준에 따라 대상체에 대한 항우울제의 반응성이 상이한 것으로 판단되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사 시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 하는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미할 수 있다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산이거나, 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

유전자 발현 수준 측정을 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단백질을 암호화하는 mRNA 발현양을 측정하는 제제는 일 양태에 따르면 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드이며, 상기 유전자의 핵산 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 mRAN에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 유전자의 mRNA의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 평가할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"란 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다.

프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 일 양상에 따른 유전자의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부 및 정도를 통해 방사선 피폭 여부 및 정도를 판단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다

상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등과 같은 하전되지 않은 연결체 또는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등과 같은 하전된 연결체로의 변형이 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 주요 우울 장애 치료 반응성 평가용 키트에 관한 것이다.

상기 키트에 사용되는 상기 유전자, 상기 단백질, 상기 단백질의 단편, 발현 수준, 및 발현 수준의 측정은 상술한 바와 같으며, 중복 기재를 생략한다.

상기 키트는 세포 용해 완충액(lysis buffer)을 더 포함할 수 있다. 상기 세포 용해 완충액은 상용화된 제품 등 다양한 물질을 포함할 수 있다. 상기 세포 용해 완충액은 HEPES, MgCl₂, NaCl, 이미다졸, DNAse 및 β-mercaptoethanol이 포함될 수 있고, 단백질의 분해를 방지하기 위해 프로테이즈 저해제인 PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride)가 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 키트는 유전자 또는 단백질을 분해 (Digestion)하는 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 유전자 분해 시약은 제한효소 등을 포함할 수 있다. 상기 단백질 분해 시약은 트립신, 트립신/EDTA, 또는 TrypLE 등을 포함할 수 있으나, 상기 유전자 또는 단백질 분해 시약은 이에 한정되지 않는다.

상기 키트는 동위원소로 라벨링된 표준 펩타이드(Isotope labeled standard peptide) 혼합물을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 데이터 분석 또는 통계처리를 할 수 있는 프로그램을 더 포함할 수 있다. 상기 프로그램은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 것일 수 있다. 상기 데이터 분석 또는 통계처리 프로그램은 Skyline Software, ProteoWizard Software, SCIEX OS Software, SPSS Statistics Software, MedCalc Software, MultiQuant Software, MasterView Software 또는 Cliquid Software 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 키트는 평가에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 압타머, 프라미어, 프로브 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 주요 우울 장애 치료 반응성 평가를 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다:

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 주요 우울 장애 치료제는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 에스시탈로프람인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 주요 우울 장애 치료제는 인플릭시맙인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서는 약물을 투여한 후 분리된 샘플에서 측정된 바이오마커의 혈액 내 단백질 발현 수준이 약물을 투여하기 전 또는 위약 투여군 (대조군)과 비교하여,

(i) MYH9의 발현이 반응군에서 감소, 무반응군에서 증가;

(ii) PCSK9 발현이 반응군에서 감소, 무반응군에서 증가;

(iii) PLEK 발현이 반응군에서 감소, 무반응군에서 증가; 하는 결과를 확인하였다.

따라서, 본 발명에서는 약물을 투여한 후 분리된 샘플에서 측정된 바이오마커의 혈액 내 단백질 발현 수준이 약물을 투여하기 전 또는 위약 투여군 (대조군)과 비교하여,

(i) MYH9의 발현이 감소하는 경우 약물에 대한 반응군으로, MYH9의 발현이 증가하는 경우 무반응군으로 평가;

(ii) PCSK9 의 발현이 감소하는 경우 약물에 대한 반응군으로, PCSK9 의 발현이 증가하는 경우 무반응군으로 평가; 및/또는

(iii) PLEK의 발현이 감소하는 경우 약물에 대한 반응군으로, PLEK의 발현이 증가하는 경우 무반응군으로 평가;할 수 있을 것이다.

본 발명에서는 약물을 투여한 후 분리된 샘플에서 측정된 바이오마커의 혈액 내 mRNA 발현 수준이 약물을 투여하기 전 또는 위약 투여군 (대조군)과 비교하여,

(i) MYH9의 발현이 반응군에서 감소, 무반응군에서 증가;

(ii) PCSK9 발현이 반응군에서 감소;

따라서, 본 발명에서는 약물을 투여한 후 분리된 샘플에서 측정된 바이오마커의 혈액 내 mRNA 발현 수준이 약물을 투여하기 전 또는 위약 투여군 (대조군)과 비교하여,

(ii) PCSK9 의 발현이 감소하는 경우 약물에 대한 반응군으로 평가; 및/또는

본 발명에 있어서, 상기 약물은 선택적 세로토닌 재흡수 억제제일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 에스시탈로프람 일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 약물은 인플릭시맙일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서, 반응군으로 평가되는 경우, 상기 약물, 예컨대 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 또는 인플릭시맙은 치료 효과가 있는 것으로 평가될 수 있다.

본 발명에서, 용어 '약물(예컨대, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 또는 인플릭시맙)이 투여되기 전'은 기준일(baseline)과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 약물이 투여되기 전 분리된 샘플에서 측정된 대조군 바이오마커는 상기 분리된 샘플에서 발현 수준이 측정된 바이오마커와 동일한 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 (i) MYH9의 단백질 발현은 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 반응군에서 4주 후 23% 이상 감소, 10주 후 20% 이상 감소되었으나, 무반응군에서는 4주 후 127% 이상 증가, 10주 후 160% 이상 증가하는 것으로 나타난 바, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 MYH9의 발현이 유의미하게 감소하는 경우 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 치료 효과를 발휘하는 것으로 예측될 수 있다. 예컨대, MYH9의 발현이 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 10% 이상 감소, 바람직하게는 20% 이상 감소하는 경우 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 치료 효과를 발휘하는 것으로 예측될 수 있을 것이다. 본 발명에 있어서, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제의 치료 효과를 확인하기 위한 MYH9 발현양 변화는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여된지 약 4주 또는 약 10주 후에 확인하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (ii) PCSK9의 단백질 발현은 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 반응군에서 10주 후 78% 이상 감소하였으나, 무반응군에서는 4주 후 190% 이상 증가, 10주 후 280% 이상 증가하는 것으로 나타난 바, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 PCSK9의 발현이 유의미하게 감소하는 경우 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 치료 효과를 발휘하는 것으로 예측될 수 있다. 예컨대, PCSK9의 발현이 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 50% 이상 감소, 바람직하게는 60% 이상 감소, 더욱 바람직하게는 70% 이상 감소하는 경우 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 치료 효과를 발휘하는 것으로 예측될 수 있을 것이다. 본 발명에 있어서, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제의 치료 효과를 확인하기 위한 PCSK9 발현양 변화는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여된지 약 10주 후에 확인하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (iii) PLEK의 단백질 발현은 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 반응군에서 4주 후 39% 이상 감소, 10주 후 32%이상 감소하였으나, 무반응군에서는 4주 후 120% 이상 증가, 10주 후 190% 이상 증가 증가하는 것으로 나타난 바, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 PLEK의 발현이 유의미하게 감소하는 경우 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 치료 효과를 발휘하는 것으로 예측될 수 있다. 예컨대, PLEK의 발현이 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여되기 전과 비교하여 20% 이상 감소, 바람직하게는 30% 이상 감소하는 경우 상기 선택적 세로토닌 재흡수 억제제는 치료 효과를 발휘하는 것으로 예측될 수 있을 것이다. 본 발명에 있어서, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제의 치료 효과를 확인하기 위한 PLEK 발현양 변화는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여된지 약 4주 또는 약 10주 후에 확인하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.

한편, 본 발명에서는 CALU, CTSD, SH3BGRL3의 발현양도 반응군과 무반응군에서 서로 상이한 양상을 보이는 것을 확인하였으며(도 5 참조), 이와 같은 반응 양상을 확인함으로써 약물의 치료 반응성을 평가할 수 있음을 알 수 있었다.

구체적으로, 단백질 발현 양상에서는 CALU, CTSD의 경우 각각 반응군에서는 투약 전에 비해 투약 4주 후 단백질 발현양이 감소하였으나, 무반응군에서는 투약 전에 비해 투약 4주 후 단백질 발현양이 증가하였고, SH3BGRL3는 반응군에서 투약 전에 비해 투약 1주 및 4주 후 단백질 발현양이 감소하였으나, 무반응군에서는 투약 전후 단백질 발현양에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

한편, mRNA 발현 양상에 있어서도 투약전과 비교하여 투약 6시간, 12시간, 2주에서 반응군과 무반응군에 독특한 발현 양상이 확인된 바, 투약 전과 비교하여 투약 약 6시간, 약 12시간, 약 2주에서 CALU, CTSD, SH3BGRL3의 mRNA 발현 양상을 도 5B와 비교함으로써 약물에 대한 반응성을 확인할 수 있을 것이다.

즉, 본 발명에서는 약물을 투여한 후 분리된 샘플에서 측정된 바이오마커의 혈액 내 단백질 발현 수준이 약물을 투여하기 전 또는 위약 투여군 (대조군)과 비교하여,

(i) CALU 발현이 반응군에서 감소, 무반응군에서 증가;

(ii) CTSD 발현이 반응군에서 감소, 무반응군에서 증가;

(iii) SH3BGRL3 발현이 반응군에서 감소; 하는 결과를 확인한 바,

(i) CALU의 발현이 감소하는 경우 약물에 대한 반응군으로, MYH9의 발현이 증가하는 경우 무반응군으로 평가;

(ii) CTSD 의 발현이 감소하는 경우 약물에 대한 반응군으로, PCSK9 의 발현이 증가하는 경우 무반응군으로 평가; 및/또는

(iii) SH3BGRL3의 발현이 감소하는 경우 약물에 대한 반응군으로 평가;할 수 있을 것이다.

상기 단백질의 발현양 변화는 약물, 예컨대 선택적 세로토닌 재흡수 억제제가 투여된지 약 4주 후에 확인하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 환자의 혈장 단백질체에서 시간 의존적 종단 변화에 의한 신뢰할 수 있는 후보 바이오마커를 도출하고 이를 기존에 보고된 mRNA 발현 양상에 대한 대규모 데이터와 비교 검증함으로써 항우울제 투여에 대한 치료 반응성을 분자적 수준에서 객관적으로 확인할 수 있도록 하여, 신뢰도 있는 항우울제 치료 반응성을 제공할 수 있다는 점에 그 의의가 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 임상 시험 피험자 선정

MADRS 점수는 약물 투여에 대한 반응을 결정하는 기준으로 간주되므로, 2013년 2월부터 2016년 2월까지 서울대학교병원에서 수행하는 에스시탈로프람 용량 증량의 효능 및 안전성을 테스트하는 임상 시험에 참여한 10명의 주요 우울 장애 환자로부터 혈장 샘플을 수집하였다. 모든 참가자는 한국인이었다.

이 시험에는 2단계가 포함되어 있는데, 표준 용량(10-20mg/일)의 에스시탈로프람으로 4주 동안 공개 치료한 후 20mg/일 또는 30mg/일 에스시탈로프람으로 6주간 무작위 이중 맹검 치료(double-blinded treatment)를 진행하였다. 정신 장애 진단 및 통계 매뉴얼(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition)에 정의된 대로 주요 우울 장애의 1차 진단을 받은 18-65세의 환자가 포함되었다. 모든 환자는 초기 스크리닝 및 기준일 방문에서 총 MADRS 점수가 18점 이상이었다. 한편, 에스시탈로프람에 과민증을 경험한 경우, 항정신병제, 기분 안정제 또는 선택적 모노아민 산화효소 억제제와 같은 향정신성 약물을 투여받은 적이 있는 경우, 우울증 증상이 있고 2가지 이상의 항우울제 치료에 내성이 있는 것으로 간주되는 경우, 주요 우울 장애 이외의 정신 질환이 있거나 조증 또는 경조증 삽화, 정신 분열증, 분열 정동 장애 또는 약물 남용 장애와 같은 정신 장애의 이전 병력이 조사자에 의해 평가되거나 MADRS의 항목 10에서 5점 이상의 점수로 자살의 상당한 위험이 있는 경우, 또는 신경학적 장애 또는 의학적으로 불안정한 상태(예: 신장 또는 간 장애, 또는 심혈관, 폐 또는 위장 장애)의 병력이 있는 경우에는 피험자에서 제외시켰다.

임상시험에 참가한 환자 중, 5명의 반응자(남성 1명 및 여성 4명) 및 5명의 무반응자(남성 1명 및 여성 4명)가 선택되었으며, 기준일(baseline), 1주차, 4주차(무작위화) 및 10주차(무작위화 후 6주)의 4개의 시점에서 각각의 혈장 샘플을 수득하였다.

연구 프로토콜은 서울대학교병원 기관심의위원회에 의해 승인되었다 (승인번호: 1008-116-329, 2010년 12월 2일 승인). 본 연구는 헬싱키 선언문 및 국제 조화 우수 임상 관행 지침에 명시된 윤리 원칙에 따라 수행되었으며, 모든 환자는 서면 동의서를 제공하였고, 원하는 경우 언제든지 연구를 중단할 수 있도록 하였다.

10명의 피험자, 즉 5명의 반응자 및 5명의 무반응자의 기준일 특징(baseline characteristics)은 표 1과 같다.

피험자의 인구통계학적 및 임상적 변수

변수	반응자 (N=5)	무반응자 (N=5)	p-Value
나이(표준편차)	44.2 (14.2)	42.8 (16.4)	0.841
남성(%)	1 (20)	1 (20)	1.000
발병 시기(표준편차)	41.8 (11.9)	33.4 (9.8)	0.093
체질량 지수(kg/m²)(표준편차)	23.1 (3.7)	24.7 (4.6)	0.309
기준선에서 임상 특성
MADRS(표준편차)	31.0 (4.6)	28.8 (2.5)	0.599
CGI-S(표준편차)	5.0 (0.7)	4.2 (1.3)	0.344
BDI(표준편차)	32.6 (7.3)	26.8 (3.6)	0.206
HRM-D(표준편차	21.6 (3.4)	21.0 (2.9)	1.000
CUDOS(표준편차)	38.4 (12.8)	40.4 (3.0)	0.917
세계보건기구 삶의 질 축약 버전
육체적 삶의 질(표준편차)	8.8 (1.7)	8.5 (0.9)	0.831
심리적 삶의 질(표준편차)	8.0 (0.8)	8.5 (0.9)	0.827
사회적 삶의 질(표준편차)	10.1 (1.5)	11.7 (2.4)	0.193
환경적 삶의 질(표준편차)	10.1 (1.7)	10.1 (1.1)	0.914

p-value는 Mann-Whitney U test 또는 Fisher's exact test를 사용하여 적절히 계산됨.

표 1에서 볼 수 있듯이, 피험자의 평균(표준편차) 연령은 각각 반응자(44.2(14.2)세)와 무반응자(42.8(16.4)세)로 유사하였고, Montgomery and Asberg Depression Rating Scale (MADRS), Clinical Global Impression-Severity (CGI-S), Beck's Depression Inventory (BDI), Hamilton Rating Scale for Depression (HAM-D), Clinically Useful Depression Outcome Scale (CUDOS)에 대한 점수 및 신체적, 심리적, 사회적, 환경적 삶의 질을 포함한 세계보건기구 삶의 질 축약 버전 점수를 포함하여 정서적 증상 및 질병 중증도에서도 두 그룹 간 유의한 차이가 없었다.

실시예 2. 혈장 샘플 준비 및 LC-MS/MS 분석

2-1. 혈액 수집 및 혈장 준비

혈장은 Human Proteome Organization Plasma Proteome Project에서 제안한 대로 준비되었다. 혈액 샘플 (3mL)을 기준일, 1주차, 4주차 (무작위화) 및 10주차 (무작위화 후 6주차)에 에틸렌디아민테트라아세트산 함유 튜브에 수집하였고, 혈액 샘플은 밤새 금식한 후 (최소 12시간) 오전 9시 30분부터 11시 30분 사이 피험자로부터 채취하였다. 혈액 샘플은 샘플 수집 직후 실온 (RT)에서 15분 동안 2000×g로 원심분리하고, 분리된 혈장은 0.5mL 튜브로 옮긴 후, 원심분리 후 20분 이내에 동결시켰다. 이후 샘플을 얼음 위에 놓고 실험실로 운반한 후, 분석할 때까지 -80 ℃에서 즉시 동결시켜 보관하였다.

2-2. 혈장 샘플 준비

혈장 샘플에서 단백질체 분석을 방해할 수 있는 다량의 혈장 단백질을 제거하고자 하였다. 혈장 내 존재하는 14가지 가장 풍부한 혈장 단백질(알부민, IgA, IgG, IgM, α1-항트립신, α1-산 당단백질, 아포지단백질 A1, 아포지단백질 A2, 보체 C3, 트랜스페린, α2-마크로글로불린, 트랜스티레틴, 합토글로빈 및 피브리노겐)을 제거하기 위하여, Buffer A로 4배 희석된 혈장의 40 μL 분취량을 바이너리 HPLC 시스템 (20A Prominence, Shimadzu, Tokyo, Japan)의 MARS14 고갈 컬럼 (Agilent Technology, Palo Alto, CA, USA)에 주입하였다. 결합되지 않은 분획을 50mM Tris (pH 8) 중 8M 요소를 포함하는 완충액으로 교환하고, Vivaspin 500 3kDa 컷오프 필터 (Sartorius, Goettingen, Germany)를 사용하여 한외여과 한 후 약 50μL로 농축하고, 새로운 필터 장치(Nanosep, 30kDa; Pall Corporation, NY, USA)로 옮겼주었다. 50mM Tris (pH 8.5) 중 8M 우레아를 포함하는 용액에 200μL 분취량을 첨가하고 혼합물을 14,000 x g에서 15분 동안 원심분리하는 절차를 두 번 반복하였다. 수집 튜브에서 통과액 (flow-through)을 제거하고 0.05M 요오도아세트아미드 용액 100μL를 첨가하여 제제를 열 혼합기에서 600rpm으로 1분 동안 혼합한 후, 20분 동안 혼합 과정없이 인큐베이션하였다. 상기 필터 유닛을 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 50mM Tris(pH 8.5)에 용해된 8M 요소 100㎕를 첨가하고, 필터 유닛을 다시 14,000×g에서 15분 동안 원심분리하고, 이 단계를 2회 반복하였다. 0.05M 중탄산암모늄의 100μL 분취량을 필터 유닛에 첨가하고, 상기 유닛을 10분 동안 14,000 × g에서 원심분리하고, 이 단계도 2회 반복하였다. 2.5㎍ Lys-C/트립신을 함유하는 0.05M 중탄산암모늄의 40㎕ 분취량을 첨가하고, 제제를 열-혼합기에서 600rpm으로 1분 동안 혼합하였다. 상기 유닛을 37 ℃의 습식 챔버에서 12시간 동안 인큐베이션하고 새로운 수집 튜브로 옮겨주었다. 상기 필터 유닛은 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리되었으며, 40 μL의 0.5 M NaCl을 첨가하고, 필터 유닛을 다시 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 포름산을 0.3%의 최종 농도로 첨가하여 분해(digestion) 반응을 중단시켰다. 상기 펩타이드 혼합물을 Sep Pak C-18 카트리지 (Waters, Milford, MA, USA)로 탈염하고, 콜드 트랩 (CentriVap Cold Traps, Labconco, Kansas City, MO, USA)으로 동결건조한 후, 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.

2-3. 나노-LC-ESI-MS/MS 분석

Dionex UltiMate 3000 RSLCnano 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 펩타이드를 분리하였다. 비드 컬럼의 트립신 펩타이드는 0.1% 포름산에서 재구성되고 200분(250nL/min)에 걸쳐 2μm C18 수지(Thermo Fisher Scientific)로 패킹된 75μm 내부 직경의 50cm Easy-Spray 컬럼에서 분리되었다. 상기 컬럼은 50 ℃에서 0.1% 포름산 및 5% DMSO에서 0-45% 아세토니트릴 구배를 사용하여 전개(develop)되었다. LC를 나노 ESI 소스가 있는 Q Exactive 질량 분석기에 연결하고, 전체 스캔과 20개의 데이터 종속 MS/MS 스캔 사이의 자동 전환을 사용하여 데이터 종속 모드에서 질량 스펙트럼을 획득하였다. 전체 스캔 MS 스펙트럼의 목표 값은 3,000,000이었고 최대 주입 시간은 120ms이고 분해능은 m/z 400에서 70,000이었다. 반복되는 펩타이드는 20초 동안 동적으로 배제되었다. 모든 MS 데이터는 Project PXD017211로 PRIDE 아카이브(www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD017211)에 기탁하였다.

2-4. 데이터베이스 검색 및 비표지 정량화

실시예 2-3.에 따른 MS/MS 스펙트럼 분석 결과를 SwissProt 인간 데이터베이스(2017년 5월) Proteome Discoverer(버전 2.2, Thermo Fisher Scientific)에서 SequestHT를 사용하여 검색하였다. 검색 매개변수는 고정 변형으로 시스테인 카르바미도메틸화를 포함하고 두 개의 오류절단(miscleavage)이 있는 가변 변형으로 N-말단 아세틸화 및 메티오닌 산화를 포함하는 기본값으로 설정되었다. 펩타이드는 최대 10ppm의 전구체 이온의 초기 질량 편차(initial mass deviation)와 허용된 단편 질량 편차(allowed fragment mass deviation)를 20ppm으로 설정한 검색을 기반으로 식별되었다. 단백질을 펩타이드에 할당할 때 고유한 펩타이드(unique peptide)와 레이저 펩티드(razor peptide)를 모두 사용하였다. 각 단백질의 고유한 펩타이드에 대한 피크 강도를 사용하여 비표지 정량(Label-free quantitation, LFQ)을 수행하였다.

2-5. LC-MS/MS 프로파일링 결과

10명의 대상자 각각으로부터 4개의 혈장 샘플을 얻어, 총 40개의 샘플에 대해 LC-MS/MS로 단백질을 프로파일링한 결과, 총 1159개의 단백질이 확인되었고, 이 중 절반 이상인 684개의 단백질에 대해 정량 분석이 진행되었으며, 104회의 LC-MS/MS 분석을 통해, 총 206개의 단백질이 완전히 정량화되었다. 상기 분석은 duplicate 또는 triplicate로 진행하였다.

LFQ (label-free quantification) 방법으로 혈장 단백질 풍부도 (plasma protein abundance)를 비교하기 전 6개의 상대적으로 안정적이고 풍부한 내인성 단백질(BTD, C8B, C1S, ITIH2, IGFALS 및 SERPINA3)을 이용하여 다른 단백질의 풍부도 데이터를 정규화하였다. 즉, 모든 실험에서 단백질 풍부도를 정규화 한 후 샘플 간 차이를 수정하였다. 정규화된 풍부도는 Pearson의 상관 계수가 0.677로, 혈장 단백질체 데이터베이스의 혈장 단백질 농도(ng/mL)와 통계적으로 유의한 상관 관계를 보여주었다 (조정된 p-value < 0.001).

기술적 변이(technical variation)가 매우 작다고 판단되는 346개의 단백질중 혈장 고갈 표적 단백질(plasma depletion target protein) 14개, 면역글로불린 관련 단백질(immunoglobulin-related protein) 10개, 정상화 인자(normalization factor) 6개를 제외시키고 총 316개의 단백질에 대해 추가 분석을 진행하였다.

2-6. 배치(batch) 간 보정, 누락 데이터 대치 및 정규화 방법

샘플 준비 날짜를 기준으로 S15 (무반응자) 및 S29 (반응자)로 구성된 배치 1; S54(비응답자) 및 S52 (반응자)의 배치 2; 및 S6(무반응자), S11(무반응자), S32(반응자), S34(무반응자), S38(반응자) 및 S46(반응자)의 배치 3의 3개의 배치를 준비하였다. 배치 간 분석 오차 보정을 위하여, 104개 LC-MS/MS 분석의 원시 데이터(raw data)에 단백질 당 평균 중심 보정(mean-centering correction per protein)을 적용하였다.

이후 누락 데이터 대치(missing data imputation)를 수행하였다. 각 개별 샘플에서 한 번에 측정된 316개의 정량된 단백질 중 180개가 완전히 정량화되었고, 나머지 136개의 단백질에 대한 누락 데이터는 국소 최소 제곱 대치법(local least-squares imputation method)(Kim, H. et al., Bioinformatics 2005, 21, 187-198 참조)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여 완전히 정량화된 180개의 단백질을 Pearson의 상관 분석에 의해 15개의 그룹으로 클러스터링하고 15개의 선택된 클러스터의 선형 최적 조합으로 누락 값을 추정하였다.

이들 데이터는 스파이크 인 표준(spike-in standard) 없이 내인성 정규화 단백질에 대해 정규화되었다. 전체 데이터에서 다음 기준에 따라 210개 단백질 중 6개 단백질이 최종적으로 LFQ 정규화에 적합한 것으로 선택되었다: (1) 혈장 농도가 NormFinder 안정성 값 (NormFinder stability value)에 의해 결정된 바와 같이 모든 샘플에서 거의 일정하게 유지됨; (2) 혈장 농도가 LMM 분석에 의해 나타난 바와 같이 5명의 반응자와 5명의 무반응자에서 유의한 차이가 없음 (p-value > 0.05); (3) 우울증에 대한 보고가 없음. 각 샘플에서 6개의 선택된 정규화 단백질 BTD, C8B, C1S, ITIH2, IGFALS 및 SERPINA3의 원시 풍부도(raw abundance)를 모든 샘플에서 6개의 원시 풍부도의 기하 평균(geometric mean)으로 나누었다. 샘플에서 이러한 6가지 비율의 중간값(median)이 해당 샘플에 대한 정규화 크기 조정 인자 (normalization scaling factor, NSF)로 정의되었다. 샘플 s에 대한 NSF는 다음 방정식을 사용하여 계산할 수 있다:

여기서

는 샘플 s에서 정규화 단백질 i의 원시 단백질 풍부도,

는 모든 샘플에서 단백질 i의 풍부도 중간값이다.

샘플에서 각 바이오마커 후보의 강도의 정규화된 풍부도(normalized abundance of the intensity of each biomarker candidate)는 원시 피크 강도(raw peak intensity)를 NSF로 나누어 계산하였다:

여기서,

는 샘플 s에서 j번째 바이오마커 후보의 정규화된 풍부도이고,

는 그 상응하는 단백질의 원시 풍부도이다.

실시예 3. 반응자와 무반응자에서 시간에 따른 혈장 단백질 변화 분석

보정 없는 Mann-Whitney 테스트를 통하여, 기준일과 1주, 4주, 10주간의 치료 후에서의 혈장 단백질 풍부도를 통계적으로 비교해 본 결과, 1주, 4주, 10주차에 각각 7개, 4개 및 6개의 단백질이 반응자에서 상향 조절되었고, 각각 16개, 17개 및 19개의 단백질이 무반응자에서 상향 조절되었다 (p-value < 0.05; 도 1A).

T₁, T₄ 및 T₁₀의 세 시점에서의 벤 다이어그램은 도 1B와 같다. 무반응자에서 상향조절된 단백질은 유전자 온톨로지(GO)에서 자극에 대한 반응, 상처에 대한 반응 및 튜브 형태 형성과 관련이 있었다 (도 1C). 이는 무반응자에서 약물이 뇌의 신경 회로와 함께 많은 수의 염증 경로를 활성화 시킨다는 것을 의미할 수 있다.

유전자 온톨로지로 구분할 때, 세포 외 구조 구성, 보체 활성화 조절 및 트리글리세리드가 풍부한 지질단백질 입자 리모델링과 관련된 단백질은 두 그룹 모두에서 풍부하게 발현되었다.

선형 혼합 모델은 종단 단백질체 데이터를 기반으로 차등적으로 풍부한 혈장 단백질을 식별하는 데 적합한데, 반응/시간 상호작용 항(response/time interaction term)이 선택적 세로토닌 재흡수 억제제에 대한 시간 의존적 반응성의 그룹 간 차이를 측정하는 데 중요하다. 선형 혼합 모델 다중 비교 분석을 통해 SGoF 방법(Carvajal-Rodriguez, A. et al., BMC Bioinform. 2009, 10, 209. 참조)으로 보정된 37개의 유의한 단백질을 확인하였다 (조정된 p-value < 0.05, 반응/시간 상호작용 항). 시간 경과에 따른 이러한 단백질의 그룹 간 차이는 표 2에서 가장 낮은 조정된 p-value로 표시된다.

반응자와 무반응자 사이에 상이하게 존재하는 반응/시간 상호작용에 상응하는 37개 단백질

UNIPROT 접근번호	조정된 p-Value	유전자 명	단백질 명	클러스터 번호	COR
P04278	2.70×10^-3	SHBG	Sex hormone-binding globulin	5	0.12
P05090	2.95×10^-3	APOD	Apolipoprotein D	6	-0.34
Q06033	4.01×10^-3	ITIH3	Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3	5	-0.21
P08567	4.36×10^-3	PLEK	Pleckstrin	4	0.04
P04275	4.69×10^-3	VWF	von Willebrand factor	6	-0.19
P52566	5.11×10^-3	ARHGDIB	Rho GDP-dissociation inhibitor 2	1	-0.15
P02656	6.89×10^-3	APOC3	Apolipoprotein C-III	6	-0.06
P06276	7.13×10^-3	BCHE	Cholinesterase	6	-0.11
P27169	8.89×10^-3	PON1	Serum paraoxonase/arylesterase 1	5	-0.08
P22105-4	9.85×10^-3	TNXB	Tenascin-X	6	-0.25
P02774-3	1.09×10^-2	GC	Vitamin D-binding protein	5	0.04
P0C0L5	1.10×10^-2	C4B	Complement C4-B	5	-0.21
P02649	1.15×10^-2	APOE	Apolipoprotein E	6	-0.04
P07339	1.45×10^-2	CTSD	Cathepsin D	4	0.02
Q92820	1.50×10^-2	GGH	Gamma-glutamyl hydrolase	5	-0.01
P09172	1.69×10^-2	DBH	Dopamine beta-hydroxylase	2	0.03
P40189	1.75×10^-2	IL6ST	Interleukin-6 receptor subunit beta	4	0.15
Q8NBP7	1.81×10^-2	PCSK9	Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9	3	-0.14
Q16610	1.83×10^-2	ECM1	Extracellular matrix protein 1	2	0.02
P62258	1.83×10^-2	YWHAE	14-3-3 protein epsilon	6	0.18
P80188	1.83×10^-2	LCN2	Neutrophil gelatinase-associated lipocalin	6	-0.11
Q9H299	1.99×10^-2	SH3BGRL3	SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 3	1	0.13
P27918	2.05×10^-2	CFP	Properdin	6	0.08
P08571	2.12×10^-2	CD14	Monocyte differentiation antigen CD14	2	0.24
P08697	2.33×10^-2	SERPINF2	Alpha-2-antiplasmin	5	0.22
P36980	2.34×10^-2	CFHR2	Complement factor H-related protein 2	4	0.16
P08253	2.57×10^-2	MMP2	72 kDa type IV collagenase	6	0.13
P13671	2.65×10^-2	C6	Complement component C6	5	0.13
O43852-3	2.80×10^-2	CALU	Calumenin	3	0.10
P14543	2.93×10^-2	NID1	Nidogen-1	4	-0.05
P35579	2.95×10^-2	MYH9	Myosin-9	1	0.05
P05160	3.70×10^-2	F13B	Coagulation factor XIII B chain	6	-0.17
P02765	3.75×10^-2	AHSG	Alpha-2-HS-glycoprotein	2	0.20
Q99453	3.85×10^-2	PHOX2B	Paired mesoderm homeobox protein 2B	2	-0.12
O43157	4.01×10^-2	PLXNB1	Plexin-B1	5	-0.01
P06396	4.26×10^-2	GSN	Gelsolin	6	0.04
O43866	4.41×10^-2	CD5L	CD5 antigen-like	3	-0.27

풍부도 패턴으로부터 유사한 패턴으로 단백질을 클러스터링하기 위하여 세 가지 다른 시간(T₁, T₄ 및 T₁₀)에서 단백질 풍부도를 기준일(T0)에서의 단백질 풍부도에서 빼준 후, t-SNE 및 친화성 전파(affinity propagation)를 진행하여(도 2A), 고유한 패턴의 6개 클러스터를 확보하였다(도 2B).

클러스터 1 및 4에서 각각 3개 및 5개의 단백질이 각각 반응자에서 시간이 지남에 따라 감소하고 무반응자에서 시간이 지남에 따라 증가하였다. 5개의 단백질을 포함하는 클러스터 2는 반응자에서 시간이 지남에 따라 거의 변화를 나타내지 않았지만 무반응자에서 시간이 지남에 따라 감소하였다. 클러스터 3에서 3개의 단백질은 반응자에서 1주차부터 증가하였으나 4주차 이후에는 균일하게 나타났다. 이와 대조적으로, 무반응자에서 이들 단백질들은 4주차에 급격히 감소한 다음 10주차에 균일하게 나타났다. 클러스터 5에서 10개의 단백질은 반응자에서 시간이 지남에 따라 거의 변화하지 않았지만 무반응자에서는 시간이 지남에 따라 증가하였다. 클러스터 6에서 11개의 단백질은 반응자에서 4주차에 감소하고 10주차에 증가하였으나, 무반응자에서는 시간이 지남에 따라 거의 변화하지 않았다.

이러한 단백질이 항우울제 반응 및 정신 장애와 관련이 있는지 여부를 평가하기 위하여 PsyGeNet에서 37개의 단백질을 검색한 결과 (도 2C), 이들 단백질 중 14개인 APOD, APOE, BCHE, DBH, GGH, GSN, ITIH3, LCN2, MMP2, PHOX2B, PON1, TNXB, VWF, YWHAE가 조현병, 양극성 장애, 코카인 사용 장애, 물질 유발 정신병, 알코올 사용 장애, 우울증 등과 같은 정신과적 증상과 관련이 있는 것으로 확인되었다.

또한, Enrichr의 DrugMatrix 범주에서 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (SSRI)에 대한 쥐 조직 및 세포에서의 반응을 검색하여, 이 37개 단백질이 에스시탈로프람의 유사체인 시탈로프람과 관련이 있는지 여부를 평가해 본 결과, ITIH3, PON1, MMP2, MYH9, APOE, GC, CD14, LCN2 및 CTSD의 9개 단백질이 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 처리 및 대조군인 옥수수유 처리한 쥐의 간에서 유의하게 상이한 발현 양상을 나타낸다는 것을 확인하였고, ITIH3, PON1, LCN2, APOE, GC, CLU 및 CTSD의 7가지 단백질이 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 및 옥수수유 처리된 쥐의 간세포에서 유의하게 상이한 발현을 나타내었으며, PLXNB1, MMP2 및 CTSD의 3가지 단백질이 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 및 옥수수유 처리된 쥐의 심장에서 유의하게 상이한 발현 양상을 나타내었다 (도 2D).

상기와 같은 결과로부터, 이들 단백질들은 혈액 뿐 아니라 간과 심장의 장기에서도 약물에 반응하여 양적 변화를 일으킨다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. mRNA 발현 양상을 통한 데이터 검증

두 개의 GEO 데이터 세트(GSE146446 [Belzeaux, R. et al. Nat. Commun. 2020, 11, 1635] 및 GSE45468 [Mehta, D. et al. Brain Behav. Immun. 2013, 31, 205-215])에서 확인된 혈액 순환 무세포 mRNA 수준에서 발현량 변화를 확인하여, 본 발명에서 선형 혼합 모델에 기반하여 확인된 37개 단백질의 유의성을 추가 검증하고자 하였다.

이를 위하여 Biobase 및 GEOquery 패키지를 사용하기 위하여 Gene Expression Omnibus 데이터베이스에서 유전자 발현 프로파일 데이터(시리즈 수탁 번호: GSE146446 및 GSE45468)를 다운로드하였다. 두 데이터 모두 GPL570 플랫폼을 사용하였다 (Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). 유전자 이름을 검색하여 Affymetrix 프로브 ID를 찾은 후, 각 유전자의 유전자 발현 수준 값을 이용하여 후속 통계 분석을 수행하였다.

GSE146446 데이터 세트에서는 171명의 우울증 환자의 혈액 내 mRNA 발현을 연구하고 항우울제 대 위약에 대한 환자의 반응을 모니터링하였으며, 항우울제로는 둘록세틴을 사용하였다. 이 데이터는 항우울제와 위약을 복용하기 8주 전과 후에 환자의 정량적 mRNA 발현을 비교하여 확인된 결과이다. 75명의 반응자 및 21명의 무반응자를 포함하여 96명의 환자가 약물을 투여받았다. 44명의 반응자와 63명의 무반응자를 포함하여 107명의 환자가 위약을 투여받았다. 본 발명에서 유의미한 것으로 확인된 37개의 혈장 단백질이 상기 데이터 세트의 mRNA 분석에서도 유사한 발현 패턴을 나타내는지 선형 혼합 모델로 분석하였다.

본 발명에서 확인된 37개 단백질 중 MYH9은 치료/반응/시간 상호작용 항에 대해 유의성을, PCSK9는 치료/반응 상호작용 항에 대해 유의성을 나타내었고(p-value < 0.05), PLEK는 치료/반응 및 치료/시간/반응 상호작용 항에 대해 유의성을 나타내었다. (p-value < 0.05, 표 3).

한편, GSE45468 데이터 세트에서는 52명 환자의 혈액 mRNA 발현 양상을 확인하였으며, 구체적으로 상기 데이터에서는 인플릭시맙과 위약 주입 6시간, 24시간 및 2주 전후의 환자에서 mRNA 발현 변화를 보여주고 있다. 반응자 12명, 무반응자 11명을 포함하여 23명의 환자가 인플릭시맙을 투여받았고, 반응자는 15명, 무반응자는 14명을 포함하여 29명의 환자가 위약을 투여받았다. 이 데이터 세트에서는 37개 단백질 중 13개 단백질에 상응하는 유전자의 mRNA 발현 양상이 확인되어 이들에 대해 선형 혼합 모델 분석을 진행하였다.

그 결과, 13개 단백질 중 CALU는 치료/시간/반응 상호작용 항에 대한 유의성을 나타내었고(p-value < 0.05), CTSD 및 SH3BGRL3은 치료/반응 상호작용 항에 대한 유의성을 나타내었다 (p-value < 0.05, 표 3).

반응자와 무반응자 사이에 상이하게 존재하는 반응/시간 상호작용에 상응하는 ６개 단백질

UNIPROT 접근번호	조정된 p-Value	유전자 명	단백질 명
P08567	4.36×10^-3	PLEK	Pleckstrin
P07339	1.45×10^-2	CTSD	Cathepsin D
Q8NBP7	1.81×10^-2	PCSK9	Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9
Q9H299	1.99×10^-2	SH3BGRL3	SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 3
O43852-3	2.80×10^-2	CALU	Calumenin
P35579	2.95×10^-2	MYH9	Myosin-9

실시예 5. 통계 분석

데이터는 R(버전 3.6.0)을 포함한 RStudio(버전 1.1.456)를 사용하여 분석되었다. 종단 혈장 단백질 풍부도는 약물 반응(무반응 또는 반응), 샘플링 시간(기준일, 1주, 4주 및 10주), 고정 변수로서의 반응/시간 상호 작용 및 기술적 복제, 고정 변수에 대한 개별 환자 중첩, 및 개인을 랜덤 변수로 사용하여 선형 혼합 모델 분석(lme4 패키지)에 의해 평가되었다. GEE 분석(geesmv 패키지)에서는, 혈장 풍부도를 2~3개의 기술적 복제의 평균값으로 병합한 다음 약물 반응, 샘플링 시간 및 약물/샘플링 시간을 분석하였다. 작업 상관 구조(working correlation structure)를 독립적으로 설정하고 가우스 추정을 수행하였다. 클러스터링 분석은 4개의 시점에서 각 그룹(반응자 및 무반응자)의 중간 단백질 농도를 기반으로 하였으며, t-확률적 이웃 임베딩(t-stochastic neighbor embedding, t-SNE)(perplexity = 2, theta=0, dims=2) 및 선호도 전파(방법=상관 대칭 행렬 및 Spearman)는 각각 Rtsne 및 apcluster 패키지를 사용하여 계산하였다.

다른 소프트웨어 패키지에는 데이터베이스 = "ALL"에서 정신 장애 유전자 연관 네트워크(PsyGeNet)의 산포도(scatter plots)를 위한 ggline과 단백질 매핑을 위한 psygenet2r이 포함되어 있다. 다중 비교를 통해 타입 I 에러를 컨트롤하고자, 선형 혼합 모델 분석에 의한 반응/시간 상호작용의 p-value에 대해 SGoF R 패키지에서 기본 옵션(알파 = 0.05, 감마 = 0.05, P0 = 0.5, a0 = 1, b0 = 1)의 베이지안 순차 적합도 메타 테스트(SGoF) 방법을 적용하고, MRM 쌍 분석의 p-value에 대한 Benjamini-Hochberg 절차를 적용한 후, 상관 분석을 위해 치환된 p-value을 계산하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation THE ASAN FOUNDATION UNIVERSITY OF ULSAN FOUNDATION FOR INDUSTRY COOPERATION <120> Biomarkers for evaluating treatment responsiveness of major depressive disorde <130> 1069706 <150> KR 10-2020-0117021 <151> 2020-09-11 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1960 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Gln Ala Ala Asp Lys Tyr Leu Tyr Val Asp Lys Asn Phe 1 5 10 15 Ile Asn Asn Pro Leu Ala Gln Ala Asp Trp Ala Ala Lys Lys Leu Val 20 25 30 Trp Val Pro Ser Asp Lys Ser Gly Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Glu 35 40 45 Glu Val Gly Glu Glu Ala Ile Val Glu Leu Val Glu Asn Gly Lys Lys 50 55 60 Val Lys Val Asn Lys Asp Asp Ile Gln Lys Met Asn Pro Pro Lys Phe 65 70 75 80 Ser Lys Val Glu Asp Met Ala Glu Leu Thr Cys Leu Asn Glu Ala Ser 85 90 95 Val Leu His Asn Leu Lys Glu Arg Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile Tyr Thr 100 105 110 Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Val Val Ile Asn Pro Tyr Lys Asn Leu Pro 115 120 125 Ile Tyr Ser Glu Glu Ile Val Glu Met Tyr Lys Gly Lys Lys Arg His 130 135 140 Glu Met Pro Pro His Ile Tyr Ala Ile Thr Asp Thr Ala Tyr Arg Ser 145 150 155 160 Met Met Gln Asp Arg Glu Asp Gln Ser Ile Leu Cys Thr Gly Glu Ser 165 170 175 Gly Ala Gly Lys Thr Glu Asn Thr Lys Lys Val Ile Gln Tyr Leu Ala 180 185 190 Tyr Val Ala Ser Ser His Lys Ser Lys Lys Asp Gln Gly Glu Leu Glu 195 200 205 Arg Gln Leu Leu Gln Ala Asn Pro Ile Leu Glu Ala Phe Gly Asn Ala 210 215 220 Lys Thr Val Lys Asn Asp Asn Ser Ser Arg Phe Gly Lys Phe Ile Arg 225 230 235 240 Ile Asn Phe Asp Val Asn Gly Tyr Ile Val Gly Ala Asn Ile Glu Thr 245 250 255 Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Ala Ile Arg Gln Ala Lys Glu Glu Arg 260 265 270 Thr Phe His Ile Phe Tyr Tyr Leu Leu Ser Gly Ala Gly Glu His Leu 275 280 285 Lys Thr Asp Leu Leu Leu Glu Pro Tyr Asn Lys Tyr Arg Phe Leu Ser 290 295 300 Asn Gly His Val Thr Ile Pro Gly Gln Gln Asp Lys Asp Met Phe Gln 305 310 315 320 Glu Thr Met Glu Ala Met Arg Ile Met Gly Ile Pro Glu Glu Glu Gln 325 330 335 Met Gly Leu Leu Arg Val Ile Ser Gly Val Leu Gln Leu Gly Asn Ile 340 345 350 Val Phe Lys Lys Glu Arg Asn Thr Asp Gln Ala Ser Met Pro Asp Asn 355 360 365 Thr Ala Ala Gln Lys Val Ser His Leu Leu Gly Ile Asn Val Thr Asp 370 375 380 Phe Thr Arg Gly Ile Leu Thr Pro Arg Ile Lys Val Gly Arg Asp Tyr 385 390 395 400 Val Gln Lys Ala Gln Thr Lys Glu Gln Ala Asp Phe Ala Ile Glu Ala 405 410 415 Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Arg Met Phe Arg Trp Leu Val Leu Arg 420 425 430 Ile Asn Lys Ala Leu Asp Lys Thr Lys Arg Gln Gly Ala Ser Phe Ile 435 440 445 Gly Ile Leu Asp Ile Ala Gly Phe Glu Ile Phe Asp Leu Asn Ser Phe 450 455 460 Glu Gln Leu Cys Ile Asn Tyr Thr Asn Glu Lys Leu Gln Gln Leu Phe 465 470 475 480 Asn His Thr Met Phe Ile Leu Glu Gln Glu Glu Tyr Gln Arg Glu Gly 485 490 495 Ile Glu Trp Asn Phe Ile Asp Phe Gly Leu Asp Leu Gln Pro Cys Ile 500 505 510 Asp Leu Ile Glu Lys Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ile Leu Ala Leu Leu 515 520 525 Asp Glu Glu Cys Trp Phe Pro Lys Ala Thr Asp Lys Ser Phe Val Glu 530 535 540 Lys Val Met Gln Glu Gln Gly Thr His Pro Lys Phe Gln Lys Pro Lys 545 550 555 560 Gln Leu Lys Asp Lys Ala Asp Phe Cys Ile Ile His Tyr Ala Gly Lys 565 570 575 Val Asp Tyr Lys Ala Asp Glu Trp Leu Met Lys Asn Met Asp Pro Leu 580 585 590 Asn Asp Asn Ile Ala Thr Leu Leu His Gln Ser Ser Asp Lys Phe Val 595 600 605 Ser Glu Leu Trp Lys Asp Val Asp Arg Ile Ile Gly Leu Asp Gln Val 610 615 620 Ala Gly Met Ser Glu Thr Ala Leu Pro Gly Ala Phe Lys Thr Arg Lys 625 630 635 640 Gly Met Phe Arg Thr Val Gly Gln Leu Tyr Lys Glu Gln Leu Ala Lys 645 650 655 Leu Met Ala Thr Leu Arg Asn Thr Asn Pro Asn Phe Val Arg Cys Ile 660 665 670 Ile Pro Asn His Glu Lys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Pro His Leu Val 675 680 685 Leu Asp Gln Leu Arg Cys Asn Gly Val Leu Glu Gly Ile Arg Ile Cys 690 695 700 Arg Gln Gly Phe Pro Asn Arg Val Val Phe Gln Glu Phe Arg Gln Arg 705 710 715 720 Tyr Glu Ile Leu Thr Pro Asn Ser Ile Pro Lys Gly Phe Met Asp Gly 725 730 735 Lys Gln Ala Cys Val Leu Met Ile Lys Ala Leu Glu Leu Asp Ser Asn 740 745 750 Leu Tyr Arg Ile Gly Gln Ser Lys Val Phe Phe Arg Ala Gly Val Leu 755 760 765 Ala His Leu Glu Glu Glu Arg Asp Leu Lys Ile Thr Asp Val Ile Ile 770 775 780 Gly Phe Gln Ala Cys Cys Arg Gly Tyr Leu Ala Arg Lys Ala Phe Ala 785 790 795 800 Lys Arg Gln Gln Gln Leu Thr Ala Met Lys Val Leu Gln Arg Asn Cys 805 810 815 Ala Ala Tyr Leu Lys Leu Arg Asn Trp Gln Trp Trp Arg Leu Phe Thr 820 825 830 Lys Val Lys Pro Leu Leu Gln Val Ser Arg Gln Glu Glu Glu Met Met 835 840 845 Ala Lys Glu Glu Glu Leu Val Lys Val Arg Glu Lys Gln Leu Ala Ala 850 855 860 Glu Asn Arg Leu Thr Glu Met Glu Thr Leu Gln Ser Gln Leu Met Ala 865 870 875 880 Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Gln Leu Gln Ala Glu Thr Glu Leu Cys 885 890 895 Ala Glu Ala Glu Glu Leu Arg Ala Arg Leu Thr Ala Lys Lys Gln Glu 900 905 910 Leu Glu Glu Ile Cys His Asp Leu Glu Ala Arg Val Glu Glu Glu Glu 915 920 925 Glu Arg Cys Gln His Leu Gln Ala Glu Lys Lys Lys Met Gln Gln Asn 930 935 940 Ile Gln Glu Leu Glu Glu Gln Leu Glu Glu Glu Glu Ser Ala Arg Gln 945 950 955 960 Lys Leu Gln Leu Glu Lys Val Thr Thr Glu Ala Lys Leu Lys Lys Leu 965 970 975 Glu Glu Glu Gln Ile Ile Leu Glu Asp Gln Asn Cys Lys Leu Ala Lys 980 985 990 Glu Lys Lys Leu Leu Glu Asp Arg Ile Ala Glu Phe Thr Thr Asn Leu 995 1000 1005 Thr Glu Glu Glu Glu Lys Ser Lys Ser Leu Ala Lys Leu Lys Asn Lys 1010 1015 1020 His Glu Ala Met Ile Thr Asp Leu Glu Glu Arg Leu Arg Arg Glu Glu 1025 1030 1035 1040 Lys Gln Arg Gln Glu Leu Glu Lys Thr Arg Arg Lys Leu Glu Gly Asp 1045 1050 1055 Ser Thr Asp Leu Ser Asp Gln Ile Ala Glu Leu Gln Ala Gln Ile Ala 1060 1065 1070 Glu Leu Lys Met Gln Leu Ala Lys Lys Glu Glu Glu Leu Gln Ala Ala 1075 1080 1085 Leu Ala Arg Val Glu Glu Glu Ala Ala Gln Lys Asn Met Ala Leu Lys 1090 1095 1100 Lys Ile Arg Glu Leu Glu Ser Gln Ile Ser Glu Leu Gln Glu Asp Leu 1105 1110 1115 1120 Glu Ser Glu Arg Ala Ser Arg Asn Lys Ala Glu Lys Gln Lys Arg Asp 1125 1130 1135 Leu Gly Glu Glu Leu Glu Ala Leu Lys Thr Glu Leu Glu Asp Thr Leu 1140 1145 1150 Asp Ser Thr Ala Ala Gln Gln Glu Leu Arg Ser Lys Arg Glu Gln Glu 1155 1160 1165 Val Asn Ile Leu Lys Lys Thr Leu Glu Glu Glu Ala Lys Thr His Glu 1170 1175 1180 Ala Gln Ile Gln Glu Met Arg Gln Lys His Ser Gln Ala Val Glu Glu 1185 1190 1195 1200 Leu Ala Glu Gln Leu Glu Gln Thr Lys Arg Val Lys Ala Asn Leu Glu 1205 1210 1215 Lys Ala Lys Gln Thr Leu Glu Asn Glu Arg Gly Glu Leu Ala Asn Glu 1220 1225 1230 Val Lys Val Leu Leu Gln Gly Lys Gly Asp Ser Glu His Lys Arg Lys 1235 1240 1245 Lys Val Glu Ala Gln Leu Gln Glu Leu Gln Val Lys Phe Asn Glu Gly 1250 1255 1260 Glu Arg Val Arg Thr Glu Leu Ala Asp Lys Val Thr Lys Leu Gln Val 1265 1270 1275 1280 Glu Leu Asp Asn Val Thr Gly Leu Leu Ser Gln Ser Asp Ser Lys Ser 1285 1290 1295 Ser Lys Leu Thr Lys Asp Phe Ser Ala Leu Glu Ser Gln Leu Gln Asp 1300 1305 1310 Thr Gln Glu Leu Leu Gln Glu Glu Asn Arg Gln Lys Leu Ser Leu Ser 1315 1320 1325 Thr Lys Leu Lys Gln Val Glu Asp Glu Lys Asn Ser Phe Arg Glu Gln 1330 1335 1340 Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Lys His Asn Leu Glu Lys Gln Ile Ala 1345 1350 1355 1360 Thr Leu His Ala Gln Val Ala Asp Met Lys Lys Lys Met Glu Asp Ser 1365 1370 1375 Val Gly Cys Leu Glu Thr Ala Glu Glu Val Lys Arg Lys Leu Gln Lys 1380 1385 1390 Asp Leu Glu Gly Leu Ser Gln Arg His Glu Glu Lys Val Ala Ala Tyr 1395 1400 1405 Asp Lys Leu Glu Lys Thr Lys Thr Arg Leu Gln Gln Glu Leu Asp Asp 1410 1415 1420 Leu Leu Val Asp Leu Asp His Gln Arg Gln Ser Ala Cys Asn Leu Glu 1425 1430 1435 1440 Lys Lys Gln Lys Lys Phe Asp Gln Leu Leu Ala Glu Glu Lys Thr Ile 1445 1450 1455 Ser Ala Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asp Arg Ala Glu Ala Glu Ala Arg 1460 1465 1470 Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ser Leu Ala Arg Ala Leu Glu Glu Ala 1475 1480 1485 Met Glu Gln Lys Ala Glu Leu Glu Arg Leu Asn Lys Gln Phe Arg Thr 1490 1495 1500 Glu Met Glu Asp Leu Met Ser Ser Lys Asp Asp Val Gly Lys Ser Val 1505 1510 1515 1520 His Glu Leu Glu Lys Ser Lys Arg Ala Leu Glu Gln Gln Val Glu Glu 1525 1530 1535 Met Lys Thr Gln Leu Glu Glu Leu Glu Asp Glu Leu Gln Ala Thr Glu 1540 1545 1550 Asp Ala Lys Leu Arg Leu Glu Val Asn Leu Gln Ala Met Lys Ala Gln 1555 1560 1565 Phe Glu Arg Asp Leu Gln Gly Arg Asp Glu Gln Ser Glu Glu Lys Lys 1570 1575 1580 Lys Gln Leu Val Arg Gln Val Arg Glu Met Glu Ala Glu Leu Glu Asp 1585 1590 1595 1600 Glu Arg Lys Gln Arg Ser Met Ala Val Ala Ala Arg Lys Lys Leu Glu 1605 1610 1615 Met Asp Leu Lys Asp Leu Glu Ala His Ile Asp Ser Ala Asn Lys Asn 1620 1625 1630 Arg Asp Glu Ala Ile Lys Gln Leu Arg Lys Leu Gln Ala Gln Met Lys 1635 1640 1645 Asp Cys Met Arg Glu Leu Asp Asp Thr Arg Ala Ser Arg Glu Glu Ile 1650 1655 1660 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Asn Glu Lys Lys Leu Lys Ser Met Glu Ala 1665 1670 1675 1680 Glu Met Ile Gln Leu Gln Glu Glu Leu Ala Ala Ala Glu Arg Ala Lys 1685 1690 1695 Arg Gln Ala Gln Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Asp Glu Ile Ala Asn 1700 1705 1710 Ser Ser Gly Lys Gly Ala Leu Ala Leu Glu Glu Lys Arg Arg Leu Glu 1715 1720 1725 Ala Arg Ile Ala Gln Leu Glu Glu Glu Leu Glu Glu Glu Gln Gly Asn 1730 1735 1740 Thr Glu Leu Ile Asn Asp Arg Leu Lys Lys Ala Asn Leu Gln Ile Asp 1745 1750 1755 1760 Gln Ile Asn Thr Asp Leu Asn Leu Glu Arg Ser His Ala Gln Lys Asn 1765 1770 1775 Glu Asn Ala Arg Gln Gln Leu Glu Arg Gln Asn Lys Glu Leu Lys Val 1780 1785 1790 Lys Leu Gln Glu Met Glu Gly Thr Val Lys Ser Lys Tyr Lys Ala Ser 1795 1800 1805 Ile Thr Ala Leu Glu Ala Lys Ile Ala Gln Leu Glu Glu Gln Leu Asp 1810 1815 1820 Asn Glu Thr Lys Glu Arg Gln Ala Ala Cys Lys Gln Val Arg Arg Thr 1825 1830 1835 1840 Glu Lys Lys Leu Lys Asp Val Leu Leu Gln Val Asp Asp Glu Arg Arg 1845 1850 1855 Asn Ala Glu Gln Tyr Lys Asp Gln Ala Asp Lys Ala Ser Thr Arg Leu 1860 1865 1870 Lys Gln Leu Lys Arg Gln Leu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Gln Arg 1875 1880 1885 Ala Asn Ala Ser Arg Arg Lys Leu Gln Arg Glu Leu Glu Asp Ala Thr 1890 1895 1900 Glu Thr Ala Asp Ala Met Asn Arg Glu Val Ser Ser Leu Lys Asn Lys 1905 1910 1915 1920 Leu Arg Arg Gly Asp Leu Pro Phe Val Val Pro Arg Arg Met Ala Arg 1925 1930 1935 Lys Gly Ala Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu Val Asp Gly Lys Ala Asp 1940 1945 1950 Gly Ala Glu Ala Lys Pro Ala Glu 1955 1960 <210> 2 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu 20 25 30 Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu 35 40 45 Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe 50 55 60 His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg 85 90 95 Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu 100 105 110 His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly 115 120 125 Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu 130 135 140 Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg 145 150 155 160 Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp 180 185 190 His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val 195 200 205 Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp 210 215 220 Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly 225 230 235 240 Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln 245 250 255 Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg 260 265 270 Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro 275 280 285 Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu 290 295 300 Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp 305 310 315 320 Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val 325 330 335 Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly 340 345 350 Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile 355 360 365 Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly 370 375 380 Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu 385 390 395 400 Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile 405 410 415 His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp 420 425 430 Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr 435 440 445 His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His 450 455 460 Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp 465 470 475 480 Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg 485 490 495 Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His 500 505 510 Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu 515 520 525 Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala 530 535 540 Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr 545 550 555 560 Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro 565 570 575 Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg 580 585 590 Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys 595 600 605 Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val 610 615 620 Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly 625 630 635 640 Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val 645 650 655 Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val 660 665 670 Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser 675 680 685 Gln Glu Leu Gln 690 <210> 3 <211> 350 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Pro Lys Arg Ile Arg Glu Gly Tyr Leu Val Lys Lys Gly Ser 1 5 10 15 Val Phe Asn Thr Trp Lys Pro Met Trp Val Val Leu Leu Glu Asp Gly 20 25 30 Ile Glu Phe Tyr Lys Lys Lys Ser Asp Asn Ser Pro Lys Gly Met Ile 35 40 45 Pro Leu Lys Gly Ser Thr Leu Thr Ser Pro Cys Gln Asp Phe Gly Lys 50 55 60 Arg Met Phe Val Phe Lys Ile Thr Thr Thr Lys Gln Gln Asp His Phe 65 70 75 80 Phe Gln Ala Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Ala Trp Val Arg Asp Ile 85 90 95 Lys Lys Ala Ile Lys Cys Ile Glu Gly Gly Gln Lys Phe Ala Arg Lys 100 105 110 Ser Thr Arg Arg Ser Ile Arg Leu Pro Glu Thr Ile Asp Leu Gly Ala 115 120 125 Leu Tyr Leu Ser Met Lys Asp Thr Glu Lys Gly Ile Lys Glu Leu Asn 130 135 140 Leu Glu Lys Asp Lys Lys Ile Phe Asn His Cys Phe Thr Gly Asn Cys 145 150 155 160 Val Ile Asp Trp Leu Val Ser Asn Gln Ser Val Arg Asn Arg Gln Glu 165 170 175 Gly Leu Met Ile Ala Ser Ser Leu Leu Asn Glu Gly Tyr Leu Gln Pro 180 185 190 Ala Gly Asp Met Ser Lys Ser Ala Val Asp Gly Thr Ala Glu Asn Pro 195 200 205 Phe Leu Asp Asn Pro Asp Ala Phe Tyr Tyr Phe Pro Asp Ser Gly Phe 210 215 220 Phe Cys Glu Glu Asn Ser Ser Asp Asp Asp Val Ile Leu Lys Glu Glu 225 230 235 240 Phe Arg Gly Val Ile Ile Lys Gln Gly Cys Leu Leu Lys Gln Gly His 245 250 255 Arg Arg Lys Asn Trp Lys Val Arg Lys Phe Ile Leu Arg Glu Asp Pro 260 265 270 Ala Tyr Leu His Tyr Tyr Asp Pro Ala Gly Ala Glu Asp Pro Leu Gly 275 280 285 Ala Ile His Leu Arg Gly Cys Val Val Thr Ser Val Glu Ser Asn Ser 290 295 300 Asn Gly Arg Lys Ser Glu Glu Glu Asn Leu Phe Glu Ile Ile Thr Ala 305 310 315 320 Asp Glu Val His Tyr Phe Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Glu Arg Thr 325 330 335 Glu Trp Ile Arg Ala Ile Gln Met Ala Ser Arg Thr Gly Lys 340 345 350 <210> 4 <211> 323 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Lys Glu Thr Asp Leu Ile Ile Met Asp Leu Arg Gln Phe Leu Met 1 5 10 15 Cys Leu Ser Leu Cys Thr Ala Phe Ala Leu Ser Lys Pro Thr Glu Lys 20 25 30 Lys Asp Arg Val His His Glu Pro Gln Leu Ser Asp Lys Val His Asn 35 40 45 Asp Ala Gln Ser Phe Asp Tyr Asp His Asp Ala Phe Leu Gly Ala Glu 50 55 60 Glu Ala Lys Thr Phe Asp Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ser Lys Glu Arg 65 70 75 80 Leu Gly Lys Ile Val Ser Lys Ile Asp Gly Asp Lys Asp Gly Phe Val 85 90 95 Thr Val Asp Glu Leu Lys Asp Trp Ile Lys Phe Ala Gln Lys Arg Trp 100 105 110 Ile Tyr Glu Asp Val Glu Arg Gln Trp Lys Gly His Asp Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Gly Leu Val Ser Trp Glu Glu Tyr Lys Asn Ala Thr Tyr Gly Tyr 130 135 140 Val Leu Asp Asp Pro Asp Pro Asp Asp Gly Phe Asn Tyr Lys Gln Met 145 150 155 160 Met Val Arg Asp Glu Arg Arg Phe Lys Met Ala Asp Lys Asp Gly Asp 165 170 175 Leu Ile Ala Thr Lys Glu Glu Phe Thr Ala Phe Leu His Pro Glu Glu 180 185 190 Tyr Asp Tyr Met Lys Asp Ile Val Val Gln Glu Thr Met Glu Asp Ile 195 200 205 Asp Lys Asn Ala Asp Gly Phe Ile Asp Leu Glu Glu Tyr Ile Gly Asp 210 215 220 Met Tyr Ser His Asp Gly Asn Thr Asp Glu Pro Glu Trp Val Lys Thr 225 230 235 240 Glu Arg Glu Gln Phe Val Glu Phe Arg Asp Lys Asn Arg Asp Gly Lys 245 250 255 Met Asp Lys Glu Glu Thr Lys Asp Trp Ile Leu Pro Ser Asp Tyr Asp 260 265 270 His Ala Glu Ala Glu Ala Arg His Leu Val Tyr Glu Ser Asp Gln Asn 275 280 285 Lys Asp Gly Lys Leu Thr Lys Glu Glu Ile Val Asp Lys Tyr Asp Leu 290 295 300 Phe Val Gly Ser Gln Ala Thr Asp Phe Gly Glu Ala Leu Val Arg His 305 310 315 320 Asp Glu Phe <210> 5 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gln Pro Ser Ser Leu Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Pro Ala Ser Ala Leu Val Arg Ile Pro Leu His Lys Phe Thr Ser Ile 20 25 30 Arg Arg Thr Met Ser Glu Val Gly Gly Ser Val Glu Asp Leu Ile Ala 35 40 45 Lys Gly Pro Val Ser Lys Tyr Ser Gln Ala Val Pro Ala Val Thr Glu 50 55 60 Gly Pro Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn Tyr Met Asp Ala Gln Tyr Tyr 65 70 75 80 Gly Glu Ile Gly Ile Gly Thr Pro Pro Gln Cys Phe Thr Val Val Phe 85 90 95 Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Ile His Cys Lys Leu 100 105 110 Leu Asp Ile Ala Cys Trp Ile His His Lys Tyr Asn Ser Asp Lys Ser 115 120 125 Ser Thr Tyr Val Lys Asn Gly Thr Ser Phe Asp Ile His Tyr Gly Ser 130 135 140 Gly Ser Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Gln Asp Thr Val Ser Val Pro Cys 145 150 155 160 Gln Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ala Leu Gly Gly Val Lys Val Glu Arg 165 170 175 Gln Val Phe Gly Glu Ala Thr Lys Gln Pro Gly Ile Thr Phe Ile Ala 180 185 190 Ala Lys Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro Arg Ile Ser Val 195 200 205 Asn Asn Val Leu Pro Val Phe Asp Asn Leu Met Gln Gln Lys Leu Val 210 215 220 Asp Gln Asn Ile Phe Ser Phe Tyr Leu Ser Arg Asp Pro Asp Ala Gln 225 230 235 240 Pro Gly Gly Glu Leu Met Leu Gly Gly Thr Asp Ser Lys Tyr Tyr Lys 245 250 255 Gly Ser Leu Ser Tyr Leu Asn Val Thr Arg Lys Ala Tyr Trp Gln Val 260 265 270 His Leu Asp Gln Val Glu Val Ala Ser Gly Leu Thr Leu Cys Lys Glu 275 280 285 Gly Cys Glu Ala Ile Val Asp Thr Gly Thr Ser Leu Met Val Gly Pro 290 295 300 Val Asp Glu Val Arg Glu Leu Gln Lys Ala Ile Gly Ala Val Pro Leu 305 310 315 320 Ile Gln Gly Glu Tyr Met Ile Pro Cys Glu Lys Val Ser Thr Leu Pro 325 330 335 Ala Ile Thr Leu Lys Leu Gly Gly Lys Gly Tyr Lys Leu Ser Pro Glu 340 345 350 Asp Tyr Thr Leu Lys Val Ser Gln Ala Gly Lys Thr Leu Cys Leu Ser 355 360 365 Gly Phe Met Gly Met Asp Ile Pro Pro Pro Ser Gly Pro Leu Trp Ile 370 375 380 Leu Gly Asp Val Phe Ile Gly Arg Tyr Tyr Thr Val Phe Asp Arg Asp 385 390 395 400 Asn Asn Arg Val Gly Phe Ala Glu Ala Ala Arg Leu 405 410 <210> 6 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Gly Leu Arg Val Tyr Ser Thr Ser Val Thr Gly Ser Arg Glu 1 5 10 15 Ile Lys Ser Gln Gln Ser Glu Val Thr Arg Ile Leu Asp Gly Lys Arg 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Leu Val Asp Ile Ser Gln Asp Asn Ala Leu Arg Asp 35 40 45 Glu Met Arg Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Thr Pro Pro Gln Ile 50 55 60 Val Asn Gly Asp Gln Tyr Cys Gly Asp Tyr Glu Leu Phe Val Glu Ala 65 70 75 80 Val Glu Gln Asn Thr Leu Gln Glu Phe Leu Lys Leu Ala 85 90

Claims

삭제
삭제
삭제
MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 에스시탈로프람 또는 인플릭시맙에 대한 치료 반응성 평가용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 압타머인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 에스시탈로프람 또는 인플릭시맙에 대한 치료 반응성 평가용 키트.
다음 단계를 포함하는, 에스시탈로프람 또는 인플릭시맙에 대한 치료 반응성 평가를 위한 정보 제공 방법:
(a) 에스시탈로프람 또는 인플릭시맙이 투여된 대상체에서 분리된 샘플에서 MYH9, PCSK9, PLEK, CALU, CTSD 및 SH3BGRL3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 발현 수준을 대조군 발현수준과 비교하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
제8항에 있어서, 상기 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.