KR20220034708A - 우울증 지표를 반영하는 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 우울증 지표를 반영하는 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명은 평가자의 관찰에 의존하는 HAM.D 또는 피검자의 주관적인 보고에 의존하는 MADRS를 대체하여 우울증 지표로 활용할 수 있는 바이오마커를 제공하는바, 종래 우울증 진단 방법과 비교하여 평가자 또는 피검자에 의한 주관적 판단을 배제할 수 있고, 설문에 응답할 수 없는 피검자에 대한 평가가 가능하여, 신뢰도 및 활용도 높은 우울증 진단이 가능한 장점이 있다.

Description

우울증 지표를 반영하는 바이오마커 {Biomarkers indicative of psychiatric index}

본 발명은 우울증 지표를 반영하는 바이오마커에 관한 것으로, 더 상세하게는 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 우울증 지표를 반영하는 바이오마커에 관한 것이다.

주요 우울 장애(Major depressive disorder, MDD)는 지속적인 우울감과 활동력 저하를 특징으로 하는 우울증 상태가 지속적 또는 반복적으로 나타나는 정신장애로, 모든 연령과 인종에서 나타나는 질환이다. 증상으로는 우울감과 절망감, 흥미나 쾌락의 현저한 저하, 저하되거나 증가된 식욕과 체중, 수면양의 감소나 증가, 신체적 초조 또는 활동 속도의 지체, 성욕의 상실이나 피로감, 부적절한 죄책감과 책임감, 무가치감, 집중력의 저하 또는 우유부단함, 죽음이나 자살에 대한 생각 등이 있다. 이와 같은 증상이 사회생활은 물론 일상생활에 문제를 일으키는 심각한 수준으로 2주 이상 지속되는 경우, 주요 우울장애로 진단될 수 있다. 주요 우울 장애는 사회적·직업적 생활에 여러 장애를 일으키며, 전체 회복율이 20%에 불과하고 회복된 환자의 80%가 일생 동안 적어도 한 번 이상의 재발을 경험하는 재발률이 매우 높은 질환이다.

주요 우울 장애에 관한 연구를 할 때, 특히 항우울제의 치료 효과를 평가하거나 생물학적 변수들의 변화를 설명하려 할 때, 그 증상의 종류와 심각도를 평가하고 변화를 비교하는 과정이 반드시 필요하다. 따라서 높은 수준의 신뢰도와 타 당도를 가진 척도의 개발이 우울증 임상 연구 수행에 필수적이라 할 수 있다. 이 경우 외국에서 제작된 척도를 번역해서 쓰게 되면, 어떤 임상 척도든 국내 환자를 대상으로 신뢰도와 타당도를 검증하는 작업이 선행되어야 한다. 우울 증상은 특히 사회문화적인 영향을 많이 받기 때문에 이 작업이 중요하다고 할 수 있다.

주요 우울 장애의 관찰자 평가척도로서 현재까지 가장 널리 사용되고 있는 것은 Hamilton 우울증 평가 척도(Hamilton Depression Rating Scale, 이하, 'HAM.D'라고 지칭함)이다. 그러나, Montgomery와 Asberg는 HAM.D가 치료에 따른 우울 증상의 변화를 민감하게 탐지하기 보다는 진단적 측면을 더 반영한다고 비판하면서, 이러한 점을 개선한 척도로 Montgomery-Asberg Depression Rating Scale(이하, 'MADRS'라고 지칭함)을 개발하였다. 이들은 65개 항목으로 이루어진 전반적 정신병리 척도인 Comprehensive Psychopathological Rating Scale (이하 CPRS)로부터 우울증과 관련된 17개의 항목을 1차 선별한다. 그리고 그 중 4주간의 치료 효과와 상관성이 가장 높았던 10개, 즉 겉으로 드러나는 슬픔(Apparent sadness), 스스로 보고하는 슬픔(Reported sadness), 내적 긴장감(Inner tension), 수면저하(Reduced sleep), 식욕저하(Reduced appetite), 집중의 어려움(Concentration difficulty), 권태(Lassitude), 느낌의 상실(Inability to feel), 비관적 사고(Pessimistic thoughts), 자살 사고(Suicidal thoughts) 항목을 추려 MADRS를 구성하였다. 각 항목별로 간략한 정의와 표준화된 질문이 제시되어 있고, 0점에서 6점까지의 일곱 단계로 평가하되 0, 2, 4, 6점에는 조작적으로 정의된 응답점(anchor point)이 붙어 있고, 1, 3, 5점은 아래·위 점수의 중간에 해당할 때 주도록 되어 있다. MADRS는 HAM.D에 비해 항목의 수가 적어 평가 시간이 짧고 우울증의 감정적, 인지적 측면이 강조되어 평가자의 관찰보다는 피검자의 주관적인 보고에 근거해 평가하는 항목의 비율이 높다. 따라서 MADRS는 HAM.D보다 평가자 훈련이 수월하여 항우울제의 치료 반응을 평가하는 대규모 연구에서 편리함과 아울러 경제적인 이점을 가질 수 있다. 또한 HAM.D 등 일부 다른 관찰자 평가 척도나 대다수의 자가보고형 척도에 비해 평가하는 증상의 포괄성이 낮기는 하지만, 우울증의 인지, 정동, 생물학적 특성을 폭넓게 담고 있다는 평가를 받고 있다. 이러한 점에서 MADRS는 HAM.D와 함께 우울증의 지표로 가장 널리 사용되고 있다.

그러나, 평가자의 관찰에 의존하는 HAM.D를 우울증 지표로 활용하는 경우 숙련된 평가자가 요구되고 평가자의 주관적 판단이 개입될 수 있어 평가자의 편견(bias)을 배제하기 위한 여러 방안이 요구되는바, 이를 위하여 복수의 평가자의 평가를 종합하여 우울증을 평가하여야 하는 번거로움이 있다.

또한, MADRS를 우울증 지표로 활용하는 경우에도 피검자의 주관적인 보고에 근거해 평가하기 때문에 평가 결과의 객관성이 담보될 수 없고, 설문에 응답할 수 없는 피검자에 대해서는 MADRS 평가가 어려우며, 외국에서 제작된 척도를 기반으로 한 MADRS의 설문이 국내 환자를 대상으로 한 우울증 지표로서 신뢰할 수 있는지에 대해서도 검증이 필요하다.

한편, 프로테오믹스(proteomics)란 샘플에서 발현되는 모든 단백질을 정량 분석하는 기술로, 새로운 분자 바이오마커를 식별하기 위한 강력한 도구 중 하나이며, 주요 우울 장애 환자의 치료에 대한 반응에 있어서도 여러 생물학적 경로를 반영하는 분자 검출이 가능하다(Martins-de-Souza, D. et al., Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 2010, 260, 499-506). 혈장 및 혈청과 같은 말초 체액의 단백질체 분석은 임상 치료에 대한 반응을 예측하고 특히 임상 초기 단계에서 약물 활성을 모니터링하는 데 도움이 된다. 그러나 현재까지 항우울제 치료에 대한 반응을 예측할 수 있는 말초혈액 검체의 단백질체 분석은 거의 없는 실정이며, 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(LC-MS/MS) 에서는 여러 혈장 단백질이 6주 치료 기간 동안 항우울제 반응을 예측하는 잠재적 바이오마커가 될 수 있음을 확인하였고, 면역, 내분비 및 대사 기전과 관련된 최대 258개의 혈액 기반 마커에 대한 다중 면역 분석 테스트에서 9개의 마커가 항우울제 치료 반응과 관련된 잠재적인 치료 전 바이오마커가 될 수 있음을 확인하였다 (Turck, C.W. et al., Front. Mol. Neurosci. 2017, 10, 272; Chan, M.K. et al., J. Psychiatr. Res. 2016, 83, 249-259).

종단 데이터(longitudinal data)는 일반적으로 생물의학 연구에 사용되는데, 통계 분석에는 혼합 효과 모델(mixed-effect models, MEMs)과 일반화 추정 방정식(generalized estimating equations, GEEs)이 널리 적용된다. 이 중 MEM은 전체 가능성 방법(full-likelihood method)을 기반으로 하는 대상체 수준 접근 방식(subject-level approach)으로, 동일한 통계 단위에서 반복측정이 이루어지거나 관련 통계 단위의 클러스터에서 측정이 이루어지는 설정에서 특히 유용하다. 누락된 값을 처리하는 데 있어 장점이 있기 때문에 혼합 효과 모델은 분산에 대한 반복적인 측정 해석과 같은 보다 전통적인 접근 방식보다 선호된다. 반대로 GEE는 부분 우도 함수(partial-likelihood function)에 의존하는 모집단 수준 모델(population-level model)이다. 프로테오믹스 연구에서는 MEM 방법이 GEE 방법보다 널리 사용되는데, 이는 원하는 효과를 고정한 후 실제 MS로 기술적 또는 생물학적 반복 측정의 무작위 효과를 측정하여 추정할 수 있기 때문이다. 또한 2회 이상의 MS 후 동일한 샘플의 반복 측정에 대한 임의의 영향의 변화(variance of any effect)를 반영하는 것이 기술적으로 더 쉽다. 대조적으로, GEE는 준우도(quasi likelihood)를 이용한 상관 구조의 설정 오류가 강건하여 표본에 대한 수정된 분산 추정 방법이 많이 개발된 바 있다.

본 발명자들은 우울증 환자를 치료하는데 필요한 시간과 비용을 줄이고 불필요한 약물에 대한 노출을 최소화고자, 항우울제의 사용 초기단계에서 항우울제 치료에 대한 반응을 미리 예측할 수 있는 바이오마커를 동정하고자 예의 노력하였으며, 그 결과, 에스시탈로프람을 복용하고 있는 우울증 환자 중 MADRS 및/또는 HAM.D 분석에 따른 심리 지수 비교시 에스시탈로프람이 치료 효과를 나타내는 우울증 환자(이하, '반응자'로 지칭됨)와 에스시탈로프람이 치료 효과를 나타내지 않는 우울증 환자(이하, '무반응자'로 지칭됨)에서 발현 양상이 유의하게 차이가 나는 단백질 바이오마커를 새로이 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.

Martins-de-Souza, D. et al., Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 2010, 260, 499-506 Turck, C.W. et al., Front. Mol. Neurosci. 2017, 10, 272 Chan, M.K. et al., J. Psychiatr. Res. 2016, 83, 249-259

본 발명은 우울증 지표를 반영하는 신규한 바이오마커 및 이를 이용하여 우울증을 진단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 우울증 지표 바이오마커를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 EXT1, PROC, NUCB1, ATRN 및 ANGPTL6은 MADRS 예측용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9 및 ATRN는 HAM.D 예측용인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 우울증 지표 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 바이오마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 압타머인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는, 우울증 지표 예측용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다:

(a) 대상체에서 분리된 샘플에서 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 측정된 발현 수준을 우울증 점수로 환산하여 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 전기영동, 질량 분석법, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 평가자의 관찰에 의존하는 HAM.D 또는 피검자의 주관적인 보고에 의존하는 MADRS를 대체하여 우울증 지표로 활용할 수 있는 바이오마커를 제공하는바, 종래 우울증 진단 방법과 비교하여 평가자 또는 피검자에 의한 주관적 판단을 배제할 수 있고, 설문에 응답할 수 없는 피검자에 대한 평가가 가능하여, 신뢰도 및 활용도 높은 우울증 진단이 가능한 장점이 있다.

도 1은 약물 반응자(Responders)와 약물 무반응자(Non-responders)에서 약물 투여의 시작점과 비교하여 차등적으로 발현 양상이 변화하는 단백질(diffrentially abundant proteins)을 기준일(baseline)과 약물 투여 1주, 4주, 10주에 확인한 결과를 바탕으로, 2개 이상의 심리적 지수와 유의한 상관관계를 보여주는 11 종의 혈장 단백질을 선별한 결과이다. 양과 음의 상관 계수는 각각 파란색과 빨간색으로 표시하였으며, 버블의 크기는 -log10 조정된 p-value를 나타내고 점선으로 표시된 원은 상당한 상관 관계가 있음을 나타낸다 (조정된 p-value < 0.05).
도 2은 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6 단백질과 MADRS 점수, HAM.D점수와의 상관관계 분석 결과, 원의 색이 파란색이면 양의 상관관계를 빨간 색이면 음의 상관관계를 나타낸다. 상관관계 계수의 Benjamini-Hochberg-corrected P값을 나타내며 0.05이하이면 검은 점선을 덧씌웠다.
도 3은 EXT1, PROC, NUCB1, ATRN, ANGPTL6 단백질 정량 값과 과 MADRS 점수를 plotting한 결과이다. 선형 회귀선을 점선으로 나타내었다.
도 4은 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, ATRN, F9 단백질 정량 값과 HAM.D 점수를 plotting한 결과이다. 선형 회귀선을 점선으로 나타내었다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 중 하나인 에스시탈로프람을 주요 우울 장애 환자에 투여하고, 약물 효능이 발휘되는 반응자와 약물 효능이 발휘되지 않는 무반응자에서 기준일(baseline) 및 치료 후 후속 방문을 통해 시간에 따른 대리 혈장 단백질(surrogate plasma protein)의 변화를 측정하고, 선형 혼합 모델(linear mixed model, LMM) 분석 결과를 중심으로 단백질 변화의 생물학적 의미를 파악하였으며, 동일한 데이터를 GEE로 분석한 후 결과를 비교하였다.

이후, 본 발명에서는 항우울제 에스시탈로프람 투여 전후에 초기(0-1주), 중기(1주-4주) 또는 후기(4-10주) 반응을 모니터링할 수 있는 후보 혈액 기반 단백질 바이오마커를 식별하기 위하여 LC-MS/MS 프로파일링이 수행하였다. 또한, 본 발명에서는 항우울제 치료 후 혈장 단백질 농도의 변화가 우울 증상의 중증도 변화와 관련이 있는지 여부를 평가하였다.

이와 같이 에스시탈로프람을 복용하고 있는 우울증 환자 10명 (반응자 5명, 무반응자 5명)을 대상으로 10주간 치료하는 동안 4개의 시점에서 혈액 샘플을 수집하여 분석한 결과, EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6의 발현 양상이 MARDS 또는 HAM.D와 유의한 상관관계가 있음을 확인되었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 우울증 지표 바이오마커에 관한 것이다.

EXT1은 exostosin glycosyltransferase 1으로 exostosin-1, EXT, LGCR, LGS, TRPS2, TTV로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 2131의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 EXT1 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. Q16394, GeneBank Accession No. NM_000127.3, NP_000118.2 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 EXT1 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

PROC는 protein C, inactivator of coagulation factors Va and VIIIa으로 APC, PC1, THPH3, THPH4로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 5624의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 PROC 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. P04070-2, GeneBank Accession No. NM_000312.4, NP_000303.1, NM_001375602.1, NP_001362531.1, NM_001375603.1, NP_001362532.1, NM_001375604.1, NP_001362533.1 , NM_001375605.1, NP_001362534.1, NM_001375606.1, NP_001362535.1, NM_001375607.1, NP_001362536.1, NM_001375608.1, NP_001362537.1, NM_001375609.1, NP_001362538.1, NM1375610.1, NP_001362539.1, NM_001375611.1, NP_001362540.1, NM_001375613.1, NP_001362542.1 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 PROC 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

NUCB1은 nucleobindin 1으로 CALNUC, NUC로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 4924의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 NUCB1 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. Q02818, GeneBank Accession No. NM_006184.6, NP_006175.2 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 NUCB1 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

PROS1은 protein S로 PROS, PS21, PS22, PS23, PS24, PS25, PSA, THPH5, THPH6로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 5627의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 PROS1 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. P07225, GeneBank Accession No. NM_000313.4, NP_000304.2, NM_001314077.2, NP_001301006.1 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 PROS1 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

F9은 coagulation factor IX로 F9 p22, FIX, HEMB, P19, PTC, THPH8로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 2158의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 F9 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. P00740, GeneBank Accession No. NM_000133.4, NP_000124.1, NM_001313913.2, NP_001300842.1 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 F9 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

ATRN은 attractin으로 DPPT-L, MGCA로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 8455의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 ATRN 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. O75882, GeneBank Accession No. NM_001207047.3, NP_001193976.1, NM_001323332.2, NP_001310261.1, NM_139321.3, NP_647537.1, NM_139322.4, NP_647538.1 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 ATRN 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

ANGPTL6는 angiopoietin like 6로 AGF, ARP5로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 83854의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 ANGPTL6 단백질은 예를 들어, Uniprot Accession No. Q8NI99, GeneBank Accession No. NM_001321411.2, NP_001308340.1, NM_001387347.1, NP_001374276.1, NM_001387348.1, NP_001374277.1, NM_031917.3, NP_114123.2 등의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함한 단백질일 수 있다. 상기 ANGPTL6 단백질은 동형 단백질(isoform) 또는 이의 전구체를 포함하나, 본 발명에서는 이를 대표하여 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 기재하였다.

[EXT1 서열정보]

<서열번호 1> UniProtKB Sequence: Q16394 (746 aa)

MQAKKRYFILLSAGSCLALLFYFGGLQFRASRSHSRREEHSGRNGLHHPSPDHFWPRFPDALRPFVPWDQLENEDSSVHISPRQKRDANSSIYKGKKCRMESCFDFTLCKKNGFKVYVYPQQKGEKIAESYQNILAAIEGSRFYTSDPSQACLFVLSLDTLDRDQLSPQYVHNLRSKVQSLHLWNNGRNHLIFNLYSGTWPDYTEDVGFDIGQAMLAKASISTENFRPNFDVSIPLFSKDHPRTGGERGFLKFNTIPPLRKYMLVFKGKRYLTGIGSDTRNALYHVHNGEDVVLLTTCKHGKDWQKHKDSRCDRDNTEYEKYDYREMLHNATFCLVPRGRRLGSFRFLEALQAACVPVMLSNGWELPFSEVINWNQAAVIGDERLLLQIPSTIRSIHQDKILALRQQTQFLWEAYFSSVEKIVLTTLEIIQDRIFKHISRNSLIWNKHPGGLFVLPQYSSYLGDFPYYYANLGLKPPSKFTAVIHAVTPLVSQSQPVLKLLVAAAKSQYCAQIIVLWNCDKPLPAKHRWPATAVPVVVIEGESKVMSSRFLPYDNIITDAVLSLDEDTVLSTTEVDFAFTVWQSFPERIVGYPARSHFWDNSKERWGYTSKWTNDYSMVLTGAAIYHKYYHYLYSHYLPASLKNMVDQLANCEDILMNFLVSAVTKLPPIKVTQKKQYKETMMGQTSRASRWADPDHFAQRQSCMNTFASWFGYMPLIHSQMRLDPVLFKDQVSILRKKYRDIERL

[PROC 서열정보]

<서열번호 2> UniProtKB Sequence: P04070-2 (516 aa)

MAAGRRTCSISTTRPCASASRMWQLTSLLLFVATWGISGTPAPLDSVFSSSERAHQVLRIRKRANSFLEELRHSSLERECIEEICDFEEAKEIFQNVDDTLAFWSKHVDGDQCLVLPLEHPCASLCCGHGTCIDGIGSFSCDCRSGWEGRFCQRGEGERWMLAGGGAGLGPGWGRGTSTSCPRPPLPAEVSFLNCSLDNGGCTHYCLEEVGWRRCSCAPGYKLGDDLLQCHPAVKFPCGRPWKRMEKKRSHLKRDTEDQEDQVDPRLIDGKMTRRGDSPWQVVLLDSKKKLACGAVLIHPSWVLTAAHCMDESKKLLVRLGEYDLRRWEKWELDLDIKEVFVHPNYSKSTTDNDIALLHLAQPATLSQTIVPICLPDSGLAERELNQAGQETLVTGWGYHSSREKEAKRNRTFVLNFIKIPVVPHNECSEVMSNMVSENMLCAGILGDRQDACEGDSGGPMVASFHGTWFLVGLVSWGEGCGLLHNYGVYTKVSRYLDWIHGHIRDKEAPQKSWAP

[NUCB1 서열정보]

<서열번호 3> UniProtKB Sequence: Q02818 (461 aa)

MPPSGPRGTLLLLPLLLLLLLRAVLAVPLERGAPNKEETPATESPDTGLYYHRYLQEVIDVLETDGHFREKLQAANAEDIKSGKLSRELDFVSHHVRTKLDELKRQEVSRLRMLLKAKMDAEQDPNVQVDHLNLLKQFEHLDPQNQHTFEARDLELLIQTATRDLAQYDAAHHEEFKRYEMLKEHERRRYLESLGEEQRKEAERKLEEQQRRHREHPKVNVPGSQAQLKEVWEELDGLDPNRFNPKTFFILHDINSDGVLDEQELEALFTKELEKVYDPKNEEDDMREMEEERLRMREHVMKNVDTNQDRLVTLEEFLASTQRKEFGDTGEGWETVEMHPAYTEEELRRFEEELAAREAELNAKAQRLSQETEALGRSQGRLEAQKRELQQAVLHMEQRKQQQQQQQGHKAPAAHPEGQLKFHPDTDDVPVPAPAGDQKEVDTSEKKLLERLPEVEVPQHL

[PROS1 서열정보]

<서열번호 4> UniProtKB Sequence: P07225 (676 aa)

MRVLGGRCGALLACLLLVLPVSEANFLSKQQASQVLVRKRRANSLLEETKQGNLERECIEELCNKEEAREVFENDPETDYFYPKYLVCLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVNAIPDQCSPLPCNEDGYMSCKDGKASFTCTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCSQICDNTPGSYHCSCKNGFVMLSNKKDCKDVDECSLKPSICGTAVCKNIPGDFECECPEGYRYNLKSKSCEDIDECSENMCAQLCVNYPGGYTCYCDGKKGFKLAQDQKSCEVVSVCLPLNLDTKYELLYLAEQFAGVVLYLKFRLPEISRFSAEFDFRTYDSEGVILYAESIDHSAWLLIALRGGKIEVQLKNEHTSKITTGGDVINNGLWNMVSVEELEHSISIKIAKEAVMDINKPGPLFKPENGLLETKVYFAGFPRKVESELIKPINPRLDGCIRSWNLMKQGASGIKEIIQEKQNKHCLVTVEKGSYYPGSGIAQFHIDYNNVSSAEGWHVNVTLNIRPSTGTGVMLALVSGNNTVPFAVSLVDSTSEKSQDILLSVENTVIYRIQALSLCSDQQSHLEFRVNRNNLELSTPLKIETISHEDLQRQLAVLDKAMKAKVATYLGGLPDVPFSATPVNAFYNGCMEVNINGVQLDLDEAISKHNDIRAHSCPSVWKKTKNS

[F9 서열정보]

<서열번호 5> UniProtKB Sequence: P00740 (461 aa)

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT

[ATRN 서열정보]

<서열번호 6> UniProtKB Sequence: O75882 (1429 aa)

MVAAAAATEARLRRRTAATAALAGRSGGPHWDWDVTRAGRPGLGAGLRLPRLLSPPLRPRLLLLLLLLSPPLLLLLLPCEAEAAAAAAAVSGSAAAEAKECDRPCVNGGRCNPGTGQCVCPAGWVGEQCQHCGGRFRLTGSSGFVTDGPGNYKYKTKCTWLIEGQPNRIMRLRFNHFATECSWDHLYVYDGDSIYAPLVAAFSGLIVPERDGNETVPEVVATSGYALLHFFSDAAYNLTGFNITYSFDMCPNNCSGRGECKISNSSDTVECECSENWKGEACDIPHCTDNCGFPHRGICNSSDVRGCSCFSDWQGPGCSVPVPANQSFWTREEYSNLKLPRASHKAVVNGNIMWVVGGYMFNHSDYNMVLAYDLASREWLPLNRSVNNVVVRYGHSLALYKDKIYMYGGKIDSTGNVTNELRVFHIHNESWVLLTPKAKEQYAVVGHSAHIVTLKNGRVVMLVIFGHCPLYGYISNVQEYDLDKNTWSILHTQGALVQGGYGHSSVYDHRTRALYVHGGYKAFSANKYRLADDLYRYDVDTQMWTILKDSRFFRYLHTAVIVSGTMLVFGGNTHNDTSMSHGAKCFSSDFMAYDIACDRWSVLPRPDLHHDVNRFGHSAVLHNSTMYVFGGFNSLLLSDILVFTSEQCDAHRSEAACLAAGPGIRCVWNTGSSQCISWALATDEQEEKLKSECFSKRTLDHDRCDQHTDCYSCTANTNDCHWCNDHCVPRNHSCSEGQISIFRYENCPKDNPMYYCNKKTSCRSCALDQNCQWEPRNQECIALPENICGIGWHLVGNSCLKITTAKENYDNAKLFCRNHNALLASLTTQKKVEFVLKQLRIMQSSQSMSKLTLTPWVGLRKINVSYWCWEDMSPFTNSLLQWMPSEPSDAGFCGILSEPSTRGLKAATCINPLNGSVCERPANHSAKQCRTPCALRTACGDCTSGSSECMWCSNMKQCVDSNAYVASFPFGQCMEWYTMSTCPPENCSGYCTCSHCLEQPGCGWCTDPSNTGKGKCIEGSYKGPVKMPSQAPTGNFYPQPLLNSSMCLEDSRYNWSFIHCPACQCNGHSKCINQSICEKCENLTTGKHCETCISGFYGDPTNGGKCQPCKCNGHASLCNTNTGKCFCTTKGVKGDECQLCEVENRYQGNPLRGTCYYTLLIDYQFTFSLSQEDDRYYTAINFVATPDEQNRDLDMFINASKNFNLNITWAASFSAGTQAGEEMPVVSKTNIKEYKDSFSNEKFDFRNHPNITFFVYVSNFTWPIKIQIAFSQHSNFMDLVQFFVTFFSCFLSLLLVAAVVWKIKQSCWASRRREQLLREMQQMASRPFASVNVALETDEEPPDLIGGSIKTVPKPIALEPCFGNKAAVLSVFVRLPRGLGGIPPPGQSGLAVASALVDISQQMPIVYKEKSGAVRNRKQQPPAQPGTCI

[ANGPTL6 서열정보]

<서열번호 7> UniProtKB Sequence: Q8NI99 (470 aa)

MGKPWLRALQLLLLLGASWARAGAPRCTYTFVLPPQKFTGAVCWSGPASTRATPEAANASELAALRMRVGRHEELLRELQRLAAADGAVAGEVRALRKESRGLSARLGQLRAQLQHEAGPGAGPGADLGAEPAAALALLGERVLNASAEAQRAAARFHQLDVKFRELAQLVTQQSSLIARLERLCPGGAGGQQQVLPPPPLVPVVPVRLVGSTSDTSRMLDPAPEPQRDQTQRQQEPMASPMPAGHPAVPTKPVGPWQDCAEARQAGHEQSGVYELRVGRHVVSVWCEQQLEGGGWTVIQRRQDGSVNFFTTWQHYKAGFGRPDGEYWLGLEPVYQLTSRGDHELLVLLEDWGGRGARAHYDGFSLEPESDHYRLRLGQYHGDAGDSLSWHNDKPFSTVDRDRDSYSGNCALYQRGGWWYHACAHSNLNGVWHHGGHYRSRYQDGVYWAEFRGGAYSLRKAAMLIRPLKL

상기한 바이오마커 단백질은 신경 기전 및 SSRI 반응과 관련이 있는 것으로 알려져 있는데, 예컨대, EXT1은 뇌의 신경계 발달에 중요한 역할을 하는 황산헤파란의 생합성에 관여하며, 이의 결실은 생쥐에서 자폐증과 유사한 행동을 일으켰다. NUCB1은 뉴런의 골지 상주 마커로 알려져 있으며, 뇌에서 아밀로이드 세동을 방해한다. PROS1은 5XFAD 마우스 모델에서 해마의 프로테옴 프로파일링을 기반으로 한 새로운 Aβ 반응성 단백질로 밝혀진바 있다. ATRN(aneuroprotectant)은 SSRI 반응자의 혈액 단백질에서 높게 나타났다.

본 명세서에서 용어 "바이오마커"는 우울증 지표와 상관관계가 있는 물질로, 예컨대 mRNA 또는 단백질 수준에서의 발현 수준이 우울증 지표인 MADRS 및/또는 HAM.D와 유의미한 상관관계를 가지고 있어, 그 발현 수준을 평가함으로써 MADRS 및/또는 HAM.D에 따른 우울증의 유무, 우울증의 심각도를 판단할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 EXT1, PROC, NUCB1, ATRN 및 ANGPTL6은 MADRS 예측용 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본 발명에서는 EXT1, PROC, NUCB1, ATRN 및 ANGPTL6로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커의 발현량을 측정하여, MADRS에 따른 우울증 여부 또는 우울증의 심각도를 평가할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9 및 ATRN는 HAM.D 예측용 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본 발명에서는 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9 및 ATRN로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 바이오마커의 발현량을 측정하여, HAM.D에 따른 우울증 여부 또는 우울증의 심각도를 평가할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 우울증 지표 예측용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 압타머인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 단백질의 단편은 면역원성 단편일 수 있다. 상기 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단편일 수 있다.

상기 "단백질의 발현 수준 측정"은 대상체의 시료에서 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 존재 여부와 발현정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있다. 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 확인 가능한 것일 수 있다.

일 양태로서 단백질의 발현 수준 측정은 상기 단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 압타머를 이용하여 단백질을 확인할 수 있다.

단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 다른 양태의 분석방법으로는 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 질량 분석법(Mass Spectrometry), 유세포 분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 일 양상에 따른 항체의 형태는 특별히 한정되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있으며, 나아가, 인간화 항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다. 일 양상에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개 의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.

상기 "유전자의 발현 수준"은 해당 유전자의 mRNA의 발현 수준 또는 해당 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 확인 가능한 것일 수 있다. 일 양태로서, 발현 수준에 차이가 나는 유전자는 마커로 활용될 수 있으며, 구체적으로, 해당 유전자의 발현 수준에 따라 MADRS 및/또는 HAM.D에 따른 우울증의 유무 및/또는 우울증의 심각도 등이 판단되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미할 수 있다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질을 암호화하는 mRNA 발현양을 측정하는 제제는 일 양태에 따르면 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드이며, 상기 유전자의 핵산 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 mRAN에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 유전자의 mRNA의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"란 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다.

프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 일 양상에 따른 유전자의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부 및 정도를 통해 방사선 피폭 여부 및 정도를 판단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다

상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등과 같은 하전되지 않은 연결체 또는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등과 같은 하전된 연결체로의 변형이 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 우울증 지표 예측용 키트에 관한 것이다.

상기 유전자, 상기 단백질, 상기 단백질의 단편, 발현 수준, 및 발현 수준의 측정은 상술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 우울증 지표는 MADRS 및/또는 HAM.D일 수 있다.

상기 키트는 세포 용해 완충액(lysis buffer)을 더 포함할 수 있다. 상기 세포 용해 완충액은 상용화된 제품 등 다양한 물질을 포함할 수 있다. 상기 세포 용해 완충액은 HEPES, MgCl₂, NaCl, 이미다졸, DNAse 및 β-mercaptoethanol이 포함될 수 있고, 단백질의 분해를 방지하기 위해 프로테이즈 저해제인 PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride)가 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 키트는 유전자 또는 단백질을 분해(Digestion)하는 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 유전자 분해 시약은 제한효소 등을 포함할 수 있다. 상기 단백질 분해 시약은 트립신, 트립신/EDTA, 또는 TrypLE 등을 포함할 수 있으나, 상기 유전자 또는 단백질 분해 시약은 이에 한정되지 않는다.

상기 키트는 동위원소로 라벨링된 표준 펩타이드(Isotope labeled standard peptide) 혼합물을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 데이터 분석 또는 통계처리를 할 수 있는 프로그램을 더 포함할 수 있다. 상기 프로그램은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 것일 수 있다. 상기 데이터 분석 또는 통계처리 프로그램은 Skyline Software, ProteoWizard Software, SCIEX OS Software, SPSS Statistics Software, MedCalc Software, MultiQuant Software, MasterView Software 또는 Cliquid Software 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 키트는 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다.

상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 우울증 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다:

(a) 대상체에서 분리된 샘플에서 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 측정된 발현 수준을 우울증 점수로 환산하여 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 있어서, 상기 상기 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 전기영동, 질량 분석법, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 EXT1, PROC, NUCB1, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현양 변화를 확인하고 이를 MADRS 점수로 환산하여 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 분석하고자 하는 대상체의 샘플에서 바이오마커를 질량 분석법에 의해 정량하고 표 3에 기재된 기준에 따라 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나, 본 발명의 기술적 특징은 EXT1, PROC, NUCB1, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커가 MADRS 지표와 유의한 상관관계가 있음을 최초로 규명한 것인바, 본 발명은 상기 바이오마커에 대한 항체 반응 등 종래 알려진 단백질 발현를 측정하는 다양한 기술을 통하여 단백질을 정량화하고 그에 상응하는 MADRS 점수 기준표를 작성하여 상기 바이오마커를 이용한 다양한 방식으로 MADRS 지표를 평가할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 또한, EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9 및 ATRN로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현양 변화를 확인하고 이를 HAM.D 점수로 환산하여 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 분석하고자 하는 대상체의 샘플에서 바이오마커를 질량 분석법에 의해 정량하고 표 5에 기재된 기준에 따라 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나, 본 발명의 기술적 특징은 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9 및 ATRN로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커가 HAM.D 지표와 유의한 상관관계가 있음을 최초로 규명한 것인바, 본 발명은 상기 바이오마커에 대한 항체 반응 등 종래 알려진 단백질 발현를 측정하는 다양한 기술을 통하여 단백질을 정량화하고 그에 상응하는 HAM.D 점수 기준표를 작성하여 상기 바이오마커를 이용한 다양한 방식으로 HAM.D 지표를 평가할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

본 발명은 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 중 하나인 에스시탈로프람을 주요 우울 장애 환자에 투여하고, 약물 효능이 발휘되는 반응자와 약물 효능이 발휘되지 않는 무반응자 모두에서 기준일(baseline) 및 치료 후 후속 방문을 통해 시간(즉, 1주, 4주, 10주)에 따른 대리 혈장 단백질(surrogate plasma protein)의 변화를 측정하고, 선형 혼합 모델(linear mixed model, LMM) 분석 결과를 중심으로 단백질 변화의 생물학적 의미를 파악하였으며, 동일한 데이터를 GEE로 분석한 후 결과를 비교함으로써, 각각 우울증 지표인 MADRS 및/또는 HAM.D를 대체하여 우울증 유무 및/또는 심각도를 객관적으로 평가할 수 있는 환자의 혈장 단백질체에서 시간 의존적 종단 변화에 따른 신뢰할 수 있는 바이오마커를 도출하였다는 것에 그 의의가 있다. 상기 바이오마커를 이용하는 경우, 종래 MADRS 및/또는 HAM.D의 방법으로 평가가 불가능한 피검자에 대해서도 평가가 가능하여, 피검자의 범위가 확장될 수 있는 장점이 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 임상 시험 피험자 선정

MADRS 점수는 약물 투여에 대한 반응을 결정하는 기준으로 간주되므로, 2013년 2월부터 2016년 2월까지 서울대학교병원에서 수행하는 에스시탈로프람 용량 증량의 효능 및 안전성을 테스트하는 임상 시험에 참여한 10명의 주요 우울 장애 환자로부터 혈장 샘플을 수집하였다. 모든 참가자는 한국인이었다.

이 시험에는 2단계가 포함되어 있는데, 표준 용량(10-20mg/일)의 에스시탈로프람으로 4주 동안 공개 치료한 후 20mg/일 또는 30mg/일 에스시탈로프람으로 6주간 무작위 이중 맹검 치료(double-blinded treatment)를 진행하였다. 정신 장애 진단 및 통계 매뉴얼(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition)에 정의된 대로 주요 우울 장애의 1차 진단을 받은 18-65세의 환자가 포함되었다. 모든 환자는 초기 스크리닝 및 기준일 방문에서 총 MADRS 점수가 18점 이상이었다. 한편, 에스시탈로프람에 과민증을 경험한 경우, 항정신병제, 기분 안정제 또는 선택적 모노아민 산화효소 억제제와 같은 향정신성 약물을 투여받은 적이 있는 경우, 우울증 증상이 있고 2가지 이상의 항우울제 치료에 내성이 있는 것으로 간주되는 경우, 주요 우울 장애 이외의 정신 질환이 있거나 조증 또는 경조증 삽화, 정신 분열증, 분열 정동 장애 또는 약물 남용 장애와 같은 정신 장애의 이전 병력이 조사자에 의해 평가되거나 MADRS의 항목 10에서 5점 이상의 점수로 자살의 상당한 위험이 있는 경우, 또는 신경학적 장애 또는 의학적으로 불안정한 상태(예: 신장 또는 간 장애, 또는 심혈관, 폐 또는 위장 장애)의 병력이 있는 경우에는 피험자에서 제외시켰다.

임상시험에 참가한 환자 중, 5명의 반응자(남성 1명 및 여성 4명) 및 5명의 무반응자(남성 1명 및 여성 4명)가 선택되었으며, 기준일(baseline), 1주차, 4주차(무작위화) 및 10주차(무작위화 후 6주)의 4개의 시점에서 각각의 혈장 샘플을 수득하였다.

연구 프로토콜은 서울대학교병원 기관심의위원회에 의해 승인되었다 (승인번호: 1008-116-329, 2010년 12월 2일 승인). 본 연구는 헬싱키 선언문 및 국제 조화 우수 임상 관행 지침에 명시된 윤리 원칙에 따라 수행되었으며, 모든 환자는 서면 동의서를 제공하였고, 원하는 경우 언제든지 연구를 중단할 수 있도록 하였다.

10명의 피험자, 즉 5명의 반응자 및 5명의 무반응자의 기준일 특징(baseline characteristics)은 표 1과 같다.

피험자의 인구통계학적 및 임상적 변수

변수	반응자 (N=5)	무반응자 (N=5)	p-Value
나이(표준편차)	44.2 (14.2)	42.8 (16.4)	0.841
남성(%)	1 (20)	1 (20)	1.000
발병 시기(표준편차)	41.8 (11.9)	33.4 (9.8)	0.093
체질량 지수(kg/m2)(표준편차)	23.1 (3.7)	24.7 (4.6)	0.309
기준일에서 임상 특성
MADRS(표준편차)	31.0 (4.6)	28.8 (2.5)	0.599
CGI-S(표준편차)	5.0 (0.7)	4.2 (1.3)	0.344
BDI(표준편차)	32.6 (7.3)	26.8 (3.6)	0.206
HRM-D(표준편차	21.6 (3.4)	21.0 (2.9)	1.000
CUDOS(표준편차)	38.4 (12.8)	40.4 (3.0)	0.917
세계보건기구 삶의 질 축약 버전
육체적 삶의 질(표준편차)	8.8 (1.7)	8.5 (0.9)	0.831
심리적 삶의 질(표준편차)	8.0 (0.8)	8.5 (0.9)	0.827
사회적 삶의 질(표준편차)	10.1 (1.5)	11.7 (2.4)	0.193
환경적 삶의 질(표준편차)	10.1 (1.7)	10.1 (1.1)	0.914

p-value는 Mann-Whitney U test 또는 Fisher's exact test를 사용하여 적절히 계산됨.

표 1에서 볼 수 있듯이, 피험자의 평균(표준편차) 연령은 각각 반응자(44.2(14.2)세)와 무반응자(42.8(16.4)세)로 유사하였고, Montgomery and Asberg Depression Rating Scale (MADRS), Clinical Global Impression-Severity (CGI-S), Beck's Depression Inventory (BDI), Hamilton Rating Scale for Depression (HAM-D), Clinically Useful Depression Outcome Scale (CUDOS)에 대한 점수 및 신체적, 심리적, 사회적, 환경적 삶의 질을 포함한 세계보건기구 삶의 질 축약 버전 점수를 포함하여 정서적 증상 및 질병 중증도에서도 두 그룹 간 유의한 차이가 없었다.

실시예 2. 혈장 샘플 준비 및 LC-MS/MS 분석

2-1. 혈액 수집 및 혈장 준비

혈장은 Human Proteome Organization Plasma Proteome Project에서 제안한 대로 준비되었다. 혈액 샘플 (3mL)을 기준일, 1주차, 4주차 (무작위화) 및 10주차 (무작위화 후 6주차)에 에틸렌디아민테트라아세트산 함유 튜브에 수집하였고, 혈액 샘플은 밤새 금식한 후 (최소 12시간) 오전 9시 30분부터 11시 30분 사이 피험자로부터 채취하였다. 혈액 샘플은 샘플 수집 직후 실온 (RT)에서 15분 동안 2000×g로 원심분리하고, 분리된 혈장은 0.5mL 튜브로 옮긴 후, 원심분리 후 20분 이내에 동결시켰다. 이후 샘플을 얼음 위에 놓고 실험실로 운반한 후, 분석할 때까지 -80 ℃에서 즉시 동결시켜 보관하였다.

2-2. 혈장 샘플 준비

혈장 샘플에서 단백질체 분석을 방해할 수 있는 다량의 혈장 단백질을 제거하고자 하였다. 혈장 내 존재하는 14가지 가장 풍부한 혈장 단백질(알부민, IgA, IgG, IgM, α1-항트립신, α1-산 당단백질, 아포지단백질 A1, 아포지단백질 A2, 보체 C3, 트랜스페린, α2-마크로글로불린, 트랜스티레틴, 합토글로빈 및 피브리노겐)을 제거하기 위하여, Buffer A로 4배 희석된 혈장의 40 μL 분취량을 바이너리 HPLC 시스템 (20A Prominence, Shimadzu, Tokyo, Japan)의 MARS14 고갈 컬럼 (Agilent Technology, Palo Alto, CA, USA)에 주입하였다. 결합되지 않은 분획을 50mM Tris (pH 8) 중 8M 요소를 포함하는 완충액으로 교환하고, Vivaspin 500 3kDa 컷오프 필터 (Sartorius, Goettingen, Germany)를 사용하여 한외여과 한 후 약 50μL로 농축하고, 새로운 필터 장치(Nanosep, 30kDa; Pall Corporation, NY, USA)로 옮겼주었다. 50mM Tris (pH 8.5) 중 8M 우레아를 포함하는 용액에 200μL 분취량을 첨가하고 혼합물을 14,000 x g에서 15분 동안 원심분리하는 절차를 두 번 반복하였다. 수집 튜브에서 통과액 (flow-through)을 제거하고 0.05M 요오도아세트아미드 용액 100μL를 첨가하여 제제를 열 혼합기에서 600rpm으로 1분 동안 혼합한 후, 20분 동안 혼합 과정없이 인큐베이션하였다. 상기 필터 유닛을 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 50mM Tris(pH 8.5)에 용해된 8M 요소 100㎕를 첨가하고, 필터 유닛을 다시 14,000×g에서 15분 동안 원심분리하고, 이 단계를 2회 반복하였다. 0.05M 중탄산암모늄의 100μL 분취량을 필터 유닛에 첨가하고, 상기 유닛을 10분 동안 14,000 × g에서 원심분리하고, 이 단계도 2회 반복하였다. 2.5㎍ Lys-C/트립신을 함유하는 0.05M 중탄산암모늄의 40㎕ 분취량을 첨가하고, 제제를 열-혼합기에서 600rpm으로 1분 동안 혼합하였다. 상기 유닛을 37 ℃의 습식 챔버에서 12시간 동안 인큐베이션하고 새로운 수집 튜브로 옮겨주었다. 상기 필터 유닛은 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리되었으며, 40 μL의 0.5 M NaCl을 첨가하고, 필터 유닛을 다시 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리하였다. 포름산을 0.3%의 최종 농도로 첨가하여 분해(digestion) 반응을 중단시켰다. 상기 펩타이드 혼합물을 Sep Pak C-18 카트리지 (Waters, Milford, MA, USA)로 탈염하고, 콜드 트랩 (CentriVap Cold Traps, Labconco, Kansas City, MO, USA)으로 동결건조한 후, 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.

2-3. 나노-LC-ESI-MS/MS 분석

Dionex UltiMate 3000 RSLCnano 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 펩타이드를 분리하였다. 비드 컬럼의 트립신 펩타이드는 0.1% 포름산에서 재구성되고 200분(250nL/min)에 걸쳐 2μm C18 수지(Thermo Fisher Scientific)로 패킹된 75μm 내부 직경의 50cm Easy-Spray 컬럼에서 분리되었다. 상기 컬럼은 50 ℃에서 0.1% 포름산 및 5% DMSO에서 0-45% 아세토니트릴 구배를 사용하여 전개(develop)되었다. LC를 나노 ESI 소스가 있는 Q Exactive 질량 분석기에 연결하고, 전체 스캔과 20개의 데이터 종속 MS/MS 스캔 사이의 자동 전환을 사용하여 데이터 종속 모드에서 질량 스펙트럼을 획득하였다. 전체 스캔 MS 스펙트럼의 목표 값은 3,000,000이었고 최대 주입 시간은 120ms이고 분해능은 m/z 400에서 70,000이었다. 반복되는 펩타이드는 20초 동안 동적으로 배제되었다. 모든 MS 데이터는 Project PXD017211로 PRIDE 아카이브(www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD017211)에 기탁하였다.

2-4. 데이터베이스 검색 및 비표지 정량화

실시예 2-3.에 따른 MS/MS 스펙트럼 분석 결과를 SwissProt 인간 데이터베이스(2017년 5월) Proteome Discoverer(버전 2.2, Thermo Fisher Scientific)에서 SequestHT를 사용하여 검색하였다. 검색 매개변수는 고정 변형으로 시스테인 카르바미도메틸화를 포함하고 두 개의 오류절단(miscleavage)이 있는 가변 변형으로 N-말단 아세틸화 및 메티오닌 산화를 포함하는 기본값으로 설정되었다. 펩타이드는 최대 10ppm의 전구체 이온의 초기 질량 편차(initial mass deviation)와 허용된 단편 질량 편차(allowed fragment mass deviation)를 20ppm으로 설정한 검색을 기반으로 식별되었다. 단백질을 펩타이드에 할당할 때 고유한 펩타이드(unique peptide)와 레이저 펩티드(razor peptide)를 모두 사용하였다. 각 단백질의 고유한 펩타이드에 대한 피크 강도를 사용하여 비표지 정량(Label-free quantitation, LFQ)을 수행하였다.

2-5. LC-MS/MS 프로파일링 결과

10명의 대상자 각각으로부터 4개의 혈장 샘플을 얻어, 총 40개의 샘플에 대해 LC-MS/MS로 단백질을 프로파일링한 결과, 총 1159개의 단백질이 확인되었고, 이 중 절반 이상인 684개의 단백질에 대해 정량 분석이 진행되었으며, 104회의 LC-MS/MS 분석을 통해, 총 206개의 단백질이 완전히 정량화되었다. 상기 분석은 duplicate 또는 triplicate로 진행하였다.

LFQ (label-free quantification) 방법으로 혈장 단백질 풍부도 (plasma protein abundance)를 비교하기 전 6개의 상대적으로 안정적이고 풍부한 내인성 단백질(BTD, C8B, C1S, ITIH2, IGFALS 및 SERPINA3)을 이용하여 다른 단백질의 풍부도 데이터를 정규화하였다. 즉, 모든 실험에서 단백질 풍부도를 정규화 한 후 샘플 간 차이를 수정하였다. 정규화된 풍부도는 Pearson의 상관 계수가 0.677로, 혈장 단백질체 데이터베이스의 혈장 단백질 농도(ng/mL)와 통계적으로 유의한 상관 관계를 보여주었다 (조정된 p-value < 0.001).

기술적 변이(technical variation)가 매우 작다고 판단되는 346개의 단백질중 혈장 고갈 표적 단백질(plasma depletion target protein) 14개, 면역글로불린 관련 단백질(immunoglobulin-related protein) 10개, 정상화 인자(normalization factor) 6개를 제외시키고 총 316개의 단백질에 대해 추가 분석을 진행하였다.

2-6. 배치(batch) 간 보정, 누락 데이터 대치 및 정규화 방법

샘플 준비 날짜를 기준으로 S15 (무반응자) 및 S29 (반응자)로 구성된 배치 1; S54(비응답자) 및 S52 (반응자)의 배치 2; 및 S6(무반응자), S11(무반응자), S32(반응자), S34(무반응자), S38(반응자) 및 S46(반응자)의 배치 3의 3개의 배치를 준비하였다. 배치 간 분석 오차 보정을 위하여, 104개 LC-MS/MS 분석의 원시 데이터(raw data)에 단백질 당 평균 중심 보정(mean-centering correction per protein)을 적용하였다.

이후 누락 데이터 대치(missing data imputation)를 수행하였다. 각 개별 샘플에서 한 번에 측정된 316개의 정량된 단백질 중 180개가 완전히 정량화되었고, 나머지 136개의 단백질에 대한 누락 데이터는 국소 최소 제곱 대치법(local least-squares imputation method)(Kim, H. et al., Bioinformatics 2005, 21, 187-198 참조)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여 완전히 정량화된 180개의 단백질을 Pearson의 상관 분석에 의해 15개의 그룹으로 클러스터링하고 15개의 선택된 클러스터의 선형 최적 조합으로 누락 값을 추정하였다.

이들 데이터는 스파이크 인 표준(spike-in standard) 없이 내인성 정규화 단백질에 대해 정규화되었다. 전체 데이터에서 다음 기준에 따라 210개 단백질 중 6개 단백질이 최종적으로 LFQ 정규화에 적합한 것으로 선택되었다: (1) 혈장 농도가 NormFinder 안정성 값 (NormFinder stability value)에 의해 결정된 바와 같이 모든 샘플에서 거의 일정하게 유지됨; (2) 혈장 농도가 LMM 분석에 의해 나타난 바와 같이 5명의 반응자와 5명의 무반응자에서 유의한 차이가 없음 (p-value > 0.05); (3) 우울증에 대한 보고가 없음. 각 샘플에서 6개의 선택된 정규화 단백질 BTD, C8B, C1S, ITIH2, IGFALS 및 SERPINA3의 원시 풍부도(raw abundance)를 모든 샘플에서 6개의 원시 풍부도의 기하 평균(geometric mean)으로 나누었다. 샘플에서 이러한 6가지 비율의 중간값(median)이 해당 샘플에 대한 정규화 크기 조정 인자 (normalization scaling factor, NSF)로 정의되었다. 샘플 s에 대한 NSF는 다음 방정식을 사용하여 계산할 수 있다:

여기서

는 샘플 s에서 정규화 단백질 i의 원시 단백질 풍부도,

는 모든 샘플에서 단백질 i의 풍부도 중간값이다.

샘플에서 각 바이오마커 후보의 강도의 정규화된 풍부도(normalized abundance of the intensity of each biomarker candidate)는 원시 피크 강도(raw peak intensity)를 NSF로 나누어 계산하였다:

여기서,

는 샘플 s에서 j번째 바이오마커 후보의 정규화된 풍부도이고,

는 그 상응하는 단백질의 원시 풍부도이다.

실시예 3. 혈장 단백질과 정신병리조사 점수(Psychiatric Morbidity Survey Scores) 사이의 상관관계 분석

MADRS 점수는 약물 투여에 대한 반응을 결정하는 표준 기준이기 때문에 MADRS 점수와 높은 양 또는 음의 상관 관계가 있는 혈장 단백질은 약물의 효능을 간접적으로 반영한다.

약물 투여 전(기준일) 및 약물 투여 후 1주, 4주, 10주 시점에 혈액 채혈과 동시에 의사가 MADRS와 HAM-D 설문 평가를 수행하여 데이터를 수집하였다. 약물 투여 전 및 약물 투여 후 4주 및 10주 시점에 측정한 MADRS와 HAM-D가 각각 기준일 점수와 비교하여 50% 이상 점수가 감소한 경우, 이를 반응자로 분류하고, 해당 반응자에서만 유의미하게 상관 관계를 나타내는 혈장 단백질을 선별하였다.

316개의 정량화된 단백질에 대한 Spearman의 상관관계 분석을 사용하여, 64개의 식별된 혈장 단백질의 풍부도(abundance)와 순열 기반 분석에 의한 CGI-S, BDI, HAM-D, CUDOS 및 심리적 삶의 질(PsychoQOL) 점수와 같은 적어도 하나의 다른 정신과적 지수(psychiatric index) 사이에서 유의한 상관 관계가 있는 것으로 확인되었다. 특히 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, LYVE1, F9, ATRN, HRG, FUCA1, CD109 및 ANGPTL6의 11개 단백질은 2개 이상의 정신과 지수(psychic index)와 유의하게 상관관계가 있는 것으로 나타났다.

이 중 우울증 지표로 대표적인 MADRS 점수와 유의하게 상관관계가 있는 5개 바이오마커가 도출되었다. 구체적으로, EXT1, NUCB1, ANGPTL6의 3개 바이오마커는 MADRS 점수와 음의 상관관계가 있는 것으로, PROC, ATRN의 2개 바이오마커는 MADRS 점수와 양의 상관관계가 있는 것으로 확인되었다. 이들 바이오마커 EXT1, PROC, NUCB1, ATRN 및 ANGPTL6에 대하여, 단백질 정량값과 MADRS 점수의 상관관계를 분석하고 선형회귀식을 계산하였다 (표 2). 또한, 우울증 심각도를 MADRS 점수의 범위로 정의하여 그에 부합하는 단백질 정량 범위를 계산하였다 (표 3).

UNITPROT ID	Gene Name	선형회귀식	Spearman's rank correlation coefficient	adjusted P-value
Q16394	EXT1	Y = -0.04228X + 25.31264	-0.3254	0.040
P04070-2	PROC	Y = 0.01828X + 30.21454	0.4229	0.007
Q02818	NUCB1	Y = -0.03633X + 25.77167	-0.3132	0.049
O75882	ATRN	Y = 0.00437X + 31.65355	0.3231	0.042
Q8NI99	ANGPTL6	Y = -0.03718X + 24.50244	-0.3162	0.047

우울증 증상	MADRS 점수 범위	EXT1	PROC	NUCB1	ATRN	ANGPTL6
정상	0-7	25.31264-25.01665	30.21454-30.34247	25.77167-25.51737	31.65355-31.68414	24.50244-24.24217
경미	8-15	≥24.67837	≤30.48868	≥25.22675	≤31.7191	≥23.94471
중간	16-25	≥24.25553	≤30.67143	≥24.86346	≤31.7628	≥23.5729
심각	26-30	≥24.04411	≤30.76281	≥24.68182	≤31.78465	≥23.38699
매우 심각	31-52	< 24.04411	> 30.76281	< 24.68182	> 31.78465	< 23.38699

또한, 이 중 우울증 지표로 대표적인 HAM.D 점수와 유의하게 상관관계가 있는 6개 바이오마커가 도출되었다. 구체적으로, EXT1, NUCB1의 2개 바이오마커는 HAM.D 점수와 음의 상관관계가 있는 것으로, PROC, PROS1, F9, ATRN의 4개 바이오마커는 HAM.D 점수와 양의 상관관계가 있는 것으로 확인되었다. 이들 바이오마커 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9 및 ATRN에 대하여, 단백질 정량값과 HAM.D 점수의 상관관계를 분석하고 선형회귀식을 계산하였다 (표 4). 또한, 우울증 심각도를 HAM.D 점수의 범위로 정의하여 그에 부합하는 단백질 정량 범위를 계산하였다 (표 5).

UNIPROT ID	Gene Name	선형회귀식	Spearman's rank correlation coefficient	P-value
Q16394	EXT1	Y = -0.06847X + 25.38902	-0.5252	0.003
P04070-2	PROC	Y = 0.01363X + 30.40771	0.4131	0.023
Q02818	NUCB1	Y = -0.0451 X + 25.6428	-0.4225	0.020
P07225	PROS1	Y = 0.0336X + 31.8582	0.4864	0.006
O75882	ATRN	Y = 0.02272X + 31.42398	0.5382	0.002
P00740	F9	Y = 0.02326 X + 30.48410	0.4187	0.021

우울증 증상	HAM.D 점수 범위	EXT1	PROC	NUCB1	PROS1	ATRN	F9
정상	0-6	25.38902-24.9782	30.40771-30.48947	25.64284- 25.37225	31.85818-32.0598	31.42398-31.56032	30.4841-30.62363
경미	7-17	≥24.22503	≤30.63938	≥24.87615	≤32.42943	≤31.81029	≤30.87945
중간	18-26	≥23.74575	≤30.73478	≥24.56046	≤32.66465	≤31.96936	≤31.04224
심각	26-54	< 23.74575	> 30.73478	< 24.56046	>32.66465	> 31.96936	> 31.04224

실시예 4. 통계 분석

데이터는 R(버전 3.6.0)을 포함한 RStudio(버전 1.1.456)를 사용하여 분석되었다. 종단 혈장 단백질 풍부도는 약물 반응(무반응 또는 반응), 샘플링 시간(기준일, 1주, 4주 및 10주), 고정 변수로서의 반응/시간 상호 작용 및 기술적 복제, 고정 변수에 대한 개별 환자 중첩, 및 개인을 랜덤 변수로 사용하여 선형 혼합 모델 분석(lme4 패키지)에 의해 평가되었다. GEE 분석(geesmv 패키지)에서는, 혈장 풍부도를 2~3개의 기술적 복제의 평균값으로 병합한 다음 약물 반응, 샘플링 시간 및 약물/샘플링 시간을 분석하였다. 작업 상관 구조(working correlation structure)를 독립적으로 설정하고 가우스 추정을 수행하였다. 클러스터링 분석은 4개의 시점에서 각 그룹(반응자 및 무반응자)의 중간 단백질 농도를 기반으로 하였으며, t-확률적 이웃 임베딩(t-stochastic neighbor embedding, t-SNE)(perplexity = 2, theta=0, dims=2) 및 선호도 전파(방법=상관 대칭 행렬 및 Spearman)는 각각 Rtsne 및 apcluster 패키지를 사용하여 계산하였다.

다른 소프트웨어 패키지에는 데이터베이스 = "ALL"에서 정신 장애 유전자 연관 네트워크(PsyGeNet)의 산포도(scatter plots)를 위한 ggline과 단백질 매핑을 위한 psygenet2r이 포함되어 있다. 다중 비교를 통해 타입 I 에러를 컨트롤하고자, 선형 혼합 모델 분석에 의한 반응/시간 상호작용의 p-value에 대해 SGoF R 패키지에서 기본 옵션(알파 = 0.05, 감마 = 0.05, P0 = 0.5, a0 = 1, b0 = 1)의 베이지안 순차 적합도 메타 테스트(SGoF) 방법을 적용하고, MRM 쌍 분석의 p-value에 대한 Benjamini-Hochberg 절차를 적용한 후, 상관 분석을 위해 치환된 p-value를 계산하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation THE ASAN FOUNDATION UNIVERSITY OF ULSAN FOUNDATION FOR INDUSTRY COOPERATION <120> Biomarkers indicative of psychiatric index <130> 1069707 <150> KR 10-2020-0117021 <151> 2020-09-11 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 746 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ala Lys Lys Arg Tyr Phe Ile Leu Leu Ser Ala Gly Ser Cys 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Phe Tyr Phe Gly Gly Leu Gln Phe Arg Ala Ser Arg 20 25 30 Ser His Ser Arg Arg Glu Glu His Ser Gly Arg Asn Gly Leu His His 35 40 45 Pro Ser Pro Asp His Phe Trp Pro Arg Phe Pro Asp Ala Leu Arg Pro 50 55 60 Phe Val Pro Trp Asp Gln Leu Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val His Ile 65 70 75 80 Ser Pro Arg Gln Lys Arg Asp Ala Asn Ser Ser Ile Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Lys Cys Arg Met Glu Ser Cys Phe Asp Phe Thr Leu Cys Lys Lys Asn 100 105 110 Gly Phe Lys Val Tyr Val Tyr Pro Gln Gln Lys Gly Glu Lys Ile Ala 115 120 125 Glu Ser Tyr Gln Asn Ile Leu Ala Ala Ile Glu Gly Ser Arg Phe Tyr 130 135 140 Thr Ser Asp Pro 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Pro Val Met Leu Ser Asn Gly Trp Glu Leu Pro Phe 355 360 365 Ser Glu Val Ile Asn Trp Asn Gln Ala Ala Val Ile Gly Asp Glu Arg 370 375 380 Leu Leu Leu Gln Ile Pro Ser Thr Ile Arg Ser Ile His Gln Asp Lys 385 390 395 400 Ile Leu Ala Leu Arg Gln Gln Thr Gln Phe Leu Trp Glu Ala Tyr Phe 405 410 415 Ser Ser Val Glu Lys Ile Val Leu Thr Thr Leu Glu Ile Ile Gln Asp 420 425 430 Arg Ile Phe Lys His Ile Ser Arg Asn Ser Leu Ile Trp Asn Lys His 435 440 445 Pro Gly Gly Leu Phe Val Leu Pro Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Gly Asp 450 455 460 Phe Pro Tyr Tyr Tyr Ala Asn Leu Gly Leu Lys Pro Pro Ser Lys Phe 465 470 475 480 Thr Ala Val Ile His Ala Val Thr Pro Leu Val Ser Gln Ser Gln Pro 485 490 495 Val Leu Lys Leu Leu Val Ala Ala Ala Lys Ser Gln Tyr Cys Ala Gln 500 505 510 Ile Ile Val Leu Trp Asn Cys Asp Lys Pro Leu Pro Ala Lys His Arg 515 520 525 Trp Pro Ala Thr Ala Val Pro Val Val Val Ile Glu Gly Glu Ser Lys 530 535 540 Val Met Ser Ser Arg Phe Leu Pro Tyr Asp Asn Ile Ile Thr Asp Ala 545 550 555 560 Val Leu Ser Leu 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Val Thr Gln Gln Ser Ser 165 170 175 Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln 180 185 190 Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg 195 200 205 Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro 210 215 220 Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser 225 230 235 240 Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro 245 250 255 Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly 260 265 270 Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu 275 280 285 Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp 290 295 300 Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe 305 310 315 320 Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln 325 330 335 Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp 340 345 350 Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro 355 360 365 Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala 370 375 380 Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp 385 390 395 400 Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly 405 410 415 Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp 420 425 430 His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp 435 440 445 Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu 450 455 460 Ile Arg Pro Leu Lys Leu 465 470

Claims (10)

1. EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 우울증 지표 바이오마커.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 EXT1, PROC, NUCB1, ATRN 및 ANGPTL6은 MADRS 예측용인 것을 특징으로 하는, 우울증 지표 바이오마커.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9 및 ATRN는 HAM.D 예측용인 것을 특징으로 하는, 우울증 지표 바이오마커.
   
4. EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 우울증 지표 예측용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 제제는 상기 바이오마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 압타머인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 제제는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
7. 제4항의 조성물을 포함하는,우울증 지표 예측용 키트.
   
8. 다음 단계를 포함하는, 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하기 위한 정보 제공 방법:
   (a) 대상체에서 분리된 샘플에서 EXT1, PROC, NUCB1, PROS1, F9, ATRN 및 ANGPTL6로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질, 이의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 측정된 발현 수준을 우울증 점수로 환산하여 우울증 여부 및/또는 우울증 심각도를 평가하는 단계.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
10. 제8항에 있어서,
    상기 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 전기영동, 질량 분석법(Mass Spectrometry), 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는
    상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.

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