KR101343286B1 - 당뇨망막병증의 조기 진단용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

당뇨망막병증의 조기 진단용 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 진단용 조성물 및 당뇨망막 병증 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석 방법에 관한 것이다. 상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은 당뇨망막병증을 조기에 진단할 수 있는 마커를 제공함으로써, 당뇨망막병증 환자에게서 발현이 감소한 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정 및 비교하여 당뇨망막병증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 아울러, 본 발명의 마커는 비침습성 진단을 가능하게 하는바, 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는 당뇨망막병증의 바이오마커를 이용한 진단 방법이 개발되면 가정 및 일반 의원에서의 조기 발견에 매우 유용할 것이며, 국가적인 관점에서 의료비 절감 효과를 가지고 올 수 있다.

Description

당뇨망막병증의 조기 진단용 마커 및 이의 용도{Markers for Early Diagnosing of Diabetic Retinopathy and Use Thereof}
본 발명은 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 진단용 조성물 및 당뇨망막 병증 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
당뇨망막병증 (diabetic retinopathy, DR)은 당뇨병의 대표적인 합병증으로 황반변성, 녹내장과 함께 안과 3대 실명질환 중 하나이다. 우리나라 전체 당뇨환자 500만명 가운데 약 25%가 이 질환을 앓고 있는 것으로 알려져 있는데, 당뇨가 있는 40세 이상 환자의 약 40% 에서 나타나며, 65세 이상 노인 실명의 60% 이상을 차지한다. 국민건강보험공단 조사 결과 당뇨망막증 환자 수는 2005년 153,000여 명에서 2009년 204,000여 명으로 4년 사이 34%나 증가한 것으로 파악되었다.
당뇨로 인해 혈당이 높아지면서 혈액순환장애와 대사장애를 불러 일으켜 눈 질환을 일으키게 되는데 안구의 후반부에서 망막에 영양을 공급하는 혈관이 좁아지거나 막혀서 혈관에 노폐물이 축적되고 출혈이 발생한다. 이 부위에 비정상적인 신생 혈관이 생기면서 제대로 혈관으로서의 기능은 못하고 쉽게 터져 출혈을 일으키는 것이 당뇨망막병증 (DR)이다.
당뇨망막병증은 심화 정도에 따라 비증식성 당뇨망막병증(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)과 증식성 당뇨망막병증(proliferative diabetic retinopathy, PDR)으로 구분한다. 당뇨망막병증 환자의 약 90%에 해당하는 비증식 당뇨망막병증 (NPDR)은 다양한 망막혈관의 이상소견과 출혈, 황반부종 등이 나타나며 그대로 방치할 경우 실명이 유발되거나 증식성 당뇨망막병증 (PDR) 등으로 심화되어 시력에 막대한 악영향을 유발하므로 시기에 맞는 적절한 치료가 필요하다. 비정상적인 신생혈관이 자라나 점차 증식성 당뇨망막병증으로 발전하면 안구 내 출혈이 일어나고 견인성 망막박리가 일어나기도 한다. 안구 내 출혈이 심하면 결국 실명까지 이르게 된다.
당뇨망막병증 (DR)은 초기 증상이 거의 없어 조기 진단이 어렵고, 시력이 떨어지거나 초점이 잘 안 맞아 뿌옇게 보이거나 눈부심 증상이 나타날 정도면 이미 병이 중증으로 진전된 상태이며, 레이저 치료 혹은 유리체 수술적 치료에도 불구하고 병증이 계속 심화되어 실명에 이르는 환자가 많다. 다만, 발병 조기에 적절한 치료를 받고 혈당 관리를 철저히 하면 85% 이상의 환자는 시력을 유지할 수 있는바, 당뇨망막의 조기발견과 심화 억제, 고위험군에 대한 조기 치료에 대한 필요성이 증가하고 있다. 그러나 당뇨망막병증의 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았고, 당뇨에 의한 망막증의 심화 정도를 판단하는 바이오마커도 매우 한정적이다. 따라서 특이성과 민감도가 높은 신규 조기 진단 마커 및 항체를 개발하여, 혈액에서 당뇨병성 망막증의 조기 진단을 위한 바이오마커를 발명하고자 하였다.
이와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 당뇨망막병증 중에서도 초기시기의 비증식성 당뇨망막병증 (NPDR) 환자 혈액을 대상으로 바이오마커를 확인하고자 하였다. NPDR 환자를 mild NPDR, moderate NPDR, severe NPDR로 분류하여 각 그룹에서 15개 (총 45개)의 혈액 샘플을 채취하고, 당뇨이지만 당뇨망막병증 (DR)이 아닌 환자의 혈액 15개를 채취하여, 이를 대상으로 Triple Quadrupole LC-MS/MS를 이용한 Multiple Reaction Monitoring (MRM) 실험 방법으로 확인 (verification)한 결과, MO NPDR에서 특이적으로 발현이 감소하는 바이오마커 6개를 발굴하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 당뇨병성 망막증의 조기진단 및 심화 정도를 효과적으로 진단할 수 있는 새로운 당뇨망막병증 진단용 마커인 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin) 중에서 1개 이상 선택되는 당뇨망막병증 진단용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin) 중에서 선택되는 1개 이상의 당뇨망막병증 진단용 마커를 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것이다. 바람직하게는 당뇨망막병증 초기 단계인 비증식성 당뇨망막병증 (NPDR) 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단용 마커"란 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 또는 증식성 당뇨망막병증 개체에 비하여 비증식성 당뇨망막병증을 가진 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명의 목적상 당뇨망막병증 진단용 마커는 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
당뇨망막병증은 심화 정도에 따라 비증식성 당뇨망막병증(NPDR)과 증식성 당뇨망막병증(PDR)로 구분한다. 비증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하지 않는 특징이 있으며, 증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하는 등 그 기전에 있어서 상이하며, 비증식성 당뇨망막병증이 반드시 증식성 당뇨망막병증으로 심화되는 것이 아니어서, 증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 알려진 마커라도 반드시 비증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 사용될 수는 없다.
본 발명자들은 다음과 같은 입증을 통해 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)이 당뇨망막병증 진단용 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서, MH(황반원공), PDR(증식성 당뇨망막병증), 및 NPDR(비증식성 당뇨망막병증) 개체의 혈장 시료를 분석하여 당뇨망막병증에 과발현 또는 저발현하는 바이오마커를 발굴하였다. 구체적으로 PDR 및 MH 개체의 시료를 분석하여 PDR 특이적 후보 마커를 확인하고 이를 바탕으로 NPDR 특이적 마커 7종을 최종 발굴하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 및 NPDR 개체의 혈장 시료를 분석하여 상기 발굴한 7종의 NPDR 특이적 마커의 유효성을 확립하였다.
하나의 양태로서, 본 발명은 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin) 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 6개 단백질의 유전자 정보는 각각 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2, GeneBank Accession No. AAA51549, Uniprot ID: P19652), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin, GeneBank Accession No. AAA51547, Uniprot ID: P01009), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2, GeneBank Accession No. AAA51701, Uniprot ID: P02652), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4, GeneBank Accession No. AAA96731, Uniprot ID: P06727), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1, GeneBank Accession No. AAA51766, Uniprot ID: P02749), 및 겔솔린(Gelsolin, GeneBank Accession No. AAH26033, Uniprot ID: P06396)이다.
그러나, 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)의 당뇨망막병증과의 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다.
상기 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)은 모두 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 MO NPDR 개체에서 특이적으로 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 감소하는 특징을 가진다. 이때 상기 당뇨망막병증 개체는 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증 개체이다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 유전자의 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으나, 해당 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적인 친화력(affinity)을 가지는 모든 검출 수단을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.
상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 "당뇨망막병증"이란 당뇨병에 의해 말초 순환 장애가 발생하여, 이 때 망막의 미세순환에 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 합병증을 의미하며, 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증일 수 있다.
바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩티드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화 되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛 간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)으로부터 선택되는 1개 이상의 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin) 중에서 선택되는 1 이상의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 사용된 용어 "압타머(aptamer)"란 단일, 이중 나선의 DNA, RNA 형태로 특정 타깃 단백질과의 3차원적 결합을 통해 단백질의 상호작용을 억제하는 생고분자 물질로서, 다양한 표적분자에 결합하는 특징을 가진다. 전형적으로 압타머는 규정된 2차 및 3차 구조, 예컨대 스템-루프 구조로 접혀지는 15~50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 압타머는 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 보다 적은 kd로 표적 고발현 단백질 또는 저발현 단백질과 결합하는 것이 바람직하다. 압타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 고발현 단백질 또는 저발현 단백질과 결합할 수 있으며, 압타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명의 압타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 바람직하게, 상기 당뇨망막병증 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles), 압타머(aptamer) 또는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 상기 당뇨망막병증 진단용 키트를 이용한 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 정보 제공 방법은 당뇨망막병증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin) 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 당뇨망막병증 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)은 모두 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 MO NPDR 개체에서 특이적으로 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 감소하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 감소하면 당뇨망막병증으로 진단하여 정보제공 할 수 있다. 이때 바람직하게 상기 당뇨망막병증은 비증식성 당뇨망막병증이다.
본 발명의 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)은 모두 MO NPDR 개체에서 특이적으로 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 감소하므로, 당뇨이지만 당뇨망막병증이 없는 개체(대조군)와 비교하여 그 발현수준이 감소하면 당뇨망막병증 심화단계 중 중기 비증식성 당뇨망막병증(MO NPDR)이라고 판정할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준을 측정하거나 비교할 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 당뇨망막병증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 당뇨망막병증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 유전자의 존재 또는 부존재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 상기 단백질 발현 수준 측정 및 비교는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin)의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, LC-MRM 방법을 사용한다.
구체적으로 생물학적 시료 중의 단백질을 부피% 기준으로 5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산의 용액으로 30분간 5%에서 85%까지 농도구배를 하면서 LC분석 컬럼을 통과시킨다. 용액 혼합 비율에 따란 특정 물질에 대한 분해능이 달라질 수 있기 때문에 농도 구배를 실시하였고, 따라서 상기 범위는 다양한 단백질들을 동시에 분리하기 위한 최적 범위를 선정한 것이다.
질량 분석에서는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring) 또는 SRM (Selected reaction monitoring)으로 정량을 실시한다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 보다 구체적으로 SIM에서는 선택한 정량이온이 혈장에서도 검출되는 이온인 경우에 정량에 방해가 될 수 있다는 문제점이 있다. 반면, MRM을 이용하는 경우, 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 달라지면서 차별화된 경향을 나타내므로, 이를 정량이온으로 사용하게 되면 백그라운드에서 방해되는 피크가 제거되어 한 층 더 깨끗한 베이스 라인을 얻을 수 있다. 따라서, 질량 분석 시에 MRM 모드를 사용함으로써 보다 우수한 분석 감도에서 원하는 물질들을 동시에 분석할 수 있다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 단백질 발현 수준과 당뇨망막병증 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 당뇨망막병증 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 당뇨망막병증 발병 여부를 진단할 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은 당뇨망막병증을 조기에 진단할 수 있는 마커를 제공함으로써, 비증식성 당뇨망막병증 환자에게서 발현이 감소한 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정 및 비교하여 당뇨망막병증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 아울러, 본 발명의 마커는 비침습성 진단을 가능하게 하는바, 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는 당뇨망막병증의 바이오마커를 이용한 진단 방법이 개발되면 가정 및 일반 의원에서의 조기 발견에 매우 유용할 것이며, 국가적인 관점에서 의료비 절감 효과를 가지고 올 수 있다.
도 1은 본 발명의 실험 과정을 개략적으로 나타낸 흐름도(flow chart)이다.
도 2 내지 도 4는 본 발명의 실시예에서 마커 후보로 제시된 61개 단백질에 대한 142개의 transition을 나타낸 표이다.
도 5는 ANOVA 분석 결과로부터, 60개의 혈장 시료에 대한 제2형 당뇨병의 경과기간(duration of T2DM) 및 HbA1c의 레벨을 타나낸 그래프이다. 검정색은 NoDR 그룹을, 초록색은 MI NPDR 그룹을, 파란색은 MO NPDR 그룹을, 빨간색은 SV NPDR 그룹을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 4개 단백질 마커인 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin) 각각의 발현 패턴을 나타낸 박스-플롯(box- plot)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2)의 interactive plot과 ROC curve를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin)의 interactive plot과 ROC curve를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2)의 interactive plot과 ROC curve를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4)의 interactive plot과 ROC curve를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1)의 interactive plot과 ROC curve를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 겔솔린(Gelsolin)의 interactive plot과 ROC curve를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 당뇨망막병증 환자의 혈장(plasma) 샘플에서 MRM 방법을 이용하여 61개의 단백질 마커 후보의 유효성을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에서 사용한 비증식성당뇨망막병증(NPDR) 환자 혈액 시료는 초기 비증식성당뇨망막병증(mild NPDR, MI NPDR) 15개, 중기 비증식성당뇨망막병증(moderate NPDR, MO NPDR) 15개, 말기 비증식성당뇨망막병증(severe NPDR, SV NPDR) 15개(총 45개)를 사용하였고, 대조군으로 당뇨이지만 당뇨망막병증이 아닌(NoDR) 환자의 혈액 15개를 대상으로 하였으며, 결과적으로 MO NPDR에서 특이적으로 발현이 감소하는 바이오마커 6개를 Triple Quadrupole LC-MS/MS를 이용한 MRM (Multiple Reaction Monitoring) 실험 방법으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 시료 및 기구는 아래와 같다.
Bicinchoninic acid (BCA, Cat. No: B9643)와 황산구리(II) 수용액 (Cat. No: C2284)은 Sigma (St Louis, MO)에서 구입하였다. Sequencing-grade modified trypsin (Cat. No: V5111, porcine)은 Promega (Madison, WI)에서 구입하였으며, 단백질 변성을 위한 요오드아세트아미드(iodoacetamide, IAA, Cat. No: I1149), 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT, Cat. No: 43815), 요소(urea, Cat. No: U6504), 포름산(formic acid, FA, Cat. No: F0507), 및 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA, Cat. No: T62200)은 Sigma에서 구입하였다. HPLC급 메탄올(HPLC-grade methanol, MeOH, Cat. No: UN1230), 아세토니트릴(acetonitrile, ACN, Cat. No: UN1648), 및 HPLC급 물(HPLC-grade water)은 덕산(Duksan, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 펩티드 탈염(desalting)에 사용되는 Sep-PAK Vac (1 cc, tC18 cartridges, Cat. No: WAT054960)는 Waters (Milford, MA)에서 구입하였다.
E.coli 유래 베타-갈락토시다아제 펩티드 혼합물(peptide mixtures of beta-galactosidase) (Cat. No: 4333606)는 Applied Biosystems (Foster City, CA)에서 구입하였다. Pico Tip emitter(stock no: FS360-20-10-N-20-C12, ID in tip 10 μm, ID 20 μm, OD 360 μm, length 20 cm) 및 IntegraFrit capillary (stock no: IF360-75-50-N-5, ID 75 μm, OD 360 μm, length 50 cm) 는 New Objective (Woburn, MA)에서 구입하였다. Sample vials (part no: LP1114-1265, 0.2-ml glass microinsert, silanized) 는 Interface Engineering (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 단백질 또는 펩티드의 흡수를 최소화하기 위하여, Protein LoBind tubes (Cat.No: 022431081, 1.5 ml) 및 low-retention tips (Rainin Instrument, Oakland, CA)를 사용하였다.
실시예 1: 당뇨망막병증 과발현 또는 저발현 단백질 발굴
본 발명의 실험 과정을 개략적으로 나타낸 흐름도(flow chart)를 도 1에 나타내었다.
본 발명에서는 단백질 마커 후보군을 선별하기 위하여 1차로 증식성 당뇨망막병증(PDR) 환자와 황반원공(MH, non-diabetic control) 환자의 유리체 단백(vitreous proteome) 분석을 통해 발현 차이가 나는 단백질인 PDR 특이적 후보 마커를 발굴하였다. 다음으로, 2차 연구에서 상기 과정으로 얻어진 PDR 단백질 발현 정도를 기반으로 증식성 당뇨망막병증(PDR) 환자와 황반원공(MH) 환자 및 비증식성 당뇨망막병증 (NPDR) 환자의 유리체 및 대응하는 혈장시료 중의 단백의 발현 양상을 MRM으로 비교 분석하였다.
그 결과, 황반원공(MH) 및 당뇨망막병증 환자(PDR)와 비교하여 발현 차이를 나타내는 단백질 리스트를 확보하였으며, 추가적으로 당뇨에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 리포단백질 군(lipoprotein family), 보체요소 군(complement component family) 및 세르핀 군(SERPIN family)을 포함하여 총 61개 단백질에 대해 142개의 transition을 결정하였다 (도 2 내지 도 4).
본 실험에서는 대조군 시료 (당뇨이지만 당뇨망막병증이 아닌 환자군)와 비증식성 당뇨망막병증의 심화 정도에 따라 mild NPDR, moderate NPDR, severe NPDR를 분석한 결과 61개의 단백질 중 MO NPDR에서 특이적으로 발현이 감소하는 바이오마커 6개의 바이오마커를 발굴하였다 (표 1).
하기 표 1에서 AUC 값은 ROC 곡선에서 도출된 계산 값이다.
No. Uniprot ID AUC 단백질명
1 P19652 0.796 Alpha-1-acid glycoprotein 2
2 P01009 0.778 Alpha-1-antitrypsin
3 P02652 0.778 Apolipoprotein A2
4 P06727 0.751 Apolipoprotein A4
5 P02749 0.747 Beta-2-glycoprotein 1
6 P06396 0.733 Gelsolin
실시예 2: 환자 선정 및 혈장 채취
당뇨망막병증 초기인 비증식성 당뇨망막병증 환자(NPDR) 45명의 혈장시료 및 대조군 환자 혈장 시료(당뇨이지만 당뇨망막병증이 아닌 환자군, NoDR)로부터 LC MS/MS 시험용 샘플을 얻었다. 상기 비증식성 당뇨망막병증 환자(NPDR) 45명 및 대조군 환자의 임상적 특징은 하기 표 2와 같다. 비증식성 당뇨망막병증 심화 단계별로 mild, moderate 및 severe한 세 군으로 나누어 실시하였다.
(NoDR: 당뇨망막병증이 없는 군, MI NPDR: Mild NPDR, MO NPDR: Moderate NPDR, SV NPDR: Severe NPDR)
그룹 성별
(여성/남성) 		나이 DM 경과기간
(년) 		HbA1c (%) 혈장농도
(㎍/㎕) 		혈장농도의 CV (%)
NoDR 7/8 63.8±9.5 7.9±5.4 7.5±1.6 63.8 9.1
MI NPDR 7/8 61.4±6.7 12.3±6.0 7.4±1.3 61.4 9.4
MO NPDR 8/7 60.6±9.9 15.9±7.7 7.4±1.1 60.6 7.9
SV NPDR 9/6 61.8±9.1 11.8±6.4 7.8±0.8 61.8 9.7
4 그룹(NoDR, MI NPDR, MO NPDR 및 SV NPDR) 사이에서 분산(variance)을 체크하기 위하여, 4 가지 분류(성별, 나이, DM 경과기간, HbA1c)에 대한 통계적 분석을 수행하였다. 성별에 대해서는 피어슨 카이-제곱 테스트(Pearson chi-square test)를 수행하였으며, 나이, DM 경과기간 및 HbA1c에 대해서는 F-테스트(F-test)를 수행하였다. 각각의 검정 통계량(test statistics), 자유도(df, degree of freedom), p-값(p-value) 및 결과 값을 하기 표 3에 나타내었다.
그 결과, 지난 2~3개월 간 혈당 평균치를 반영하는 설탕 분자의 양을 타나내는 HbA1c 레벨은, 모든 그룹에서 7.4% 증가했고, ANOVA 분석에서 그룹 간 차이가 없었다.
분류 Test Statistic df p -value 결과 분석방법
성별 1.6276 3 0.6531 그룹 간 차이 없음 Pearson chi-square test
나이 2.52 3 0.0675 그룹 간 차이 없음 F-statistic
DM 경과기간 3.83 3 0.0148 MO vs. NoDR 차이
p-value=0.0014		 F-statistic
HbA1c 0.3 3 0.8232 그룹 간 차이 없음 F-statistic
상기 표 3의 ANOVA 분석 결과로부터, 60개의 혈장 시료에 대한 제2형 당뇨병의 경과기간(duration of T2DM) 및 HbA1c의 레벨을 도 5와 같이 그래프로 나타내었다. 표 3의 ANOVA 분석 결과에 따르면, NoDR과 MO NPDR 사이의 제2형 당뇨병 경과기간(도 5의 A)을 제외하고는 4 그룹 간의 특이적인 분산(variation) 차이는 없었다. 또한, HbA1c에 대한 그룹 간 분산(도 5의 B)에서도 특이적인 차이가 없었다. 도 5에서 검정색은 NoDR 그룹을, 초록색은 MI NPDR 그룹을, 파란색은 MO NPDR 그룹을, 빨간색은 SV NPDR 그룹을 나타낸다.
44 그룹(NoDR, MI NPDR, MO NPDR 및 SV NPDR) 사이에서 당뇨 치료에 따른 차이를 확인하기 위하여, 3 가지 분류 즉, 고혈당 치료제인 인슐린, 고지혈증 치료제인 스타틴, 그리고 고혈압 치료제 복용 여부에 대한 통계적 분석을 수행하였다. 인슐린과 스타틴 복용 여부에 대해서는 피셔 정확 검정(Fisher exact test)을, 고혈압 치료제 복용 여부에 대해서는 피어슨 카이-제곱 테스트(Pearson chi-square test)를 수행하였다. 각 분석 결과값으로 p-값(p-value)을 하기 표 4에 나타내었다.
Figure 112012000706426-pat00001
그 결과, 4 그룹(NoDR, MI NPDR, MO NPDR 및 SV NPDR) 사이에서 당뇨 치료를 위한 3개 항목인 고혈당 치료(인슐린), 고지혈증 치료 (스타틴), 고혈압 치료에 대한 차이는 각 항목에 대해 유의적인 차이가 나타나지 않았다. (표 4)
상기 데이터들은 4 그룹에서 채취한 혈장 시료가 상대적으로 균질한 당뇨 배경을 갖고 있음을 나타내는 것이며, 이에 본 발명자들은 타겟 단백질의 발현량 차이는 1차적으로 당뇨망막병증 심화 단계(stage)의 차이에 기인한 것이라는 가설을 세울 수 있다.
각 혈장 시료는 종래 방법(Park, J.; Kwon, H.; Kang, Y.; Kim, Y., Proteomic analysis of O-GlcNAc modifications derived from streptozotocin and glucosamine induced beta-cell apoptosis. J Biochem Mol Biol 2007, 40, (6), 1058-68.)에 따라 처리하였다. 구체적으로, K2-EDTA-코팅된 10-ml 튜브 (BD Sciences, NJ, P/N number: 367525)로 혈액을 채취하고, 4℃에서 10분 동안 3000 g로 원심분리 하였다. 각각의 혈장 시료는 50 ㎕짜리 표본으로 나누어 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 혈장 시료의 전처리
혈장(plasma) 시료를 Bradford를 이용하여 정량하여 이중 200 ㎍에 해당하는 혈장을 취해 100 ㎕ 6 M 요소(Urea)로 변성(denaturation)시켰다. 다음으로 1.7 ㎕ 200 mM DTT로 환원시킨 후, 6.7 ㎕ 200 mM 요오드아세트산(iodoacetic acid)를 사용하여 알킬화시켰다. 여기에 증류수 500 ㎕를 첨가하여 요소를 1 M 이하로 희석시킨 후, 트립신(Trypsin)을 50 : 1 (단백질 : 트립신, w/w)의 비율로 처리하여 변성된 단백질을 펩티드로 만들었다. 37℃의 shaker에서 하룻밤 보관하였다가, 50 ㎕ 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)을 넣고 반응을 종결시켰다. 변성된 펩티드(digested peptide)를 Sep-PAK tC18 카트리지(50 mg)를 사용하여 탈염을 하고, 2 ㎖ 60% 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1% TFA 용액으로 동결 건조하였다. 이를 300 ㎕ 용액 A (95% 증류수, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 녹이고, 여기에 내부 표준(internal standard)인 베타-갈락토시다아제 펩티드(beta-galactosidase peptide, 잔기 954-962, GDFQFNISR) 50 fmol을 스파이킹(spiking) 시키고, 이를 MRM 분석하였다.
실시예 4: Transition의 선정
상기 단백질들의 Transition을 선정하기 위해 발굴 연구에서 선정한 단백질들에 대해 각각 MS/MS 분석을 하였다. 이를 바탕으로 각 단백질에 대한 대표 펩티드를 선정하고 (Q1 transition), 이 펩티드를 전기적으로 깨서 발생하는 파쇄 이온(fragmentation ion) 중 가장 강도가 높은 이온을 (Q3) 선정하였다. 각 단백질 당 2개의 펩티드를 선정하고 각 펩티드 당 2개의 파쇄 이온(fragmentation ion)을 선정하여 Q1/Q3를 하나의 단백질에 대한 4개의 Transition으로 결정하였다. 일부 피크가 낮게 나와서 실험적으로 선정하기 어려운 Transition에 대해서는 MIDAS (MRM Initiated Detection and Sequencing) workflow program (MRM Pliot, version 2.0, Applied biosystems, USA)을 사용하여 Transition을 선정하였다. 그리고 MIDAS workflow program로도 잡히지 않은 transition은 Peptide Atlas database를 활용하여 observed number가 높은 펩티드를 선별하여 transition을 선정하였다.
실시예 5: LC 및 MRM
LC는 MDS사의 MDLC nanoflow Tempo LC를 사용하였다. 펩티드의 분리를 위해 직경 3 ㎛, 기공 크기(pore size) 200 Å의 C18 수지(resin)를 길이 15 cm, 내경 100 ㎛의 fused sillica capillary column을 사용하여 직접 충진 하였다. 펩티드 시료는 1.0 ㎕를 Trap column을 거치지 않고 analitical column으로 바로 주입되는 직접 주입 방법으로 주입하였으며 유속은 400 nl/min 으로 사용하였다. 컬럼을 용액 A (95% 증류수, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)으로 10분 간 평형화 한 후 용액 B (5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 30분 간 5%에서 85%까지, 5분 간 85%의 농도 구배를 통해 펩티드를 용출하였다.
질량 분석법(Mass spectrometry)은 Applied Biosystems의 hybrid triple quadrupole/linear ion trap인 4000 QTrap 장비를 이용하여 선정 단백질들에 대한 Transition에 대해 MRM 모드로 모니터링을 하였다. 이온 전압(Ion voltage)은 2000 Volt를 사용하였으며, Quadruple 1 (Q1)과 Quadruple 3 (Q3)에서의 resolution은 unit으로 설정하였다. Transition에 대한 체류 시간(dwell time)은 20 millisecond로 설정하여 총 사이클 시간이 2.5초가 되도록 설정하였다. Neubulizing gas는 5 unit으로 사용하였으며, 히터 온도는 150℃로 설정하여 분석하였다. 배치(Batch) 간 variation을 증명하기 위해 각각의 샘플에 스파이킹(spiking)된 50 fmole 베타-갈락토시다아제 펩티드(beta-galactosidase peptide, Transition 542.3/636.3)도 동시에 모니터링 하였다. MS 작동 시간(run time)은 LC와 시간 동조로 60분 동안 진행하며 MS 및 LC는 Analyst 2.1.2를 사용하여 구동하였다.
실시예 6 : 데이터 분석
상대 정량을 위해 베타-갈락토시다아제 펩티드(beta-galatosidase peptide, Transition 542.3/636.3)를 사용하여 blank, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0, 100.0 fmol 총 8개의 농도 점에서 MRM 정량하여 표준 곡선(standard curve)을 결정하였다. 각 개인별 MRM 결과는 MultiQuant (AppliedBiosystems, ver1.0)을 사용하여 해당 MRM transition의 이온 추출 크로마토그래피 (XIC, Extract ion chromatography)를 생성하였으며, 각 transition의 피크 면적을 계산하고 이를 다시 시간 경과에 따라 도식화하였다. 각 XIC한 피크의 면적을 내부 표준(Internal standard)인 베타-갈락토시다아제 펩티드(beta-galatosidase peptide, Transition 542.3/636.3)의 XIC된 피크 면적으로 정상화하고 이 값으로 상대 정량 분석을 각 단백질별로 수행하였다. 통계 분석을 위해서 MedCalc (MedCalc Software, Belgium, vesion 11.3.3)을 이용하여 ROC (Receiver Operating Characteristic) Curve 및 Interactive plot 등을 작성하였으며 ANOVA (Analysis of variance) 통계 분석을 수행하였다. 일부 도표 작성과 t-TEST분석을 위해 Sigma Plot (Systat Software Inc, USA,version 10.1)을 사용하였다. 많은 타겟 단백질들이 질병 그룹을 분류함에 있어 상관성을 분석하기 위해 다변량 분석 (Multivariable Analysis)을 수행하였다. 사용한 알고리즘은 PLS-DA (Partial Least Square Discriminant Analysis, 부분 최소 자승법 판별 분석)을 사용하였으며 SIMCA-P+ (Umetrics, USA, demo version) software를 사용하였다.
임상적으로, SV NPDR은 망막 표면의 출혈을 일으키며, 그 결과 환자에게 시력저하 증상이 나타나서, 결과적으로 안과 검사에 의한 진단을 받게 된다. 따라서, 마커를 이용한 SV NPDR의 조기 진단은 무의미하며, SV NPDR 환자는 진단 마커 발굴을 위한 발현 패턴 분석에서 제외되었다.
본 발명에서 6개 단백질 마커 후보의 발현 패턴은 NoDR, MI NPDR 및 MO NPDR 그룹을 이용하여 박스-플롯(box-plot) 형태로 관찰되었으며, 이를 도 6에 나타내었다. 발현 패턴 분석 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 6개 단백질은 3개 그룹 중 MO NPDR 그룹에서 특이적으로 발현이 감소하는 것을 알 수 있으며, 따라서 이들 단백질은 초기 단계의 NPDR을 진단하는 지표로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
상기 분석의 결과, NoDR 환자에 비해 NPDR 환자에서 발현 차이가 나는 단백질 중 유의적으로 차이를 보이는 6개의 단백질을 발굴하였고 각 단백질의 ROC curve와 interactive plot은 도 7 내지 도 12에 나타내었다.
도 7 내지 도 12는 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2), 알파-1-안티트립신(Alpha-1-antitrypsin), 아포리포프로틴 A2(Apolipoprotein A2), 아포리포프로틴 A4(Apolipoprotein A4), 베타-2-글리코프로틴 1(Beta-2-glycoprotein 1), 및 겔솔린(Gelsolin) 각각의 interactive plot과 ROC curve로서, 각각 MO NPDR에서 특이적으로 발현이 감소하는 특징을 보임으로써, 중기 비증식성 당뇨망막병증(MO NPDR)에 특이적인 진단용 마커로 이용할 수 있음을 확인하였다.
도 7 내지 도 12의 각 interactve plot에서 민감도(sensitivity)와 특이성(specificity)은 "Sens"와 "Spec"으로 나타내었으며, %값으로 표시하였다. 한편, 파란색 원은 MO NPDR에 대한 NoDR에서 각 단백질의 표준화 농도를 나타낸 것이다. 또한, 각 ROC curve 안에서 각 잠재 마커의 AUC 값을 나타내었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  5. 제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 비증식성 당뇨망막병증 진단용 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단용 키트.
  7. 생물학적 시료로부터 알파-1-애시드-글리코프로틴 2(Alpha-1-acid glycoprotein 2) 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  8. 삭제
  9. 제 7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인 것을 특징으로 하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 mRNA 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것임을 특징으로 하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 해당 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제 7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 비증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
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