KR102073312B1 - 당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당뇨망막병증 환자의 진단 및 진행 정도 판단을 위해 사용될 수 있는 마커, 상기 마커와 관련된 유전자 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

당뇨망막병증 진단용 마커 및 이의 용도{Marker for diagnosing diabetic retinopathy and use thereof}
본 발명은 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 진단용 마커, 조성물 및 당뇨망막병증 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 당뇨병은 다양한 합병증을 동반하게 되는데, 대표적으로 심혈관계 질환, 당뇨신증, 당뇨신경병증, 당뇨망막병증이 발생하게 된다.
그 중에서, 당뇨망막병증 (Diabetic Retinopathy, DR) 은 당뇨 환자에게서 당뇨 진단 10년 내에 60% 이상에서, 20년 내에 90% 이상에서 나타난다. 당뇨망막병증은 당뇨병의 미세혈관 합병증 (microangiopathy)의 하나로 망막 혈관의 투과성 변화와 혈관 폐쇄, 허혈 변화(ischemia), 신생혈관 생성 (neovascularization), 그리고 이에 따른 섬유혈관 증식(fibrovascular proliferation) 이 특징이다. 당뇨망막병증은 성인 최대의 후천적 실명 원인으로, 미국의 경우 매년 12,000명에서 24,000명이 당뇨로 인해 실명에 이르고 있다. 미국의 연구에서, 당뇨망막병증의 유병률은 당뇨 환자의 40% 정도로 추산되며 8% 정도는 실명에 이를 수 있는 심각한 상태인 것으로 보고되고 있다. 당뇨망막병증은 그 진행 정도에 따라 초기의 비증식성 당뇨망병증(NPDR, non-proliferative diabetic retinopathy) 과 후기의 증식성 당뇨망막병증(PDR, proliferative diabetic retinopathy)으로 구분할 수 있다(도 1).
비증식성 당뇨망막병증(NPDR)은 망막 모세혈관의 폐쇄 및 투과성 변화 등으로 망막출혈, 미세혈관류(microaneurysm), 삼출물(exudate), 망막 부종(edema) 등이 나타나면서 조금씩 시력이 떨어지게 된다. 또한 황반부의 부종 (DME, 당뇨황반부종) 을 동반하게 되면 이 시기에서도 심각한 시력 저하를 보일 수 있다.
증식성 당뇨망막병증(PDR)은 망막의 광범위한 혈관 폐쇄에 따르는 허혈 (ischemia) 상태로 인해 신생혈관(neovascularization) 이 증식하는 단계이다. 이러한 증식은 망막에서 유리체로 진행되고 섬유혈관 증식이 일어나 견인막에 의해 유리체출혈(vitreous hemorrhage)이나 망막이 원래 부착 부위에서 떨어지는 견인망막박리(tractional retinal detachment), 신생혈관녹내장 등의 합병증이 발생해 실명이 진행되는 단계이다.
이러한 당뇨망막병증에 대한 레이저 치료 혹은 유리체 수술적 치료에도 불구하고 병증이 계속 진행되어 실명에 이르는 환자가 아직도 많다. 이에 따라, 당뇨망막의 조기발견과 진행 억제, 고위험군에 대한 조기 치료에 대한 필요성이 증가하고 있다. 그러나, 당뇨망막병증의 병인은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았고, 당뇨에 의한 망막증의 진행 정도를 판단하는 바이오마커도 매우 한정적이다.
현재까지 당뇨망막병증 연구는 유리체의 개별 단백질에 대한 생화학 및 분자생물학적 연구를 중심으로 주로 이루어지고 있다. 또한 당뇨망막병증의 단백질체 연구도 환자 유리체에서 단백질을 2-DE 및 Mass spcectrometry로 동정하는 유리체 단백질체의 Profiling(Discovery) 단계의 연구이다. 이들 유리체 단백질들이 혈액에서 발현이 되는지 혹은 이들을 임상적인 바이오마커로 이용할 수 있는 지에 대한 확인(verification) 및 검증(validation) 연구는 거의 이루어지지 않은 상태이다.
따라서, 임상적으로 특이성과 민감도가 높은 신규 진단 마커와 아울러 이를 검출할 수 있는 항체를 개발하여, 당뇨병성 망막증의 조기 진단 및 진행 정도를 손쉽게 미리 예측할 필요가 있다. 더욱이 자각 증상이 별로 없는 초기 단계인 비증식성 당뇨망막병증의 바이오 마커 발굴의 필요성은 더욱 대두되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용한 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 당뇨망막병증 특이 단백질을 발굴하고, LC-MS/MS 방법을 이용하여 당뇨망막병증 개체에서 증가 또는 감소하는 단백질을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 당뇨병성 망막증의 조기진단 및 진행 정도를 효과적으로 진단할 수 있는 새로운 당뇨망막병증 진단용 마커인 C7, ITIH2 및 C5 중에서 1개 이상 선택되는 당뇨망막병증 진단용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 C7(Complement component C7), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 C5(Complement C5) 중에서 선택되는 1개 이상의 당뇨망막병증 진단용 마커를 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "당뇨망막병증"이란 당뇨병에 의해 말초 순환 장애가 발생하여, 이 때 망막의 미세순환에 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 합병증을 의미하며, 바람직하게 비증식성 당뇨망막병증일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것이다. 바람직하게는 당뇨망막병증 중 초기 단계인 비증식성 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단용 마커"란 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 또는 증식성 당뇨망막병증 개체에 비하여 비증식성 당뇨망막병증을 가진 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명자들은 NoDR (당뇨병환자이나 NPDR 아님) 과 NPDR 환자들의 혈장(plasma)을 이용하여, 상기 마커들이 당뇨망막병증의 진단에 유효함을 확인하였다. PDR 환자는 그 증세가 매우 심각(extreme)하여 안과학적인 검사방법으로 쉽게 진단이 가능하고, 급격한 시력 손실 등의 환자의 자각증세가 빨리 진행되므로 별도의 분자 진단의 효용성이 떨어진다. 그러나, NPDR 환자는 그 증상 발달이 미미하여 초기에 안과학적인 검사 방법으로 확진하기 어렵고, 환자의 자각도 매우 느리다. 이에 따라, 본 발명자들은 NoDR과 NPDR에 대한 발현 수준을 확인한 것이다.
본 발명의 목적상 당뇨망막병증 진단용 마커는 C7, ITIH2 및 C5 으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
당뇨망막병증은 진행 정도에 따라 초기의 비증식성 당뇨망막병증(NPDR)과 후기의 증식성 당뇨망막병증(PDR)로 구분한다. 비증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하지 않는 특징이 있으며, 증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하는 등 그 기전에 있어서 상이하며, 비증식성 당뇨망막병증이 반드시 증식성 당뇨망막병증으로 진행되는 것이 아니어서, 증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 알려진 마커라도 반드시 비증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 사용될 수는 없다. 그러나, 당뇨망막병증의 초기 단계를 진단할 수 있는 비증식성 당뇨망막병증 진단용 마커는 비증식성 당뇨망막병증 및 증식성 당뇨망막병증 모두 특이적으로 진단할 수 있다.
본 발명자들은 다음과 같은 입증을 통해 C7, ITIH2 및 C5가 당뇨망막병증 진단용 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.
즉, 본 발명의 실시 예에서, 데이터 발굴(Data mining)을 통해 가능 바이오 마커 후보(candidate)를 선별해 내고, 상기 선별한 바이오 마커 후보에 대한 유효성 검증(validation stage)에 의하여 바이오 마커를 발굴하였으며, 이를 바탕으로 NPDR 특이적 마커 3종(C7, ITIH2, C5)을 최종 발굴하였다.
본 발명의 또 다른 실시 예에서는, 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체) 및 NPDR 개체의 혈장 시료를 분석하여 상기 발굴한 3종의 NPDR 특이적 마커의 유효성을 확립하였다.
또, 하나의 양태로서, 본 발명은 C7(Complement component C7), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 C5(Complement C5) 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
C7(Complement component C7)는 인체의 항원-항체 면역 반응을 조절하는 역할을 갖고 있으며, 세포막 공격계(membrane attack complex, MAC)를 형성하여 병원체를 용해 시키다. 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 면역 반응 및 용해에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 GeneBank Accession No., Uniprot 등에서 찾을 수 있다. 그러나, C7의 당뇨망막병증과의 직접적인 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다.
ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2)는 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 히알루로난(hyaluronan) 대사에 관여하면서 혈액 내에서 히알루로난(hyaluronan)을 운반하는 역할을 담당한 단백질로서, 그 유전자 정보는 GeneBank Accession No., Uniprot 등에서 찾을 수 있다. 그러나 ITIH2의 당뇨망막병증과의 직접적인 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다.
C5(Complement C5) 는 인체의 항원-항체 면역 반응을 조절하는 역할을 갖고 있으며, 세포막 공격계(membrane attack complex, MAC)를 형성하여 병원체를 용해 시키다. 유전자 존재론(Gene ontology) 분류에 따르면 면역 반응 및 용해에 관여하는 단백질로서, 그 유전자 정보는 GeneBank Accession No., Uniprot 등에서 찾을 수 있다. 그러나, C5의 당뇨망막병증과의 직접적인 연관성은 어디에도 전혀 알려지지 않았다
상기 C7(Complement component C7), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 C5(Complement C5)는 모두 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)과 비교하여 당뇨망막병증 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 감소하는 특징을 가진다.
상기 조성물은 C7(Complement component C7), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 C5(Complement C5)로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 당뇨망막병증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 C7, ITIH2 및 C5로 부터 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 유전자의 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자 (nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으나, 해당 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적인 친화력(affinity)을 가지는 모든 검출 수단을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하지 않고 단백질 발현 수준자체를 측정한다.
상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 C7, ITIH2 및 C5로 부터 선택되는 1개 이상의 단백질 중에서 선택되는 1개 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머 (aptamer)를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 C7, ITIH2 및 C5 중에서 선택되는 1 이상의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 사용된 용어 "압타머(aptamer)"란 단일, 이중 나선의 DNA, RNA 형태로 특정 타깃 단백질과의 3차원적 결합을 통해 단백질의 상호작용을 억제하는 생고분자 물질로서, 다양한 표적분자에 결합하는 특징을 가진다. 전형적으로 압타머는 규정된 2차 및 3차 구조, 예컨대 스템-루프 구조로 접혀지는 15~50 염기 길이의작은 핵산일 수 있다. 압타머는 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 보다 적은 kd로 표적 고발현 단백질 또는 저발현 단백질과 결합하는 것이 바람직하다. 압타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 고발현 단백질 또는 저발현 단백질과 결합할 수 있으며, 압타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명의 압타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 마커 또는 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 바람직하게, 상기 당뇨망막병증 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자 (nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자 (nanoparticles), 압타머(aptamer) 또는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함 할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 마커, 조성물 또는 상기 당뇨망막병증 진단용 키트를 이용한 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 정보 제공 방법은 당뇨망막병증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 C7(Complement component C7), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 C5(Complement C5)중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 당뇨망막병증 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 바람직하게 C7, ITIH2 및 C5의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 증식성 당뇨망막병증 개체 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 비교하여, 감소하면 비증식성 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 바람직하게 mRNA 발현 수준을 측정 및 비교할 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 당뇨망막병증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 당뇨망막병증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자 (nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 유전자의 존재 또는 부존재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 상기 단백질 발현 수준 측정 및 비교는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, C7, ITIH2 및 C5 의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, LC-MRM 방법을 사용할 수 있다.
구체적으로 당뇨망막병증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료 중의 단백질을 부피% 기준으로 5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산의 용액으로 30분간 5%에서 85%까지 농도구배를 하면서 LC 분석 컬럼을 통과시킨다. 용액 혼합 비율에 따란 특정 물질에 대한 분해능이 달라질 수 있기 때문에 농도 구배를 실시하였고, 따라서 상기 범위는 다양한 단백질들을 동시에 분리하기 위한 최적 범위를 선정한 것이다.
질량 분석에서는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring)으로 정량을 실시한다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 보다 구체적으로 SIM에서는 선택한 정량이온이 혈장에서도 검출되는 이온인 경우에 정량에 방해가 될 수 있다는 문제점이 있다. 반면, MRM을 이용하는 경우, 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 달라지면서 차별화된 경향을 나타내므로, 이를 정량이온으로 사용하게 되면 백그라운드에서 방해되는 피크가 제거되어 한 층 더 깨끗한 베이스 라인을 얻을 수 있다. 따라서, 질량 분석시에 MRM 모드를 사용함으로써 보다 우수한 분석 감도에서 원하는 물질들을 동시에 분석할 수 있다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 단백질 발현 수준과 당뇨망막병증 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 당뇨망막병증 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 당뇨망막병증 발병 여부를 진단할 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은 당뇨망막병증을 진단할 수 있는 마커를 제공함으로서, 당뇨망막병증 환자에게서 발현이 증가 또는 감소한 유전자 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서 당뇨망막병증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 아울러, 본 발명의 마커는 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는 당뇨망막병증의 초기 진단을 할 수 있다.
도 1은 비증식성 당뇨망막병증 및 증식성 당뇨망막병증 환자의 안구 사진이고,
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예 1 내지 6의 실시 과정을 개략적으로 나타낸 플로우 차트이고,
도 3은 본 발명의 실시예 6에 따른 C7(Complement component C7)의 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 4는 본 발명의 실시예 6에 따른 C7의 ROC curve 를 나타낸 그래프이고,
도 5는 본 발명의 실시예 6에 따른 ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2)의 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 6은 본 발명의 실시예 6에 따른 ITIH2의 ROC curve 를 나타낸 그래프이고,
도 7은 본 발명의 실시예 6에 따른 C5(Complement C5)의 interactive plot을 나타낸 그래프이고,
도 8은 본 발명의 실시예 6에 따른 C5의 ROC curve 를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 당뇨망막병증 과발현 또는 저발현 단백질 발굴
데이터 발굴(Data mining)을 통해 가능 바이오 마커 후보(candidate)를 선별해 내고, 상기 선별한 바이오 마커 후보에 대하여 유효성 검증(validation stage)을 수행하였다. 본 데이터 발굴 연구를 통하여, 당뇨망막병증 (Diabetic Retinopathy, DR) 관련 단백질에 대한 총 1010개의 정보(identification and quantitation information)가 수집되었고, 수집된 데이터(data)의 빈도수(frequency)를 바탕으로 해서 MRM validation 수행을 위한 후보 단백질을 선별 하였다.
본 발명에서는 빈도수(frequency)가 7회 이상 관측된 단백질을 사용하였으며, 총 128개 단백질이 선별되었다. 2차로 pooling 시료를 활용하여 실제 detection transition을 다시 선별 하였으며, 본 발명에 대한 연구를 통하여, 최종 28개 단백질에 대한 transition을 얻을 수 있었다. 총 60개의 각 샘플(Individual sample) 시료(NoDR: 20, MI NPDR: 20, MO NPDR: 20)를 사용하여, 상기 28개 단백질의 특이적 발현 여부를 MRM을 통해 확인해 보았다. 본 실험에서는 대조군 시료 (당뇨이지만 당뇨망막병증이 아닌 환자군, NoDR)와 비증식성 당뇨망막병증의 진행 정도에 따라 mild NPDR(MI NPDR), moderate NPDR (MO NPDR)를 분석한 결과 28개의 단백질 중 NPDR이 진행되면서 moderate NPDR에서 특이적으로 감소하는 3개의 단백질을 발굴하였다(표 1).
서열번호 단백질명 발현양상 UniProt Gene Accession
1 C7 (Complement component C7) 발현 감소 P10643 NM_000587
2 ITIH2 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 발현 감소 P19823 NM_002216
3 C5 (Complement C5) 발현 감소 P01031 NM_001735
실시예 2: 환자 선정 및 혈장 채취
당뇨망막병증 초기인 비증식성 당뇨망막병증 환자(NPDR) 40명의 혈장시료 및 대조군 환자 혈장 시료(당뇨이지만 당뇨망막병증이 아닌 환자군, NoDR)로부터 LC-MS/MS 시험용 샘플을 얻었다. 상기 비증식성 당뇨망막병증 환자(NPDR) 40명 및 대조군 환자의 임상적 특징은 하기 표 2와 같다.
군 성별
(여성/남성)		 나이 DM 경과기간
(년)		 Hypertension
(Hyper./total)		 혈장농도
(㎍/㎕)		 혈장 농도의 CV(%)
NoDR 10/10 63.8±9.5 12.3±5.94 8/20 79.26 9.2
MI NPDR 10/10 61.4±6.7 16.9±6.0 9/20 68.04 9.3
MO NPDR 10/10 60.6±9.9 15.9±5.91 15/20 74.13 8.3
실시예 3: 혈장 시료의 전처리
혈장(Plasma) 시료를 Bradford를 이용하여 정량하고, 이중 200㎍에 해당하는 혈장을 취해서 요소(Urea)로 변성시키었으며, DTT 및 요오드아세트산(iodoacetic acid)를 사용하여 환원 및 알킬화시켰다. 여기에 트립신(Trypsin)을 50 : 1 (단백질 : 트립신, w/w)의 비율로 처리하여 변성된 단백질을 펩타이드로 만든 후 펩타이드를 C18 ZipTip을 사용하여 탈염을 하고 동결 건조하였다. 이를 용액 A (95% 증류수, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 녹이고 여기에 내부 표준(internal standard)인 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galactosidase peptide) 50 fmol을 스파이킹(spiking) 시킨 다음 이를 MRM 분석하였다.
실시예 4: 트랜지션(Transition)의 선정
상기 단백질들의 트랜지션(Transition)을 선정하기 위해 발굴 연구에서 선정한 단백질들에 대해 각각 MS/MS 분석을 하였다. 이를 바탕으로 각 단백질에 대한 대표 펩타이드를 선정하고 (Q1 transition), 이 펩타이드를 전기적으로 깨서 발생하는 fragmentation ion 중 가장 강도가 높은 이온을 (Q3) 선정하였다. 그런 다음, 각 단백질 당 최소 2개 이상의 펩타이드를 선정하고, 각 펩타이드 당 최소 2개 이상의 fragmentation ion을 선정하여 Q1/Q3를 값을 결정하였다. 본 발명에서는 Skyline(version 1.1.0.2905) 프로그램(program)을 사용하여 트랜지션(transition)을 선정하였으며, 일부 피크가 낮게 나와서 실험적으로 선정하기 어려운 트랜지션에 대해서는 MIDAS(MRM-Initiated Detection and Sequencing) workflow 프로그램(MRMPliot, version 2.0, Appliedbiosystems, USA)을 사용하여 트랜지션을 선정하였다. 그리고 MIDAS workflow 프로그램으로도 잡히지 않은 트랜지션은 Peptide Atlas database를 활용하여 관찰 빈도(observed number)가 높은 펩타이드를 선별하여 트랜지션을 선정하였다.
실시예 5: LC 및 MRM
LC는 MDS사의 MDLC nanoflow TempoLC를 사용하였다. 펩타이드의 분리를 위해 직경 3㎛, pore size 200 Å의 C18 resin을 길이 15cm, 내경 100㎛의 fused sillica capillary column을 사용하여 직접 충진하였다. 펩타이드 시료는 1.0㎕를 Trap column을 거치지 않고 analitical column으로 바로 주입되는 직접 주입 방법으로 주입하였으며 유속은 400 nl/min 으로 사용하였다. Column을 용액 A (95% 증류수, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)으로 10분간 평형화한 후 용액 B (5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 30분간 5%에서 85%까지, 5분간 85%의 농도구배를 통해 펩타이드를 용출하였다.
질량 분석법(Mass spectrometry)은 Applied Biosystems의 hybrid triple quadrupole/linear ion trap인 4000 QTrap 장비를 이용하여 선정 단백질들에 대한 트랜지션(Transition)에 대해 MRM 모드로 모니터링을 하였다. 이온 전압(Ion voltage)은 2000 Volt를 사용하였으며 Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3 (Q3)에서의 resolution은 unit으로 설정하였다. 트랜지션에 대한 Dwell time은 20 millisecond로 설정하여 전체 사이클 시간(total cycle time)이 2.5초가 되도록 설정하였다. Neubulizing gas는 5 unit로 사용하였으며 히터 온도는 150℃로 설정하여 분석하였다. 배치(Batch) 간 변화(variation)을 증명하기 위해 각각의 샘플에 스파이킹(spiking) 된 50 fmole 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galactosidase peptide, Transition 542.3/636.3)도 동시에 모니터링하였다. MS run time은 LC와 시간 동조하여 60분 동안 진행하였으며, MS 및 LC는 Analyst 2.1.2를 사용하여 구동하였다.
실시예 6 : 데이터 분석
상대 정량을 위해 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galatosidase peptide, Transition 542.3/636.3)를 사용하여 blank, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0, 100.0 fmol 총 8개의 농도 점에서 MRM 정량하여 Standard curve를 결정하였다. 각 개인별 MRM 결과는 MultiQuant (AppliedBiosystems, ver1.0)을 사용하여 해당 MRM transition의 이온 추출 크로마토그래피 (XIC, Extract ion chromatography)를 생성하였으며 각 transition의 피크 면적을 계산하고 이를 다시 시간 경과에 따라 도식화하였다. 각 XIC한 피크의 면적을 내부 표준(Internal standard)인 베타-갈락토시다아제 펩타이드(beta-galatosidase peptide, Transition 542.3/636.3)의 XIC된 피크 면적으로 정상화하고 이 값으로 상대 정량 분석을 각 단백질별로 수행하였다. 통계 분석을 위해서 MedCalc (MedCalc Software, Belgium, vesion 11.3.3)을 이용하여 Interactive plot 및 ROC (Receiver Operating Characteristic) Curve 등을 작성하였으며 ANOVA (Analysis of variance) 통계 분석을 수행하였다. 일부 도표 작성과 t-TEST분석을 위해 Sigma Plot (Systat Software Inc, USA,version 10.1)을 사용하였다.
상기 분석의 결과 발현 차이가 나는 단백질 중 유의적으로 차이를 보이는 3개의 단백질을 발굴하였고, 각 단백질의 interactive plot은 도 3, 도 5, 도 7과 같으며, ROC curve는 도 4, 도 6, 도 8과 같다.
그 결과, 도 3, 도 5, 도 7의 interactive plot에 나타난 바와 같이 C7, ITIH2 및 C5 각각에서 Mi_NPDR 시료와 Mo_NPDR 시료는 NoDR 시료에 비해 발현이 감소하여, 비증식성 당뇨망막병증에 특이적인 진단용 마커로 이용할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 도 4, 도 6, 도 8의 ROC curve에 나타난 바와 같이 Mo_NPDR 시료는 민감도(sensitivity)와 특이성(specificity)에서도 우수함을 확인할 수 있다.
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. C7 (Complement component C7), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 C5(Complement C5)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비증식성 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 비증식성 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함하는 것인 비증식성 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 비증식성 당뇨망막병증 진단용 키트.
  8. 삭제
  9. C7 (Complement component C7), ITIH2(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2) 및 C5(Complement C5)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 당뇨이지만 당뇨망막병증이 아닌 개체 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준과 비교하여, 감소하면 비증식성 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함하는 비증식성 당뇨망막병증 진단을 위한 정보 제공 방법.
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