KR101927350B1 - 에스트로겐 수용체 및 아로마타제 수준의 측정을 통한 코눈물관협착 질환의 진단용 키트 - Google Patents

에스트로겐 수용체 및 아로마타제 수준의 측정을 통한 코눈물관협착 질환의 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

코눈물관 관련 질환, 상세하게는 코눈물관 협착 질환 또는 눈물흘림증의 진단을 위한 바이오 마커 및 그의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 조성물, 키트, 및 방법에 의하면, 적은 양의 조직만을 채취하여 빠르게 코눈물관 관련 질환을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 조영제를 투여하여 진단하는 방법이 아니라, 조직 내의 마커의 발현을 확인하는 방법으로써, 환자의 부담이 적은 효과가 있다.

Description

에스트로겐 수용체 및 아로마타제 수준의 측정을 통한 코눈물관협착 질환의 진단용 키트{Kit for diagnosing nasolacrimal duct obstruction by measuring the level of estrogen receper and aromatase}
코눈물관 관련 질환, 상세하게는 코눈물관 협착 질환 또는 눈물흘림증의 진단을 위한 바이오 마커 및 그의 용도에 관한 것이다.
코눈물관 협착(nasolacrimal duct obstruction)은 선천적 또는 후천적으로 코눈물관이 좁하지거나 막히는 병을 의미하고, 눈물흘림증(epiphora)라고 불리는 눈물의 과도한 발생을 주증상으로 하는 질병이다.
코눈물관 협착을 진단하는 방법은 기계적으로 코눈물관에 생리식염수를 주사하여 관류가 되는지를 확인하는 방법 또는 코눈물관에 조영제를 주사하여 영상을 촬영하는 방법이 있다. 그러나, 이와 같이 실질적으로 병변이 진행되는 코눈물관이나 눈물주머니에서 확인하는 방법은 조직의 염증만을 확인할 수밖에 없어서 질환이 진행된 후에 판별이 되는 제한이 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 코눈물관 관련 질환의 진단법의 문제를 극복하기 위해, 코눈물관 관련 질환에서 과발현되는 단백질 또는 유전자를 검출함으로써 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), MUCIN5AC, 또는 아로마타제(aromatase) 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 코눈물관(nasolacrimal duct) 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 코눈물관 관련 질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 분리된 생물학적 시료로부터 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), MUCIN5AC, 또는 아로마타제(aromatase) 단백질 또는 그의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 코눈물관 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), MUCIN5AC, 또는 아로마타제(aromatase) 단백질과 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및 무처리 대조군에 비하여 상기 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), 또는 아로마타제(aromatase) 단백질의 발현 수준을 감소시킨 피검 물질을 코눈물관 관련 질환의 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 코눈물관 관련 질환의 치료제를 스크리닝 하는 방법.
일 양상은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), MUCIN5AC, 또는 아로마타제(aromatase) 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 코눈물관(nasolacrimal duct) 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 코눈물관 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 분리된 생물학적 시료로부터 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), MUCIN5AC, 또는 아로마타제(aromatase) 단백질 또는 그의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 코눈물관 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 코눈물관 관련 질환의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 코눈물관 관련 질환을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 코눈물관 관련 질환을 가지는 개체에서 증가를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 명세서에서는 본 발명의 코눈물관 관련 질환을 가지는 개체로부터 분리된 눈물 주머니 시료에서 변화되는 단백질 또는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "에스트로겐 수용체(estrogen receptor)"는 에스트로겐(17β-estradiol)에 의해 활성화되는 수용체를 의미할 수 있다. 상기 에스트로겐 수용체는 ERα 또는 ERβ인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "아로마타제(aromatase)"는 "에스트로겐 합성효소(estrogen synthetase)" 또는 "CYP19A1"과 호환적으로 사용되고, 스테로이드 생성과 관련되는 다양한 반응을 촉매하는 모노옥시제나아제 시토크롬 P450 슈퍼패밀리 중 하나를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "MUCIN5AC"는 MUC5AC 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 코눈물관 관련 질환은 코눈물관협착 질환(nasolacrimal duct obstruction) 또는 눈물흘림증(epiphora)일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 코눈물관협착 질환은 만성 또는 급성의 코눈물관협착 질환일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "mRNA 수준 측정"이란 혈관 협착 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다. 따라서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하고, 상세하게는 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 코눈물관 관련 질환 진단을 위하여 생물학적 시료에서 코눈물관 관련 질환 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 또한, 예를 들면, 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정할 수 있다.
상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 에스트로겐 수용체, MUCIN5AC, 또는 아로마타제 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 에스트로겐 수용체, MUCIN5AC, 또는 아로마타제 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한 본 명세서의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 상기 코눈물관 관련 질환 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 LISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 질량 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 상기 MRM(Multiple reaction monitoring) 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군, 또는 동일 개체의 단백질 발현 수준과 코눈물관 관련 질환이 있는 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 또한, 코눈물관 관련 질환 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 코눈물관 관련 질환 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 코눈물관 관련 질환 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 눈물주머니 시료, 비점막 시료, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다. 상세하게는 상기 생물학적 시료는 눈물주머니로부터 분리된 시료일 수 있다. 상기 정상 대조군은 상기 생물학적 시료와 동일한 개체에서 분리된 시료일 수 있다. 예를 들면, 상기 생물학적 시료로 눈물주머니로부터 분리된 시료를 사용하고, 정상 대조군 시료는 동일 개체의 비점막으로부터 분리된 시료를 사용할 수 있다.
상기 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), MUCIN5AC, 또는 아로마타제(aromatase)은 정상 대조군(코눈물관 관련 질환이 없는 개체, 또는 동일 개체에서 코눈물관 관련 질환과 관련이 없는 시료, 예를 들면, 비점막 시료)과 비교하여, 코눈물관 관련 질환을 갖는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 증가하므로, 상기 수준이 증가하면 코눈물관 관련 질환으로 진단할 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 방법은 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 코눈물관 관련 질환으로 판단하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), MUCIN5AC, 또는 아로마타제(aromatase) 단백질과 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및 무처리 대조군에 비하여 상기 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER), 또는 아로마타제(aromatase) 단백질의 발현 또는 활성 수준을 감소시킨 피검 물질을 코눈물관 관련 질환의 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 코눈물관 관련 질환의 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
상기 피검 물질, 예를 들면, 약물 후보 물질, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있다.
상기 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질들을 발현하는 벡터를 세포에 형질전환 하는 단계; 상기 형질전환된 세포에 약물 후보물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 상기 마커는 코눈물관 관련 질환에서 발현이 증가하므로, 상기 마커의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 물질은 코눈물관 관련 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 조성물, 키트, 및 방법에 의하면, 적은 양의 조직만을 채취하여 빠르게 코눈물관 관련 질환을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 조영제를 투여하여 진단하는 방법이 아니라, 조직 내의 마커의 발현을 확인하는 방법으로써, 환자의 부담이 적은 효과가 있다.
도 1a는 급성 코눈물관 협착 질환을 갖는 환자의 눈물주머니 시료와 비점막 시료(대조군 시료)에서 단백질 발현량을 나타낸 도면이다.
도 1b는 만성 코눈물관 협착 질환을 갖는 환자의 눈물주머니 시료와 비점막 시료(대조군 시료)에서 단백질 발현량을 나타낸 도면이다.
도 1c는 급성 및 만성 코눈물관 협착 질환을 갖는 환자의 눈물주머니 시료와 비점막 시료(대조군 시료)에서 상대적인 단백질 발현량을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 . 코눈물관협착 질환 환자 조직 시료의 분석
코눈물관협착 질환을 갖는 환자의 눈물주머니와 비점막 부위로부터 조직 시료를 분리하여 웨스턴 블랏과 면역형광분석을 수행하였다.
구체적으로, 5명의 만성 코눈물관협착 질환 환자, 6명의 급성 코눈물관협착 질환 환자의 눈물주머니와 비점막 부위로부터 조직 시료를 채취하였다. 비점막 부위는 정상 대조군으로서 활용하였다.
이후에, 웨스턴 블랏을 다음과 같이 수행하였다. 조직 시료를 프로-프렙 용액(Intron, Gyeonggi, Korea)에 용해시켜 BCA 기법을 이용하여 정량 후 동일한 단백질 양을 로딩하여 전기영동을 진행하였다. 전기영동을 진행한 멤브레인을 5 % 탈지유에 상온에서 1시간 동안 블로킹 과정을 거친 후에 ERα와 aromatase(CYP19A1)의 펩타이드를 타겟으로 하는 1차 항체(SantaCruz Biotechnology, CA, USA)를 1:1000의 비율로 TBS-Tween20 (Tris buffered saline-Tween20) 버퍼(Intron)에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 쉐이커를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인 을 TBS-Tween20 버퍼로 10분간 3번의 세척 과정을 거친 후, 1차 항체를 검출할 수 있는 2차 항체(SantaCruz Biotechnology)를 1:5000의 비율로 TBS-Tween20 (Intron)에 희석 시킨 뒤에 상온에서 2 시간 동안 쉐이커 위에서 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인을 다시 TBST로 10분간 2번의 세척한 뒤에, ECL-용액(GenDEPOT, TX, USA)을 이용하여 HRP(horseradish peroxidase) 의 활성을 검출하여 각 조직에서의 ERα와 aromatase(CYP19A1)의 발현을 분석하였고, 그 결과를 도 1a(급성환자조직) 내지 1b(만성환자조직)에 나타내었고, 상대적인 단백질 발현을 도 1 c에 나타내었다.
도 1a는 급성 코눈물관 협착 질환을 갖는 환자의 눈물주머니 시료와 비점막 시료(대조군 시료)에서 단백질 발현량을 나타낸 도면이다.
도 1b는 만성 코눈물관 협착 질환을 갖는 환자의 눈물주머니 시료와 비점막 시료(대조군 시료)에서 단백질 발현량을 나타낸 도면이다.
도 1c는 급성 및 만성 코눈물관 협착 질환을 갖는 환자의 눈물주머니 시료와 비점막 시료(대조군 시료)에서 상대적인 단백질 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이 일 구체예에 따른 ERα,또는 CYP19A1는 대조군 시료인 비점막에 비해 눈물 주머니 시료에서 단백질의 발현이 유의적으로 증가되어 있음을 알 수 있다.
따라서, 상기 ERα, 또는 CYP19A1은 코눈물관 협착 질환을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (5)

  1. 에스트로겐 수용체 알파(estrogen receptor alpha: ERα), 및 아로마타제(aromatase) 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 코눈물관협착(nasolacrimal duct obstruction) 질환의 진단용 키트.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 코눈물관협착 질환의 진단용 키트.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 코눈물관협착 질환의 진단용 키트.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것인 코눈물관협착 질환의 진단용 키트.
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